特許 6961278 生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法及び装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6961278

(24)【登録日】2021年10月15日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法及び装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20211025BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20211025BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 D

   G01N33/543 545L

   !C12N15/12ZNA

【請求項の数】17

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2021-38665(P2021-38665)

(22)【出願日】2021年3月10日

【審査請求日】2021年3月10日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】301032942

【氏名又は名称】国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構

(74)【代理人】

【識別番号】110000338

【氏名又は名称】特許業務法人ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ

(72)【発明者】

【氏名】徳田 隆彦

(72)【発明者】

【氏名】建部 陽嗣

【審査官】 西浦 昌哉

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１９−０２７９５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５０５６６５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１７／１７０９８６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１９−５１３７５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 徳田隆彦 他，脳脊髄液および血液中のTDP-43定量とその臨床的有用性，最新医学，日本，2010年07月，Vol.65, No.7，p.1642-1647

【文献】 DENG, H-X et al.，Mutations in UBQLN2 cause dominant X-linked juvenile and adult-onset ALS and ALS/dementia，nature，2011年09月08日，Vol.477，p.211-215

【文献】 SUZUKI, H. et al.，Nuclear TDP-43 causes neuronal toxicity by escaping from the inhibitory regulation by hnRNPs，Human Molecular Genetics，2014年11月06日，Vol.24/No.6，p.1513-1527

【文献】 SERAFIN, V. et al.，Disposable immunoplatforms for the simultaneous determination of biomarkers for neurodegenerative disorders using poly(amidoamine) dendrimer/gold nanoparticle nanocomposite，Analytical and Bioanalytical Chemistry，2020年05月30日，Vol.413，p.799-811

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法であって、
非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する調製工程、及び
前記測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する検出工程、
を含み、
前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、
前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープとが異なり、
前記捕捉ビーズと前記非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ２．３以上９以下であり、
前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズの濃度が、前記測定試料９０μＬに対して４０万個以上５０万個以下である、方法。

【請求項2】

生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法であって、
非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する調製工程、及び
前記測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する検出工程、
を含み、
前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、
前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープとが異なり、
前記捕捉ビーズと前記非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ２．３以上９以下であり、
前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズの濃度が、前記測定試料９０μＬに対して４０万個以上５０万個以下であり、
前記捕捉ビーズおよび前記非捕捉ビーズに使用される緩衝液にはＥＤＴＡが添加されている、方法。

【請求項3】

ＴＤＰ−４３がリン酸化ＴＤＰ−４３である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記測定試料に含まれるＴＤＰ−４３の濃度が１．４３ｐｇ／ｍＬ以上６．６５ｐｇ／ｍＬ以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記検出抗体及び捕捉抗体の一方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０３〜２０９番目のアミノ酸までのペプチドを含み、
前記検出抗体及び捕捉抗体の他方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６１〜４１４番目のアミノ酸からなるペプチドに含まれるエピトープ、又は、４０４〜４１０番目のアミノ酸からなるペプチドであって、４０９番目及び４１０番目のセリンがリン酸化されているペプチドを含むエピトープである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記検出工程において、
複数のマイクロウェルを有する基板に前記測定試料を接触させ、
前記測定試料中の捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを、前記マイクロウェルに１ビーズずつ配置し、
前記マイクロウェルに配置された捕捉ビーズ上の免疫複合体に由来するシグナルを検出し、
前記マイクロウェルは、前記捕捉ビーズ又は非捕捉ビーズ１個のみを収容可能な容積を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記検出工程において、シグナルの検出が前記免疫複合体に由来するシグナルを撮像することによって行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記生体試料が、髄液又は血液試料である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記血液試料が、血清又は血漿である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記免疫複合体が、捕捉抗体と、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体との複合体であり、前記捕捉抗体が捕捉ビーズに結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記免疫複合体が、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズに結合した捕捉抗体と、ＴＤＰ−４３を含む生体試料と、検出抗体とを混合することによって形成される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法によって取得されたシグナルの強度に基づいて、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得する方法。

【請求項13】

前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法に用いられる試薬又は試薬キット。

【請求項14】

被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する装置であって、
前記装置は、処理部を備え、
前記処理部は、
非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、
前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、
前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、
前記捕捉ビーズと前記非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ２．３以上９以下であり、
前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズの濃度が、前記測定試料９０μＬに対して４０万個以上５０万個以下である、装置。

【請求項15】

被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３に由来するシグナルの強度に基づいて、前記被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得する装置であって、
前記装置は、処理部を備え、
前記処理部は、
非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、
前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、
前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、
前記シグナルの強度に基づいて、前記被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得し、
前記捕捉ビーズと前記非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ２．３以上９以下であり、
前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズの濃度が、前記測定試料９０μＬに対して４０万個以上５０万個以下である、
装置。

【請求項16】

コンピュータに、
非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、
前記生体試料は、被験者から採取されたものであり、
前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、
前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なる、ステップ
を実行させ、
前記捕捉ビーズと前記非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ２．３以上９以下であり、
前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズの濃度が、前記測定試料９０μＬに対して４０万個以上５０万個以下である、ＴＤＰ−４３を測定するためのコンピュータプログラム。

【請求項17】

コンピュータに、
非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、
前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、
前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、
前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なる、ステップと、
前記シグナルの強度に基づいて、前記生体試料を採取した被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得するステップと、
を実行させ、
前記捕捉ビーズと前記非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ２．３以上９以下であり、
前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズの濃度が、前記測定試料９０μＬに対して４０万個以上５０万個以下である、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法及び装置等に関する。

【背景技術】

【0002】

ＴＤＰ−４３はＲＮＡ結合タンパク質として知られている。また、ＴＤＰ−４３は、前頭側頭葉型認知症（ＦＴＬＤ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の疾患のバイオマーカーの候補の１つとして考えられている。

【0003】

例えば、非特許文献１には、ＥＬＩＳＡを使用して髄液中のＴＤＰ−４３濃度を測定し、ＡＬＳ患者において有意に上昇したことが記載されている。また、非特許文献３には、ＥＬＩＳＡを使用してＦＴＬＤ患者の血漿中のＴＤＰ−４３濃度を測定したことが記載されている。

【0004】

また、非特許文献２には、超高感度デジタルＥＬＩＳＡ装置として知られているSimoa（商標）を使用して、ＡＬＳ患者の髄液又は血漿中のニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）及びＴＤＰ−４３の濃度を測定したことが記載されている。また、この測定には、Simoa（商標）専用のＴＤＰ-４３測定キット（TDP43 Discovery Kit）を、キットのプロトコールに従って用いたことが記載されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Kasai T, et al., Acta Neuropathol. 2009; 117(1):55-62

【非特許文献2】Kasai T, et al., Ann Clin Transl Neurol. 2019; 6(12):2489-2502

【非特許文献3】Foulds P, et al., Acta Neuropathol. 2008; 116(2):141-6

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

ＴＤＰ−４３は、ヒトの髄液又は血漿中にはきわめて微量しか存在しない。そのため、上記先行技術文献に開示されているＴＤＰ−４３の測定方法では検出感度が低く、ＴＤＰ−４３の濃度が相対的に高いごく一部の患者でのみ検出ができる程度にとどまっている。つまり、現状では、患者と健常者との間でＴＤＰ−４３の存在量に何等かの有意差は認められるものの、被験者がＦＴＬＤ及びＡＬＳ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチーを有しているか否かの客観的な診断に利用はできない。すなわち、ＴＤＰ−４３を診断用のバイオマーカーとして利用する道を拓くためには、ＴＤＰ−４３の測定方法及び装置の更なる改善及び開発が望まれている。

