特許 6961486 システインプロテアーゼ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6961486

(24)【登録日】2021年10月15日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】システインプロテアーゼ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/57 20060101AFI20211025BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 9/52 20060101ALI20211025BHJP

   A61K 38/48 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/57ZNA

   C12N1/21

   C12N9/52

   A61K38/48

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P37/06

【請求項の数】18

【全頁数】56

(21)【出願番号】特願2017-542896(P2017-542896)

(86)(22)【出願日】2016年2月12日

(65)【公表番号】特表2018-506286(P2018-506286A)

(43)【公表日】2018年3月8日

(86)【国際出願番号】EP2016053052

(87)【国際公開番号】WO2016128558

(87)【国際公開日】20160818

【審査請求日】2019年2月8日

(31)【優先権主張番号】1502306.2

(32)【優先日】2015年2月12日

(33)【優先権主張国】GB

(73)【特許権者】

【識別番号】517280580

【氏名又は名称】ハンサ バイオファーマ エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100163658

【弁理士】

【氏名又は名称】小池 順造

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100151301

【弁理士】

【氏名又は名称】戸崎 富哉

(72)【発明者】

【氏名】チェルマン、クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】イャルヌム、ソフィア

(72)【発明者】

【氏名】ノルダル、エマ

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５４２４１８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Agniswamy, J. et al.，Chain A, Igg-degrading Protease，PDB [online]，2012年12月27日，https://ncbi.nlm.nih.gov/protein/90108755，Database Accession No. 2AU1_A

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／５７

Ａ６１Ｋ ３８／４８

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３５／０２

Ａ６１Ｐ ３７／０６

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ９／５２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有し、配列番号２の配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体が：
（ａ）配列番号２に対して少なくとも９０％同一であり；
（ｂ）前記変異体配列中の、配列番号１の９４位に対応する位置にシステイン（Ｃ）を有し；及び
（ｃ）前記変異体配列中の、配列番号１の８４位、２６２位、２８４位及び２８６位に対応する位置に、それぞれ、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びアスパラギン酸（Ｄ）を有し；
前記ポリペプチドは、ＩｇＧの切断において、同じアッセイにおいて測定した場合ＩｄｅＳよりも少なくとも１．５倍有効であり、且つ、ＩｄｅＳよりも免疫原性が低く、更に配列番号２の配列の前記変異体が：
（１）前記変異体中の、配列番号１の１３０位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し；及び／又は
（２）連続配列ＮＱＴＮを含まず；及び／又は
（３）配列番号２のＮ末端における最初の２０残基（連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲ ＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴ；配列番号１９を含む）全体が欠失している、ポリペプチド。

【請求項2】

配列番号２の配列の前記変異体が、前記変異体中の、配列番号１の１３０位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）である、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

配列番号２の配列の前記変異体が、配列番号２に対して少なくとも９５％又は９９％同一である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

配列番号３〜１６のいずれか１つの配列を含むか、又はそれからなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項5】

前記配列が、メチオニンをＮ末端に、及び／又はヒスチジンタグをＣ末端に、更に含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項6】

同じアッセイにおいて測定した場合、前記ポリペプチドが、ＩｇＧの切断において、ＩｄｅＳよりも少なくとも２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍又は７．５倍更に有効である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項7】

ＩｄｅＳよりも免疫原性が低い、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。

【請求項8】

同じアッセイにおいて測定した場合、前記ポリペプチドの免疫原性が、ＩｄｅＳの免疫原性の８５％以下である、請求項７に記載のポリペプチド。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか１項のポリペプチドをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド又は発現ベクター。

【請求項10】

請求項９のポリヌクレオチド又は発現ベクターを含む宿主細胞。

【請求項11】

細菌細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。

【請求項12】

細菌細胞がＥ．コリの細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。

【請求項13】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む、組成物。

【請求項14】

請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含む、医薬組成物。

【請求項15】

被験体における疾患又は状態を予防又は治療するための方法において使用するための医薬製剤の製造における、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。

【請求項16】

前記疾患又は状態が、病原性ＩｇＧ抗体によって全体的又は部分的に媒介される疾患又は状態であり、好ましくは、前記疾患又は状態が、アジソン病、抗ＧＢＭ糸球体腎炎、抗好中球細胞質抗体関連血管炎、抗ＮＭＤＡＲ脳炎、抗リン脂質抗体症候群、劇症型ＡＰＳ、自己免疫性水疱性皮膚症、落葉状天疱瘡、ブラジル天疱瘡、尋常性天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性好中球減少症、類天疱瘡、セリアック病、慢性蕁麻疹、完全先天性心ブロック、糖尿病１Ａ型、後天性表皮水疱症、本態性混合型クリオグロブリン血症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、甲状腺腫、甲状腺機能亢進症、浸潤性眼球突出症、浸潤性皮膚症、ギラン・バレー症候群、急性炎症性脱髄性多発神経炎、急性運動性軸索型ニューロパチー、血友病−後天性第ＦＶＩＩＩ因子欠損症、特発性血小板減少性紫斑病、ランバート・イートン筋無力症症候群、混合性結合組織病、多発性骨髄腫、重症筋無力症、筋無力症クリーゼ、心筋炎、拡張型心筋症、視神経脊髄炎、原発性胆汁性肝硬変、一次進行型多発性硬化症、リウマチ性心疾患、リウマチ熱、関節リウマチ、血清病、免疫複合体過敏症（ＩＩＩ型）、シェーグレン症候群、ループス腎炎を含むＳＬＥ、全身硬直性症候群、全身性硬化症、移植拒絶反応又は血栓性血小板減少性紫斑病である、請求項１５に記載の使用。

【請求項17】

ＩｇＧを切断するためのエクスビボの方法であって、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性が生じることを可能にする条件下で、ＩｇＧを含有する試料と、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチドとを接触させることを含む、方法。

【請求項18】

Ｆｃ及びＦａｂ断片を生成するために実施される、及び／又は、試料が、請求項１６に定義された疾患又は状態に罹患している被験体から採取された血液試料である、請求項１７に記載のエクスビボの方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を示す新規なポリペプチド、並びにそのインビボ及びエクスビボでの使用に関する。ポリペプチドの使用としては、ＩｇＧによって媒介される疾患及び状態を予防又は治療するための方法、及びＩｇＧを解析するための方法が挙げられる。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
ＩｄｅＳ（Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリンＧ分解酵素（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ−ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ））は、ヒトの病原体であるＳ．ピオゲネスによって産生される細胞外システインプロテアーゼである。ＩｄｅＳは、最初に血清型Ｍ１のＡ群連鎖球菌株から単離されたが、今では、試験されたすべてのＡ群連鎖球菌株において、ｉｄｅｓ遺伝子が同定されている。ＩｄｅＳは、程度の非常に高い基質特異性を有し、その、同定された唯一の基質がＩｇＧである。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧの全てのサブクラスの、重鎖下部のヒンジ領域において、タンパク質分解による１回切断を触媒する。ＩｄｅＳは、これに相当する、様々な動物におけるＩｇＧのいくつかのサブクラスの重鎖の切断も触媒する。ＩｄｅＳは、２段階の機構を介して、ＩｇＧを、Ｆｃ及びＦ（ａｂ’）_２の断片に効率的に切断する。第１段階では、ＩｇＧの一方の（第１の）重鎖が切断されて、非共有的に結合したＦｃ分子を有する、１回切断されたＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）分子が生成される。ｓｃＩｇＧ分子は、事実上、原型ＩｇＧ分子の残りの（第２の）重鎖を保持する中間産物である。該メカニズムの第２段階においては、この第２の重鎖が、ＩｄｅＳによって切断され、Ｆ（ａｂ’）_２断片及びホモダイマーのＦｃ断片が遊離する。これらは、生理学的条件下で一般的に観察される産物である。還元条件下で、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、２つのＦａｂ断片に解離する場合があり、ホモダイマーのＦｃは、その構成要素のモノマーに解離する場合がある。

【発明の概要】

【0003】

発明の要旨
ＩｄｅＳのＩｇＧ切断能力は、例えば、ＩｇＧ解析のために用いられ得る、Ｆａｂ及びＦｃの断片を生成するための方法において、エクスビボでの有用性を有することが示されている。例えば、国際特許出願公開第２００３０５１９１４号及び国際特許出願公開第２００９０３３６７０号を参照。ＩｄｅＳは、疾患を媒介するか、又はそうでなければ、望ましくない、ＩｇＧ分子の、インビボでの切断が可能であるため、治療剤としての、インビボでの有用性も有することが示されている。例えば、国際特許出願公開第２００３０５１９１４号、国際特許出願公開第２００６１３１３４７号及び国際特許出願公開第２０１３１１０９４６号を参照。ＩｄｅＳは、ＩｇＧによって全体的又は部分的に媒介される、任意の疾患又は状態に対する治療法として用いられ得る。多くの自己免疫疾患は、供与された臓器の急性拒絶反応のように、ＩｇＧが、全体的又は部分的に媒介する。

【0004】

しかしながら、ＩｄｅＳは免疫原性タンパク質である。つまり、ＩｄｅＳが治療薬として用いられる場合、ＩｄｅＳを受容する被験体の免疫系は、頻繁にそれに応答する。ＩｄｅＳに対する免疫系の応答は、典型的には、ＩｄｅＳに特異的な抗体の産生を伴う。これらの抗体は、本明細書では、ＩｄｅＳに特異的な抗薬物抗体（ＡＤＡ）又は「ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ」と言われる場合がある。一般的に、ＩｄｅＳに対する免疫応答、及び特にＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの産生は、関連する２タイプの問題を引き起こし得る。第１に、ＩｄｅＳの有効性は、例えば、ＡＤＡ結合により、減少し得、同じ効果を挙げるために、より高い用量又は反復用量が必要となる可能性がある。この効果を有するＡＤＡは、「中和作用を有する（ｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇ）ＡＤＡ」と呼ばれ得る。第２に、ＡＤＡ及びＩｄｅＳの免疫複合体によって誘発される高炎症応答等の、望ましくないか、又は有害でさえある、合併症があり得る。ある特定の被験体においては、ＩｄｅＳに特異的なＡＤＡの量が多いほど、これらの問題が生じる可能性が高い。患者におけるＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ分子の存在及び量は、薬剤特異的ＣＡＰ ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験、又は患者からの血清試料に対して行われた力価アッセイ等の任意の好適な方法によって決定され得る。臨床医によって決定された閾値を上回れば、患者におけるＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ分子の量によりＩｄｅＳの投与が不可能になり得るか、又はより高い用量のＩｄｅＳが必要であることが示され得る。かかる、より高い用量は、結果として、患者におけるＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ分子の量の増加をもたらし、それによってＩｄｅＳの更なる投与が不可能になり得る。

【0005】

ＩｄｅＳは、扁桃炎及び連鎖球菌性咽頭炎等の、一般的な感染の原因となる、Ｓ．ピオゲネスの病原性因子である。従って、ほとんどのヒト被験体は、この関係でＩｄｅＳに遭遇して、血流中に抗ＩｄｅＳ抗体を有する可能性がある。ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡは、無作為なヒト被験体由来の血清試料において、日常的に検出される（以前の連鎖球菌感染による可能性が高い）。数千人のドナーの血清プールから抽出されたＩｇＧの調製物であるＩＶＩｇ（静脈内免疫グロブリン（Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ））調製物においても同様である。最初のＩｄｅＳ投与前に、被験体がＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを有していなくても、その後に、かかる分子が産生される可能性がある。従って、ある任意の被験体に対する、ＩｄｅＳの免疫原性に関連する問題は、治療としてのＩｄｅＳの使用に対する障害を提示しているようである。特に反復投与が必要な場合、これらの問題は、ＩｄｅＳの用量の増加を必要とし、且つ／又はＩｄｅＳによる治療を全く不可能にする場合がある。このタイプの問題に対する既存のアプローチには、例えば、免疫原性を低下させるための、治療剤のペグ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）又は治療剤と免疫抑制剤との共投与が含まれる。

【0006】

本発明者らは全く異なるアプローチを採用した。本発明者らは、本明細書に記載の通りに改変された場合に、免疫原性に関連する問題が、ＩｄｅＳと比較して軽減される、新規ポリペプチドをもたらす、ＩｄｅＳの配列内の特定の位置を同定した。いくつかの改変は、本発明のポリペプチドのＩｇＧを切断する際の効力を、ＩｄｅＳに比べて増加させ、それにより、同じ効果を達成するために、より低い用量又は濃度を使用させることによって、間接的に免疫原性を低下させ得る。代替的に、又は追加的に、他の改変は、本発明のポリペプチドを認識するＩｄｅＳ特異的抗体の能力を、ＩｄｅＳに比べて低下させることによって、直接的に免疫原性を低下させ得る。

【0007】

ＩｄｅＳの全配列は、ＮＣＢＩ参照配列番号（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｎｏ）ＷＰ＿０１０９２２１６０．１として公に入手可能であり、本明細書では、配列番号１として示されている。この配列は、Ｎ末端のメチオニンに続く２８アミノ酸の分泌シグナル配列を含む。Ｎ末端のメチオニン及びシグナル配列（Ｎ末端における合計２９アミノ酸）は、通常除去されて、成熟ＩｄｅＳタンパク質を形成し、その配列はＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＤＦ１３９４９．１として公に入手可能であり、本明細書では、配列番号２として示されている。

【0008】

特に明記しない限り、本明細書に開示されるポリペプチドにおける、アミノ酸位置の番号付けに関する全ての言及は、配列番号１において、Ｎ末端から開始する、対応する位置の番号付けに基づく。従って、配列番号２は、配列番号１のＮ末端メチオニン及び２８アミノ酸のシグナル配列を欠くので、配列番号２のＮ末端のアスパラギン酸（Ｄ）残基は、３０位として言及される（これが、配列番号１における、対応する位置であるため）。この番号付けスキームを適用すると、ＩｄｅＳのＩｇＧシステインプロテアーゼ活性にとって最も重要な残基は、９４位のシステイン（Ｃ）（配列番号２のＮ末端から６５番目の残基）である。ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性にとって重要な可能性のある他の残基は、８４位のリジン（Ｋ）、２６２位のヒスチジン（Ｈ）並びに２８４位及び２８６位のそれぞれのアスパラギン酸（Ｄ）である。これらは、それぞれ、配列番号２のＮ末端から５５番目、２２３番目、２５５番目及び２５７番目の残基である。

【0009】

従って、本発明によれば、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有し、配列番号２の配列の変異体を含むポリペプチドであって、該変異体が：
（ａ）配列番号２に対して少なくとも５０％同一であり；
（ｂ）前記変異体配列中の、配列番号１の９４位に対応する位置にシステイン（Ｃ）を有し；及び場合により
（ｃ）前記変異体配列中の、配列番号１の８４位、２６２位、２８４位及び２８６位に対応する位置に、それぞれ、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びアスパラギン酸（Ｄ）を有し；
前記ポリペプチドは、ＩｇＧの切断において、ＩｄｅＳよりも有効であり、及び／又は、ＩｄｅＳよりも免疫原性が低い。本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ２よりも、ＩｇＧ１の切断においてより有効な場合がある。
好ましくは、配列番号２の前記変異体は：
（１）前記変異体中の、配列番号１の１３０位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）であり；及び／又は
（２）前記変異体中の、配列番号１の１３１位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）であり；及び／又は
（３）連続配列ＮＱＴＮを含まず；及び／又は
（４）連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲ ＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴを含まない。

【0010】

本発明は、本発明のポリペプチドをコードするか又は発現させるポリヌクレオチド、発現ベクター又は宿主細胞も提供する。

【0011】

本発明は、被験体における、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防する方法であって、治療有効量又は予防有効量の本発明のポリペプチドを、被験体に投与することを含む、方法も提供する。該方法は、典型的には、被験体への、前記ポリペプチドの複数回投与を含み得る。

【0012】

本発明は、患者、典型的には、ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態に罹患している患者、から採取された血液をエクスビボで処理する方法であって、血液と、本発明のポリペプチドとを接触させることを含む、方法も提供する。

【0013】

本発明は、治療又は治療剤の、被験体への利益を向上させるための方法であって、該方法が、（ａ）被験体に、本発明のポリペプチドを投与すること；（ｂ）続いて、被験体に、前記治療を施し又は前記治療剤を投与することを含み；
− 前記治療が、臓器移植（若しくは前記治療剤が抗体）、ウイルスベクター等の遺伝子治療、欠損した、酵素、増殖因子若しくは凝固因子等の内因性因子についての置換、又は細胞治療であり；
− 投与される前記ポリペプチドの量は、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分であり；且つ
− 工程（ａ）及び（ｂ）は、被験体の血漿中に存在する実質的にすべてのＩｇＧ分子を切断するのに十分な時間間隔で隔てられる、方法も提供する。

【0014】

本発明は、ＩｇＧと本発明のポリペプチドとを、好ましくはエクスビボで、接触させることを含む、ＩｇＧの、Ｆｃ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）_２断片を生成する方法も提供する。

