特許 6963434 試料導入方法及び試料導入装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6963434

(24)【登録日】2021年10月19日

(45)【発行日】2021年11月10日

(54)【発明の名称】試料導入方法及び試料導入装置

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/04 20060101AFI20211028BHJP

   G01N 30/32 20060101ALI20211028BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20211028BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20211028BHJP

   G01N 30/20 20060101ALI20211028BHJP

【ＦＩ】

   G01N30/04 Z

   G01N30/32 C

   G01N30/86 Z

   G01N30/26 M

   G01N30/20 A

【請求項の数】19

【全頁数】118

(21)【出願番号】特願2017-142311(P2017-142311)

(22)【出願日】2017年7月21日

(65)【公開番号】特開2019-23573(P2019-23573A)

(43)【公開日】2019年2月14日

【審査請求日】2020年4月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】501206149

【氏名又は名称】田中 信男

(73)【特許権者】

【識別番号】390030188

【氏名又は名称】ジーエルサイエンス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100063842

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 三雄

(74)【代理人】

【識別番号】100118119

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 大典

(72)【発明者】

【氏名】田中 信男

(72)【発明者】

【氏名】宇津 秀之

(72)【発明者】

【氏名】黒田 育磨

【審査官】 高田 亜希

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５０４４７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−０４２９４０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００４／０２３２０８０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 実開平０４−００３３５１（ＪＰ，Ｕ）

【文献】 国際公開第２０１０／１１９８０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／００２４０４８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 欧州特許出願公開第０２６２６６９７（ＥＰ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３０／００ −３０／９６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１−２０／２９２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラム充填層の手前までの試料バンド移動流路の一部又は全部において、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させ、前記第一流速から前記第二流速への変更を、流路の切り替えによって行うことを特徴とする試料導入方法。

【請求項2】

液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させることを特徴とする請求項１に記載の試料導入方法。

【請求項3】

液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐ時までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させることを特徴とする請求項１に記載の試料導入方法。

【請求項4】

液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラム充填層の手前までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させることを特徴とする請求項１に記載の試料導入方法。

【請求項5】

前記分離カラム充填層に導入された試料バンドを、分離カラム内が前記第二流速で平衡化してから前記分離カラムから溶出することを特徴とする請求項１から４のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項6】

前記第二流速で分離カラムが平衡化された後に試料バンドの分離カラムへの導入を行うことを特徴とする請求項１又は４に記載の試料導入方法。

【請求項7】

前記第一流速は１〜１００μＬ／ｍｉｎであることを特徴とする請求項１から６のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項8】

前記第二流速／前記第一流速は１．２５以上であることを特徴とする請求項１から７のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項9】

前記分離カラムの内径は４．６ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１から８のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項10】

分離溶出される試料中の成分のピークの溶出容量が５．１６８ｍＬ以下であることを特徴とする請求項１から９のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項11】

前記第一流速から前記第二流速への変更を１７０ＭＰａ／ｍｉｎ以下で行うことを特徴とする請求項１から１０のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項12】

試料の分離溶出を行った後、前記第二流速から前記第一流速に変更することを特徴とする請求項１から１１のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項13】

前記第一流速から前記第二流速への変更の際、前記第一流速から、前記第二流速とは異なる速さ、且つ第一流速よりも速い第三流速に変更し、その後第二流速に変更することを特徴とする請求項１から１２のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項14】

前記試料注入装置から前記分離カラム充填層の手前までの流路の一部の間を第一流速で試料バンドを移動させている時に、流路の切り替えによって前記試料バンドを前記試料バンドの軸方向に交差する方向で分割し、分割された前記試料バンドの少なくとも一部分を前記分離カラム充填層に導入することを特徴とする請求項１から１３のうちいずれか１項に記載の試料導入方法。

【請求項15】

請求項１から１３のうちいずれか１項に記載の前記試料導入方法の効果を予測する方法であって、前記第二流速で試料注入から前記分離カラムを用いた分離溶出までを行う方法で得られる第１クロマトグラムと、前記分離カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、前記第一流速で試料注入から溶出までを行う従来の方法で得られる第２クロマトグラムと、前記分離カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、前記第二流速で試料注入から溶出までを行う従来の方法で得られる第３クロマトグラムを材料として、前記第１クロマトグラムで得られるピークの分散値から前記第３クロマトグラムで得られるピークの分散値を差し引いて、前記第２クロマトグラムで得られるピークの分散値を加えることにより、前記第１クロマトグラムを得るのに用いた前記分離カラムを用いて、前記第２クロマトグラムを得るのに用いた前記第一流速と前記第３クロマトグラムを得るのに用いた前記第二流速を使用して前記請求項１から１３のうちいずれか１項に記載の試料導入方法を実施した場合の、前記第１クロマトグラムを得た方法からのカラム性能改善の程度を予測する方法。

【請求項16】

液体クロマトグラフィー装置における試料導入装置であって、試料注入装置から分離カラム充填層の手前までの試料バンド移動流路の一部又は全部において、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させるための導入制御装置と、前記第一流速から前記第二流速への変更を行うための流路切り替え装置とを備えることを特徴とする試料導入装置。

【請求項17】

液体クロマトグラフィー装置における試料導入装置であって、試料注入装置から分離カラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で試料バンドを移動させるための導入制御装置を備えることを特徴とする請求項１６に記載の試料導入装置。

【請求項18】

前記導入制御装置及び前記流路切り替え装置は、前記第二流速で前記分離カラムが平衡化された後に試料バンドの前記分離カラムへの導入を行うことを特徴とする請求項１６に記載の試料導入装置。

【請求項19】

前記試料注入装置から前記分離カラム充填層の手前までの流路の一部の間に、流路の切り替えによって前記試料バンドを前記試料バンドの軸方向に交差する方向で分割する試料バンド分割装置を備えていることを特徴とする請求項１６から１８のうちいずれか１項に記載の試料導入装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、液体クロマトグラフィーに関し、より詳細には、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）或いは超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）について、高性能及び超高性能を与える条件下での操作方法、特に試料の導入方法に関し、更にはこれらの方法のために必要な試料導入装置に関する。

【0002】

ここで、「高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）」は、最大４０ＭＰａの圧力下で実行される液体クロマトグラフィーを意味する。又、「超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）」は、４０ＭＰａより大きく１３０ＭＰａまでの圧力下で実行される液体クロマトグラフィーを意味する。又、「分離カラム」は、液体クロマトグラフィーにおいて、導入された試料中の成分や溶質の相互分離を行うための装置を意味し、以下、「分離カラム」を単に「カラム」ともいう。

【背景技術】

【0003】

ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣにおいて、分離の高速化、即ち、短時間に大きな理論段数を発生させて分離時間を短縮するためには、小さな充填剤が詰められたカラムを使用することが必要である。しかし、小さなカラム充填剤は、充填剤の間隙（移動相が通る流路）を小さくするので、送液に高い圧力を必要とする。そこで、圧力を低くするために短いカラムが用いられる。

【0004】

又、小さな充填剤の間隙に高速で送液すると、液体と粒子壁との摩擦により熱が発生する。発生した熱はカラム管壁からカラムの外に放散されるが、カラム中心部は高温となり、カラム内に温度分布が生じる結果、移動相溶媒の粘度に基づく送液抵抗や、移動相−固定相間の溶質の分配係数が不均一となるので、同じ溶質でもカラム内の位置に依存して移動速度が不均一となる。これにより溶質のバンド幅が拡がり、カラムの分離性能が低下する。そこで、カラム内の温度平衡を迅速に達成し、カラムの分離性能を保つためには、カラムを細くすることが有効である。

【0005】

以上の理由で、小さな充填剤は、カラムの高い性能を発揮するため、短く細いカラムに充填されることとなる。そして、小さな高性能カラムから溶出される溶質のバンドは、非常に小さな体積及び分散をもつ（非特許文献１）。

【0006】

又、溶質を溶かして試料を作製する溶媒は、溶出力が強い溶媒、溶解力が大きい溶媒、或いは移動相と同じ組成の溶媒を用いることが多い。そして試料がカラムに注入されたとき、試料中の溶媒自身によって溶質がカラム内を進行するので、試料バンド幅が広がり、理論段数を低下させる。そこで、注入する試料の体積を減らすことは非常に重要であるが、試料のハンドリングの容易さと検出器の感度に基づいて、内径１．０〜４．６ｍｍのカラムを使用するとき、一般的に０．１〜２０μＬの試料が注入される。そして、試料がインジェクター等の試料注入装置からカラムまでの流路、例えば接続配管を流れる間に層流（配管の中心において速く、壁際で遅い放物線型のフロープロファイルの形）になることにより、又、Ｕｎｓｗｅｐｔ ｖｏｌｕｍｅの存在（滞留の効果）により、試料バンド幅が拡がる。

【0007】

カラムによって分離された試料成分（溶質）それぞれがクロマトグラム上に現れるピークはガウス分布で近似される。ガウス分布の分散（σ^２：標準偏差σの２乗）には加算性があり、あるＨＰＬＣ装置とカラムを用いて分離された溶質バンドの分散（全体の溶質バンドの分散、σ_total²）は、式１に示すように、カラム本体がもたらす溶質バンドの分散σ_col²と、カラム外の流路等における溶質バンドの分散σ_extra²の合計として表される（非特許文献２）。

【0008】

（式１） σ_total² =σ_col² +σ_extra²

【0009】

カラム外における溶質バンドの分散σ_extra²は、式２に示すように、（１）試料注入装置（ｉｎｊ）と、試料注入装置からカラム入口に至る配管（ｔｕｂｅ１）における溶質バンドの分散（σ_inj² +σ_tube1²）、（２）カラム出口から検出器に至る配管（ｔｕｂｅ２）と検出器セル（ｄｅｔ）における溶質バンドの分散（σ_tube2² +σ_det²）及び（３）検出器からの信号の平均化及びデータ処理装置が信号を取り込む時間間隔がもたらす溶質バンドの分散σ_data²からなる。

【0010】

（式２） σ_extra² =σ_inj² +σ_tube1² +σ_tube2² +σ_det² +σ_data²

【0011】

実際にＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置において得られるピークの分散（全体の溶質バンドの分散、σ_total²）は、式２右辺に、カラムでの溶質バンドの分散（σ_col²）を加えて、式３のように示される。

【0012】

（式３） σ_total² =σ_inj² +σ_tube1² +σ_col² +σ_tube2² +σ_det² +σ_data²

【0013】

カラムの理論段数（Ｎ）は、式４に示すように、溶質の保持時間（t_R）（或いは保持体積（V_R））と溶質バンドの分散を用いて計算される。ここでσ_total-t²は、観測された時間として計算された分散であり、σ_total-v² は体積として計算された分散である。以下、ピーク半値幅（ピーク高さの１／２におけるピーク幅）＝２．３５σとして理論段数を計算した。V_(extra)はカラム外の流路等の体積であり、t_(extra)はV_(extra)を流速で除して求められる。

【0014】

（式４） N=(t_R−t_(extra)）²/σ_total-t² =(V_R−V_(extra)）²/σ_total-v²

【0015】

式５に示す、σ_extra²が無い理想的な条件下でカラムが示すべき理論段数（N_col）と比較して、式４に示す、実際にＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置にカラムを接続して得られる理論段数（Ｎ）は一般的に小さい。これは、式１、式２に示す、カラム外における溶質バンドの分散σ_extra²の寄与に基づくものである。

【0016】

（式５） N_col=(t_R−t_(extra)）²/σ_col-t²）=(V_R−V_(extra)）²/σ_col-v²

【0017】

ここで、σ_extra²に上記（３）のσ_data²を含める理由を以下に述べる。クロマトグラムは検出器シグナルを時間に対してプロットする。クロマトグラムがデータ処理装置に表示されるとき、検出器の出力の遅さと、データ処理装置のデータ取り込みの遅さも、時間を尺度とするピークの拡がり（分散）を与える。移動相液体が一定の流速で流れている場合には、時間を尺度とする溶質バンドの分散を、流速を用いて体積を尺度とする分散に変換し、表すことが出来る。

【0018】

小さなカラムを用いるＨＰＬＣ分離やＵＨＰＬＣ分離において高性能を得るためには、カラム外における溶質バンドの分散σ_extra²を低減することが必要である。σ_extra²の中で、上記（３）のσ_data²は、検出器のレスポンス時間を短くして、データ処理装置のデータ取り込み間隔を短くすることにより低減される。

【0019】

又、上記（２）のσ_tube2² + σ_det²は、カラム出口と検出器セルの接続配管内径を小さく、長さを短くし、検出器セル流路の内径と容量を小さくすることにより低減される。

【0020】

液体試料をＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置に注入する際、試料バンドが、オートサンプラー又はインジェクター等の試料注入装置から配管を通って分離カラムに至る流路で、層流（放物線型のフロープロファイル）及び、接続部品の角（隅）がもたらすＵｎｓｗｅｐｔ ｖｏｌｕｍｅによる滞留の効果により拡散する。上記（１）のσ_inj² +σ_tube1²も、試料注入装置からカラムまでの配管内径を小さく、長さを短くすることと、試料注入装置のサンプルループやサンプルニードルの内径を小さくし、試料が通るバルブ内の流路を小さくすることにより低減されるが、試料注入装置のサンプルループやサンプルニードル、バルブ内の流路は、引圧或いは大気圧下で液体試料を再現性よく通す必要があるので、抵抗になりにくい、実用的な内径の大きさが必要である。

【0021】

以上に示したような、カラム外での溶質バンドの分散σ_extra²は、カラムサイズが小さくなると相対的に大きな寄与となり、小さなカラムであるほど、カラムが本来もっている性能を発揮しにくくなる。一般に使用されているＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置では、カラム管の容量が２００μＬを下回る場合（例えば内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム（カラム管容量約１７３μＬ）や内径１．０ｍｍ、長さ２５ｃｍ（カラム管容量約１９６μＬ）のカラム或いはこれらより容量の小さいカラムの場合）、この傾向が顕著となる。

【0022】

具体的には、ＵＨＰＬＣ装置においては、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムがしばしば使用され、多くの場合０．１〜２．０μＬの試料が注入される。そして、多くのＵＨＰＬＣ装置においては、カラム外での溶質バンドの分散σ_extra²により、保持係数ｋ＝約５を与える溶質について、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムでは約３０％、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム（カラム管容量約３９μＬ）では約７０％以上の理論段数の低下が報告されている（非特許文献３）。

【0023】

又、小さなカラムほど、全体の溶質バンドの分散σ_total²に対して、カラム外での溶質バンドの分散σ_extra²の占める割合が大きくなる傾向にあるが、この傾向は、クロマトグラム上で溶質の保持係数が小さいとき、更に顕著となる。ＵＨＰＬＣ装置において、保持係数ｋ＝約１を与える溶質については、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムにおいても約５０％の理論段数の低下が報告されている（非特許文献４）。内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムについては、σ_extra²はさらに大きな性能低下をもたらす（非特許文献１）。

【0024】

又、ＵＨＰＬＣ装置のカラム外での溶質バンドの分散σ_extra²を減らすため、試料注入装置からカラムに至る流路配管を、装置に元々備え付けられていた配管（内径０．１２７ｍｍ、長さ５５ｃｍ）から、より長さが短い配管（内径０．１２７ｍｍ、長さ２５ｃｍ）に変更することで、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム、内径２．１ｍｍ、長さ１０ｃｍのカラムの性能向上を確認した例が報告されている（非特許文献５）。

【0025】

ＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置の試料注入装置は、送液ポンプとカラムの間に設置されており、通常、試料を入れるインジェクションポート、試料を一時的に溜めて置くサンプルループを備え、インジェクションポートから入れられた試料が、送液ポンプとカラムの間の流路に組み入れられて、カラム内に導入されている。そして、流路に組み入れられた試料は、カラム入口までの流路を拡散しながら移動するので、その流路の容量が試料バンドの分散に大きく影響する。試料注入装置の一種であるオートサンプラーでは、容量５．０〜５０μＬのサンプルループが接続された流路切替バルブが搭載され、この流路切替バルブの出口からカラム入口までの接続には、外径１．６ｍｍ、内径０．１〜０．２５ｍｍ、長さ２０〜３０ｃｍの配管がよく使用される。耐圧があり、カラムの付け替えを繰り返しても破損しにくい外径１．６ｍｍのステンレス管の中では内径０．１ｍｍがもっとも内径が小さい。又、オートサンプラーとカラムオーブンが別々のユニットになっている場合等、流路切替バルブからカラム入口までは一定の長さの配管が必要になる。

【0026】

カラム外での溶質バンドの分散σ_extra²は、カラムサイズが小さくなると相対的に大きな寄与となり、カラム性能を低下させる。内径が小さく、長さが短いカラムを用いて、カラムが本来もっている性能（理論段数）を得るためにはσ_extra²を低減することが必要であるが、中でも、試料注入装置と、試料注入装置からカラム入口に至る配管については、低減について上記のような実際の制限があるので、試料注入装置で注入されてから、カラム入り口に至る流路で拡散する試料バンドについては、これまで上記の方法、或いは、溶出力の小さな溶媒を用いて、カラム入口の固定相に試料を狭いバンドとして吸着させて濃縮する方法（非特許文献６、非特許文献７）以外に有効な解決法が見出されなかった。

【0027】

カラム内部の、充填剤が詰められた層（充填層）以外の構造については、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムについては、充填層を入口側と出口側それぞれから押えるために外径２．１ｍｍ、長さ（厚さ）１ｍｍ、孔径０．２μｍ、空隙率２０％、空隙容量約０．７μＬのフリットが使われていることと、その他に入口側と出口側の分散スペース等の容量が約０．３μＬあることが記されている（非特許文献８）。また、他の例で、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムについては、充填層を入口側と出口側それぞれから押えるために外径２．２ｍｍ、長さ（厚さ）１ｍｍ、孔径０．２μｍ、空隙率２０％、空隙容量約０．７６μＬのフリットが使われていることが記されている（非特許文献９）。

【0028】

ＨＰＬＣ装置とＵＨＰＬＣ装置のカラム外での溶質バンドの分散σ_extra²の値を確認するため、２種のＨＰＬＣ装置と４種のＵＨＰＬＣ装置にて、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ）をつないだ状態で、移動相の流速と試料中の溶質の分散の関係が確認されている。各装置により値は異なるものの、流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎから１．２ｍＬ／ｍｉｎに増やすにつれ、溶質の分散が増える傾向が報告されている（非特許文献１０）。

【0029】

又、ＵＨＰＬＣ装置にて、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオンをつないだ状態で、移動相の流速と試料中の溶質の分散の関係が確認されている別の報告がある。流速を１０μＬ／ｍｉｎから７００μＬ／ｍｉｎに増やすにつれ、溶質の分散が０．５μＬ^２程から２．５μＬ^２程に増える傾向が報告されている。特に１００μＬ／ｍｉｎ以下の流速では、流速が減るにつれて溶質の分散が減る顕著な傾向が報告されている（非特許文献１１）。

【0030】

又、キャピラリーＵＨＰＬＣ装置にて、カラムは使用せず、内部ループ容量１０ｎＬのインジェクターに内径０．０２５ｍｍ、長さ６０ｃｍのフューズドシリカキャピラリーを接続し、更に容量１０ｎＬのＵＶ検出器セルを接続した状態で、移動相の流速と試料中の溶質の分散の関係が確認されていて、流速を０．１μＬ／ｍｉｎから６．０μＬ／ｍｉｎに増やすにつれ、分散が１０ｎＬ^２から２５０ｎＬ^２に増える傾向が報告されている（非特許文献１２）。

【0031】

又、キャピラリーＵＨＰＬＣ装置にて、カラムは使用せず、内部ループ容量２０ｎＬのインジェクターに内径０．０２０ｍｍ、０．０２９ｍｍ、０．０４２ｍｍ、０．０５１ｍｍ、長さ１００ｃｍの４種のフューズドシリカキャピラリーを個別に接続し、更にフューズドシリカキャピラリーの出口に電気化学検出器のマイクロファイバー電極を取り付けた状態で、移動相の流速と試料中の溶質の分散の関係が確認されていて、流速を０．５μＬ／ｍｉｎから１５．０μＬ／ｍｉｎに増やすにつれ、４種のフューズドシリカキャピラリーいずれの場合においても、溶質の分散が増える傾向が報告されている（非特許文献１３）。

【0032】

又、ＨＰＬＣ装置にて、カラムは使用せず、ループ容量１μＬのインジェクターに内径０．１２ｍｍ、長さ３３ｃｍのスチールキャピラリーを接続し、更にスチールキャピラリーの出口に容量４．５μＬのＵＶ検出器セルを取り付けた状態と、カラムは使用せず、ループ容量１μＬのインジェクターに内径０．１２ｍｍ、長さ３３ｃｍのスチールキャピラリーを接続し、更に内径０．２ｍｍ、長さ１００ｃｍのスチールキャピラリーを接続し、更にスチールキャピラリーの出口に容量４．５μＬのＵＶ検出器セルを取り付けた状態で、移動相の流速と試料中の溶質の分散の関係が確認されている。どちらの状態でも流速を５μＬ／ｓｅｃから６０μＬ／ｓｅｃ（０．３ｍＬ／ｍｉｎから３．６ｍＬ／ｍｉｎ）に増やすにつれ、溶質の分散が増える傾向が報告されている。又、流速の増加に応じて溶質の分散が大きくなる勾配は、内径０．２ｍｍ、長さ１００ｃｍのスチールキャピラリーを接続した状態の方が大きくなっている（非特許文献１４）。

【0033】

一方、ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣにおいては、カラムの高い性能が得られる一定の流速（線速度は１ｍｍ／ｓｅｃ以上が多い）での使用が一般的である。単位時間あたりに得られる理論段数を大きくする目的や、分離の高速化、即ち、短時間に大きな理論段数を発生させて分離時間を短縮する目的のため、カラムは、充填剤である全多孔性粒子や表面多孔性粒子の直径が５μｍから３μｍ、更に２μｍ以下の製品が市販され、使用できるようになって来ていて、これに伴い、Ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒプロットの極小値により示される、最もカラム単位長当たりの分散が小さくなる移動相の線速度（最適線速度）は、より高い値になって来た。例えば、充填剤径５μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラムでは最適線速度は１ｍｍ／ｓｅｃ（カラムの空隙率を５０％と仮定して流速に換算すると約０．５ｍＬ／ｍｉｎ）、充填剤径２．６μｍ、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムでは最適線速度は４ｍｍ／ｓｅｃ（カラムの空隙率を５０％と仮定して流速に換算すると約０．４２ｍＬ／ｍｉｎ）、充填剤径１．７μｍ、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムでは最適線速度は６ｍｍ／ｓｅｃ（カラムの空隙率を５０％と仮定して流速に換算すると約０．６２ｍＬ／ｍｉｎ）であることが示されている。また、線速度は（流速／カラム断面積）／カラム空隙割合であることから、最適線速度にあたる流速より低い流速においては、いずれのカラムでも流速が低いほどカラム性能が発揮しにくくなることが示されている（非特許文献１１）。

【0034】

又、Ｖａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒプロットの極小値により示される最適線速度については、試料注入用流路切り替えバルブからカラム入口までの容量だけが異なるＵＨＰＬＣ装置で同じカラムを使用する場合には、試料注入用流路切り替えバルブからカラム入口までの容量が小さいＵＨＰＬＣ装置を使用する方が最適線速度が高くなることが記されている（非特許文献１）。

【0035】

又、一方、ＨＰＬＣでの複数成分の分離を一定の流速での使用で行う際に、全ての成分を十分に分離出来る流速にすると全体の溶出時間がかかり過ぎ、全体の溶出時間を短く出来る流速にすると一部の成分の分離が不十分になるため、分離すべき物質を溶離する間はカラムの性能を発揮しやすい流速（線速度はＣ１８基修飾型モノリスカラムで、１．２２ｍｍ／ｓｅｃあるいは２ｍｍ／ｓｅｃ）とし、その後全体の溶出時間を短く出来るように流速を上げる、即ち物質を溶離している間に流速を変化させることを特徴とする方法が報告されている（特許文献１）。

【0036】

又、ＨＰＬＣでのオートサンプラーへの試料残留を減らす目的で、サンプルループに吸入した試料を、移動相により注入用ニードルからインジェクションポートを経て分析流路に注入する際に、試料の全量がインジェクションポートを通過する時間帯は、移動相の流速を分析条件で定められた一定流速（第１流量。１ｍＬ／ｍｉｎ）よりも下げる（第２流量。０．２ｍＬ／ｍｉｎ）ことにより、ニードルとインジェクションポートとの接続部にかかる圧力を低下させる液体クロマトグラフが報告されている（特許文献２）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0037】

【特許文献1】特表２００２−５０４８５５

【特許文献2】ＷＯ２０１０／１１９８０１

【非特許文献】

【0038】

【非特許文献1】Y. Ma, A. W. Chassy, S. Miyazaki, M. Motokawa, K. Morisato, H. Uzu, M. Ohira, M. Furuno, K. Nakanishi, H. Minakuchi, K. Mriziq, T. Farkas, O. Fiehn, N. Tanaka, Journal of Chromatography A, 1383, 47-57（2015）. Efficiency of short, small-diameter columns for reversed-phase liquid chromatography under practical operating conditions.

【非特許文献2】A. Prus, C. Kempter, J. Gysler, T. Jira, Journal of Chromatography A, 1016, 129−141（2003）. Extracolumn band broadening in capillary liquid chromatography.

【非特許文献3】N. Wu, A. C. Bradley, Journal of Chromatography A, 1261, 113-120 （2012）. Effect of column dimension on observed column efficiency in very high pressure liquid chromatography

【非特許文献4】F. Gritti, C. A. Sanchez, T. Farkas, G. Guiochon, Journal of Chromatography A, 1217, 3000-3012 （2010）. Achieving the full performance of highly efficient columns by optimizing conventional benchmark high-performance liquid chromatography instruments.

【非特許文献5】F. Gritti, C. A. Sanchez, T. Farkas, G. Guiochon, Journal of Chromatography A, 1217, 7677-7689 （2010）. On the extra-column band-broadening contributions of modern, very high pressure liquid chromatographs using 2.1mmI.D. columns packed with sub-2 μm particles.

【非特許文献6】J. P. C. Vissers, A. H. de Ru, M. Ursem, J.-P. Chervet, Journal of Chromatography A, 746, 1-7 （1996）. Optimised injection techniques for micro and capillary liquid chromatography.

【非特許文献7】A. C. Sanchez, J. A. Anspach, T. Farkas, Journal of Chromatography A, 1228, 338-348 （2012）. Performance optimizing injection sequence for minimizing injection band broadening contributions in high efficiency liquid chromatographic separations.

【非特許文献8】F. Gritti, T. McDonald, M. Gilar, Journal of Chromatography A, 1420, 54-65 （2015）. Impact of the column hardware volume on resolution in very high pressure liquid chromatography non-invasive investigations.

【非特許文献9】N. Lambert, S. Miyazaki, M. Ohira, N. Tanaka, A. Felinger, Journal of Chromatography A, 1473, 99-108 （2016）. Comparison of the kinetic performance of different columns for fast liquid chromatography, emphasizing the contributions of column end structure.

【非特許文献10】S. Fekete, J. Fekete, Journal of Chromatography A, 1218, 5286-5291（2011）. The impact of extra-column band broadening on the chromatographic efficiency of 5 cm long narrow-bore very efficient columns.

【非特許文献11】S. Fekete, D. Guillarme, Journal of Chromatography A, 1308, 104-113（2013）. Kinetic evaluation of new generation of column packed with 1.3 μm core-shell particles.

【非特許文献12】F. Gritti, T. McDonald, M. Bunner, M. Gilar, Journal of Chromatography A, 1451, 107-119（2016）. Intrinsic advantages of packed capillaries over narrow-bore columns in very high-pressure gradient liquid chromatography.

【非特許文献13】J. P. Grinias, B. Bunner, M. Gilar, J. W. Jorgenson, Chromatography, 2, 669-690（2015）. Measurement and modeling of extra-column effects due to injection and connections in capillary liquid chromatography.

