特許 6962684 乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6962684

(24)【登録日】2021年10月18日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/64 20060101AFI20211025BHJP

   A23C 9/13 20060101ALI20211025BHJP

   A23K 20/189 20160101ALI20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/64 ZZNA

   A23C9/13

   A23K20/189

【請求項の数】13

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2016-526547(P2016-526547)

(86)(22)【出願日】2014年7月11日

(65)【公表番号】特表2016-527882(P2016-527882A)

(43)【公表日】2016年9月15日

(86)【国際出願番号】EP2014064913

(87)【国際公開番号】WO2015007638

(87)【国際公開日】20150122

【審査請求日】2017年7月5日

【審判番号】不服2019-12674(P2019-12674/J1)

【審判請求日】2019年9月24日

(31)【優先権主張番号】13177064.6

(32)【優先日】2013年7月18日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】503260310

【氏名又は名称】セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100092624

【弁理士】

【氏名又は名称】鶴田 準一

(74)【代理人】

【識別番号】100114018

【弁理士】

【氏名又は名称】南山 知広

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100173107

【弁理士】

【氏名又は名称】胡田 尚則

(72)【発明者】

【氏名】マーティン ロン

(72)【発明者】

【氏名】ヨーナス ヤコプスン

(72)【発明者】

【氏名】ヨハネス マーテン バン デン ブレンク

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 中島 庸子

【審判官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特表平０５−５００６０３号公報

【文献】 特表２００９−５３３０３６号公報

【文献】 独国特許出願公開第０１４９２０６０号明細書

【文献】 ＮＥＴＨ．ＭＩＬＫ ＤＡＩＲＹ Ｊ．，１９８５年，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２，ｐｐ．６３−７０

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

IPC C12N 15/00-15/90, C12N 9/00- 9/99, C07K 1/00-19/00, C12Q 1/00- 3/00

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物であって：
（ｉ）組成物１ｇあたり２５〜３００００ＩＭＣＵの強度の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素；
（ｉｉ）１５０ｐｐｍ〜２５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度のポリマー；及び
（ｉｉｉ）１〜３５０ｇ／ｋｇの濃度の塩；
を含有し；
かつｐＨが２〜８であり；
かつ当該ポリマーが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の特性：
（ａ）当該ポリマーは、エチレンオキシドのモノマーのポリマーである；及び
（ｂ）当該ポリマーは、分子量２００ｇ／ｍｏｌ〜５００００ｇ／ｍｏｌのポリマーである；及び
（ｃ）当該ポリマーは、反復モノマー／要素数（いわゆる「ｎ」数）が、ｎ＝５〜ｎ＝１２５０のポリマーである；
を備えるポリマーであり；かつ
（Ｄ）任意で、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の特性を備えるポリマーが、上記特性（ａ）のモノマーと異なる１つ以上の置換基化合物を含み、当該ポリマーが置換されたポリマーである場合、斯かる置換されたポリマーの分子量は上記特性（ｂ）の範囲内であり、置換基化合物の分子量は、置換されたポリマーのポリマー部分の分子量を下回る；
当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物。

【請求項2】

以下の工程：
（ａ）請求項１に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を提供する工程；及び
（ｂ）当該組成物を、−１０℃〜５０℃の温度で９０〜２０００日の期間保存する工程；
を含む、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を保存する方法。

【請求項3】

食料又は飼料製品を生産する方法であって、有効量の請求項１に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を食料又は飼料成分に添加する工程、及び更なる製造工程を実施して食料又は飼料製品を取得する工程、を含み、
当該製品が乳製品であり、当該方法が、有効量の請求項１に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を乳に添加する工程、及び更なる製造工程を実施して乳製品を取得する工程を含み；かつ
当該乳が羊の乳、山羊の乳、バッファローの乳、ヤクの乳、リャマの乳、ラクダの乳又は牛乳であり；かつ
当該乳製品が、発酵乳製品、クワルク又はチーズである；
当該生産方法。

【請求項4】

前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物が、まず請求項２に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の保存方法に従って保存され、続いて請求項３に記載の食料又は飼料成分に添加される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

目的の酵素を含有する水性媒体から乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法であって、以下の工程：
（ｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む複数の成分からなる水性試料を取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の水性試料に対して１５０〜２５００ｐｐｍの濃度でポリマーを添加してポリマー含有試料を取得する工程；及び
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のポリマー含有試料からアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離することによって、所望の単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を取得する工程；
を含み、
ここで当該ポリマーが、請求項１に規定される（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意で（Ｄ）の特性を備えるポリマーである、当該方法。

【請求項6】

前記単離工程（ｉｉｉ）が、以下の工程：
（Ａ）疎水部分を含む固体基礎マトリックス含有リガンドを含有することにより当該リガンドへの所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素の吸着を達成する固相上に、前記工程（ｉｉ）のポリマー含有試料を適用する工程；及び
（Ｂ）当該固相から所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を溶出して、当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を回収することにより、所望の精製された単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を取得する工程；
を含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

目的の酵素を含有する水性媒体から乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法であって、以下の工程：
（ｉ）疎水部分を含む固体基礎マトリックス含有リガンドを含有することにより当該リガンドへの所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素の吸着を達成する固相上に、アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む複数の成分からなる水性試料を適用する工程；
（ｉｉ）溶出緩衝剤に対して１５０〜２５００ｐｐｍの濃度でポリマーを添加する工程；かつ
（ｉｉｉ）工程（ｉ）の固相から工程（ｉｉ）の溶出緩衝剤を用いて所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を溶出して、当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を回収することにより、所望の精製された単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を取得する工程；
を含み、ここで当該ポリマーが、請求項１に規定される（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意で（Ｄ）の特性を備えるポリマーである、当該方法。

【請求項8】

前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、表１：

【表1】

の「ラクダキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する；又は
前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、前記表１の「ウシペプシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシペプシン又はウシペプシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ウシペプシン」の欄に示すウシペプシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する；
請求項１に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物、又は請求項５〜７のいずれか１項に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法。

【請求項9】

前記ポリマーが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート又はＢｒｉｊ３５である、請求項１又は８のいずれか１項に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物、又は請求項５〜８のいずれか１項に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法。

【請求項10】

前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート２０又はＢｒｉｊ３５であって、当該ＰＥＧの分子量が５０００ｇ／ｍｏｌ〜１５０００ｇ／ｍｏｌである、請求項９に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物、又は請求項９に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法。

【請求項11】

前記項目（ｉ）における酵素強度が、組成物１ｇあたり１００ＩＭＣＵ〜１００００ＩＭＣＵの強度であり；かつ
前記項目（ｉｉ）におけるポリマー濃度が、１５０ｐｐｍ〜２５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であり；かつ
前記塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ_２ＳＯ_４、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、Ｎａ_２ＨＰＯ_４若しくはＮａＨ_２ＰＯ_４又はそれらの組み合わせから成る群から選択され；かつ
−前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり３００ＩＭＣＵを上回り、当該乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し；又は
−前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり１５０ＩＭＣＵを上回り、当該乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、前記表１の「ウシキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシキモシン又はウシキモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ウシキモシン」の欄に示すウシキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有し；かつ
当該液体組成物の合計の重量が１０ｇ〜１００００ｋｇである；
請求項１及び請求項８〜１０のいずれか１項に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物。

【請求項12】

前記項目（ｉｉ）において添加されるポリマー濃度が、１５０ｐｐｍ〜２５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）であり；かつ
前記項目（ｉｉｉ）において取得される単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の純度が全タンパク質の６０％ｗ／ｗ以上であり（即ち単離された組成物中の全タンパク質の６０％ｗ／ｗが単離された凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素である）；かつ
前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＢｒｉｊ３５であり；かつ
当該ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である場合、当該ポリマーの分子量が２０００ｇ／ｍｏｌ〜３００００ｇ／ｍｏｌであり；かつ
前記項目（ｉｉｉ）において単離される乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が：
−その特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり３００ＩＭＣＵを上回り、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する酵素である；又は
−その特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり１５０ＩＭＣＵを上回り、前記表１の「ウシキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシキモシン又はウシキモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ウシキモシン」の欄に示すウシキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する；
酵素であり；かつ
工程（ｉ）のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む多くの成分からなる水性試料が、生産性宿主細胞中での乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の組換え生産によって取得され；かつ
所望の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法が：クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、吸着床（ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）、バッチ吸着、膜吸着及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）からなる群から選択される１つ以上の精製技術を使用して行われる；
請求項５〜１０のいずれか１項に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法。

【請求項13】

前記項目（ｉｉ）において添加されるポリマー濃度が、１５０ｐｐｍ〜２５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）であり；かつ
前記項目（ｉｉｉ）において取得される単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の純度が全タンパク質の６０％ｗ／ｗ以上であり（即ち単離された組成物中の全タンパク質の６０％ｗ／ｗが単離された凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素である）；かつ
前記ポリマーが５０００ｇ／ｍｏｌ〜３００００ｇ／ｍｏｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＢｒｉｊ３５であり；かつ
前記項目（ｉｉｉ）において単離される乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が：
−その特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり３００ＩＭＣＵを上回り、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する酵素である；又は
−その特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり１５０ＩＭＣＵを上回り、前記表１の「ウシキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシキモシン又はウシキモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ウシキモシン」の欄に示すウシキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する；
酵素であり；かつ
工程（ｉ）のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む多くの成分からなる水性試料が、生産性宿主細胞中での乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の組換え生産によって取得され；かつ
所望の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法が：クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、吸着床（ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）、バッチ吸着、膜吸着及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）からなる群から選択される１つ以上の精製技術を使用して行われ；かつ
前記リガンドの疎水部分がベンジル基であり；かつ
前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ラクダキモシン」の欄に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する、又は前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、前記表１の「ウシペプシン」の欄に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシペプシン又はウシペプシンのバリアントであって、当該バリアントは、前記表１の「ウシペプシン」の欄に示すウシペプシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上の配列同一性を有する；
請求項６〜１０及び請求項１２のいずれか１項に記載の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体又は乾燥顆粒化組成物、及び所望の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