【0007】

本発明の一態様は、検出感度が高い、ＴＤＰ−４３の測定方法及び装置等を実現することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上記の課題を解決するために、本発明は、以下に示す態様を含む。
＜１＞生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法であって、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する調製工程、及び前記測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する検出工程、を含み、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープとが異なる、方法。
＜２＞捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比が、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズ２．３以上９以下である、＜１＞の方法。
＜３＞捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズの濃度が、前記測定試料９０μＬに対して４０万個以上５０万個以下である、＜１＞又は＜２＞の方法。
＜４＞ＴＤＰ−４３がリン酸化ＴＤＰ−４３である、＜１＞〜＜３＞のいずれかの方法。
＜５＞前記測定試料に含まれるＴＤＰ−４３の濃度が６．６５ｐｇ／ｍＬ以下である、＜１＞〜＜４＞のいずれかの方法。
＜６＞前記検出抗体及び捕捉抗体の一方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０３〜２０９番目のアミノ酸までのペプチドを含み、前記検出抗体及び捕捉抗体の他方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６１〜４１４番目のアミノ酸からなるペプチド又は４０４〜４１０番目のアミノ酸からなるペプチドを含む、＜１＞〜＜５＞のいずれかの方法。
＜７＞前記検出工程において、複数のマイクロウェルを有する基板に前記測定試料を接触させ、前記測定試料中の捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを、前記マイクロウェルに１ビーズずつ配置し、前記マイクロウェルに配置された捕捉ビーズ上の免疫複合体に由来するシグナルを検出し、前記マイクロウェルは、前記捕捉ビーズ又は非捕捉ビーズ１個のみを収容可能な容積を有する、＜１＞〜＜６＞のいずれかの方法。
＜８＞前記検出工程において、シグナルの検出が前記免疫複合体に由来するシグナルを撮像することによって行われる、＜１＞〜＜７＞のいずれかの方法。
＜９＞前記生体試料が、髄液又は血液試料である、＜１＞〜＜８＞のいずれかの方法。
＜１０＞前記血液試料が、血清又は血漿である、＜９＞の方法。
＜１１＞前記免疫複合体が、捕捉抗体と、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体との複合体であり、前記捕捉抗体が捕捉ビーズに結合する、＜１＞〜＜１０＞のいずれかの方法。
＜１２＞前記免疫複合体が、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズに結合した捕捉抗体と、ＴＤＰ−４３を含む生体試料と、検出抗体とを混合することによって形成される、＜１＞〜＜１１＞のいずれかの方法。
＜１３＞＜１＞〜＜１２＞のいずれかの方法によって取得されたシグナルの強度に基づいて、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得する方法。
＜１４＞前記捕捉ビーズ及び前記非捕捉ビーズを含む、＜１＞〜＜１３＞のいずれかの方法に用いられる試薬又は試薬キット。
＜１５＞被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する装置であって、前記装置は、処理部を備え、前記処理部は、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なる、装置。
＜１６＞被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３に由来するシグナルの強度に基づいて、前記被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得する装置であって、前記装置は、処理部を備え、前記処理部は、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得し、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なり、前記シグナルの強度に基づいて、前記被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得する、装置。
＜１７＞コンピュータに、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、前記生体試料は、被験者から採取されたものであり、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なる、ステップを実行させる、ＴＤＰ−４３を測定するためのコンピュータプログラム。
＜１８＞コンピュータに、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させて調製された、前記非捕捉ビーズと前記免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、前記免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップであって、前記非捕捉ビーズは前記免疫複合体と結合せず、前記検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方は、ＴＤＰ−４３を特異的に認識し、前記捕捉抗体のエピトープと前記検出抗体のエピトープが異なる、ステップと、前記シグナルの強度に基づいて、前記生体試料を採取した被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得するステップと、を実行させる、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラム。

【発明の効果】

【0009】

本発明の一態様によれば、検出感度が高い、ＴＤＰ−４３の測定方法及び装置等を実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明のＴＤＰ−４３の測定方法の検出下限濃度の測定結果を示す図である。

【図2】従来技術によるＴＤＰ−４３の測定方法の検出下限濃度の測定結果を示す図である。

【図3】本発明のＴＤＰ−４３の測定方法による、ヒト髄液試料中のＴＤＰ−４３濃度の測定結果を示す図である。

【図4】従来技術によるＴＤＰ−４３の測定方法による、ヒト髄液試料中のＴＤＰ−４３濃度の測定結果を示す図である。

【図5】非捕捉ビーズ濃度の検討結果を示す図である。

【図6】非捕捉ビーズ濃度の検討結果を示す図である。

【図7】本発明のＴＤＰ−４３の測定方法による、ヒト髄液試料中のリン酸化ＴＤＰ−４３濃度の測定結果を示す図である。

【図8】本発明のＴＤＰ−４３の測定装置の要部構成を示す図である。

【図9】本発明のＴＤＰ−４３の情報取得装置の要部構成を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

〔１．ＴＤＰ−４３の測定方法〕
本発明のＴＤＰ−４３の測定方法（以下、「本発明の測定方法」と略記する場合がある）は、被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法である。

【0012】

ＴＤＰ−４３はＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質４３（TAR DNA-binding protein 43）のことであり、２つのＲＮＡ認識モチーフを有するＲＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質である。配列番号１はヒト由来のＴＤＰ−４３のアミノ酸配列である。転写、翻訳及びスプライシングの制御を含むＲＮＡ代謝にＴＤＰ−４３は関与している。ＴＤＰ−４３は、正常ニューロンでは主に核に局在している。一方、ＦＴＬＤ及びＡＬＳ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチー患者のニューロンでは、リン酸化されたＴＤＰ−４３が細胞質又は神経突起に局在する。

【0013】

例えば、ヒト由来のＴＤＰ−４３として、NCBI Reference Sequence NP_031401として登録されているアミノ酸配列から成る、タンパク質が挙げられる。

【0014】

本発明の測定方法によって、生体試料中の、非リン酸化ＴＤＰ−４３及びリン酸化ＴＤＰ−４３の少なくとも一方を測定することができる。本明細書において、特に断り書きがない限り、ＴＤＰ−４３は、非リン酸化ＴＤＰ−４３及びリン酸化ＴＤＰ−４３の両方を表す。リン酸化ＴＤＰ−４３は、ＴＤＰ−４３がリン酸化されている限り限定されない。リン酸化ＴＤＰ−４３の例として、NCBI Reference Sequence NP_031401として登録されているアミノ酸配列の４０３番目のセリン（Ｓｅｒ４０３）、４０４番目のセリン（Ｓｅｒ４０４）、４０９番目のセリン（Ｓｅｒ４０９）及び４１０番目のセリン（Ｓｅｒ４１０）の少なくとも１つのセリンがリン酸化されているＴＤＰ−４３が挙げられるが、これらに限定されない。

【0015】

被験者の例として、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類等が挙げられ、中でも哺乳動物が好ましい。哺乳類としては、ヒト及びヒト以外の動物が挙げられる。ヒト以外の動物として、ウシ、ウマ、ブタ及びヒツジ等のような家畜、並びに、犬、猫、ラット、マウス、ハムスター、サル及びウサギ等のような愛玩動物又は実験動物が挙げられる。好ましくはヒトが挙げられる。また、鳥類としてはニワトリ、カモ、アヒル等の家禽類が挙げられる。

【0016】

被験者から採取される生体試料は、ＴＤＰ−４３を含み得る試料であれば特に限定されない。生体試料の例として、血液試料及び髄液（脳脊髄液）等が挙げられる。血液試料には、全血、血漿、血清等が含まれ、血液試料は血漿又は血清であることが好ましく、血漿であることがより好ましい。血漿は、ヘパリン塩（好ましくは、ナトリウム塩）採血、クエン酸塩（好ましくは、ナトリウム塩）採血、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）塩（好ましくは、ナトリウム塩又はカリウム塩）採血された全血から分離することができる。血漿は、ＥＤＴＡ塩採血、又はヘパリン塩採血された全血から分離された血漿であることがより好ましい。

【0017】

本発明の測定方法は、調製工程と、検出工程と、を含む。以下、各工程について説明する。

【0018】

（調製工程）
調製工程においては、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させて、非捕捉ビーズと免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料を調製する。