【0015】

本発明による方法を実施するためのキットも提供される。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、コントロールと比較した、本発明のポリペプチドの効力（ＩｇＧの切断における有効性）を測定するための、代表的なアッセイの結果を示す。

【図2】図２は、ＩｇＧ１と、本発明のポリペプチド又はコントロールとのインキュベーションによって生成された切断産物を可視化するために用いられた、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。

【図3】図３は、ＩｇＧ１と、本発明の更なるポリペプチド又はコントロールとのインキュベーションによって生成された切断産物を可視化するために用いられた、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。

【図4】図４は、ＩｇＧ２と、本発明のポリペプチド又はコントロールとのインキュベーションによって生成された切断産物を可視化するために用いられた、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を示す。

【図5】図５は、コントロールと比較した、本発明のポリペプチドの、ＩｄｅＳ特異的抗体による認識のレベルを測定するための、代表的な競合アッセイの結果を示す。

【図6】図６は、コントロールと比較した、本発明のポリペプチドの、ＩｄｅＳ特異的抗体による認識のレベルを測定するための、代表的な競合アッセイの結果を示す。

【図7】図７は、種々のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドによる、ＩｇＧ１の切断についての、代表的な滴定曲線を示す。

【図8】図８は、種々のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドによる、ＩｇＧ２の切断についての、代表的な滴定曲線を示す。

【図9】図９は、ＩｇＧと、本発明のポリペプチド又はコントロールとのインキュベーションによって生成された切断産物を可視化するために用いられた、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【図10】図１０は、ＩｇＧと、本発明のポリペプチド又はコントロールとのインキュベーションによって生成された切断産物を可視化するために用いられた、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【図11】図１１は、ＩＶＩｇと、本発明のポリペプチド又はコントロールとのインキュベーションによって生成された切断産物を可視化するために用いられた、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【図12】図１２は、ＩＶＩｇと、本発明のポリペプチド又はコントロールとのインキュベーションによって生成された切断産物を可視化するために用いられた、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。

【図13】図１３ 本発明のポリペプチドによる、免疫グロブリン切断の模式図。

【図14】図１４は、代表的な、ＡＤＡ結合部位と本発明のポリペプチド又はコントロールとの競合（％）の結果を示す。

【図15】図１５は、代表的な、ＡＤＡ結合部位と本発明のポリペプチド又はコントロールとの更なる競合（％）の結果を示す。

【図16】図１６は、インビボでのヒトＩｇＧの切断において、本発明のポリペプチドの有効性を測定するために用いられた、代表的な有効性ＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図17】図１７は、本発明のポリペプチドによって、インビボで生成されたＩｇＧ切断産物を可視化するための、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を含むＩｄｅＳの全配列である。ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１０９２２１６０．１としても開示されている。
配列番号２は、Ｎ末端メチオニン及びシグナル配列を欠く、ＩｄｅＳの成熟配列である。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＤＦ１３９４９．１としても開示されている。
配列番号３〜１６は、本発明の例示的なポリペプチドの配列である
配列番号１７は、本明細書でコントロールとして用いられるＩｄｅＳポリペプチドの配列である。追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを伴う、配列番号２の配列（内部標準のｐＣＡＲＴ１２４）を含む。
配列番号１８は、配列番号１の３３６位〜３３９位に対応する連続配列ＮＱＴＮである。
配列番号１９は、配列番号１の３０位〜４９位に対応する連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲ ＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴである。
配列番号２０〜３４は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
配列番号３５は、配列番号１の３１位〜４９位に対応する配列ＳＦＳＡＮＱＥＩＲＹ ＳＥＶＴＰＹＨＶＴである。
配列番号３６は、ＩｄｅＺポリペプチド（ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１）の３６位〜５４位に対応する配列ＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹ ＡＫＥＶＰＨＱＩＴである。
配列番号３７は、本発明のポリペプチドのＮ末端に存在し得る配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡ ＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴである。

【0018】

発明の詳細な説明
開示された生成物及び方法の異なる用途は、当該技術分野の特定のニーズに合わせて調整され得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、本発明の特定の実施形態を説明するためのみのものであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。

【0019】

更に、本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容が特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリペプチド」への言及は、「ポリペプチド（複数）」を含む、などとなる。

【0020】

「ポリペプチド」は、本明細書においては、その最も広い意味において、２つ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、又は他のペプチド模倣体の化合物を指すために用いられる。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列、また並びにより長いポリペプチド及びタンパク質を含む。本明細書で用いられる場合、用語「アミノ酸」は、Ｄ又はＬの光学異性体の両方、並びにアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む、天然及び／若しくは非天然又は合成のアミノ酸のいずれかを指す。

【0021】

用語「患者」及び「被験体」は交換可能に用いられ、典型的には、ヒトを指す。ＩｇＧへの言及は、特に断らない限り、典型的にはヒトＩｇＧを指す。

【0022】

本明細書で引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記のものか下記のものかにかかわらず、参照によりその全体が、本明細書に組み込まれる。

【0023】

ポリペプチドの機能的特徴
本発明は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有する新規ポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ＩｇＧの切断において、ＩｄｅＳよりも有効であり、及び／又はＩｄｅＳよりも免疫原性が低い。本発明のポリペプチドに対するコントロール又は比較の関係において、「ＩｄｅＳ」は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドを指す。代替的に、又は追加的に、コントロール又は比較として用いられる場合、「ＩｄｅＳ」は、標準的な細菌発現系における発現及びそれからの単離を促進するために、付加的な、メチオニン（Ｍ）残基をＮ末端に、及び／又はタグをＣ末端に伴う、配列番号２のアミノ酸配列（ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ）を含むポリペプチドを指し得る。好適なタグとしては、ポリペプチドのＣ末端に直接連結され得るか、又は３つ、４つ又は５つのグリシン残基等の任意の好適なリンカー配列によって間接的に連結され得るヒスチジンタグが挙げられる。ヒスチジンタグは、典型的には６つのヒスチジン残基からなるが、これよりも長く、典型的には、最大７つ、８つ、９つ、１０個又は２０個のアミノ酸で、又はこれよりも短く、例えば５つ、４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸であり得る。本明細書で用いられる例示的なＩｄｅＳポリペプチドの配列は、配列番号１４として示されているコントロールである（ｉｓ ａ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａｓ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）。このポリペプチドは、追加のＮ末端メチオニン及びヒスチジンタグを有する配列番号２の配列を含み、本明細書ではｐＣＡＲＴ１２４と言われる場合がある。

【0024】

ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性は、任意の好適な方法によって、例えば、ポリペプチドを、ＩｇＧを含有する試料とインキュベーションし、ＩｇＧ切断産物の存在を判断することによって評価され得る。有効性は、中和抗体等の阻害剤の存在下又は非存在下で評価され得る。しかしながら、本明細書における有効性は、特に断らない限り、通常、かかる阻害剤の非存在下で評価される有効性を意味する。好適な方法は実施例に記載されている。ＩｇＧの切断におけるポリペプチドの有効性は、本明細書において、ポリペプチドの「効力」と言われる場合がある。本発明のポリペプチドの効力は、典型的には、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの効力より、少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、６．０倍、７．０倍又は７．５倍大きい。本発明のポリペプチドの効力は、好ましくは、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの効力より少なくとも４．５倍、より好ましくは少なくとも６．０倍、最も好ましくは少なくとも７．５倍大きい。ＩｄｅＳと比較した、効力の増加は、ＩｄｅＳの免疫原性に関する問題を問わず、望ましい向上である。しかしながら、かかる効力の増加により、典型的には、より高い用量のＩｄｅＳと同じ治療効果を目的として、より低い用量の本発明のポリペプチドの使用も可能となる。該より低い用量により、ＩｄｅＳと比較して、本発明のポリペプチドの、より多くの反復投与も可能になり得る。これは、より低い用量の使用では、免疫系が、より低い濃度で存在する薬剤に応答する可能性が低く、又はそれほど激しく応答しないため、治療剤の、免疫原性に関連する問題を軽減するからである。従って、本発明のポリペプチドは、同等の用量で存在する場合、ＩｄｅＳと同等の免疫原性であるか、又はＩｄｅＳよりも更に免疫原性が高い場合があるが、同じ治療効果を達成するために必要となるのはより低い用量であるため、免疫原性に関するこの問題は軽減されるか、又は回避される。代替的な実施形態においては、本発明のポリペプチドは、同等の用量で存在する場合、ＩｄｅＳよりも免疫原性が低いという条件で、ＩｄｅＳと同等の効力を有し得る。

【0025】

ポリペプチドの効力を評価するためのアッセイである、ＩｇＧの切断における、ポリペプチドの有効性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で周知であり、任意の好適なアッセイが用いられ得る。好適なアッセイとしては、実施例に記載されるもの等の、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイが挙げられる。かかるアッセイにおいて、アッセイプレートのウェルは、典型的には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の抗体標的でコーティングされる。本実施例では、次いで、試験するポリペプチドの試料がウェルに加えられ、続いてＢＳＡに特異的な標的特異的抗体の試料が加えられる。ポリペプチド及び抗体が、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に好適な条件下で相互作用させられる。好適な間隔の後、アッセイプレートが洗浄され、標的特異的抗体に特異的に結合する検出抗体が、標的特異的抗体への結合に好適な条件下で加えられる。検出抗体は、各ウェル中で標的に結合している、任意の無傷標的特異的抗体に結合する。洗浄後、ウェル中に存在する検出抗体の量は、そのウェルに結合した標的特異的抗体の量に比例する。検出抗体は、標識又は別のレポーター系（酵素等）に直接的又は間接的に結合され得、各ウェル中に残っている検出抗体の量が決定され得る。ウェル中に存在した、試験したポリペプチドの効力が高いほど、残存する無傷標的特異的抗体は少なく、従って検出抗体が少なくなる。典型的には、試験したポリペプチドの効力が、ＩｄｅＳの効力と直接比較され得るように、ある特定のアッセイプレート上の少なくとも１つのウェルは、試験するポリペプチドの代わりにＩｄｅＳを含む。本発明のポリペプチドは、ＩｇＧ２よりも、ＩｇＧ１の切断において効果的であり得る。

【0026】

他のアッセイは、試験したポリペプチドによるＩｇＧの切断から生じるＩｇＧの断片を、直接可視化及び／又は定量することによって、試験したポリペプチドの効力を決定し得る。このタイプのアッセイも、実施例に記載されている。かかるアッセイでは、典型的には、ＩｇＧの試料が、滴定シリーズにおける種々の濃度の試験ポリペプチドと（又はコントロールとしてＩｄｅＳと）インキュベーションされる。次いで、各濃度でのインキュベーションから生じる生成物が、ゲル電気泳動を用いて、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分離される。次いで、ＩｇＧ全体及びＩｇＧの切断から生じる断片が、サイズによって同定され得、好適な色素による染色強度によって定量化され得る。切断断片の量が多いほど、ある特定の濃度で試験したポリペプチドの効力は大きい。本発明のポリペプチドは、典型的には、ＩｄｅＳよりも低い濃度（滴定シリーズにおける、より低いポイント（ｐｏｉｎｔ））で、検出可能な量の切断断片を生成する。各切断イベントから生じる、種々の断片の量も決定され得るので、このタイプのアッセイは、ＩｇＧ分子の第１又は第２の重鎖の切断において、より有効である試験ポリペプチドの同定も可能にし得る。

【0027】

このタイプのアッセイは、また、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの存在が本発明のポリペプチドの効力を低下させ得る程度を決定するために、適合され得る。適合されたアッセイにおいては、ＩｇＧの試料を試験ポリペプチドと（又はコントロールとしてのＩｄｅＳと）インキュベーションする際に、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを含有する血清又はＩＶＩｇ調製物が、反応溶媒と共に含められる。好ましくは、本発明のポリペプチドの効力は、ＡＤＡの存在によって影響されないか、又は同じアッセイにおいて、ＩｄｅＳの効力よりも、ＡＤＡの存在によってあまり減少しない。言い換えれば、好ましくは、本発明のポリペプチドに対するＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの中和効果は、同じアッセイで測定される、ＩｄｅＳに対する、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡの中和効果と同じか、又はそれより低い。

【0028】

上記の通り、本発明のポリペプチドは、同等の用量で存在する場合、免疫原性がＩｄｅＳと同等であるか、又はＩｄｅＳよりも免疫原性が更に高い場合がある。同じ治療効果を達成するために必要となる本発明のポリペプチドはより低い用量であるため、免疫原性に関するこの問題が軽減されるか、又は回避されるからである。しかしながら、典型的には、本発明のポリペプチドは、免疫原性がＩｄｅＳ以下であり、好ましくは、免疫原性がＩｄｅＳよりも低い。即ち、本発明のポリペプチドは、同等の用量又は濃度で存在し、同じアッセイで測定される場合、ＩｄｅＳと同じか、又は好ましくはより低い免疫応答をもたらし得る。本発明のポリペプチドの免疫原性は、典型的には、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの免疫原性の、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である。好ましくは、本発明のポリペプチドの免疫原性は、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの免疫原性の８５％以下である。より好ましくは、本発明のポリペプチドの免疫原性は、同じアッセイで測定したＩｄｅＳの免疫原性の７０％以下である。

【0029】

ポリペプチドの免疫原性を評価するためのアッセイは、当該技術分野で公知であり、任意の好適なアッセイが用いられ得る。ポリペプチドの免疫原性を、ＩｄｅＳの免疫原性と比較して評価するための好ましいアッセイは、ＩｄｅＳに特異的なＡＤＡが、本発明のポリペプチドにも結合する程度を評価することを含む。このタイプのアッセイは実施例に記載されている。

【0030】

かかるアッセイの１つは、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡへの結合についての、ＩｄｅＳと試験ポリペプチドとの間の競合についての試験を含む。典型的には、アッセイプレートのウェルがＩｄｅＳでコーティングされ、続いて、プレインキュベーションされた、ＩｄｅＳ特異的ＡＤＡを含有する溶液（例、ＩＶＩｇ調製物）、及び試験ポリペプチド（又はコントロールとしてのＩｄｅＳ）の混合物が投与される。プレインキュベーションは、タンパク質とＡＤＡとの間の高親和性結合のみが可能となるように、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性の阻害剤、例、ヨード酢酸（ｉｏｄｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＩＨＡｃ）の存在下、及び高塩濃度で行われる。プレインキュベーションした混合物は、ＩｄｅＳでコーティングしたウェルと相互作用させられる。試験ポリペプチドに結合していないＩｄｅＳ特異的ＡＤＡは、いずれも、ウェル上のＩｄｅＳに結合する。好適な間隔の後、アッセイプレートが洗浄され、ＩｇＧに特異的に結合する検出抗体が、結合に好適な条件下で加えられる。検出抗体は、各ウェル中の、ＩｄｅＳに結合した任意のＡＤＡに結合する。洗浄後、ウェル中に存在する検出抗体の量は、試験ポリペプチドに結合していたＡＤＡの量に反比例する。検出抗体は、各ウェル中に残存する検出抗体の量が決定され得るように、標識又は別のレポーター系（酵素等）に直接的又は間接的に結合され得る。典型的には、ＡＤＡの、試験したポリペプチドへの結合を、ＩｄｅＳへの結合と直接的に比較し得るように、ある特定のアッセイプレート上の少なくとも１つのウェルで、試験するポリペプチドの代わりに、プレインキュベーションした、ＩＶＩｇ及びＩｄｅＳの混合物が試験される。

【0031】

別の好適なアッセイは、種々の濃度のＩｄｅＳ特異的ＡＤＡ、例、ＩＶＩｇ調製物の滴定シリーズが、試験ポリペプチドに結合する程度を、ＩｄｅＳと比較して、試験することを含む。好ましくは、本発明のポリペプチドは、結合が検出可能となるためには、ＩｄｅＳへの結合が検出可能なＡＤＡ濃度と比べて、より高濃度のＡＤＡが必要となる。かかるアッセイは、実施例に記載されている。かかるアッセイは、典型的には、アッセイプレートのウェルを試験ポリペプチド又はＩｄｅＳでコーティングすること、続いて各ウェルを滴定シリーズからの種々の濃度のＩｄｅＳ特異的ＡＤＡとインキュベーションすることを含む。インキュベーションは、タンパク質とＡＤＡとの間の高親和性結合のみが可能になるように、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性の阻害剤、例、ヨード酢酸（ＩＨＡｃ）の存在下、及び高塩濃度で行われる。好適な間隔の後、アッセイプレートが洗浄され、ＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２に特異的に結合する検出抗体が、結合に好適な条件下で加えられる。検出抗体は、各ウェル中の試験ポリペプチド又はＩｄｅＳに結合した任意のＡＤＡに結合する。洗浄後、ウェルに存在する検出抗体の量は、試験ポリペプチド又はＩｄｅＳに結合したＡＤＡの量に正比例する。各ウェルに残っている検出抗体の量が決定され得るように、検出抗体は、標識又は別のレポーター系（酵素等）に直接的又は間接的に結合され得る。ある特定のアッセイプレートにおける少なくとも１つのウェルが、ブランクとしての、ＡＤＡを欠く緩衝液とインキュベーションされ、試験ウェルにおける結合の検出のための閾値レベルが設定される。