キモシンやペプシン等の乳凝固酵素による乳の酵素的凝固は、チーズの製造における最も重要なプロセスの一つである。乳の酵素的凝固は、二つの相：タンパク質溶解性酵素、キモシン又はペプシンが、κ―カゼインを攻撃して、準安定状態のカゼインミセル構造をもたらす第一の相、及び乳が凝固して凝塊を形成する第二の相、からなるプロセスである。

【0003】

ヒト胃内の乳凝固酵素であるキモシン（ＥＣ ３．４．２３．４）及びペプシン（ＥＣ ３．４．２３．１）は、ペプチダーゼの幅広いクラスに属するアスパラギン酸プロテアーゼである。

【0004】

商業的に重要な乳凝固酵素製品は、しばしば液体組成物であり、本分野において、製品中の乳凝固酵素を安定化させる、例えば酵素の保存安定性を改善する、様々な異なる方法での試みが開示されている。

【0005】

例えば、ＥＰ２３３３０５６Ａ１（ＤＳＭ、出願日２００７年１２月４日）は、蟻酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩又はプロパンジオールが、液体組成物／製品中のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素の安定性を増大し得ることを開示している。

【0006】

ＷＯ２０１２／１２７００５Ａ１（ＤＳＭ）は、２〜１００ｇ／ｋｇの濃度の無機塩及び蟻酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩、安息香酸塩、ソルビン酸塩、又はフマル酸塩、グリコール（エタンジオール）、プロピレングリコール（プロパンジオール）、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール又はガラクチトール等の保存料を含有する、安定な液体キモシン組成物を開示している。

【0007】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）はエチレンオキシドのポリマーであり、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とも称される。ＰＥＧは、３００ｇ／ｍｏｌ〜１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ等の幅広い分子量のものが商業的に入手できる。

【0008】

ＵＳ５１３９９４３（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、公開日１９９２年８月１８日）は、液体−液体二相系による微生物的に生産されたキモシンの回収におけるＰＥＧの使用を開示しており、ここでＰＥＧ及び無機塩が、発酵媒体／ビールに添加されて、液体−液体（水性）二相系が形成され、ＰＥＧ相からキモシンが回収／単離される。実施例において、約４〜５％ｗｔ／ｖｏｌのＰＥＧ８０００及び約１０％ｗｔ／ｖｏｌの硫酸ナトリウムを使用して、液体−液体（水性）二相系が取得されている。

【0009】

ＵＳ７９９８７０５Ｂ２ （Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、公開日２０１１年８月１６日）は、高い塩濃度（例えば細胞培養液）でイオン交換クロマトグラフィー樹脂に対する動的結合容量を増大させて、所望のタンパク質を精製するためのＰＥＧの使用を開示している。所望のタンパク質の例として、ウシグロブリン、ウシ血清アルブミン及びリゾチームが示されており、乳凝固酵素（例えばキモシン）は明示されていない。実施例（例えば実施例１）において、タンパク質の最良の回収率は、約６％ｗ／ｖのＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ４６００）を使用して得られたことが記載されており、例えば０．５％程度のＰＥＧは、タンパク質の回収／単離に対して殆ど正の影響をもたらさなかったことを示す。

【0010】

本分野で知られているように、ＰＥＧ化という用語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構造を、他の巨大分子、例えば治療的タンパク質と共有結合する作用を指す（以下「ＰＥＧ化する」と称する）。ＰＥＧ化は、分子の分子量が増大することにより、薬物の溶解性の改善、用量頻度の減少等、未修飾体と比較して幾つかの顕著な薬理的利益をもたらし得る。

【0011】

ＵＳ２０１１／０００８８４６Ａ１（Ｑｉａｇｅｎ）は、産業的に使用される酵素及びレンニン（キモシン）のＰＥＧ化が、適切な産業的に使用される酵素の長いリスト内の、適切な産業的に使用される酵素の一例として示されている。実施例はポリメラーゼのＰＥＧ化に関するもののみで、レンニン（キモシン）のＰＥＧ化に関する実施例は存在しない。

【0012】

上記に引用した従来技術文献のいずれも、ＰＥＧがキモシン等のアスパラギン酸プロテアーゼ乳凝固酵素の安定性を増大し得ることを記載していないことに留意されたい。

【0013】

ＤＥ１４９２０６０Ａ１ （Ｎｏｒｄｍａｒｋ−Ｗｅｒｋｅ ＧｍｂＨ、１９６９年公開）は、１〜２０ｗｔ％の濃度の分子量４００〜６０００のＰＥＧ（１００００〜２０００００ｐｐｍ相当）を添加することにより、ペプシン組成物を作製する方法を記載している。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0014】

本発明が解決する課題は、新規な乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素（例えばキモシン）組成物の提供であり、当該アスパラギン酸プロテアーゼは、安定性及び／又は活性が増大している。

【0015】

本発明が解決する他の課題は、アスパラギン酸プロテアーゼ酵素（例えばキモシン）を単離する新規な方法の提供であり、当該方法は、単離されたアスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物の活性の増大をもたらし得る。

【課題を解決するための手段】

【0016】

前記課題の解決は、発明者らが、キモシンにＰＥＧ又は類似の置換されたポリオキシエチレン（例えばＢｒｉｊ３５）を添加することにより、当該キモシンの物理的安定性が顕著に改善したことを同定したことを基礎とする。

【0017】

ＰＥＧ及びＢｒｉｊ３５の構造は、本願図１に示される。

【0018】

本願実施例で検討されるように、組換え生産されたウシキモシン（ＣＨＹ−ＭＡＸ（登録商標）， Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ）及びラクダキモシン（ＣＨＹ−ＭＡＸ（登録商標） Ｍ， Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ）は、クロマトグラフィーによって精製され、ここでＰＥＧ８０００及びＢｒｉｊ３５は、カラムからの溶出前に添加され、又はＰＥＧ８０００及びＢｒｉｊ３５は、溶出緩衝剤に添加された。

【0019】

ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を含有する試料は、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５を添加せずに精製した対照試料と比較して、特異的活性が１．５〜２倍に増大した（本願実施例２及び図２）。

【0020】

斯かるキモシン酵素の特異的活性の顕著な増大の効果は、特に、タンパク質の単離直後に見られる点で、発明者らにとって驚異的であった。

【0021】

斯かる迅速に観察される特異的活性の増大は、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５が長期的な保存での沈殿の問題を低下させることによって酵素の長期的な保存安定性を増大すること等だけでは説明できない。なぜなら、本願実施例で使用した精製プロトコール／方法において、タンパク質の単離直後に酵素の顕著な沈殿は認められないからである。また、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５を添加していない対照実験においても、タンパク質の単離直後にクソの顕著な沈殿は認められない。

【0022】

理論に拘束されず、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５は、キモシンの立体構造の安定性の増大をもたらすと考えられ、これは、本願実施例で迅速に観察される特異的活性の増大を説明し得る。

【0023】

理論に拘束されず、従来技術において、ＰＥＧ又は構造的に類似のポリマーが、アスパラギン酸プロテアーゼ乳凝固酵素、例えばキモシンの安定性を増大させ得ること、特に立体構造の安定性が増大し得ることを記載又は示唆するものは存在しないと考えられる。

【0024】

酵素の立体構造の安定性は、本願図３に図示される。

【0025】

本分野で知られるように、立体構造の喪失は、酵素の活性の喪失と等しい。

【0026】

本願実施例において、ＰＥＧの添加が、液体及び／又は顆粒化キモシン組成物の長期間の保存安定性を増大させたことも実証されている。

【0027】

理論に拘束されず、アスパラギン酸プロテアーゼ乳凝固酵素（例えばキモシン）において、立体構造の喪失は、例えば液体製剤中の例えば長期間の保存の間の酵素の沈殿の増大をもたらし得るのであろう。

【0028】

従って、ＰＥＧは、例えば酵素の立体構造の安定性を提供することによって、保存中の乳凝固酵素の沈殿の減少を助けるのであろう。

【0029】

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、エチレンオキシドのポリマーであり、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とも称され、構造に基づくＩＵＰＡＣ命名では、ＰＥＧはポリ（オキシエチレン）である。

【0030】

本願において当業者が理解する通り、Ｂｒｉｊ３５は、置換されたポリオキシエチレンを意味し、ここで置換基は、本願図１に示すように、「Ｃ１２」として示される。

【0031】

本願において当業者が理解する通り、ポリマー、例えばポリビニルポリピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート又はポリメタクリレートは、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５と構造的及び機能的に関連していると見做され得る。