【0019】

＜抗体＞
抗体は、ＴＤＰ−４３（非リン酸化ＴＤＰ−４３及び／又はリン酸化ＴＤＰ−４３）を認識できる限り、抗体は特に限定されない。ＴＤＰ−４３を認識できる抗体は、ＴＤＰ−４３と特異的に結合する抗体であることが好ましい。リン酸化ＴＤＰ−４３を認識する抗体は、非リン酸化ＴＤＰ−４３とは結合せず、リン酸化ＴＤＰ−４３に特異的に結合する抗体であることがより好ましい。

【0020】

抗体としては、ＴＤＰ−４３の全体又は一部を抗原としてヒト以外の動物に免疫して得られたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２等）のいずれも用いることができる。また、免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に限定されない。また、ファージディスプレイ法等により抗体ライブラリから選択されたものを使用してもよい。

【0021】

さらに、抗体は市販のものを使用してもよい。非リン酸化ＴＤＰ−４３を認識する抗体としては、例えば、６００１９−２−Ｉｇ（Proteintech社）及び１２８９２−１−ＡＰ（Proteintech社）等が挙げられる。リン酸化ＴＤＰ−４３を認識する抗体としては、例えば、配列番号１のＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence NP_031401として登録されているアミノ酸配列）の４０４〜４１０番目に対応するペプチドであって、４０９番目及び４１０番目のセリン（Ｓ）がリン酸化されたリン酸化ＴＤＰ−４３のペプチドが抗原ペプチドである抗体等が挙げられる。

【0022】

上記６００１９−２−Ｉｇのエピトープは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０３〜２０９番目のアミノ酸までのペプチドである。上記１２８９２−１−ＡＰのエピトープは、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６１〜４１４番目のアミノ酸までのペプチドである。

【0023】

本発明の測定方法において、捕捉抗体及び検出抗体の一方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０３〜２０９番目のアミノ酸までのペプチドを含むことが好ましい。そして、他方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６１〜４１４番目のアミノ酸からなるペプチド、又は、４０４〜４１０番目のアミノ酸からなるペプチドであって、４０９番目及び４１０番目のセリンがリン酸化されているペプチドを含むことが好ましい。非リン酸化ＴＤＰ−４３の測定において、捕捉抗体及び検出抗体の一方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０３〜２０９番目のアミノ酸までのペプチドを含むことがより好ましい。そして、他方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６１〜４１４番目のアミノ酸からなるペプチドを含むことがより好ましい。リン酸化ＴＤＰ−４３の測定において、捕捉抗体及び検出抗体の一方のエピトープが、配列番号１で示されるアミノ酸配列の２０３〜２０９番目のアミノ酸までのペプチドを含むことがより好ましい。そして、他方のエピトープが４０４〜４１０番目のアミノ酸からなるペプチドであって、４０９番目及び４１０番目のセリンがリン酸化されているペプチドを含むことが好ましい。

【0024】

本明細書において、捕捉抗体とは、ＴＤＰ−４３と結合し、後述のビーズ上に固定される抗体である。ビーズへの固定は、アビジン（又はストレプトアビジン）及びビオチン等の物質を介在した間接的な固定であってもよい。本明細書において、検出抗体とは、ＴＤＰ−４３と結合し、好ましくは後述の標識物質を有する抗体である。

【0025】

検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方はＴＤＰ−４３を特異的に認識する抗体であり、これにより、生体試料中のＴＤＰ−４３を特異的に検出することができる。検出抗体及び捕捉抗体がＴＤＰ−４３を特異的に認識する抗体であることが好ましい。

【0026】

ＴＤＰ−４３がリン酸化ＴＤＰ−４３である場合、検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方はリン酸化ＴＤＰ−４３を特異的に認識する抗体である。もう一方の抗体は、リン酸化ＴＤＰ−４３を特異的に認識する抗体であっても、非リン酸化ＴＤＰ−４３を特異的に認識する抗体であってもよい。

【0027】

また、検出抗体のエピトープと捕捉抗体のエピトープとは異なる。

【0028】

＜ビーズ＞
ビーズは、個々のビーズを空間的に分離することができる特性を有する限り限定されない。ビーズは、複数の場所（例えば、ウェル）に空間的に分離することができるような形態で提供されてもよい。例えば、ビーズは、球形、ディスク、リング、立方体状等の形状としてもよい。また、ビーズは、微粒子（例えば、液体中に懸濁される複数の粒子）、ナノチューブ等であってもよい。

【0029】

ビーズのサイズ又は形状は、適宜設計することができる。例えば、ビーズの形状には、球体、立方体、楕円体、チューブ等が含まれる。ビーズの平均直径（実質的に球形の場合）、又は平均最大断面寸法（他の形状の場合）は、約０．１μｍ以上であってもよく、約１μｍ以上であってもよく、約１０μｍ以上であってもよく、約１００μｍ以上であってもよく、約１ｍｍ以上であってもよい。また、ビーズの平均直径又はビーズの最大外寸は、約０．１μｍ〜約１００μｍであってもよく、約１μｍ〜約１００μｍであってもよく、約１０μｍ〜約１００μｍであってもよく、約０．１μｍ〜約１ｍｍであってもよく、約１μｍ〜約１０ｍｍであってもよく、約０．１μｍ〜約１０μｍであってもよい。本実施態様において使用するビーズの平均直径又は平均最大断面寸法は、ビーズの直径／最大断面寸法の算術平均値である。

【0030】

ビーズの平均最大断面寸法は、例えば、レーザー光散乱、顕微鏡法、ふるい分析、電気抵抗方式、又は他の公知の技術を使用して測定することができる。ビーズの平均直径は、レーザー回折・散乱法による粒度分布測定装置により測定される体積基準のメジアン径である。このような粒度分布測定装置としては、例えば、日機装株式会社製「マイクロトラックＭＴ３０００ＩＩ」等が挙げられる。

【0031】

ビーズは、測定において使用される溶媒又は溶液に不溶性又は実質的に不溶性である。ビーズは、多孔質又は実質的に多孔質、中空、部分的に中空等であってもよい。ビーズは、非多孔質固体又は実質的に非多孔質の固体（例えば、本質的に孔がない）であることが好ましい。ビーズは、溶媒を実質的に吸収又は吸収してもよい。ビーズは、溶媒を非吸収又は実質的に非吸収であることが好ましい。

【0032】

さらに、ビーズの材料は、プラスチック又は合成ポリマー（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアミド、ポリウレタン、フェノールポリマー又はニトロセルロース等）、天然由来ポリマー（ラテックスゴム、多糖類金属、又は金属化合物（例えば、金、銀、スチール、アルミニウム、銅等を含む金属化合物）、無機ガラス、シリカ、及びこれらの混合物等を選択することができる。ビーズは、磁性材料を含むことが好ましい。さらに、ビーズは、光学的に検出できることが好ましい。

【0033】

ビーズは市販のビーズを使用してもよい。例えば、Agilent Technologies社のカルボキシル官能化常磁性ビーズ（直径２．７μｍ）を使用することができる。

【0034】

ビーズに使用される緩衝液（バッファ）は、抗原抗体反応の安定化等の点で、キレート剤が添加されていることが好ましく、ＥＤＴＡが添加されていることがより好ましい。

【0035】

本明細書において、捕捉ビーズは、ＴＤＰ−４３を含む複合体を固定化できるビーズである。例えば、ビーズにＴＤＰ−４３と結合できる分子（以下、「捕捉分子」ともいう）を直接的又は間接的に固定したものを捕捉ビーズとすることができる。捕捉分子としては、上述の捕捉抗体が例示される。

【0036】

捕捉ビーズの調製方法は、ビーズに捕捉分子を結合できる限り限定されない。例えば、Quanterix社のSimoa（商標）Homebrew Assay Development kit等の市販キットを使用して、捕捉ビーズを調製してもよい。捕捉ビーズは、非特異的結合を抑制するため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等でブロッキングされていてもよい。