【非特許文献14】K. P. Hupe, R. J. Jonker, G. Rozing, Journal of Chromatography, 285, 253-265（1984）. Determination of band-spreading effects in high-performance liquid chromatographic instruments.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0039】

上述のように、ＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置に注入された試料は、試料注入装置からカラムに至る配管中で大きな分散を生じる。小さな（内径が小さく、長さが短い）カラムを用いる場合、カラムが本来もっている性能（理論段数）を得るために、カラム外における溶質バンドの分散を最小化することが必要であるが、カラムにとって適切な容量と溶質重量でありながら、試料注入装置からカラム入り口に至る流路とカラム内部の充填層前までの流路で拡散する試料バンドについては、これまで、上記の従来技術、特に、溶出力の小さな溶媒を用いて、カラム入口側の固定相（充填層の入口側）に試料を狭いバンドとして吸着させて濃縮する方法以外に有効な解決法が見出されなかった。

【0040】

又、試料注入装置とカラムの間に、濃縮カラムを入れたバルブを設けて、濃縮カラムに一旦試料を狭いバンドとして吸着させ、その後カラムに試料を導入する方法も用いられているが、試料中の溶質に合わせての濃縮が必要になり、濃縮を行ない難い条件では適用出来ない。

【0041】

非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３のように、カラム外における溶質バンドの分散は、カラム外に使用する配管が、長さが同じであれば内径が小さい方が低減出来、又、流速が小さい方が低減出来ることが確認されていた。しかし、ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣにおいては、カラムの高い性能が得られる一定の流速（一般的に、最適線速度は１ｍｍ／ｓｅｃ以上が多い）での使用が一般的であり、カラム充填剤の微粒子化に伴い、カラム単位長当たりの理論段相当高さが最も小さくなる移動相の線速度（最適線速度）は、より高い値になって来ていて、もし移動相の線速度を低くして使用すれば、カラムの性能が発揮出来ないことから、ＨＰＬＣ装置又はＵＨＰＬＣ装置においてカラムを付けた状態で、流速を小さくすることで溶質バンドの分散を低減することが分離分析に利用されることは無かった。

【0042】

特許文献１に記載の発明は、分離すべき物質を溶離する間はカラムの性能を発揮しやすい流速（内径７．２ｍｍ、長さ８．３ｃｍの、Ｃ１８基修飾型モノリスカラムで３ｍＬ／ｍｉｎ、内径４．６ｍｍ、長さ９．３ｃｍの、Ｃ１８基修飾型モノリスカラムで２ｍＬ／ｍｉｎ）とし、その後全体の溶出時間を短く出来るように流速を上げる、即ち１つあるいはいくつかの溶質がカラムから溶出された後で流速を変化させることを特徴としているが、カラム充填剤種に固有の、カラムの性能を発揮しやすい流速で分離と溶出を行った後に流速を上げていることから、カラム外での溶質バンドの分散の低減には寄与していない。

【0043】

又、特許文献２に記載の発明は、カラム外での溶質バンドの分散の低減には全く着目しておらず、「第２流量は小さすぎるとサンプルループに吸入した試料を分析流路に導入する時間が長くなり、液体クロマトグラフの稼働率が低下する。」、「実際には試料残留によるキャリーオーバが分析結果に影響を及ぼさない大きさの第２流量の値を実験的に定めるのが好ましく、実施例では、第１流量が１ｍＬ／ｍｉｎのときに第２流量を０．２ｍＬ／ｍｉｎとしているが、その値は一例であり、それより多い第２流量でもキャリーオーバが問題にならない程度であれば稼働率を優先させるためにいくらか高めの第２流量を設定することができる。」と記載されている。更に、「流路切り替えバルブからカラムまでの配管を含む分析流路では移動相の流速を分析条件で定められた一定流速（第１流量）とすること」が記載されている。更に、第２流量の最小値が０．２ｍＬ／ｍｉｎであるが、この流量では、試料バンドの分散が顕著に生じてしまう。

【0044】

このことからも明らかなように、特許文献２に記載の発明は、ニードルとインジェクションポートとの接続部にかかる圧力を低下させることが目的であり、そのために、試料がインジェクションポートを通過する時間帯のみ移動相の流速を分析条件で定められた一定流速（第１流量）よりも遅い流速（第２流量）にする構成であり、試料がインジェクションポートを通過後カラム入口までは、移動相の流速を分析条件で定められた一定流速（第１流量）としている。従って、流路切り替えバルブの下流側カラム前の流路では、移動相の流速を分析条件で定められた一定流速（第１流量）としているため、カラム外での溶質バンドの分散が生じている。更に、第２流量であっても、カラム外での溶質バンドの分散が生じている。

【0045】

そこで、本発明は、試料の容量や試料中の溶質重量が分離カラムに対して過大である場合だけでなく、分離カラムに対して適切な量であると考えられる試料についても、一層高いカラム性能を発現させるために、分離カラム外における溶質バンドの分散を低減することを目的とする。又、分離カラムの分離性能、即ち理論段数を向上させることを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0046】

上記課題を解決するための手段としての本発明は、液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラム充填層の手前までの試料バンド移動流路の一部又は全部において、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させることを特徴とする試料導入方法である。

【0047】

又、上記試料導入方法において、試料注入装置から分離カラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させることを特徴とする試料導入方法である。

【0048】

詳しくは、分離カラムの充填層に試料を導入する際に、サンプルループ内、試料注入用流路切り替えバルブの中の流路内及び試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの流路内あるいはサンプルループ内と試料注入用流路切り替えバルブの中の流路内、試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの流路内及び分離カラム充填層の入口側の端部分において、分析条件で定められた流速よりも低い流速で試料バンドを分離カラム充填層手前まで移動させ、あるいは試料バンドが分離カラム充填層入口側境界を跨ぐまで移動させ、あるいは試料バンド全体が分離カラム充填層に入り終わる時まで移動させ、その後分析条件で定められた流速に変えることで、分散の増加を抑えた試料バンドを分離カラム充填層に導入すると共に、分離カラムの性能を発揮し易い、分析条件で定められた流速で試料をカラム充填層内で分離することにより、分離カラムの分離性能を向上させる発明である。

【0049】

又、上記試料導入方法において、液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐ時までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させることを特徴とする試料導入方法である。

【0050】

又、上記試料導入方法において、液体クロマトグラフィーにおいて、試料注入装置から分離カラム充填層前までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させることを特徴とする試料導入方法である。

【0051】

又、上記試料導入方法において、前記分離カラム充填層に導入された試料バンドを、分離カラム内が前記第二流速で平衡化してから前記分離カラムから溶出することを特徴とする試料導入方法である。

【0052】

又、上記試料導入方法において、前記第一流速は１〜１００μＬ／ｍｉｎであることを特徴とする試料導入方法である。

【0053】

又、上記試料導入方法において、前記第一流速は５〜１００μＬ／ｍｉｎであることを特徴とする試料導入方法である。

【0054】

又、上記試料導入方法において、前記第二流速は１０００μＬ／ｍｉｎ以下であることを特徴とする試料導入方法である。

【0055】

又、上記試料導入方法において、前記第二流速／前記第一流速は１．２５以上であることを特徴とする試料導入方法である。

【0056】

又、上記試料導入方法において、前記第二流速／前記第一流速は１．２５〜１２０であることを特徴とする試料導入方法である。

【0057】

又、上記試料導入方法において、前記分離カラムの内径は４．６ｍｍ以下であることを特徴とする試料導入方法である。

【0058】

又、上記試料導入方法において、分離溶出される試料中の成分のピークの溶出容量が５．１６８ｍＬ以下であることを特徴とする試料導入方法である。

【0059】

又、上記試料導入方法において、前記第一流速から前記第二流速への変更を１７０ＭＰａ／ｍｉｎ以下で行うことを特徴とする試料導入方法である。

【0060】

又、上記試料導入方法において、試料の分離溶出を行った後、前記第二流速から前記第一流速に変更することを特徴とする試料導入方法である。

【0061】

又、上記試料導入方法において、前記第一流速から、前記第二流速とは異なる速さ、且つ第一流速よりも速い第三流速に変更し、その後第二流速に変更することを特徴とする試料導入方法である。

【0062】

又、上記試料導入方法において、前記第一流速から前記第二流速への変更を、流路の切り替えによって行うことを特徴とする試料導入方法である。

【0063】

又、上記試料導入方法において、前記試料注入装置から前記分離カラム充填層前までの流路の一部の間を第一流速で試料バンドを移動させている時に、流路の切り替えによって前記試料バンドを前記試料バンドの軸方向に交差する方向で分割し、分割された前記試料バンドの少なくとも一部分を前記分離カラムに導入することを特徴とする試料導入方法である。

【0064】

又、上記試料導入方法の効果を予測する方法であって、前記第二流速で試料注入から前記分離カラムを用いた分離溶出までを行う方法で得られる第１クロマトグラムと、前記分離カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、前記第一流速で試料注入から溶出までを行う従来の方法で得られる第２クロマトグラムと、前記分離カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、前記第二流速で試料注入から溶出までを行う従来の方法で得られる第３クロマトグラムを材料として、前記第１クロマトグラムで得られるピークの分散値から前記第３クロマトグラムで得られるピークの分散値を差し引いて、前記第２クロマトグラムで得られるピークの分散値を加えることにより、前記第１クロマトグラムを得るのに用いた前記分離カラムを用いて、前記第２クロマトグラムを得るのに用いた前記第一流速と前記第３クロマトグラムを得るのに用いた前記第二流速を使用して上記の試料導入方法を実施した場合の、前記第１クロマトグラムからのカラム性能改善の程度を予測する方法である。

【0065】

又、液体クロマトグラフィー装置における試料導入装置であって、試料注入装置から分離カラム充填層の手前までの試料バンド移動流路の一部又は全部において、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で前記試料バンドを移動させるための導入制御装置を備えることを特徴とする試料導入装置である。

【0066】

又、上記試料導入装置において、液体クロマトグラフィー装置における試料導入装置であって、試料注入装置から分離カラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、その後第一流速より速い第二流速で試料バンドを移動させるための導入制御装置を備えることを特徴とする試料導入装置である。

【0067】

又、上記試料導入装置において、前記第一流速から前記第二流速への変更を行うための流路切り替え装置を備えていることを特徴とする試料導入装置である。

【0068】

又、上記試料導入装置において、前記試料注入装置から前記分離カラム充填層前までの流路の一部の間に、流路の切り替えによって前記試料バンドを前記試料バンドの軸方向に交差する方向で分割する試料バンド分割装置を備えていることを特徴とする試料導入装置である。

【発明の効果】

【0069】

本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおいて、サンプルループ内、試料注入用流路切り替えバルブの中の流路内及び試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの流路内あるいはサンプルループ内と試料注入用流路切り替えバルブの中の流路内、試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの流路内及び分離カラム充填層の入口側の端部分において、分析条件で定められた流速よりも低い流速で試料バンドを分離カラム充填層手前まで移動させ、あるいは試料バンドが分離カラム充填層入口側境界を跨ぐまで移動させ、あるいは試料バンド全体が分離カラム充填層に入り終わる時まで移動させ、その後分析条件で定められた流速に変えることで、分離カラムに導入される試料バンドの分散を低減することが可能となった。又、分離カラムの分離性能、即ち理論段数を向上させることが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【0070】

【図1】本発明液体クロマトグラフ概念図

【図2】本発明試料導入方法において用いられる流速と比較例における流速との比較概念図

【図3】カラム入口側構造の概念図

【図4】試料バンドと試料溶媒の存在範囲と充填層入口側境界の位置を示す概念図

【図5A】本発明の試料導入方法を実施した時の試料バンドの幅及び形状（試料溶媒とウラシルの存在範囲）を示す概念図

【図5B】本発明の試料導入方法を実施した時の試料バンドの幅及び形状（試料溶媒とウラシルの存在範囲）を示す概念図

【図6A】比較例の注入法を用いた時の試料バンドの幅及び形状（試料溶媒とウラシルの存在範囲）を示す概念図

【図6B】比較例の注入法を用いた時の試料バンドの幅及び形状（試料溶媒とウラシルの存在範囲）を示す概念図

【図7】本発明に使用したＵＨＰＬＣ装置の試料注入方法を示す概念図

【図8】内径０．２５４ｍｍ配管での、各流速での溶質バンドの溶出容量とピーク幅及び形状を示す図

【図9】内径０．１３ｍｍ配管での、各流速での溶質バンドの溶出容量とピーク幅及び形状を示す図

【図10】移動相流速と溶質バンド分散の相関を示す図

【図11】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図12】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図13】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図14】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図15】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図16】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図17】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図18】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図19】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図20】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図21】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図22】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図23】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図24】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図25】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図26】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図27】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図28】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図29】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図30】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図31】比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図32】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図33】比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図34】本発明の試料バンド導入方法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図35】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図36】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図37】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図38】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図39】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図40】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図41】試料バンド導入装置の実施形態及び導入工程を示す図

【図42】試料バンド導入装置の実施形態及び導入工程を示す図

【図43】試料バンド導入装置の実施形態及び導入工程を示す図

【図44A】流路を切り替えることにより試料バンドを分割する、試料バンド分割装置の実施形態を示す図

【図44B】流路を切り替えることにより試料バンドを分割する、試料バンド分割装置の実施形態を示す図

【図45】試料バンド導入装置の実施形態及び導入工程を示す図

【図46】試料バンドの導入と分割を行う装置の実施形態及び分割導入工程を示す図

【図47】本発明の試料バンド導入方法の効果の予測計算結果を示すグラフと予測計算の材料であるクロマトグラム

【図48】本発明の試料バンド導入方法の効果の予測計算結果を示すグラフと予測計算の材料となるクロマトグラム

【図49】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【図50】内径０．１３ｍｍ配管と０．２５４ｍｍ配管での、流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎでの溶質バンドの溶出容量とピーク幅及び形状を示す図

【図51】本発明の試料バンド導入方法及び比較例の注入法を用いた分析結果のクロマトグラム

【発明を実施するための形態】

【0071】

以下本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明の液体クロマトグラフィーにおける試料導入方法は、試料注入装置から分離カラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動の一部又は全部の間、試料バンドを１００μＬ／ｍｉｎ以下の第一流速で移動させ、続いて第一流速より速い第二流速で試料バンドを移動させる試料導入方法である。

【0072】

「試料注入装置から」とは、移動相を送液する送液ポンプから連通する流路のうち、試料注入装置内に設置された移動相及び試料バンドが流れる流路に入ってからの意味である。従って、「試料注入装置から分離カラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動」は移動相を流路に供給する送液ポンプにより、試料バンドの進行方向の前又は／及び後に位置する移動相と共に行われる移動である。

【0073】

試料バンドが第一流速で移動させられるのは、移動相及び試料バンドを同時に移動させる送液ポンプで移動相と共に試料バンドの移動が行われる流路であって、試料注入装置から分離カラム充填層の手前までの試料バンド移動流路の一部又は全部である。試料バンド移動流路にはサンプルループ内の流路、試料注入用流路切り替えバルブの内の流路、試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの流路が含まれる。

【0074】

そして、分離カラム（以下単に「カラム」ともいう。）の充填層に試料を導入する際に、試料注入装置から分離カラム充填層（以下単に「カラム充填層」ともいう。）前までの試料バンド移動流路内において、言い換えれば、試料バンドが分離カラム充填層に入る前まで、又は、試料注入装置から分離カラム充填層前までの試料バンド移動流路内及び分離カラム充填層の入口側の端部分において、言い換えれば、試料バンドが分離カラム充填層入口側境界を跨ぐまで或いは試料バンド全体が分離カラム充填層に入り終わる時まで、分析条件で定められた流速よりも低い流速で試料バンドを移動させ、その後分析条件で定められた流速に変えることで、試料注入装置から分離カラム充填層前までの試料バンド移動流路内での試料バンドの分散の増加を抑えながら試料バンドを分離カラムの充填層に導入すると共に、試料の分離カラム充填層内での分離にはカラムの性能を発揮出来る、分析条件で定められた流速を用いる方法である。

【0075】

この方法を実施するための本発明の液体クロマトグラフ１は、高性能液体クロマトグラフ及び超高性能液体クロマトグラフを含み、図１に示すように、移動相容器９０内の移動相９１を流路に供給する送液ポンプ５、試料注入用流路切り替えバルブ３及びサンプルループ３００を備え、所定量の試料を適時に流路に供給する試料注入装置４、試料導入装置１０、試料を成分毎に分離する分離カラム２、分離カラム２で分離された試料成分を検出する、検出器セル９９１を備えた検出器９９、これらを接続する配管６及び導入制御装置１８を備えて構成されている。特に、試料注入装置４、詳しくは試料注入用流路切り替えバルブ３出口と分離カラム２はカラム前配管６３で接続されている。試料導入装置１０は、分離カラム２に試料を導入するための装置であり、試料注入用流路切り替えバルブ３及びサンプルループ３００を備えた試料注入装置４、送液ポンプ５及び導入制御装置１８、移動相容器９０を備えて構成することが出来る。

【0076】

試料注入装置は、サンプルループを接続して固定した試料注入用流路切り替えバルブを含む構成の固定ループ注入方式のオートサンプラーを用いるが、サンプルループを接続して固定した試料注入用流路切り替えバルブを含む構成のマニュアルインジェクター、サンプル容器から試料を吸引するためのニードルを含む流路がサンプルループとしても使用され、試料注入用流路切り替えバルブを含む構成のダイレクト注入方式もしくはダイレクトインジェクション方式のオートサンプラー、試料送液用ポンプからの流路が試料注入用流路切り替えバルブや逆止弁を介して、移動相送液用ポンプとカラムをつないだ流路に接続されたオートサンプラー等、移動相送液用ポンプとカラムをつないだ流路に、試料注入用流路切り替えバルブや逆止弁を介して試料バンドを注入出来る試料注入装置を用いることが出来る。

【0077】

分離カラム２内には充填剤が充填されて分離カラム充填層２０が構成されている。試料注入装置４から分離カラム充填層２０の手前までの流路である試料バンド移動流路７は、送液ポンプ５と分離カラム２を連通する流路のうち移動相９１及び試料バンドが流れる流路であり、図１及び図３に示すように、試料注入用流路切り替えバルブ３、サンプルループ３００、試料注入用流路切り替えバルブ３の下流側に配置されるカラム前配管６３、カラム前配管６３と分離カラム２を連結するエンドユニオン２０６を備えて構成されている。分離カラム充填層２０と試料バンド移動流路７との境目には分離カラム充填層入口側の境界２００が存在し、図３においては、分離カラム２内の分離カラム充填層２０の上流側にはフリット２０５が設置され、分離カラム充填層２０とフリット２０５の接触面が境界２００を構成している。移動相及び試料は、カラム前配管６３から、エンドユニオン２０６内流路２０３及びコーン（分散スペース）２０４、フリット２０５を通じて、分離カラム充填層２０に供給される。従って、フリット２０５までは試料バンド移動流路７を構成している。尚、分離カラム２はフリット及び／又はコーン（分散スペース）を設置しない構成としてもよい。

【0078】

導入制御装置１８は、送液ポンプ５の動作を制御して、流路に供給される移動相９１の流量をコントロールして流速を制御する流速プログラムを備えた装置であり、コンピュータで構成されている。導入制御装置１８は、移動相９１を配管６及び分離カラム２を含む流路に流す際の分析条件で定められた流速である第二流速と分析条件で定められた流速よりも低い流速である第一流速の２種類の流速が設定されている。第二流速は試料成分の分離及び検出を行うための流速である。又、導入制御装置１８は、試料注入装置４の試料注入動作、具体的には、サンプルバイアルから試料を吸引して試料注入用流路切り替えバルブ３内とサンプルループ３００内に運び、試料注入用流路切り替えバルブ３のポジションを切り替えて試料をカラム前配管６３に注入する動作等試料を試料バンド移動流路に注入し分離カラムに導入するための制御も行う。

【0079】

図２と図４に示すように、導入制御装置１８の制御により、試料注入装置４から試料が試料バンド移動流路７に注入されると同時、或いは注入される前から、分析条件で定められた流速よりも低い流速である第一流速で移動相が送液ポンプ５下流の流路に供給されて、注入された試料バンド１００が第一流速で試料バンド移動流路７内を分離カラム２方向へ移動する（図４（Ａ））。その後試料バンド１００が分離カラム２の充填層２０内に入り始める前（図４（Ｂ））に、あるいは試料バンドが分離カラム２の充填層２０の入口側境界を跨いでいる時（図４（Ｃ））に、あるいは試料バンド１００全体が分離カラム２の充填層２０に入り終わった時（図４（Ｄ））に、導入制御装置１８の制御により、送液ポンプ５の流速を分析条件で定められた流速に変え、分析条件で定められた流速である第二流速で移動相が送液ポンプ５下流の流路に供給されて、試料バンドが第二流速で、試料バンド移動流路７及び分離カラム２の充填層２０内又は分離カラム２の充填層２０内、更には分離カラム２より下流の配管６６及び検出器９９を移動する。

【0080】

図４（Ａ）及び図４（Ｂ）は、試料バンドが分散しながら移動し、分離カラム２の充填層２０に導入されるイメージ図である。ここでは、試料バンドに複数の溶質が含まれる場合は、その中に分離カラム充填層を素通りする溶質と、分離カラム充填層に保持される溶質を含むものとして説明する。試料バンドに分離カラム充填層を素通りする溶質が無い場合にも、試料を溶解させている試料溶媒はバンドとなり分離カラム充填層を素通りする。試料バンドが充填層２０に入っていない時は試料バンド１００中には複数の溶質が含まれ、一体になって移動している（図４（Ａ）、図４（Ｂ））。

【0081】

試料バンドが分離カラム充填層入口側境界２００を跨いだ時には、試料バンドの内、分離カラム充填層に導入された部分では、分離カラム充填層に保持される溶質は、分離カラム充填層を素通りする溶質より低い速度で充填層内を進んでいるが、試料バンドに含まれる複数の溶質全ては分離カラム充填層入口側境界２００を跨いでいる（図４（Ｃ））。

【0082】

試料バンド全体が分離カラム充填層２０に入り終わった時には、分離カラム充填層に保持される溶質は、分離カラム充填層を素通りする溶質より低い速度で分離カラム充填層内を進んでいるが、試料バンドに含まれる複数の溶質全てが分離カラム充填層２０に入り終わっている（図４（Ｄ））。

【0083】

又、試料バンドに溶質が一種類だけ含まれる場合も、試料バンドが分離カラム充填層入口側境界２００を跨いだ時には、試料バンドの内、分離カラム充填層に導入された部分では、一種類の溶質が分離カラム充填層を素通りしていたとしても、或いは一種類の溶質が分離カラム充填層に保持される溶質であって、試料溶媒より低い速度で分離カラム充填層内を進んでいたとしても、試料バンドに含まれる一種類の溶質は分離カラム充填層入口側境界２００を跨いでいる（図４（Ｃ））。試料バンド全体が分離カラム充填層２０に入り終わった時には、一種類の溶質が分離カラム充填層を素通りしていたとしても、或いは一種類の溶質が分離カラム充填層に保持される溶質であって、試料溶媒より低い速度で分離カラム充填層内を進んでいたとしても、試料バンドに含まれる一種類の溶質全てが分離カラム充填層２０に入り終わっている（図４（Ｄ））。

【0084】

図５Ａ及び図５Ｂは、後述する実施例１６、図２５（Ｃ）で得られたクロマトグラムにおいて、各流路や分離カラムの充填層中でウラシルを含む試料バンドがどのように広がりながら移動しているかを、図４７（Ｂ）も参考に描いたイメージ図である。又、図６Ａ及び図６Ｂは、図２５（Ａ）（比較例）で得られたクロマトグラムにおいて、各流路や充填層中でウラシル含む試料バンドがどのように広がりながら移動しているかを、図４７（Ｃ）も参考に描いたイメージ図である。

【0085】

図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ及び図６Ｂでは、試料バンドがサンプルループ内にある時（（１））から分離カラムの充填層前の試料バンド移動流路内を移動していて充填層に達していない時までは、試料バンド内に１０種類の溶質が含まれ、混合された状態である。試料バンドが分離カラム充填層入口側境界２００を跨いだ時（（２））には、ウラシル以外の溶質は親水性が低く、分離カラムの充填層２０にある充填剤、即ち、固定相と親和性があるので、分離カラムの充填層を素通りせず固定相に分配されながら移動するので、ウラシルに比べて移動速度が遅くなる（それぞれの溶質はウラシルの１／（１＋ｋ）倍の速度で進む。ｋは保持係数である）。つまり（２）の時に、ウラシルは図に示すピークの形をしているとすると、ウラシル以外の溶質も、それぞれ半分が、（２）のピークの移動する方向から半分の中に含まれ、分離カラムの充填層内に入っている。即ち、、ウラシルのピーク全体が分離カラムの充填層内に入った時には、ウラシル以外の溶質も分離カラムの充填層内に入っている。（３）の時には、ウラシル以外の溶質は分離カラム内の充填層をウラシルよりも遅れて移動している。

【0086】

図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ及び図６Ｂでは、実施例１６で使用した、試料注入用流路切り替えバルブ出口（ポートａ）からカラム入口までの配管（内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管）の容量約１．９９μＬに、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）入口側のエンドユニオン内流路、コーン及びフリット空隙の合計の容量約１．１０μＬを加算した約３．０９μＬを、試料注入用流路切り替えバルブのポートａと分離カラム充填層入口側の境界２００の間の容量として記載している。

【0087】

また、図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ及び図６Ｂでは、実施例１６で使用した、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量約１．０８μＬに、検出器セルの容量６ｎＬを加算し、更にカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）出口側のエンドユニオン内流路、コーン及びフリット空隙の合計の容量約１．１０μＬを加算した約２．１９μＬを、分離カラム充填層出口側の境界と検出器セル９９１出口の間の容量として記載している。

【0088】

また、図５Ａ及び図５Ｂでは、（２）のウラシルのピークのイメージの全値幅を、図４７（Ｂ）のウラシルのピークの分散σ^２＝０．２２μＬ^２からσ＝０．４６９μＬを算出し、更に全値幅の９９．９％として６σ＝６×０．４６９μＬ＝２．８１μＬとした。また、（３）のウラシルのピークのイメージの全値幅を、図２５（Ｃ）のウラシルのピークの半値幅０．０２１０ｍｉｎ＝２．３５σとしてσ＝０．００８９ｍｉｎを算出し、更に全値幅の９９．９％として６σ＝６×０．００８９ｍｉｎ＝０．０５３６ｍｉｎを算出し、図２５（Ｃ）の第二流速０．１ｍＬ／ｍｉｎを乗じて０．００５３６ｍＬ＝５．３６μＬとした。

【0089】

図５Ａと図５Ｂは、図２５（Ｃ）のように、第一流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで試料０．５μＬが送液ポンプとカラムの間の流路に注入され、試料バンドが分離カラム充填層入口側境界を跨いだ時に送液ポンプの流速が第二流速０．１ｍＬ／ｍｉｎに変更され、試料バンド中のウラシルが分離カラム充填層を素通りして検出器セル９９１の出口に達したイメージを示している。（１）は試料注入前でサンプルループ内に試料バンドが入っている時のイメージである。（２）は試料注入から第一流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液し、試料バンドが分離カラム充填層入口側境界２００を跨いでいる時のウラシルのピークのイメージで、図４７（Ｂ）の、カラムの代わりにＺＤＵを使用して流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで採取したピーク（ピークトップの溶出容量は３．２２μＬ）を参照している。参照した理由は、実施例２７の図４７（Ｂ）では、流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎでウラシルを０．５μＬ注入していて、試料注入用流路切り替えバルブ出口にカラム入口までの配管として内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、カラムに代えてＺＤＵ（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社）を用い、ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬ、検出器セルの容量は６ｎＬとしていて、試料注入用流路切り替えバルブ出口から検出器セル出口までの容量は１．９９＋０．０２＋１．０８＋０．００６＝３．１０μＬで、この容量が図５Ａの、試料注入用流路切り替えバルブのポートａと分離カラム充填層入口側の境界２００の間の容量３．０９μＬと同程度だからである。（３）は（２）の状態から送液ポンプの流速を第二流速０．１ｍＬ／ｍｉｎに変更し、試料中の１０種の溶質が分離カラム充填層で分離され、最も早く溶出したウラシルのピークのイメージで、図２５（Ｃ）のウラシルのピークを参照している。

【0090】

また、図６Ａ及び図６Ｂでは、（２）のウラシルのピークのイメージの全値幅を、図４７（Ｃ）のウラシルのピークの分散σ^２＝０．９２μＬ^２からσ＝０．９５９μＬを算出し、更に全値幅の９９．９％として６σ＝６×０．９５９μＬ＝５．７５μＬとした。（３）のウラシルのピークのイメージの全値幅を、図２５（Ａ）のウラシルのピークの半値幅０．０２９１ｍｉｎ＝２．３５σとしてσ＝０．０１２４ｍｉｎを算出し、更に全値幅の９９．９％として６σ＝６×０．０１２４ｍｉｎ＝０．０７４３ｍｉｎを算出し、図２５（Ａ）の流速０．１ｍＬ／ｍｉｎを乗じて０．００７４３ｍＬ＝７．４３μＬとした。

【0091】

図６Ａと図６Ｂは、図２５（Ａ）（比較例）のように、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料０．５μＬが送液ポンプとカラムの間の流路に注入され、試料バンドが分離カラム充填層入口側境界２００を跨ぎ、更に試料バンド中のウラシルが分離カラム充填層２０を素通りして検出器セル９９１の出口に達したイメージを示している。（１）は試料注入前でサンプルループ内に試料バンドがある時のイメージである。（２）は試料注入から送液ポンプの流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液し、試料バンドが分離カラム充填層入口側境界２００を跨いでいる時のウラシルのピークのイメージで、図４７（Ｃ）の、カラムの代わりにＺＤＵを使用して流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで採取したピーク（ピークトップの溶出容量は３．８０μＬ）を参照している。参照した理由は、実施例２７の図４７（Ｃ）では、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎでウラシルを０．５μＬ注入していて、試料注入用流路切り替えバルブ出口にカラム入口までの配管として内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、カラムに代えてＺＤＵ（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社）を用い、ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬ、検出器セルの容量は６ｎＬとしていて、試料注入用流路切り替えバルブ出口から検出器セル出口までの容量は１．９９＋０．０２＋１．０８＋０．００６＝３．１０μＬで、この容量が図６Ａの、試料注入用流路切り替えバルブのポートａと分離カラム充填層入口側の境界２００の間の容量３．０９μＬと同程度だからである。（３）は（２）の状態から引き続き送液ポンプの流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、試料中の１０種の溶質が分離カラム充填層で分離され、最も早く溶出したウラシルのピークのイメージで、図２５（Ａ）のウラシルのピークを参照している。