【0032】

本分野で知られているように、ポリマーはヘテロポリマーやコポリマーであってもよく、これらは、ホモポリマーが１つのモノマーで構成されるのに対して、２つ以上のモノマー種で構成されるポリマーである。

【0033】

本願において当業者が理解する通り、以下：エチレンオキシド、ビニルポリピロリドン、ビニルアルコール、酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリレート及びメタクリレートの２つ以上のモノマー種に由来するコポリマーが、本願において、構造的及び機能的に関連すると見做され得る。

【0034】

理論に拘束されず、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５に構造的及び機能的に関連するポリマーが乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の安定性の顕著な改善をもたらさないと考えることに、顕著な技術的根拠は存在しないと考えられる。

【0035】

本願実施例において、ＰＥＧ８０００及びＢｒｉｊ３５が用いられ、これらは平均分子量がそれぞれ８０００ｇ／ｍｏｌ及び１２２５ｇ／ｍｏｌである。

【0036】

本発明において、分子量（分子量（ＭＷ）とも表記する）２００ｇ／ｍｏｌ〜５０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマーが適切であり得る。

【0037】

本発明において、モノマー／要素の反復回数（ｎ数）がｎ＝５〜ｎ＝１２５０であるポリマーが適切であり得る。

【0038】

例えば、図１において、Ｂｒｉｊ３５はｎ＝２３である。

【0039】

本分野で知られているように、ｎ＝１２５０のＰＥＧはＭＷが約５０，０００ｇ／ｍｏｌでＰＥＧ８０００は分子量約８，０００ｇ／ｍｏｌ及びｎ＝２００である。

【0040】

図６は、本発明におけるポリマーの例としてポリソルベート２０を示しており、これは合計で２０個のエチレンオキシドモノマーを含む。

【0041】

本願実施例４は、ポリソルベート２０の添加が、試験された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素液体組成物の安定性を増大させたことを示す。

【0042】

本願において当業者が理解する通り、ポリソルベート２０は、本願の特性（ｃ）に関し、モノマー／要素の反復回数（ｎ数）がｎ＝２０であるポリマーである。

【0043】

例えば、図６の命名法を使用して、ポリソルベート２０は、例えば、ｗ、ｘ、ｙ及びｚ＝５、即ち４つのそれぞれｎ＝５のグループであり得る。

【0044】

従って、本願において当業者が理解する通り、そのようなポリソルベート２０ポリマーは、本願において、本願の特性（ｃ）に関し、ｎ＝５×４＝２０のポリマーであり得る。

【0045】

本願において当業者が理解する通り、本願において重要なことは、そのようなポリマー中に存在する本願におけるモノマー（例えばエチレンオキシド）の数である。

【0046】

例えば、そのようなポリマー中に存在する本願におけるモノマー（例えばエチレンオキシド）の数は、例えば、本願のポリマーの分子量にとって重要である。

【0047】

従って、本願において当業者が理解する通り、本願の特性（ｃ）に関し、「反復するモノマー」は、そのようなポリマー中に存在する本願におけるモノマー（例えばエチレンオキシド）の合計の数である。

【0048】

本分野で知られているように、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、相対的に類似の構造として見られても良い。

【0049】

本分野で知られているように、様々な哺乳類又は真菌種（例えばウシ、ラクダ、ヒツジ、ブタ、又はケカビ（ｍｕｃｏｒ）から取得された様々な天然の野生型の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼポリペプチド配列は、相対的に高い三次構造の類似性を有している。

【0050】

本願図４において、異なる哺乳類種（ウシ、バッファロー、ヤギ、ヒツジ、ラクダ及びブタ）由来の本願乳凝固キモシンの配列のアラインメントを示す。図４に見られるように、それらは密接な配列関連性を有し、非常に高い三次構造の類似性を有することが知られている。

【0051】

本願図５において、商業的に入手可能な異なる哺乳類又は真菌種由来の様々な乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素（ラクダキモシン、ウシキモシン、ウシペプシン、真菌ケカビペプシン及び真菌エンドキア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ペプシン）の配列のアラインメントを示す。

【0052】

図５の５種類の配列は高度に同一とはいえないが、当業者が理解するように、これらの５種類の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、高度な三次元構造の類似性を有することが知られている。

【0053】

上記で検討され、本願実施例で示すように、本願の安定性の改善／増大は、ウシキモシン及びラクダキモシンで実証されている。

【0054】

理論に拘束されず、本願の安定性の改善／増大効果は、一般的な乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素において適切であるべきと考える顕著な技術的根拠は無く、上記で検討されているように、それらは、高度な三次元構造の類似性を有することが知られており、当業者が理解するように、この三次元構造の類似性が、安定性の改善をもたらす本願ポリマー−酵素相互作用が、構造的に類似の本願乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の一般的なクラスの効果であることをもっともらしくすると考えられる。

【0055】

従って、本発明の第一の側面は、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物であって：
（ｉ）組成物１ｇあたり２５〜３００００ＩＭＣＵの強度の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素；
（ｉｉ）１ｐｐｍ〜１００００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度のポリマー；及び
（ｉｉｉ）１〜３５０ｇ／ｋｇの濃度の塩；
を含有し；
かつｐＨが２〜８であり；
かつ当該ポリマーが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の特性：
（ａ）当該ポリマーは、エチレンオキシド、ビニルポリピロリドン、ビニルアルコール、酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリレート及びメタクリレートからなるモノマーの群から選択される１つ以上のモノマーのポリマーである；及び
（ｂ）当該ポリマーは、分子量２００ｇ／ｍｏｌ〜５００００ｇ／ｍｏｌのポリマーである；及び
（ｃ）当該ポリマーは、反復モノマー／要素数（いわゆる「ｎ」数）が、ｎ＝５〜ｎ＝１２５０のポリマーである；
を備えるポリマーであり；かつ
（Ｄ）任意で、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の特性を備えるポリマーが、上記特性（ａ）のモノマーと異なる１つ以上の置換基化合物を含み、当該ポリマーが置換されたポリマーである場合、斯かる置換されたポリマーの分子量は上記特性（ｂ）の範囲内であり、置換基化合物の分子量は、置換されたポリマーのポリマー部分の分子量を下回る；
当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物に関する。

【0056】

当業者が理解するように、上記第一の側面の項目（ｉ）における「組成物１ｇあたり・・・ＩＭＣＵ」は、そのような組成物１ｇあたりのＩＭＣＵ酵素活性を意味する。

【0057】

上記第一の側面の項目（ｉｉｉ）における「ｇ／ｋｇ」も同様で、そのような組成物１ｋｇあたりの塩のグラムを意味する。

【0058】

上記第一の側面の液体組成物の合計の重量は１０ｇ〜１００００ｋｇが好ましい。

【0059】

当業者が理解するように、上記第一の側面における本願液体組成物１ｋｇは、概ね体積１リットルである。

【0060】

上記で検討したように、Ｂｒｉｊ３５は、置換されたポリオキシエチレンを意味し、ここで置換基は、本願図１に示すように、「Ｃ１２」構造として示される。Ｂｒｉｊ３５の平均分子量は、約１２２５ｇ／ｍｏｌである。

【0061】

従って、Ｂｒｉｊ３５は、上記第一の側面の任意の特性（Ｄ）の置換されたポリマーの一例であり、ここで置換化合物は本願図１に示すように、「Ｃ１２」構造として示され、置換されたポリマーの分子量は、１２２５ｇ／ｍｏｌであり、置換化合物（「Ｃ１２」構造）の分子量は、ポリマー部分（ｎ＝２３のエチレンオキシドのポリマー）の分子量を顕著に下回る。

【0062】

本分野における当業者が理解するように、特性（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有するポリマー部分が最も重要とみなされ、任意の特性（Ｄ）の可能な置換基化合物は、さほど重要でないとみなされる。

【0063】

上記のように、図６において、本願のポリマーの他の例としてポリソルベート２０が示され、これは、合計で２０個のエチレンオキシドモノマーを含む。

【0064】

Ｂｒｉｊ３５と同様に、ポリソルベート２０（別名Ｔｗｅｅｎ２０）は、本願の置換ポリマーとして理解される。ポリソルベート２０中の置換基／化合物はソルビタン及びラウリル酸塩で、当該置換基／化合物の分子量は、ポリマー部分（２０個のエチレンオキシドモノマー）よりも顕著に小さい。

【0065】

本分野の当業者が理解するように、「ポリマー」は、より具体的な「置換されたポリマー」を含むため、ポリマーは置換されてもされていなくてもよい。

【0066】

上記で検討したように、ＵＳ５１３９９４３は、液体−液体（水性）二相系を取得するために４〜５％ｗ／ｖｏｌのＰＥＧ８０００を使用し、ＵＳ７９９８７０５Ｂ２は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂に対する動的結合能力を顕著に増大させるために、約６％ｗ／ｖのＰＥＧを使用している。

【0067】

第一の側面の組成物において、本願ポリマー（例えばＰＥＧ）の使用量は僅か１ｐｐｍ〜１００００ｐｐｍ ｗ／ｗ （即ち０．０００１％〜１．０％ｗ／ｗ）に過ぎず、即ち、その使用量は、上記で検討した従来技術文献で要求されるよりも顕著に少ない。