【0037】

本明細書において、非捕捉ビーズは、ＴＤＰ−４３と実質的に結合しないビーズである。非捕捉ビーズは、捕捉分子を備えていない。非捕捉ビーズに使用されるビーズの材質は、捕捉ビーズに使用されるビーズと同じであってもよいが、異なっていてもよい。また、非捕捉ビーズとしては、例えば、Quanterix社のDye-Encoded Helper Beadsを使用してもよい。非捕捉ビーズは、非特異的結合を抑制するため、ＢＳＡ等でブロッキングされていてもよい。

【0038】

捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を形成させる方法は、本実施態様が実現できる限り限定されない。例えば以下のように免疫複合体を形成させることができる。まず、捕捉抗体に生体試料中のＴＤＰ−４３を結合させて、ＴＤＰ−４３を捕捉ビーズ上に結合させる（好ましくは、捕捉する）。次に、検出抗体を、捕捉抗体に捕捉されたＴＤＰ−４３に結合させて免疫複合体を形成させる。

【0039】

また、免疫複合体を形成させる方法として、生体試料中のＴＤＰ−４３と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体を緩衝液中で形成させてから、捕捉ビーズに結合させてもよい。例えば、アビジン又はストレプトアビジンを固定化したビーズと、ビオチン標識した捕捉抗体、ＴＤＰ−４３及び検出抗体の複合体とを接触させることにより、免疫複合体を捕捉ビーズ上に固定することができる。

【0040】

免疫複合体は、非捕捉ビーズの存在下で形成される。測定試料を調製する際の捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数比は、捕捉ビーズを１としたときに、非捕捉ビーズが好ましくは２．３以上であり、より好ましくは３以上である。また、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数比は、捕捉ビーズを１としたときに、非捕捉ビーズが好ましくは９以下である。捕捉ビーズと非捕捉ビーズの個数比が上記範囲内であると、ＴＤＰ−４３をより高感度に検出することができる。

【0041】

生体試料又は希釈した生体試料と混合されるビーズ全体（捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズ）の数は、例えば、測定試料９０μＬに対して、好ましくは４０万〜５０万個程度とすることができる。

【0042】

測定試料の調製は、免疫複合体が形成可能な緩衝液（例えば１〜５×ＰＢＳ）中で行ってもよい。また、測定試料の調製中に、捕捉抗体で生体試料中のＴＤＰ−４３を捕捉した後、検出抗体を結合させる前に、捕捉ビーズを緩衝液で洗浄してもよい。また、捕捉ビーズ上に、生体試料中のＴＤＰ−４３と、検出抗体と、捕捉抗体との免疫複合体を形成させた後にも、捕捉ビーズを緩衝液で洗浄してもよい。

【0043】

検出抗体は、生体試料又は希釈した生体試料１００μＬに対して、最終濃度が０．０５〜１μｇ／ｍＬ（好ましくは、０．１〜０．５μｇ／ｍＬ程度）となるように添加してもよい。検出抗体は、標識物質を備えることが好ましい。

【0044】

（検出工程）
検出工程においては、測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルを検出する。

【0045】

測定試料中の免疫複合体に由来するシグナルの検出は、免疫複合体に含まれる標識物質を検出することにより行うことができる。標識物質は、検出可能なシグナルが生じる限り、特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質（以下、「シグナル発生物質」ともいう）であってもよく、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素等が挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素等が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、Alexa Fluor（登録商標）等の蛍光色素、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質等が挙げられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３２Ｐ等が挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、β−ガラクトシダーゼが特に好ましい。

【0046】

酵素の基質は、当該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）等の化学発光基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の発色基質が挙げられる。酵素としてβ−ガラクトシダーゼを使用する場合には、レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用することができる。酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、ＣＤＰ−Ｓｔａｒ（登録商標）（４−クロロ−３−（メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−（５’−クロロ）トリクシロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）、ＣＳＰＤ（登録商標）（３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２−（５’−クロロ）トリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン］−４−イル）フェニルリン酸２ナトリウム）等の化学発光基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸（ＢＣＩＰ）、５−ブロモ−６−クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、ｐ−ニトロフェニルリン酸等の発色基質が挙げられる。酵素としてβ−ガラクトシダーゼを使用する場合には、レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用することができる。酵素として、ペルオキシダーゼを用いる場合には、Thermo Fisher SCIENCE社のSuper Signal ELISAシリーズ等を使用することができる。これら酵素反応は、ビーズを後述するマイクロウェルに配置してから前に行うことが好ましいが、ビーズをマイクロウェルに配置してから酵素反応を行ってもよい。

【0047】

また、検出抗体をビオチン化しておき、標識物質を標識したアビジン又はストレプトアビジンと結合させてから、シグナルを検出してもよい。

【0048】

シグナルの検出は、測定試料に含まれている捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを含むビーズについて、その全部又は一部について行うことができる。シグナルの検出は個々のビーズについて行うことが好ましい。ここで、捕捉ビーズと、非捕捉ビーズとは、そのシグナルの有無、強弱、波長等が異なるため、これらを識別できる検出装置を使用することが好ましい。

【0049】

個々のビーズのシグナルを検出する方法としては、例えば、シグナルが蛍光である場合には、フローサイトメータを用いて検出してもよい。また、複数のマイクロウェルを有する基板に測定試料を接触させて、測定試料中の捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを、マイクロウェルに配置して、マイクロウェル内のシグナルを検出してもよい。

【0050】

基板上においてマイクロウェルは、実質的に平坦な表面上に、又は非平面の３次元配列で配置され得る。マイクロウェルは、規則的なパターンで配列されていてもよいし、ランダムに分布していてもよい。好ましくは、マイクロウェルは、実質的に平坦な表面上の部位の規則的なパターンであることが好ましい。

【0051】

基板に含まれるマイクロウェルの数は、１測定試料あたり１０００〜１，０００，０００個程度としてもよく、好ましくは１０，０００〜５００，０００個、より好ましくは１００，０００〜５００，０００個程度である。

【0052】

基板の材料として、例えば、ガラス（修飾及び／又は官能化ガラスを含む）、プラスチック（ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）、テフロン（登録商標）、多糖類、ナイロン又はニトロセルロース等）、エラストマー（例えば、ジメチルシロキサン及びポリウレタン等））、複合材料、セラミックス、シリカ又はシリカ系材料（ケイ素及び変性シリコンを含む）、炭素、金属、及び、光ファイバー束等が挙げられる。

【0053】

個々のマイクロウェルの容量は、ビーズの大きさに合わせて、適宜設定してもよい。例えば、１ウェルに収容されるビーズの数は１〜５個程度、好ましくは１〜２個程度、より好ましくは１個である。このため、マイクロウェルの容積は、１ウェルに前記数のビーズが収容される大きさであることが好ましい（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２１２８４８号明細書、国際公開第２０１１／１０９３６４号）。より具体的には、マイクロウェルの容積は、１００ａＬ〜１ｐＬ、好ましくは１ｆＬ〜５００ｆＬ、より好ましくは１０ｆＬ〜９０ｆＬの範囲である。１つの基板上に存在する複数のマイクロウェルは、それぞれがほぼ同じ容積を有することが好ましい。

【0054】

マイクロウェルの形成方法は、所望の大きさのマイクロウェルが形成できる限り限定されない。例えば、フォトリソグラフィー、スタンピング技術、成形技術、エッチング技術等の公知の方法により形成してもよい。

【0055】

マイクロウェル内へのビーズの配置は、公知の方法を使用して行うことができる。ビーズは、基板上のマイクロウェルのすべてに配置されてもよく、一部に配置されてもよい。

【0056】

例えば、測定試料をマイクロウェルが設計された基板に接触させた後、基板及び溶液を遠心して、ビーズをマイクロウェルに配置してもよい。ビーズが磁気である場合、磁石を使用してビーズをマイクロウェルに配置してもよい。マイクロウェルが光ファイバー束の端部に形成されている場合、光ファイバーのもう一端の周りに測定試料を接触させた後、遠心力、圧力等の力を加えて、マイクロウェルにビーズを配置してもよい。