【0092】

図７には、本発明で使用したＵＨＰＬＣ装置の試料注入方法を示している。本発明で使用した、試料注入装置の試料注入用流路切り替えバルブは、各流路に接続された複数のポート（互いに独立した貫通口）が形成されたステーターに対して、流路溝が設けられたローターシールを押しつけ、それを回転摺動させることによりステーターの各ポートを接続するポジションを切り替える回転式のバルブで、液体クロマトグラフで用いられる一般的な流路切り替えバルブである。試料注入用流路切り替えバルブ３が図７（Ａ）のポジションの時、試料５μＬが試料注入口４１から入れられ、試料注入口４１がつながった試料注入用流路切り替えバルブ３のステーターのポートｅと試料注入用流路切り替えバルブのローターシールに設けられた流路溝（ローターシールの溝）の１つは試料で満たされる。又、ドレイン４２がつながった試料注入用流路切り替えバルブ３のステーターのポートｄも試料で満たされる。次に図７（Ｂ）のポジションに試料注入用流路切り替えバルブ３が切り替わり（試料注入用流路切り替えバルブ３のローターシールが時計周りに回転し）、試料で満たされたローターシールの溝はポートｅとポートｆの間に移動する。この状態で試料がサンプルループ３００に向かって必要量（例えば０．５μＬ）入れられ、ポートｆも試料で満たされる。次に図７（Ｃ）のポジションに試料注入用流路切り替えバルブ３が切り替わり（試料注入用流路切り替えバルブ３のローターシールが反時計周りに回転し）、試料で満たされたローターシールの溝はポートｄとポートｅの間に移動し、一方で送液ポンプからカラムに向かって流れている移動相により、ポートｆとサンプルループ３００内にあった０．５μＬの試料は図７（Ｄ）のように、移動相で満たされていたローターシールの溝の１つと、ポートａを通ってカラムに向かって流れていく。ローターシールの溝の１つの容量とポートａの容量を合計すると約０．０９μＬであることを、ローターシールとステーターの各部の寸法から確認している。

【0093】

第一流速で試料バンドを分離カラム充填層に向かってどこまで移動させるかについては、本発明の効果を最も発揮させるためには、試料バンドが分離カラム充填層入口側の境界を跨ぐまで、好ましくは試料バンドのピークトップが分離カラム充填層入口側の境界に達するまで、移動させることが望ましい。後述する実施例１６を例にすると、試料の注入容量が０．５μＬであり、試料注入用流路切り替えバルブ（Ｃ７２ＶＨ−１６９６Ｄバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のステーター中の流路（ポート）１つの容量とローターシールに設けられた流路溝１つの容量の合計は約０．０９μＬであった。試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続している配管については、内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍなので、容量は約１．９９μＬである。カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）の場合は、図３に示すカラム入口側エンドユニオン内流路２０３の容量、コーン（分散スペース）２０４の容量、フリット２０５の空隙の容量の合計が約１．１０μＬであった。したがって、図５に示すように、試料注入前の試料バンドの中央から分離カラム充填層入口側境界までの容量は、０．２５＋０．０９＋１．９９＋１．１０＝３．４３μＬである。また、図４７（Ｂ）のように、カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ）を使用して、第一流速において従来の試料注入法でのクロマトグラムを採取しておくと、ピークを形成しながら移動する試料バンドのピークトップが、サンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動するのに要した送液容量を見積もることが出来る。試料注入容量が０．５μＬの場合、図４７（Ｂ）で得られた保持時間に流速を掛けた値（この場合０．３２２ｍｉｎ×１０μＬ／ｍｉｎ＝３．２２μＬ）からＺＤＵの容量０．０２μＬと、ＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量１．０８μＬと、検出器セルの容量６ｎＬを差し引いた容量を算出すると、２．１１４μＬになる。また、この値にカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）の入口側エンドユニオン内流路の容量、コーン（分散スペース）の容量、フリット空隙の容量の合計（約１．１０μＬ）を加えると、３．２１４μＬであり、この値を、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動するのに要した送液容量として見積もることが出来る。

【0094】

よって後述する実施例１６で使用した装置とカラム、注入容量で本発明を実施する際、第一流速から第二流速への変更を行う流速プログラムを導入制御用のコンピュータで作成する時は、試料注入用流路切り替えバルブとカラム入口を接続している配管の容量１．９９μＬ、もしくは、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内からカラム入口まで移動するのに要した送液容量２．１１４μＬ、あるいは、これらの容量にカラム入口から充填層入口側境界までの容量１．１０μＬを加えた、３．０９μＬや３．２１４μＬを第一流速で送液する容量として設定しておくと、高いカラム性能が得られやすい。

【0095】

後述する実施例１６では、第一流速を１０μＬ／ｍｉｎとし、１μＬ、２μＬ、３μＬ、３．５μＬ、４μＬ、５μＬ、６μＬ、８μＬ送液してから第二流速に変更しているが、第一流速で３〜５μＬ送液した時に、特に高いカラム性能が発揮されている。

【0096】

また、図４７（Ｂ）で得られたピークの全値幅は約２．８１μＬであることから、第一流速で送液した容量が３．２１４μＬあるいは、直管に比べて複雑な構造であるフリット空隙を試料バンドが通過するのに容量が増えたとして、３．５μＬ程度になったとしても、これらの値から前後１．４１μＬの間（１．８０４〜４．９１μＬ）では、試料バンドがカラム入口側充填層の境界を跨いでいる。そして、第一流速で送液した容量が５μＬ、６μＬ、８μＬの時は試料バンド全体が充填層に入っている。即ち、第一流速で試料バンドを、試料バンド全体が分離カラム充填層に入り終わるまで移動させてから第二流速に変更しても、高いカラム性能が得られることが示されている。また、第一流速で送液した容量が５μＬから８μＬに増えるにつれ、試料中の溶質がカラム性能を発揮出来ない遅い流速で分離される時間が長くなり、発揮されるカラム性能が徐々に低くなることから、第一流速で試料バンド全体が分離カラム充填層に入り終わった後は、出来るだけ速やかに送液ポンプの流速を、第一流速よりも速い、カラム性能を発揮出来る流速に変更することが望ましい。

【0097】

実施例１６で第一流速で送液する容量のうち、最も少ない容量は１μＬであった。試料バンドがサンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動する容量に対する比率は、１／３．４３＝約０．２９、又は１／３．２１４＝約０．３１である。これらの比率以上になるように第一流速で送液する容量を設定しておくと、本発明の試料導入方法の効果が得られやすい。

【0098】

後述する実施例１３を例にすると、試料の注入容量が２μＬであり、試料注入用流路切り替えバルブ（Ｃ７２ＶＨ−１６９６Ｄバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のステーター中の流路（ポート）１つの容量とローターシールに設けられた流路溝１つの容量の合計は約０．０９μＬであった。試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続している配管については、内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍなので、容量は約１．９９μＬである。カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）の場合は、図３に示すエンドユニオン内流路２０３の容量、コーン（分散スペース）２０４の容量、フリット２０５の空隙の容量の合計が約１．１０μＬであった。よって、試料注入前の試料バンドの中央から分離カラム充填層入口側境界までの容量は、１．０＋０．０９＋１．９９＋１．１０＝４．１８μＬである。また、試料注入容量が２μＬの場合、図５０（Ａ）で得られた保持時間に流速を掛けた値（この場合０．３８３ｍｉｎ×１０μＬ／ｍｉｎ＝３．８３μＬ）からＺＤＵの容量０．０２μＬと、ＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量１．０８μＬと、検出器セルの容量６ｎＬを差し引いた容量を算出すると、２．７２４μＬになる。また、この値にカラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）のエンドユニオン内流路の容量、コーン（分散スペース）の容量、フリット空隙の容量の合計（約１．１０μＬ）を加えると、３．８２４μＬであり、この値を、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動するのに要した送液容量として見積もることが出来る。

【0099】

よって実施例１３で使用した装置とカラム、注入容量で本発明を実施する際、第一流速から第二流速への変更を行う流速プログラムを導入制御用のコンピュータで作成する時は、試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続している配管の容量１．９９μＬ、もしくは、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内からカラム入口まで移動するのに要した送液容量２．７２４μＬ、或いは、これらの容量にカラム入口から充填層入口側境界までの容量１．１０μＬを足して、３．０９μＬや３．８２４μＬを第一流速で送液する容量として設定しておくと、高い性能が得られやすい。

【0100】

実施例１３では、第一流速を１０μＬ／ｍｉｎとし、１μＬ、２μＬ、３μＬ、３．５μＬ送液してから第二流速に変更しているが、第一流速で３．５μＬ送液した時に、最も高いカラム性能が発揮されている。

【0101】

実施例１３で第一流速で送液する容量のうち、最も少ない容量は１μＬであった。試料バンドがサンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動する容量に対する比率は、１／４．１８＝約０．２４、又は１／３．８２４＝約０．２６である。これらの比率以上になるように第一流速で送液する容量を設定しておくと、本発明の試料導入方法の効果が得られやすい。

【0102】

後述する実施例８を例にすると、試料の注入容量が０．５μＬであり、試料注入用流路切り替えバルブ（Ｃ７２ＶＨ−１６９６Ｄバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のステーター中の流路（ポート）１つの容量とローターシールに設けられた流路溝１つの容量の合計は約０．０９μＬであった。試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続している配管については、内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍなので、容量は約７．７μＬである。カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）の場合は、図３に示すエンドユニオン内流路２０３の容量、コーン（分散スペース）２０４の容量、フリット２０５の空隙の容量の合計が約１．１０μＬであった。よって、試料バンドの中央から分離カラム充填層入口側境界までの容量は、０．２５＋０．０９＋７．７＋１．１０＝９．１４μＬである。また、試料注入容量が０．５μＬの場合、図４８（Ｂ）で得られた保持時間に流速を掛けた値（この場合０．９４５ｍｉｎ×１０μＬ／ｍｉｎ＝９．４５μＬ）からＺＤＵの容量０．０２μＬと、ＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量１．０８μＬと、検出器セルの容量６ｎＬを差し引いた容量を算出すると、８．３４４μＬになる。また、この値にカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８のエンドユニオン内流路の容量、コーン（分散スペース）の容量、フリット空隙の容量の合計（約１．１０μＬ）を加えると、９．４４４μＬであり、この値を、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動するのに要した送液容量として見積もることが出来る。

【0103】

よって実施例８で使用した装置とカラム、注入容量で本発明を実施する際、第一流速から第二流速への変更を行う流速プログラムを導入制御用のコンピュータで作成する時は、試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続している配管の容量７．７μＬ、もしくは、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内からカラム入口まで移動するのに要した送液容量８．３４４μＬ、あるいは、これらの容量にカラム入口から充填層入口側境界までの容量１．１０μＬを足して、８．８０μＬや９．４４４μＬを第一流速で送液する容量として設定しておくと、高い性能が得られやすい。

【0104】

実施例８では、第一流速を１０μＬ／ｍｉｎとし、５μＬ、８μＬ、１０μＬ、１２μＬ、１５μＬ送液してから第二流速に切り替えているが、第一流速で１０μＬ送液した時に、最も高いカラム性能が発揮されている。また、第一流速で８〜１５μＬ送液した時に比較的高いカラム性能が発揮されている。

【0105】

また、図４８（Ｂ）で得られたピークの全値幅は約５．３７μＬであることから、第一流速で送液した容量が９．４４４μＬあるいは、フリット空隙を試料バンドが通過するのに容量が増えたとして、１０μＬ程度になったとしても、これらの値から前後２．６９μＬの間（６．７５４〜１２．６９μＬ）では、試料バンドがカラム入口側充填層の境界を跨いでいる。そして、第一流速で送液した容量が１５μＬの時は試料バンド全体が充填層に入っている。即ち、第一流速で試料バンドを、試料バンド全体が充填層に入り終わる時まで移動させてから第二流速に切り替えても、高いカラム性能が得られることが示されている。

【0106】

実施例８で第一流速で送液する容量のうち、最も少ない容量は５μＬであった。試料バンドがサンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動する容量に対する比率は、５／９．１４＝約０．５５、又は５／９．４４４＝約０．５３である。これらの比率以上になるように第一流速で送液する容量を設定しておくと、本発明の試料導入方法の効果が得られやすい。

【0107】

後述する実施例５を例にすると、試料の注入容量が２μＬであり、試料注入用流路切り替えバルブ（Ｃ７２ＶＨ−１６９６Ｄバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のステーター中の流路（ポート）１つの容量とローターシールに設けられた流路溝１つの容量の合計は約０．０９μＬであった。試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続している配管については、内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍなので、容量は約７．７μＬである。カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）の場合は、図３に示すエンドユニオン内流路２０３の容量、コーン（分散スペース）２０４の容量、フリット２０５の空隙の容量の合計が約１．１０μＬであった。よって、試料注入前の試料バンドの中央から分離カラム充填層入口側境界までの容量は、１．０＋０．０９＋７．７＋１．１０＝９．８９μＬである。また、試料注入容量が２μＬの場合、図５０（Ｂ）で得られた保持時間に流速を掛けた値（この場合０．９８８ｍｉｎ×１０μＬ／ｍｉｎ＝９．８８μＬ）からＺＤＵの容量０．０２μＬと、ＺＤＵ出口から検出器セル入口までの容量１．０８μＬと、検出器セルの容量６ｎＬを差し引いた容量を算出すると、８．７７４μＬになる。また、この値にカラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８のエンドユニオン内流路の容量、コーン（分散スペース）の容量、フリット空隙の容量の合計（約１．１０μＬ）を加えると、９．８７４μＬであり、この値を、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで移動するのに要した送液容量として見積もることが出来る。

【0108】

よって実施例５で使用した装置とカラム、注入容量で本発明を実施する際、第一流速から第二流速への変更を行う流速プログラムを導入制御用のコンピュータで作成する時は、試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続している配管の容量７．７μＬ、もしくは、試料バンドのピークトップが、サンプルループ内からカラム入口まで移動するのに要した送液容量８．７７４μＬ、あるいは、これらの容量にカラム入口から充填層入口側境界までの容量１．１０μＬを足して、８．８０μＬや９．８７４μＬを第一流速で送液する容量として設定しておくと、高い性能が得られやすい。

【0109】

実施例５では、第一流速を１０μＬ／ｍｉｎとし、５μＬ、８μＬ、１０μＬ、１２μＬ送液してから第二流速に切り替えているが、第一流速で１０μＬ送液した時に、最も高いカラム性能が発揮されている。

【0110】

実施例５で第一流速で送液する容量のうち、最も少ない容量は５μＬであった。試料バンドがサンプルループ内から分離カラム充填層入口側境界まで試料バンドが移動する容量に対する比率は、５／９．８９＝約０．５１、又は５／９．８７４＝約０．５１である。これらの比率以上になるように第一流速で送液する容量を設定しておくと、本発明の試料導入方法の効果が得られやすい。

【0111】

又、本発明の試料導入方法によるクロマトグラムを連続して採取する時には、試料の分離溶出を行った後、第二流速から第一流速に変更して第一流速でカラムが平衡化された状態で次の試料導入に備えることが望ましい。第一流速でカラムを平衡化する時間の目安は、第二流速と第一流速の差や、カラム充填剤種、移動相の種類、カラム長さ等によっても変化する場合があるが、圧力トレースによって確認出来る。実施例で確認した長さ５ｃｍのカラムの場合、試料の分離溶出を行った後に第一流速で１分程度送液すると、カラムが平衡化されている。本発明の試料導入方法を使用して連続でクロマトグラムを採取する場合の再現性は良好である。

【0112】

試料に含まれる溶質、各溶質の濃度及び試料溶媒と試料注入容量、サンプルループ、試料注入用流路切り替えバルブが同一で、試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管の長さが一定であれば、どのような内径の配管でも、流速０．１μＬ／ｍｉｎ以上では流速が大きくなるほど注入された試料のカラム外における溶質バンドの分散（σ_extra²）が大きくなる。又、その勾配は配管の内径が大きい方が急になる。又、試料に含まれる溶質、各溶質の濃度及び試料溶媒と試料注入容量、サンプルループ、試料注入用流路切り替えバルブが同一で、試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管の内径、流速が一定であれば、配管が長くなるほど注入された試料のカラム外における溶質バンドの分散（σ_extra²）が大きくなる。

【0113】

試料が送液ポンプと分離カラム充填層をつなぐ配管に注入されて分離カラム充填層まで至るまでの配管である、サンプルループ内と試料注入用流路切り替えバルブの中の流路内、試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム入口までの配管、分離カラム入口側エンドユニオン内の流路とコーン（分散スペース）の長さと内径は特に限定されず、又、これらの組み合わせも特に限定されない。又、分離カラム充填層入口側手前のフリットのサイズや孔径も特に限定されないし、充填層をフリット無しでカラム管に固定化出来る場合はフリットが無くても構わない。試料が送液ポンプと分離カラムをつなぐ配管に注入されて分離カラム充填層まで至るまでの配管がどのような内径と長さであっても、流速０．１μＬ／ｍｉｎ以上では流速が大きくなるほど注入された試料のカラム外における溶質バンドの分散（σ_extra²）が大きくなると予測できる（このことは非特許文献１０、１１、１２、１３等から予測できる）ことから、カラム性能を発揮出来る一定の流速で試料注入から分析までを行う従来の方法に比べて、カラム性能を発揮出来る一定の流速よりも低い流速で、試料注入によって送液ポンプと分離カラム充填層の間の配管に組み込まれる、サンプルループ内と試料注入用流路切り替えバルブの中の流路内及び、試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの配管中を、試料バンドを移動させて試料バンドの分散を抑え、分離カラム充填層に試料が入る前にカラム性能を発揮出来る一定の流速に上げて試料をカラムに導入して分析を行うことで、高いカラム性能が得られる。

【0114】

又、カラム性能を発揮出来る一定の流速よりも低い流速で、試料注入によって送液ポンプと分離カラム充填層の間の配管に組み込まれる、サンプルループ内と試料注入用流路切り替えバルブの中の流路内及び、試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの配管中を試料バンドを移動させ、或いは更に試料バンドが分離カラム充填層入口側境界を跨ぐまで、或いは更に試料バンド全体が分離カラム充填層に入り終わるまで試料バンドを移動させて試料バンドの分散を抑え、続いてカラム性能を発揮出来る一定の流速に上げて試料を分離カラム充填層で分離することで、どのような長さと内径の充填層を持つ分離カラムであっても、高いカラム性能が得られる。

【0115】

又、分離カラムのコーン（分散スペース）は試料バンドが分離カラム充填層に導入される際、充填層の中心に集中せず均一に導入されるよう分散させるために設置され、この時の移動相の流速が速い程大きな容量を必要とするものなので、カラム性能を発揮出来る一定の流速よりも低い流速（第一流速）で試料バンドを充填層に導入する時、第一流速が分離カラムのコーン（分散スペース）が必要無い程に低ければ、コーン（分散スペース）を設置しない分離カラムを使用することが出来る。

【0116】

一方で、例えば後述する実施例３（図１２）と実施例７（図１６）を比較すると、実施例３では試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管は内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍとし、カラムは内径３．０ｍｍ、長さ５ｃｍとしている。図１２（Ａ）のピークＮｏ．３の分散を半値幅（０．０２５７ｍｉｎ）から計算（ピーク半値幅＝２．３５σ、更にσの単位をμＬとするため、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎを乗じ、更に２乗してσ^２を算出）すると４３．０６μＬ^２であり、図１２（Ｃ）のピークＮｏ．３の分散は３５．０８μＬ^２なので、ピークＮｏ．３については本発明の方法により比較例に比べて分散が７．９８μＬ^２減少している。実施例７では試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管は内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍとし、カラムは内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍとしている。図１６（Ａ）のピークＮｏ．３の分散は６．６９μＬ^２であり、図１６（Ｃ）のピークＮｏ．３の分散は２．１３μＬ^２なので、ピークＮｏ．３については本発明の方法により比較例に比べて分散が４．５６μＬ^２減少している。減少している分散は実施例３の方が大きいが、本発明の方法の効果は、実施例７の方が顕著に現れている。

【0117】

この理由は、実施例３では、一定の流速で試料注入から分析までを行う従来の方法にて得られるクロマトグラム（比較例）での各ピークの分散値が、本発明の方法により達成出来る分散値の減少幅に比べて大きいためである。

【0118】

次に、第一流速について述べる。第一流速は可能な限り低い方が良いが、実際は使用するＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置等の送液ポンプが安定して送液できる流速域にも関係する。図４７（Ｂ）のように、カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、試料を従来の方法で注入したデータを複数回採取し、再現性を確認して送液ポンプの安定性を確認することが良い。

【0119】

第一流速は１μＬ／ｍｉｎ〜１００μＬ／ｍｉｎである。第一流速は可能な限り遅い方が良いが、１μＬ／ｍｉｎより遅い流速は現在の送液ポンプでは再現性が悪い場合があり、実際の使用には適さないためである。尚、今後の送液ポンプの性能の向上により、１μＬ／ｍｉｎより遅い流速でも再現性が良くなっている場合には、第一流速を１μＬ／ｍｉｎより遅くしてもよい。又、第一流速が１００μＬ／ｍｉｎより速いと試料バンドの分散が大きくなるからである。

【0120】

第一流速は、好ましくは、５μＬ／ｍｉｎ〜１００μＬ／ｍｉｎである。５μＬ／ｍｉｎより遅いと、現在の送液ポンプでは再現性が悪い場合があり、５μＬ／ｍｉｎ以上であれば送液ポンプの再現性もよく、実際の使用に適しているからである。

【0121】

第二流速は移動相を分離カラムに流す際の分析条件で定められたカラム性能を発揮出来る流速であり、サンプルループと試料注入用流路切り替えバルブ、試料注入用流路切り替えバルブ出口から分離カラム充填層前までの配管の内径と長さ、容量及び分離カラムの長さと内径等の条件によっても異なるが、０．０２ｍＬ／ｍｉｎ〜１ｍＬ／ｍｉｎとすることが出来る。尚、同じ分析において第一流速の流速の範囲が第二流速より遅い流速の範囲内であれば、第二流速は１００μＬ／ｍｉｎ以下でもよい。

【0122】

第二流速と第一流速の比、第二流速（ｍＬ／ｍｉｎ）／第一流速（ｍＬ／ｍｉｎ）は１．２５〜１２０とすることが好ましい。第二流速と第一流速の比、第二流速（ｍＬ／ｍｉｎ）／第一流速（ｍＬ／ｍｉｎ）は大きい方が本発明の実施による効果が得られやすい。第二流速（ｍＬ／ｍｉｎ）／第一流速（ｍＬ／ｍｉｎ）が１．２５より小さいと、本発明の効果が得られにくいからである。又、第二流速（ｍＬ／ｍｉｎ）／第一流速（ｍＬ／ｍｉｎ）が１２０より大きいと、２種類の流速の差が大きくなり過ぎ、送液ポンプが安定して送液出来る流速域から第一流速が外れてしまい、現在の送液ポンプでは再現性が悪くなる場合があるからである。より好ましくは、第一流速を５〜８０μＬ／ｍｉｎとし、前記第二流速を１００〜６００μＬ／ｍｉｎとして、第二流速（ｍＬ／ｍｉｎ）／第一流速（ｍＬ／ｍｉｎ）を１００／８０〜６００／５とすることが好ましい。

【0123】

又、第一流速を例えば０ｍＬ／ｍｉｎから０．０２ｍＬ／ｍｉｎに直線勾配で変化させてから第二流速（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）に切り替えても、本発明の効果が得られる。同じ分析において第一流速の流速の範囲が第二流速より遅い流速の範囲内であれば、第一流速は分析中に増速又は減速の変化をさせても良い。

【0124】

又、第一流速から第二流速への切り替えの勾配が緩やかな場合でも、本発明の効果が得られる。同じ分析において第二流速の流速の範囲が第一流速より速い流速の範囲内であれば、第二流速も分析中に増速又は減速の変化をさせても良い。

【0125】

第一流速から第二流速への変更の勾配について更に述べる。第一流速から第二流速への変更は、第一流速から第二流速へ直接変更することが出来るが、先ず第一流速から、第一流速より速く第二流速より遅い第三流速に変更し、その後第二流速に変更することとしてもよい。例えば第一流速がカラムでの分離に最適な流速より遅く、第二流速がカラムでの分離に最適な流速より速い場合で、第二流速での圧力平衡達成に時間的余裕がある場合においては、第三流速を第二流速より遅い流速、例えば、そのカラムでの分離に最適な流速とすることとしてもよい。この構成によれば、分離性能の向上が得られる。

【0126】

又、第一流速から第二流速への変更は、出来るだけ急勾配で行うことが好ましい。例えば第一流速から第二流速へ変更する時、先ず第一流速から、第二流速より速い第三流速に変更し、その後第二流速に変更することとしてもよい。このようにすることで、第一流速から第二流速への変更の勾配を急にすることが出来、第二流速での圧力の安定化が速く達成されるからである。ただし、ピーク面積に基づく定量を目的としない場合には、目的とする分離を達成するために必要十分な圧力勾配を設定することができる。

【0127】

本発明者は、本発明の試料導入方法における第一流速から第二流速への変更の勾配については、後述する実施例９で汎用のＵＨＰＬＣ装置を使用し、送液ポンプ１台で得られたクロマトグラムから３．４ＭＰａ／０．０２ｍｉｎ＝１７０ＭＰａ／ｍｉｎを確認した。

【0128】

次に、本発明の試料導入方法の効果を得られやすいカラムの内径、ピークの溶出容量について述べる。前述したように、一定の流速で試料注入から分析までを行う従来の方法で得られるクロマトグラムでの各ピークの分散値（単位：μＬ^２）が、本発明の試料導入方法により達成出来る分散値の減少幅に比べて大きいと、本発明の試料導入方法の顕著な効果は得られにくい。ピークの溶出容量が大きいと、溶質が移動相中で拡散する度合いも大きくなり、ピークの分散値が大きくなるからである。一定の流速で試料注入から分析までを行う従来の方法で得られるクロマトグラムのピークの分散値は、カラムの内径が大きいほど（カラムの内径が大きければ、カラム性能を発揮しやすい流速も通常大きくなり、クロマトグラムでの各ピークの溶出容量も大きくなる）、又、ピークの保持時間が長いほど大きくなる（溶出容量も大きくなる）。カラムの内径が４．６ｍｍでも本発明が効果を奏し、溶出容量が５．１６８ｍＬのピークでも本発明が効果を奏する。

【0129】

更に、汎用のＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置等に組み込んで使用する本発明の試料導入装置及び試料導入方法について説明する。試料導入装置１０は、図１に示すように、分離カラム２に試料を導入するための装置であり、試料注入用流路切り替えバルブ３、試料注入装置４及び１台又は２台の送液ポンプ５を備えて構成することが出来る。

【0130】

又、２台の送液ポンプと試料注入装置を備えた汎用のＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置等に、更に流路切り替え装置としてのミクロ６方流路切り替えバルブを組み込んで、第一流速から第二流速への変更を流路の切り替えによって行う本発明の試料導入方法及び試料導入装置を実現することが出来る。試料導入装置１１は、図４１及び図４２に示すように、分離カラム２に試料を導入するための装置であり、第一流速で試料注入装置から流路に注入された試料バンドを、第一流速のままで分散を抑えつつ移動あるいは分離カラム充填層に導入させるための送液ポンプ５１と、第二流速で試料バンドを分離カラム充填層に導入し分離する、あるいは分離するための送液ポンプ５２を備えており、２台の送液ポンプがミクロ６方流路切り替えバルブの別々のポートに至る流路に接続されている。又、２台の送液ポンプと試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブは図示しない導入制御装置によって制御されている。試料導入装置１１は、図示しない導入制御装置、２台の送液ポンプ５１、５２と図示しない２つの移動相容器、試料注入装置４、ミクロ６方流路切り替えバルブ８を備えて構成することが出来る。このような構成とすることで、第一流速においての試料注入装置４からの試料注入後、流速を第一流速から第二流速へ変更する時に、ミクロ６方流路切り替えバルブ８の切り替えにより、分離カラム２に至る流路につなげる送液ポンプを、第一流速で送液していた送液ポンプ５１から、第二流速で分離カラムあるいは分離カラムと同等の抵抗にあらかじめ送液することで背圧がかけられて安定化していた送液ポンプ５２に変更することにより、送液ポンプ５２において、第二流速での圧力が一定となるまでに送液される移動相が送液ポンプのヘッド内等で圧縮される時間を、もしくは更に分離カラムが第二流速での圧力で平衡化される時間を短縮出来、第一流速から第二流速への変更を速やかに行うことが可能となる。