【0032】

ポリペプチドの構造的特徴
本節は、前節で概説した機能的特徴に付加的に生かされる（ａｐｐｌｙ ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ）、本発明のポリペプチドの構造的特徴を示す。

【0033】

本発明のポリペプチドは、典型的には、長さが、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０又は３００アミノ酸である。本発明のポリペプチドは、典型的には、長さが４００、３５０、３４０、３３０、３２０又は３１０アミノ酸以下である。上に列挙した下限のいずれかが、上に列挙した上限のいずれかと組み合わされて、本発明のポリペプチドの長さについての範囲が提供され得ることが理解される。例えば、ポリペプチドは、長さが１００〜４００アミノ酸、又は長さが２５０〜３５０アミノ酸であり得る。ポリペプチドは、好ましくは、長さが２９０〜３２０アミノ酸、最も好ましくは、長さが３００〜３１０アミノ酸である。

【0034】

本発明のポリペプチドの一次構造（アミノ酸配列）は、ＩｄｅＳの一次構造に、具体的には配列番号２のアミノ酸配列に基づく。本発明のポリペプチドの配列は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一である、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含む。変異体配列は、配列番号２の配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であり得る。変異体は、本明細書で同定された１つ以上の特定の改変を含むことを除いて、配列番号２の配列と同一であり得る。配列番号２の配列に対する同一性は、配列番号２に示される配列の少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個又はそれ以上の連続したアミノ酸の領域にわたって、又はより好ましくは配列番号２の全長にわたって測定され得る。

【0035】

アミノ酸の同一性は、任意の好適なアルゴリズムを用いて算出され得る。例えば、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−１０に記載の通り、（典型的にはそれらの初期設定で）相同性を算出し、又は配列を整列する（ｌｉｎｅ ｕｐ）（均等又は対応する配列を同定する等）ために使用され得る。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードとアライメントされた場合に、ある正の値の（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ）閾値スコアＴに一致するか、又はこれを満たすかのいずれかの、クエリ配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）中の長さＷの短いワードを同定することにより、最初に、スコアの高い配列ペア（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒ，ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、上記）。これらの最初の近傍ワードのヒットは、それらを含有するＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして機能する。累積アライメントスコア（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）が増加し得る限り、該ワードヒットが、各配列に沿って両方向に伸長される。ワードヒットの各方向への伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアがその最大達成値（ｍａｘｉｍｕｍ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｖａｌｕｅ）から量Ｘだけ低下するとき；１以上の負のスコアの残基アライメント（ｒｅｓｉｄｕｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の累積に起因して累積スコアがゼロ以下になるとき；又はいずれかの配列の端部に到達するとき。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ，Ｔ及びＸは、アラインメントの感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。

【0036】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２配列間の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）の統計解析を行う（例、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１基準（ｍｅａｓｕｒｅ）は、ポリヌクレオチド又はアミノ酸の２配列間の一致が偶然に起こる確率の目安を提供する、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ，Ｐ（Ｎ））である。ある配列が、別の配列と類似であるとみなされるのは、例えば、第１の配列と第２の配列との比較において、最小合計確率が約１未満である場合、好ましくは約０．１未満である場合、より好ましくは約０．０１未満である場合、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合である。或いは、ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、その初期設定で用いられる）を提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７−３９５）。

【0037】

本発明のポリペプチドの配列は、アミノ酸の付加、欠失又は置換等の改変が、配列番号２の配列に対してなされる、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含む。特に明記しない限り、改変は、好ましくは保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性又は類似の側鎖の嵩の、他のアミノ酸で置換する。導入されるアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸に類似の極性、親水性、疎水性、塩基性度、酸性度、中性度又は電荷を有し得る。或いは、保存的置換は、前から存在する芳香族又は脂肪族のアミノ酸の代わりに芳香族又は脂肪族である別のアミノ酸を導入し得る。保存的なアミノ酸の変化は当該技術分野で周知であり、以下の表Ａ１に記載の通りの、２０の主要アミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が同様の極性を有する場合、これは、表Ａ２における、アミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによって決定され得る。

【0038】

【表1】

【0039】

【表2】

【0040】

本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含む。しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列における特定の残基は、好ましくは、前記変異体配列内に保持される。例えば、前記変異体配列は、典型的には、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性に必要とされることが知られている特定の残基を保持する。従って、配列番号１の９４位のシステインは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列中に保持されなければならない（配列番号２の６５番目の残基）。場合により、配列番号１の８４位のリシン、２６２位のヒスチジン、並びに２８４位及び２８６位のそれぞれのアスパラギン酸も保持される。これらは、それぞれ、配列番号２の５５番目、２３３番目、２５５番目及び２５７番目の残基である。従って、本発明のポリペプチドは、典型的には、配列番号１の９４位に対応する前記変異配列の位置にシステイン（Ｃ）を有する、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含み；且つ場合により、前記変異体配列中の、配列番号１の８４位、２６２位、２８４位及び２８６位に対応する位置に、それぞれ、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びアスパラギン酸（Ｄ）を有する；

【0041】

上記の構造上の制約から始めて、本発明者らは、ＩｄｅＳの三次元モデルを評価することにより、ＩｄｅＳの機能的特性を調節するための改変用に、特定の位置を同定した。本発明者らは以下のことを同定した：
（１）配列番号１の１３０位のアスパラギン（Ｎ）を、正に荷電したアミノ酸で置換することにより、この変化を組み込んだポリペプチドの効力が増強される。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号１の１３０位に対応する前記変異体中の位置に、正に荷電したアミノ酸を有する、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含み得る。一般的な、正に荷電したアミノ酸が上記の表Ａ１に同定されている。正に荷電したアミノ酸は、好ましくはアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）である。従って、この特定の改変は、本明細書では用語「Ｎ１３０Ｒ／Ｋ」によって同定され得る。
（２）配列番号１の１３１位のグリシン（Ｇ）を、正に荷電したアミノ酸で置換することにより、この変化を組み込んだポリペプチドの効力が増強される。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号１の１３１位に対応する前記変異体中の位置に正に荷電したアミノ酸を有する、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含み得る。一般的な、正に荷電したアミノ酸は、上記の表Ａ１に同定されている。正に荷電したアミノ酸は、好ましくはアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）である。従って、この特定の改変は、本明細書では用語「Ｇ１３１Ｒ／Ｋ」によって同定され得る。
（３）配列番号２のＣ末端の最後の４残基を欠失させることにより、この変化を組み込んだポリペプチドの効力が増強される。配列番号２のＣ末端の最後の４つの残基は、連続配列ＮＱＴＮからなる。従って、本発明のポリペプチドは、連続配列ＮＱＴＮを含まない、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含み得る。即ち、配列番号２のＣ末端の最後の４残基は、配列番号２の前記変異体には存在しなくてもよい。配列番号２の最後の４残基は、配列番号１の３３６位〜３３９位に対応する。従って、この特定の改変は、本明細書中で用語「Ｎ３３６＿Ｎ３３９ｄｅｌ」によって同定され得る。
（４）配列番号２のＮ末端の最初の２０残基を欠失させる又は改変することは、効力に悪影響を及ぼすことなく、この変化を組み込むポリペプチドの効力を増強し得、及び／又は免疫原性を低下させ得る。配列番号２のＮ末端の最初の２０残基は、連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴ（配列番号１９）からなる。従って、本発明のポリペプチドは、連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴを含まない、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含み得る。
一例として、配列番号１９の前記連続配列は、その全体が欠失されていてもよい。すなわち、配列番号２のＮ末端の最初の２０残基は、配列番号２の前記変異体には存在しなくてもよい。配列番号２の最初の２０残基は、配列番号１の３０位〜４９位に対応する。従って、この連続した配列の欠失は、本明細書中で用語「Ｄ３０＿Ｔ４９ｄｅｌ」によって同定され得る。
或いは、本発明のポリペプチドは、配列番号２のＮ末端の最初の２０残基の配列が、前記最初の２０残基中の１以上のアミノ酸を置換することによって改変された、配列番号２のアミノ酸配列の変異体を含み得る。改変された配列は、好ましくは、配列番号２の最初の２０個のアミノ酸と比較して免疫原性が減少する。一例として、配列番号２の２位〜２０位のアミノ酸（配列番号１の３１位〜４９位に対応する）は、場合により、連続配列ＤＹＱＲＮＡＴＥＡＹ ＡＫＥＶＰＨＱＩＴ（配列番号３６）で置換され得る。換言すれば、本発明のポリペプチドの最初の２０個のアミノ酸は、配列番号１９の配列の代わりに、配列ＤＤＹＱＲＮＡＴＥＡ ＹＡＫＥＶＰＨＱＩＴ（配列番号３７）からなり得る。挿入された配列である配列番号３６は、ＩｄｅＺのＮ末端領域からとられており、ＮＣＢＩ参照配列番号ＷＰ＿０１４６２２７８０．１のＩｄｅＺの３６位〜５４位に対応する。ヒト被験体は、典型的には、ＩｄｅＺに対する抗体を発現しないので、この配列を含むポリペプチドにはＡＤＡは作用しにくい。本明細書において、配列番号３５の、配列番号３７との置換は、用語「Ｓ３１＿Ｔ４９ｒｅｐｌＺ」によって同定され得る。

【0042】

従って、まとめると、本発明のポリペプチドは、配列番号２の配列の変異体を含み、該変異体は：
（ａ）配列番号２に対して少なくとも５０％同一であり；
（ｂ）前記変異体配列中の、配列番号１の９４位に対応する位置にシステイン（Ｃ）を有し；及び場合により
（ｃ）前記変異体配列中の、配列番号１の８４位、２６２位、２８４位及び２８６位に対応する位置に、それぞれ、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン酸（Ｄ）及びアスパラギン酸（Ｄ）を有する；
好ましくは、配列番号２の前記変異体は：
（１）前記変異体中の、配列番号１の１３０位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）であり；及び／又は
（２）前記変異体中の、配列番号１の１３１位に対応する位置に、正に荷電したアミノ酸を有し、場合により、前記正に荷電したアミノ酸がアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）であり；及び／又は
（３）連続配列ＮＱＴＮを含まず；及び／又は
（４）連続配列ＤＳＦＳＡＮＱＥＩＲ ＹＳＥＶＴＰＹＨＶＴを含まない。

【0043】

配列番号２の前記変異体は、上記の（１）〜（４）の改変の１つ、２つ、３つ又は４つ全てを含み得る。前記変異体は、上記の（１）〜（４）の改変の２つ又は３つの任意の組み合わせを含み得る。好ましい変異体は、改変（３）並びに改変（１）及び（２）の少なくとも１つを含む。他の好ましい変異体は、改変（３）及び（４）、並びに改変（１）及び（２）の少なくとも１方を含む。

【0044】

本発明者らは、上記の改変（１）〜（４）の任意の組み合わせに代えて、又はそれに加えて適用され得る、配列番号２の配列に対する特定の他の改変が、本発明のポリペプチド効力を増大させ、及び／又はＩｄｅＳ特異的ＡＤＡによる本発明のポリペプチドの認識を低下させ得ることも究明した。従って、本発明のポリペプチドは、置換が、配列番号１の１１５位、１１９位、１３９位、１４２位、１９８位、２１６位、２２６位、２４１位、２４５位、３０２位、３１６位及び３３３位に対応する位置の１以上でなされる、配列番号２の配列の変異体を含み得る。前記変異体は、これらの位置の全てにおいて置換を含み得るが、典型的には、これらの位置の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つにおける置換を含む。これらの位置における置換は、典型的には、存在するアミノ酸を、種々の特性を有する別のアミノ酸で置換する。例えば、荷電していないアミノ酸は、荷電したアミノ酸で置換され得、逆もまた同様である。これらの位置における好ましい置換は、以下の表Ｂに１文字コードを用いて記載されている：

【0045】

【表3】

【0046】

表Ｂ中の置換の各々は、各行ごとに、左から右へ、第１列、第２列及び第３列の項目を組み合わせることによって得られる用語を用いて、本明細書で言及され得る。例えば、第１行における置換は、本明細書では「Ｋ１１５Ｅ」と言われる場合があり、第２行における置換は「Ｅ１１９Ｒ」と言われる場合がある、という具合である。具体的な改変「Ｄ２２６Ｎ」は、配列番号１の２２４位〜２２６位の連続したＲＧＤ配列である、ＩｄｅＳの配列における既知の細胞接着モチーフを破壊することを意図している。

【0047】

以下の表Ｃに、本発明の特定の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列を製造するためになされた改変をまとめる。

【0048】

【表4】

【0049】

配列番号１及び２のアミノ酸配列を、以下に完全に再掲し、続いて表Ｃに記載した本発明の例示的ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【0050】

【化1-1】

【0051】

【化1-2】

【0052】

【化1-3】

【0053】

本発明のポリペプチドは、配列番号３〜１６のいずれか１つの配列を含み、それから実質的になり、又は、それからなり得る。配列番号３〜１６のそれぞれは、場合により、メチオニンをＮ末端に、及び／又は、ヒスチジンタグをＣ末端に、更に含み得る。ヒスチジンタグは、好ましくは６つのヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、３×グリシン残基又は５×グリシン残基のリンカーによって、Ｃ末端に連結される。配列番号１３については、ヒスチジンタグは、好ましくは５×グリシン残基のリンカーによって、Ｃ末端に連結される。

【0054】

ポリペプチドの製造
本明細書に開示される通りのポリペプチドは、任意の好適な手段によって製造され得る。例えば、ポリペプチドは、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学又は溶液相ペプチド合成等の、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて直接的に合成され得る。或いは、ポリペプチドは、細胞、典型的には細菌細胞を、前記ポリペプチドをコードする核酸分子又はベクターで形質転換することによって製造され得る。細菌宿主細胞における発現によるポリペプチドの製造は、以下に記載され、実施例に例示される。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子及びベクターを提供する。本発明は、かかる核酸又はベクターを含む宿主細胞も提供する。本明細書に開示されるポリペプチドをコードする、例示的なポリヌクレオチド分子は、配列番号２０〜３４として示される。これらの配列の各々は、３’末端にＮ末端メチオニンのコドン（ＡＴＧ）を含み、５’末端の終止コドン（ＴＡＡ）の前に、３×グリシンのリンカー及び６×ｈｉｓのヒスチジンタグのコドンを含み、それらは場合により除去され得る。

【0055】

用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では交換可能に用いられ、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか又はそれらの類似体）のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ及びプライマーが挙げられる。本発明のポリヌクレオチドは、単離又は実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されるとは、周囲の任意の培地から、ポリペプチドが実質的に単離されているが完全ではない場合があることを意味する。ポリヌクレオチドは、それらの意図される使用を妨げない担体又は希釈剤と混合され得、依然として実質的に単離されているとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードする」核酸配列は、適切な調節配列の制御下（例えば、発現ベクター中）に置かれた場合に、インビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。本発明の目的のためには、かかる核酸配列としては、ウイルス、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、更には合成ＤＮＡ配列が挙げられ得るが、これらに限定されない。転写終結配列が、コード配列の３’に位置し得る。

【0056】

ポリヌクレオチドは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ （１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）における例に記載されている通りの、当該技術分野で周知の方法に従って合成され得る。本発明の核酸分子は、挿入された配列に作動可能に連結された制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得、従ってインビボでの本発明のポリペプチドの発現を可能にする。これらの発現カセットは、典型的には、次にベクター（例、プラスミド又は組換えウイルスベクター）内に提供される。かかる発現カセットは、宿主被験体に直接的に投与され得る。或いは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが、宿主被験体に投与され得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、遺伝子ベクターを用いて調製及び／又は投与される。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を運搬することができ、本発明のポリペプチドを発現させることができる、任意のベクターであり得る。

【0057】

従って、本発明は、かかるポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。かかる発現ベクターは、分子生物学の分野において日常的に構築されており、本発明のペプチドの発現を可能にするために、例えばプラスミドＤＮＡ及び適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサー及び他のエレメント、例えば必要であり得るポリアデニル化シグナル等の使用を含み得、これらは適正な方向性で配置される。他の好適なベクターは、当業者には明らかである。これに関する更なる例として、我々は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを引用する。

【0058】

本発明は、本発明のポリペプチドを発現するように改変された細胞も含む。かかる細胞としては、典型的には、細菌細胞、例えばＥ．コリ、等の原核細胞が挙げられる。かかる細胞は、本発明のポリペプチドを製造するための通常の方法を用いて培養され得る。