【0057】

ビーズをマイクロウェルに配置した後、マイクロウェルの周囲の基板に残った測定試料を除去し、基板の表面を洗浄及び／又は拭き取って余分な測定試料を除去してもよい。マイクロウェルを含む基板としては、例えば、Quanterix社のSimoa（商標）Diskを使用してもよい。

【0058】

また、ビーズを配置した後のマイクロウェルは、フルオラス液体、油（例えば、鉱油、フッ素化油）、強磁性流体、非水性ポリマー溶液（例えば、増粘剤）等でシールされてもよい。シールには、例えば、Quanterix社のSimoa（商標）Sealing Oilを使用してもよい。

【0059】

マイクロウェルに配置されたビーズの検出は、例えば標識物質が酵素又は蛍光色素である場合には、ＣＣＤカメラ等で、シグナルを撮像することにより行ってもよい。また、標識物質が放射性同位元素である場合には、オートラジオグラフィーを使用して検出してもよい。

【0060】

マイクロウェルに配置されるビーズは、捕捉ビーズ又は非捕捉ビーズである。ＴＤＰ−４３を捕捉した捕捉ビーズは、標識物質に由来するシグナル（すなわち、前記免疫複合体に由来するシグナル）を発するのに対して、標的タンパク質を捕捉しなかったビーズ及び非捕捉ビーズは、前記標識物質に由来するシグナルを発しない。このため、標識物質に由来するシグナルを発するウェルの数を計数することによって、標的タンパク質を定量することができる。シグナルを検出するマイクロウェルは、基板上のすべてのマイクロウェルであってもよく、一部でもよい。

【0061】

標識物質に由来するシグナルを発するウェルの数は、例えば、Quanterix社のSimoa（商標）HD-1 Analyzer及びSimoa（商標）HD-X Analyzerで測定することができる。Simoa（商標）HD-1 Analyzer及びSimoa（商標）HD-X Analyzerを使用した場合、シグナルの強さは、ビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ：average enzymes per bead）値として表される。このため、ＡＥＢ値を測定試料中の免疫複合体に由来するシグナル強度としてもよい。

【0062】

また、検量線を用いて、ＡＥＢ値をＴＤＰ−４３の測定値に換算してもよい。ここでＴＤＰ−４３の測定値とは、ＴＤＰ−４３の量又は濃度を反映した値をいう。当該測定値を「量」で標記する場合には、モルであっても質量であってもよいが、質量で標記することが好ましい。また、値を「濃度」で表記する場合には、モル濃度であっても生体試料の一定容量あたりの質量の割合（質量／容量）であってもよいが、好ましくは質量／容量である。

【0063】

本実施態様の測定方法において、Quanterix社のプロトコールにしたがって、標識物質としてβ−ガラクトシダーゼを用い、レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシドを基質として用いることが好ましい。また、ビーズはSimoa（商標）Diskにアプライされ、Simoa（商標）HD-1 Analyzer及びSimoa（商標）HD-X Analyzerでシグナル強度を取得することが好ましい。

【0064】

本発明の測定方法の一態様は、ＴＤＰ−４３を含むサンドイッチ免疫複合体を形成し、ＴＤＰ−４３を検出するサンドイッチイムノアッセイ方法である。

【0065】

本発明の測定方法によって生体試料中のＴＤＰ−４３を測定することに加えて、生体試料中のニューロフィラメント軽鎖（ＮｆＬ）を測定することによって、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報の精度をより向上させることができる。

【0066】

本発明の測定方法によって、実施例に示すように、測定試料に含まれるＴＤＰ−４３の濃度が６．６５ｐｇ／ｍＬ以下であっても、ＴＤＰ−４３の定量が可能である。また、本発明の測定方法は、測定試料中のＴＤＰ−４３の濃度が６ｐｇ／ｍＬ以下、５ｐｇ／ｍＬ以下、４ｐｇ／ｍＬ以下、３ｐｇ／ｍＬ以下、又は、２ｐｇ／ｍＬ以下であっても、ＴＤＰ−４３の定量が可能である。測定試料に含まれるＴＤＰ−４３の濃度の下限は特に限定されないが、定量の容易さの観点では、測定試料中のＴＤＰ−４３の濃度が１ｐｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、１．３ｐｇ／ｍＬ以上、又は１．４ｐｇ／ｍＬ以上であることがより好ましい場合がある。

【0067】

〔２．ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得する方法〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得する方法（以下、「情報取得方法」と略記する場合がある）に関する。本発明の情報取得方法は、上記測定方法によって取得されたシグナルの強度に基づいて、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得する。ＴＤＰ−４３プロテイノパチーの例として、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及び前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）等が挙げられる。

【0068】

より具体的には、被験者の生体試料中のＴＤＰ−４３に由来するシグナル強度を所定の基準値と比較する。そして、被験者の生体試料中のＴＤＰ−４３に由来するシグナル強度が所定の基準値よりも高い場合に、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているという情報を取得する。

【0069】

ここで、所定の基準値とは、ＴＤＰ−４３に由来するシグナル強度の基準値をいう。当該基準値は、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーを発症していない者の生体試料中のＴＤＰ−４３に由来するシグナル強度（陰性対照値）に基づいて決定してもよい。または、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーを発症した者の生体試料中のＴＤＰ−４３に由来するシグナル強度（陽性対照値）に基づいて決定してもよい。当該基準値は、陰性対照値及び陽性対照値の双方から決定してもよい。例えば、複数の陽性対照値と、複数の陰性対照値とを取得し、これらの複数の値に基づいて陽性と陰性とを最も精度よく分類できる値を基準値としてもよい。ここで、最も精度よく分類できる値は、検査の目的によって感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率等の指標に基づいて適宜設定することができる。感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率等の観点から、陽性と陰性とを最も精度よく分類できる基準値を設定してもよい。

【0070】

シグナル強度に代えて、ＴＤＰ−４３の測定値を用いて、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得してもよい。

【0071】

〔３．ＴＤＰ−４３を測定する装置〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３を測定する装置（以下、「測定装置」と略記する場合がある）に関する。本発明の一実施形態に係る測定装置について、図８に基づき、詳細に説明する。図８は、本発明の一実施形態に係る測定装置２０の概略構成を示す図である。測定装置２０は、被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する装置である。

【0072】

図８に示すように、測定装置２０は、入力部３０と、出力部３１と、記憶媒体３２と接続されている。測定装置２０は、処理部（ＣＰＵ）２１と、主記憶部２２と、ＲＯＭ（read only memory）２３と、補助記憶部２４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）２８と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２５と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）２６と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）２７は、バス２９によって互いにデータ通信可能に接続されている。

【0073】

ＣＰＵ２１は、測定装置２０の処理部である。ＣＰＵ２１が、補助記憶部２４又はＲＯＭ２３に記憶されているコンピュータプログラムを実行し、取得されるデータの処理を行うことにより、測定装置２０が機能する。

【0074】

ＲＯＭ２３は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ（登録商標）等によって構成され、ＣＰＵ２１により実行されるコンピュータプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。ＣＰＵ２１はＭＰＵ２１としてもよい。ＲＯＭ２３は、測定装置２０の起動時に、ＣＰＵ２１によって実行されるブートプログラムや測定装置２０ハードウェアの動作に関連するプログラムや設定を記憶する。

【0075】

主記憶部２２は、ＳＲＡＭ又はＤＲＡＭ等のＲＡＭ（Random access memory）によって構成される。主記憶部２２は、ＲＯＭ２３及び補助記憶部２４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。また、主記憶部２２は、ＣＰＵ２１がこれらのコンピュータプログラムを実行するときの作業領域として利用される。

