特許 6963336 改変ＥＧＦタンパク質、その製造方法及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6963336

(24)【登録日】2021年10月19日

(45)【発行日】2021年11月5日

(54)【発明の名称】改変ＥＧＦタンパク質、その製造方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/63 20060101AFI20211025BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20211025BHJP

   C07K 14/485 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211025BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20211025BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20211025BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20211025BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20211025BHJP

   C12N 15/19 20060101ALN20211025BHJP

   C07K 1/22 20060101ALN20211025BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/63 Z

   C12P21/02 HZNA

   C07K14/485

   C12N5/10

   A61K38/18

   A61P17/00

   A61K8/64

   A61Q19/08

   !C12N15/19

   !C07K1/22

【請求項の数】22

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2020-542519(P2020-542519)

(86)(22)【出願日】2018年10月23日

(65)【公表番号】特表2021-500069(P2021-500069A)

(43)【公表日】2021年1月7日

(86)【国際出願番号】KR2018012569

(87)【国際公開番号】WO2019083256

(87)【国際公開日】20190502

【審査請求日】2020年6月9日

(31)【優先権主張番号】10-2017-0137132

(32)【優先日】2017年10月23日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2017-0137140

(32)【優先日】2017年10月23日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2018-0125012

(32)【優先日】2018年10月19日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】518438092

【氏名又は名称】プロゲン・シーオー．，エルティーディー．

【氏名又は名称原語表記】ＰＲＯＧＥＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100108855

【弁理士】

【氏名又は名称】蔵田 昌俊

(74)【代理人】

【識別番号】100103034

【弁理士】

【氏名又は名称】野河 信久

(74)【代理人】

【識別番号】100179062

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 正

(74)【代理人】

【識別番号】100199565

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 茂

(74)【代理人】

【識別番号】100219542

【弁理士】

【氏名又は名称】大宅 郁治

(74)【代理人】

【識別番号】100153051

【弁理士】

【氏名又は名称】河野 直樹

(74)【代理人】

【識別番号】100162570

【弁理士】

【氏名又は名称】金子 早苗

(72)【発明者】

【氏名】ヤン、ズンユン

(72)【発明者】

【氏名】ナム、ウンジュ

【審査官】 山本 晋也

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／００３１６１１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５２１４０１（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／６３

Ｃ１２Ｐ ２１／０２

Ｃ０７Ｋ １４／４８５

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ａ６１Ｋ ３８／１８

Ａ６１Ｐ １７／００

Ａ６１Ｋ ８／６４

Ａ６１Ｑ １９／０８

Ｃ１２Ｎ １５／１９

Ｃ０７Ｋ １／２２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する改変ＥＧＦタンパク質。

【請求項2】

前記配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する改変ＥＧＦタンパク質が、配列番号５で示される塩基配列によりコードされるものである、請求項１に記載の改変ＥＧＦタンパク質。

【請求項3】

請求項１に記載の改変ＥＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項4】

請求項３に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。

【請求項5】

前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である、請求項４に記載の宿主細胞。

【請求項6】

改変ＥＧＦタンパク質を製造する方法であって、
工程１） 改変ＥＧＦタンパク質を産生する宿主細胞を培養温度３５℃〜３８℃で培養し；
工程２） 前記宿主細胞を、培養温度を３２℃〜３４℃に低下させた状態で培養する
工程を含み、
前記改変ＥＧＦタンパク質が、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する、方法。

【請求項7】

前記工程１の培養を３〜８日間行う、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記工程１の培養温度が３７℃である、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記工程１の培養をｐＨ６．８〜７．３で行う、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記工程２の培養を７〜１２日間行う、請求項６に記載の方法。

【請求項11】

前記工程２の培養温度が３３℃である、請求項６に記載の方法。

【請求項12】

前記工程２の培養をｐＨ６．８〜７．１で行う、請求項６に記載の方法。

【請求項13】

前記工程１において培養した細胞の数が６×１０^６〜９×１０^６細胞／ｍｌに達した場合に、培養温度を低下させる、請求項６に記載の方法。

【請求項14】

前記工程１及び／又は工程２の培養が流加培養である、請求項６に記載の方法。

【請求項15】

培養液から得た前記改変ＥＧＦタンパク質を精製することをさらに含む、請求項６に記載の方法。

【請求項16】

前記精製をアフィニティークロマトグラフィーにより行う、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記アフィニティークロマトグラフィーがプロテインＡ結合樹脂を使用する、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）である、請求項６に記載の方法。

【請求項19】

請求項１に記載の改変ＥＧＦタンパク質を有効成分として含む、皮膚状態を改善するための化粧料組成物。

【請求項20】

前記皮膚状態の改善が、しわ形成の阻止、皮膚老化の阻止、皮膚弾力性、皮膚再生、外傷又は創傷治癒の改善、角質層の再生、皮膚刺激の緩和、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１９に記載の化粧料組成物。

【請求項21】

請求項１に記載の改変ＥＧＦタンパク質を有効成分として含む、皮膚疾患を予防又は治療するための医薬組成物。

【請求項22】

前記皮膚疾患が、足部潰瘍、褥瘡、口腔粘膜炎、熱傷、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、改変ＥＧＦタンパク質、その製造方法及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

化粧品業界の継続的な発展に伴い、素材に新技術を応用することにより得られた高機能化粧品が化粧品業界全体で開発されている。また、美白、シワ改善、皮膚再生などの効果を求める顧客の増加に伴い、化粧品業界では機能性化粧品の価値が高まり、さまざまな素材を化粧品に組み込む研究が盛んに行われている。最近、表皮成長因子（ＥＧＦ）は、その優れた皮膚再生能力などにより多くの注目を集めている。