【0059】

ポリペプチドは、それらの製造、単離又は精製を促進するために、誘導体化又は修飾され得る。例えば、細菌宿主細胞における組換え発現によって、本発明のポリペプチドが製造される場合、ポリペプチドの配列は、発現を向上させるために、Ｎ末端に更なるメチオニン（Ｍ）残基を含み得る。別の例として、本発明のポリペプチドは、分離手段に直接且つ特異的に結合できるリガンドの付加によって誘導体化又は修飾され得る。或いは、ポリペプチドは、結合対の一方のメンバーの付加によって誘導体化又は修飾され得、分離手段は、結合対の他方のメンバーの付加によって誘導体化又は修飾される試薬を含む。任意の好適な結合対が用いられ得る。本発明において使用するためのポリペプチドが、結合対の一方のメンバーの付加によって誘導体化又は修飾される好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、好ましくはヒスチジンタグ付き又はビオチンタグ付きである。典型的には、ヒスチジン又はビオチンのタグのアミノ酸コード配列が、遺伝子レベルで含められ、ポリペプチドはＥ．コリで組換え発現する。ヒスチジン又はビオチンのタグは、典型的には、ポリペプチドのいずれかの末端に、好ましくはＣ末端に存在する。それは、ポリペプチドに直接的に連結されてもよく、３つ、４つ又は５つのグリシン残基等の任意の好適なリンカー配列によって間接的に連結されてもよい。ヒスチジンタグは、典型的には６つのヒスチジン残基からなるが、これよりも長く、典型的には、最大７つ、８つ、９つ、１０個又は２０個のアミノ酸又はこれよりも短く、例えば５つ、４つ、３つ、２つ又は１つのアミノ酸であり得る。

【0060】

ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば安定性を高めるために、天然に存在しないアミノ酸を含むように改変され得る。ポリペプチドが合成手段によって製造される場合、かかるアミノ酸は製造中に導入され得る。ポリペプチドは、また、合成又は組換えでの製造のいずれかに続けて改変され得る。ポリペプチドは、また、Ｄ−アミノ酸を用いて製造され得る。かかる場合、アミノ酸は、ＣからＮの向きで逆の順序で連結される。これは、かかるポリペプチドを製造するための技術分野において慣用的である。

【0061】

当該技術分野においては、多くの側鎖修飾が知られており、ポリペプチドが、本明細書で特定され得る通りの、更に必要とされる任意の活性又は特性を保持することを条件として、ポリペプチドの側鎖に対してなされ得る。ポリペプチドは、化学的に修飾（例、翻訳後修飾）され得ることも理解される。例えば、それらはグリコシル化、リン酸化され得、又は修飾アミノ酸残基を含み得る。

【0062】

ポリペプチドは、ＰＥＧ化されていてもよい。本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。それは、意図される使用を妨げない担体又は希釈剤と混合され得、依然として実質的に単離されているとみなされ得る。また、それは、実質的に精製された形態であり得、その場合、一般に、少なくとも９０％、例、少なくとも９５％、９８％又は９９％のタンパク質を、標品中に含む。

【0063】

ポリペプチドを含む組成物及び製剤
別の態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含む組成物を提供する。例えば、本発明は、本発明の１以上のポリペプチド及び少なくとも１つの医薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む組成物を提供する。担体（複数可）は、組成物の他の成分と適合し、組成物が投与される被験体に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。典型的には、担体及び最終組成物は、無菌で、発熱物質（ｐｙｒｏｇｅｎ）フリーである。

【0064】

好適な組成物の製剤化は、全てが、当業者に容易に利用可能である、標準的な医薬処方化学及び方法論を用いて行われ得る。例えば、薬剤は、１以上の医薬的に許容可能な賦形剤又はビヒクルと組み合わせられ得る。湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、還元剤等の補助物質が、賦形剤又はビヒクル中に存在し得る。好適な還元剤としては、システイン、チオグリセロール、チオレデューシン（ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｉｎ）、グルタチオン等が挙げられる。賦形剤、ビヒクル及び補助物質は、一般に、組成物を受容する個体において免疫応答を誘導せず、過度の毒性を伴わずに投与され得る医薬品である。医薬的に許容可能な賦形剤としては、水、生理食塩水、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、グリセロール、チオグリセロール及びエタノール等の液体が挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容可能な塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の鉱酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩も、それに含められ得る。医薬的に許容可能な賦形剤、ビヒクル及び補助物質の詳細な検討は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。

【0065】

かかる組成物は、ボーラス投与又は連続的投与に好適な形態で調製、包装又は販売され得る。注射用組成物は、アンプル等で、単位投与形態で、又は保存剤を含有する複数用量容器で、調製、包装又は販売され得る。組成物としては、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中の乳液、ペースト、及び埋め込み可能な徐放性又は生分解性製剤が挙げられるが、これらに限定されない。かかる組成物は、懸濁化剤、安定化剤又は分散剤が挙げられるが、これらに限定されない１以上の追加の成分を更に含み得る。非経口投与用組成物の一実施形態においては、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、滅菌の発熱物質フリーの水）で再構成するために、乾燥形態（例えば、粉末又は顆粒）で提供され、後に再構成された組成物が非経口投与される。組成物は、滅菌注射用の、水性又は油性の懸濁液又は溶液の形態で調製、包装又は販売され得る。この懸濁液又は溶液は、公知技術に従って製剤化され得、有効成分に加えて、本明細書に記載の分散剤、湿潤剤又は懸濁化剤等の追加成分を含み得る。かかる滅菌注射用製剤は、例えば、水又は１，３−ブタンジオール等の、非毒性の、非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒を用いて調製され得る。他の許容可能な希釈剤及び溶媒としては、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、及び合成モノ又はジグリセリド等の固定油が挙げられるが、これらに限定されない。

【0066】

非経口投与可能な、他の有用な組成物としては、有効成分を、微結晶形態で、リポソーム調製物で、又は生分解性ポリマー系の成分として、含むものが挙げられる。持続的な放出又は埋め込みのための組成物は、乳液、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー又は難溶性塩等の、医薬的に許容可能なポリマー又は疎水性材料を含み得る。組成物は、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内又は他の適切な投与経路を含む、任意の好適な経路による投与に好適であり得る。好ましい組成物は、静脈内注入による投与に好適である。

【0067】

ポリペプチドの使用方法
本発明は、種々の方法における本発明のポリペプチドの使用を提供する。例えば、本発明のポリペプチドは、バイオテクノロジーに有用なツールを提供し得る。ポリペプチドは、ＩｇＧ、特にヒトＩｇＧの特異的なエクスビボ切断のために用いられ得る。かかる方法においては、ポリペプチドは、特異的システインプロテアーゼ活性を生じさせる条件下で、ＩｇＧを含有する試料とインキュベーションされ得る。国際公開第２００３０５１９１４号及び国際公開第２００９０３３６７０号に記載されたもの等の、任意の好適な方法を用いて、特定の切断が確認され得、切断産物が単離され得る。従って、該方法は、特に、Ｆｃ及びＦ（ａｂ’）_２の断片を生成するために用いられ得る。次いで、本発明のポリペプチドによるＩｇＧの切断から生じるＦ（ａｂ’）_２断片に対する（例えば、２−メルカプトエタノールアミン又はシステアミンで）還元工程を実施することによって、Ｆａｂ断片が製造され得る。

【0068】

該方法は、また、試料中のＩｇＧを検出若しくは解析するため、又は試料からＩｇＧを除去するために用いられ得る。試料中のＩｇＧを検出するための方法は、典型的には、ＩｇＧ特異的結合及び切断を可能にする条件下で、ポリペプチドを、試料とインキュベーションすることを含む。ＩｇＧの存在は、特異的ＩｇＧ切断産物の検出によって確認され得、それがその後解析され得る。

【0069】

本発明によるポリペプチドはまた、治療又は予防において用いられ得る。治療的適用においては、ポリペプチド又は組成物は、既に疾患又は状態に罹患している被験体に、状態又はその１以上の症状を治癒、緩和又は部分的に食い止めるのに十分な量で、投与される。かかる治療的処置は、疾患の症状の重症度の低下、又は症状のない期間の頻度若しくは持続の増加をもたらし得る。これを達成するのに十分な量は、「治療有効量」と定義される。予防的適用においては、ポリペプチド又は組成物は、症状の発症を予防又は遅延させるのに十分な量で、疾患又は状態の症状をまだ示さない被験体に投与される。かかる量は、「予防有効量」と定義される。被験体は、任意の好適な手段によって、疾患又は状態を発症する危険性があると同定されている場合がある。従って、本発明は、ヒト又は動物の身体の治療において使用するための、本発明のポリペプチドも提供する。被験体における疾患又は状態の予防方法又は治療方法であって、本発明のポリペプチドを、被験体に、予防有効量又は治療有効量で投与することを含む、方法も、本明細書において提供される。ポリペプチドは、免疫抑制剤と共投与され得る。ポリペプチドは、好ましくは、静脈内注入によって投与されるが、例えば、皮内、皮下、経皮、筋肉内、動脈内、腹腔内、関節内、骨内又は他の適切な投与経路を含む任意の好適な経路によって投与され得る。投与される前記ポリペプチドの量は、約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５ｍｇ／ｋｇ体重の下限を有し得る。投与される前記ポリペプチドの量は、約０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０ｍｇ／ｋｇ体重の上限を有し得る。上記の上限のいずれかと上記の下限のいずれかが組み合わせられて、投与される用量の範囲が提供され得ることが理解される。例えば、投与される前記ポリペプチドの量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜２ｍｇ／ｋｇ体重、０．１０〜１ｍｇ／ｋｇ体重、また好ましくは０．２５ｍｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ポリペプチドは、ポリペプチドに結合することができる、被験体血清中のＡＤＡの量が、臨床医によって決定された閾値を超えなければ、同一被験体に対して、複数時に投与され得る。ポリペプチドに結合することができる、被験体血清中のＡＤＡの量は、薬剤特異的ＣＡＰ ＦＥＩＡ（ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ）試験又は力価アッセイ等の任意の好適な方法によって決定され得る。

【0070】

本発明のポリペプチドは、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態の治療又は予防に特に有用であり得る。従って、本発明は、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態の治療又は予防において使用するための、本発明のポリペプチドを提供する。本発明は、個体に、本発明のポリペプチドを投与することを含む、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防する方法も提供する。該方法は、前記ポリペプチドの反復投与を含み得る。本発明は、病原性ＩｇＧ抗体によって媒介される疾患又は状態を治療又は予防するための医薬の製造において使用するための、本発明のポリペプチドも提供する。

【0071】

病原性抗体は、典型的には、抗体によって全体的又は部分的に媒介される、自己免疫疾患又は他の状態において標的とされる抗原に特異的であり得る。表Ｄは、かかる疾患及び関連する抗原のリストを示す。本発明のポリペプチドは、これらの疾患又は状態のいずれかを治療するために用いられ得る。該ポリペプチドは、病原性ＩｇＧ抗体によって全体的又は部分的に媒介される自己免疫疾患の治療又は予防に特に有効である。

【0072】

【表5-1】

【0073】

【表5-2】

【0074】

【表5-3】

【0075】

【表5-4】

【0076】

別の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、治療又は治療剤の、被験体への利益を向上させる方法において用いられ得る。該方法は、本明細書では、工程（ａ）及び（ｂ）と呼ばれる２つの工程を含む。

【0077】

工程（ａ）は、被験体に、本発明のポリペプチドを投与することを含む。投与されるポリペプチドの量は、好ましくは、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分である。工程（ｂ）は、引き続いて、被験体に、前記治療を施すか、又は治療剤を投与することを含む。工程（ａ）及び（ｂ）は、好ましくは、被験体の血漿中に存在する実質的にすべてのＩｇＧ分子の切断が生じるのに十分な時間間隔で隔てられる。前記間隔は、典型的には、少なくとも３０分、また多くとも２１日であり得る。

【0078】

利益が向上する治療剤は、典型的には、がん又は別の疾患の治療のために投与される抗体である。治療剤は、ＩＶＩｇであり得る。本実施形態の文脈において、本発明は、代替的に、被験体におけるがん又は別の疾患を治療するための方法であって、（ａ）被験体に、本発明のポリペプチドを投与すること；及び（ｂ）その後、前記被験体に、治療有効量の抗体を投与すること（前記がん又は前記他の疾患の治療である）を含み；ここで：
− 投与される前記ポリペプチドの量は、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分である；及び
− 工程（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも２時間、また多くとも２１日の時間間隔で隔てられる
方法を提供するものとして記述され得る。

【0079】

言い換えれば、本発明は、がん又は他の疾患の治療のための、かかる方法において使用するためのポリペプチドも提供する。本発明は、かかる方法による、がん又は別の疾患を治療するための医薬の製造における、医薬の使用も提供する。がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星細胞腫（小児小脳又は小児大脳）、基底細胞がん、胆管がん（肝外）、膀胱がん、骨がん、骨肉腫／悪性線維性組織球腫、脳幹グリオーマ、脳がん、脳腫瘍（小脳星細胞腫）、脳腫瘍（大脳星細胞腫／悪性グリオーマ）、脳腫瘍（上衣腫）、脳腫瘍（髄芽腫）、脳腫瘍（テント上原始神経外胚葉性腫瘍）、脳腫瘍（視覚路及び視床下部グリオーマ）、乳がん、気管支アデノーマ／カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、カルチノイド腫瘍（消化管）、原発不明のがん腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、子宮頸がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイングファミリー腫瘍におけるユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、小児性、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん（眼球内黒色腫）、眼がん（網膜芽細胞腫）、胆嚢がん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ（ｓｔｏｍａｃｈ））がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍（頭蓋外、性腺外、又は卵巣）、妊娠性トロホブラスト腫瘍、脳幹のグリオーマ、グリオーマ（小児性大脳星細胞腫）、グリオーマ（小児性視覚路及び視床下部）、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、視床下部及び視覚路グリオーマ、眼球内黒色腫、島細胞がん（膵内分泌部）、カポジ肉腫、腎臓がん（腎細胞がん）、咽頭がん、白血病、白血病（急性リンパ芽球性）（急性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病（急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ））（急性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病とも呼ばれる）、白血病（慢性リンパ性）（慢性リンパ性白血病とも呼ばれる）、白血病（慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ））（慢性骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病とも呼ばれる）、白血病（有毛細胞）、口唇及び口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん（原発性）、肺がん（非小細胞）、肺がん（小細胞）、リンパ腫、リンパ腫（ＡＩＤＳ関連）、リンパ腫（バーキット）、リンパ腫（皮膚Ｔ細胞）、リンパ腫（ホジキン）、リンパ腫（非ホジキン）（ホジキンリンパ腫を除く全てのリンパ腫の古い分類）、リンパ腫（原発性中枢神経系）、マクログロブリン血症（ワルデンシュトレーム）、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、黒色腫（眼内（眼））、メルケル細胞がん、中皮腫（成人悪性）、中皮腫、原発不明を含む転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）白血病（慢性）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（成人急性）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）白血病（小児急性）、骨髄腫（多発性）（骨髄のがん）、骨髄増殖性疾患、鼻腔及び副鼻腔のがん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、口腔咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん（表層上皮・間質性腫瘍）、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓がん、膵臓がん（島細胞）、副鼻腔及び鼻腔のがん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体アデノーマ、形質細胞腫／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん（腎臓がん）（腎盂及び尿管）、移行上皮がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、ユーイングファミリー腫瘍、カポジ肉腫、肉腫（軟組織）、肉腫（子宮）、セザリー症候群、皮膚がん（非黒色腫性）、皮膚がん（黒色腫）、皮膚がん腫（メルケル細胞）、小細胞肺がん、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮細胞がん、原発不明を含む扁平上皮頸部がん（転移性）、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫（皮膚性）（菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照）、精巣がん、咽頭がん、胸腺腫、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、甲状腺がん、腎盂及び尿管の移行上皮がん、トロホブラスト腫瘍、尿管及び腎盂移行上皮がん、尿道がん、子宮がん（子宮内膜）、子宮肉腫、腟がん、視覚路及び視床下部のグリオーマ、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、並びにウィルムス腫瘍（腎臓がん）であり得る。

【0080】

がんは、好ましくは、前立腺がん、乳がん、膀胱がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、腎臓（腎臓細胞）がん、食道がん、甲状腺がん、皮膚がん、リンパ腫、黒色腫又は白血病である。

【0081】

工程（ｂ）において投与される抗体は、好ましくは、上記のがんのタイプの１つ以上に関連する腫瘍抗原に特異的である。該方法における使用のための抗体に関して、対象の標的としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＢ２、ＦＡＰ、ａｖインテグリン、メソセリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡ１Ｘ、５Ｔ４、α４β７インテグリン、Ｈｅｒ２が挙げられる。他の標的は、ＩＬ−１〜ＩＬ−１３のインターロイキン類、腫瘍壊死因子α及びβ、インターフェロンα、β及びγ、腫瘍増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）及び顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）等のサイトカインである。Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｂａｓｉｃ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｇｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ １９９１）を参照。他の標的は、ホルモン、酵素、及びアデニルシクラーゼ、グアニルシクラーゼ、及びホスホリパーゼＣ等の細胞内及び細胞間メッセンジャーである。対象の他の標的は、ＣＤ２０及びＣＤ３３等の白血球抗原である。薬物も対象の標的であり得る。標的分子は、ヒトの、哺乳動物の又は細菌のであり得る。他の標的は、微生物病原体（ウイルス性及び細菌性の両方）及び腫瘍由来のタンパク質、糖タンパク質及び炭水化物等の抗原である。更に他の標的は、米国特許第４，３６６，２４１号に記載されている。