【0131】

図４１に示す試料導入装置１１の構成では、２台の送液ポンプ５１、５２と、図示しない導入制御装置（送液ポンプ、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブを制御する装置）、ループ３０１を備えたミクロ６方流路切り替えバルブ８を用いた。送液ポンプ５１と配管６１で接続した、試料注入用流路切り替えバルブ及びサンプルループを備えた試料注入装置４から分離カラム２までの間に、内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍ（容量約１．９９μＬ）の配管６２、ループ３０１を備えた、試料注入用流路切り替えバルブとは別個のミクロ６方流路切り替えバルブ８、更に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍ（容量約１．９９μＬ）のカラム前配管６３を接続し、続いて分離カラム２（内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ）、検出器セル９９１を備えた検出器を接続した。試料注入後（図４１（Ａ））、送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ（５μＬ／ｍｉｎ）で６．５μＬ送液して試料バンドを第一流速でループ３０１の中に移動させ（図４１（Ｂ））、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて（図４１（Ｃ））、ループ３０１の中の試料バンドを送液ポンプ５２からの送液（流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）によって第二流速で分離カラム２へ移動させ、導入している（図４１（Ｄ））。送液ポンプ５２はミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションが変わる前（図４１（Ａ）と図４１（Ｂ））から流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液していて、分離カラム２により８．２ＭＰａの背圧がかかっていた。このような構成の試料導入装置によれば、流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析までを行う従来の方法に比べて高いカラム性能を得ることが出来る。

【0132】

図４２に示す試料導入装置１１の構成では、２台の送液ポンプ５１、５２と、図示しない導入制御装置（送液ポンプ、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブを制御する装置）、抵抗管３９と抵抗用のカラム３８を備えたミクロ６方流路切り替えバルブ８を用いた。送液ポンプ５１とミクロ６方流路切り替えバルブ８を介して配管接続した、試料注入用流路切り替えバルブ及びサンプルループを備えた試料注入装置４から分離カラム２までの間に、内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍ（容量約１．９９μＬ）のカラム前配管６３、続いて分離カラム２（内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ）、検出器セル９９１を備えた検出器を接続した。試料注入後（図４２（Ａ））、送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ（５μＬ／ｍｉｎ）で、試料バンドを第一流速で３．５μＬ送液して試料バンドを分離カラム２の充填層入口側境界を跨ぐまで移動させ（図４２（Ｂ））、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて（図４２（Ｃ））、送液ポンプ５２からの送液（流速０．１ｍＬ／ｍｉｎ）によって試料バンドを第二流速で分離カラム２へ導入し、分離カラム２の充填層で試料バンドを分離している（図４２（Ｄ））。抵抗管３９と抵抗用カラム３８は、分離カラム２、分離カラム２下流の配管及び検出器セル９９１と同等の抵抗値を持つものを使っているため、送液ポンプ５２は試料注入時から、すなわちミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションが変わる前（図４２（Ａ）と図４２（Ｂ））から０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液していて、抵抗管３９と抵抗用カラム３８により１６．９ＭＰａの背圧がかかっていた。このような構成の試料導入装置によれば、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析までを行う従来の方法に比べて高いカラム性能を得ることが出来る。

【0133】

試料導入装置は、送液ポンプを１台又は２台備えた構成とし、第一流速から第二流速への変更を、図１に示すように送液ポンプ１台又は２台を直接、分離カラム２に至る流路に接続して行ってもよく、図４１及び図４２に示すように送液ポンプ２台をミクロ６方流路切り替えバルブ８等の切り替えバルブを介して分離カラム２に至る流路に接続して行ってもよい。送液ポンプを直接、分離カラム２に至る流路に接続して流速の変更を行う際、第二流速での圧力が一定となるまでに送液される移動相が送液ポンプのヘッド内等で圧縮される時間と、分離カラムが第二流速での圧力で平衡化される時間が必要であるので、送液ポンプ２台を切り替えバルブを介して分離カラム２に至る流路に接続して、分離カラム或いは抵抗用カラムや抵抗管を用いて１台の送液ポンプの第二流速での圧力が一定となるまでに送液される移動相が送液ポンプのヘッド内等で圧縮される時間を、もしくは更に分離カラムが第二流速での圧力で平衡化される時間を短縮して流速の変更を行う方が、第一流速から第二流速への変更の勾配を急にすることが出来る。

【0134】

更に、２台の送液ポンプと試料注入装置を備えた汎用のＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置等に、更に流路切り替え装置としてのミクロ６方流路切り替えバルブを組み込んで、第一流速から第二流速への変更を流路の切り替えによって行い、更に分離カラム入口手前に、流路を切り替えることにより試料バンドを進行方向（軸方向）に交差する方向で分割する、試料バンド分割装置７７を組み込んで使用する本発明の試料導入方法及び試料導入装置について説明する。試料導入装置１２は、図４３に示すように、分離カラム２に試料を導入するための装置であり、第一流速で試料注入装置から流路に注入された試料バンドを、第一流速のままで分散を抑えつつ分離カラム手前の試料バンド分割装置７７の前まで移動させるための送液ポンプ５１と、第二流速で試料バンドを図４４（Ａ）に示す試料バンド分割装置７７を通過させて分離カラム充填層への導入と分離を行う送液ポンプ５２、或いは第二流速で試料バンドを図４４（Ａ）に示す試料バンド分割装置７７の流路切替点７０を跨ぐまで移動させ、更にミクロ６方流路切り替えバルブ８の切り替え操作を加えることで試料バンドの分割と試料バンド前部分の分離カラム充填層への導入と分離を行うための送液ポンプ５２を備えており、２台の送液ポンプがミクロ６方流路切り替えバルブの別々のポートに至る流路に接続されている。

【0135】

又、２台の送液ポンプと試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブは図示しない導入制御装置によって制御されている。試料導入装置１２は、図示しない導入制御装置、２台の送液ポンプ５１、５２と図示しない２つの移動相容器、試料注入装置４、ミクロ６方流路切り替えバルブ８、試料バンド分割装置７７を備えて構成することが出来る。このような構成とすることで、第一流速においての試料注入装置４からの試料注入後、流速を第一流速から第二流速へ変更する時に、ミクロ６方流路切り替えバルブ８の切り替えにより、分離カラム２に至る流路につなげる送液ポンプを、第一流速で送液していた送液ポンプ５１から、第二流速に近い流速で分離カラムにあらかじめ送液することで背圧がかけられて安定化していた送液ポンプ５２に変更することにより、送液ポンプ５２において、第二流速での圧力が一定となるまでに送液される移動相が送液ポンプのヘッド内等で圧縮される時間と、分離カラムが第二流速での圧力で平衡化される時間を短縮出来、第一流速から第二流速への速やかな変更が可能となり、或いは更に試料バンドを分離カラム充填層手前で試料バンドの進行方向に交差する方向で分割し、分離カラム充填層への導入と分離を行うことが可能となる。

【0136】

図４３に示す試料導入装置１２の構成では、２台の送液ポンプ５１、５２と、図示しない導入制御装置（送液ポンプ、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブを制御する装置）、ミクロ６方流路切り替えバルブ８を用いた。送液ポンプ５１とミクロ６方流路切り替えバルブ８を介して配管接続した試料注入装置４から分離カラム２までの間に、内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍ（容量約１．９９μＬ）のカラム前配管６３、続いて分離カラム２入口手前に図４４（Ａ）に示す、流路を切り替えることにより試料バンドを分割する、試料バンド分割装置７７を取り付け、その先に分離カラム２（内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ）、検出器セル９９１を備えた検出器を接続した。試料注入後（図４３（Ａ））、送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ（５μＬ／ｍｉｎ）で試料バンド１００を第一流速で２μＬ送液して試料バンド１００を分離カラム２入口手前に取り付けた、試料バンド分割装置７７の手前まで移動させ（図４３（Ｂ））、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて（図４３（Ｃ））、送液ポンプ５１は停止し、送液ポンプ５２からの送液（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）によって試料バンド１００を第二流速で分離カラム２へ導入している（図４３（Ｄ））。送液ポンプ５２は試料注入時から、即ちミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションが変わる前から０．０９５ｍＬ／ｍｉｎで送液していて、２０．８ＭＰａ程の背圧がかかっていた。このような構成の試料導入装置によれば、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析までを行う従来の方法に比べて高いカラム性能を得ることが出来る。又、図４３に示す構成では、図４４（Ａ）に示す試料バンド分割装置７７を使用して、第１送液ポートと第２送液ポートを切り替えることにより試料バンドを分割することが可能だが、ここでは図４３に示す構成で、試料バンドの分割は行わない場合について述べている。試料バンドの分割を行う場合については後述する。

【0137】

図４３に示す試料導入装置１２の構成では、２台の送液ポンプ５１、５２と、図示しない導入制御装置（送液ポンプ、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブを制御する装置）、ミクロ６方流路切り替えバルブ８を用いた。送液ポンプ５１とミクロ６方流路切り替えバルブ８を介して配管接続した試料注入装置４から分離カラム２までの間に、内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍ（容量約１．９９μＬ）のカラム前配管６３、続いて分離カラム２入口手前に図４４（Ａ）に示す、流路を切り替えることにより試料バンドを分割する、試料バンド分割装置７７を取り付け、その先に分離カラム２（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍ）、検出器セル９９１を備えた検出器を接続した。試料注入後（図４３（Ａ））、送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ（５μＬ／ｍｉｎ）で１μＬ送液して試料バンドを分離カラム２入口手前に取り付けた、流路を切り替えることにより試料バンドを分割する、試料バンド分割装置７７の手前まで移動させ（図４３（Ｂ））、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて（図４３（Ｃ））、送液ポンプ５１は停止し、送液ポンプ５２からの送液（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）によって試料バンドを試料バンド分割装置７７の流路切替点７０を跨ぐまで移動させ（図４３（Ｄ））、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを図４３（Ｂ）のように切り替えて、第２送液ポート６５からの送液（０．２ｍＬ／ｍｉｎ）によって試料バンドを進行方向に交差する方向で分割し、試料バンド前部分を分離カラム充填層へ導入し分離することが出来る。更に、試料バンド前部分の分離終了後、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを図４３（Ｄ）のように切り替えて第１送液ポート６４内に留置されていた試料バンド後部分を分離カラム充填層へ導入し分離することが出来る。送液ポンプ５２は試料注入時、ミクロ６方切り替えバルブ８のポジションが変わる前から０．１９５ｍＬ／ｍｉｎで送液していて、８．２ＭＰａ程の背圧がかかっていた。このような構成の試料導入装置によれば、流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能を得ることが出来る。

【0138】

Ｔ字コネクター（３方ジョイント）と二重管を用いて、二重管の内管を第１送液ポート、外管を第２送液ポートとする試料バンド分割装置の構造は、入口側に一般的なカラムエンドジョイント（１つの接続管ポートを持つカラムエンドジョイント）を持つ分離カラムについて、カラム入口のフィルター（フリット）直前で試料バンドを分割することを可能とする。図４４（Ｂ）に示すように、Ｔ字コネクターの内径が第２送液ポートの外径よりも大きければ、第２送液ポートがＴ字コネクターの内側に入っていても構わない。第２送液ポートに送液するための枝管がＴ字コネクターの内側に入っていても構わない。また、カラム入口側のエンドユニオン内流路の内径が第１送液ポートの外径よりも大きければ、第１送液ポートと第２送液ポートの出口を同一平面上にすることが出来るし、第１送液ポートがエンドユニオン内流路内に入っていても構わない。第１送液ポートの出口にある流路切替点７０がフリット２０５に近い方が、試料バンドが分割されてから分離カラム充填層に導入されるまでに拡散する配管の容量が少なくなるため、より高いカラム性能を発揮出来る。各管の間及びＴ字コネクターやカラムエンドジョイントとの接続は適切なフェラルとオシネ或いはナットを用いて行う。試料バンド分割装置を構成する部品については、試料バンドのカラム前での拡散を大きくしないように、適切な内径や容量のものを用いる。例えば、Ｔ字コネクターは、一般的な外径１／１６インチ（外径１．６ｍｍ）チューブが接続出来るものである。第１送液ポートは、内径０．０５〜０．２５ｍｍ、外径０．１〜０．４ｍｍのステンレススチール管（長さ１０〜２５ｃｍ）であり、第２送液ポートは、内径０．４〜１．０ｍｍ、外径１．６ｍｍのステンレススチール管である。第２送液ポートに送液するための枝管は内径０．１〜０．５ｍｍ、外径１．６ｍｍのステンレススチール管である。

【0139】

図４４Ａ及び図４４Ｂに示すように、第１送液ポートと第２送液ポートの出口は同一平面上の構造である。又、二重管の内管が分離カラムのフリットや充填層を傷つけない限り、第１送液ポートは第２送液ポートより長くても、又少し短くても良い。又、フリットを突き抜けて、分離カラム充填層に直接的に試料を導入出来る構成としても良い。

【0140】

更に、１台の送液ポンプと試料注入装置を備えた汎用のＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置等に更にミクロ６方流路切り替えバルブを組み込み、更に送液ポンプ出口を分岐して一方は試料注入装置を介してミクロ６方流路切り替えバルブにつなぎ、もう一方はミクロ６方流路切り替えバルブの別のポートにつなぐことにより試料バンドを分割出来るようにした、試料バンド分割装置を組み込んで使用する本発明の試料導入装置及び試料導入方法について説明する。試料導入装置１３は、図４５に示すように、分離カラム２に試料を導入するための装置であり、第一流速で試料注入装置から流路に注入された試料バンドを、第一流速のままで分散を抑えつつ分離カラムと試料注入装置の間のミクロ６方流路切り替えバルブ内に移動させて一時的に留置し、送液ポンプの流速を第二流速に変更して送液ポンプと分離カラムを安定化させた後に、ミクロ６方流路切り替えバルブ内に留置されていた試料バンドを第二流速で分離カラム２の充填層に導入し分離することが出来る。又、試料導入装置１３は、図４６に示すように、分離カラム２に試料を導入するための装置であり、第一流速で試料注入装置から流路に注入された試料バンドを、第一流速のままで分散を抑えつつミクロ６方流路切り替えバルブのポートａを跨ぐまで移動させてから（図４６（Ｂ））、ミクロ６方流路切り替えバルブのポジションを切り替えて試料バンドを分割し、試料バンドの後部分をミクロ６方流路切り替えバルブ内に一時的に留置し、試料バンドの前部分を分離カラム２の充填層に導入して分離し（図４６（Ｃ））、その後留置されていた試料バンドの後部分を、ミクロ６方流路切り替えバルブのポジションを切り替えることで分離カラム２の充填層に導入して分離することが出来る（図４６（Ｄ））。試料導入装置１３は、図示しない導入制御装置（送液ポンプ、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブを制御する装置）、１台の送液ポンプ５５と図示しない移動相容器、試料注入装置４、ミクロ６方流路切り替えバルブ８を備えて構成することが出来る。

【0141】

このような構成とすることで、試料注入後、流速を第一流速から第二流速へ変更する時に、ミクロ６方流路切り替えバルブ８の切り替えと送液ポンプ５５の流速の変更を行うことにより、第二流速で送液ポンプのヘッド内等と分離カラムが平衡化された後に試料バンドの分離カラムへの導入と分離を行うことが可能となる。又、このような構成とすることで、試料注入後、流速を第一流速から第二流速へ変更する時に、ミクロ６方流路切り替えバルブ８の切り替えと送液ポンプ５５の流速の変更を行うことにより、送液ポンプ１台で、分離カラム充填層の前の流路で試料バンドの分散を抑えることと、試料バンドの進行方向に交差する方向で試料バンドを分割し、分離カラム充填層に導入し、分離を行うことが可能となる。

【0142】

図４５に示す試料導入装置１３の構成では、送液ポンプ５５を１台と、図示しない導入制御装置（送液ポンプ、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブを制御する装置）、ミクロ６方流路切り替えバルブ８を用いた。送液ポンプ５５からの流路を２方に分岐し、１方は試料注入装置４を介してミクロ６方流路切り替えバルブ８のポートｂに接続し、もう１方はミクロ６方流路切り替えバルブ８のポートｆに接続している。ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポートａに内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍ（容量約１．９９μＬ）のカラム前配管６３、続いて分離カラム２、検出器セル９９１を備えた検出器を接続した。試料注入後（図４５（Ａ））、送液ポンプ５５の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ（５μＬ／ｍｉｎ）で試料バンド１００を第一流速で２μＬ送液して試料バンド１００をミクロ６方流路切り替えバルブ８内の流路まで移動させ（図４５（Ｂ））、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて、試料バンド１００をミクロ６方流路切り替えバルブ８内に一時的に留置する（図４５（Ｃ））。この間に送液ポンプ５５の流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げ、その後ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて、試料バンド１００を第二流速で分離カラム２へ導入している（図４５（Ｄ））。このような構成の試料導入装置によれば、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能を得ることが出来る。

【0143】

又、図４６（図４５と流路は同じ）に示す試料導入装置１３の構成では、試料注入後（図４６（Ａ））、送液ポンプ５５の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ（５μＬ／ｍｉｎ）で、試料バンド１００を第一流速で２．６μＬ送液して、試料バンド１００をミクロ６方流路切り替えバルブ８内の流路を跨いで試料バンド１００の前部分がミクロ６方流路切り替えバルブ８の外に出るまで移動させ（図４６（Ｂ））、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて、試料バンド１００の後部分をミクロ６方流路切り替えバルブ８内に一時的に留置する。上記ポジションの切り替えと同時に送液ポンプ５５の流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げ、試料バンド１００を第二流速で分離カラム２へ導入し分離溶出している（図４６（Ｃ））。試料バンド１００の前部分の分離溶出後、ミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて、試料バンド１００の後部分を分離カラム２へ導入している（図４６（Ｄ））。このような構成の試料導入装置によれば、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能を得ることが出来る。

【0144】

図４３、図４６のような構成の試料導入装置を用いる試料導入方法によれば、試料バンドは進行方向（軸方向）に交差する方向で分割されているため、試料バンドの分散が分離カラム充填層に導入される前に減少している。

【0145】

又、図４６に示す構成では、送液ポンプ５５と試料注入装置の間の配管を分岐してミクロ６方流路切り替えバルブのポートｆにつなぐのではなく、送液ポンプ５５と試料注入装置の間の配管は分岐せず、別途送液ポンプを用意して、この送液ポンプからの流路をミクロ６方流路切り替えバルブのポートｆにつなぐ構成でも、本発明の、試料バンドの分割を伴う試料導入方法を実施出来る。

【0146】

又、図１の試料注入装置と分離カラムの間の流路に図４４Ａ又は図４４Ｂに示す試料分割装置を設置し、第２送液ポート送液用に別途送液ポンプからの流路をつなぐ構成でも、本発明の、試料バンドの分割を伴う試料導入方法を実施出来る。

【0147】

このように、本発明は、従来液体クロマトグラフィーで行われて来た、試料注入から分離溶出までをカラム性能を発揮出来る一定の流速で行う方法に対し、試料注入装置から分離カラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時まで試料を移動させる間の少なくとも一部の間は上記一定の流速（第二流速）よりも低い流速（第一流速）とし、その後第二流速に変更するという簡単な操作により、従来の方法より高いカラム性能を発揮することが出来る発明である。第一流速から第二流速への変更は、送液ポンプ１台で行うことが出来るし、送液ポンプ１台と流路切り替えバルブを使用して行うことも、送液ポンプ２台と流路切り替えバルブを使用して行うことも出来る。又、本発明の効果を、従来の方法で得られたクロマトグラムデータを材料として予測することが出来る。

【0148】

本発明の試料導入方法の効果を予測するには、後述する実施例２７（図４７）で行った予測計算のように、第二流速（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）で試料注入から分離カラムを用いた分離溶出までを行う従来の方法で得られる第１クロマトグラム（図２５（Ａ）（比較例））と、分離カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、第一流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）で試料注入から溶出までを行う従来の方法で得られる第２クロマトグラム（図４７（Ｂ））と、分離カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、第二流速（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）で試料注入から溶出までを行う従来の方法で得られる第３クロマトグラム（図４７（Ｃ））を材料として、第１クロマトグラムで得られるピークの分散値から第３クロマトグラムで得られるピークの分散値を差し引いて、第２クロマトグラムで得られるピークの分散値を加えることで、第１クロマトグラムを得るのに用いた分離カラムを用いて、第２クロマトグラムを得るのに用いた第一流速と第３クロマトグラムを得るのに用いた第二流速を使用して本発明の試料導入方法を実施した場合に、第１クロマトグラムの図２５（Ａ）（比較例）からのカラム性能改善の程度を見積もることが出来る。

【0149】

ここで、分離カラムの代わりに接続するゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ）は、流速１００μＬ／ｍｉｎ以下において、ゼロデッドボリュームユニオン内の流路径が小さ過ぎると流路抵抗が過大になり望ましくないが、試料バンドの分散をより効果的に抑えるために、内部容量は少なく、流路径は小さい方が望ましい。ゼロデッドボリュームユニオンの好ましい内部容量は０．１μＬ以下であり、好ましい流路径は０．２５４ｍｍ以下である。

【0150】

より簡便に本発明の試料導入方法の効果を予測する方法としては、例えば図４７（Ｂ）、図４７（Ｃ）のように、使用するＨＰＬＣ装置やＵＨＰＬＣ装置等でカラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオンを接続し、試料を従来の方法で注入してクロマトグラムデータを採取し、両者の分散値の差（例えば０．７μＬ^２）を確認しておき、図２５（Ａ）（比較例）のように図４７（Ｃ）と同じ流速で試料注入から分析までを行ったクロマトグラムで得られたピークのうちいくつかを選んで半値幅から分散値を計算し（例えば図２５（Ａ）（比較例）でのピークＮｏ．１では１．５３３μＬ^２）、続いて１．５３３μＬ^２−０．７μＬ^２＝０．８３３μＬ^２から半値幅を計算すれば（この場合（√０．８３３）×２．３５／１００＝０．０２１４ｍｉｎ）、図４７（Ｂ）で用いた流速を第一流速、図４７（Ｃ）で用いた流速を第二流速として本発明の試料導入方法を実施した時に、図２５（Ｃ）に近い水準のクロマトグラムが得られるかの目安になる。図２５（Ｃ）ではピークＮｏ．１の半値幅は０．０２１０ｍｉｎが得られており、予測の半値幅０．０２１４ｍｉｎに近い値になっている。

【実施例】

【0151】

以下、本発明の装置と操作法を具体化する方法を、実施例として比較例と共に説明する。表１は各実施例、比較例における試料注入装置からカラム前までに接続した配管のサイズ、カラムサイズ、第一流速での送液容量（試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速で試料バンドを移動させた容量）、第一流速、第二流速（カラム内で分離を行い、分析を行った流速）、図番号、使用装置、試料バンドの分割の有無、検出器セル容量（実施例１〜２６と３０では容量６ｎＬのセルを使用、実施例２９では容量１μＬのセルを使用）を示したものである。尚、以下の例において、従来の試料注入方法（試料注入用流路切り替えバルブの操作によって、試料ループ内の試料バンドを移動相の流路へ組み込むこと）を「従来の試料注入方法」又は「従来の試料注入法」と表現する。

【0152】

【表1】

【実施例1】

【0153】

汎用のＵＨＰＬＣ装置のカラム外での溶質バンドの分散がどれくらいの値なのかを確認するため、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオンを用いた状態で、移動相の流速と試料中の溶質の分散の関係を確認した。

【0154】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムに代えてゼロデッドボリュームユニオン（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社、以下ＺＤＵと表記）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．６、０．８ｍＬ／ｍｉｎの１１種の流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、、ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料Ｉ：ウラシル（Ｕ、０．２ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。試料注入容量は０．２μＬとした。

【0155】

各流速（０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）での溶質バンドの溶出容量（μＬ）とピーク幅及び形状を図８（Ａ）〜図８（Ｆ）に示す。又、移動相の流速（１１種）と溶質バンドの分散の関係のプロットを図１０（Ａ）に示す。図１０（Ａ）において、溶質バンドの分散は、モーメント法により計算した。

【0156】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムに代えてＺＤＵ（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４ｍＬ／ｍｉｎの９種の流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料Ｉ：ウラシル（Ｕ、０．２ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。試料注入容量は０．２μＬとした。

【0157】

各流速（０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．３ｍＬ／ｍｉｎ）での溶質バンドの溶出容量（μＬ）とピーク幅及び形状を図９（Ａ）〜図９（Ｆ）に示す。又、移動相の流速（９種）と溶質バンドの分散の関係のプロットを図１０（Ｂ）と図１０（Ｃ）に示す。図１０（Ｃ）は図１０（Ｂ）を縦軸方向に拡大した図である。溶質バンドの分散は、モーメント法により計算した。

【0158】

図８、図９及び図１０に示すように、ＵＨＰＬＣ装置の試料注入用流路切り替えバルブからＺＤＵまでの配管に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管を用いた場合では、流速０．００５〜０．８ｍＬ／ｍｉｎの間で、内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管を用いた場合では、流速０．００５〜０．４ｍＬ／ｍｉｎの間で、流速が小さい方が試料ピークの対称性が良く、試料バンドの分散を小さく保つことが出来ることを確認した。又、試料の濃度と注入容量、試料注入装置からＺＤＵまでの配管の長さ、流速が一定であれば、配管の内径が小さいほど注入された試料バンドの分散の増加を抑えることが出来ることを確認した。

【0159】

実施例１の結果と、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４に記載されている内容から、試料中の各溶質の濃度及び試料溶媒と試料注入容量、試料注入装置からカラムまでの配管の長さが一定であれば、どのような内径の配管でも、流速０．１μＬ／ｍｉｎ以上では流速が大きくなるほど注入された試料のカラム外における溶質バンドの分散（σ_extra²）が大きくなること、又、その勾配は配管の内径が大きい方が急になることが予測できる。

【0160】

図８（Ａ）から図８（Ｅ）までに示されるデータは、図示しないがもう１回ずつ採取した。それぞれのピークの溶出容量（保持時間×流速）の２回分の平均値（９．６９、９．７７、９．８５、１０．２０、１０．２５）を更に平均すると、（（９．６９＋９．７７＋９．８５＋１０．２０＋１０．２５）／５）は９．９５２μＬであった。また、図９（Ａ）から図９（Ｅ）までに示されるデータは、図示しないがもう１回ずつ採取した。それぞれのピークの溶出容量（保持時間×流速）の２回分の平均値（３．０７、３．３１、３．３５、３．３５、３．５０）を更に平均すると、（（３．０７＋３．３１＋３．３５＋３．３５＋３．５０）／５）は３．３１６μＬであった。

【0161】

これらからＺＤＵの容量（０．０２μＬ）とＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管の容量（１．０８μＬ）と検出器セルの容量（６ｎＬ）を差し引くと、それぞれ９．９５２−１．１０６＝８．８４６μＬ、３．３１６−１．１０６＝２．２１μＬであった。一方で、実施例４から実施例２６までと実施例２９で使用したカラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）とＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）の、図３に示すカラム入口側のエンドユニオン内流路の容量、コーン（分散スペース）の容量、フリット空隙の容量を合計すると、どちらのカラムについても約１．１０μＬであることが確認出来ていたため、実施例４以降で、試料バンドの分散を小さく保つことが出来る流速（第一流速）を様々な値に設定し、また、第一流速で試料バンドを移動させる容量を検討する際には、試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム前までの配管に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管を用いた場合には８．８４６＋１．１＝９．９４６≒１０μＬ、試料注入用流路切り替えバルブからカラム前までの配管に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管を用いた場合には２．２１＋１．１＝３．３１≒３．５μＬを、検討する容量に加えることとした。

【実施例2】

【0162】

試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図１１（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１１（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0163】

尚、図１１〜図４０、図４９及び図５１において、横軸は溶出時間（ｍｉｎ）を、右側の縦軸は圧力を、左側の縦軸はＵＶ検出器の信号強度を示している。圧力は送液ポンプ出口で測定されていて、各図のクロマトグラムの下に測定された圧力のトレース（以下、圧力トレースと表記）を示している。クロマトグラムはＵＶ検出器で測定されている。クロマトグラムと圧力トレースの横軸はいずれも、試料注入装置の試料注入用流路切り替えバルブが切り替わり、流路に試料が注入された時間を０ｍｉｎとしている。

【0164】

又、図１１〜図４０、図４９、図５１において、各図のクロマトグラムの左上には、試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管サイズ（Ｔｕｂｅ：長さと内径を表記）、カラムサイズ（Ｃｏｌｕｍｎ：長さと内径を表記）、流速（Ｆ．Ｒ．：流速と、流速を変化させた時間を表記）を記載している。各図のクロマトグラムの右上の表には、各ピークの番号と保持時間（Ｒ．Ｔ．の列に表記、単位はｍｉｎ）、半値幅（Ｈ．Ｗ．の列に表記、単位はｍｉｎ）を記載している。