【0068】

従って、理論に拘束されず、本願に記載の乳凝固酵素に対する立体構造安定性の増大を得るために使用される本願ポリマー（例えばＰＥＧ）の必要量は、上記従来技術で使用される量と比較して、顕著に少ないと言える。

【0069】

本願ポリマー（例えばＰＥＧ）は、加工助剤（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｉｄｓ）とも記載され得る。

【0070】

本発明の第一の側面は液体組成物に関するが、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素（例えばキモシン）は、乾燥顆粒化組成物／製品として商業化されてもよい。

【0071】

従って、本発明の第二の側面は、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼの乾燥顆粒化酵素組成物であって：
（ｉ）組成物１ｇあたり２５〜３００００ＩＭＣＵの強度の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素；
（ｉｉ）１ｐｐｍ〜１００００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度のポリマー；及び
（ｉｉｉ）塩；
を含有し；
かつ当該組成物が水に懸濁した場合のｐＨが２〜８であり；
かつ当該ポリマーが、第一の側面に規定される（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意で（Ｄ）の特性を備えるポリマーである；
当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の乾燥顆粒化組成物に関する。

【0072】

上記で検討したように、ＰＥＧ化は、他のより大きい分子、例えば治療タンパク質に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）構造を共有結合させる（以下「ＰＥＧ化する」と表記する）作用に関する。

【0073】

本分野の当業者が理解するように、本発明の革新は、そのようなＰＥＧ化に関するものではない。

【0074】

従って、本分野の当業者が理解するように、本願の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体及び／又は乾燥組成物は、好ましくは、１つの組成物ではなく、前記ポリマーは、当該乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素と共有結合している。

【0075】

本願で検討されるように、本願の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の利点は、保存安定性に優れる点である。

【0076】

従って、本発明の第三の側面は、以下の工程：
（ａ）第一若しくは第二の側面の、又は本願のいずれかの態様に関する乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を提供する工程；及び
（ｂ）当該組成物を、−１０℃〜５０℃の温度で９０〜２０００日の期間保存する工程；
を含む、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を保存する方法に関する。

【0077】

本願乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、従来技術に従って、例えば、所望の食品（例えばチーズ製品等の所望の乳ベースの製品等）を生産するのに使用されてもよい。

【0078】

従って、本発明の第四の側面は、食料又は飼料製品を生産する方法であって、当該生産方法は、有効量の第一又は第二の側面又は本願の関連する態様の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を食料又は飼料成分に添加する工程、及び更なる製造工程を実施して食料又は飼料製品を取得する工程、を含む。

【0079】

本願に記載のように本願ポリマーを使用して、上記で検討したように、特異的活性の増大した乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素試料を単離／精製できる。

【0080】

従って、本発明の第五の側面は、目的の酵素を含有する水性媒体から乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法であって、以下の工程：
（ｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む複数の成分からなる水性試料を取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の水性試料に対して１〜１００００ｐｐｍの濃度でポリマーを添加してポリマー含有試料を取得する工程；及び
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のポリマー含有試料からアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離することによって、所望の単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を取得する工程；
を含み、
ここで当該ポリマーが、第一の側面に規定される（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意で（Ｄ）の特性を備えるポリマーである、当該方法に関する。

【0081】

上記で検討したように、ＵＳ５１３９９４３は、液体−液体（水性）二相系を取得するために４〜５％ｗ／ｖｏｌのＰＥＧ８０００を使用し、ＵＳ７９９８７０５Ｂ２は、イオン交換クロマトグラフィー樹脂に対する動的結合能力を顕著に増大させるために、約６％ｗ／ｖのＰＥＧを使用している。

【0082】

第五の側面の方法において、本願ポリマー（例えばＰＥＧ）の使用量は僅か１ｐｐｍ〜１００００ｐｐｍ ｗ／ｗ （即ち０．０００１％〜１．０％ｗ／ｗ）に過ぎず、即ち、その使用量は、上記で検討した従来技術文献で要求されるよりも顕著に少ない。

【0083】

定義
本願における用語の定義は全て本分野に関する当業者が理解し得るものに従っている。

【0084】

「乳凝固酵素」は、乳凝固酵素活性を有する酵素、即ち活性な乳凝固酵素を意味する。乳凝固活性（Ｃ）は、１ｍｌあたり又は１ｇあたりのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｉｌｋ−Ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ （ＩＭＣＵ）で表され得る。当業者は、本願の乳凝固酵素の活性をどうやって決定するかを承知している。本願実施例１において、乳凝固酵素活性を決定する標準的な方法及び特異的な乳凝固酵素活性の例を提供している。本分野で知られているように、特異的凝固活性（全タンパク質１ｍｌあたりのＩＭＣＵ）は、凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を、全タンパク質量（１ｍｌあたりの全タンパク質ｍｇ）で割って決定される。

【0085】

「ｐｐｍ」は、１００万分の１を意味する。本分野で知られているように、「ｐｐｍ」という単位は質量分率に用いられ、ｐｐｍは、本願において、質量分率（ｗ／ｗ）に関連して使用される。例えば、本願の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物に関して本願ポリマーの濃度が５００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）であるということは、当該ポリマーが、試料組成物１グラムあたり、１グラムの１００万分の１の５００倍存在していることを意味し、これは０．０５％ｗ／ｗに相当する。言い換えると、１ｐｐｍ（ｗ／ｗ）は０．０００１％（ｗ／ｗ）に対応し、１００００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）は１％（ｗ／ｗ）に対応する。

【0086】

「配列同一性」は、２つのアミノ酸の間の関連性を意味する。

【0087】

本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度が、本分野の公知の方法によって決定され、好ましくは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６： ２７６−２７７）、好ましくはバージョン３．０．０以降中で実施される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３）を使用して決定される。使用される任意のパラメーターは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップエクステンションペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２ （ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。Ｎｅｅｄｌｅラベルされた「最長の同一性」（-ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得された）のアウトプットをパーセント同一性として使用し、以下のように計算された：
（同一の残基数×１００）／（アラインメントの長さ-アラインメント中の合計のギャップ数）

【0088】

「バリアント」は、１つ以上の位置に、変異、即ち置換、挿入及び／又は欠失を含む、乳凝固酵素活性を有するペプチドを意味する。置換は、１つの位置を占める１つのアミノ酸を、異なるアミノ酸で置き換えることを意味し；欠失は、１つの位置を占める１つのアミノ酸を除去することを意味し；そして挿入は、１つの位置を占める１つのアミノ酸の隣に１〜３個のアミノ酸を追加することを意味する。

【0089】

アミノ酸は、天然であっても、又は非天然アミノ酸、例えばＤ異性体（又はＤ型）で置き換えられてもよく、例えば理論的にはＤ−アラニンであってもよい。

【0090】

本発明の態様は以下に例示のみのために記載される。

【図面の簡単な説明】

【0091】

【図1】ＰＥＧ及びＢｒｉｊ３５の構造を示す。

【0092】

【図2A】溶出緩衝剤に０．１％ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加した場合の、ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加しない対照と比較した結果を示す。例えば、本願実施例２に記載の詳細を参照されたい。図２Ａはラクダキモシンにおけるデータを示す。

【0093】

【図2B】溶出緩衝剤に０．１％ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加した場合の、ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加しない対照と比較した結果を示す。例えば、本願実施例２に記載の詳細を参照されたい。図２Ｂはウシキモシンにおけるデータを示す。

【0094】

【図3】酵素の立体構造の安定性を図示している。

【0095】

【図4】異なる哺乳類種（ウシ、バッファロー、ヤギ、ヒツジ、ラクダ及びブタ）由来の様々な本願乳凝固キモシンの配列のアラインメントを示す。図４の全ての配列は、公然と入手可能である。

【0096】

【図5】商業的に入手可能な異なる哺乳類又は真菌種由来の様々な乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素（ラクダキモシン、ウシキモシン、ウシペプシン、真菌ケカビペプシン及び真菌エンドキア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ペプシン）の配列のアラインメントを示す。図５の全ての配列は、公然と入手可能である。

【0097】

【図6】本願の他のポリマーである合計で２０個のエチレンオキシドモノマーを含むポリソルベート２０の構造を示す。

【発明を実施するための形態】

【0098】

発明の詳細な記載
乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素
下記の本願乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の具体的な検討は、本願において検討される発明の全ての側面に関連する。

【0099】

好ましい態様において、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、キモシン（ＥＣ ３．４．２３．４）、ペプシン（ＥＣ ３．４．２３．１）及びケカビペプシン（ｍｕｃｏｒｐｅｐｓｉｎ）（ＥＣ ３．４．２３．２３）から成る群から選択される乳凝固酵素である。

【0100】

好ましい乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、カメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンで、例えばＷＯ０２／３６７５２Ａ２ （Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ）に記載されている。本明細書中ではこれをラクダキモシンとも称しており、公然知られている成熟ポリペプチドアミノ酸配列は、本願図５に記載されている。

【0101】

本分野で知られているように、酵素の特性を実質的に変化させずに所望の酵素のバリアントを作成する（即ちアミノ酸配列を変更する）ことは、当業者にとってありふれた作業である。

【0102】

従って、好ましい態様において、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する。

【0103】

好ましい乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、ウシキモシンである。ウシキモシンの公然知られている成熟ポリペプチドアミノ酸配列は、本願図５に記載されている。

【0104】

従って、好ましい態様において、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシキモシン又はウシキモシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すウシキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する。