【0082】

抗体は、直接的又は間接的に、細胞傷害性部分又は検出可能な標識に結合され得る。抗体は、当該技術分野で公知の、様々な方法のうちの１つ以上を用いて、１つ以上の投与経路を介して投与され得る。投与の経路及び／又は様式は、所望の結果に依存して変わる。抗体についての好ましい投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄又は他の非経口の、例えば注射又は注入による投与経路が挙げられる。語句「非経口投与」は、本明細書で用いられる場合、通常は、経腸及び局所投与以外の、注射による投与様式を意味する。或いは、抗体は、非経口でない経路（局所、表皮又は粘膜等の投与経路）を介して投与され得る。腫瘍周辺、腫瘍近傍（ｊｕｘｔａｔｕｍｏｒａｌ）、腫瘍内、病巣内、病巣周辺、腔内注入、膀胱内投与（ｉｎｔｒａｖｅｓｉｃｌｅ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、及び吸入を含む局所投与も好ましい。

【0083】

好適な、本発明の抗体の投与量は、熟練した医師により決定され得る。抗体の実際の投与量レベルは、患者に対して毒性がなく、特定の患者、組成及び投与様式に関して、所望の治療応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るように変化させられ得る。選択された投与量レベルは、使用される特定の抗体の活性、投与経路、投与時期、抗体の排出速度、治療の継続期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて用いられる他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、全般的な健康状態及び以前の病歴、並びに医学分野において周知の同様の要因を含む、様々な薬物動態学的因子に依存する。

【0084】

抗体の好適な用量は、例えば、治療される患者の体重１ｋｇあたり約０．１μｇ〜約１００ｍｇの範囲中であり得る。例えば、好適な投与量は、約１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日又は約１０μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重／日であり得る。

【0085】

投与計画は、所望の最適応答（例、治療応答）を提供するように調節され得る。例えば、単一のボーラスが投与され得、又は方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）及び（ｂ）の間の、必要な間隔を超えないという条件で、経時的に投与される分割用量をいくつか含み得るか、若しくは、治療状況の緊急適応があれば、用量が、比例的に減少又は増加され得る。投与の容易さ及び投与量の均一性のためには、非経口組成物を、単位投与形態で製剤化することが、特に好都合である。単位投与形態は、本明細書で用いられる場合、治療される被験体のための単位投与量として適した、物理的に別個の単位（各単位は、所望の治療効果を生じるように算出された所定量の活性化合物（必要とされる医薬的担体を伴う）を含有する）を指す。

【0086】

工程（ｂ）の抗体は、化学療法又は放射線療法と併用して投与され得る。該方法は、追加の抗がん抗体又は他の治療剤の投与を更に含み得、これは、単一の組成物で、又は併用療法の一部としての別個の組成物で、工程（ｂ）の抗体と共に投与され得る。例えば、工程（ｂ）の抗体は、他の薬剤の前に、その後に、又はそれと同時に、投与され得る。

【0087】

抗体は、アバゴボマブ（Ａｂａｇｏｖｏｍａｂ）、アブシキシマブ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）、アクトクスマブ（Ａｃｔｏｘｕｍａｂ）、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、アデカツムマブ（Ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）、アフェリモマブ（Ａｆｅｌｉｍｏｍａｂ）、アフツズマブ（Ａｆｕｔｕｚｕｍａｂ）、アラシズマブペゴール（Ａｌａｃｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ）、アリロクマブ（Ａｌｉｒｏｃｕｍａｂ）、アルツモマブペンテト酸（Ａｌｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）、アマツキシマブ（Ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）、アナツモマブマフェナトクス（Ａｎａｔｕｍｏｍａｂ ｍａｆｅｎａｔｏｘ）、アンルキンズマブ（Ａｎｒｕｋｉｎｚｕｍａｂ）、アポリズマブ（Ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、アルシツモマブ（Ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）、アセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アチヌマブ（Ａｔｉｎｕｍａｂ）、アツリズマブ（Ａｔｌｉｚｕｍａｂ）（＝トシリズマブ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、バピネウズマブ（Ｂａｐｉｎｅｕｚｕｍａｂ）、バシリキシマブ（Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、バビツキシマブ（Ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、ベンラリズマブ（Ｂｅｎｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ（Ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、ベズロトクスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビマグルマブ（Ｂｉｍａｇｒｕｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン（Ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）、ブロソズマブ（Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン（Ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ブリアキヌマブ（Ｂｒｉａｋｉｎｕｍａｂ）、ブロダルマブ（Ｂｒｏｄａｌｕｍａｂ）、カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ）、カンツズマブメルタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、カンツズマブラブタンシン（Ｃａｎｔｕｚｕｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、カプラシズマブ（Ｃａｐｌａｃｉｚｕｍａｂ）、カプロマブペンデチド（Ｃａｐｒｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カツマキソマブ（Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂ）、ＣＣ４９、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セルトリズマブペゴール（Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、Ｃｈ．１４．１８、シタツズマブボガトクス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シクスツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ）、クラザキズマブ（Ｃｌａｚａｋｉｚｕｍａｂ）、クレノリキシマブ（Ｃｌｅｎｏｌｉｘｉｍａｂ）、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、クレネズマブ（Ｃｒｅｎｅｚｕｍａｂ）、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ（Ｄａｃｅｔｕｚｕｍａｂ）、ダクリズマブ（Ｄａｃｌｉｚｕｍａｂ）、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダラツムマブ（Ｄａｒａｔｕｍｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デノスマブ（Ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、ドルリモマブアリトクス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、デュリゴツマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）、デュピルマブ（Ｄｕｐｉｌｕｍａｂ）、デュシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ（Ｅｃｕｌｉｚｕｍａｂ）、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ（Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ）、エファリズマブ（Ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エロツズマブ（Ｅｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンリモマブペゴール（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、エルリズマブ（Ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ（Ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エボロクマブ（Ｅｖｏｌｏｃｕｍａｂ）、エキスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファルレツズマブ（Ｆａｒｌｅｔｕｚｕｍａｂ）、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ（Ｆｅｌｖｉｚｕｍａｂ）、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ（Ｆｉｇｉｔｕｍｕｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フォントリズマブ（Ｆｏｎｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、フォラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、フォラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレソリムマブ（Ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）、フルラヌマブ（Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガリキシマブ（Ｇａｌｉｘｉｍａｂ）、ガニツマブ（Ｇａｎｉｔｕｍａｂ）、ガンテネルマブ（Ｇａｎｔｅｎｅｒｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ゲボキズマブ（Ｇｅｖｏｋｉｚｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレムバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ（Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ＧＳ６６２４、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、イブリツモマブチウキセタン（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ ｔｉｕｘｅｔａｎ）、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インクラクマブ（Ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、インテツムマブ（Ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）、イノリモマブ（Ｉｎｏｌｉｍｏｍａｂ）、イノツズマブオゾガマイシン（Ｉｎｏｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、イピリムマブ（Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イトリズマブ（Ｉｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、イキセキズマブ（Ｉｘｅｋｉｚｕｍａｂ）、ケリキシマブ（Ｋｅｌｉｘｉｍａｂ）、ラベツズマブ（Ｌａｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、ラムパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、レブリキズマブ（Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レキサツムマブ（Ｌｅｘａｔｕｍｕｍａｂ）、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リンツズマブ（Ｌｉｎｔｕｚｕｍａｂ）、リリルマブ（Ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ルカツムマブ（Ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）、ルミリキシマブ（Ｌｕｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、マパツムマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、マツズマブ（Ｍａｔｕｚｕｍａｂ）、メポリズマブ（Ｍｅｐｏｌｉｚｕｍａｂ）、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ（Ｍｉｌａｔｕｚｕｍａｂ）、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モガムリズマブ（Ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モタビズマブ（Ｍｏｔａｖｉｚｕｍａｂ）、モキセツモマブパスドトクス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｍｕｒｏｍｏｎａｂ−ＣＤ３）、ナコロマブタフェナトクス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナプツモマブエスタフェナトクス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナタリズマブ（Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ネバクマブ（Ｎｅｂａｃｕｍａｂ）、ネシツムマブ（Ｎｅｃｉｔｕｍｕｍａｂ）、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ニモツズマブ（Ｎｉｍｏｔｕｚｕｍａｂ）、ニボルマブ（Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）、ノフェツモマブメルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オビヌツズマブ（Ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ）、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ（Ｏｃｒｅｌｉｚｕｍａｂ）、オデュリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）、オララツマブ（Ｏｌａｒａｔｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ）、オナルツズマブ（Ｏｎａｒｔｕｚｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトクス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ（Ｏｒｅｇｏｖｏｍａｂ）、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ（Ｐａｇｉｂａｘｉｍａｂ）、パリビズマブ（Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ）、パニツムマブ（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ（Ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、ペキセリズマブ（Ｐｅｘｅｌｉｚｕｍａｂ）、ピジリズマブ（Ｐｉｄｉｌｉｚｕｍａｂ）、ピナツズマブベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、ポラツズマブベドチン（Ｐｏｌａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ポネズマブ（Ｐｏｎｅｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラムシルマブ（Ｒａｍｕｃｉｒｕｍａｂ）、ラニビズマブ（Ｒａｎｉｂｉｚｕｍａｂ）、ラキシバクマブ（Ｒａｘｉｂａｃｕｍａｂ）、レガビルマブ（Ｒｅｇａｖｉｒｕｍａｂ）、レスリズマブ（Ｒｅｓｌｉｚｕｍａｂ）、リロツムマブ（Ｒｉｌｏｔｕｍｕｍａｂ）、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロレデュマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロモソズマブ（Ｒｏｍｏｓｏｚｕｍａｂ）、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サリルマブ（Ｓａｒｉｌｕｍａｂ）、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ（Ｓｅｃｕｋｉｎｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏ
ｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ（Ｓｉｌｔｕｘｉｍａｂ）、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ（Ｓｉｐｌｉｚｕｍａｂ）、シルクマブ（Ｓｉｒｕｋｕｍａｂ）、ソラネズマブ（Ｓｏｌａｎｅｚｕｍａｂ）、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タリズマブ（Ｔａｌｉｚｕｍａｂ）、タネズマブ（Ｔａｎｅｚｕｍａｂ）、タプリツモマブパプトクス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトクス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（Ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（＝トレメリムマブ（ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ））、チルドラキズマブ（Ｔｉｌｄｒａｋｉｚｕｍａｂ）、チガツズマブ（Ｔｉｇａｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（＝アツリズマブ（ａｔｌｉｚｕｍａｂ））、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トシツモマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ（Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）、ウルトキサズマブ（Ｕｒｔｏｘａｚｕｍａｂ）、ウステキヌマブ（Ｕｓｔｅｋｉｎｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ（Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ）、ベルツズマブ（Ｖｅｌｔｕｚｕｍａｂ）、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ビシリズマブ（Ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボロシキシマブ（Ｖｏｌｏｃｉｘｉｍａｂ）、ボルセツズマブマフォドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ザルツムマブ（Ｚａｌｕｔｕｍｕｍａｂ）、ザノリムマブ（Ｚａｎｏｌｉｍｕｍａｂ）、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、又はゾリモマブアリトクス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）であり得る。

【0088】

利益が向上する治療は、典型的には臓器移植である。臓器は、腎臓、肝臓、心臓、膵臓、肺、又は小腸から選択され得る。治療される被験体は、好ましくは、感作されるか又は高感作され得る。「感作された」とは、被験体がヒト主要組織適合性（ＭＨＣ）抗原（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも呼ばれる）に対する抗体を有するようになったことを意味する。抗ＨＬＡ抗体は、同種感作Ｂ細胞に由来し、通常、輸血、以前の移植又は妊娠により、以前に感作された患者に存在する（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。

【0089】

移植レシピエントの候補が感作されているか否かは、任意の好適な方法によって決定され得る。レシピエントが感作されているか否かを判定するために、例えば、パネル反応性抗体（ＰＲＡ）試験が用いられ得る。ＰＲＡスコア＞３０％は、典型的には、患者が「高い免疫学的リスク」又は「感作性」であることを意味すると解される。或いは、移植ドナー候補の血液の試料が、意図されたレシピエントのそれと混合される、交差適合試験が行なわれ得る。交差適合陽性は、レシピエントがドナー試料に反応する抗体を有することを意味し、レシピエントが感作され、移植が行われるべきでないことを示す。交差適合試験は、典型的には、移植直前の最終検査として行われる。

【0090】

ドナー候補のＭＨＣ抗原に対する、力価の高い抗体（即ち、ドナー特異的抗体（ＤＳＡ））の存在は、急性抗体媒介性拒絶反応のリスクのため、まさに移植の禁忌である。要するに、ドナーＭＨＣ抗原への感作は、好適なドナーの同定を妨げる。交差適合試験陽性は、移植に対する明白な障害である。腎臓移植を待っている患者のおおよそ３分の１が感作されており、１５％が高感作性であるため、このことが、移植を待っている患者の集積につながる。米国においては、２００１〜２００２年における腎移植待ちリストの平均時間は、パネル反応性抗体（ＰＲＡ）スコアが０〜９％の患者については１３２９日、ＰＲＡが１０〜７９％の患者については１９２０日であり、ＰＲＡが８０％以上の患者については３６４９日であった（臓器調達移植ネットワーク（ＯＰＴＮ）データベース、２０１１）。

【0091】

ＤＳＡの障害を克服するための、承認された１つの戦略は、ＤＳＡのレベルを、移植が検討され得るレベルに低下させるために、血漿交換又は免疫吸着を、多くの場合静脈内ガンマグロブリン（ＩＶＩｇ）又はリツキシマブ（例）と併用して適用することである（Ｊｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｖｏ ｅｔ ａｌ．，２００８ａ；Ｖｏ ｅｔ ａｌ．，２００８ｂ）。しかしながら、血漿交換、免疫吸着及びＩＶＩｇ処置は、長期間にわたる反復治療を含むので、非効率的で、厳密な計画を必要とするという欠点がある。死亡したドナーからの臓器が利用可能になるときは、長引いた冷虚血時間が、腎臓移植における遅延移植機能及び同種移植片喪失の最も重要な危険因子の１つであるので、数時間以内に移植する必要がある（Ｏｊｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。

【0092】

対照的に、本発明の方法は、移植レシピエント候補において、ＤＳＡの、迅速、一時的且つ安全な除去を可能にする。移植の直前に本発明のポリペプチドを投与することにより、高感作患者を効果的に脱感作することができ、それにより移植が可能となり、急性抗体媒介性拒絶反応が回避される。移植前の、ポリペプチドの単回投与により、ドナー特異的ＩｇＧ抗体を有する数千人の患者の移植が可能になる。

【0093】

この実施形態の文脈において、本方法は、代替的に、被験体における臓器不全を治療するための方法であって、（ａ）被験体に、本発明のポリペプチドを投与すること、及び（ｂ）続いて、被験体に置換臓器を移植することを含み：
− 投与される前記ポリペプチドの量は、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分である；及び
− 工程（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも２時間、また多くとも２１日の時間間隔で隔てられる、方法と記述され得る。

【0094】

言い換えれば、この実施形態は、被験体における移植臓器の拒絶反応、特に急性抗体媒介性移植拒絶反応の拒絶反応、を予防するための方法であって、臓器移植の少なくとも２時間前、また多くとも２１日前に、被験体に本発明のポリペプチドを投与することを含み、投与される前記ポリペプチドの量が、被験体の血漿中に存在する実質的に全てのＩｇＧ分子を切断するのに十分である、方法として記述され得る。本発明は、臓器不全を治療する、又は移植拒絶反応、特に急性抗体媒介性移植拒絶反応、を予防する方法等における、本発明のポリペプチドの使用も提供する。本発明は、かかる方法による、臓器不全の治療のため、又は移植拒絶反応の予防のための医薬の製造における、本発明のポリペプチドの使用も提供する。この実施形態においては、本発明の方法は、移植時又は移植の直前に実施される工程であって、患者中のＴ細胞及び／又はＢ細胞の誘導抑制を含む、工程を更に含み得る。前記誘導抑制は、典型的には、Ｔ細胞を死滅させるか又は抑圧する、有効量の薬剤を投与すること、及び／又はＢ細胞を死滅させるか又は抑圧する、有効量の薬剤を投与することを含み得る。Ｔ細胞を死滅させるか又は抑圧する薬剤としては、ムロモナブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）抗体及びリンパ球免疫グロブリン、抗胸腺細胞グロブリン製剤（ＡＴＧＡＭ）が挙げられる。リツキシマブは、Ｂ細胞を死滅又は抑圧することが知られている。