【0003】

ＥＧＦは６ｋＤａの小さなタンパク質で、細胞の核に作用し表皮細胞の分裂及び増殖を促進することにより、皮膚の再生過程に関与している。また、このタンパク質は、コラーゲンシンターゼの分泌を調節し、角質層の潰瘍又は損傷の回復に大きな効果を示す(Young Seok Kim, 2006)。ＥＧＦは、皮膚状態を改善する化粧品、糖尿病性足潰瘍の治療薬、創傷治癒剤などに広く用いられているが、このタンパク質は、創傷領域への送達、持続性などが比較的低いという問題がある。したがって、増加したin vivoでの透過性及び持続性を有する新しいＥＧＦタンパク質を開発する必要がある。

【発明の開示】

【0004】

本発明者らは、既存のＥＧＦタンパク質と比較して、優れた細胞透過性、in vivo持続性及び安定性を有する改変ＥＧＦタンパク質を発見し、これにより、本発明を完成させた。

【0005】

本発明の目的は、改変ＥＧＦタンパク質、その製造方法及びその使用を提供することである。

【0006】

上記目的を達成するために、本発明は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する改変ＥＧＦタンパク質を提供する。

【0007】

また、本発明は前記改変ＥＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

【0008】

また、本発明は前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

【0009】

また、本発明は、１）改変ＥＧＦタンパク質を産生する宿主細胞を培養温度３５℃〜３８℃で培養し；かつ、２）前記宿主細胞を、培養温度を３２℃〜３４℃に低下させた状態で培養する工程を含む、改変ＥＧＦタンパク質を製造する方法を提供する。

【0010】

また、本発明は、本発明の改変ＥＧＦタンパク質を有効成分として含む、皮膚状態を改善するための化粧料組成物を提供する。

【0011】

また、本発明は、本発明の改変ＥＧＦタンパク質を有効成分として含む、皮膚疾患を予防又は治療するための医薬組成物を提供する。

【0012】

本発明の改変ＥＧＦタンパク質は細胞膜に結合し、ＥＧＦは効果的に細胞に送達され、それにより細胞透過性及び半減期が増加する。また、過酷な条件でＥＧＦが完全な状態を維持するという点で、改変ＥＧＦタンパク質は向上した長期安定性を有する。したがって、タンパク質の変性のために有効期間が短く、保管及び流通が困難な化粧料組成物及び医薬組成物に、このタンパク質は、非常に効果的に応用することがでる。さらに、本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法は、改変ＥＧＦタンパク質を活性な形態で製造することが可能で、最適な培養温度及びｐＨの確立により優れた生産性で実施できるため、商業的に使用することができる。本発明のある態様では、改変ＥＧＦタンパク質は、２．３ｇ／Ｌ以上の生産性及び７５％以上の精製収率で生産され、このことは、本発明の改変ＥＧＦタンパク質の生産方法の優位性を示す。したがって、本発明の改変ＥＧＦタンパク質は、細胞透過性及びin vivoでの持続性と安定性の点で既存のＥＧＦタンパク質よりも優れており、化粧料組成物又は医薬組成物として使用することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】図１は、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質を発現することができる遺伝子構築物の構造の概略図である。

【図2】図２は、選択した６つのリサーチセルバンク（ＲＣＢ）候補細胞株で発現させたＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。

【図3】図３は、最終細胞株の長期継代安定性を確認するために、３５継代の間に測定されたＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の生産性及び倍加時間のグラフである。

【図4A】図４Ａ〜４Ｃは、過酷な条件下での経時的なＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性のグラフである。図４Ａは、初期段階でのＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性を示す。

【図4B】図４Ａ〜４Ｃは、過酷な条件下での経時的なＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性のグラフである。図４Ｂは、２か月後のＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性を示す。

【図4C】図４Ａ〜４Ｃは、過酷な条件下での経時的なＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性のグラフである。図４Ｃは、３か月後のＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性を示す。

【図5】図５は、凍結解凍（Ｆ／Ｔ）の繰返しに応じた、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性の経時変化のグラフである。Ｆ／Ｔサイクルは合計５回繰り返した。

【図6】図６は、Ｂａｌｂ／ｃマウス及びＳＫＨ-１ヘアレスマウスの皮膚をＦＩＴＣで標識されたＰＢＳ、ＥＧＦ、ＥＧＦ-ｄｅｒｉ及びＥＧＦリポソームタンパク質の各々で処置し、６時間及び１２時間後に、共焦点蛍光顕微鏡を用いて皮膚のそれぞれの層におけるタンパク質の透過性を分析して得た結果である。

【図7】図７は、Ｂａｌｂ／ｃマウス及びＳＫＨ-１ヘアレスマウスの皮膚を、ＦＩＴＣで標識されたＰＢＳ、ＥＧＦ、ＥＧＦ-ｄｅｒｉ及びＥＧＦリポソームタンパク質の各々で処置し、血中ＥＧＦ濃度を経時的に測定して得た結果である。ＥＧＦ（s.c.）は、ＥＧＦを皮下注射した群を意味する。

【図8A】図８Ａは、培養方法の開発においてサプリメントの最適な組合せを選択するために使用された結果である。

【図8B】図８Ｂは、培養方法の開発においてサプリメントの最適な組合せを選択するために使用された結果である。

【図8C】図８Ｃは、培養方法の開発においてサプリメントの最適な組合せを選択するために使用された結果である。

【図9A】図９Ａは、最終的に確立された培養条件での生存細胞密度、生存能力及び生産性である。

【図9B】図９Ｂは、最終的に確立された培養条件での生存細胞密度、生存能力及び生産性である。

【図9C】図９Ｃは、最終的に確立された培養条件での生存細胞密度、生存能力及び生産性である。

【図10A】図１０Ａは、確立された精製方法に従って達成された精製収率及び純度である。

【図10B】図１０Ｂは、確立された精製方法に従って達成された精製収率及び純度である。

【図11】図１１は、標準的なＥＧＦと比較したＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質のin vitro活性である。