【0165】

又、試料中の１０種の化合物は図１１〜図４０、図４９、図５１において同じであり、使用したカラム間ではこれらの溶出順序も同じであったので、クロマトグラムのピーク番号は図１１（Ａ）でのみ各ピークの上に付していて、他のクロマトグラムのピーク番号は、ピークの溶出順序に従った番号をクロマトグラムの右上の表に記載している。

【0166】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ６０．５ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約３０．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−４（充填剤径３μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を１．０ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0167】

図１１（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速１．０ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0168】

図１１（Ｂ）は、試料ＩＩを５μＬ注入する前に流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．６０分後（注入から３０μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３０μＬと記載）から流速を１．０ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の７．００分後から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0169】

図１１（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈ（ピーク番号１〜１０）についてそれぞれ、半値幅０．０３０１、０．０３０７、０．０３５７、０．０４２４、０．０５０５、０．０５４０、０．０６３６、０．０８１９、０．１１２２及び０．１５８７ｍｉｎが得られている。

【0170】

これに対して図１１（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２４２、０．０２６７、０．０３３１、０．０３９４、０．０４８４、０．０５２３、０．０６１４、０．０８１４、０．１１０１及び０．１５０４ｍｉｎが得られていて、図１１（Ａ）の比較例に比べてそれぞれ、１９．６、１３．０、７．３、７．１、４．２、３．１、３．５、０．６、１．９、５．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0171】

又、図１１（Ａ）（比較例）にてＯｃＰｈ（ピーク番号１０）の溶出容量は５．１６８ｍＬであり、図１１（Ｂ）にて半値幅の減少が確認された、最も溶出容量の大きい溶質のピークであった。又、試料注入後、流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで３０μＬ送液してから流速を１ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0172】

又、図１１（Ｂ）において、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．９０−０．６０＝０．３０ｍｉｎであり、０．０５ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．９ＭＰａ）と１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（２２．５ＭＰａ）の差は２１．６ＭＰａであることから、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、２１．６／０．３０＝７２．０ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例3】

【0173】

試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図１２（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１２（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0174】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径３μｍ、内径３．０ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．６ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0175】

図１２（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを３μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0176】

図１２（Ｂ）は、試料ＩＩを３μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：５μＬと記載）から流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。

【0177】

図１２（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈ（ピーク番号１〜１０）についてそれぞれ、半値幅０．０２２８、０．０２３６、０．０２５７、０．０２９７、０．０３５５、０．０３９０、０．０４４８、０．０６０３、０．０８１６及び０．１１５２ｍｉｎが得られている。

【0178】

これに対して図１２（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２２７、０．０２１３、０．０２３２、０．０２８５、０．０３３９、０．０３７３、０．０４２８、０．０５８４、０．０８０１及び０．１１４６ｍｉｎが得られていて、図１２（Ａ）の比較例に比べてそれぞれ、０．４、９．７、１０．１、４．０、４．５、４．４、４．５、３．２、１．８、０．５％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0179】

又、図１２（Ａ）（比較例）にてＯｃＰｈ（ピーク番号１０）の溶出容量は２．３４７ｍＬであり、図１２（Ｂ）にて半値幅の減少が確認された、最も溶出容量の大きい溶質のピークであった。又、試料注入後、流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで５μＬ送液してから流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0180】

又、図１２（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．６ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．７５−０．５０＝０．２５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．２ＭＰａ）と０．６ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．０ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．６ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．２５＝３９．２ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例4】

【0181】

試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図１３（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１３（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。又、本発明の試料導入方法における流速の変化の勾配がピーク幅に与える効果を確認した（図１３（Ｃ））。

【0182】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0183】

図１３（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0184】

図１３（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：５μＬと記載）から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0185】

図１３（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後）から０．１０分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．６０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0186】

図１３（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０３１０、０．０３２１、０．０３０１、０．０２８６、０．０３２４、０．０３０９、０．０３３６、０．０３８７及び０．０４７７ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈについては、ＢｅＰｈと重なっているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0187】

これに対して図１３（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２６２、０．０２３０、０．０１８７、０．０２０１、０．０２０９、０．０２２６、０．０２５９、０．０３１３及び０．０４２４ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１５．５、２８．３、３７．９、２９．７、２６．９、２２．９、１９．１及び１１．１％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0188】

又、図１３（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２７１、０．０２３１、０．０２０７、０．０２０５、０．０２１４、０．０２３１、０．０２６５、０．０３２２及び０．０４１９ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１２．６、２８．０、３１．２、２８．３、２５．２、２１．１、１６．８及び１２．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0189】

図１３（Ｂ）の方が図１３（Ｃ）に比べて、わずかに高いカラム性能が発揮されている。この理由は、図１３（Ｂ）では０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化の勾配が図１３（Ｃ）に比べてわずかに緩やかであったので、カラム充填層前の配管中（少なくとも約７．７μＬの容量がある）で試料がその分散の増加を抑えることが出来る流速で送液された送液容量が図１３（Ｃ）に比べて実質多かったためと思われる。

【0190】

又、試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで５μＬ送液してから流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0191】

又、図１３（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８１−０．５０＝０．３１ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．３１＝３１．６ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0192】

又、図１３（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．６２−０．５０＝０．１２ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１２＝８１．７ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例5】

【0193】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行う時間（第一流速による送液容量）が、ピーク幅に与える効果を確認した（図１３（Ｃ）、図１４（Ａ）、図１４（Ｂ）及び図１４（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図１３（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0194】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0195】

図１３（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0196】

図１３（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：５μＬと記載）から０．１０分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．６０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0197】

図１４（Ａ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．８０分後（注入から８μＬ送液後）から０．１０分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．９０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0198】

図１４（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．００分後（注入から１０μＬ送液後）から０．１０分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．１０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0199】

図１４（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．２０分後（注入から１２μＬ送液後）から０．１０分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．３０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0200】

図１３（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０３１０、０．０３２１、０．０３０１、０．０２８６、０．０３２４、０．０３０９、０．０３３６、０．０３８７及び０．０４７７ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈについては、ＢｅＰｈと重なっているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0201】

これに対して図１３（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２７１、０．０２３１、０．０２０７、０．０２０５、０．０２１４、０．０２３１、０．０２６５、０．０３２２及び０．０４１９ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１２．６、２８．０、３１．２、２８．３、２５．２、２１．１、１６．８及び１２．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0202】

図１４（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２３９、０．０１７５、０．０１５７、０．０１７０、０．０１７５、０．０１８７、０．０２３１、０．０２９７及び０．０４１８ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２２．９、４５．５、４７．８、４０．６、３９．５、３１．３、２３．３及び１２．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0203】

図１４（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０２、０．０１５５、０．０１２７、０．０１３７、０．０１５７、０．０１８２、０．０２２２、０．０２８４及び０．０４１９ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３４．８、５１．７、５７．８、５２．１、４１．１、３３．９、２６．６及び１２．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0204】

図１４（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１６７、０．０１３３、０．０１３３、０．０１４１、０．０１６０、０．０１８４、０．０２３８、０．０３１１及び０．０４２４ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４６．１、５８．６、５５．８、５０．７、４０．５、２９．２、１９．６及び１１．１％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0205】

試料注入から流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで５、８、１０及び１２μＬ送液し、０．１分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図１３（Ｃ）、図１４（Ａ）、図１４（Ｂ）及び図１４（Ｃ））の中では、概ね図１４（Ｂ）のクロマトグラムのピークの半値幅が最も小さくなった。

【0206】

試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで１０μＬ送液してから流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに上げる流速プログラムによる分析が、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて最も高いカラム性能が得られることを確認した。試料注入用流路切り替えバルブからカラム入口までの配管の容量は約７．７μＬであるが、実際は試料注入用流路切り替えバルブとサンプルループ内の容量と、図３に示す、カラム入口側内部の、カラム充填層入口側の境界までの容量も存在するため、実際に試料注入装置からカラム充填層入口側の境界を試料バンドが跨ぐまで試料バンドを移動させるのに約１０μＬの送液が必要であることと、試料注入装置からカラムまで試料バンドを運ぶのに１２μＬ送液してしまうと、０．０１ｍＬ／ｍｉｎというカラム性能が出難い流速でカラム充填層に試料が入り、分離が行われてしまうために、最も高いカラム性能は得られないことを確認した。

【0207】

又、図１４（Ａ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．９４−０．８０＝０．１４ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１４＝７０．０ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0208】

又、図１４（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．１５−１．００＝０．１５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１５＝６５．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0209】

又、図１４（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．３７−１．２０＝０．１７ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１７＝５７．６ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例6】

【0210】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク形状に与える効果を確認した（図１４（Ｂ）、図１５（Ａ）、図１５（Ｂ）及び図１５（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図１３（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0211】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0212】

図１３（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0213】

図１４（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．００分後（注入から１０μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：１０μＬと記載）から０．１０分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．１０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0214】

図１５（Ａ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から１０μＬ送液後）から０．０９分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．５９分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0215】

図１５（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．２０分後（注入から１０μＬ送液後）から０．０８分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．２８分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0216】

図１５（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．１０分後（注入から１０μＬ送液後）から０．０８分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．１８分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の２．５０分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0217】

図１３（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０３１０、０．０３２１、０．０３０１、０．０２８６、０．０３２４、０．０３０９、０．０３３６、０．０３８７及び０．０４７７ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈについては、ＢｅＰｈと重なっているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0218】

これに対して図１４（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０２、０．０１５５、０．０１２７、０．０１３７、０．０１５７、０．０１８２、０．０２２２、０．０２８４及び０．０４１９ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３４．８、５１．７、５７．８、５２．１、４１．１、３３．９、２６．６及び１２．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0219】

図１５（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９８、０．０１５７、０．０１４９、０．０１６０、０．０１６４、０．０１９１、０．０２３４、０．０２９９及び０．０４０４ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３６．１、５１．１、５０．５、４４．１、３８．２、３０．４、２２．７及び１５．３％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0220】

図１５（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２２３、０．０２０４、０．０１７０、０．０１９８、０．０２０４、０．０２１８、０．０２６４、０．０３１７及び０．０４２６ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２８．１、３６．４、４３．５、３０．８、２９．５、２１．４、１８．１及び１０．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0221】

図１５（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２７７、０．０２３６、０．０２１０、０．０２２４、０．０２３２、０．０２５１、０．０２７０、０．０３４６及び０．０４２７ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１０．６、２６．５、３０．２、２１．７、１８．８、１９．６、１０．６及び１０．５％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0222】

試料注入から流速０．０１、０．０２、０．０５及び０．１ｍＬ／ｍｉｎで１０μＬ送液し、その後、流速が０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定する圧力に到達するまでの約０．１分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図１４（Ｂ）、図１５（Ａ）、図１５（Ｂ）及び図１５（Ｃ））の中では、図１４（Ｂ）のクロマトグラムのピークの半値幅が最も小さく、試料注入から１０μＬ分、カラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで送液される流速が小さいほど、クロマトグラムのピークの半値幅が小さくなる結果が得られた。

【0223】

又、図１５（Ａ）において、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．６２−０．５０＝０．１２ｍｉｎであり、０．０２ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．７ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．４ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．４／０．１２＝７８．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0224】

又、図１５（Ｂ）において、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．３６−０．２０＝０．１６ｍｉｎであり、０．０５ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．７ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は８．４ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、８．４／０．１６＝５２．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0225】

又、図１５（Ｃ）において、０．１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．２３−０．１０＝０．１３ｍｉｎであり、０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（３．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は６．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、６．８／０．１３＝５２．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例7】

【0226】

試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図１６（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図１６（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。又、本発明の試料導入方法における流速の変化の勾配がピーク幅に与える効果を確認した（図１６（Ｃ））。

【0227】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0228】

図１６（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0229】

図１６（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：５μＬと記載）から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0230】

図１６（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．６３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0231】

図１６（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０７２７、０．０７７０、０．０６０８、０．０６２３、０．１２４８、０．０６７０、０．０７０８、０．０７８１及び０．０９０８ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈについては、ＢｅＰｈと重なっているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。又、ＢｅＰｈについては、ＢｕＰｈと重なっているため、０．１２４８という明らかに大きい半値幅が計算されていた。

【0232】

これに対して図１６（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０４１３、０．０３６４、０．０３２５、０．０３２９、０．０３４８、０．０３７１、０．０３８０、０．０４３８、０．０５４３及び０．０７１９ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４３．２、５２．７、４６．５、４７．２、４３．３、３８．１、３０．５及び２０．８％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0233】

図１６（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０４０３、０．０３７９、０．０３４３、０．０３５４、０．０３７７、０．０４０６、０．０４０５、０．０４５９、０．０５５９及び０．０７３２ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４４．６、５０．８、４３．６、４３．２、３９．６、３５．２、２８．４及び１９．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0234】

図１６（Ｂ）では、ＵとＯｃＰｈの保持時間の差が２．５２２ｍｉｎで、図１６（Ａ）の比較例の場合（２．４６５ｍｉｎ）や図１６（Ｃ）の場合（２．４８１ｍｉｎ）に比べて大きくなっており、クロマトグラム前半の、ピークＮｏ．１とピークＮｏ．２の分離も、図１６（Ｃ）に比べて良くなっている。この理由は、図１６（Ｂ）では、圧力が１６．７ＭＰａで安定する前に一部の溶質が溶出していることから、０．１ｍＬ／ｍｉｎより低い流速で試料バンドがカラム充填剤層に入り、その後流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎに達したことが示されている。

【0235】

又、ウラシル（Ｕ）のピークＮｏ．１を除いて、図１６（Ｂ）の方が図１６（Ｃ）に比べて９本のピークの半値幅が小さく、高いカラム性能が発揮されている。この理由は、図１６（Ｂ）では０．０１ｍＬから０．１ｍＬへの流速の変化の勾配が図１６（Ｃ）に比べてわずかに緩やかであったので、カラム充填層前の配管中（少なくとも約７．７μＬの容量がある）で試料がその分散の増加を抑えることが出来る流速で送液された送液容量が図１６（Ｃ）に比べて実質多かったためと思われる。又、この接続管を用いた条件下でこのカラムについての最適流速は０．０５ｍＬ／ｍｉｎと０．１ｍＬ／ｍｉｎの間にあることが認められた。この範囲の流速での溶出により、図１６（Ｂ）において高いカラム性能が得られたものと解釈される。図１６（Ｂ）においてピークＮｏ．１が溶出される時には、圧力が流速０．１ｍＬ／ｍｉｎでの平衡圧力（１６．７ＭＰａ）より相当に低く、結果としてピークＮｏ．１の半値幅が図１６（Ｃ）のピークＮｏ．１の半値幅に比べて大きくなったものと解釈できる。

【0236】

試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで５μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0237】

又、図１６（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．４１−０．５０＝０．９１ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．８ＭＰａ）の差は１５．２ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．２／０．９１＝１６．７ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0238】

又、図１６（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．６５−０．５０＝０．１５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１５＝１００．７ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例8】

【0239】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行う時間（第一流速による送液容量）がピーク形状に与える効果を確認した（図１６（Ｃ）、図１７（Ａ）、図１７（Ｂ）、図１７（Ｃ）及び図１８（Ａ））。又、従来の試料注入法（図１６（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0240】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0241】

図１６（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0242】

図１６（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：５μＬと記載）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．６３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0243】

図１７（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．８０分後（注入から８μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．９３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0244】

図１７（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．００分後（注入から１０μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．１３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0245】

図１７（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．２０分後（注入から１２μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．３３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0246】

図１８（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．５０分後（注入から１５μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．６３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0247】

図１６（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０７２７、０．０７７０、０．０６０８、０．０６２３、０．１２４８、０．０６７０、０．０７０８、０．０７８１及び０．０９０８ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈについては、ＢｅＰｈと重なっているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。又、ＢｅＰｈについては、ＢｕＰｈと重なっているため、０．１２４８という明らかに大きい半値幅が計算されていた。

【0248】

これに対して図１６（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０４０３、０．０３７９、０．０３４３、０．０３５４、０．０３７７、０．０４０６、０．０４０５、０．０４５９、０．０５５９及び０．０７３２ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４４．６、５０．８、４３．６、４３．２、３９．６、３５．２、２８．４及び１９．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0249】

図１７（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０３００、０．０２７８、０．０２６２、０．０２７４、０．０２９９、０．０３１６、０．０３３４、０．０４０２、０．０５１２及び０．０６９９ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、５８．７、６３．９、５６．９、５６．０、５０．１、４３．２、３４．４及び２３．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0250】

図１７（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２８８、０．０２６６、０．０２５２、０．０２６５、０．０２８８、０．０３０７、０．０３２７、０．０３９２、０．０５０８及び０．０６８４ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、６０．４、６５．５、５８．６、５７．５、５１．２、４４．６、３５．０及び２４．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0251】

図１７（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９１、０．０２６６、０．０２５３、０．０２６７、０．０２９１、０．０３０９、０．０３２８、０．０３９８、０．０５１１及び０．０６９３ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、６０．０、６５．５、５８．４、５７．１、５１．０、４３．８、３４．６及び２３．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0252】

図１８（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９０、０．０２６８、０．０２５８、０．０２７２、０．０２９７、０．０３１３、０．０３３６、０．０４０６、０．０５２３及び０．０７１２ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、６０．１、６５．２、５７．６、５６．３、４９．９、４２．７、３３．０及び２１．６％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0253】

試料注入から流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで５、８、１０、１２及び１５μＬ送液し、０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図１６（Ｃ）、図１７（Ａ）、図１７（Ｂ）、図１７（Ｃ）及び図１８（Ａ））の中では、図１７（Ｂ）のクロマトグラムのピークの半値幅が最も小さくなった。

【0254】

試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで１０μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げる流速プログラムによる分析が、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて最も高いカラム性能が得られることを確認した。試料注入用流路切り替えバルブからカラム入口までの配管の容量は約７．７μＬであるが、実際は試料注入用流路切り替えバルブとサンプルループ内の容量と、図３に示す、カラム入口側内部の、カラム充填層入口側の境界までの容量も存在するため、実際に試料注入装置からカラム充填層入口側の境界を試料バンドが跨ぐまで試料バンドを移動させるのに約１０μＬの送液が必要であることと、試料注入装置からカラムまで試料バンドを運ぶのに１２μＬ、１５μＬ送液してしまうと、０．０１ｍＬ／ｍｉｎというカラム性能が出難い流速でカラム充填層に試料が入り、分離が行われてしまうために、最も高いカラム性能は得られないことを確認した。

【0255】

又、図１７（Ａ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．９８−０．８０＝０．１８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１８＝８３．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0256】

又、図１７（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．１８−１．００＝０．１８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１８＝８３．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0257】

又、図１７（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．４０−１．２０＝０．２０ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．２０＝７５．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0258】

又、図１８（Ａ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．６８−１．５０＝０．１８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１８＝８３．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例9】

【0259】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク形状に与える効果を確認した（図１９（Ａ）、図１９（Ｂ）、図１９（Ｃ）、図２０（Ａ）及び図２０（Ｂ））。又、従来の試料注入法（図１６（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0260】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0261】

図１６（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0262】

図１９（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の２．００分後（注入から１０μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：１０μＬと記載）から０．１４分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の２．１４分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の５．５０分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0263】

図１９（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．００分後（注入から１０μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．１３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0264】

図１９（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から１０μＬ送液後）から０．１２分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．６２分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0265】

図２０（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．２０分後（注入から１０μＬ送液後）から０．０８分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．２８分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0266】

図２０（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０８ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．１３分後（注入から１０．４μＬ送液後）から０．０４分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．１７分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０８ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0267】

図１６（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０７２７、０．０７７０、０．０６０８、０．０６２３、０．１２４８、０．０６７０、０．０７０８、０．０７８１及び０．０９０８ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈについては、ＢｅＰｈと重なっているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。又、ＢｅＰｈについては、ＢｕＰｈと重なっているため、０．１２４８という明らかに大きい半値幅が計算されていた。

【0268】

これに対して図１９（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２４３、０．０２２５、０．０２１８、０．０２３４、０．０２５９、０．０２７４、０．０３０１、０．０３７４、０．０４９０及び０．０６７７ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、６６．６、７０．８、６４．１、６２．４、５５．１、４７．２、３７．３及び２５．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0269】

図１９（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２８８、０．０２６６、０．０２５２、０．０２６５、０．０２８８、０．０３０７、０．０３２７、０．０３９２、０．０５０８及び０．０６８４ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、６０．４、６５．５、５８．６、５７．５、５１．２、４４．６、３５．０及び２４．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0270】

図１９（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０３５７、０．０３３１、０．０３０６、０．０３２０、０．０３４０、０．０３６４、０．０３７３、０．０４３４、０．０５３７及び０．０７１０ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、５０．９、５７．０、４９．７、４８．６、４４．３、３８．７、３１．２及び２１．８％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0271】

図２０（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０５１２、０．０４９１、０．０４３３、０．０４４６、０．０４９６、０．０５４６、０．０６３３及び０．０７９５ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈとＢｅＰｈについては、互いに重なり合っているため、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２９．６、３６．２、２８．８、２８．４、２６．０、２２．９、１９．０及び１２．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0272】

図２０（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０６３２、０．０６４６、０．０５４０、０．０５５４、０．０６０５、０．０６４７、０．０７２６及び０．０８５８ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈとＢｅＰｈについては、互いに重なり合っているため、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１３．１、１６．１、１１．２、１１．１、９．７、８．６、７．０及び５．５％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる

【0273】

試料注入から流速０．００５、０．０１、０．０２、０．０５及び０．０８ｍＬ／ｍｉｎで約１０μＬ送液し、その後０．０４〜０．１４分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図１９（Ａ）、図１９（Ｂ）、図１９（Ｃ）、図２０（Ａ）及び図２０（Ｂ））の中では、図１９（Ａ）のクロマトグラムのピークの半値幅が最も小さく、試料注入から１０μＬ送液して、カラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで試料バンドを移動させる第一流速が小さいほど、クロマトグラムのピークの半値幅が小さくなる傾向が見られた。

【0274】

いずれの場合も流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られたが、中でも試料注入後０．００５ｍＬ／ｍｉｎという最も小さい流速で１０μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げる流速プログラムによる分析により、最も高いカラム性能が得られることを確認した。

【0275】

又、図１９（Ａ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は２．１８−２．００＝０．１８ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．８ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．９ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．９／０．１８＝８８．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0276】

又、図１９（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．１８−１．００＝０．１８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１８＝８３．８ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0277】

又、図１９（Ｃ）において、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．６６−０．５０＝０．１６ｍｉｎであり、０．０２ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（３．２ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．８ＭＰａ）の差は１３．６ＭＰａであることから、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１３．６／０．１６＝８５．０ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0278】

又、図２０（Ａ）において、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．３０−０．２０＝０．１０ｍｉｎであり、０．０５ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（８．４ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は８．３ＭＰａであることから、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、８．３／０．１０＝８３．０ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0279】

又、図２０（Ｂ）において、０．０８ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．１５−０．１３＝０．０２ｍｉｎであり、０．０８ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１３．４ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．８ＭＰａ）の差は３．４ＭＰａであることから、０．０８ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、３．４／０．０２＝１７０．０ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例10】

【0280】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク形状に与える効果を確認した（図２０（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図１６（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0281】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0282】

図１６（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0283】

図２０（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入と同時に直線的に流速を上げ始め、注入の１．００分後には流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとし（１．００分かけて、流速を０ｍＬ／ｍｉｎから０．０２ｍＬ／ｍｉｎに直線勾配で上昇させる。クロマトグラムの左上に（１）：１０μＬと記載）、注入から１．０１分後から流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとして０．１３分間送液し、注入から１．１４分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．５０分後から流速を０ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0284】

図１６（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０７２７、０．０７７０、０．０６０８、０．０６２３、０．１２４８、０．０６７０、０．０７０８、０．０７８１及び０．０９０８ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈについては、ＢｅＰｈと重なっているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。又、ＢｅＰｈについては、ＢｕＰｈと重なっているため、０．１２４８という明らかに大きい半値幅が計算されていた。

【0285】

これに対して図２０（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０３２２、０．０３０４、０．０２８４、０．０２９８、０．０３２０、０．０３４３、０．０３５７、０．０４２２、０．０５３２及び０．０７１８ｍｉｎが得られている。図１６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、５５．７、６０．５、５３．３、５２．２、４６．７、４０．４、３１．９及び２１．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0286】

試料注入後１分間で流速を０ｍＬ／ｍｉｎから０．０２ｍＬ／ｍｉｎに直線勾配で上げてから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げる流速プログラムによる分析を行うことで、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0287】

又、図２０（Ｃ）において、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．１７−１．００＝０．１７ｍｉｎであり、０．０２ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（３．５ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．８ＭＰａ）の差は１３．３ＭＰａであることから、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１３．３／０．１７＝７８．２ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例11】

【0288】

試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図２１（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図２１（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。又、本発明の試料導入方法における流速の変化の勾配がピーク幅に与える効果を確認した（図２１（Ｃ））。

【0289】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0290】

図２１（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0291】

図２１（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．００分後（注入から１０μＬ送液後）から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の７．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0292】

図２１（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．００分後（注入から１０μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：１０μＬと記載）から０．１１分間は流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．１１分後から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の７．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0293】

図２１（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０９９５、０．０９４８、０．０８４７、０．０８７５、０．０９８１、０．１０９１、０．１２９７及び０．１６６３ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈとＢｅＰｈについては、互いに重なり合っているため、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0294】

これに対して図２１（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０５７９、０．０５１４、０．０４８６、０．０５１５、０．０５６４、０．０５９５、０．０６４６、０．０８０１、０．１０５６及び０．１４８１ｍｉｎが得られている。図２１（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４１．８、４５．８、４２．６、４１．１、３４．１、２６．６、１８．６及び１０．９％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0295】

図２１（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０５４５、０．０４９８、０．０４７５、０．０５０８、０．０５６１、０．０５９１、０．０６４５、０．０８０１、０．１０４８及び０．１４８３ｍｉｎが得られている。図２１（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４５．２、４７．５、４３．９、４１．９、３４．３、２６．６、１９．２及び１０．８％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0296】

図２１（Ｃ）の方が図２１（Ｂ）に比べて、概ね高いカラム性能が発揮されている。この理由は、図２１（Ｂ）では０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．０５ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化の勾配が図２１（Ｃ）に比べて緩やかであったため、部分的であるが流速が０．０５ｍＬ／ｍｉｎに変化する途中で試料中の溶質がカラム充填層で分離されたためと思われる。

【0297】

実施例５、実施例８の結果では、分散を小さく保つことが出来る流速で、試料注入装置から試料バンドが１０μＬ移動した時が、最も高いカラム性能が発揮されていた。この結果は、試料注入用流路切り替えバルブからカラム入口側のフリット空隙まで（カラム充填層の手前まで）の実質的な容量が約１０μＬであることと合致している。

【0298】

非特許文献１では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（ウォーターズ社）に検出セル容量６ｎＬのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を組み合わせ、更に試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管の容量を最小化したＵＨＰＬＣ装置と、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を使用して、温度条件は４０℃とし、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を送液する流速を変えて、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ）についてＶａｎ Ｄｅｅｍｔｅｒプロットを作成している。カラム長さは５００００μｍで、カラムの空隙率は約５０％であり、ＯｃＰｈについての最適線速度が４ｍｍ／ｓｅｃで、理論段高さは５．１μｍであった。即ち、最適流速は約０．１ｍＬ／ｍｉｎであり、この時のＯｃＰｈの理論段数は９８００であった（理論段高さは５．１μｍであり、カラム長さは５００００μｍであった）。

【0299】

一方で、図１６（Ａ）と図２１（Ａ）のＯｃＰｈの理論段数はそれぞれ、４４５５と５７００であり、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を使用しているが、流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎの時より、０．０５ｍＬ／ｍｉｎの時の方が高いカラム性能が発揮されている。非特許文献１で使用したＵＨＰＬＣ装置より、実施例７と１１で使用したＵＨＰＬＣ装置の方が試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管の容量が大きかったため、発揮されたカラム性能が低かっただけでなく、同じカラムを使用していても、最適流速が低流速側（０．０５ｍＬ／ｍｉｎと０．１ｍＬ／ｍｉｎの間）に変わっていた。

【0300】

図２１（Ｃ）の方が図２１（Ｂ）に比べて、概ね高いカラム性能が発揮された理由は、図２１（Ｂ）では０．０５ｍＬ／ｍｉｎより低い流速（カラム性能がより低くなる流速）で、図２１（Ｃ）より長い時間、試料中の溶質がカラム充填層で分離されたためと解釈できる。

【0301】

試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで１０μＬ送液してから流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0302】

又、図２１（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．０５ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．８５−１．００＝０．８５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．０５ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（８．３ＭＰａ）の差は６．７ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．０５ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、６．７／０．８５＝７．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0303】

又、図２１（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．０５ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．３５−１．００＝０．３５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．０５ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（８．３ＭＰａ）の差は６．７ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．０５ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、６．７／０．３５＝１９．１ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例12】

【0304】

試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図２２（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図２２（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。又、本発明の試料導入方法における流速の変化の勾配がピーク幅に与える効果を確認した（図２２（Ｃ））。

【0305】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0306】

図２２（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0307】

図２２（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0308】

図２２（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．４０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0309】

図２２（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２００、０．０１６４、０．０１５９、０．０１６３、０．０１７４、０．０１８３、０．０１９５、０．０２３６、０．０３０６及び０．０４１９ｍｉｎが得られている。