【実施例】

【0095】

実施例
特に表示しない限り、用いた方法は、標準的な生化学及び分子生物学の技術である。好適な方法論の教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．が挙げられる。

【0096】

実施例１−ポリペプチドの設計、製造及び精製
成熟したＩｄｅＳ分子を解析し、突然変異に好適な領域を同定した。いくつかの場合においては、インシリコ評価を用いて、突然変異で起こり得る結果を評価した。各ポリペプチドの配列を決定し、各ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、導入された突然変異の数に応じて、出発配列の部位特異的突然変異又は合成のいずれかによって、ＧｅｎｅＣｕｓｔ，Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇで生成した。ｃＤＮＡを配列決定し、短いグリシンリンカー（３×Ｇｌｙ）によってＣ末端に連結したＣ末端６×Ｈｉｓタグとインフレームで、ｐＥＴ９ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に移した。細菌の発現を向上させるために、Ｎ末端メチオニンを付加した。Ｅ．コリＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、プラスミドで形質転換（熱ショック）して、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢアガロースプレート上に播種した。単一のコロニーを拾い、一晩の培養（３ｍｌのＬＢ培地）を３７℃、２５０ｒｐｍで開始した。翌日、グリセロールストックを調製し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び消泡剤を添加した１０ｍｌのＴＢ培地に終夜培養液を植菌し、ＯＤ０．６〜０．８（３７℃、３００ｒｐｍ）まで増殖させた。この時点で、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を加え、１時間培養を継続した後、遠心分離により細菌を回収した。ペレットをＰＢＳ中で洗浄し、−２０℃で凍結させた。細菌溶解のための凍結融解プロトコルを用い（各１ｍｌ ＰＢＳにおいて３回の凍結／融解サイクル）、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡを予め充填したスピンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製した。精製後、溶出したタンパク質を、緩衝液交換（ＭＷＣＯ ９Ｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｃｆｇ装置中に３倍容量のＰＢＳ）前に、１０ｍＭ ＤＴＴで活性化した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）無染色１２％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏｒａｄ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、各タンパク質の純度及び安定性を評価した。

【0097】

以下の表には、試験した各ポリペプチドについて行った変更を、更なるＮ末端メチオニン及びｈｉｓタグを含まない、成熟ＩｄｅＳと比較してまとめている。従って、本明細書に記載される実験において用いられる各ポリペプチドの配列は、典型的には、該表に示される通りの配列番号の配列と、追加のＮ末端メチオニン及び短いグリシンリンカーによってＣ末端に連結したｈｉｓタグを含む。

【0098】

【表6】

【0099】

コントロールとして、改造型ＩｄｅＳを、上記と同じ方法論を用いて製造した。この改造型ＩｄｅＳは、配列番号２の配列と、追加のＮ末端メチオニン及び短いグリシンリンカーによりＣ末端に連結されたｈｉｓタグを含む。この改造型ＩｄｅＳを、本明細書においてｐＣＡＲＴ１２４と呼ぶ場合がある。ｐＣＡＲＴ１２４の配列を以下に示す：

【0100】

【化2】

【0101】

更なるコントロールとして用いるために、タグを欠いているＩｄｅＳも、自動化された多段階クロマトグラフィー精製を用いて、製造管理及び品質管理に関する基準（ＧＭＰ ｓｔａｎｄａｒｄ）と無関係に製造した。このポリペプチドを、本明細書においてＢＸ１００１８６５と言う。

【0102】

試験したポリペプチド並びにｐＣＡＲＴ１２４のそれぞれを製造するために用いたｃＤＮＡ配列を以下に示す。各ｃＤＮＡ配列は、３’末端にＮ末端メチオニン（ＡＴＧ）のコドン、及び５’末端の停止コドン（ＴＡＡ）の前の、グリシンリンカー及びヒスチジンタグのコドンを含む。

【0103】

【化3-1】

【0104】

【化3-2】

【0105】

【化3-3】

【0106】

【化3-4】

【0107】

実施例２−効力の評価（ＩｇＧ切断の有効性）
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡベースの効力アッセイを用いて、酵素活性を測定した。ＥＬＩＳＡの原理は、マルチタイタープレートのウェルを抗体標的（ＢＳＡ）でコーティングし、次いで種々の濃度の（試験又はコントロールの）ＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドを、ウェル中の抗ＢＳＡ抗体とインキュベーションした後、検出抗体を用いて、ウェルに結合した抗ＢＳＡ抗体の量を検出することである。ある特定の、ウェル中のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドの濃度が高いほど、ウェルに結合する無傷の抗ＢＳＡポリペプチドはより少なく、もたらされるシグナルはより弱い。同様に、同じ濃度で存在する場合、より強力なＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドは、より効力が弱いＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドよりも、弱いシグナルをもたらす。

【0108】

基準ＩｄｅＳ、ＢＸ１００１８６５を、１：２の段階希釈で、３２０ｎＭから０．１６ｎＭまでの滴定シリーズとして調製し、アッセイ用の標準較正曲線を描くことを可能にした。複数の既知濃度についてのアッセイで得られた、試験した各ポリペプチドの結果を較正曲線の直線部分と比較して、同じ効力を達成する基準ＩｄｅＳの濃度を決定した。各ポリペプチドの既知の濃度を、曲線から決定した、基準ＩｄｅＳの等価濃度で割ることにより、基準ＩｄｅＳ ＢＸ１００１８６５と比較した効力の倍数変化であるスコアがもたらされる。例えば、５ｎＭ試験ポリペプチドが較正曲線上の１０ｎＭ基準ＩｄｅＳに等しい結果を出す場合、試験ポリペプチドは、基準ＩｄｅＳ ＢＸ１００１８６５の２倍超の効力を有する。基準ＩｄｅＳ ＢＸ１００１８６５に対する効力の倍数変化の平均スコアを、試験した各ポリペプチドについて、種々の濃度で得られた全スコア（それらが較正曲線の直線部分内にあることを条件とする）から算出した。次いで、プレート間の比較を可能にするために、この平均スコアを、各プレートに含めたｐＣＡＲＴ１２４の基準ＩｄｅＳについて得た平均スコアと比較した。ｐＣＡＲＴ１２４についての平均スコアを、試験ポリペプチドについての平均スコアで割って「ｐＣＡＲＴ１２４比」を編み出した。これは事実上、各ポリペプチドについての効力の、ＩｄｅＳに対する倍数変化である。このｐＣＡＲＴ１２４比は、次いで、棒グラフに視覚化し得る。

【0109】

実験プロトコルの簡単な要旨：マルチタイタープレートのウェルを、ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングし、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄し、ＰＢＳ中２％魚皮ゼラチンで１時間ブロッキングした。ＩｄｅＳ ＢＸ１００１８６５ポリペプチドは、０．１％ゼラチンを含むＰＢＳ中、１：２の段階希釈で、３２０ｎＭから０．１６ｎＭまでの滴定シリーズとして調製した。次いで、試験ポリペプチド及びｐＣＡＲＴ１２４コントロールを、０．１％ゼラチンを含むＰＢＳ中、それぞれ１５、７．５、３．７５及び１．９ｎＭで調製した。５０μｌのポリペプチド試料を、５０μｌのウサギ抗ＢＳＡ（ＡＣＲＩＳ、＃Ｒ１０４８Ｐ、１０ｎＭ）を基質として含む各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄した。特異的なビオチン化抗ウサギＦｃヤギ抗体（３０，０００×希釈）を検出抗体として加え、３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、４００００倍に希釈したストレプトアビジン（ＳＡ）−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ＨＲＰ用の発色基質としてＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔを用いて、７分間発色させ、０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させた。λ＝４５０ｎｍで吸光度（ＯＤ）を測定した。各試験ポリペプチドについて、及びｐＣＡＲＴ１２４について、ＢＸ１００１８６５と比較した効力の倍数変化についての平均スコアを決定した。次いで、各試験ポリペプチドについての「ｐＣＡＲＴ１２４比」を、上記の通り算出した。

【0110】

ｐＣＡＲＴ１５２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８９及び１９０についての「ｐＣＡＲＴ１２４比」の結果を、ｐＣＡＲＴ１２４についての結果と共に、図１に示す。本明細書に示される本発明の例示的なポリペプチドは全て、ＩｄｅＳコントロール（ｐＣＡＲＴ１２４）と比べて、効力において少なくとも１．５倍の向上を達成する。ｐＣＡＲＴ１５２、１８３、１８４、１８８、１８９及び１９０は全て、はるかに高い効力、ｐＣＡＲＴ１８９についての、コントロールよりも８．０倍も高い向上でさえ、達成する。これらの６つの文字列（ｔｅｘｔ）ポリペプチドの各々は、Ｎ１３０Ｒ／Ｋ改変を含む。別に、ｐＣＡＲＴ１２５ポリペプチドを試験した。ＩｄｅＳの効力に匹敵する効力を達成した（データ示さず）。

【0111】

ＩｇＧ切断パターンの可視化
種々の基質中の、各ポリペプチドの滴定シリーズによって生成された切断産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで可視化することにより、種々のｐＣＡＲＴポリペプチドの有効性を更に評価した。純粋ＩｇＧ基質中での有効性を試験するために、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）をＩｇＧ１用に用い、デノスマブ（ＸＧＥＶＡ）をＩｇＧ２用に用いた。より複雑な生理学的環境中での有効性を試験するために、ポリペプチドをＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ）中（ｉｎ ｉｎ）でもいくつか滴定した。これにより、中和作用を有する抗ＩｄｅＳ抗体がポリペプチド活性に与える影響を評価できる。各ポリペプチドの切断パターンを、同一基質中のＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）の切断パターンと比較する。プロトコルは以下の通りである：

【0112】

純粋ＩｇＧの試験のために、各試験ポリペプチド又はコントロールを、支持タンパク質として０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：３の段階滴定シリーズで、６．７μｇ／ｍｌから０．０４ｎｇ／ｍｌまで希釈した。各濃度の２５μｌをマルチタイタープレートに移し、切断反応を、Ｈｕｍｉｒａ又はＸＧＥＶＡ（２ｍｇ／ｍｌ）のいずれか２５μｌを加えることによって開始した。従って、各出発濃度のポリペプチドは、ウェル中で１：２に希釈され、３．３μｇ／ｍｌ〜０．０２ｎｇ／ｍｌの滴定シリーズがもたらされる。

【0113】

ＩＶＩｇ試験のために、各試験ポリペプチド又はコントロールを、支持タンパク質として０．０５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：２の段階滴定シリーズで、３０μｇ／ｍｌから０．０１５ｎｇ／ｍｌまで希釈した。各濃度の２５μｌをマルチタイタープレートに移し、２５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＩＶＩｇを加えることによって切断反応を開始させた。従って、各出発濃度のポリペプチドは、ウェル中で１：２に希釈され、１５μｇ／ｍｌ〜０．００７５ｎｇ／ｍｌの滴定シリーズがもたらされる。

【0114】

プレートを、３７℃で１．５時間インキュベーションした。試料を、２×ＳＤＳローディング緩衝液で１：４に混合し、９２℃で５分間加熱した。１０μｌをポリアクリルアミドゲル（１５ウェル４−２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）プレキャストゲル（Ｂｉｏｒａｄ））にロードし、これを、標準的なプロトコルに従って読み取った。

【0115】

図２は、ｐＣＡＲＴ１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８９及び１９０について、ＩｇＧ１（アダリムマブ）基質を用いて生成された切断パターンを、ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）と比較して示す。ポリペプチド濃度は、１：３の段階希釈系列で３．３３μｇ／ｍｌ（レーン１）から０．０２ｎｇ／ｍｌ（レーン１２）までである。無傷のアダリムマブ（酵素なし）を、左に可視化する（レーンＣ）。右側の矢印は、ＩｇＧ由来の種々の切断産物を示す。矢印１：無傷ＩｇＧ；矢印２：ｓｃＩｇＧ（１回切断ＩｇＧ−第１のＩｇＧ重鎖の切断の結果）；矢印３：Ｆ（ａｂ’）_２断片（第２のＩｇＧ重鎖の切断の結果）。縦線を付記し、無傷ＩｇＧがｓｃＩｇＧになる第１のＩｇＧ重鎖切断（レーン６と７との間）、及びｓｃＩｇＧがＦ（ａｂ’）_２断片になる第２のＩｇＧ重鎖切断（レーン２と３との間）での比較を容易にした。

【0116】

特に、ｐＣＡＲＴ１８３、１８４、１８８、１８９及び１９０はすべて、同じ濃度でｐＣＡＲＴ１２４と比較して、第２の重鎖切断の有効性の増大を示し、より濃いＦ（ａｂ’）_２（矢印３）バンド及びより薄いｓｃＩｇＧバンド（矢印２）をもたらす。差は０．１２μｇ／ｍｌの濃度（レーン４）から見られるが、０．３７μｇ／ｍｌ（レーン３）では更に顕著である。従って、図２は、全体で、１３０位における正電荷アミノ酸への変化（Ｎ１３０Ｒ／Ｋ）が、第２のＩｇＧ重鎖の切断の有効性を増大させることを示す（ｐＣＡＲＴ１８３、１８４、１８８、１８９及び１９０）。

【0117】

図３は、ｐＣＡＲＴ１５２及び２０９についての、ＩｇＧ１基質を用いて生成された切断パターンを、ＩｄｅＳコントロール（ｐＣＡＲＴ１２４及びＢＸ１００１８６５）の両方と比較して示す。酵素濃度は、１：３の段階希釈系列で３．３３μｇ／ｍｌ（レーン１）から０．０２ｎｇ／ｍｌ（レーン（ｌｉｎｅ）１２）である。右側の矢印は、ＩｇＧ由来の種々の切断産物を示す。矢印１：無傷ＩｇＧ；矢印２：ｓｃＩｇＧ（１回切断ＩｇＧ−第１のＩｇＧ重鎖切断の結果）；矢印３：Ｆ（ａｂ’）_２断片（第２のＩｇＧ重鎖切断の結果）；矢印４：Ｆｃ断片；（^＊）は、滴定緩衝液中の担体タンパク質（ＢＳＡ）を示す。縦線を付記し、無傷ＩｇＧがｓｃＩｇＧになる第１のＩｇＧ重鎖切断（レーン６と７との間）、及びｓｃＩｇＧがＦ（ａｂ’）_２断片になる第２のＩｇＧ重鎖切断（レーン２と３との間）での比較を容易にした。

【0118】

ｐＣＡＲＴ１５２及びｐＣＡＲＴ２０９は、両方、第２の重鎖切断の有効性増大を示し、同じ濃度で、ｐＣＡＲＴ１２４及びＢＸ１００１８６５（矢印３及び２）と比較して、より濃いＦ（ａｂ’）_２バンド（矢印３）及び残存するより薄いｓｃＩｇＧ（矢印２）をもたらす。この差は酵素濃度４１ｎｇ／ｍｌ（レーン５）から見られるが、０．１２μｇ／ｍｌ及び０．３７μｇ／ｍｌ（レーン４及びレーン３）では更に顕著である。ｐＣＡＲＴ１５２及びｐＣＡＲＴ２０９は両方、原型ＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）の約３倍の、第２の重鎖切断の有効性を示す。即ち、０．３７μｇ／ｍｌのｐＣＡＲＴ１５２及びｐＣＡＲＴ２０９（レーン３）は、１．１１μｇ／ｍｌのＢＸ１００１８６及びｐＣＡＲＴ１２４（レーン２）の結果と同様の結果をもたらす。

【0119】

ｐＣＡＲＴ１５２及びｐＣＡＲＴ２０９はまた、第１のＩｇＧ重鎖の切断において効力の向上を示し、原型のＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）と比較して、同濃度で、より濃いｓｃＩｇＧのバンド（矢印２）及びより薄いＩｇＧバンド（矢印１）を生じる。ｐＣＡＲＴ１５２については、これは１．５ｎｇ／ｍｌの酵素（レーン８）で見られ得るが、４．６ｎｇ／ｍｌ（レーン７）では更に明らかである。ｐＣＡＲＴ２０９は、第一の重鎖切断についても、原型ＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）の約３倍の切断有効性の増大を示す（すなわち、４．６ｎｇ／ｍｌ（レーン７）のｐＣＡＲＴ２０９は、１４ｎｇ／ｍｌ（レーン６）のＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４と同様の結果をもたらす）。

【0120】

従って、図３は、１３０位における単一アミノ酸置換（ｐＣＡＲＴ１５２におけるＮ１３０Ｋ）は、主として第２のＩｇＧ１重鎖切断の有効性を増大させるが、第１のＩｇＧ１重鎖もある程度増大させ、ＮＱＴＮ配列の欠失（ｐＣＡＲＴ２０９）が、第１及び第２のＩｇＧ１重鎖の両方に対する、切断の有効性を３倍向上させることを示す。