【0105】

好ましい乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、ウシペプシンである。ウシペプシンの公然知られている成熟ポリペプチドアミノ酸配列は、本願図５に記載されている。

【0106】

従って、好ましい態様において、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシペプシン又はウシペプシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すウシペプシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する。

【0107】

好ましい乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、ケカビペプシンである（例えばＥＰ０８０５８６６Ｂ１ （Ｈａｒｂｏｅ ｅｔ ａｌ， Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ Ａ／Ｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ））。公然知られている成熟ポリペプチドアミノ酸配列は、本願図５に記載されている。

【0108】

従って、好ましい態様において、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むケカビペプシン（ケカビと称する）又はケカビペプシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すケカビペプシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する。

【0109】

好ましい乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、エンドキア（Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ペプシンである。公然知られている成熟ポリペプチドアミノ酸配列は、本願図５に記載されている。

【0110】

従って、好ましい態様において、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むエンドキアペプシン（エンドキアと称する）又はエンドキアペプシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すエンドキアペプシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する。

【0111】

ポリマー
上記で検討したように、第一の側面の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物、第二の側面の乾燥組成物、及び／又は第五の側面の所望の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の単離方法におけるポリマーは、以下の特性（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）又は任意の（Ｄ）：
（ａ）当該ポリマーは、エチレンオキシド、ビニルポリピロリドン、ビニルアルコール、酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリレート及びメタクリレートからなるモノマーの群から選択される１つ以上のモノマーのポリマーである；及び
（ｂ）当該ポリマーは、分子量２００ｇ／ｍｏｌ〜５００００ｇ／ｍｏｌのポリマーである；及び
（ｃ）当該ポリマーは、反復モノマー／要素数（いわゆる「ｎ」数）が、ｎ＝５〜ｎ＝１２５０のポリマーである；及び
（Ｄ）任意で、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の特性を備えるポリマーが、上記特性（ａ）のモノマーと異なる１つ以上の置換基化合物を含み、当該ポリマーが置換されたポリマーである場合、斯かる置換されたポリマーの分子量は上記特性（ｂ）の範囲内であり、置換基化合物の分子量は、置換されたポリマーのポリマー部分の分子量を下回る；
を有するポリマーである。

【0112】

下記本願ポリマーの具体例の検討は、本願で検討される本発明の全ての側面に関連する。

【0113】

本分野における当業者に理解されるように、特性（ａ）の２つ以上のモノマーのポリマーは、本分野においてヘテロポリマー又はコポリマーと称されても良く、これらは、ホモポリマーが１つのモノマーで構成されるのに対して、２つ以上のモノマー種で構成される。即ち、特性（ａ）の１つのモノマーで構成されるポリマーは、本分野において、ホモポリマーと称され得る。

【0114】

特性（ａ）において、ポリマーは、特性（ａ）の群から選択される２つの異なるモノマーで構成されるポリマーであるのが好ましい。

【0115】

好ましくは、当該ポリマーはホモポリマーである。

【0116】

任意の特性（Ｄ）において、置換基化合物の分子量は、置換されるポリマーのポリマー部分の分子量の２分の１以下であるのが好ましく、より好ましくは、置換基化合物の分子量は、置換されるポリマーのポリマー部分の分子量の４分の１以下である

【0117】

本願において好ましい置換されるポリマーはＢｒｉｊ３５で、その構造は本願図１に示されている。

【0118】

置換化合物は、例えば、Ｃ_１−Ｃ_２５アルキル（例えばＣ_１−Ｃ_２５置換アルキル）、Ｃ_１−Ｃ_２５アルケニル（例えばＣ_１−Ｃ_２５置換アルケニル）であってもよく、当該アルキル及び／又はアルケニルは、直鎖、環状又は分岐であってもよい。

【0119】

本分野で知られているように、ポリマーは、例えばＣｌ、Ｂｒ及び類似の置換基化合物を含んでも良く、即ち、Ｃｌ、Ｂｒも、本願置換基化合物の例であり得る。

【0120】

好ましくは、前記ポリマーは、分子量７５０ｇ／ｍｏｌ〜３０，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば分子量２０００ｇ／ｍｏｌ〜２０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー、又は例えば５０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌのポリマーである。

【0121】

本願で当業者が理解するように、好ましい分子量は、具体的なポリマーの種類や、置換されたポリマー（例えばＢｒｉｊ３５）であるか否かに依存し得る。

【0122】

好ましくは、前記ポリマーは、反復モノマー／要素数（いわゆる「ｎ」数）が、ｎ＝２０〜ｎ＝５００のポリマー、例えば反復モノマー／要素数（いわゆる「ｎ」数）が、ｎ＝１００〜ｎ＝３００のポリマーである。

【0123】

分子量と同様に、本分野の当業者が理解するように、好ましい「ｎ」数は、具体的なポリマーの種類や、置換されたポリマー（例えばＢｒｉｊ３５）であるか否かに依存し得る。

【0124】

本願において、例えば所望の特定の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素（例えばウシ又はラクダキモシン）に関して本願における安定性の改善を達成するために、本願所望の特定のポリマーにおいて最適な分子量及び／又は「ｎ」数を設定することは、当業者にとってありふれた作業である。

【0125】

好ましくは、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルポリピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリソルベート又はＢｒｉｊ３５である。

【0126】

前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルポリピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート又はポリメタクリレートである場合、当該ポリマーは、分子量１５００ｇ／ｍｏｌ〜４０，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば分子量２０００ｇ／ｍｏｌ〜３０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー、又は例えば５０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌのポリマーであるのが好ましい。

【0127】

好ましくは、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート２０又はＢｒｉｊ３５である。

【0128】

ＰＥＧに関して、分子量１５００ｇ／ｍｏｌ〜４０，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば分子量２０００ｇ／ｍｏｌ〜３０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー、又は例えば５０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌのポリマーであるのが好ましい。

【0129】

第一及び／又は第二の側面−乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体及び／又は乾燥組成物
上記で検討したように、本発明の第一の側面は、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物であって：
（ｉ）組成物１ｇあたり２５〜３００００ＩＭＣＵの強度の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素；
（ｉｉ）１ｐｐｍ〜１００００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度のポリマー；及び
（ｉｉｉ）１〜３５０ｇ／ｋｇの濃度の塩；
を含有し；
かつｐＨが２〜８であり；
かつ当該ポリマーが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意で（Ｄ）の特性（本願において記載）を有する、当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物に関する。

【0130】

上記で検討したように、本発明の第二の側面は、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の乾燥顆粒化組成物であって：
（ｉ）組成物１ｇあたり２５〜３００００ＩＭＣＵの強度の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素；
（ｉｉ）１ｐｐｍ〜１００００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度のポリマー；及び
（ｉｉｉ）塩；
を含有し；
かつ当該組成物が水に懸濁した場合のｐＨが２〜８であり；
かつ当該ポリマーが、以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意で（Ｄ）の特性（本願において記載）を有する、当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の乾燥顆粒化組成物に関する。

【0131】

液体及び乾燥組成物のいずれも、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の好ましい態様／例は、上記に記載されている。

【0132】

液体及び乾燥組成物のいずれも、ポリマーの好ましい態様／例は、上記に記載されている。

【0133】

液体及び乾燥組成物のいずれも、前記項目（ｉ）における酵素強度が、組成物１ｇあたり１００ＩＭＣＵ〜１００００ＩＭＣＵの強度であるのが好ましく、より好ましくは、組成物１ｇあたり５００ＩＭＣＵ〜６０００ＩＭＣＵの強度である。

【0134】

液体及び乾燥組成物のいずれも、前記項目（ｉｉ）におけるポリマー濃度が、１ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが好ましい。

【0135】

液体及び乾燥組成物のいずれも、前記項目（ｉｉ）におけるポリマー濃度が、１ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが好ましい。

【0136】

液体及び乾燥組成物のいずれも、前記項目（ｉｉ）におけるポリマー濃度が、１０ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが好ましく、５０ｐｐｍ〜４０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのがより好ましく、１００ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが尚もより好ましい。

【0137】

前記項目（ｉｉ）におけるポリマー濃度が、１６０ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）、例えば１７５ｐｐｍ〜４０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが重要であってもよい。

【0138】

前記項目（ｉｉ）におけるポリマー濃度が、５ｐｐｍ〜１４５ｐｐｍ（ｗ／ｗ）、例えば１０ｐｐｍ〜１３０ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが重要であってもよい。

【0139】

液体組成物において、項目（ｉｉｉ）における塩濃度は、好ましくは１０〜３００ｇ／ｋｇ、より好ましくは２５〜２５０ｇ／ｋｇである。

【0140】

当業者が承知しているように、乾燥組成物において、項目（ｉｉｉ）における塩濃度は相対的に高く、例えば５０％（ｗ／ｗ）〜９９．９％（ｗ／ｗ）、又は例えば８０％（ｗ／ｗ）〜９９％（ｗ／ｗ）である。

【0141】

液体及び乾燥組成物のいずれも、好ましくは前記塩は無機塩であって、好ましくは、当該無機塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ_２Ｓ０_４、（ＮＨ_４）_２Ｓ０_４、Ｋ_２ＨＰ０_４、ＫＨ_２Ｐ０_４、Ｎａ_２ＨＰ０_４、ＮａＨ_２Ｐ０_４又はそれらの組み合わせから成る群から選択される。最も好ましくは、前記塩はＮａＣｌである。