【0076】

補助記憶部２４は、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等によって構成される。補助記憶部２４には、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラム等の、ＣＰＵ２１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いる各種設定データが記憶されている。具体的には、補助記憶部２４は、後述する測定プログラム、シグナル強度の基準値、リン酸化タウタンパク質の測定値の基準値等を記憶する。

【0077】

通信Ｉ／Ｆ２８は、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃ等のシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４等のパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインタフェース、ネットワークインタフェースコントローラ（ＮＩＣ：Network interface controller）等から構成される。通信Ｉ／Ｆ２８は、ＣＰＵ２１の制御下で、測定ユニット又は他の外部機器からのデータを受信し、必要に応じて測定装置２０が保存又は生成する情報を、測定ユニット又は外部に送信又は表示する。通信Ｉ／Ｆ２８は、ネットワークを介して測定ユニット又は他の外部機器と通信を行ってもよい。

【0078】

入力Ｉ／Ｆ２５は、例えばＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃ等のシリアルインタフェース、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４等のパラレルインタフェース、及びＤ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器等からなるアナログインタフェース等から構成される。入力Ｉ／Ｆ２５は、入力部３０は文字入力、クリック、音声入力等を受け付ける。受け付けた入力内容は、主記憶部２２又は補助記憶部２４に記憶される。

【0079】

入力部３０は、タッチパネル、キーボード、マウス、ペンタブレット、マイク等から構成され、測定装置２０に文字入力又は音声入力を行う。入力部３０は、測定装置２０の外部から接続されても、測定装置２０と一体となっていてもよい。

【0080】

出力Ｉ／Ｆ２６は、例えば入力Ｉ／Ｆ２５と同様のインタフェースから構成される。出力Ｉ／Ｆ２６は、ＣＰＵ２１が生成した情報を出力部３１に出力する。出力Ｉ／Ｆ２６は、ＣＰＵ２１が生成し、補助記憶部２４に記憶した情報を、出力部３１に出力する。

【0081】

出力部３１は、例えばディスプレイ、プリンター等で構成され、測定ユニットから送信される測定結果及び測定装置２０における各種操作ウインドウ、測定結果等を表示する。

【0082】

メディアＩ／Ｆ２７は、記憶媒体３２に記憶された例えばアプリケーションソフト等を読み出す。読み出されたアプリケーションソフト等は、主記憶部２２又は補助記憶部２４に記憶される。また、メディアＩ／Ｆ２７は、ＣＰＵ２１が生成した情報を記憶媒体３２に書き込む。メディアＩ／Ｆ２７は、ＣＰＵ２１が生成し、補助記憶部２４に記憶した情報を、記憶媒体３２に書き込む。

【0083】

記憶媒体３２は、フレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、又はＤＶＤ−ＲＯＭ等で構成される。記憶媒体３２は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、又はＤＶＤ−ＲＯＭドライブ等によってメディアＩ／Ｆ２７と接続される。記憶媒体３２には、コンピュータがオペレーションを実行するためのアプリケーションプログラム等が格納されていてもよい。

【0084】

ＣＰＵ２１は、測定装置２０の制御に必要なアプリケーションソフトや各種設定をＲＯＭ２３又は補助記憶部２４からの読み出しに代えて、ネットワークを介して取得してもよい。前記アプリケーションプログラムがネットワーク上のサーバコンピュータの補助記憶部２４内に格納されており、このサーバコンピュータに測定装置２０がアクセスして、コンピュータプログラムをダウンロードし、これをＲＯＭ２３又は補助記憶部２４に記憶することも可能である。

【0085】

また、ＲＯＭ２３又は補助記憶部２４には、例えば米国マイクロソフト社が製造販売するＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）等のグラフィカルユーザインタフェース環境を提供するオペレーションシステムがインストールされていてもよい。

【0086】

処理部２１は、検査者が入力部３０から行う、非捕捉ビーズと免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、免疫複合体に由来するシグナルを取得するための入力を受け付ける。次に後述する測定ユニット等で検出された免疫複合体に由来するシグナルを取得する。そして、処理部２１は、これらの取得したシグナルの強度を補助記憶部２４等に記憶する。

【0087】

測定装置２０は、パーソナルコンピュータ等であり得る。また、測定装置２０は、後述する測定ユニットに内蔵されていてもよい。

【0088】

〔４．ＴＤＰ−４３を測定するシステム〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３を測定するシステムに関する。ＴＤＰ−４３を測定するシステムは、測定装置２０と、測定ユニットと、を備える。ＴＤＰ−４３を測定するシステムは、被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３を測定するシステムである。

【0089】

測定ユニットは、少なくともシグナルを検出するためのＣＣＤカメラ等の撮像装置を備えた検出部を備え、場合によっては、さらに測定試料を調製するための試料調製部を備えていてもよい。また、検出部は、フローサイトメータであってもよい。検出部は、マイクロウェルに測定試料中のビーズを配置するための加圧装置、減圧装置、又は遠心装置を備えていてもよい。

【0090】

測定ユニットは、測定装置２０と一体型となっていてもよい。検出部に撮像装置を備え、測定装置２０と一体型となった装置としては、例えば、Simoa（商標）HD-1 Analyzer及びSimoa（商標）HD-X Analyzer等が挙げられる。

【0091】

〔５．ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得する装置〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得する装置（以下、「情報取得装置」と略記する場合がある）に関する。本発明の一実施形態に係る情報取得装置を図９に示す。情報取得装置５０は、被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３のシグナル強度に基づいて、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報を取得する装置である。

【0092】

図９に示すように、情報取得装置５０は、入力部６０と、出力部６１と、記憶媒体６２と接続されている。情報取得装置５０は、処理部（ＣＰＵ）５１と、主記憶部５２と、ＲＯＭ（read only memory）５３と、補助記憶部５４と、通信インタフェース（Ｉ／Ｆ）５８と、入力インタフェース（Ｉ／Ｆ）５５と、出力インタフェース（Ｉ／Ｆ）５６と、メディアインターフェース（Ｉ／Ｆ）５７は、バス５９によって互いにデータ通信可能に接続されている。

【0093】

図９の各構成の詳細は、図８の各構成の詳細と同様である。

【0094】

処理部５１は、検査者が入力部６０から行う、非捕捉ビーズと免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、免疫複合体に由来するシグナルを取得するための入力を受け付ける。次に後述する測定ユニット等で検出された免疫複合体に由来するシグナルを取得する。続いて、補助記憶部５４等に記憶されているシグナル強度の基準値と、取得したシグナル強度を比較する。処理部５１は、測定試料について取得されたシグナルが基準値より高い場合には、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患している可能性があると決定する。測定試料について取得されたシグナルが基準値より低い場合には、処理部５１は、被験者がＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患している可能性がないと決定する。処理部５１は、これらの決定結果をＴＤＰ−４３プロテイノパチーであるか否かの情報として補助記憶部５４等に記憶する。処理部５１は、これらの結果を出力部６１に出力するか、又は記憶媒体６２に記憶してもよい。

【0095】

〔６．ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得するシステム〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得するシステム（以下、「情報取得システム」と略記する場合がある）に関する。情報取得システムは、情報取得装置５０と、測定ユニットと、を備える。情報取得システムは、被験者から採取された生体試料中のＴＤＰ−４３を測定するシステムである。測定ユニットの詳細は、〔４．ＴＤＰ−４３を測定するシステム〕に記載される測定ユニットの詳細と同様である。

【0096】

測定ユニットは、情報取得装置５０と一体型となっていてもよい。検出部に撮像装置を備え、情報取得装置５０と一体型となった装置としては、例えば、Simoa（商標）HD-1 Analyzer及びSimoa（商標）HD-X Analyzer等が挙げられる。