【発明を実施するための最良の形態】

【0014】

本発明のある態様では、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する改変ＥＧＦタンパク質が提供される。

【0015】

本明細書では、「ＥＧＦ」という用語は、分子量６ｋＤａで５３アミノ酸からなるタンパク質（配列番号１）を指す。ＥＧＦは表皮細胞の分裂及び増殖を促進し、それにより皮膚損傷を回復し、角質層潰瘍治癒を促進し、皮膚再生などを行い、また、新しい血管を形成し、線維芽細胞を増殖し、コラーゲンシンターゼを分泌する。

【0016】

本明細書では、「改変ＥＧＦタンパク質」という用語は、ＥＧＦ誘導体（以下、ＥＧＦ-ｄｅｒｉという）を指してもよい。本発明では、ＥＧＦ-ｄｅｒｉは、配列番号５で示される塩基配列によりコードされるものであってもよい、配列番号４で示されるアミノ酸配列であってもよい。また、ある態様では、ＥＧＦ-ｄｅｒｉはシグナル配列を含んでいてもよい。シグナル配列を含むＥＧＦ-ｄｅｒｉは、配列番号２で示されるアミノ酸配列であってもよく、それは配列番号３で示される塩基配列によりコードされてもよい。ある態様では、ＥＧＦ-ｄｅｒｉは、標準のＥＧＦと比較してin vivoでの送達及び持続性が向上しているだけでなく、過酷な条件でも長期間タンパク質の活性を保持する可能性がある。したがって、タンパク質の変性のために有効期間が短く、保管及び流通が困難な化粧料組成物に、ＥＧＦ-ｄｅｒｉは、非常に効果的に応用することがでる。

【0017】

本発明の別の態様では、改変ＥＧＦタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。前記発現ベクターはｐＡＤ１５ ＥＧＦ誘導体であってもよい。また、前記宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）であってもよい。ある態様では、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質を発現する発現ベクターｐＡＤ１５ ＥＧＦ誘導体は、発現ベクター系（ProGen、韓国）を用いて構築された。次いで、このベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）-ＤＧ４４ ＤＨＦＲ（−）細胞に導入し、その後、スクリーニングを２回行い、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質が高発現している細胞株を選択した。

【0018】

本発明のさらに別の態様では、１）改変ＥＧＦタンパク質を産生する宿主細胞を培養温度３５℃〜３８℃で培養し；かつ、２）前記宿主細胞を、培養温度を３２℃〜３４℃に低下させた状態で培養する工程を含む、改変ＥＧＦタンパク質を製造する方法が提供される。前記宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞であってもよく、改変ＥＧＦタンパク質は、配列番号２又は配列番号４で示されるアミノ酸配列を有してもよい。

【0019】

本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法において、工程１）及び／又は工程２）は流加培養であってもよい。本明細書では、「流加培養」という用語は、栄養培地が培養開始と同時に培養容器に徐々に添加され、培養液は培養終了まで容器から取り出されない培養方法を指す。流加培養では、培養物中の特定の物質の濃度は、その添加速度を微生物によるその消費速度と比例させることにより、あらかじめ設定した値に制御してもよい。

【0020】

本明細書では、「培地」という用語は、多細胞生物又は組織の外側である人工in vitro環境において、細胞を維持し、成長し、増殖し又は拡大するための栄養溶液を指す。培地は、特定の細胞を培養するために最適化してもよく、その例には、細胞増殖をサポートするために調製された基礎培地、モノクローナル抗体産生を促進するために調製された生産培地、及び栄養素が高濃度に濃縮された濃縮培地を含む。基礎培地は、最小限の細胞増殖をサポートすることができる培地を指す。基礎培地は、亜鉛、鉄、マグネシウム、カルシウム及びカリウムなどの標準的な無機塩、並びに微量元素、ビタミン、エネルギー源、バッファー系及びアミノ酸を供給する。本発明の基礎培地は、細胞増殖期である培養の初期に使用してもよい。ある態様では、Hycell CHO培地が基礎培地として用いられた。

【0021】

本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法は、当該改変ＥＧＦタンパク質を産生する宿主細胞を３５℃〜３８℃で培養する工程を含む。具体的には、３７℃、ｐＨ６．８〜７．３で培養を行ってもよい。

【0022】

宿主細胞を３５℃〜３８℃で培養するこの工程は、細胞増殖工程であって、その間に急速な細胞増殖が生じる。一般に、細胞増殖の培養条件は、細胞の種類、生産しようとする目的タンパク質の種類などにより異なっていてもよい。本発明で使用するＣＨＯ細胞の場合、細胞数は、３７℃、ｐＨ６．８〜７．３で最も活発に増加することが知られている。

【0023】

一方、本発明の培養において、細胞増殖期は、培養開始から３〜８日、特に４〜７日であってもよい。ある態様では、細胞増殖期は培養開始から７日であってもよい。また、ある態様では、細胞増殖期の培養温度は３７℃であってもよい。

【0024】

本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法は、前記宿主細胞を、培養温度を３２℃〜３４℃に低下させた状態で培養する工程を含む。工程１）で、培養細胞数が６×１０^６〜９×１０^６細胞／ｍｌに達すると、培養温度を低下させてもよい。具体的には、３３℃、ｐＨ６．８〜７．１で培養を行ってもよい。