【0142】

液体及び乾燥組成物のいずれも、保存料等の更なる添加物／化合物を含有してもよい。

【0143】

当業者が承知しているように、保存料は、一般に、製品の棚寿命の間中微生物の増殖を防止するのに十分な濃度で添加される。

【0144】

保存料の例として、例えば、弱有機酸、例えば蟻酸塩、酢酸塩、乳酸塩、プロピオン酸塩、リンゴ酸塩、安息香酸塩、ソルビン酸塩又はフマル酸塩等が挙げられる。パラベン（パラヒドロキシベンゾエートのアルキルエステル）も、保存料として使用され得る。グリセロール又はプロパンジオールも、保存料として記載されている。

【0145】

液体及び乾燥組成物のいずれも、好ましくはｐＨは３〜７、より好ましくはｐＨは４〜６．５、尚もより好ましくはｐＨは５〜６である。

【0146】

好ましくは、前記液体組成物は、水性組成物であり、例えば水溶液である。本願において、水性組成物又は水溶液は、水、例えば２０重量％以上の水、例えば４０重量％以上の水を含有する任意の組成物または溶液を包含する。好ましくは、本発明の組成物は、５０、６０、７０又は８０重量％以上の水を含有する。より好ましくは、本発明の組成物は、８５、９０、９５重量％の水を含有する。

【0147】

本願実施例２に検討され、また本願図２で見られるように、本願ポリマーを使用して、酵素の特異的活性が顕著に増大した、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を取得できた。

【0148】

本願図２Ａに見られるように、本願ポリマーを使用して、特異的活性が全タンパク質１ｍｇあたり３５０ＩＭＣＵを上回るラクダ酵素組成物が取得され、比較実験（即ちポリマー不添加）において、当該酵素の特異的活性は全タンパク質１ｍｇあたり約２００ＩＭＣＵ程度であった。

【0149】

本願図２Ｂに見られるように、本願ポリマーを使用して、特異的活性が全タンパク質１ｍｇあたり１５０ＩＭＣＵを上回るウシ酵素組成物が取得され、比較実験（即ちポリマー不添加）において、当該酵素の特異的活性は全タンパク質１ｍｇあたり約１２５ＩＭＣＵ程度であった。

【0150】

従って、好ましい態様において、液体及び乾燥組成物のいずれも、
−前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり３００ＩＭＣＵを上回り、より好ましくは乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり３５０ＩＭＣＵを上回り、当該乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有し；又は
−前記乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり１５０ＩＭＣＵを上回り、より好ましくは乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり１６５ＩＭＣＵを上回り、当該乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシキモシン又はウシキモシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すウシキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する。

【0151】

好ましくは、本願液体組成物の合計の重量は１０ｇ〜１００００ｋｇ、例えば１００ｇ〜３０００ｋｇである。

【0152】

好ましくは、本願乾燥顆粒化組成物の合計の重量は０．２５ｇ〜２００ｋｇ、例えば０．５ｇ〜５０ｋｇである。

【0153】

好ましくは、前記組成物は、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物である。

【0154】

第三の側面−保存方法
上記で検討したように、本発明の第三の側面は、以下の工程：
（ａ）第一若しくは第二の側面の、又は本願のいずれかの態様に関する乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を提供する工程；及び
（ｂ）当該組成物を、−１０℃〜５０℃の温度で９０〜２０００日の期間保存する工程；
を含む、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を保存する方法に関する。

【0155】

好ましくは、工程（ｂ）における保存温度は、４℃〜３８℃である。

【0156】

好ましくは、工程（ｂ）における保存期間は、１８０日〜５００日である。

【0157】

第四の側面−食料又は飼料製品の製造方法
上記で検討したように、本願乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物は、本分野において、所望の乳製品（例えばチーズ製品）の製造等に使用され得る。

【0158】

上記で検討したように、本発明の第四の側面は、食料又は飼料製品を生産する方法であって、当該生産方法は、有効量の第一又は第二の側面又は本願の関連する態様の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物を食料又は飼料成分に添加する工程、及び更なる製造工程を実施して食料又は飼料製品を取得する工程、を含む。

【0159】

好ましくは、前記食料又は飼料製品は乳製品であり、前記方法は、有効量の本願単離されたキモシンポリペプチドバリアントを乳に添加する工程、及び更なる製造工程を実施して、乳製品を取得する工程を含む。

【0160】

前記乳は、例えばヤギ、ヒツジ、バッファロー、ヤク、リャマ、ラクダ又はウシの乳であってもよい。

【0161】

前記乳製品は、例えば発酵乳製品、クワルク又はチーズであってもよい。

【0162】

前記第四の側面の食料又は飼料製品を生産する方法、又はその本願における態様は、方法であって、第一に、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素組成物が、前記第三の側面の乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を保存する方法によって保存されたものであり、それが、前記第四の側面の食料又は飼料製品を生産する方法に従い、食料又は飼料成分に添加される。

【0163】

第五の側面−乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法
本発明の第五の側面は、目的の酵素を含有する水性媒体から乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離する方法であって、以下の工程：
（ｉ）アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む複数の成分からなる水性試料を取得する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）の水性試料に対して１〜１００００ｐｐｍの濃度でポリマーを添加してポリマー含有試料を取得する工程；及び
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）のポリマー含有試料からアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を単離することによって、所望の単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を取得する工程；
を含み、
ここで当該ポリマーが、第一の側面に規定される（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）並びに任意で（Ｄ）の特性を備えるポリマーである、当該方法に関する。

【0164】

第五の側面の方法において、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の好ましい例／態様は、上記に記載されている。

【0165】

第五の側面の方法において、ポリマーの好ましい例／態様は、上記に記載されている。

【0166】

前記項目（ｉｉ）におけるポリマー濃度は、１０ｐｐｍ〜５０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが好ましく、１００ｐｐｍ〜４０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのがより好ましく、３００ｐｐｍ〜３０００ｐｐｍ（ｗ／ｗ）の濃度であるのが尚もより好ましい。

【0167】

工程（ｉｉｉ）における「単離」は、本分野における当業者が理解する筈である通り、工程（ｉｉｉ）において取得された単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が、工程（ｉ）のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む多くの成分からなる水性試料と比較して、より単離されている（即ちより高純度である）ことと理解される。

【0168】

一例としては、工程（ｉｉｉ）において取得された単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の純度は、全タンパク質の６０％ｗ／ｗ以上である（即ち単離された組成物中の全タンパク質の６０％ｗ／ｗが単離された凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素である）。なおもより高純度、即ち全タンパク質の９０％ｗ／ｗ以上であってもよい。

【0169】

好ましくは、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルポリピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、又はＢｒｉｊ３５である。

【0170】

前記ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルポリピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリアクリレート又はポリメタクリレートである場合、当該ポリマーは、分子量１５００ｇ／ｍｏｌ〜４０，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば分子量２０００ｇ／ｍｏｌ〜３０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー、又は例えば５０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌのポリマーであるのが好ましい。

【0171】

好ましくは、前記ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート２０又はＢｒｉｊ３５である。

【0172】

ＰＥＧに関し、好ましくは、当該ポリマーは、分子量１５００ｇ／ｍｏｌ〜４０，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば分子量２０００ｇ／ｍｏｌ〜３０，０００ｇ／ｍｏｌのポリマー、又は例えば５０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌのポリマーであるのが好ましい。

【0173】

好ましい態様において、前記工程（ｉｉｉ）において単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素は：
−その特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり３００ＩＭＣＵを上回り、より好ましくはその特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり３５０ＩＭＣＵを上回り、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシンと称する）又はカメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すラクダキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する酵素である；又は
−その特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり１５０ＩＭＣＵを上回り、より好ましくはその特異的活性が、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素タンパク質の合計の１ｍｇあたり１６５ＩＭＣＵを上回り、本明細書中図５に示すポリペプチドアミノ酸配列を含むウシキモシン又はウシキモシンのバリアントであって、当該バリアントは、本明細書中図５に示すウシキモシンポリペプチドアミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上）の配列同一性を有する；
酵素である。

【0174】

工程（ｉ）のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含有する多くの成分からなる水性試料は、生産性宿主細胞（例えば真核性生産性宿主細胞）中での乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の組換え生産によって取得されてもよい。

【0175】

本分野で公知のように、所望の例えば酵素を更に精製する前に、通常、発酵培地中の生産性宿主細胞や他の不要な物質が除去／分離され（例えば遠心分離及び／又は濾過）、即ち、宿主細胞のような大過剰の不要な成分が除去された、所望の酵素を含有する試料が取得される。本分野で公知のように、これは、非精製第一濾過物と呼ばれることもあり、この用語は本願で使用され得て、それは、本願の工程（ｉ）のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む多くの成分からなる水性試料の一例であってもよい。

【0176】

ＷＯ０２／３６７５２Ａ２ （Ｃｈｒ． Ｈａｎｓｅｎ）は、生産性宿主細胞としてアスペルギルス細胞（好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））を用いて、カメリウス・ドロメダリウス（Ｃａｍｅｌｉｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）キモシン（ラクダキモシン）を生産する組換え方法を記載している。

【0177】

従って、好ましくは、前記組換え生産宿主細胞は、アスペルギルス細胞（好ましくはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ））であってもよい。