【0097】

〔７．ＴＤＰ−４３を測定するためのコンピュータプログラム〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３を測定するためのコンピュータプログラム（以下、「測定プログラム」と略記する場合がある）に関する。測定プログラムは、測定装置２０の動作を制御する測定プログラムとして使用される。測定プログラムは、非捕捉ビーズと免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップをコンピュータに実行させる。

【0098】

〔８．ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラム〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３プロテイノパチーに罹患しているか否かの情報を取得するためのコンピュータプログラム（以下、「情報取得プログラム」と略記する場合がある）に関する。情報取得プログラムは、情報取得装置５０の動作を制御する測定プログラムとして使用される。情報取得プログラムは、非捕捉ビーズと免疫複合体が結合した捕捉ビーズとを含む測定試料について、免疫複合体に由来するシグナルを取得するステップをコンピュータに実行させる。

【0099】

さらに、測定プログラム及び情報取得プログラムは、ハードディスク、フラッシュメモリ等の半導体メモリ素子、光ディスク等の記憶媒体に記憶されていてもよい。記憶媒体へのプログラムの記憶形式は、情報取得装置が前記プログラムを読み取り可能である限り限定されない。記憶媒体への記憶は、不揮発性であることが好ましい。

【0100】

〔９．ＴＤＰ−４３の検出用試薬及び試薬キット〕
本発明はまた、ＴＤＰ−４３を検出するための試薬（以下、「検出用試薬」と略記する場合がある）に関する。検出用試薬は、本発明の測定方法に用いられ、捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズを含む。検出用試薬に含まれる捕捉ビーズと非捕捉ビーズの好ましい個数比は、〔１．ＴＤＰ−４３の測定方法〕に記載されるとおりである。

【0101】

本発明はまた、ＴＤＰ−４３を検出するための試薬キット（以下、「試薬キット」と略記する場合がある）に関する。試薬キットは、本発明の測定方法に用いられ、上記検出用試薬を含む。

【0102】

試薬キットは検出抗体をさらに含んでいてもよく、他の試薬及び器具等を含んでいてもよい。試薬キットは、ビーズに捕捉抗体が固定化されていない場合は、捕捉抗体を含有する試薬をさらに含んでいてもよい。また、試薬キットは、複数の異なる試薬を、適切な容量及び／又は形態で混合していてもよいし、それぞれ別の容器により提供してもよい。また、試薬キットには、ＴＤＰ−４３の測定手順等を記載した指示書を含んでいてもよい。紙若しくはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、又は、磁気テープ、コンピュータ等の読み取り可能なディスク若しくはＣＤ−ＲＯＭ等のような電子媒体に付されてもよい。

【0103】

以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明の以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献のすべてが参考として援用される。

【実施例】

【0104】

〔材料〕
捕捉ビーズは、Quanterix社のSimoa（商標）Homebrew Assay Development kitのビーズを使用して、添付のプロトコールに従って調製した。非捕捉ビーズとして、Quanterix社のDye-Encoded Helper Beadsを使用した。ビーズバッファがＥＤＴＡを添加されたバッファを使用した。捕捉抗体として、６００１９−２−Ｉｇ（Proteintech社）を使用した。６００１９−２−Ｉｇの抗原ペプチドはＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence NP_031401として登録されているアミノ酸配列）の２０３〜２０９番目に対応するペプチドである。検出抗体として、１２８９２−１−ＡＰ（Proteintech社）を使用し、検出抗体のビオチン化は上記kitのプロトコールに従って調製した。１２８９２−１−ＡＰの抗原ペプチドはＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence NP_031401として登録されているアミノ酸配列）の２６１〜４１４番目に対応するペプチドである。１２８９２−１−ＡＰはポリクローナル抗体である。以下、６００１９−２−Ｉｇ（捕捉抗体）及び１２８９２−１−ＡＰ（検出抗体）の組み合わせを使用したＴＤＰ−４３の測定方法を、実施例の測定方法と略記する場合がある。

【0105】

標的タンパク質として、非リン酸化ＴＤＰ−４３又はリン酸化ＴＤＰ−４３を使用した。また、標準曲線を作成するために標準ペプチドとしてヒトＴＤＰ−４３標準ペプチドを使用した。標的タンパク質又は標準ペプチドは、Simoa（商標）Homebrew Assay Development kitのSample diluentを用いて希釈した。

【0106】

〔評価例１〕ヒトＴＤＰ−４３標準ペプチドの検出下限濃度の測定
捕捉抗体として６００１９−２−Ｉｇ（Proteintech社）を使用した。検出抗体として検出抗体として１２８９２−１−ＡＰ（Proteintech社）を使用した。そして、Simoa（商標）Homebrew Assay Development kitに添付のプロトコールを参照して、ヒトＴＤＰ−４３標準ペプチドの測定を行った。また、Simoa（商標）Enzyme and Substrate kit、Simoa（商標）Disk kit、Simoa（商標）Sealing Oil、System buffer 1、System buffer 2、Simoa（商標）HD-1 Analyzerを使用し、メーカーのプロトコールに従って、測定を行った。測定は、測定用サンプルと、捕捉ビーズ、ビオチン標識抗体、非捕捉ビーズ等の必要な試薬をSimoa（商標）HD-1 Analyzerにセットした。そして、Simoa（商標）HD-1 Analyzerですべての測定工程を行った。

【0107】

評価例１においては、捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比は、捕捉ビーズ１に対して非捕捉ビーズが３〜９となるように調製した。また、ビーズ全体（捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズ）の濃度は、測定試料９０μＬに対して４０万〜５０万個となるように調製した。

【0108】

具体的な測定工程は以下の通りである。まず、非捕捉ビーズの存在下で、捕捉ビーズに結合されている捕捉抗体と標準ペプチドとを結合させた。次に、ビオチン化された検出抗体を、捕捉抗体と結合した標準ペプチドにさらに結合させ、捕捉ビーズ上に捕捉抗体と標準ペプチドとビオチン化検出抗体の免疫複合体を形成させた。

【0109】

免疫複合体の形成後、非捕捉ビーズの存在下で捕捉ビーズとβ−ガラクトシダーゼを結合させたストレプトアビジンとを反応させた。そして、非捕捉ビーズの存在下で捕捉ビーズをβ−ガラクトシダーゼの基質（ＲＧＰ：レソルフィンβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）と反応させた。ＲＧＰとの反応が終わった捕捉ビーズと非捕捉ビーズを、Simoa（商標）Diskにアプライした。その後、アプライされたビーズは、多数のフェムトリットル（ｆＬ）単位のウェルが配置されたアレイの各ウェルに一つずつ格納された。ウェルに格納された各ビーズをSimoa（商標）HD-1 Analyzerによって撮影し、蛍光強度（ＡＥＢ）を測定した。蛍光強度の強いビーズの数を測定することにより、標的タンパク質を定量した。ブランクとしてバッファを使用した。

【0110】

Simoa（商標）Homebrew Assay Development kitの捕捉抗体及び検出抗体を使用した測定方法を比較例の測定方法として、実施例の測定方法と比較した。実施例の測定方法の測定結果を図１、比較例の測定方法の測定結果を図２に示す。図１及び２の横軸は、ＴＤＰ−４３濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示し、縦軸は測定により得られた実測値（ＡＥＢ）を示す。

【0111】

図２の比較例の測定方法の検出下限濃度は６．６５ｐｇ／ｍＬであった。一方、図１の実施例の測定方法の検出下限濃度は１．４３ｐｇ／ｍＬと、比較例の測定方法に比べてＴＤＰ−４３標準ペプチドの検出感度が明らかに向上していた。

【0112】

また、ビーズバッファとしてＥＤＴＡが添加されたバッファを使用することによって、抗原抗体反応の安定化させることができた。

【0113】

〔評価例２〕ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）のＴＤＰ−４３の定量
ヒトＣＳＦをサンプルとして、実施例の測定方法と比較例の測定方法を比較した。実施例の測定方法において、ビーズ全体の濃度及びは捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比は評価例１と同様の条件で行った。異常凝集したＴＤＰ−４３が中枢神経系内に蓄積する筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者４名及び対照患者（ＣＴＲＬ）４名のＣＳＦ中の非リン酸化ＴＤＰ−４３を測定した。ＣＳＦはSimoa（商標）Homebrew Assay Development kitのSample diluentで４倍に希釈して測定した。また、ブランクとしてバッファを用いた。