【0025】

上記工程に従い、細胞の培養温度を下げると、細胞は、目的タンパク質の生産を最大化する培養条件のタンパク質生産期に入る。細胞増殖期からタンパク質産生期に入るために、生存細胞密度が最大生存細胞密度の８０％〜９０％に達した時点で、培養条件を変更してもよい。ある態様では、生存細胞密度が約９０％に達した時点で、培養条件を変更してもよい。

【0026】

ある態様では、細胞増殖期からタンパク質産生期への移行が起こる細胞の培養温度は、３３℃であってもよい。培養温度が３５℃以上の場合、得られた改変ＥＧＦタンパク質が不安定になるという問題があり、培養温度が３１℃以下の場合、細胞が十分に増殖しないため、生産性が低下するという問題がある。そして、本発明による培養温度の変更は、培養６〜８日目に行ってもよく、ある態様では、変更は培養７日目に行ってもよい。他方、本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法では、培養温度を３２℃〜３４℃に低下させた状態で培養を行う期間は、３５℃〜３８℃で行われた培養の終了から７〜１２日、特に８〜１０日である。

【0027】

「生存細胞密度（ＶＣＤ）」という用語は、一定の領域における生細胞の量又は数を指す。本発明では、目的タンパク質を高効率で生産するために、生存細胞密度を測定し、適当な数の細胞が生存する場合に培養条件を変更する。生存細胞密度は、細胞の吸光度の測定により確認してもよい。

【0028】

また、本発明では、宿主細胞を培養する工程で、タンパク質生産のために基礎培地にサプリメントを添加してもよい。本明細書では、「サプリメント」という用語は、細胞がタンパク質生産期に入ったときに、健康を維持しながらタンパク質を産生できるように、栄養素を十分に供給するために基礎培地にさらに含まれる物質を指す。一般に、サプリメントには脂質、アミノ酸、ビタミン、成長因子などが含まれる。タンパク質生産のために使用することができるサプリメントの種類は、当該技術分野においてよく知られており、その例には、ＡｃｔｉＣＨＯ（GE Healthcare）、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（GE Healthcare）、ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２（味の素株式会社）が含まれるが、これらに限定されない。特に、サプリメントはＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ（ＣＢ）５及びＡＳＦ Ｆｅｅｄ２であってもよい。

【0029】

サプリメントは、高レベルの組換えタンパク質を生産するために適当な量で添加してもよく、個別に又は組み合わせて使用してもよい。細胞が増殖期を終了しタンパク質生産期に入る直前の時点からサプリメントを添加してもよい。本発明の培養では、サプリメントはタンパク質生産のために温度を下げる１〜３日前から添加してもよい。ある態様では、サプリメントはタンパク質生産のために温度を下げる３日前から添加してもよい。サプリメントは、細胞の生存やタンパク質生産中に消費されるという点から、継続的に添加する必要がある。一般に、サプリメントは、添加した日から１〜３日間隔で定期的に添加してもよい。ある態様では、サプリメントは２日間隔で添加された。

【0030】

サプリメントとしてＣＢ５を用いる場合、その濃度は３．０％〜５．０％であってもよい。ある態様では、ＣＢ５の濃度は、３．０％、３．５％、４．０％、４．５％又は５．０％であってもよいが、これらに限定されず、３．０％が好ましい。また、サプリメントとしてＡＳＦ Ｆｅｅｄ２を用いる場合、その濃度は０．５％〜２％であってもよい。ある態様では、ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２の濃度は、０．５％、１％、１．５％又は２％であってもよいが、これらに限定されず、２．０％が好ましい。そして、宿主細胞を培養する工程において、サプリメントとしてのＣＢ５又はＡＳＦ Ｆｅｅｄ２は、個別に又は組み合わせて添加してもよい。

【0031】

改変ＥＧＦタンパク質製造のためのサプリメントの最適な組合せを確認するために、サプリメントとしてＣＢ５又はＡＳＦ Ｆｅｅｄ２を、以下の組合せで培養中に添加した：ＣＢ５ ４．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ０．５％、ＣＢ５ ３．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．５％、ＣＢ５ ５．０％、ＣＢ５ ４．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．０％又はＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％。その結果、培養中にサプリメントとしてＣＢ５又はＦｅｅｄ２を添加した場合に、優れた生存細胞密度、細胞生存率及び改変ＥＧＦタンパク質の生産性が認められ、特に、ＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％の組合せで最良の結果が得られた。

【0032】

本発明の改変ＥＧＦタンパク質製造のための培養は、１０〜２０日間、特に１２〜１８日間継続してもよく、ある態様では、培養は１５日間継続してもよい。

【0033】

また、本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法は、培養液から得た改変ＥＧＦタンパク質を精製する工程をさらに含んでもよい。改変タンパク質を精製し、高収率で得るために、アフィニティークロマトグラフィーを実施してもよい。特に、プロテインＡ結合樹脂を充填したカラム、すなわち、樹脂リガンドとしてプロテインＡを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、改変ＥＧＦタンパク質を得ることができる。

【0034】

本明細書では、「培養液」という用語は細胞培養後の培養液を指し、細胞が産生し分泌するタンパク質を含む様々な因子を含み、培養終了後、遠心分離で細胞を除去することにより入手してもよい。

【0035】

「アフィニティークロマトグラフィー」という用語は、特異的な生物学的親和性の高い２種類の物質の一方を固定相として用い、この固定相に対する親和性の差を利用して目的物質の分離を行うクロマトグラフィーの１つを指す。したがって、培養液から改変ＥＧＦタンパク質を得る工程において、当該培養液はプロテインＡ結合樹脂を充填したカラムを用いて精製してもよい。