【0310】

これに対して図２２（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９４、０．０１２９、０．０１２７、０．０１３５、０．０１５０、０．０１５７、０．０１７６、０．０２１９、０．０２９３及び０．０４１２ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３．０、２１．３、２０．１、１７．２、１３．８、１４．２、９．７、７．２、４．２及び１．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0311】

図２２（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９１、０．０１２９、０．０１２８、０．０１３６、０．０１５０、０．０１５６、０．０１７６、０．０２２０、０．０２９３及び０．０４１０ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４．５、２１．３、１９．５、１６．６、１３．８、１４．８、９．７、６．８、４．２及び２．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0312】

図２２（Ｃ）では図２２（Ｂ）に比べて、ほぼ同等のカラム性能が発揮されている。この理由は、図２２（Ｂ）では０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化の勾配が図２２（Ｃ）に比べてわずかに緩やかであったが、試料注入用流路切り替えバルブからカラム充填層前までの実質的な容量が約３．５μＬであり、試料がその分散の増加を抑えることが出来る流速でカラム充填層前までに移動した容量と、カラム充填層での分離における流速が図２２（Ｃ）とほぼ同等であったためと思われる。

【0313】

図２２（Ｂ）では図２２（Ｃ）に比べて、わずかに低い流速でカラムに試料が導入されたと思われるが、試料中の溶質がカラムから溶出する前に圧力が１０．１ＭＰａで安定していることから、ほぼ同等のカラム性能が発揮されたと思われる。図２２（Ｂ）でのＵとＯｃＰｈの保持時間の差は１．６１０ｍｉｎで、図２２（Ｃ）でのＵとＯｃＰｈの保持時間の差１．６１２ｍｉｎとほぼ同等である。

【0314】

図２２（Ａ）（比較例）、図２２（Ｂ）、図２２（Ｃ）について、それぞれ２回ずつ採取したクロマトグラムから、各ピークの保持時間（単位はｍｉｎ）と半値幅（単位はｍｉｎ）を表２に示す。いずれの条件下でも再現性は良好であった。

【0315】

【表2】

【0316】

又、試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液してから流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0317】

又、図２２（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．６２−０．３５＝０．２７ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．２７＝３６．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0318】

又、図２２（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．５１−０．３５＝０．１６ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１６＝６１．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例13】

【0319】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行う時間（第一流速による送液容量）がピーク形状に与える効果を確認した（図２３（Ａ）、図２３（Ｂ）、図２３（Ｃ）及び図２２（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図２２（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0320】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0321】

図２２（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0322】

図２３（Ａ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．１０分後（注入から１μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：１μＬと記載）から０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．１５分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0323】

図２３（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．２０分後（注入から２μＬ送液後）から０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．２５分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0324】

図２３（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３０分後（注入から３μＬ送液後）から０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．３５分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0325】

図２２（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．４０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0326】

図２２（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２００、０．０１６４、０．０１５９、０．０１６３、０．０１７４、０．０１８３、０．０１９５、０．０２３６、０．０３０６及び０．０４１９ｍｉｎが得られている。

【0327】

これに対して図２３（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９５、０．０１４３、０．０１３９、０．０１４５、０．０１５８、０．０１６６、０．０１８４、０．０２２７、０．０２９８及び０．０４１５ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２．５、１２．８、１２．６、１１．０、９．２、９．３、５．６、３．８、２．６及び１．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0328】

図２３（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２００、０．０１３９、０．０１３５、０．０１４２、０．０１５５、０．０１６２、０．０１８０、０．０２２４、０．０２９６及び０．０４１２ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、０．０、１５．２、１５．１、１２．９、１０．９、１１．５、７．７、５．１、３．３及び１．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0329】

図２３（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９８、０．０１３４、０．０１３２、０．０１４０、０．０１５４、０．０１６１、０．０１７８、０．０２２４、０．０２９８及び０．０４１８ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１．０、１８．３、１７．０、１４．１、１１．５、１２．０、８．７、５．１、２．６及び０．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0330】

図２２（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９１、０．０１２９、０．０１２８、０．０１３６、０．０１５０、０．０１５６、０．０１７６、０．０２２０、０．０２９３及び０．０４１０ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４．５、２１．３、１９．５、１６．６、１３．８、１４．８、９．７、６．８、４．２及び２．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0331】

試料注入から流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで１、２、３及び３．５μＬ送液し、その後０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図２３（Ａ）、図２３（Ｂ）、図２３（Ｃ）及び図２２（Ｃ））の中では、図２２（Ｃ）のクロマトグラムのピークの半値幅が最も小さくなった。

【0332】

試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液してから流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに上げての分析が、流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて最も高いカラム性能が得られることを確認した。試料注入用流路切り替えバルブとカラム入口を接続した配管の容量は約１．９９μＬであるが、実際は試料注入用流路切り替えバルブとサンプルループ内の容量と、図３に示す、カラム入口側内部の、充填層入口側の境界までの容量も存在するため、実際に試料注入装置からカラム充填層入口側の境界を試料バンドが跨ぐまで試料を運ぶのに３．５μＬの送液が必要であることを確認した。

【0333】

又、図２３（Ａ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．２６−０．１０＝０．１６ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１６＝６１．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0334】

又、図２３（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．２９−０．２０＝０．０９ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．０９＝１０８．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0335】

又、図２３（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．４５−０．３０＝０．１５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１５＝６５．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例14】

【0336】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク形状に与える効果を確認した（図２４（Ａ）、図２４（Ｂ））。又、従来の試料注入法（図２２（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0337】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0338】

図２２（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0339】

図２４（Ａ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．７０分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）から０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．７５分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0340】

図２４（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．４０分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0341】

図２２（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２００、０．０１６４、０．０１５９、０．０１６３、０．０１７４、０．０１８３、０．０１９５、０．０２３６、０．０３０６及び０．０４１９ｍｉｎが得られている。

【0342】

これに対して図２４（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９３、０．０１２８、０．０１２６、０．０１３３、０．０１４９、０．０１５７、０．０１７５、０．０２１９、０．０２９２及び０．０４０７ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３．５、２２．０、２０．８、１８．４、１４．４、１４．２、１０．３、７．２、４．６及び２．９％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0343】

図２４（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９１、０．０１２９、０．０１２８、０．０１３６、０．０１５０、０．０１５６、０．０１７６、０．０２２０、０．０２９３及び０．０４１０ｍｉｎが得られている。図２２（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４．５、２１．３、１９．５、１６．６、１３．８、１４．８、９．７、６．８、４．３及び２．１％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0344】

試料注入から流速０．００５及び０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液し、その後０．０５分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図２４（Ａ）及び図２４（Ｂ））では、概ね図２４（Ａ）のクロマトグラムのピークの半値幅の方が小さかった。

【0345】

試料注入後０．００５ｍＬ／ｍｉｎ、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液してから流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析した中では、いずれの場合も流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られたが、中でも試料注入後０．００５ｍＬ／ｍｉｎという最も小さい流速で３．５μＬ送液してから流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎに上げる流速プログラムによる分析により、最も高いカラム性能が得られることを確認した。

【0346】

又、図２４（Ａ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８７−０．７０＝０．１７ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．１ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は１０．０ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１０．０／０．１７＝５８．８ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0347】

又、図２４（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．５１−０．３５＝０．１６ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．３ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１０．１ＭＰａ）の差は９．８ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、９．８／０．１６＝６１．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例15】

【0348】

試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を伴う試料導入方法によるカラム性能向上の確認のため、従来の試料注入法（図２５（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図２５（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。又、本発明の試料導入方法における流速の変化の勾配がピーク形状に与える効果を確認した（図２５（Ｃ））。

【0349】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0350】

図２５（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0351】

図２５（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0352】

図２５（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．４８分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0353】

図２５（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９１、０．０２６６、０．０２５４、０．０２６５、０．０２８８、０．０３０４、０．０３２４、０．０３９４、０．０５０６及び０．０６９２ｍｉｎが得られている。

【0354】

これに対して図２５（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２３８、０．０２０７、０．０１９９、０．０２１２、０．０２３７、０．０２５１、０．０２８１、０．０３５５、０．０４７２及び０．０６６５ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１８．２、２２．２、２１．７、２０．０、１７．７、１７．４、１３．３、９．９、６．７及び３．９％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0355】

図２５（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２１０、０．０１９２、０．０１９２、０．０２０９、０．０２３８、０．０２５２、０．０２８１、０．０３５５、０．０４７９及び０．０６７１ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２７．８、２７．８、２４．４、２１．１、１７．４、１７．１、１３．３、９．９、５．３及び３．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0356】

図２５（Ｂ）では０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化の勾配が図２５（Ｃ）に比べて緩やかであり、より低い流速でカラム充填層に試料が導入され、部分的に低い流速で分離が行われたことを示している。図２５（Ｂ）では図２５（Ｃ）に比べて、クロマトグラム後期のピーク（ピークＮｏ．９、１０）について、わずかに小さなピーク幅が得られる一方、初期のピーク（ピークＮｏ．１、２、３、４）について、わずかに大きなピーク幅が得られた。

【0357】

非特許文献１では、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（ウォーターズ社）に検出セル容量６ｎＬのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を組み合わせ、更に試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム入口までの配管の容量を最小化したＵＨＰＬＣ装置と、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を使用して、温度条件は４０℃、移動相をアセトニトリル／水＝６５／３５とした時、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ）について最適流速は約０．１ｍＬ／ｍｉｎであった。また、実施例７と１１で使用したＵＨＰＬＣ装置では、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を使用して、流速が０．１ｍＬ／ｍｉｎの時よりも０．０５ｍＬ／ｍｉｎの時の方がＯｃＰｈの理論段数が高かった。

【0358】

実施例１５で使用したＵＨＰＬＣ装置では、図示していないが、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を使用して、温度条件は４０℃とし、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を送液する流速を変えて、保持係数ｋ＝６．５の溶質について理論段数を確認したところ、流速０．０７５ｍＬ／ｍｉｎで最も高く、７６００であった。

【0359】

図２５（Ｂ）において図２５（Ｃ）に比べて、クロマトグラム後期の、０．１ｍＬ／ｍｉｎでカラムが平衡化した後に溶出するピーク（ピークＮｏ．９及び１０、保持係数ｋは図２５（Ａ）において８．３及び１２．４）について、わずかに小さなピーク幅が得られた理由としては、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）が、実施例１５で使用したＵＨＰＬＣ装置において、高いカラム性能を得られる最適な流速０．０７５ｍＬ／ｍｉｎに近い流速で部分的に分離が行われたことが考えられる。

【0360】

図２５（Ｂ）において、ピークＮｏ．１、２、３、４について、これら４本のピークの間隔（保持時間の差）が図２５（Ｃ）より大きいことから、これら４本のピークが図２５（Ｂ）において図２５（Ｃ）より高性能を与える条件下で分離される一方、０．１ｍＬ／ｍｉｎより低い流速で溶出されたことにより、ピーク幅が図２５（Ｃ）より大きくなったと考えられる。

【0361】

試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0362】

又、図２５（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．２３−０．３５＝０．８８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．８８＝１７．２ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0363】

又、図２５（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．５２−０．３５＝０．１７ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１７＝８８．８ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例16】

【0364】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行う時間（第一流速による送液容量）がピーク幅に与える効果を確認した（図２６（Ａ）、図２６（Ｂ）、図２６（Ｃ）、図２５（Ｃ）、図２７（Ａ）、図２７（Ｂ）、図２７（Ｃ）及び図２８（Ａ））。又、従来の試料注入法（図２５（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0365】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0366】

図２５（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0367】

図２６（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．１０分後（注入から１μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：１μＬと記載）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．２３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0368】

図２６（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．２０分後（注入から２μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．３３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0369】

図２６（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３０分後（注入から３μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．４３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0370】

図２５（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．４８分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0371】

図２７（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．４０分後（注入から４μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．５３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0372】

図２７（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５０分後（注入から５μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．６３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0373】

図２７（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．６０分後（注入から６μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．７３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0374】

図２８（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．８０分後（注入から８μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．９３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0375】

図２５（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９１、０．０２６６、０．０２５４、０．０２６５、０．０２８８、０．０３０４、０．０３２４、０．０３９４、０．０５０６及び０．０６９２ｍｉｎが得られている。

【0376】

これに対して図２６（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２３２、０．０２１３、０．０２０６、０．０２２２、０．０２４９、０．０２６４、０．０２９０、０．０３６２、０．０４８１及び０．０６７４ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２０．３、１９．９、１８．９、１６．２、１３．５、１３．２、１０．５、８．１、４．９及び２．６％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0377】

図２６（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２１９、０．０２０４、０．０１９９、０．０２１４、０．０２４１、０．０２５６、０．０２８５、０．０３５７、０．０４７８及び０．０６６７ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２４．７、２３．３、２１．７、１９．２、１６．３、１５．８、１２．０、９．４、５．５及び３．６％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0378】

図２６（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２１０、０．０１９５、０．０１９３、０．０２０９、０．０２３５、０．０２５２、０．０２８１、０．０３５６、０．０４７５及び０．０６６７ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２７．８、２６．７、２４．０、２１．１、１８．４、１７．１、１３．３、９．６、６．１及び３．６％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0379】

図２５（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２１０、０．０１９２、０．０１９２、０．０２０９、０．０２３８、０．０２５２、０．０２８１、０．０３５５、０．０４７９及び０．０６７１ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２７．８、２７．８、２４．４、２１．１、１７．４、１７．１、１３．３、９．９、５．３及び３．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0380】

図２７（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２１０、０．０１９１、０．０１９３、０．０２０９、０．０２３８、０．０２５１、０．０２８０、０．０３５６、０．０４７９及び０．０６７１ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２７．８、２８．２、２４．０、２１．１、１７．４、１７．４、１３．６、９．６、５．３及び３．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0381】

図２７（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０９、０．０１９１、０．０１９３、０．０２１１、０．０２３８、０．０２５２、０．０２８１、０．０３５４、０．０４７９及び０．０６７０ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２８．２、２８．２、２４．０、２０．４、１７．４、１７．１、１３．３、１０．２、５．３及び３．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0382】

図２７（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０７、０．０１９２、０．０１９４、０．０２１２、０．０２３９、０．０２５２、０．０２８５、０．０３６１、０．０４８１及び０．０６７６ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２８．９、２７．８、２３．６、２０．０、１７．０、１７．１、１２．０、８．４、４．９及び２．３％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0383】

図２８（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０８、０．０１９５、０．０１９７、０．０２１５、０．０２４４、０．０２５６、０．０２９０、０．０３６６、０．０４９０及び０．０６８９ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２８．５、２６．７、２２．４、１８．９、１５．３、１５．８、１０．５、７．１、３．２及び０．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0384】

試料注入から流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで１μＬ、２μＬ、３μＬ、３．５μＬ、４μＬ、５μＬ、６μＬ、８μＬ送液し、その後０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図２６（Ａ）、図２６（Ｂ）、図２６（Ｃ）、図２５（Ｃ）、図２７（Ａ）、図２７（Ｂ）、図２７（Ｃ）及び図２８（Ａ））の中では、図２５（Ｃ）、図２７（Ａ）及び図２７（Ｂ）は図２６（Ａ）、図２６（Ｂ）、図２６（Ｃ）、図２７（Ｃ）及び図２８（Ａ）に比べてクロマトグラムのピークの半値幅が小さい傾向を示した。

【0385】

試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで１μＬ、２μＬ、３μＬ、３．５μＬ、４μＬ、５μＬ、６μＬ、８μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析した中では、試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５〜５μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げる流速プログラムにより、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて概ね最も高いカラム性能が得られることを確認した。試料注入用流路切り替えバルブとカラム入口を接続した配管の容量は約１．９９μＬであるが、実際は試料注入用流路切り替えバルブとサンプルループ内の容量と、図３に示す、カラム入口側内部の、カラム充填層入口側の境界までの容量も存在するため、実際に試料注入装置からカラム充填層入口側の境界を試料バンドが跨ぐまで試料を運ぶのに３．５〜５μＬの送液が必要であることと、試料注入装置からカラムまで試料を運ぶのに６μＬ、８μＬ送液してしまうと、０．０１ｍＬ／ｍｉｎというカラム性能が発揮出来ない流速で、試料がカラム充填層に入り、分離されてしまうために、最も高いカラム性能は得られないことを確認した。

【0386】

又、図２６（Ａ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．３０−０．１０＝０．２０ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．２０＝７５．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0387】

又、図２６（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．４０−０．２０＝０．２０ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．２０＝７５．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0388】

又、図２６（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．４９−０．３０＝０．１９ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１９＝７９．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0389】

又、図２７（Ａ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．５８−０．４０＝０．１８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１８＝８３．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0390】

又、図２７（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．６８−０．５０＝０．１８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１８＝８３．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0391】

又、図２７（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．７９−０．６０＝０．１９ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１９＝７９．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0392】

又、図２８（Ａ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．９８−０．８０＝０．１８ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．１８＝８３．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例17】

【0393】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク形状に与える効果を確認した（図２９（Ａ）、図２９（Ｂ）、図２９（Ｃ）、図３０（Ａ）及び図３０（Ｂ））。又、従来の試料注入法（図２５（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0394】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0395】

図２５（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0396】

図２９（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．７０分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）から０．１４分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．８４分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0397】

図２９（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．１３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．４８分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0398】

図２９（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．１８分後（注入から３．６μＬ送液後）から０．１２分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．３０分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0399】

図３０（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．０７分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．０８分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．１５分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0400】

図３０（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０８ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．０５分後（注入から４μＬ送液後）から０．０４分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．０９分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０８ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0401】

図２５（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９１、０．０２６６、０．０２５４、０．０２６５、０．０２８８、０．０３０４、０．０３２４、０．０３９４、０．０５０６及び０．０６９２ｍｉｎが得られている。

【0402】

これに対して図２９（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０２、０．０１８８、０．０１９０、０．０２０４、０．０２３３、０．０２４８、０．０２７７、０．０３５５、０．０４７６及び０．０６７１ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３０．６、２９．３、２５．２、２３．０、１９．１、１８．４、１４．５、９．９、５．９及び３．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0403】

図２９（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２１１、０．０１９４、０．０１９４、０．０２０９、０．０２３６、０．０２５０、０．０２８０、０．０３５８、０．０４７８及び０．０６７５ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２７．５、２７．１、２３．６、２１．１、１８．１、１７．８、１３．６、９．１、５．５及び２．５％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0404】

図２９（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２２４、０．０２０６、０．０２０１、０．０２１９、０．０２４５、０．０２６０、０．０２８７、０．０３５９、０．０４８０及び０．０６７４ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２３．０、２２．６、２０．９、１７．４、１４．９、１４．５、１１．４、８．９、５．１及び２．６％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0405】

図３０（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２５４、０．０２３６、０．０２２６、０．０２４０、０．０２６２、０．０２７９、０．０３０２、０．０３７４、０．０４８９及び０．０６８４ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１２．７、１１．３、１１．０、９．４、９．０、８．２、６．８、５．１、３．４及び１．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0406】

図３０（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２７６、０．０２５４、０．０２４５、０．０２５８、０．０２８０、０．０２９７、０．０３１９、０．０３８２、０．０４９６及び０．０６８５ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、５．２、４．５、３．５、２．６、２．８、２．３、１．５、３．０、２．０及び１．０％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0407】

試料注入から流速０．００５、０．０１、０．０２、０．０５及び０．０８ｍＬ／ｍｉｎで３．５〜４．０μＬ送液し、その後０．０４〜０．１４分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図２９（Ａ）、図２９（Ｂ）、図２９（Ｃ）、図３０（Ａ）及び図３０（Ｂ））の中では、図２９（Ａ）のクロマトグラムのピークの半値幅が最も小さくなった。

【0408】

試料注入後０．００５ｍＬ／ｍｉｎ、０．０１ｍＬ／ｍｉｎ、０．０２ｍＬ／ｍｉｎ、０．０５ｍＬ／ｍｉｎ、０．０８ｍＬ／ｍｉｎで３．５〜４μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析した中では、いずれの場合も流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られたが、中でも試料注入後０．００５ｍＬ／ｍｉｎという最も小さい流速で３．５μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げる流速プログラムにより、最も高いカラム性能が得られることを確認した。

【0409】

又、図２９（Ａ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８７−０．７０＝０．１７ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（０．８ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．９ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．９／０．１７＝９３．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0410】

又、図２９（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．６０−０．３５＝０．２５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．２５＝６０．４ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0411】

又、図２９（Ｃ）において、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．３４−０．１８＝０．１６ｍｉｎであり、０．０２ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（３．２ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１３．５ＭＰａであることから、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１３．５／０．１６＝８４．４ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0412】

又、図３０（Ａ）において、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．２３−０．０７＝０．１６ｍｉｎであり、０．０５ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（８．３ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は８．４ＭＰａであることから、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、８．４／０．１６＝５２．５ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0413】

又、図３０（Ｂ）において、０．０８ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．１４−０．０５＝０．０９ｍｉｎであり、０．０８ｍＬ／ｍｉｎで安定していた圧力（１３．４ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は３．３ＭＰａであることから、０．０８ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、３．３／０．０９＝３６．７ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例18】

【0414】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク形状に与える効果を確認した（図３０（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図２５（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0415】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0416】

図２５（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0417】

図３０（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入と同時に流速を直線的に上げ始め、注入の０．３５分後には流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとし（０．３５分かけて、流速を０ｍＬ／ｍｉｎから０．０２ｍＬ／ｍｉｎに直線勾配で上昇させる。クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）、注入から０．３７分後から流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとして０．１３分間送液し、注入から０．５０分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0418】

図２５（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９１、０．０２６６、０．０２５４、０．０２６５、０．０２８８、０．０３０４、０．０３２４、０．０３９４、０．０５０６及び０．０６９２ｍｉｎが得られている。

【0419】

これに対して図３０（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２２０、０．０２０３、０．０２００、０．０２１７、０．０２４３、０．０２５８、０．０２９０、０．０３６５、０．０４８８及び０．０６８２ｍｉｎが得られている。図２５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２４．４、２３．７、２１．３、１８．１、１５．６、１５．１、１０．５、７．４、３．６及び１．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0420】

試料注入後０．３５分間で流速を０ｍＬ／ｍｉｎから０．０２ｍＬ／ｍｉｎに直線勾配で上げてから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0421】

又、図３０（Ｃ）において、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．５４−０．３７＝０．１７ｍｉｎであり、０．０２ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（２．２ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１４．５ＭＰａであることから、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１４．５／０．１７＝８５．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例19】

【0422】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、分析に適した流速がピーク幅に与える効果を確認した（図３２（Ａ）、図３２（Ｂ）及び図３２（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図３１（Ａ）、図３１（Ｂ）及び図３１（Ｃ））（比較例）との比較を行った。また、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速と分析に適した流速の差がクロマトグラムにどのような影響を及ぼすかを確認した。

【0423】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．２、０．４、０．６ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0424】

図３１（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0425】

図３１（Ｂ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0426】

図３１（Ｃ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．６ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0427】

図３２（Ａ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．７０分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）から流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の５．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0428】

図３２（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．７０分後（注入から３．５μＬ送液後）から流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0429】

図３２（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．７０分後（注入から３．５μＬ送液後）から流速を０．６ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の２．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0430】

図３１（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２８０、０．０２２０、０．０２２４、０．０２３３、０．０２５３、０．０２６５、０．０２９０、０．０３５６、０．０４６７及び０．０６５０ｍｉｎが得られている。

【0431】

図３１（Ｂ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１４４、０．０１２１、０．０１１９、０．０１２３、０．０１３２、０．０１４８、０．０１７８、０．０２３１及び０．０３１８ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0432】

図３１（Ｃ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１０１、０．００８７、０．００８５、０．００８７、０．００９５、０．０１０６、０．０１２６、０．０１６３及び０．０２１９ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0433】

これに対して図３２（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２６４、０．０１８２、０．０１８５、０．０１９８、０．０２２２、０．０２３０、０．０２６４、０．０３３３、０．０４４９及び０．０６３６ｍｉｎが得られている。図３１（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、５．７、１７．３、１７．４、１５．０、１２．３、１３．２、９．０、６．５、３．９及び２．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。また、図３２（Ａ）では、ピークＮｏ．１のＵが溶出する前に圧力が６．８ＭＰａで安定していた。

【0434】

図３２（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１４３、０．０１００、０．００９８、０．０１０３、０．０１１５、０．０１３４、０．０１６７、０．０２２４及び０．０３１０ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図３１（Ｂ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、０．７、１７．４、１７．６、１６．３、１２．９、９．５、６．２、３．０及び２．５％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。また、図３２（Ｂ）では、ピークＮｏ．１のＵが溶出する前に圧力が１３．５ＭＰａで安定していた。

【0435】

図３２（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１００、０．００７３、０．００７２、０．００７３、０．００８２、０．００９７、０．０１１９、０．０１５８及び０．０２１３ｍｉｎが得られている。ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェアの自動計算で半値幅を認識しなかった。図３１（Ｃ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１．０、１６．１、１５．３、１６．１、１３．７、８．５、５．６、３．１及び２．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0436】

又、図３２（Ｃ）では、ピークＮｏ．１のＵが溶出した後に圧力が２０ＭＰａで安定していたように見えたため、図３１（Ｃ）と図３２（Ｃ）の各ピークの保持時間の差を比較したところ、図３１（Ｃ）ではピークＮｏ．１と２の差が０．０３２ｍｉｎ、ピークＮｏ．２と３の差が０．０４３ｍｉｎ、ピークＮｏ．３と４の差が０．０４２ｍｉｎ、ピークＮｏ．４と５の差が０．０５４ｍｉｎであり、図３２（Ｃ）ではピークＮｏ．１と２の差が０．０３１ｍｉｎ、ピークＮｏ．２と３の差が０．０４３ｍｉｎ、ピークＮｏ．３と４の差が０．０４２ｍｉｎ、ピークＮｏ．４と５の差が０．０５４ｍｉｎであった。もし圧力が２０．４ＭＰａで安定する前にＵが溶出した場合にはピークＮｏ．１と２の保持時間の差が、図３１（Ｃ）よりも図３２（Ｃ）において大きくなると思われる。このことから、ピークＮｏ．１のＵが溶出する前に圧力が２０．４ＭＰａで安定していたと思われる。

【0437】

試料注入から流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液し、その後流速を０．２、０．４、０．６ｍＬ／ｍｉｎとすることで分離を行ったクロマトグラム（図３２（Ａ）、図３２（Ｂ）及び図３２（Ｃ））では、いずれも比較例（図３１（Ａ）、図３１（Ｂ）及び図３１（Ｃ））に比べて、溶質ピークの半値幅が減少した。また、使用したカラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）の場合には、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速（０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）と分析に適した流速の差が０．１９５ｍＬ／ｍｉｎ、０．３９５ｍＬ／ｍｉｎ、０．５９５ｍＬ／ｍｉｎのいずれの場合でも、１回だけ流速を変化させる単純な流速プログラムに従う圧力の変化が迅速に起こり、比較例に比べて各ピークの保持時間の差（ピーク溶出時間の間隔）には概ね影響しないことを確認した。

【0438】

又、図３２（Ａ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．２ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８９−０．７０＝０．１９ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（０．１ＭＰａ）と０．２ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（６．８ＭＰａ）の差は６．７ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．２ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、６．７／０．１９＝３５．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0439】

又、図３２（Ｂ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．４ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８８−０．７０＝０．１８ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（０．１ＭＰａ）と０．４ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１３．６ＭＰａ）の差は１３．５ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．４ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１３．５／０．１８＝７５．０ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0440】

又、図３２（Ｃ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．６ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８７−０．７０＝０．１７ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（０．１ＭＰａ）と０．６ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（２０．４ＭＰａ）の差は２０．３ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．６ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、２０．３／０．１７＝１１９．４ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例20】

【0441】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、分析に適した流速がピーク幅に与える効果を確認した（図３４（Ａ）、図３４（Ｂ）及び図３４（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図３３（Ａ）、図３３（Ｂ）及び図３３（Ｃ））（比較例）との比較を行った。また、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速と分析に適した流速の差がクロマトグラムにどのような影響を及ぼすかを確認した。

【0442】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、図３３（Ａ）、図３３（Ｃ）、図３４（Ａ）及び図３４（Ｃ）では試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、図３３（Ｂ）及び図３４（Ｂ）では試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続した。カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．０２、０．０５、０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0443】

図３３（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．０２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0444】

図３３（Ｂ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0445】

図３３（Ｃ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0446】

図３４（Ａ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．７０分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）から流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の１８．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0447】

図３４（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の１．００分後（注入から１０μＬ送液後）から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の７．５０分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0448】

図３４（Ｃ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．３５分後（注入から３．５μＬ送液後）から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．０１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0449】

図３３（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０９０７、０．０８３４、０．０９３９、０．１０９３、０．１２７９、０．１３２６、０．１６２８、０．２１９７、０．３０８５及び０．４５３８ｍｉｎが得られている。

【0450】

図３３（Ｂ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０９９５、０．０９４８、０．０８４７、０．０８７５、０．０９８１、０．１０９１、０．１２９７及び０．１６６３ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0451】

図３３（Ｃ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９１、０．０２６６、０．０２５４、０．０２６５、０．０２８８、０．０３０４、０．０３２４、０．０３９４、０．０５０６及び０．０６９２ｍｉｎが得られている。