【0121】

図４は、ｐＣＡＲＴ１５２及びｐＣＡＲＴ２０９について、ＩｇＧ２基質を用いて生成した切断パターンを、ＩｄｅＳコントロール（ｐＣＡＲＴ１２４及びＢＸ１００１８６５）の両方と比較して示す。酵素濃度は、１：３の段階希釈系列で３．３３μｇ／ｍｌ（レーン１）から０．０２ｎｇ／ｍｌ（レーン（ｌｉｎｅ）１２）までである。右側の矢印は、ＩｇＧ由来の種々の切断産物を示す。矢印１：無傷ＩｇＧ；矢印２：ｓｃＩｇＧ（１回切断ＩｇＧ−第１のＩｇＧ重鎖切断の結果）；矢印３：Ｆ（ａｂ’）_２断片（第２のＩｇＧ重鎖切断の結果）；矢印４：Ｆｃ断片；（^＊）は、滴定緩衝液中の担体タンパク質（ＢＳＡ）を示す。縦線を付記し、無傷ＩｇＧがｓｃＩｇＧになる、第１のＩｇＧ重鎖の切断（レーン６と７との間）、及びｓｃＩｇＧがＦ（ａｂ’）_２断片になる、第２のＩｇＧ重鎖の切断（レーン２と３との間）での比較を容易にした。

【0122】

ｐＣＡＲＴ１５２及びｐＣＡＲＴ２０９は両方とも、同じ濃度のｐＣＡＲＴ１２４及びＢＸ１００１８６５と比較して（矢印３及び２）、第２の重鎖切断の有効性増大を示し、より濃いＦ（ａｂ’）_２（矢印３）バンド及びより薄いｓｃＩｇＧ（矢印２）をもたらす。この差異は、０．３７μｇ／ｍｌ（レーン３）の酵素濃度から見られるが、１．１１μｇ／ｍｌ（レーン２）で更に明らかである。

【0123】

ｐＣＡＲＴ２０９についてのレーン６（酵素濃度１４ｎｇ／ｍｌ）における結果は、ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４と比較して、ｐＣＡＲＴ２０９も第１のＩｇＧ重鎖の切断においてより有効であることを示す。これは、殆どのタンパク質がｓｃＩｇＧに変換されるにつれて、より薄い無傷ＩｇＧバンド（矢印１）及びより濃いｓｃＩｇＧバンド（矢印２）をもたらす。

【0124】

従って、図４は、１３０位での単一のアミノ酸置換（ｐＣＡＲＴ１５２のＮ１３０Ｋ）が、主として第２のＩｇＧ２重鎖切断の有効性を増大させ、ＮＱＴＮ配列の欠失（ｐＣＡＲＴ２０９）は、第１及び第２の両方のＩｇＧ２重鎖切断の有効性を向上させることを示す。

【0125】

全体として、試験ポリペプチドは、一般に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２を切断する際に、ＩｄｅＳよりも有効であることが理解され得る。ＥＬＩＳＡの結果と整合して、ｐＣＡＲＴ１５２、１８３、１８４、１８８、１８９及び１９０は特に有効であるようである。これらのポリペプチドについての有効性の増大は、主に第二のＩｇＧ重鎖の切断に関連するようである。

【0126】

１３１位のＧから正電荷アミノ酸への変化は、Ｎ１３０Ｒ／Ｋ置換と同様の結果をもたらすと予想される。１３０位及び１３１位は、配列番号１の１２６位〜１３６位にわたるベータヘアピン構造のループに位置する。本明細書で得られた結果に基づいて、１３０位及び１３１位のいずれか又は両方における正電荷アミノ酸の変化は、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を増加させると予想される。

【0127】

実施例３−免疫原性の評価
競合的ＡＤＡアッセイ
このアッセイは、抗ＩｄｅＳ抗体への結合についての、試験ポリペプチドとＩｄｅＳとの間の競合に基づいている。試験酵素とＩＶＩｇとのプレインキュベーションにより、試験したｐＣＡＲＴ酵素に対する抗ＩｄｅＳ抗体の結合が可能になる。その後、ＩｄｅＳでコーティングしたプレートに、ＩＶＩｇ−酵素混合物を加え、試験ポリペプチドに結合していないすべての抗ＩｄｅＳ抗体を、プレート上のＩｄｅＳに、代わりに結合させる。結合のためのインキュベーションは、すべて、ＩｇＧ切断を阻害するために、２ｍＭヨード酢酸（ＩＨＡｃ）の存在下で、及び高塩濃度で行い、高親和性結合のみが生じるようにした。洗浄後、検出剤として、特異的なビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）_２ヤギＦ（ａｂ’）_２断片を使用する。ＩＶＩｇ中の抗ＩｄｅＳ抗体による試験ポリペプチドの認識が乏しいと、ＩＶＩｇ中の抗ＩｄｅＳ抗体のプレートへの高結合をもたらし、強いシグナルをもたらす。ＩＶＩｇ中の抗ＩｄｅＳ抗体による試験ポリペプチドの良好な認識は、反対の結果をもたらす。詳細なプロトコルは以下の通りである。

【0128】

マルチタイタープレート上に、基準ＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５）を一晩コーティングし（５μｇ／ｍｌ）、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄し、２ｍＭ ＩＨＡｃ及び１Ｍ ＮａＣｌを添加したＰＢＳ中２％ＢＳＡで１時間ブロッキングした。０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＩＨＡｃ及び１Ｍ ＮａＣｌを添加したＰＢＳ中の試験ポリペプチド及び２０μｇ／ｍｌ ＩＶＩｇを段階的に希釈して、混合用プレートを調製した。混合用プレートを、シェーカー上で、室温で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、ブロッキング溶液を、ＩｄｅＳでコーティングしたプレートから捨て、混合用プレートからの各混合物５０μｌを、コーティングしたプレートのウェルに移した。シェーカー上で、室温で１時間インキュベーションした後、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、検出剤の、特異的なビオチン化抗ヒトＦ（ａｂ’）_２ヤギＦ（ａｂ’）_２断片（２００００倍希釈）を加えた。３０分間インキュベーションした後、プレートを洗浄し、４００００倍に希釈したＳＡ−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、ＨＲＰの発色基質としてＴＭＢ Ｏｎｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔを用いて、７分間発色させ、０．５Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４で停止させた。吸光度（ＯＤ）を、λ＝４５０ｎｍで測定した。棒グラフにおいて視覚化するために、結果を逆数にし（１／ＯＤ値）、ｐＣＡＲＴ１２４と比較した比（１／（試験ポリペプチド／ｐＣＡＲＴ１２４））として提示した。

【0129】

ｐＣＡＲＴ１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８９及び１９０についての結果を図５に示す。ｐＣＡＲＴ１２５についての結果を図６に示す。試験したポリペプチドは全て、ＩｄｅＳと比較して、抗ＩｄｅＳ抗体の幾分かの認識低下（典型的には少なくとも１０％）を示す。特に、ｐＣＡＲＴ１８５、１８６及び１８７は、認識においてより大幅な低下（ＩｄｅＳと比較して約４０％）を示す。ｐＣＡＲＴ１２５は、約６０％の低下を示す。

【0130】

まとめ
試験したポリペプチドはすべて、ＩｄｅＳと比較して、効力の増大及び／又は免疫原性の低下を示す。

【0131】

実施例４−効力の評価
効力ＥＬＩＳＡ
ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２の切断能力を扱うために、２つのＥＬＩＳＡベースの効力アッセイを用意した。一方のアッセイはＩｇＧ１の切断を、そして他方はＩｇＧ２の切断を測定する。試験した種々のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドについて、ＥＣ５０（半最大有効濃度）値を算出した。アッセイの原理は、Ｆａｂ領域に対し特異性を有する、ヒトＩｇＧ抗体に対するＦ（ａｂ）_２断片で、マルチタイタープレートのウェルをコーティングすることであった。次いで、ウェル中で、ヒトＩｇＧ１抗体（Ｈｕｍｉｒａ）又はヒトＩｇＧ２抗体（ＸＧＥＶＡ）と共に、滴定濃度のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチド（試験又はコントロール）をインキュベーションした。ウェルに結合した無傷又は一回切断のヒトＩｇＧ（Ｈｕｍｉｒａ又はＸＧＥＶＡ）の量を、抗体のＦｃ部分に対する特異性を有する、ヒトＩｇＧに対する検出抗体を用いて測定した。ある特定の、ウェル中のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドの濃度が高いほど、ウェルに結合する無傷ヒトＩｇＧ抗体が少なく、より弱いシグナルがもたらされる。同様に、より強力なＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドは、同じ濃度で存在する場合、より効力が弱いＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドよりも弱いシグナルをもたらす。ＩｇＧ１（ｈｕｍｉｒａ）及びＩｇＧ２（ＸＧＥＶＡ）アッセイの両方において、ＩｄｅＳコントロール（ｐＣＡＲＴ１２４）及び全ての試験したＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドについて、滴定用量応答曲線を作成した。ＩｇＧ分子の第２の切断において、その最大効果の５０％が観察されるポリペプチドの濃度、即ちＩｇＧの半数が完全に切断されている濃度を表すＥＣ５０値も、試験した各変異体について算出した。ＥＣ５０値がより低いと、より有効なＩｇＧシステインプロテアーゼを表す。ＩｇＧのＦｃ部分が依然として存在し、Ｆｃ特異的検出抗体によって検出し得るので、ＩｇＧからｓｃＩｇＧへの、第１のＩｇＧ重鎖の切断は、このアッセイにおいては明確でない（図１３）。

【0132】

実験プロトコルの簡単な要約：特異的な抗ヒトＦａｂヤギＦ（ａｂ）_２断片（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９−００６−０９７）を用いて、マルチタイタープレートのウェルを、一晩（＋２〜８℃）コーティングし、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、リン酸緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳ−Ｔ）中０．４５％フィッシュゼラチン（ブロック緩衝液）中で、室温で４５〜１２０分間ブロッキングした。コントロールのＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）及び試験するＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドを、開始濃度８０μｇ／ｍｌで、ブロック緩衝液中、１：４段階希釈で滴定シリーズとして調製した。等量（２５μｌ）の、０．５μｇ／ｍｌの濃度のヒトＩｇＧ１（Ｈｕｍｉｒａ）及び滴定量ＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドをウェルに加え、３７℃の、制御された温度環境下で震盪しながら２時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄した。特異的なビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃマウス抗体（ｍ−ａ−ｈＩｇＧ Ｂｉｏ ＩＩ、Ｌｏｔ：Ｃ００１３−ＺＣ４３Ｃ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（６００ｎｇ／ｍｌ）をＳｔｒｅｐ−ｓｕｌｆｏ（２００ｎｇ／ｍｌ）と混合し、マルチタイタープレートに加えた。プレートをアルミニウムテープで密封し、振盪しながら、＋２５℃で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔ中で洗浄し、１５０μｌの２倍希釈Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ Ｃａｔ．ｎｏ．Ｒ９２ＴＣ−２）を各ウェルに加えた。プレートを直ちにプレートリーダー、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ １２０ Ｍｏｄｅｌ １３００で読み取った。

【0133】

ゲルで可視化された有効性アッセイ：ＩｇＧ１（Ｈｕｍｉｒａ）、ＩｇＧ２（ＸＧＥＶＡ）の切断並びにヒトＩｇＧのプールのＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ）の切断について、実施例２に記載の通りに行ったアッセイ。

【0134】

結果
効力ＥＬＩＳＡ
効力アッセイにおいて、試験したＩｇＧシステインプロテアーゼについて得られた用量−応答曲線を図７（ＩｇＧ１切断）及び図８（ＩｇＧ２切断）に示す。本明細書で試験した、本発明の例示的なポリペプチドのｐＣＡＲＴ１２５、２１３、２１４は、ＩｄｅＳコントロールのｐＣＡＲＴ１２４と比較して、ＥＣ５０値を減少させて（表１）ＩｇＧ１（図７）及びＩｇＧ２（図８）の、両方の重鎖を切断する効力を向上させ、ｐＣＡＲＴ１２５については１．５、ｐＣＡＲＴ２１４については２．２、及びｐＣＡＲＴ２１３については３．０の、切断における倍数的な効力向上であった。ＩｇＧ２の切断（図８）に関しては、ｐＣＡＲＴ１２４（ＩｄｅＳ）と比較して、ｐＣＡＲＴ１２５については１．６、ｐＣＡＲＴ２１４については２．１、及びｐＣＡＲＴ２１３については３．５の倍数的な向上であった。

【0135】

ゲルで可視化した有効性アッセイ
ゲルで可視化した、ＩｇＧ１（図９Ａ）及びＩｇＧ２（図９Ｂ）の切断は、第１及び第２の重鎖切断を明確に示す（図中の縦線は、ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４の切断による第１及び第２のＩｇＧ重鎖切断を示す）。図中の^＊は、おおよそのＥＣ５０値、即ち、ＩｇＧの５０％が１回切断（ｓｃＩｇＧ）され、５０％が完全に切断（Ｆ（ａｂ’）_２）される濃度を示す。ゲルからのデータを表２（ＩｇＧ１切断）及び表３（ＩｇＧ２切断）にまとめる。ＩｇＧ１（Ｈｕｍｉｒａ）の第１の重鎖切断に必要なＩｇＧシステインプロテアーゼの濃度は、ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４（ＩｄｅＳコントロール）、ｐＣＡＲＴ１２５，２１３及び２１４について１．５ｎｇ／ｍｌで、試験したすべてのポリペプチドについて、ほぼ同じであった（図９Ａ）。ＩｇＧ１の第２の重鎖切断に関しては、ＩｄｅＳ、ｐＣＡＲＴ１２５及び２１４は、ゲル上で支配的なＦ（ａｂ’）２バンドを得るのに約１２０ｎｇ／ｍｌ必要であり、ｐＣＡＲＴ２１３については、約１回滴定ステップが少ない４０ｎｇ／ｍｌである（図９Ａ）。図９Ｂにおいて可視化したＩｇＧ２（ＸＧＥＶＡ）切断により、試験したすべてのポリペプチド、ＢＸ１００１８６５、ｐＣＡＲＴ１２４、１２５、２１３及び２１４が、およそ同じ有効性を示し、第１のＩｇＧ重鎖を切断してｓｃＩｇＧ２を生成するのに１４ｎｇ／ｍｌ必要であり、及びＦ（ａｂ’）_２断片を生成するためには約３７０ｎｇ／ｍｌであることが示される（表３）。
もう１式の有効性実験において、ＩｄｅＳコントロールとしてＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４を用いて、Ｈｕｍｉｒａ（ＩｇＧ１）及びＸＧＥＶＡ（ＩｇＧ２）に対してｐＣＡＲＴ２２８を試験した（図１０Ａ及び１０Ｂ、表４）。これらの実験において、図９及び表３と比較して、コントロール（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）については、おおよそ１滴定ステップ高い濃度が必要であり、試料の取扱い及び試料の滴定希釈における実験室の精度に起因して、実験間の小さな差異が観察され得る。信頼できる比較を得るためには、ｐＣＡＲＴ２２８を、同じ実験におけるＩｄｅＳコントロールの切断と比較しなければならない。ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の切断の両方において、非常に類似したＩｇＧ切断パターンが、ｐＣＡＲＴ２２８及びＩｄｅＳコントロールについて見られる（図１０Ａ及びＢ）が、ｐＣＡＲＴ２２８による、ＩｇＧ１の第２のＩｇＧ重鎖切断に、１２０ｎｇ／ｍｌ必要であり、ＩｄｅＳについての３７０ｎｇ／ｍｌと比較して（表４）、およそ３倍（１滴定ステップ）効率的である（図１０Ａ）。

【0136】

ＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドｐＣＡＲＴ１２５、２１３及び２１４も、ＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）をコントロールとして用いて、ヒトＩｇＧプール、ＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ）中で滴定した（図１１）。試験されたポリペプチドは、全て、第１のＩｇＧ重鎖切断のために１．５μｇ／ｍｌを、及び第２のＩｇＧ重鎖切断のために約６μｇ／ｍｌを必要とした（図１１及び表５）。図１１における、３０μｇ／ｍｌからの１：２希釈物（図１２）を用いたより広い滴定スペクトルにおいて、試験した変異体と比較して、ｐＣＡＲＴ２２８によるＩＶＩｇの切断を解析した。ＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）並びにｐＣＡＲＴ２２８については（図１２）、ｓｃＩｇＧ生成のための濃度が１．９μｇ／ｍｌで、Ｆ（ａｂ’）_２断片を得るためには７．５μｇ／ｍｌであり、同様の有効性が見られる（表６）（これらは、ｐＣＡＲＴ１２５，２１３及び２１４についての滴定ステップと同じ滴定ステップを表す（図１１及び表５））。

【0137】

実施例４の図の要旨
図７ 種々のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドによるＩｇＧ１（Ｈｕｍｉｒａ）切断についての滴定曲線。

【0138】

図８ 種々のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドによるＩｇＧ２（ＸＧＥＶＡ）切断についての滴定曲線。