【0036】

このアフィニティークロマトグラフィーで用いる樹脂は、マトリックス、親水性架橋剤及びリガンドから成る。ここで、当該マトリックスは、架橋アガロース、例えば、高度に架橋された高流量アガロースであってもよい。当該リガンドは、本発明の改変ＥＧＦタンパク質に特異的に結合するタンパク質であるプロテインＡであってもよい。樹脂中で、改変ＥＧＦタンパク質はアガロースフラグメントに共有結合され、したがって、改変ＥＧＦタンパク質に選択的に結合してもよい。また、樹脂中のリガンドは長い親水性架橋剤を有するため、分離しようとする目的タンパク質はそこにたやすく結合してもよい。樹脂の例は、MabSelectであってもよい。

【0037】

本明細書では、「プロテインＡ」という用語は、配列番号２又は４で示されるアミノ酸配列を有する改変ＥＧＦタンパク質の特定のサブユニットをエピトープとして認識し、それに特異的に結合することができるタンパク質を指す。ある態様では、プロテインＡ結合樹脂を充填したカラムでは、改変ＥＧＦタンパク質はグリシン溶液で溶出してもよい。この溶液は、適当な濃度及びｐＨで使用してよく、これにより、当該溶液が標的タンパク質の特性や活性を変化させない範囲で、標的タンパク質がプロテインＡに結合するのを防ぐかもしれない。この溶液の適当な濃度は５０ｍＭ〜１５０ｍＭであってもよく、本発明の態様によれば、溶液の濃度は０．１Ｍであってもよい。他方、この溶液の適当なｐＨは３．４〜４．４であってもよく、本発明の態様によれば、溶液のｐＨは３．８であってもよい。

【0038】

ある態様では、上記の確立された方法で精製工程を行う場合、公知のＥＧＦ産生と比較して、同様の活性を示しながら、高いタンパク質収量及び純度が認められる。

【0039】

したがって、本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法では、単純かつ経済的な製造工程が用いられているだけではなく、製造された改変ＥＧＦタンパク質は優れた活性を有し、このことは、上記方法で製造された改変ＥＧＦタンパク質をより安価に消費者に提供することを可能にする。

【0040】

本発明のさらに別の態様では、本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法により得られた改変ＥＧＦタンパク質を有効成分として含有する皮膚状態の改善用化粧料組成物が提供される。

【0041】

ここで、皮膚状態の改善とは、皮膚細胞の機能の低下又は損失から皮膚を保護すること、若しくは、しわ形成の阻止、皮膚老化の阻止、皮膚弾力性、皮膚再生、外傷又は創傷治癒の改善、角質層の再生、皮膚刺激の緩和、及びそれらの組合せからなる群から選択される皮膚状態を改善することを意味する。

【0042】

本発明では、化粧料組成物を使用して皮膚状態を改善する方法が提供される。

【0043】

皮膚状態を改善する方法は、本発明の化粧料組成物を、必要とする対象の皮膚に適用する工程を含んでいてもよい。対象は哺乳動物、具体的にはヒトであってもよい。

【0044】

本発明の化粧料組成物を皮膚に適用する工程は、その剤型に応じて、化粧料組成物を皮膚に直接適用又は噴霧することを含んでいてもよい。ここで、化粧料組成物の使用及び１日の使用回数は、使用者の年齢、性別、使用目的、症状の程度などにより、適当に設定してもよい。例えば、適当な量の化粧料組成物は、１日に１〜６回の頻度で皮膚に適用してもよい。

【0045】

本発明のさらに別の態様では、本発明の改変ＥＧＦタンパク質の製造方法により得られた改変ＥＧＦタンパク質を有効成分として含む、皮膚疾患を予防又は治療するための医薬組成物が提供される。

【0046】

皮膚疾患は、足部潰瘍、褥瘡、口腔粘膜炎、熱傷、及びそれらの組合せからなる群から選択されてもよい。

【0047】

医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。担体は、本発明の医薬組成物の総重量に基づいて、約１〜約９９．９９重量％、５〜９０重量％、１０〜８５重量％、２０〜６０重量％、好ましくは約９〜約９９．９９重量％の量で含まれてもよい。

【0048】

本発明では、医薬組成物を使用して、皮膚疾患を予防又は治療する方法が提供される。

【0049】

皮膚疾患を予防又は治療する方法は、本発明の医薬組成物を、必要とする対象の皮膚に適用する工程を含んでいてもよい。医薬組成物を適用することができる対象は、哺乳動物、具体的にはヒトであってもよい。

【0050】

本発明の医薬組成物を皮膚に適用する工程は、その剤型に応じて、医薬組成物を皮膚に直接適用又は噴霧することを含んでいてもよい。医薬組成物の使用及び１日の使用回数は、使用者の年齢、性別、使用目的、症状の程度などにより、適当に設定してもよい。例えば、適当な量の医薬組成物は、１日に１〜６回の頻度で皮膚に適用してもよい。

【実施例】

【0051】

以下に、実施例により、本発明をより詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は本発明を説明するためだけのものであって、本発明の範囲はそこに限定されない。

【0052】

実施例１ 改変ＥＧＦタンパク質発現ベクターの構築及び細胞株の開発
ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質を発現する発現ベクターｐＡＤ１５ ＥＧＦ誘導体を、発現ベクター系（ProGen、韓国）を用いて構築した。発現ベクターに挿入された遺伝子構築物の構造を図１に示す。このベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）-ＤＧ４４ ＤＨＦＲ（−）細胞に導入し、次いで、高発現モノクローナル細胞株のスクリーニングを２回行った。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）は、細胞の増殖段階である遺伝子複製に必要な４つの要素の１つであるデオキシチミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）の合成に不可欠な酵素である。物質ＨＴ（ヒポキサンチン及びチミジン）はｄＴＭＰの前駆体であり、細胞がｄＴＭＰを合成するのに使用する。