【0452】

これに対して図３４（Ａ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０７７８、０．０７４３、０．０８９７、０．１０６１、０．１２７１、０．１３０６、０．１５９１、０．２１６７、０．３０８２及び０．４４９５ｍｉｎが得られている。図３３（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１４．２、１０．９、４．５、２．９、０．６、１．５、２．３、１．４、０．１及び０．９％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。また、図３４（Ａ）では、ピークＮｏ．１のＵが溶出する前に圧力が３．４ＭＰａで安定していた。

【0453】

図３４（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０５７９、０．０５１４、０．０４８６、０．０５１５、０．０５６４、０．０５９５、０．０６４６、０．０８０１、０．１０５６及び０．１４８１ｍｉｎが得られている。図３３（Ｂ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４１．８、４５．８、４２．６、４１．１、３４．１、２６．６、１８．６及び１０．９％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0454】

また、図３４（Ｂ）では、ピークＮｏ．１のＵが溶出した後に圧力が８．３ＭＰａで安定していたように見えたため、図３３（Ｂ）と図３４（Ｂ）の各ピークの保持時間の差を比較したところ、図３３（Ｂ）ではピークＮｏ．１と２の差が０．１７９ｍｉｎ、ピークＮｏ．２と３の差が０．２６７ｍｉｎ、ピークＮｏ．３と４の差が０．２６３ｍｉｎ、ピークＮｏ．４と５の差が０．３２７ｍｉｎであり、図３４（Ｂ）ではピークＮｏ．１と２の差が０．１８７ｍｉｎ、ピークＮｏ．２と３の差が０．２７０ｍｉｎ、ピークＮｏ．３と４の差が０．２６２ｍｉｎ、ピークＮｏ．４と５の差が０．３２５ｍｉｎであった。ピークＮｏ．１と２の差、ピークＮｏ．２と３の差がいずれも、図３３（Ｂ）よりも図３４（Ｂ）の方が大きいことから、図３４（Ｂ）ではピークＮｏ．１のＵとピークＮｏ．２のＡｃＡｎが溶出した後で圧力が８．３ＭＰａで安定したと思われる。

【0455】

図３４（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２３８、０．０２０７、０．０１９９、０．０２１２、０．０２３７、０．０２５１、０．０２８１、０．０３５５、０．０４７２及び０．０６６５ｍｉｎが得られている。図３３（Ｃ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１８．２、２２．２、２１．７、２０．０、１７．７、１７．４、１３．３、９．９、６．７及び３．９％減少しており、溶質バンドの分散も減少していることがわかる。また、図３４（Ｃ）では、ピークＮｏ．１のＵとピークＮｏ．２のＡｃＡｎとピークＮｏ．３のＡｃＰｈが溶出した後で圧力が１６．７ＭＰａで安定したと思われる。

【0456】

試料注入から流速０．００５もしくは０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬあるいは１０．０μＬ送液し、その後流速を０．０２、０．０５、０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図３４（Ａ）、図３４（Ｂ）及び図３４（Ｃ））では、いずれも比較例（図３３（Ａ）、図３３（Ｂ）及び図３３（Ｃ））に比べて、溶質ピークの半値幅が減少した。また、使用したカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）の場合、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速（０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）と分析に適した流速の差が０．０１５ｍＬ／ｍｉｎの場合では、１回だけ流速を変化させる単純な流速プログラムに従う圧力の変化が迅速に起こり、比較例に比べて各ピークの保持時間の差には影響しないことを確認した。また、使用したカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）の場合、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）と分析に適した流速の差が０．０４０ｍＬ／ｍｉｎ、０．０９０ｍＬ／ｍｉｎの場合では、１回だけ流速を変化させる単純な流速プログラムに従う圧力の変化が迅速に起こらなかったことを確認した。

【0457】

試料バンドの分散を小さく保つことが出来る流速（第一流速）から分析に適した流速（第二流速）へ１回だけ変化させる単純な流速プログラムに従う圧力の変化が迅速に起こらない理由としては、２種の流速に伴う圧力の差や、充填剤種、送液ポンプからカラム充填層前までの流路の容量と流速との比の大きさ等が考えられるが、例えば実施例１１で示した図２１（Ｃ）や実施例１５で示した図２５（Ｃ）のように、流速の変化を２回行う（分析に適した流速に伴う圧力での安定化を早めるために、１回分析に適した流速（第二流速）よりも大きな流速（第三流速）に変化させ、その後分析に適した流速（第二流速）に変化させる）流速プログラムにより、圧力の変化を迅速に起こすことが出来る。

【0458】

試料注入後０．００５ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液してから流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．０２ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。又、試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで１０μＬ送液してから流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。又、試料注入後０．０１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液してから流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに上げて分析する流速プログラムにより、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0459】

実施例２から実施例２０において検討した、試料注入用流路切り替えバルブ出口とカラム入口を接続した配管とカラム内径を変更した組み合わせでは、いずれもカラム性能を発揮しやすい一定の流速で、試料注入装置と分離カラムとの間の流路内への試料注入から分離カラムを経て分析までを行う従来の方法に比べて、試料注入用流路切り替えバルブからカラム充填剤層前まであるいはカラム充填層まで試料バンドを、分析に適した流速よりも試料バンドの分散の増加を抑えられる流速で移動させ、続いて流速を分析に適した値に変化させる流速プログラムにより、高いカラム性能が得られることを確認した。

【0460】

又、図３４（Ａ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．０２ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．４５−０．７０＝０．７５ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（０．８ＭＰａ）と０．０２ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（３．３ＭＰａ）の差は２．５ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．０２ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、２．５／０．７５＝３．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0461】

又、図３４（Ｂ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．０５ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．８５−１．００＝０．８５ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（１．６ＭＰａ）と０．０５ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（８．３ＭＰａ）の差は６．７ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．０５ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、６．７／０．８５＝７．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0462】

又、図３４（Ｃ）において、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は１．２２−０．３５＝０．８７ｍｉｎであり、０．０１ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（１．６ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１６．７ＭＰａ）の差は１５．１ＭＰａであることから、０．０１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１５．１／０．８７＝１７．４ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例21】

【0463】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、送液ポンプ２台と、試料注入装置、ループを備えたミクロ６方流路切り替えバルブとこれらを制御する導入制御装置を組み合わせた試料導入装置（図４１）を用いた。従来の試料注入法（図３５（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図３５（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0464】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用した。図３５（Ａ）（比較例）の際は、図４１（Ａ）で、試料注入装置４が備える試料注入用流路切り替えバルブとは別個の流路切り替えバルブ、具体的にはミクロ６方流路切り替えバルブ８（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ）のポートａに接続している内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）とカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）と検出器出口までの接続管を、ポートｄに付け変えて測定した。図３５（Ｂ）（本発明の実施例）の際は、図４１（Ａ）に示すように、ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５１と試料注入装置に含まれる試料注入用流路切り替えバルブを流路接続し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、更に５μＬループ（内径０．２ｍｍ、長さ１５．９ｃｍ）を備えたミクロ６方流路切り替えバルブ８（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のポートｅを接続した。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートａに内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、更にカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）と検出器出口までの接続管を接続した。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５２とＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｂは外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍのステンレススチール管で接続した。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0465】

図３５（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は送液ポンプ５１から流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0466】

図３５（Ｂ）では、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に送液ポンプ５１の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、送液ポンプ５２の流速は０．０５ｍＬ／ｍｉｎとした。注入の１．３０分後（注入から６．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：６．５μＬと記載）にミクロ６方切り替えバルブを図４１（Ｃ）のポジションに切り替え、試料をカラムに流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで導入した。注入の８．００分後からミクロ６方切り替えバルブを図４１（Ａ）のポジションに切り替えることにより連続での測定に備えている。送液ポンプ５２の出口で圧力を測定しているので、クロマトグラムの下に表示した圧力トレースは８．２ＭＰａで一定となっている。

【0467】

図３５（Ｂ）で注入の１．３０分後にミクロ６方流路切り替えバルブを図４１（Ｃ）のポジションに切り替えた際、圧力トレースの低下が見られないことから、第一流速（送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）から第二流速（送液ポンプ５２の流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎ）への速やかな変更を伴う本発明の実施が行われている。

【0468】

図３５（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．１０５０、０．０９８７、０．０８８１、０．０９１１、０．１０００、０．１１１１、０．１２９０及び０．１６４５ｍｉｎが得られている。ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈについては、データ解析用のソフトウェア（ＥＺＣｈｒｏｍ Ｅｌｉｔｅ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）の自動計算で半値幅を認識しなかった。

【0469】

これに対して図３５（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０８８４、０．０８１７、０．０７４３、０．０７６８、０．０８６６、０．０９３８、０．０８６５、０．０９８３、０．１１８５及び０．１５４１ｍｉｎが得られている。図３５（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１５．８、１７．２、１５．７、１５．７、１３．５、１１．５、８．１及び６．３％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【実施例22】

【0470】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、送液ポンプ２台と、試料注入装置、抵抗管と抵抗用カラムを備えたミクロ６方流路切り替えバルブとこれらを制御する導入制御装置を組み合わせた試料導入装置（図４２）を用いた。従来の試料注入法（図３６（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図３６（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0471】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用した。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５１とミクロ６方流路切り替えバルブ８（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のポートａを流路接続し、Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｂと試料注入装置に含まれる試料注入用流路切り替えバルブを流路接続した。試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、更に分離カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）と分離カラム出口から検出器出口までの接続管（検出器セルを含む）を接続した。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５２とＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｃを流路接続し、Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｄには抵抗用カラムと、分離カラム出口から検出器出口までの接続管と同等の圧力がかけられる抵抗（カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）と、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０３ｍｍ、長さ１２ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管）を接続した。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｅとｆは互いに流路接続した。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0472】

図３６（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は図４２（Ａ）の流路で送液ポンプ５１から流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0473】

図３６（Ｂ）では、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に図４２（Ａ）の流路で送液ポンプ５１の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、送液ポンプ５２の流速は０．１ｍＬ／ｍｉｎとした。注入の０．７０分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）にミクロ６方切り替えバルブを図４２（Ｃ）のポジションに切り替え、試料をカラムに流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで導入し分離を始めた。注入の４．００分後からＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポジションを切り替えて図４２（Ａ）の流路とし、カラムへ送液する流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとすることで連続での測定に備えている。送液ポンプ５２の出口で圧力を測っているため、クロマトグラムの下に表示した圧力トレースは１７．０ＭＰａで一定となっている。

【0474】

図３６（Ｂ）で注入の０．７０分後にミクロ６方流路切り替えバルブを図４２（Ｃ）のポジションに切り替えた際、圧力トレースの低下が見られないことから、第一流速（送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）から第二流速（送液ポンプ５２の流速０．１ｍＬ／ｍｉｎ）への速やかな変更を伴う本発明の実施が行われている。

【0475】

図３６（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０３０８、０．０２８０、０．０２６４、０．０２７６、０．０３０２、０．０３１８、０．０３３９、０．０４０４、０．０５０９及び０．０６９２ｍｉｎが得られている。

【0476】

これに対して図３６（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１８８、０．０１７４、０．０１７９、０．０１９８、０．０２２９、０．０２４２、０．０２７５、０．０３５３、０．０４７６及び０．０６６９ｍｉｎが得られている。図３６（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３９．０、３７．９、３２．２、２８．３、２４．２、２３．９、１８．９、１２．６、６．５及び３．３％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【実施例23】

【0477】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、送液ポンプ２台と、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブとこれらを制御する導入制御装置を組み合わせた試料導入装置（図４３）を用いた。本実施例では、図４３中の試料バンド分割装置（図４４（Ａ）に構造を示す）は接続しているが試料バンドの分割には使用せず、試料バンド分割は行わなかった。従来の試料注入法（図３７（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図３７（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0478】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用した。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５１とミクロ６方流路切り替えバルブ８（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のポートｂを流路接続し、Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートａと試料注入装置に含まれる試料注入用流路切り替えバルブを流路接続した。試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、更に試料バンド分割装置を接続し、分離カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）とカラム出口から検出器出口までの接続管（検出器セルを含む）を接続した。流路を切り替えて試料バンドの分割を行うことが出来る試料バンド分割装置７７は、図４４（Ａ）に示す構造であり、Ｔ字コネクターＵ−４２８（内径０．５ｍｍ、ＩＤＥＸ社）を使用し、二重管は、第１送液ポート６４送液用の内管に外径０．２３６ｍｍ、内径０．１０８ｍｍ、長さ１０ｃｍのステンレススチール管（容量約０．９２μＬ）、及び、第２送液ポート６５送液用の外管に外径１．６ｍｍ、内径０．５ｍｍ、長さ５ｃｍのステンレススチール管で構成した。送液ポンプ５２とＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｆを流路接続し、Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｃと試料バンド分割装置の第２送液ポートを流路接続した（外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍのステンレススチール管を使用）。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｄとｅは互いに流路接続した。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0479】

図３７（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．７μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は図４３（Ａ）の流路で送液ポンプ５１から流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0480】

図３７（Ｂ）では、試料ＩＩを０．７μＬ注入する前に図４３（Ａ）の流路で送液ポンプ５１の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、送液ポンプ５２の流速は０．０９５ｍＬ／ｍｉｎとした。注入の０．４０分後（注入から２．０μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：２μＬと記載）にミクロ６方切り替えバルブを図４３（Ｃ）のポジションに切り替え、更に注入の０．５０分後に送液ポンプ５１の流速を０ｍＬ／ｍｉｎに、送液ポンプ５２の流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎに変更して試料をカラムに導入した。注入の５．００分後からＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポジションを切り替えて図４３（Ａ）の流路とし、送液ポンプ５１の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎに、送液ポンプ５２の流速を０．０９５ｍＬ／ｍｉｎに変更することで連続での測定に備えている。カラムには常に０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液され、送液ポンプ５２の出口で圧力を測っているので、クロマトグラムの下に表示した圧力トレースは２０．８ＭＰａで一定となっている。

【0481】

図３７（Ｂ）で注入の０．４０分後にミクロ６方流路切り替えバルブを図４３（Ｃ）のポジションに切り替えた際、圧力トレースの低下が見られないことから、第一流速（送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）から第二流速（送液ポンプ５２の流速０．１ｍＬ／ｍｉｎ）への速やかな変更を伴う本発明の実施が行われている。

【0482】

図３７（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９８、０．０２５９、０．０２４２、０．０２５４、０．０２７５、０．０２９１、０．０３１１、０．０３７９、０．０４９３及び０．０６６８ｍｉｎが得られている。

【0483】

これに対して図３７（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２４４、０．０２１０、０．０２０２、０．０２１３、０．０２３６、０．０２５１、０．０２７５、０．０３４６、０．０４５６及び０．０６３８ｍｉｎが得られている。図３７（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１８．１、１８．９、１６．５、１６．１、１４．２、１３．７、１１．６、８．７、７．５及び４．５％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【実施例24】

【0484】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、送液ポンプ１台と、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブとこれらを制御する導入制御装置を組み合わせた試料導入装置（図４５）を用いた。本実施例では、図４６に示すように、試料バンドの分割も行った。従来の試料注入法（図３８（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図３８（Ｂ））、本発明の試料導入方法に試料分割を伴う試料導入方法を組み合わせた方法（図３８（Ｃ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0485】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用した。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５５と試料注入装置に含まれる試料注入用流路切り替えバルブを流路接続（流路途中にＴ字コネクターを接続）し、更に試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、ミクロ６方流路切り替えバルブ８（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のポートｂに接続した。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートａに内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、更にカラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）とカラム出口から検出器出口までの接続管（検出器セルを含む）を接続した。又、送液ポンプ５５と試料注入用流路切り替えバルブをつないだ流路の間のＴ字コネクターとＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｆを外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍのステンレススチール管を使用して接続した。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｃとｅにはプラグを取り付けた。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0486】

図３８（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．４μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は図４５（Ａ）の流路で送液ポンプ５５から流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0487】

図３８（Ｂ）では、試料ＩＩを０．４μＬ注入する前に図４５（Ａ）の流路で送液ポンプ５５の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．４０分後（注入から２μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：２μＬと記載）にミクロ６方切り替えバルブを図４５（Ｃ）のポジションに切り替え、更に注入の０．４５分後から０．２１分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．６６分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．００分後にミクロ６方切り替えバルブを図４５（Ｄ）のポジションに切り替え、ミクロ６方切り替えバルブ内に一時的に留め置かれた試料の一部分をカラムに導入し、分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとすることで連続での測定に備えている。

【0488】

図３８（Ｂ）で注入の１．００分後にミクロ６方流路切り替えバルブを図４５（Ｄ）のポジションに切り替えた際、圧力トレースの低下が見られないことから、第一流速（０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）から第二流速（０．１ｍＬ／ｍｉｎ）への変更による送液ポンプ５５と分離カラム２の平衡化を行った後に、試料バンドの第二流速での分離カラム２への導入と分離が行われている。

【0489】

図３８（Ｃ）では、試料ＩＩを０．４μＬ注入する前に図４６（Ａ）の流路で送液ポンプ５５の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．５２分後にミクロ６方切り替えバルブを図４６（Ｃ）のポジションに切り替え（注入から２．６μＬ送液後、クロマトグラムの左下に（１）：２．６μＬと記載）、同時に流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、０．２６分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．７８分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとすることで、分割された試料バンドの前部分の分離を行ったクロマトグラムである（図３８（Ｃ）の第１クロマトグラム）。更に注入の４．００分後にミクロ６方切り替えバルブを図４６（Ｄ）のポジションに切り替え、ミクロ６方切り替えバルブ内に一時的に留め置かれた試料の後部分をカラムに導入し、分離を行ったクロマトグラムである（図３８（Ｃ）の第２クロマトグラム）。注入の７．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとすることで連続での測定に備えている。注入の０．５２分後にミクロ６方切り替えバルブが図４６（Ｃ）のポジションに切り替わった時に試料の分割が行われている（クロマトグラムの左下（２）：試料分割ありと記載）。

【0490】

図３８（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９８、０．０２７４、０．０２５７、０．０２７６、０．０３０４、０．０３１９、０．０３３５、０．０４０５、０．０５０２及び０．０６６６ｍｉｎが得られている。

【0491】

これに対して図３８（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２３２、０．０２２９、０．０２２０、０．０２３６、０．０２４３、０．０２７５、０．０３０１、０．０３８０、０．０４８３及び０．０６５７ｍｉｎが得られている。図３８（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、２２．１、１６．４、１４．４、１４．５、２０．１、１３．８、１０．１、６．２、３．８及び１．４％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0492】

図３８（Ｃ）の第１クロマトグラムでは、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１５４、０．０１５９、０．０１５３、０．０１８２、０．０２１８、０．０２３６、０．０２５６、０．０３４６、０．０４７５及び０．０６４２ｍｉｎが得られている。図３８（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、４８．３、４２．０、４０．５、３３．７、２８．３、２６．０、２３．３、１８．０、１１．０及び４．２％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0493】

図３８（Ｃ）の第２クロマトグラムでは、クロマトグラムの右上の表には記載していないが、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０５、０．０１９５、０．０２１４、０．０２３０、０．０２５０、０．０２６７、０．０２９５、０．０３７３、０．０４７３及び０．０６３６ｍｉｎが得られている。図３８（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３１．２、２８．８、１６．７、１６．７、１７．８、１６．３、１１．９、７．９、５．８及び４．５％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0494】

又、図３８（Ｂ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．７３−０．４０＝０．３３ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（１．０ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（２０．５ＭＰａ）の差は１９．５ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１９．５／０．３３＝５９．１ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0495】

又、図３８（Ｃ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８３−０．５２＝０．３１ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（１．０ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（２０．５ＭＰａ）の差は１９．５ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１９．５／０．３１＝６２．９ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例25】

【0496】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、送液ポンプ２台と、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブとこれらを制御する導入制御装置を組み合わせた試料導入装置（図４３）を用いた。本実施例では、図４３中の試料バンド分割装置７７（図４４（Ａ）に構造を示す）を使用して、試料バンドの分割を行った。従来の試料注入法（図３９（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法に試料分割を伴う試料導入方法を組み合わせた方法（図３９（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0497】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用した。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５１とミクロ６方流路切り替えバルブ８（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のポートｂを流路接続し、Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートａと試料注入装置に含まれる試料注入用流路切り替えバルブを流路接続した。試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、更に図４４（Ａ）に示す試料バンド分割装置７７を接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）とカラム出口から検出器出口までの接続管（検出器セルを含む）を接続した。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５２とＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｆを流路接続し、Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｃと試料バンド分割装置の第２送液ポートを流路接続した（外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍのステンレススチール管を使用）。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｄとｅは互いに流路接続した。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0498】

図３９（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを１．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は図４３（Ａ）の流路で送液ポンプ５１から流速０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0499】

図３９（Ｂ）では、試料ＩＩを１．５μＬ注入する前に図４３（Ａ）の流路で送液ポンプ５１の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、送液ポンプ５２の流速は０．１９５ｍＬ／ｍｉｎとした。注入の０．２０分後（注入から１．０μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：１μＬと記載）にミクロ６方切り替えバルブを図４３（Ｃ）のポジションに切り替え、送液ポンプ５１の流速を０ｍＬ／ｍｉｎとし、送液ポンプ５２の流速は０．２ｍＬ／ｍｉｎとした。更に注入の０．２１分後にミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて図４３（Ａ）の流路とし、試料バンドの分割と前部分のカラムへの導入を行った（第１クロマトグラム）。注入の４．００分後にミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて図４３（Ｃ）の流路とし、試料バンド分割装置の手前の流路に留められていた試料バンドの後部分のカラムへの導入を行った（第２クロマトグラム）。注入の８．００分後にミクロ６方流路切り替えバルブ８のポジションを切り替えて図４３（Ａ）の流路とし、送液ポンプ５１の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎに、送液ポンプ５２の流速を０．１９５ｍＬ／ｍｉｎに変更することで連続での測定に備えている。カラムには常に０．２ｍＬ／ｍｉｎで送液され、送液ポンプ５２の出口で圧力を測っているので、クロマトグラムの下に表示した圧力トレースは８．０ＭＰａでほぼ一定となっている。

【0500】

図３９（Ｂ）で注入の０．２０分後にミクロ６方流路切り替えバルブを図４３（Ｃ）のポジションに切り替えた際、圧力トレースの低下が見られないことから、第一流速（送液ポンプ５１の流速０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）から第二流速（送液ポンプ５２の流速０．２ｍＬ／ｍｉｎ）への速やかな変更を伴う本発明の実施が行われている。

【0501】

図３９（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２６１、０．０１６１、０．０１９９、０．０１９８、０．０２１９、０．０２３９、０．０２８７、０．０３８３、０．０５０９及び０．０７４３ｍｉｎが得られている。

【0502】

これに対して図３９（Ｂ）第１クロマトグラムでは、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１８０、０．０１４３、０．０１５５、０．０１８３、０．０２０２、０．０２２３、０．０２６６、０．０３５９、０．０４９０及び０．０７２１ｍｉｎが得られている。図３９（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３１．０、１１．２、２２．１、７．６、７．８、６．７、７．３、６．３、３．７及び３．０％減少しており、溶質バンドの分散も減少していることがわかる。

【実施例26】

【0503】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、送液ポンプ１台と、試料注入装置、ミクロ６方流路切り替えバルブとこれらを制御する導入制御装置を組み合わせた試料導入装置（図４５）を用いた。本実施例では、図４６に示すような、試料バンドの分割は行わなかった。従来の試料注入法（図４０（Ａ））（比較例）と本発明の試料導入方法（図４０（Ｂ））におけるカラム性能の比較を行った。

【0504】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用した。ＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００の送液ポンプ５５と試料注入装置に含まれる試料注入用流路切り替えバルブを流路接続（流路途中にＴ字コネクターを接続）し、更に試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、ミクロ６方流路切り替えバルブ８（Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブ、Ｖａｌｃｏ社）のポートｂに接続した。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートａに内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、更にカラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）とカラム出口から検出器出口までの接続管（検出器セルを含む）を接続した。また、送液ポンプ５５と試料注入用流路切り替えバルブをつないだ流路の間のＴ字コネクターとＣ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｆを外径１．６ｍｍ、内径０．１ｍｍのステンレススチール管を使用して接続した。Ｃ７２Ｘ−１６９６ＥＨバルブのポートｃとｅにはプラグを取り付けた。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．４ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0505】

図４０（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを１μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は図４５（Ａ）の流路で送液ポンプ５５から流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0506】

図４０（Ｂ）では、試料ＩＩを１μＬ注入する前に図４５（Ａ）の流路で送液ポンプ５５の流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、試料を注入後ミクロ６方流路切り替えバルブ８内の流路まで移動させ（図４５（Ｂ））、注入の０．４０分後（注入から２μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：２μＬと記載）にミクロ６方切り替えバルブ８を図４５（Ｃ）のポジションに切り替え、試料をミクロ６方流路切り替えバルブ８内に一時的に留置する。更に注入の０．４５分後から流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の１．００分後にミクロ６方切り替えバルブを図４５（Ｄ）のポジションに切り替え、試料をカラムへ導入することで分離を行ったクロマトグラムである。注入の４．００分後から流速を０．００５ｍＬ／ｍｉｎとすることで連続での測定に備えている。

【0507】

図４０（Ｂ）で注入の１．００分後にミクロ６方流路切り替えバルブを図４５（Ｄ）のポジションに切り替えた際、圧力トレースの低下が見られないことから、第一流速（０．００５ｍＬ／ｍｉｎ）から第二流速（０．４ｍＬ／ｍｉｎ）への変更による送液ポンプ５５と分離カラム２の平衡化を行った後に、試料バンドの第二流速での分離カラム２への導入と分離が行われている。

【0508】

図４０（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１１８、０．０１０９、０．０１０９、０．０１２０、０．０１２７、０．０１３７、０．０１４３、０．０１７７、０．０２２７及び０．０３１０ｍｉｎが得られている。

【0509】

これに対して図４０（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１０５、０．００９１、０．００８９、０．００９９、０．０１２１、０．０１１５、０．０１３６、０．０１７０、０．０２１７及び０．０３０３ｍｉｎが得られている。図４０（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１１．８、１７．３、１８．３、１７．５、４．７、１６．１、１６．１、１２．４、１１．５及び２．３％減少しており、溶質バンドの分散も減少していることがわかる。又、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0510】

又、図４０（Ｂ）において、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．４ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．８３−０．４５＝０．３８ｍｉｎであり、０．００５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（０．１ＭＰａ）と０．４ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１３．１ＭＰａ）の差は１３．０ＭＰａであることから、０．００５ｍＬ／ｍｉｎから０．４ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１３．０／０．３８＝３４．２ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【実施例27】

【0511】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、本発明の試料導入方法を実施する前に、本発明の試料導入方法の効果を予測する方法を行った。従来の試料注入法で測定したクロマトグラム（図２５（Ａ））（比較例）と、カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ）をつないで従来の試料注入法で測定したクロマトグラム（図４７（Ｂ）及び図４７（Ｃ））から予測計算を行い、本発明の試料導入方法によって得られるカラム性能を予測し、本発明の試料導入方法（図２５（Ｃ））におけるカラム性能との比較を行った。

【0512】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口にカラム入口までの配管として内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）を接続し、カラムに代えてＺＤＵ（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．０１、０．１ｍＬ／ｍｉｎの２種の流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。ＺＤＵ出口から検出器出口までの接続管については、ＺＤＵ出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料Ｉ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0513】

図４７（Ｂ）は、従来の試料注入法を用いて、試料Ｉを０．５μＬ注入し、溶出を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0514】

図４７（Ｃ）は、従来の試料注入法を用いて、試料Ｉを０．５μＬ注入し、溶出を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0515】

図４７（Ｂ）では、ピークの溶出容量は１０×０．３２２＝３．２２μＬで、溶質バンドの分散σ（ｅｘｔｒａ−１）^２はモーメント法（二次中心モーメント）により計算し、０．２２μＬ^２であった。

【0516】

図４７（Ｃ）では、ピークの溶出容量は１００×０．０３８＝３．８μＬで、溶質バンドの分散σ（ｅｘｔｒａ−２）^２はモーメント法（二次中心モーメント）により計算し、０．９２μＬ^２であった。

【0517】

図２５（Ａ）（比較例）から、保持時間が最も大きいピーク（ピークＮｏ．１０）の保持係数ｋを以下のように計算した。保持係数ｋに対するカラム外体積の影響を除くため、図４７（Ｂ）と図４７（Ｃ）から計算されたピークの溶出容量の平均（３．５１μＬ）から、ＺＤＵの容量（０．０２μＬ）を差し引いた容量（３．４９μＬ）を差し引いて算出した。ｋ＝｛（１００×２．７７４−３．４９）−（１００×０．２３９−３．４９）｝／（１００×０．２３９−３．４９）＝１２．４２である。

【0518】

図２５（Ａ）（比較例）から、保持時間が最も大きいピークの分散σ（Ｎ）^２を以下のように計算した。σ（Ｎ）^２＝（１００×０．０６９２／２．３５）^２＝８．６７μＬ^２である。