【0114】

実施例の測定方法の測定結果を図３、比較例の測定方法の測定結果を図４に示す。図３及び４の縦軸はＣＳＦ中のＴＤＰ−４３濃度（ｐｇ／ｍＬ）を示す。

【0115】

比較例の測定方法と実施例の測定方法においてそれぞれ同じ８例の患者のＣＳＦサンプルを測定した。図４に示すように、比較例の測定方法では、８例中７例のサンプルにおいて、ＴＤＰ−４３の測定値が検出感度下限（６．６５ｐｇ／ｍＬ）以下だった。さらに、５例のサンプルでは測定値が得られなかった（図４において０として表示）。また、比較例の測定方法では、かろうじて測定されたＴＤＰ−４３濃度について、ＡＬＳ患者と対照患者（ＣＴＲＬ）で明らかな差はなかった。

【0116】

一方、図３に示すように、実施例の測定方法においては、すべてのＣＳＦサンプルでＴＤＰ−４３濃度を測定することができた。また、ＡＬＳ患者と対照患者（ＣＴＲＬ）の間でＣＳＦ中のＴＤＰ−４３濃度に明らかな差が認められた。

【0117】

評価例２より、実施例の測定方法は、従来の比較例の測定方法では不可能であった、ヒトの脳脊髄液中のＴＤＰ−４３の定量ができるようになったことが分かった。また、実施例の測定方法によって得られたヒト体液中のＴＤＰ−４３濃度（測定値）を用いることによって、従来では不可能であった、ＡＬＳ又はＦＴＬＤ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチーの生化学的診断に利用可能な情報が得られることが示唆された。

【0118】

〔評価例３〕捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズの割合の検討
実施例の測定方法によって、ヒト生体試料中のＴＤＰ−４３の高感度での定量が可能となった理由の１つに、ＴＤＰ−４３の特異抗体が結合している捕捉ビーズと、ＴＤＰ−４３の特異抗体が結合しておらず免疫複合体を捕捉しない非捕捉ビーズ（ヘルパービーズ）の混合比（個数比）が考えられる。そこで、捕捉ビーズ及び非捕捉ビーズの最適な混合比を検討することにした。

【0119】

ＴＤＰ−４３の測定は、評価例１と同様の手順で行った。ヒトＴＤＰ−４３標準ペプチドを標的タンパク質として使用した。ヒトＴＤＰ−４３標準ペプチドは１．６７ｐｇ／ｍＬ又は５．０ｐｇ／ｍＬとなるように、Simoa（商標）Homebrew Assay Development kitのSample diluentで希釈したものを測定用サンプルとして使用した。測定試料９０μＬに対して捕捉ビーズと非捕捉ビーズの合計数が４０万〜５０万個程度となるようにした。そして、捕捉ビーズと非捕捉ビーズの合計数を１００％とし、非捕捉ビーズの数の割合を０、５０、７５％と変化させて、ＴＤＰ−４３を測定した際のＡＥＢを比較した。１回の測定には、ヒトＴＤＰ−４３標準ペプチド溶液を１５２μＬ使用した。

【0120】

ＴＤＰ−４３の濃度が１．６７ｐｇ／ｍＬのときの検討結果を図５、ＴＤＰ−４３の濃度が５．０ｐｇ／ｍＬのときの検討結果を図６に示す。

【0121】

図５及び６に示すように、非捕捉ビーズの数の割合が７５％の時に最も強いＡＥＢが得られた。評価例３の結果及びこれまでの経験から、ＴＤＰ−４３を検出するためには、捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの割合（捕捉ビーズ：非捕捉ビーズ）を２５：７５〜１０：９０（すなわち、１：３〜１：９）の範囲とすることが好ましいことが示唆された。

【0122】

〔評価例４〕ヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）のリン酸化ＴＤＰ−４３の定量
ヒトＣＳＦをサンプルとして、実施例の測定方法においてリン酸化ＴＤＰ−４３の定量を行った。検出抗体として５−２２−２抗体を使用した。５−２２−２抗体は、リン酸化ＴＤＰ−４３を特異的に認識するモノクローナル抗体であって、東京都医学総合研究所 長谷川成人博士から提供を受けた。５−２２−２抗体の抗原ペプチドはＴＤＰ−４３のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence NP_031401として登録されているアミノ酸配列）の４０４〜４１０番目に対応するペプチドであって、４０９及び４１０番目のセリン（Ｓ）がリン酸化されたリン酸化ＴＤＰ−４３のペプチドである。実施例の測定方法において、ビーズ全体の濃度及びは捕捉ビーズと非捕捉ビーズとの個数比は評価例１と同様の条件で行った。

【0123】

異常凝集したリン酸化ＴＤＰ−４３が中枢神経系内に蓄積する筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の患者５名及び対照患者（ｎｏｎ−ＡＬＳ）４名のＣＳＦ中のリン酸化ＴＤＰ−４３を測定した。ＣＳＦはSimoa（商標）Homebrew Assay Development kitのSample diluentで４倍に希釈して測定した。また、ブランクとしてバッファを用いた。リン酸化ＴＤＰ−４３の定量結果を図７に示す。図７の縦軸はＣＳＦ中から検出されたリン酸化ＴＤＰ−４３のシグナル値（arbitrary unit）を示す。

【0124】

図７に示すように、実施例の測定方法によって、１０例のサンプルすべてでヒトＣＳＦ中のリン酸化ＴＤＰ−４３を検出することができた。また、ＡＬＳ患者と対照患者（ｎｏｎ−ＡＬＳ）の間でＣＳＦ中のリン酸化ＴＤＰ−４３濃度に明らかな差が認められた。

【0125】

評価例２より、実施例の測定方法は、従来の比較例の測定方法では不可能であった、ヒトの脳脊髄液中の非リン酸化ＴＤＰ−４３の定量に加えて、リン酸化ＴＤＰ−４３の定量もできることが分かった。非リン酸化ＴＤＰ−４３及びリン酸化ＴＤＰ−４３の定量が可能である実施例の測定方法によって、従来では不可能であった、ＡＬＳ又はＦＴＬＤ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチーの生化学的診断に利用可能な情報が得られることが示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0126】

本発明の測定方法によっては、ＡＬＳ又はＦＴＬＤ等のＴＤＰ−４３プロテイノパチーの高感度の生化学的診断に利用可能な情報を提供することができ、例えば、医薬用途などに利用することができる。

【符号の説明】

【0127】

２０ 測定装置
２１、５１ 処理部（ＣＰＵ）
２２、５２ 主記憶部
２３、５３ ＲＯＭ
２４、５４ 補助記憶部
２５、５５ 入力Ｉ／Ｆ
２６、５６ 出力Ｉ／Ｆ
２７、５７ メディアＩ／Ｆ
２８、５８ 通信Ｉ／Ｆ
２９、５９ バス
３０、６０ 入力部
３１、６１ 出力部
３２、６２ 記憶媒体
５０ 情報入力装置

【要約】

【課題】検出感度が高い、ＴＤＰ−４３の測定方法等の実現。
【解決手段】生体試料中のＴＤＰ−４３を測定する方法に関する。当該方法に使用される非捕捉ビーズは、生体試料中のＴＤＰ−４３と、捕捉抗体と、検出抗体との免疫複合体とは結合しない。捕捉ビーズ上に免疫複合体が形成されている。検出抗体及び捕捉抗体の少なくとも一方はＴＤＰ−４３を特異的に認識し、捕捉抗体のエピトープと検出抗体のエピトープとが異なる。
【選択図】なし

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]