【0053】

ＣＨＯ-ＤＧ４４ ＤＨＦＲ（−）細胞にＤＨＦＲ遺伝子を含む発現ベクターが導入される前は、細胞増殖を可能にするために、ＨＴを含む培地で培養を行われなければならない。標的遺伝子及びＤＨＦＲを発現するプラスミドが安定に挿入され、ＤＨＦＲタンパク質を発現した細胞株のみが生存し、選択されるように、発現ベクターの導入後は、ＨＴを含まない培地で培養が行われた。これはＨＴ選択工程と呼ばれる。このＨＴ選択工程によるＤＨＦＲ及びＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質を発現する細胞株の選択後、ＤＨＦＲの強力な阻害剤であるメトトレキサート（ＭＴＸ）の濃度を段階的に増加させながら、高発現細胞株を選択した。その後、１μＭのＭＴＸで６０〜８０μｇ／１０^６細胞／日の生産性を有する細胞株を選択した。以下の表１に示す６つの細胞株を、ＲＣＢ候補細胞株として選択した。

【0054】

【表1】

【0055】

実施例２ ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質発現の確認
選択した６つのＲＣＢ候補細胞株でＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質が十分に発現しているかどうかを確認するために、６つの細胞株の培養液に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。各レーンにロードされた培養液を表２に示し、各培養液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図２に示す。

【0056】

【表2】

【0057】

図２に示されるように、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質は約６２ｋＤａの分子量を有することが確認された。また、選択した６つの細胞株の培養液では、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質が８０％以上を占めていた。ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質のほとんどは活性な単量体（６２ｋＤａ）で存在し、５％以下が二量体型（１２４ｋＤａ）として観察され、切断型は観察されなかった。

【0058】

実験例１ ＲＢＣ候補細胞株の長期継代安定性の確認
特定の細胞株を医薬品製造用の細胞株として使用するためには、生産中は、生産性と倍加時間をある範囲内で一定に保つ必要がある。実施例１で選択された各ＲＣＢ細胞株を、マスターセルバンク（ＭＣＢ）を介してワーキングセルバンク（ＷＣＢ）とする場合、約１０回以上の継代が必要であった。また、２００Ｌ以上で本培養を行う場合、５継代以上の種培養が必要で、本培養は２０継代以上必要であった。したがって、ＲＣＢ細胞株を医薬品の製造に使用するには、３５回以上の継代の間、生産性と倍加時間を安定に保つ必要がある。これを特定するために、選択したＲＣＢ候補細胞株のそれぞれについて、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の生産性と倍加時間を測定した。生産性の測定では、最初に、培養中の細胞培養物を遠心分離し、新しい培養液の濃度が５×１０^５細胞／ｍｌとなるように懸濁した。続いて、Ｔ-２５フラスコを用い、この懸濁液の５ｍｌを３日間培養した。次に、この培養液を１ｍｌ採取し、そのうちの０．５ｍｌを用いて細胞数を測定し、また、残りの０．５ｍｌを遠心分離して得た上清を使用して、ヒトＩｇＧによるＥＬＩＳＡで、１×１０^６細胞あたりの生産性を測定した。倍加時間（Ｔｄ）は以下のように測定した。培養中の細胞溶液を１２５ｍｌフラスコに０．３×１０^６細胞／ｍｌで接種し、３日間培養した。その後、細胞数を測定した。次の式を用いて計算を行った：
Ｔｄ＝ｌｎ２／ｍ （ｍ＝ｌｎｘ２−ｌｎｘ１／ｔ２−ｔ１）
式中、ｔ１及びｔ２は培養の開始時間と終了時間、ｘ１及びｘ２は培養前後の生存細胞数である。
選択されたＲＣＢ候補細胞株の中で、最良の長期継代安定性を示す細胞株が、医薬品開発のための最終細胞株として選択された。最終細胞株として選択された細胞株Ｆについて、３５継代の間に測定した生産性及び倍加時間を表３及び図３に示す。

【0059】

【表3】

【0060】

表３及び図３に示すように、最終細胞株では、生産性は１００〜１３２％に維持され、倍加時間は約２５時間で一定に維持された。これは、選択された最終細胞株が医薬品製造用の細胞株として使用できることを示す。

【0061】

実験例２ 過酷な条件下でのＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の安定性の確認
過酷な条件下でのＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の安定性を確認するために、１２６μｇ／ｍｌのＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質を、温度４０℃、相対湿度７５±５％で３か月間保管し、ＥＧＦ-ｄｅｒｉの活性を測定した。経時的なＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の量を表４に示し、経時的なＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の活性を表５及び図４Ａ〜４Ｃに示す。

【0062】

【表4】

【0063】

【表5】

【0064】

表４に示すように、４０℃の過酷な条件で、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の形態は、時間の経過とともに７９％、４９．５％、３２％と徐々に減少した。しかし、表５及び図４Ａ〜４Ｃに示すように、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の生物活性はほとんど保持されていた。これは、過酷な条件では、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の部分的な分解が生じたものの、分解物のほとんどは正常なＥＧＦであり、活性を保持していたことを示す。これらの結果から、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質は、過酷な条件下でも損失が少ないという活性保持の点で、高い安定性を示すことが確認された。

【0065】

実験例３ ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の製剤化とその凍結融解
ｐＨ７．２±０．２の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の製剤用緩衝液として用いた。次いで、この緩衝液を用いて製剤化したＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質を、−８０〜−７０℃で冷凍保存した。製剤化されたＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の凍結融解（Ｆ／Ｔ）サイクルを合計５回行った。結果を表６及び図５に示す。