【0178】

リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）由来のケカビペプシンは、好ましくは、生産宿主細胞として、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）を使用して生産され得る。

【0179】

好ましくは、前記第五の側面の方法は、それが単一の方法でない場合、前記工程（ｉ）の水性試料にＰＥＧ及び無機塩が添加されて、液体−液体（水性）二相系が形成されて、ＰＥＧ相から前記アスパラギン酸プロテアーゼ酵素が回収／単離される。

【0180】

上記のように、ＵＳ５１３９９４３は、そのような液体−液体（水性）二相系の使用に基づくと見做され得る方法を記載している。

【0181】

好ましい態様において、第五の側面の方法は、前記単離工程（ｉｉｉ）が、以下の工程：
（Ａ）疎水部分を含む固体基礎マトリックス含有リガンドを含有することにより当該リガンドへの所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素の吸着を達成する固相上に、前記工程（ｉｉ）のポリマー含有試料を適用する工程；及び
（Ｂ）当該固相から所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を溶出して、当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を回収することにより、所望の精製された単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を取得する工程；
を含む方法である。

【0182】

好ましい態様において、第五の側面の方法は、第五の側面の工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）が：
（ｉ）疎水部分を含む固体基礎マトリックス含有リガンドを含有することにより当該リガンドへの所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素の吸着を達成する固相上に、第五の側面の工程（ｉ）のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含む複数の成分からなる水性試料が適用され；
（ｉｉ）第五の側面の工程（ｉｉ）におけるポリマーの添加が、溶出緩衝剤への添加であり；かつ
（ｉｉｉ）第五の側面の単位工程（ｉｉｉ）が、当該固相から所望のアスパラギン酸プロテアーゼ酵素を溶出して、当該アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を回収することにより、所望の精製された単離された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を取得することを含む；
ことを含む方法である。

【0183】

直上の２つの好ましい態様は、クロマトグラフィー単離方法（例えばカラムクロマトグラフィー）に関するものと見做され得る。そのようなクロマトグラフィーは当業者に周知であり、従って、本願においてクロマトグラフィー法を詳細に記載することを要しない。

【0184】

「固体基礎マトリックス」は、リガンドとの共有結合を可能とする反応性の官能基を含有する固体の骨格材料を意味する。この用語は、本願において固体支持マトリックスとも記載される。

【0185】

本分野で公知のように、前記骨格材料は無機物で、例えばシリカであり、又は有機物である。本願で有用な有機骨格材料として、セルロース及びその誘導体、アガロース、デキストラン、ポリマー、例えばポリアクリレート、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート、コポリマー等が挙げられる。

【0186】

本分野で周知のように、固体基礎マトリックスの例は、いわゆる樹脂であってもよく、本分野で周知のように、この用語は、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）に関連して使用されてもよい。

【0187】

本分野で周知のように、当該固体基礎マトリックスは、好ましくは粒子であり、例えば固体基礎マトリックスは、７５０μｍ以下、又は１００μｍ以下の粒径の粒子を含んでも良い。

【0188】

リガンド基の共有結合を可能とする固体支持マトリックスの反応性官能基は本分野で周知であり、例えばヒドロキシ基、カルボキシ基、チオール及びアミノである。

【0189】

本明細書中、「リガンド」は、リガンドと固体基礎マトリックスとを共有結合させる疎水性部分（あるいは基）及びスペーサーアームを意味する。当該スペーサーアームは、固体基礎マトリックスと選択された基／部分とを共有結合させられる任意の基又は置換基であってもよい。そのようなスペーサーアームは本分野で周知であり、例えばアルキレン基、芳香族基、アルキル芳香族基、アミド基、アミノ基、尿素基、カルバメート基を含む。

【0190】

所望の酵素を含有する水性充填培地は、当該所望の酵素がリガンドと結合又は吸着できる条件下で、リガンドと接触させられる。当業者は、所望の酵素の所望のリガンドへの適切な吸着を達成するためにどうやってその条件を調整する（例えばｐＨを３〜１０、又は４〜８等に調整し、及び／又は流速を調整する）かを承知している。

【0191】

従って、この工程は、当業者が実施するありふれた工程であり、当業者は、様々な本願リガンドを承知している（例えばＹａｎｇ ｅｔ ａｌ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ， １２１８ （２０１１） ８８１３−８８２５のレビューを参照されたい）。

【0192】

当業者は、様々な本願精製／分離技術を承知しており、リガンドに所望の酵素を吸着させるために本願リガンドを含有する固体基礎マトリックスを含有する固相に所望の酵素を含有する本願培地を適用する場合に、例えば、クロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、吸着床（ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）、バッチ吸着、膜吸着及びイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）からなる群から選択される１つ以上の精製技術を使用する。

【0193】

好ましくは、吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）精製技術が使用される。

【0194】

これらの精製技術は全て当業者に周知であり、故に、特定の適切な使用されるリガンドに所望の酵素を適切に結合させること、及び適切に溶出工程を実施して、精製された／単離された所望の酵素を取得することは、当業者にとってありふれた技術である。

【0195】

言い換えると、リガンドへの所望の酵素の適切な吸着、及び所望の酵素の適切な溶出を達成して、精製された／単離された所望の酵素を取得するための、適切な溶媒、緩衝剤等を同定することは、当業者にとってありふれた技術である。

【0196】

従って、本願でこれらの工程を詳細に述べる必要は無いと考える。

【0197】

本分野で周知のように、「クロマトグラフィー」は、単離すべき成分が２つの相、その１つが固定相と呼ばれ、他方の移動相が所定の方向に移動する、当該２つの相の間で分離される、物理的分離方法に関する。

【0198】

本分野で公知のように、「カラムクロマトグラフィー」は、固定床がチューブ内にある分離技術を指す。

【0199】

本分野で公知のように、「吸着流動床（ｅｘｐａｎｄｅｄ ｂｅｄ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）（ＥＢＡ）」は、粘性及び粒状の液体の処理を可能にする調製的クロマトグラフィー技術に関する。

【0200】

ＥＢＡ中のタンパク質が結合した粒子は、古典的なカラムクロマトグラフィーの場合と同じであり、通常のイオン交換、疎水相互作用及びアフィニティークロマトグラフィーリガンドが使用され得る。古典的なカラムクロマトグラフィーがパックされた床で出来た固相を使用する場合、ＥＢＡは、流動化状態の粒子を使用する。ＥＰＡ樹脂は様々なサイズ及び密度の粒子を含むことにより、展開して床が展開状態になったとき、粒径の勾配をもたらし、局所的なループが形成される。全細胞又は細胞デブリ等の粒子はパックされた床のカラムを詰まらせ得るため、流動化床を徐々に通す。従って、ＥＢＡは、粗い培養液又は壊れた細胞のスラリーに使用され得て、故に、パックされた床が使用されるときに要求され得る、遠心分離や濾過等の最初の浄化工程を経る場合がある。

【0201】

「吸着床」、「バッチ吸着」及び「膜吸着」は本分野の当業者に周知である。

【0202】

本分野で公知のように、リガンドの疎水部分は、脂肪族基又は芳香族基であってもよい。

【0203】

脂肪族基は、異なる長さのアルキル基、例えばＣ_２〜Ｃ_４０アルキル基又はＣ_４〜Ｃ_３０アルキル基；異なる長さのアルケニル基、例えばＣ_２〜Ｃ_４０アルケニル基又はＣ_４〜Ｃ_３０アルケニル基；又は異なる長さのアルキニル基、例えばＣ_２〜Ｃ_４０アルキニル基又はＣ_４〜Ｃ_３０アルキニル基等であってもよい。

【0204】

芳香族基は、フェニル基又はベンジル基であってもよい。

【0205】

好ましい態様において、前記リガンドの疎水性部分は、ベンジル基である。

【0206】

好ましい態様において、前記リガンドは、正電荷部分を有していても良く、即ち、前記リガンドは、疎水性部分と正電荷部分を有する。

【0207】

本分野で公知のように、リガンドの正電荷部分は、例えばアミノ基、又は四級アンモニウム基であってもよい。

【0208】

好ましくは、前記疎水性部分はベンジル基であり、前記正電荷部分はアミノ基であり、即ち前記リガンドはベンジルアミンである。

【実施例】

【0209】

実施例１：特異的な乳凝固活性の判定
４．１凝固活性の決定
乳凝固活性は、ＲＥＭＣＡＴ法を使用して決定され、これは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｄａｉｒｙ Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎによって開発された標準的な方法である（ＩＤＦ法）。

【0210】

乳凝固活性は、低温、低脂肪の、１リットルあたり０．５ｇの塩化カルシウム溶液を含有する（ｐＨ〜６．５）乳粉末から調製された標準の乳基質の目視できる凝集に必要な時間から決定される。乳凝固酵素試料の凝固時間は、既知の乳凝固活性を有する参照標準、及び当該試料と同様のＩＤＦ標準１１０Ｂによる酵素組成物と比較された。バリアントの試料は、８４ｍＭ酢酸ｐＨ５．５緩衝剤を使用して、約３ＩＭＣＵ／ｍｌに調整された。その後、２００μｌ酵素をウォーターバス中に置いたガラス試験管中で予温した乳（３２℃）１０ｍｌに添加して、定常的に撹拌しながら３２℃±１℃の定常温度を維持した。