【0519】

図２５（Ａ）（比較例）から、保持時間が最も大きいピークの理論段数Ｎ（Ｎ）を、式４に従い以下のように計算した。Ｎ（Ｎ）＝（２．７７４−０．０３４９）^２／（０．０６９２／２．３５）^２＝８６５２である。

【0520】

（式４） N =(t_R−t_(extra)）²/σ_total-t² =(V_R−V_(extra)）²/σ_total-v²

【0521】

式６に従い、カラム内移動相体積Ｖｍは、親水性が非常に高く、カラムに保持されないウラシル（Ｕ）の溶出体積から、カラム外体積３．４９μＬを差し引いて求められる。Ｖｍ＝１００×０．２３９−３．４９＝２０．４１μＬである。

【0522】

（式６） Vm =F.R.×t_R(U)−V_(extra)

【0523】

式７に従い、ｋ＝１２．４２でカラムが与える真の分散値σ（ｃｏｌ）^２を以下のように計算した。σ（ｃｏｌ）^２＝８．６７−０．９２＝７．７５μＬ^２である。

【0524】

（式７） σ_(col)² =σ_(N)²−σ_(extra-2)²

【0525】

式４に従い、ｋ＝１２．４２でカラムが与える真の理論段数Ｎ（ｃｏｌ）を以下のように計算した。Ｎ（ｃｏｌ）＝（（２．７７４−０．０３４９）×１００）^２／７．７５＝９６７９である。

【0526】

カラムの真の理論段数がｋ値によらず一定であると仮定して、各保持係数（ｋ＝１〜１２）での真の分散値を式８に従い計算した。例えばσ（ｃｏｌ）^２（ｋ＝１２）＝（２０．４１×（１＋１２））＾２／９６７９＝７．２７μＬ^２である。

【0527】

（式８） σ_(col)² = (Vm(1+k))²/N_(col)

【0528】

式９に従い、ｋ＝１〜１２で、図２５（Ａ）と同条件で得られる分散値σ（ｔｏｔａｌ）^２を計算した。例えばσ（ｔｏｔａｌ）^２（ｋ＝１２）＝７．２７＋０．９２＝８．１９μＬ^２である。

【0529】

（式９） σ_(total)² =σ_(col)² +σ_(extra-2)²

【0530】

式１０に従い、ｋ＝１〜１２で、図２５（Ａ）と同条件で得られる理論段数Ｎ（ｔｏｔａｌ）を計算した。例えばＮ（ｔｏｔａｌ）（ｋ＝１２）＝（２０．４１×（１＋１２））^２／８．１９＝８５９２である。

【0531】

（式１０） N_(total) = (Vm(1+k))²/σ_(total)²

【0532】

式１１に従い、ｋ＝１〜１２で、本発明の試料導入方法で得られる分散値σ（ＳＱ）^２を計算した。例えばσ（ＳＱ）^２（ｋ＝１２）＝７．２７＋０．２２＝７．４９μＬ^２である。なお、この計算のために必要な各溶質バンドの保持時間としては、比較例である流速一定での従来の試料注入法にて得られるクロマトグラムの各溶質バンドの保持時間を使用している。

【0533】

（式１１） σ_(SQ)² =σ_(col)² +σ_(extra-1)²

【0534】

式１２に従い、ｋ＝１〜１２で、本発明の試料導入方法で得られる理論段数Ｎ（ＳＱ）を計算した。例えばＮ（ＳＱ）（ｋ＝１２）＝（２０．４１×（１＋１２））^２／７．４９＝９３９５である。なお、この計算のために必要な各溶質バンドの保持時間としては、比較例である流速一定での従来の試料注入法にて得られるクロマトグラムの各溶質バンドの保持時間を使用している。

【0535】

（式１２） N_(SQ) = (Vm(1+k))²/σ_(SQ)²

【0536】

図４７（Ａ）に、図２５（Ａ）（比較例）のクロマトグラムから式４により計算した各ピークの理論段数と、保持係数ｋとの関係をプロットした（図中で、比較例の実測と表記）。又、図２５（Ｃ）のクロマトグラムの各ピークの半値幅から分散を計算し、その保持時間として図２５（Ａ）の各ピークの保持時間を使用した上で各ピークの理論段数と、保持係数ｋとの関係をプロットした（図中で、本発明の実測と表記）。又上記の式１０にて計算した各溶質バンドの理論段数と、保持係数ｋ（１〜１２）との関係をプロットした（図中で、比較例の予測と表記）。又、上記の式１２にて計算した各溶質バンドの理論段数と、保持係数ｋ（１〜１２）との関係をプロットした（図中で、本発明の予測と表記）。

【0537】

本発明の予測に基づくプロットは、本発明の試料導入方法における流速の変化が、瞬時に流線の乱れ無く起こり、且つ流速の変化に応答する圧力の変化が、瞬時に圧力ショック無く起こる場合の理論的な数値を示すものと考えられる。

【0538】

図４７（Ａ）に示したように、本発明の試料導入方法により実際に得られた理論段数（図２５（Ｃ）の各ピークの保持時間として、比較例である図２５（Ａ）の各ピークの保持時間を使用して、図２５（Ａ）（比較例）からＮ（Ｎ）を計算した方法（式４）と同じ方法で計算した）は、ｋ＝１〜１２の範囲で、保持係数ｋに依存した予測計算値より約３〜３５％低いが、従来の試料注入法でカラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ）をつないで測定したデータから、本発明の試料導入方法で得られるカラム性能の予測がある程度可能であることを示していた。本発明の試料導入方法で得られるカラム性能の目安を確認出来れば、カラムを付けた状態で本発明の試料導入方法に必要なパラメータ（試料バンドの分散を抑えることが出来る流速をどの程度に設定するかや、試料バンドの分散を抑えることが出来る流速でカラム充填層前までどれくらいの送液容量とするか）を変化させて検討する前に、本発明の試料導入方法の効果を容易に予測できる。又、図４７（Ｂ）のようなデータから、試料バンドの分散を抑えることが出来る流速でカラム充填層前までどれくらいの送液容量とするかの設定が容易となる。試料注入用流路切り替えバルブ出口からカラム前までにつなぐ配管の容量はその寸法から計算することが出来るが、試料注入用流路切り替えバルブ内部を含む容量の算出は困難であり、カラムの代わりにＺＤＵをつないで測定することで得られるデータが有効である。

【0539】

図４７（Ｂ）ではピークの溶出容量は３．２２μＬなので、この値からＺＤＵの容量（０．０２μＬ）と、ＺＤＵ出口から検出器セルまでの容量（１．０８μＬ＋０．００６μＬ）を差し引くと２．１１４μＬとなり、試料注入装置からカラム入口前までの容量は２．１１４μＬと見積もることが出来る。試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速（０．０１ｍＬ／ｍｉｎ）で２．１１４μＬと同等の容量を送液し、その後流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより、図２５（Ａ）の比較例に比べて、図２６（Ｂ）に似たクロマトグラムを容易に取得出来ると思われる。カラム入口から充填層に至るまでの構造（一般的には図３に示すように、入口側エンドユニオン内流路、コーン（分散スペース）、フリットがあり、続いて充填層がある）とこれらの内部の容量はそれぞれのカラムによって異なるものと思われ、又、一般的には開示されていないから、これらの内部の容量も見積もって、試料バンドの分散を小さく保つことが出来る流速でどれくらいの送液容量とするかを決めることは困難であるが（図２５（Ａ）の比較例に比べて、図２５（Ｃ）に似たクロマトグラムをすぐ取得することは困難であるが）、本発明の試料導入方法による効果を図２６（Ｂ）に似たクロマトグラムから容易に確認出来るものと思われる。

【実施例28】

【0540】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行い、その後分析に適した流速にて分析を行うにあたり、本発明の試料導入方法を実施する前に、本発明の試料導入方法の効果を予測する方法を行った。従来の試料注入法で測定したクロマトグラム（図２１（Ａ））（比較例）と、カラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ）をつないで従来の試料注入法で測定したクロマトグラム（図４８（Ｂ）及び図４８（Ｃ））から予測計算を行い、本発明の試料導入方法によって得られるカラム性能を予測し、本発明の試料導入方法（図２１（Ｃ））におけるカラム性能との比較を行った。

【0541】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．２５４ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約７．７μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムに代えてＺＤＵ（Ｕ−４３５、内径０．２５ｍｍ、内部容量０．０２μＬ、ＩＤＥＸ社）を用いた。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．０１、０．０５ｍＬ／ｍｉｎの２種の流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。ＺＤＵ出口から検出器出口までの接続管については、ＺＤＵ出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、ＺＤＵ出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料Ｉ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0542】

図４８（Ｂ）は、従来の試料注入法を用いて、試料Ｉを０．５μＬ注入し、溶出を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．０１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0543】

図４８（Ｃ）は、従来の試料注入法を用いて、試料Ｉを０．５μＬ注入し、溶出を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．０５ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0544】

図４８（Ｂ）では、ピークの溶出容量は１０×０．９４５＝９．４５μＬで、溶質バンドの分散σ（ｅｘｔｒａ−１）^２はモーメント法（二次中心モーメント）により計算し、０．８０μＬ^２であった。

【0545】

図４８（Ｃ）では、ピークの溶出容量は５０×０．１８２＝９．１μＬで、溶質バンドの分散σ（ｅｘｔｒａ−２）^２はモーメント法（二次中心モーメント）により計算し、３．６４μＬ^２であった。

【0546】

図２１（Ａ）（比較例）から、保持時間が最も大きいピーク（ピークＮｏ．１０）の保持係数ｋを以下のように計算した。保持係数ｋに対するカラム外体積の影響を除くため、図４８（Ｂ）と図４８（Ｃ）から計算されたピークの溶出容量の平均（９．２７５μＬ）から、ＺＤＵの容量（０．０２μＬ）を差し引いた容量（９．２５５μＬ）を差し引いて算出した。ｋ＝｛（５０×５．５２８−９．２５５）−（５０×０．５９１−９．２５５）｝／（５０×０．５９１−９．２５５）＝１２．１６である。

【0547】

図２１（Ａ）（比較例）から、保持時間が最も大きいピークの分散σ（Ｎ）^２を以下のように計算した。σ（Ｎ）^２＝（５０×０．１６６３／２．３５）^２＝１２．５２μＬ^２である。

【0548】

図２１（Ａ）（比較例）から、保持時間が最も大きいピークの理論段数Ｎ（Ｎ）を、式４に従い以下のように計算した。Ｎ（Ｎ）＝（５．５２８−０．１８５１）^２／（０．１６６３／２．３５）^２＝５７００である。

【0549】

（式４） N =(t_R−t_(extra)）²/σ_total-t² =(V_R −V_(extra)）²/σ_total-v²

【0550】

式６に従い、カラム内移動相体積Ｖｍは、親水性が非常に高く、カラムに保持されないウラシル（Ｕ）の溶出体積から、カラム外体積９．２５５μＬを差し引いて求められる。Ｖｍ＝５０×０．５９１−９．２５５＝２０．３０μＬである。

【0551】

（式６） Vm =F.R.×t_R(U)−V_(extra)

【0552】

式７に従い、ｋ＝１２．１６でカラムが与える真の分散値σ（ｃｏｌ）^２を以下のように計算した。σ（ｃｏｌ）^２＝１２．５２−３．６４＝８．８８μＬ^２である。

【0553】

（式７） σ_(col)² =σ_(N)²−σ_(extra-2)²

【0554】

式４に従い、ｋ＝１２．１６でカラムが与える真の理論段数Ｎ（ｃｏｌ）を以下のように計算した。Ｎ（ｃｏｌ）＝（（５．５２８−０．１８５１）×５０）^２／８．８８＝８０３７である。

【0555】

カラムの真の理論段数がｋ値によらず一定であると仮定して、各保持係数（ｋ＝１〜１２）での真の分散値を式８に従い計算した。例えばσ（ｃｏｌ）＾２（ｋ＝１２）＝（２０．３０×（１＋１２））^２／８０３７＝８．６６μＬ^２である。

【0556】

（式８） σ_(col)² = (Vm(1+k))²/N_(col)

【0557】

式９に従い、ｋ＝１〜１２で、図２１（Ａ）と同条件で得られる分散値σ（ｔｏｔａｌ）^２を計算した。例えばσ（ｔｏｔａｌ）^２（ｋ＝１２）＝８．６６＋３．６４＝１２．３０μＬ^２である。

【0558】

（式９） σ_(total)² =σ_(col)² +σ_(extra-2)²

【0559】

式１０に従い、ｋ＝１〜１２で、図２１（Ａ）と同条件で得られる理論段数Ｎ（ｔｏｔａｌ）を計算した。例えばＮ（ｔｏｔａｌ）（ｋ＝１２）＝（２０．３０×（１＋１２））^２／１２．３０＝５６５８である。

【0560】

（式１０） N_(total) = (Vm(1+k))²/σ_(total)²

【0561】

式１１に従い、ｋ＝１〜１２で、本発明の試料導入方法で得られる分散値σ（ＳＱ）^２を計算した。例えばσ（ＳＱ）^２（ｋ＝１２）＝８．６６＋０．８０＝９．４６μＬ^２である。なお、この計算のために必要な各溶質バンドの保持時間としては、比較例である流速一定での従来の試料注入法にて得られるクロマトグラムの各溶質バンドの保持時間を使用している。

【0562】

（式１１） σ_(SQ)² =σ_(col)² +σ_(extra-1)²

【0563】

式１２に従い、ｋ＝１〜１２で、本発明の試料導入方法で得られる理論段数Ｎ（ＳＱ）を計算した。例えばＮ（ＳＱ）（ｋ＝１２）＝（２０．３０×（１＋１２））^２／９．４６＝７３５７である。なお、この計算のために必要な各溶質バンドの保持時間としては、比較例である流速一定での従来の試料注入法にて得られるクロマトグラムの各溶質バンドの保持時間を使用している。

【0564】

（式１２） N_(SQ) = (Vm(1+k))²/σ_(SQ)²

【0565】

図４８（Ａ）に、図２１（Ａ）（比較例）のクロマトグラムから式４により計算した各ピークの理論段数と、保持係数ｋとの関係をプロットした（図中で、比較例の実測と表記）。又、図２１（Ｃ）のクロマトグラムの各ピークの半値幅から分散を計算し、その保持時間として図２１（Ａ）の各ピークの保持時間を使用した上で各ピークの理論段数と、保持係数ｋとの関係をプロットした（図中で、本発明の実測と表記）。又、上記の式１０にて計算した各溶質バンドの理論段数と、保持係数ｋ（１〜１２）との関係をプロットした（図中で、比較例の予測と表記）。又、上記の式１２にて計算した各溶質バンドの理論段数と、保持係数ｋ（１〜１２）との関係をプロットした（図中で、本発明の予測と表記）。

【0566】

本発明の予測に基づくプロットは、本発明の試料導入方法における流速の変化が、瞬時に流線の乱れ無く起こり、且つ流速の変化に応答する圧力の変化が、瞬時に圧力ショック無く起こる場合の理論的な数値を示すものである。

【0567】

図４８（Ａ）に示したように、本発明の試料導入方法により実際に得られた理論段数（図２１（Ｃ）の各ピークの保持時間に、比較例である図２１（Ａ）の各ピークの保持時間を使用して、図２１（Ａ）（比較例）からＮ（Ｎ）を計算した方法（式４）と同じ方法で計算した）は、保持係数ｋに依存した予測計算値とほぼ同等であり、従来の試料注入法で測定したクロマトグラムと、従来の試料注入法でカラムの代わりにゼロデッドボリュームユニオン（ＺＤＵ）をつないで測定したデータから、本発明の試料導入方法で得られるカラム性能の予測が可能であった。

【0568】

図４７（Ａ）及び図４８（Ａ）に示すように、カラムに代えてＺＤＵを用いて第一流速と第二流速で測定されたカラム外バンド分散値の差に基づいて計算された予測値と比較して、相当する条件下での本発明の実施において得られたカラム理論段数が、ｋ＝１〜１２の範囲において、約３〜３５％小さい場合、あるいは、ほぼ同等の場合が見られた。

【実施例29】

【0569】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク幅に与える効果を確認した（図４９（Ｂ）及び図４９（Ｃ））。又、従来の試料注入法（図４９（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0570】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＫｉｎｅｔｅｘ Ｃ１８（充填剤径２．６μｍ、内径２．１ ｍｍ、長さ５ｃｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量１μＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器セル入り口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径１．６ｍｍ、内径０．１２７ｍｍ、長さ１５．２ｃｍのＰＥＥＫ管（容量約１．９３μＬ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約２．８１μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0571】

図４９（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを２μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．３ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0572】

図４９（Ｂ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．１８分後（注入から３．６μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．６μＬと記載）から０．０７分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．２５分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．５０分後から流速を０．０２ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0573】

図４９（Ｃ）は、試料ＩＩを２μＬ注入する前に流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の０．０７分後（注入から３．５μＬ送液後）から０．０７分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の０．１４分後から流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の３．００分後から流速を０．０５ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0574】

図４９（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２２１、０．０１８４、０．０１７７、０．０１８０、０．０１９２、０．０２０１、０．０２１１、０．０２４７、０．０３１０及び０．０４１４ｍｉｎが得られている。

【0575】

これに対して図４９（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１９９、０．０１５３、０．０１４９、０．０１５７、０．０１７１、０．０１７８、０．０１９２、０．０２３１、０．０２９６及び０．０４０６ｍｉｎが得られている。図４９（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、１０．０、１６．８、１５．８、１２．８、１０．９、１１．４、９．０、６．５、４．５及び１．９％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0576】

図４９（Ｃ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２０２、０．０１６１、０．０１５５、０．０１６３、０．０１７４、０．０１８３、０．０１９５、０．０２３４、０．０３００及び０．０４０７ｍｉｎが得られている。図４９（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、８．６、１２．５、１２．４、９．４、９．４、９．０、７．６、５．３、３．２及び１．７％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0577】

試料注入から流速０．０２ｍＬ及び０．０５ｍＬ／ｍｉｎで３．６μＬ及び３．５μＬ送液し、その後０．０７分間は流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．３ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラム（図４９（Ｂ）及び図４９（Ｃ））の中では、図４９（Ｂ）のクロマトグラムのピークの半値幅が最も小さくなった。

【0578】

又、図４９（Ｂ）において、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．２７−０．１８＝０．０９ｍｉｎであり、０．０５ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（０．５ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（７．５ＭＰａ）の差は７．０ＭＰａであることから、０．０５ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、７．０／０．０９＝７７．８ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0579】

又、図４９（Ｃ）において、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は０．１８−０．０７＝０．１１ｍｉｎであり、０．０２ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（１．２ＭＰａ）と０．３ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（７．５ＭＰａ）の差は６．３ＭＰａであることから、０．０２ｍＬ／ｍｉｎから０．３ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、６．３／０．１１＝５７．３ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0580】

又、実施例２〜２０までは、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとし、検出器セル容量を６ｎＬとした汎用ＵＨＰＬＣを使用して、本発明の試料導入方法の効果を確認したが、本実施例では、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約２．８１μＬとし、検出器セル容量を１μＬとした汎用ＵＨＰＬＣを使用して、本発明の試料導入方法の効果を確認した。

【実施例30】

【0581】

本発明の試料導入方法における、試料バンドの分散の増加を抑えることが出来る流速でのカラム充填層前まで、あるいはカラム充填層入口側境界を試料バンドが跨ぐまで、あるいはカラム充填層に試料バンド全体が入り終わる時までの試料バンドの移動を行うにあたり、第一流速がピーク幅に与える効果を確認した（図５１（Ｂ））。また、従来の試料注入法（図５１（Ａ））（比較例）との比較を行った。

【0582】

試料注入装置としてオートサンプラーに５μＬサンプルループ（内径０．２６５ｍｍ、長さ９．０ｃｍ）を接続した試料注入用流路切り替えバルブを備えたＵＨＰＬＣ装置ＬＣ８００（ジーエルサイエンス社）を使用し、試料注入用流路切り替えバルブ出口に内径０．１３ｍｍ、長さ１５ｃｍのステンレススチール管（容量約１．９９μＬ）をカラム入口までの配管として接続し、カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ Ｃ１８（充填剤径２μｍ、内径１．０ ｍｍ、長さ５ｃｍ、ジーエルサイエンス社）を用いて、移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）を０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、検出器セル容量６ｎＬ、検出波長２４０ｎｍのＵＶ検出器（ＭＵ７０１、ジーエルサイエンス社）を使用した。検出器のレスポンスは０．０１秒、データ取り込み間隔は５ｍＳｅｃとした。カラム出口から検出器出口までの接続管については、カラム出口に外径０．８ｍｍ、内径０．１３ｍｍ、長さ６．５ｃｍのステンレススチール管（容量約０．８６μＬ）を接続し、続いてＺＤＵを介して、外径０．３７５ｍｍ、内径０．０５ｍｍ、長さ２０ｃｍのフューズドシリカキャピラリー管（容量約０．３９μＬ、中央部に検出セル（窓）を持つ）を接続して使用した。即ち、カラム出口から検出器セル入り口までの接続管の容量は約１．０８μＬとした。試料には、試料ＩＩ：ウラシル（Ｕ、０．１ｍｇ／ｍＬ）、 アセトアニリド（ＡｃＡｎ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、アセトフェノン（ＡｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、プロピオフェノン（ＰｒＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ブチロフェノン（ＢｕＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ベンゾフェノン（ＢｅＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、バレロフェノン（ＶａＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘキサノフェノン（ＨｘＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、ヘプタノフェノン（ＨｐＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）、オクタノフェノン（ＯｃＰｈ、０．０５ｍｇ／ｍＬ）混合物のアセトニトリル／水＝６５／３５溶液を使用した。

【0583】

図５１（Ａ）（比較例）は、従来の試料注入法を用いて、試料ＩＩを０．５μＬ注入し、分離を行ったクロマトグラムである。移動相（アセトニトリル／水＝６５／３５）は流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで送液した。

【0584】

図５１（Ｂ）は、試料ＩＩを０．５μＬ注入する前に流速を０．００１ｍＬ／ｍｉｎとしておき、注入の３．５０分後（注入から３．５μＬ送液後、クロマトグラムの左上に（１）：３．５μＬと記載）から０．２３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、注入の３．７３分後から流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより分離を行ったクロマトグラムである。注入の７．００分後から流速を０．００１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより連続での測定に備えている。

【0585】

図５１（Ａ）（比較例）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０２９１、０．０２６６、０．０２５４、０．０２７０、０．０２９４、０．０３１３、０．０３３３、０．０４０９、０．０５３２及び０．０７２７ｍｉｎが得られている。

【0586】

これに対して図５１（Ｂ）では、Ｕ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、半値幅０．０１８４、０．０１７０、０．０１８３、０．０２０８、０．０２３９、０．０２５６、０．０２９２、０．０３７７、０．０５１０及び０．０７０８ｍｉｎが得られている。図５１（Ａ）の比較例に比べてＵ、ＡｃＡｎ、ＡｃＰｈ、ＰｒＰｈ、ＢｕＰｈ、ＢｅＰｈ、ＶａＰｈ、ＨｘＰｈ、ＨｐＰｈ及びＯｃＰｈについてそれぞれ、３６．８、３６．１、２８．０、２３．０、１８．７、１８．２、１２．３、７．８、４．１及び２．６％減少しており、溶質バンドの分散が減少していることがわかる。

【0587】

試料注入後、流速０．００１ｍＬ／ｍｉｎで３．５μＬ送液し、その後０．２３分間は流速を０．２ｍＬ／ｍｉｎとし、その後流速を０．１ｍＬ／ｍｉｎとする流速プログラムにより、流速０．１ｍＬ／ｍｉｎで試料注入から分析まで行う従来の方法に比べて高いカラム性能が得られることを確認した。

【0588】

又、図５１（Ｂ）において、０．００１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの流速の変化に要する時間は３．７７−３．５０＝０．２７ｍｉｎであり、０．００１ｍＬ／ｍｉｎでの圧力（０．１ＭＰａ）と０．１ｍＬ／ｍｉｎで安定した圧力（１７．１ＭＰａ）の差は１７．０ＭＰａであることから、０．００１ｍＬ／ｍｉｎから０．１ｍＬ／ｍｉｎへの変化の勾配は、１７．０／０．２７＝６３．０ＭＰａ／ｍｉｎであった。

【0589】

本発明の試料導入方法により、様々な内径の液体クロマトグラフィー用カラムにおいて、カラム外での溶質の分散を減ずることが出来、内径１．０ｍｍ、２．１ｍｍ、３．０ｍｍ、４．６ｍｍのカラムにおいて、カラム理論段数を増大させる効果が認められた。本発明により、ＵＨＰＬＣで必要とされる、細く短い、小さなカラムについて、特にクロマトグラム初期に溶出するピークについて、カラム性能を向上させることが可能となった。実施例で用いた送液ポンプや流路切り替えバルブ等の動作は、１／１００分単位で制御されているが、制御可能な時間間隔を例えば１／１０００分〜１／１００００分単位に短く出来れば、又、より設定流速への応答性の早い送液ポンプを使用出来れば、カラム性能を向上させるためにより好適な制御が出来ることは自明である。

【0590】

又、実施例で用いた送液ポンプの制御方法は、導入制御装置（制御用のコンピュータを含む）から、目的とする流速をタイムテーブルに表記した流速プログラムを送液ポンプに転送して制御する方法で行ったが、目的とする圧力をタイムテーブルに表記した圧力プログラムを導入制御装置から送液ポンプに転送して制御する方法でも、本発明を実施出来る。

【0591】

又、実施例で用いたカラムは、図３に示すように、カラム入口側のフリットで充填剤が漏れないように充填層を押さえている形態であるが、モノリスカラムのように充填剤が一体型になっており、フリットが無くとも充填剤がカラム管に固定化されているカラムでも、本発明を実施出来ることは自明である。

【0592】

又、本発明の試料導入方法は、実施例で用いた試料注入装置である、固定ループ注入方式のオートサンプラー（サンプルループを接続して固定した試料注入用流路切り替えバルブを含む）だけでなく、マニュアルインジェクター（サンプルループを接続して固定した試料注入用流路切り替えバルブを含む）は元より、試料注入用流路切り替えバルブのローターシールの溝の１つをサンプルループとして使用する内部ループ式インジェクター、ダイレクト注入方式もしくはダイレクトインジェクション方式のオートサンプラー（サンプル容器から試料を吸引するためのニードルを含む流路がサンプルループとしても使用され、試料注入用流路切り替えバルブを含む）や、試料送液用ポンプからの流路が試料注入用流路切り替えバルブや逆止弁を介して、移動相送液用ポンプとカラムをつないだ流路に接続されたオートサンプラー等、移動相送液用ポンプとカラムをつないだ流路に、試料注入用流路切り替えバルブや逆止弁を介して試料バンドを注入出来る試料注入装置を備えた液体クロマトグラフィーにて使用出来る。

【0593】

実施例で用いた試料注入装置の制御方法は、導入制御装置（制御用のコンピュータを含む）から、目的とする注入容量を表記したプログラムを試料注入装置に転送して制御する方法で行ったが、上記の様々な試料注入装置についても同様の制御が可能である。ただ、マニュアルインジェクターについては手動で動かすため、導入制御装置からの制御は必要無い。マニュアルインジェクターを使用する場合は、マニュアルインジェクターの試料注入用流路切り替えバルブのポジションが切り替わり、試料が流路に注入された時、インジェクションマーカーとしての信号がデータ処理装置と送液ポンプ（既に導入制御装置から流速プログラムや圧力プログラムを転送されている）に送られて、データ取り込みと送液ポンプの流速プログラムの実行が行われる。

【0594】

又、図１、図２及び図４１〜図４６には、本発明の実施に最低限必要な送液ポンプ及び移動相容器を示しているが、１台の送液ポンプと１つの移動相容器が接続された１つの流路に、複数台の送液ポンプと複数の移動相容器や、１つの流路に１台の送液ポンプと複数の移動相容器が接続された構成でもよい。尚、１種類の移動相を送液する送液ポンプ複数台を１つの流路につないで使用する高圧グラジエント方式の送液ポンプや、複数の移動相を送液する送液ポンプ１台を１つの流路につないで使用する低圧グラジエント方式の送液ポンプも本発明の実施に使用出来る。

【0595】

本発明の試料導入方法の原理（流速の制御により、式１におけるσ_extra²を減らすこと）は、種々の液体クロマトグラフィーだけでなく、超臨界流体クロマトグラフィーのような、他のクロマトグラフィーにも応用できる可能性がある。

【産業上の利用可能性】

【0596】

本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおいて、カラムの分離性能、即ち理論段数を向上させることが可能となったので、物質の分析、分取効率が向上し、様々な分野の研究並びに応用において利用が可能である。

【符号の説明】

【0597】

１ 液体クロマトグラフ
１０ 試料導入装置
１８ 導入制御装置
１００ 試料バンド
２ 分離カラム
２０ 分離カラム充填層
３ 試料注入用流路切り替えバルブ
３００ サンプルループ
４ 試料注入装置
５ 送液ポンプ
６ 配管
６３ カラム前配管
７ 試料バンド移動流路
８ ミクロ６方流路切り替えバルブ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44A】

【図44B】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】