【0066】

【表6】

【0067】

表６及び図５に示すように、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の凍結解凍サイクルが増加すると、ピーク２が増加し、メインピークが減少した。最初の凍結融解サイクルでは、ピーク２が最も高い増加を示し、５回の凍結融解サイクル後、メインピークは約２％減少した。つまり、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質は、合計５回の凍結解凍サイクル後でも約９７％以上の純度を維持した。これらの結果から、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質は、凍結融解サイクルを繰り返した過酷な条件下においても損失が少ないという活性保持の点で、高い安定性を示すことが確認された。

【0068】

実験例４ ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の皮膚透過の分析
ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の皮膚透過性を調べるために、実験動物として、脱毛したＢａｌｂ／ｃマウス及びＳＫＨ-１無毛マウスを準備した。２種類のマウス、すなわち、脱毛クリームにより背の皮膚から体毛を除いたＢａｌｂ／ｃマウス及び遺伝的に無毛のマウスを使用して、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の皮膚透過性が、脱毛による皮膚の人為的損傷により異なるかどうかを調べた。２種類のマウスを、皮膚に塗布するタンパク質に応じて、それぞれ、ＰＢＳ群、ＥＧＦ群、ＥＧＦ-ｄｅｒｉ群、ＥＧＦリポソーム（H&A PharmaChem）群に分けた。それぞれのタンパク質の皮膚透過性を特定することができるように、各タンパク質を蛍光標識試薬であるフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した。ＦＩＴＣで標識されたタンパク質の溶液を、ＦＩＴＣに基づいて２００ｎｇの量で、各群のマウスの皮膚に滴下し、ブラシを用いて塗布した。

【0069】

実験例４．１ ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の経皮送達
ＦＩＴＣで標識された各タンパク質の溶液が各群のマウスの背の皮膚に塗布されてから６時間及び１２時間経過後、マウスを殺し、皮膚組織を取り除いた。皮膚組織は、クライオスタットを用い縦方向の切片を得、その後、共焦点蛍光顕微鏡を用いて、各皮膚層の透過性を分析した。結果を図６に示す。

【0070】

図６に示すように、経皮送達の６時間及び１２時間後に、ＥＧＦ-ｄｅｒｉ群のマウスの皮下組織層にＦＩＴＣのシグナルが認められた。このパターンは、マウスの種類に関係なく同様に認められた。そして、この皮膚透過性は、経皮送達の効率的な方法として一般に知られているリポソームを用いた場合と類似していた。実験中の経皮送達による透過性は、個体差はあるものの、全体的なパターンは十分な再現性で類似していた。これは、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の皮膚透過性が高いことを示す。

【0071】

実験例４．２ ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質の安全性を評価するための採血実験
ＦＩＴＣで標識された各タンパク質の溶液を各群のマウスの背の皮膚に塗布し、その後、眼から採血して経時的な血中ＥＧＦ濃度を測定した。結果を図７に示す。

【0072】

図７に示すように、陰性対照であるＰＢＳ群と比較して、血中のＥＧＦ濃度の増加又は変化は、ＥＧＦ群、ＥＧＦ-ｄｅｒｉ群及びＥＧＦリポソーム群のすべてにおいて、認められなかった。これは、ＥＧＦを皮下に注射した群においても同様であった。これは、血中に送達されるＥＧＦの量は血中のＥＧＦ濃度に比べて非常に少なく、ＥＧＦが体内で急速に酵素分解され、長期的には血中のＥＧＦ濃度に影響を与えなかったことを示す。そして、これらの結果から、ＥＧＦ-ｄｅｒｉタンパク質は化粧料又は医薬品として安全に使用できることが理解された。

【0073】

実験例５ 改変ＥＧＦタンパク質製造のための細胞培養条件の確認
実験例５．１ 最適なサプリメントの確認
改変ＥＧＦタンパク質製造のためのサプリメントの最適条件を確立するために、サプリメントの様々な組合せのもとで細胞を培養した。最初に、０．５×１０^５細胞／ｍｌのクローンを３７℃で６日間、Hycell CHO培地（HyClone、米国）中で培養し（増殖期）、温度を３３℃に変えて、１５日目までクローンを培養した（生産期）。培養ｐＨは、増殖期はｐＨ６．９〜７．３、生産期はｐＨ６．９〜７．１であった。１５０ｒｐｍで開始した培養のかくはん速度は、培養４日目に２００ｒｐｍ、培養６日目に２５０ｒｐｍに増加した。グルコースを毎日３．０ｇ／Ｌ以上に維持した。

【0074】

サプリメントの最適な組合せを確認するために、サプリメントとしてＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ５（ＣＢ５、GE Healthcare、米国）及びＡＳＦ Ｆｅｅｄ２（味の素株式会社）を、培養の４日目、６日目、８日目、１０日目、１２日目及び１４日目に、以下の組合せで添加した：ＣＢ５ ４．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ０．５％、ＣＢ５ ３．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．５％、ＣＢ５ ５．０％、ＣＢ５ ４．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．０％及びＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％。これは、以下の表７及び図８Ａ〜８Ｃに具体的に示されている。