【0211】

乳凝固酵素の全体の乳凝固活性（強度）は、以下の式に従って、試料と同一の酵素組成物を有する標準に対する１ｍｌあたりのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｉｌｋ−Ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｕｎｉｔｓ （ＩＭＣＵ）によって求められる。
強度（ＩＭＣＵ／ｍｌ）＝Ｓ標準×Ｔ標準×Ｄ試料／Ｄ標準×Ｔ試料
Ｓ標準：レンネットにおける国際参照標準の乳凝固活性
Ｔ標準：当該標準の希釈物において得られた凝固時間（秒）
Ｄ試料：試料の希釈係数
Ｄ標準：標準の希釈係数
Ｔ試料：希釈されたレンネット試料において得られた酵素添加してから凝集するまでの時間（秒）

【0212】

４．２全タンパク質量の決定
全タンパク質量は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを説明書通りに用いて決定された。

【0213】

４．３特異的な凝固活性の計算
特異的な凝固活性（全タンパク質１ｍｇあたりのＩＭＣＵ）は、凝固活性（ＩＭＣＵ／ｍｌ）を全タンパク質量（１ｍｌあたりの全タンパク質ｍｇ）で割って求められた。

【0214】

実施例２：溶出緩衝剤へのＰＥＧ又はＢｒｉｊ−３５の添加
ウシキモシン又はラクダキモシンは、アスペルギルス・ニガー中で組換え発現させられた（ＷＯ０２／３６７５２Ａ２に概説）。

【0215】

前記酵素は、アガロースに共有結合したベンジルアミンリガンド（ＷＯ０１／５８９２４Ａ２に記載のベンジルアミンリガンドに類似）を採用する固相抽出アプローチによって精製された。

【0216】

２５μｍＰＥフィルターの付いたウェル容積２ｍｌの９６ウェルフィルタープレートを、製Ｆａｓｔｌｉｎｅ １３００でパックした。

【0217】

ウェルを樹脂でパックして、全てのウェルに６〜８ｍｍの高さの床を与えた。全てのウェル中の樹脂は、５ｍｌの２０ｍＭマロン酸ナトリウムｐＨ５．７で平衡化した。

【0218】

培養物の上澄を、３ｍｌの上澄と０．５ｍｌの２Ｍマロン酸ナトリウムｐＨ５．７とを混合してｐＨ５．７に調整した。そして試料３．５ｍｌを８μｍフィルターに通して粒子を除去し、プレートの９６個の各ウェルに充填した。充填後樹脂を５ｍｌの２０ｍＭマロン酸塩、５００ｍＭのＮａＣｌ緩衝剤ｐＨ５．７で洗浄し、殆ど乾燥させた。当該樹脂を５００μｌアリコートの２０ｍＭマロン酸ｐＨ２．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５％グリセロールで溶出し、バイアル中に回収した。

【0219】

幾つかの実験において、溶出緩衝剤にＰＥＧ−８０００又はＢｒｉｊ−３５が添加され、これらの最終濃度は０．０５〜０．２５ｗ／ｗ％であった。

【0220】

他の実験において、前記酵素が樹脂に結合する前に、ＰＥＧ−８０００又はＢｒｉｊ−３５が添加され、これらの最終濃度は０．０５〜０．２５ｗ／ｗ％であった。

【0221】

対照実験において、ＰＥＧ−８０００又はＢｒｉｊ−３５は添加されなかった。

【0222】

回収直後、溶出物に１．５Ｍマロン酸二ナトリウムが添加されて、ｐＨが５．４〜５．８に調整された。

【0223】

試料は、単離後１日以内にタンパク質濃度及び乳凝固活性に関して解析された。

【0224】

回収されたフラクション中のタンパク質濃度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを使用して解析された。

【0225】

結果
図２は、溶出緩衝剤に０．１％ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加した場合の、ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加しない対照と比較した結果を示す。

【0226】

図２に示されているように、ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を含有する試料の特異的活性は、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５を添加せずに精製した対照試料の２倍に増大した。

【0227】

ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５が酵素が樹脂に結合する前に添加された場合も、同様の肯定的な結果が得られた。

【0228】

図２と同様に、０．０５ｗ／ｗ％のＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５又は０．２５ｗ／ｗ％のＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加しても、肯定的な結果が得られた。

【0229】

結論
上記結果は、ＰＥＧ８０００又はＢｒｉｊ３５を添加して精製した試料の特異的活性は、ＰＥＧ／Ｂｒｉｊ３５を添加せずに精製した対照試料の２倍に増大したことを示す。

【0230】

当該溶出物／試料は、ＰＥＧ８０００／Ｂｒｉｊ３５を含有すると考えられる。

【0231】

実施例３：製剤へのＰＥＧの添加（精製後）
約１１００ＩＭＣＵ／ｇの強度で乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素を含有する、乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物を取得した。

【0232】

組成物は、ウシキモシン、ラクダキモシン及びケカビペプシン（即ち３種類の組成物）において取得された。

【0233】

各組成物に、０．０１５％ｗ／ｗ （１５０ｐｐｍｗ／ｗ）のＰＥＧ８０００を添加した。

【0234】

対照組成物には、ＰＥＧ８０００を添加しなかった。

【0235】

前記組成物は５〜３７℃で６か月間保存され、通常の間隔で乳凝固活性が解析された。

【0236】

上記試験の結果は、ＰＥＧの添加が、試験された乳凝固アスパラギン酸プロテアーゼ酵素の液体組成物の６ヶ月の保存後に、より長期間の保存安定性が増大していた（即ちこれらの組成物はより高いＩＭＣＵ／ｇ活性を維持していた）ことを実証した。

【0237】

実施例４：製剤へのＰＥＧ又はポリソルベート２０の添加（精製後）
産業的酵素の液体製剤は、ポンピング、撹拌及び膜濾過等の単位操作からの物理的力に晒される。部分的に充填された含有された液体製剤の周囲の輸送の途中でのスロッシングもこれに寄与し得る。せん断応力及び水−空気境界への酵素の暴露の増大も、変性や酵素活性の付随的な低下をもたらし得る。

【0238】

酵素又はタンパク質試料の物理的安定性は、試料体積率に対して高い頭部の空間を有する試験管中で試料を繰り返し撹拌することによって試験できる。撹拌に対する様々なアスパラギン酸プロテアーゼ酵素の安定性は、１０ｍｌチューブに充填した試料２ｍｌを旋回装置で１時間転倒することによって調査された。各溶液において、垂直転倒１時間後に各溶液において相対的な乳凝固活性が測定され、全く同一の組成物を含有する非転倒対照と比較された。結果は「保持された活性」として表され、これは、転倒した試料の活性を、転倒していない対照試料の活性で割って得られる。

【0239】

結果：
濃度０．０１５％（１５０ｐｐｍ）で添加されたＰＥＧ８０００は、試験した全てのアスパラギン酸プロテアーゼ酵素の転倒に対する顕著な保護効果を有することが認められた（表ｘ）。このＰＥＧ８０００の保護効果は、ウシキモシン及びラクダキモシンにおいて最も顕著で、ＰＥＧ８０００を添加しないと活性はそれぞれ１１％及び３５％失われた。ウシキモシン及びラクダキモシンの試料にＰＥＧ８０００が添加されると、試料撹拌後の活性の低下が無くなった。ＰＥＧ不添加のラクダキモシンの例において、撹拌後に白色の沈殿が観察された。ＰＥＧを添加したラクダキモシンの試料中には、撹拌後に沈殿は無かった。これは、活性の低下が変性後のタンパク質凝集によるもので、試験管表面への酵素の表面吸着によるものではないことを示唆する。ケカビペプシンにおいて、ＰＥＧ８０００の物理的安定性に対する僅かな保護効果があった。

【0240】

撹拌に対するラクダキモシンの安定性に対するＰＥＧ８０００の影響は、ダイズレシチン、ポリソルベート２０及びモノステアリン酸グリセロールと比較された。表ｙは、ＰＥＧ８０００の効果とポリソルベート２０の効果が類似していたことを示す。ダイズレシチン又はモノステアリン酸グリセロールを添加した試料における保持された活性は、未処理対照試料（添加無し）の場合と同程度であった。これは、本実施例において見られる撹拌に対する安定効果が、界面活性剤による表面吸着の阻害によるものでなく、ＰＥＧ８０００及びポリソルベート２０中に含まれるポリオキシエチレン構造要素に関連する要素であることを示唆する。

【0241】

【表1】

【0242】

【表2】

【0243】

結論
これらの結果は、ＰＥＧ８０００が、液体試料を撹拌することによる物理的力に対するアスパラギン酸プロテアーゼの安定化効果を有することを実証する。更に、ポリソルベート２０等のポリオキシエチレン構造要素を含む他の化合物も同様の安定化効果を有することが示される。

【0244】

参考資料
１： ＥＰ２３３３０５６Ａ１ （ＤＳＭ、出願日２００７年１２月４日）
２： ＷＯ２０１２／１２７００５Ａ１ （ＤＳＭ）
３： ＵＳ５１３９９４３ （Ｇｅｎｅｎｃｏｒ、公開日１９９２年８月１８日）
４： ＵＳ７９９８７０５Ｂ２ （Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、公開日２０１１年８月１６日）
５： ＵＳ２０１１／０００８８４６Ａ１ （Ｑｉａｇｅｎ）

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]