【0139】

図９ ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４（原型ＩｄｅＳ）を、同じ切断実験におけるコントロールとして伴う、ｐＣＡＲＴ１２５、２１３及び２１４の滴定量（３３００ｎｇ／ｍｌから１：３希釈）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したＩｇＧ切断。Ａ：ｈｕｍｉｒａ（ＩｇＧ１）の切断及びＢ：ＸＧＥＶＡ（ＩｇＧ２）の切断。縦線は、第１及び第２のＩｇＧ重鎖切断（切断産物の量が未切断産物よりも支配的である）をもたらすのに必要なＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）濃度を示す。図中の^＊は、この実験におけるおおよそのＥＣ５０値を表す。

【0140】

図１０ ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４（原型ＩｄｅＳ）を、同じ切断実験におけるコントロールとして伴う、ｐＣＡＲＴ２２８の滴定量（３３００ｎｇ／ｍｌから１：３希釈）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したＩｇＧ切断。Ａ：ｈｕｍｉｒａ（ＩｇＧ１）の切断及びＢ：ＸＧＥＶＡ（ＩｇＧ２）の切断。縦線は、第１及び第２のＩｇＧ重鎖切断（切断産物の量が未切断産物よりも支配的である）をもたらすのに必要なＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）濃度を示す。

【0141】

図１１ 試験したＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドの滴定（６μｇ／ｍｌから１：２希釈）量及び同じ切断実験におけるコントロールとしてＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したＩＶＩｇ切断。

【0142】

図１２ ＩｄｅＳ（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）を、同じ切断実験のコントロールとして伴う、ｐＣＡＲＴ２２８の滴定量（３０μｇ／ｍｌからの１：２希釈）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析したＩＶＩｇ切断。

【0143】

図１３ 本発明のポリペプチドによる免疫グロブリン切断の模式図。ＩｇＧの酵素的切断は２段階で行われる。第１に、無傷ＩｇＧの１つの重鎖が切断され、１回切断されたＩｇＧ（ｓｃＩｇＧ）が生成される。第２に、次のＩｇＧ重鎖が切断され、Ｆｃ部分が遊離する。ｓｃＩｇＧ分子においては、Ｆｃ部分は依然としてＦａｂ部分に結合しており、効力ＥＬＩＳＡにおける検出抗体は、ＩｇＧ分子のＦｃ部分を認識しているので、該アッセイでは、完全なＩｇＧとｓｃＩｇＧは区別されない。

【0144】

考察及び結論
効力ＥＬＩＳＡにおけるｐＣＡＲＴ１２５、２１３、及び２１４についてのより低いＥＣ５０値は、ｐＣＡＲＴ１２４（原型ＩｄｅＳ）と比較して、これらのポリペプチドの、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の両方の、第２の重鎖切断（ｓｃＩｇＧからＦ（ａｂ’）_２へ）の効力が向上することを示す。ゲルでのＩｇＧ切断を可視化することにより、Ｆｃ特異的検出抗体を用いた効力ＥＬＩＳＡにおいては測定できない、（ＩｇＧからｓｃＩｇＧへの）第１の重鎖の切断が示される。病原性ＩｇＧ分子を不能化することが主な焦点である臨床状況において重要な、Ｆｃにより媒介されるＩｇＧの作用は、大抵、１回切断分子において無くなっている（データ示さず）。ｐＣＡＲＴ２２８は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の切断の両方において、原型ＩｄｅＳと同様に有効である。これは、ＩｄｅＳと同じ分子サイズで、望ましい低さの、ＩｄｅＳ特異的抗体の認識を伴うＩｇＧシステインプロテアーゼが必要な場合に重要である。ＩＶＩｇは、おおよそ６５〜７０％のＩｇＧ１、３５〜３０％のＩｇＧ２及び約１％を占めるＩｇＧ３／ＩｇＧ４を含有するヒトＩｇＧのプールである。ヒトＩＶＩｇはまた、ＩｇＧドナーの、以前のＳ．ピオゲネスへの曝露に由来する抗ＩｄｅＳ抗体を自然に含有する。ヒトＩＶＩｇ中の抗ＩｄｅＳ抗体は、それらのＩｄｅＳに対する結合が、ＩｄｅＳのＩｇＧプロテアーゼ活性を低下させ得るか又は完全に無くし得るという点で、中和作用がある。ＩＶＩｇ切断の結果は、抗ＩｄｅＳ中和抗体の存在により、（ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が優先されるが、）異なるＩｇＧサブクラスすべてが、全般的に切断されることを示す。一般に、試験した全てのＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドは、ＩｇＧ１と比較して、ＩｇＧ２切断においてより有効性が低い。

【0145】

【表7】

【0146】

【表8】

【0147】

【表9】

【0148】

【表10】

【0149】

【表11】

【0150】

【表12】

【0151】

実施例５−ＡＤＡ ＥＬＩＳＡ（ＡＤＡ−ＩｄｅＳ結合部位に対する競合ＥＬＩＳＡ）。
ＥＬＩＳＡ，Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）ベースのアッセイを用いて、ＩｄｅＳに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）結合部位を、本発明の「ＡＤＡ」改変ポリペプチド（ｐＣＡＲＴ１２５、２１３及び２１４）について評価した。ＥＬＩＳＡの原理は、原型のｈｉｓタグ付きＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）で、マルチタイタープレートのウェルをコーティングすることであった。ほとんどのヒトは、以前のＡ群ストレプトコッカスの感染に起因して、血清中に、ＩｄｅＳに対する抗体を有する。本明細書では、２つの異なるヒト臨床血清プールを、ＡＤＡ検出についての基準として用いた。第１のプールは、ヒト血清プール１１９１８０７と呼ばれる、１００個体からの正常なヒト血清であり、第２のプールは、第ＩＩ相プール−２と呼ばれる、第ＩＩ相研究１３−ＨＭｅｄＩｄｅＳ−０２における患者由来の血清プールである。これらの患者には、ＩｄｅＳが、０．２４〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重の用量範囲で、１回投与され、それにより血清中の抗ＩｄｅＳ ＡＤＡレベルをおおよそ５０倍に誘導した。

【0152】

この競合的ＡＤＡ ＥＬＩＳＡの要点は、ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）が、マイクロタイタープレートの底部にコーティングされていることである。ヒト血清プールを、ＡＤＡ認識に関して試験する本発明のポリペプチドか、又はポジティブコントロールＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）と、本発明のポリペプチドが１００倍過剰の、１：１００のモル比で、共にプレインキュベーションする。原型ＩｄｅＳへの、おおよそ８０％の結合をもたらすための、プレインキュベーション用に用いた２つの異なる血清プールの濃度を、標準曲線から推定する。試験したポリペプチドにおいて、ＡＤＡ結合部位が無効化した場合、これらの変異体は、ウェルの底部において、ＡＤＡの結合で、原型ＩｄｅＳに対して競合することができない、即ち、弱いシグナルにより、原型ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）に対する、高いＡＤＡ類似性が実証され、強いシグナルにより、原型ＩｄｅＳに対する、低いＡＤＡ類似性が実証される。

【0153】

標準曲線の直線部分において、おおよそ８０％の結合を達成する両基準の濃度は、約２００ｎｇＡＤＡ（ＩｄｅＳ）／ｍｌであった。競合的プレインキュベーションにおいては、両基準は別々にこの濃度で用い、本発明のポリペプチドの濃度は、ＡＤＡ濃度の１００倍の濃度（１５０ｋＤａの抗体とおおよそ３５ｋＤａのＩｄｅＳとの間のモル重量差、４．２倍を加味し、２００ｎｇ／ｍｌの１００倍を４．２で割り、試験したポリペプチドおおよそ５μｇ／ｍｌを得る）で用いた。２００ｎｇ／ｍｌのＡＤＡを含有する基準血清及びＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）又は本発明のポリペプチドを、室温（ＲＴ）で１時間、共にプレインキュベーションする。最大ＡＤＡ結合についてのコントロールとして、同濃度の基準を、ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）や試験したポリペプチドなしでプレインキュベーションし、最大結合の８０％の値として用いた。標準曲線の最低値を、競合の算出範囲に関しての下限値として用いた。ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）又は試験したポリペプチドとプレインキュベーションした基準についての平均スコアを、８０％基準結合値で引き、下限値で引いた８０％基準結合値で割り、競合値％を得た。％競合が最低の試験したポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｅｓ）は、原型ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）と比較して、ほとんどのＡＤＡ結合エピトープが無効化したことを意味する。

【0154】

実験プロトコルの簡単な要約：マルチタイタープレートのウェルを、一晩、ｐＣＡＲＴ１２４（１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ中０．４５％の魚皮ゼラチン及び２ｍＭのシステインプロテアーゼ阻害剤、ヨード酢酸（ＩＨＡｃ）で１時間ブロッキングした。

【0155】

両基準を、ＰＢＳ中０．４５％魚皮ゼラチン、２ｍＭ ＩＨＡｃで、１：３の段階希釈で、５０００ｎｇＡＤＡ（ＩｄｅＳ）／ｍｌ〜２．５ｎｇＡＤＡ（ＩｄｅＳ）／ｍｌの滴定シリーズとして調製し、標準曲線の直線部分並びに最大部分及び最小部分の、両方での測定により、アッセイの標準較正曲線の作成を可能にした。プレートのブロッキングと同時に、該基準及びＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）又は試験したポリペプチド、即ち、２００ｎｇ／ｍｌ ＡＤＡ（基準）及び５μｇ／ｍｌ ＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）又は試験するポリペプチドを用いた、競合工程における試料を、室温で１時間、共にプレインキュベーションした。

【0156】

ｐＣＡＲＴ１２４でコーティングしたプレートを３回洗浄し、５０μｌのプレインキュベーションした試料又は５０μｌの基準を、マルチタイタープレートの各ウェルに加えた。

【0157】

プレートを室温で２時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄した。ブロッキング緩衝液中に、検出抗体として、特異的な抗ヒトＦ（ａｂ）ヤギＦ（ａｂ）_２断片−ｂｉｏ（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９−０６６−０９７，０．６５ｍｇ／ｍｌ）（１０００倍希釈）、及びＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｓｕｌｆｏ（ＭＳＤ Ｃａｔ．Ｎｏ：Ｒ３２ＡＤ−１又はＲ３２ＡＤ−５）（２０００倍希釈）を加え、暗中、室温で１時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、４倍希釈のＲｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（４×））を加え、プレートを、プレートリーダー、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ１２０ Ｍｏｄｅｌ １３００で直接解析した。

【0158】

結果及び結論
試験したＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチド、ｐＣＡＲＴ１２５，２１３及び２１４は、全て、原型のＩｄｅＳ（ｐＣＡＲＴ１２４）と比較して、ヒト血清中のＩｄｅＳ特異的ＡＤＡにより認識されにくい。ＡＤＡ認識エピトープのいくつかは、ＩｄｅＳのＮ末端部分に見出される。本発明のこれらのポリペプチドは全て、ＩｄｅＳと比較してＮ末端が欠失しており、該Ｎ末端の欠失が、ｐＣＡＲＴ１２５と原型のＩｄｅＳとの間の唯一の連続した相違である。
ｐＣＡＲＴ１２５、２１３及び２１４についての、ＩｄｅＳ−ＡＤＡ結合部位の遮断パーセンテージ（％）を図１４及び図１５に示す。原型ＩｄｅＳのｐＣＡＲＴ１２４を１００％類似のポジティブコントロールとして使用する。

【0159】

実施例６−オクタガム（ヒトＩＶＩｇ）マウスモデルにおけるインビボ有効性の評価
本研究においては、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ヒトＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。ヒトＩＶＩｇの濃度は、ヒトＩｇＧ血漿濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）と関連性を持たせるように、９００ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。

【0160】

０日目に、ヒトＩＶＩｇをｉ．ｐ．注射した。ヒトＩＶＩｇの注射の２４時間後（１日目）、ＰＢＳ、ＩｄｅＳコントロール（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）又は試験するＩｇＧシステインプロテアーゼのｐＣＡＲＴ１２５、ｐＣＡＲＴ２１３及びｐＣＡＲＴ２１４を、１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。２時間後、血清試料を採取し、マウスを屠殺した。

【0161】

有効性ＥＬＩＳＡ
アッセイの原理は、Ｆａｂ領域に対する特異性を有する、ヒトＩｇＧ抗体に対するＦ（ａｂ’）_２断片で、マルチタイタープレートのウェルをコーティングすることであった。次いで、ＩＶＩｇ並びにＩｄｅＳコントロール（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）又は試験したＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドで処置したマウス由来の血清を加えた。抗体のＦｃ部分に対する特異性を有する、ヒトＩｇＧ（ＩＶＩｇ）に対する検出抗体を用いて、ウェルに結合した無傷又は１回切断のヒトＩｇＧ（ＩＶＩｇ）の量を測定した。無傷ヒトＩｇＧ抗体（ＩＶＩｇ）の検出濃度が低いほど、ＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドがより有効であると予想される。

【0162】

実験室プロトコルの簡単な要約：特異的な抗ヒトＦａｂヤギＦ（ａｂ）_２断片（０．５μｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９−００６−０９７）を用いて、マルチタイタープレートのウェルを一晩コーティングし（＋２〜８℃）、次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０添加ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、ＰＢＳ−Ｔ（ブロック緩衝液）中２％ＢＳＡで、室温で４５〜１２０分間ブロッキングした。ヒト血清タンパク質検量物質（ＤＡＫＯ＃Ｘ０９０８）を基準として用い、０．５〜３００ｎｇ／ｍｌの範囲で加えた。ＩＶＩｇ及び種々のＩｇＧシステインプロテアーゼポリペプチドで処置したマウスから採取した血清試料を解凍し、ブロック緩衝液で１０００００倍に希釈した後、アッセイマルチタイタープレートに加えた。プレートを、震盪しながら、室温で２時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ−Ｔで洗浄した。特異的なビオチン化抗ヒトＩｇＧ Ｆｃマウス（６００ｎｇ／ｍｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ＃１０９−０６６−０９８）抗体を、Ｓｔｒｅｐ−ｓｕｌｆｏ（２００ｎｇ／ｍｌ）（ＭＳＤ＃Ｒ３２ＡＤ−１）と混合し、マルチタイタープレートに加えた。プレートをアルミニウムテープで密封し、震盪しながら、室温で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、１５０μｌの２倍希釈Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ Ｔ（ＭＳＤ＃Ｒ９２ＴＣ−２）を各ウェルに加えた。該プレートを、直ちにプレートリーダー、ＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ １２０ Ｍｏｄｅｌ １３００で直接解析した。

【0163】

ゲルで可視化された有効性
１０μｌのマウス血清を、９０μｌのＰＢＳで１：１０に希釈した。その後、１０μｌの希釈血清を３０μｌの４×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液と混合した。５μｌの自製（ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）ＩｇＧマーカーを用いて、種々のＩｇＧ断片（ＩｇＧ、ｓｃＩｇＧ及びＦ（ａｂ’）２）を示した。試料を、９２℃で３分間加熱し（Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｘｅｒ ｃｏｍｐａｃｔ，ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、短時間遠心してから、１０μｌを４〜２０％Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＴＧＸ、Ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅ（商標）ゲル（Ｃａｔ．＃４５６−８０９６、Ｂｉｏｒａｄ）にロードした。ゲルを、２００Ｖで４０分間泳動（ｒｕｎ）した。

【0164】

結果と結論
有効性ＥＬＩＳＡにより、血清中のヒトＩｇＧレベルを研究し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＩｇＧ分解を解析することにより、ＩｄｅＳコントロール（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）及びｐＣＡＲＴ１２５、２１３及び２１４によるヒトＩＶＩｇ（Ｏｃｔａｇａｍ）のインビボ切断を比較した。

【0165】

マウスにおける、ＩｄｅＳコントロール（ＢＸ１００１８６５及びｐＣＡＲＴ１２４）及び種々のＩｇＧシステインプロテアーゼｐＣＡＲＴ１２５、ｐＣＡＲＴ２１３及びｐＣＡＲＴ２１４による治療は、このマウスモデルにおいて、明らかに、インビボでのヒトＩｇＧの切断を実証した（表７及び図１６）。

【0166】

ＩｄｅＳコントロール（ＢＸ１００１８６及びｐＣＡＲＴ１２４）、ｐＣＡＲＴ１２５及びｐＣＡＲＴ２１３について、完全な切断が示され、ゲルに、目に見えるｓｃＩｇＧバンド及び顕著なＦ（ａｂ’）_２バンドはなかった（図１７）。ｐＣＡＲＴ２１４は、ｓｃＩｇＧ分子が、血清中に、２時間後に存在し、このマウスモデルにおいて、示された有効性がより低かった（図１７Ｃにおける^＊）。しかしながら、ゲルには、無傷ＩＶＩｇは検出できなかった。このことは、図１６において、ｐＣＡＲＴ２１４についてのより高いバーは、無傷ＩｇＧではなく、ｓｃＩｇＧを表すことを意味する。これは、本発明のポリペプチドが、インビボモデルにおいて、ＩｇＧを切断することを示す。

【0167】

【表13】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]