【0075】

【表7】

【0076】

図８Ａに示すように、生存細胞密度（ＶＣＤ）値は、ＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％、ＣＢ５ ４．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．０％及びＣＢ５ ３．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．５％で、７．０×１０^６〜８．０×１０^６細胞／ｍＬであった。これらのうち、最高のＶＣＤ値はＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％で得られた。そして、図８Ｂに示すように、５つの異なるサプリメントの組合せの中で、ＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％及びＣＢ５ ３．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．５％の条件で最良の結果が得られ、１５日間の培養中、細胞生存率が９０％以上に維持された。また、図８Ｃに示すように、培養終了時（１５日目）の改変ＥＧＦタンパク質の生産性は、ＣＢ５ ５．０％で１．０ｇ／Ｌ、ＣＢ５ ４．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ０．５％で１．２９４ｇ／Ｌ、ＣＢ５ ４．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．０％で１．４４ｇ／Ｌ、ＣＢ５ ３．５％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ １．５％で１．７ｇ／Ｌ、そして、ＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％で最高の生産性である１．７４ｇ／Ｌであった。

【0077】

これらの結果から、改変ＥＧＦタンパク質を製造するためのサプリメントの最適な組合せは、ＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％であることが確認された。

【0078】

実験例５．２ 確立された最適条件下での生存細胞密度、細胞生存率、及びＥＧＦタンパク質の生産性の確認
表８に示すように、基礎培地としてHycell CHOを用いる流加法により、実験例５．１で確立された改変ＥＧＦタンパク質を生産するためのサプリメントの最適な組合せのもとで、０．５×１０^６細胞／ｍＬで播種した。培養温度は、培養７日目まで、すなわち増殖期は３７℃に、その後、培養１５日目までは３３℃に保った。培養ｐＨは、３７℃で培養中（増殖期）はｐＨ６．９〜７．３で、３３℃で培養中（生産期）は、ｐＨ６．９〜７．１であった。１５０ｒｐｍで開始した培養のかくはん速度は、培養４日目に２００ｒｐｍ、培養６日目に２５０ｒｐｍに増加した。培養期間中、グルコース濃度は３．０ｇ／Ｌ以上に維持した。培養の４、６、８、１０、１２及び１４日目に、ＣＢ５ ３．０％＋ＡＳＦ Ｆｅｅｄ２ ２．０％をサプリメントとして添加した。結果を図９Ａ〜９Ｃに示す。

【0079】

【表8】

【0080】

図９Ａ〜９Ｃに示すように、２回のバッチで得られた結果を参照すると、ＶＣＤ値は８．０×１０^６〜１２．０×１０^６細胞／ｍＬ（図９Ａ）で、細胞生存率は培養１４日目までは９０％以上、最終培養日である１５日目は８０％以上であった（図９Ｂ）。改変ＥＧＦの生産性は２．３ｇ／Ｌ以上であった（図９Ｃ）。結果を表９に要約する。以上の結果から、標準的なＥＧＦに比べてはるかに優れた培養生産性を有する方法が確立されたことがわかった。

【0081】

【表9】

【0082】

実験例５．３ 改変ＥＧＦタンパク質の精製
ＥＧＦ-ｄｅｒｉの最適化された精製方法は以下のとおりである。まず、プロテインＡを固定相とするカラムをMabselect系で準備し、得られた細胞上清を１４ｇタンパク質／Ｌとなるようにカラムに注入した。続いて、５０ｍＭ リン酸ナトリウム及び５００ｍＭ ＮａＣｌから成るｐＨ７．０の洗浄バッファー１と、５０ｍＭ 酢酸ナトリウムで構成されるｐＨ４．５の洗浄バッファー２を順に用いて、不純物を除去した。次いで、１００ｍＭ グリシンから成るｐＨ３．８の溶出バッファーをカラムに注入し、改変ＥＧＦタンパク質を溶出した。結果を表１０、並びに図１０Ａ及び１０Ｂに示す。

【0083】

【表10】

【0084】

図１０Ａ及び１０Ｂに示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びサイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ−ＨＰＬＣ）の結果から、改変ＥＧＦタンパク質は十分に精製されていることが確認された。また、表１０に示されるように、精製された改変ＥＧＦタンパク質は、７５％以上の精製収率及び９７％以上の純度であった。

【0085】

実験例６ ＥＧＦ標品とＥＧＦ-ｄｅｒｉの生物活性の比較
標準的なＥＧＦとＥＧＦ-ｄｅｒｉの生物活性を比較するために、以下の方法で実験を行った。この実験で使用した標準的なＥＧＦは、the National Institute for Biological Standards and Control（ＮＩＢＳＣ）から得た。

【0086】

まず、ＮＲＫ-４９Ｆ細胞株（ATCC CRL-1570、ラット腎臓）を培地（５％新生仔牛血清(Gibco、Cat# 2610-074)＋ＤＭＥＭ(ATCC、Cat# 30-2002)＋１％抗生物質(Gibco、Cat# 15240-062)）で培養した。続いて、５０ｍＬのアッセイ培地（０．５％新生仔牛血清(Gibco、Cat# 2610-074)＋ＤＭＥＭ(ATCC、Cat# 30-2002)）を用い、０．５×１０^３細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに実験当日に播種した。次に、２つの試料、ＮＩＢＳＣ ＥＧＦ及びＥＧＦ-ｄｅｒｉのそれぞれを、その最終濃度が１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．０１ｎｇ／ｍＬ及び０．００１ｎｇ／ｍＬとなるように、同じアッセイ培地で希釈し、５０ｍＬをプレートの各ウェルに加えた。その後、３７±０．５℃、５±０．５％ＣＯ_２で７２時間培養した。培養終了後、１００ｍＬのCell titer-Glo 2.0試薬を各ウェルに分注し、遮光して室温で１０分間反応を進行させた。そして、発光積分５００、発光Ｌｍ１の条件で測定した。ＥＣ５０値を測定結果に基づいて計算した。結果を図１１に示す。

【0087】

図１１に示されるように、本発明の改変ＥＧＦタンパク質であるＥＧＦ-ｄｅｒｉは、ＮＩＢＳＣで購入した標準的なＥＧＦと同様の生物活性を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図11】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]