【図1】オビヌツズマブ＋ミコフェノール酸モフェチル対プラセボ＋ミコフェノール酸モフェチルを調査するフェーズＩＩ研究のための研究デザインを示す。ＥＰ＝エンドポイント、ＭＭＦ＝ミコフェノール酸モフェチル

【図2A】ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中で、オビヌツズマブまたはリツキシマブにより誘発された全血液Ｂ細胞減損、内部移行、及び補体依存性細胞傷害性を示す。ＲＡ（ｎ＝３１）及びＳＬＥ（ｎ＝３４）を有する患者からの全血液試料を示す。試料を、２４時間、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ、ＲＴＸ、ＯＢＺ_Ｇｌｙ、及びＯＢＺを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーでＢ細胞死を分析した。値は、三連のウェルの平均である。ボックス内の横線は、中央値を表し、ボックスは、四分位数範囲を表し、ウィスカーは、範囲を表す。

【図2B】ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中で、オビヌツズマブまたはリツキシマブにより誘発された全血液Ｂ細胞減損、内部移行、及び補体依存性細胞傷害性を示す。表面の接触可能なｍＡｂの頻度を示す。抗ＦｃγＲＩＩ遮断ｍＡｂ、ＡＴ１０を用いた事前のインキュベーション行って、または行わずに、ＲＡ（ｎ＝５）及びＳＬＥ（ｎ＝８）を有する患者からの単離Ｂ細胞を用いた６時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーにより頻度を評価した。横線は、中央値を表す。

【図2C】ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中で、オビヌツズマブまたはリツキシマブにより誘発された全血液Ｂ細胞減損、内部移行、及び補体依存性細胞傷害性を示す。ＲＴＸ及びＯＢＺにより誘導されたＣＤＣを示す。単離Ｂ細胞（健康対照（ＨＣ）、ｎ＝２、ＲＡ、ｎ＝２、及びＳＬＥ、ｎ＝３）を、３０分間、健常血清（ＮＨＳ）または加熱不活性化血清（ＨＩＳ）と共に、ＲＴＸまたはＯＢＺでインキュベートし、その後、溶解ＣＤ１９＋Ａｖ＋ＰＩ＋Ｂ細胞の頻度を分析した。

【図2D】ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中で、オビヌツズマブまたはリツキシマブにより誘発された全血液Ｂ細胞減損、内部移行、及び補体依存性細胞傷害性を示す。ｍＡｂによるＣＤＣの効率性を表す、ＮＨＳ対ＨＩＳでインキュベートした試料中のＣＤ１９＋Ａｖ＋ＰＩ＋細胞における倍増率を示す。ＲＴＸ、リツキシマブ；ＯＢＺ、オビヌツズマブ；ＲＡ、リウマチ性関節炎；ＳＬＥ、全身性エリテマトーデス。ＨＣ、健康対照^＊ｐ＜０．０５；^＊＊、ｐ＜０．００５；^＊＊＊、ｐ＜０．０００１；及びｎｓ、有意差なし。

【図3A】ＮＫ細胞の脱顆粒化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示し、これは、ＣＤ１０７ａとＣＤ１６との間のＮＫ細胞発現の関係を記載する。全血液試料を、２４時間、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。前方及び側方散乱特性、ならびにＣＤ３の発現ではなくＣＤ５６の発現に基づいて、ＮＫ細胞を特定した。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の頻度は、活性化／脱顆粒化ＮＫ細胞を表した。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱。前方散乱対側方散乱のフローサイトメトリーゲーティングを示す。

【図3B】ＮＫ細胞の脱顆粒化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示し、これは、ＣＤ１０７ａとＣＤ１６との間のＮＫ細胞発現の関係を記載する。全血液試料を、２４時間、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。前方及び側方散乱特性、ならびにＣＤ３の発現ではなくＣＤ５６の発現に基づいて、ＮＫ細胞を特定した。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の頻度は、活性化／脱顆粒化ＮＫ細胞を表した。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱。ＣＤ５６対ＣＤ３のフローサイトメトリーゲーティングを示す。

【図3C】ＮＫ細胞の脱顆粒化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示し、これは、ＣＤ１０７ａとＣＤ１６との間のＮＫ細胞発現の関係を記載する。全血液試料を、２４時間、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。前方及び側方散乱特性、ならびにＣＤ３の発現ではなくＣＤ５６の発現に基づいて、ＮＫ細胞を特定した。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の頻度は、活性化／脱顆粒化ＮＫ細胞を表した。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱。前方散乱のフローサイトメトリーゲーティング対ＣＤ１０７ａを示す。

【図3D】ＮＫ細胞の脱顆粒化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示し、これは、ＣＤ１０７ａとＣＤ１６との間のＮＫ細胞発現の関係を記載する。全血液試料を、２４時間、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。前方及び側方散乱特性、ならびにＣＤ３の発現ではなくＣＤ５６の発現に基づいて、ＮＫ細胞を特定した。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の頻度は、活性化／脱顆粒化ＮＫ細胞を表した。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱。前方散乱のフローサイトメトリーゲーティング対ＣＤ１６を示す。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の３つの分集団を、ＣＤ１６の相対的発現（四角で囲まれた、高、中、及び低）に基づいて特定した。活性化ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の相対的頻度は、階層的な様式であるＣＤ１６＋＋＜ＣＤ１６＋＜ＣＤ１６−のＣＤ１６発現に基づいて、これらの３つの分集団で異なった。

【図3E】ＮＫ細胞の脱顆粒化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示し、これは、ＣＤ１０７ａとＣＤ１６との間のＮＫ細胞発現の関係を記載する。全血液試料を、２４時間、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。前方及び側方散乱特性、ならびにＣＤ３の発現ではなくＣＤ５６の発現に基づいて、ＮＫ細胞を特定した。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の頻度は、活性化／脱顆粒化ＮＫ細胞を表した。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱。高のボックスに関する前方散乱のフローサイトメトリーゲーティング対ＣＤ１０７ａを示す。

【図3F】ＮＫ細胞の脱顆粒化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示し、これは、ＣＤ１０７ａとＣＤ１６との間のＮＫ細胞発現の関係を記載する。全血液試料を、２４時間、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。前方及び側方散乱特性、ならびにＣＤ３の発現ではなくＣＤ５６の発現に基づいて、ＮＫ細胞を特定した。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の頻度は、活性化／脱顆粒化ＮＫ細胞を表した。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱。中のボックスに関する前方散乱のフローサイトメトリーゲーティング対ＣＤ１０７ａを示す。

【図3G】ＮＫ細胞の脱顆粒化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示し、これは、ＣＤ１０７ａとＣＤ１６との間のＮＫ細胞発現の関係を記載する。全血液試料を、２４時間、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートし、その後、フローサイトメトリーにより分析した。前方及び側方散乱特性、ならびにＣＤ３の発現ではなくＣＤ５６の発現に基づいて、ＮＫ細胞を特定した。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋細胞の頻度は、活性化／脱顆粒化ＮＫ細胞を表した。ＦＳＣ、前方散乱；ＳＳＣ、側方散乱。低のボックスに関する前方散乱のフローサイトメトリーゲーティング対ＣＤ１０７ａを示す。

【図4A】ＯＢＺが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞を活性化することにおいてＲＴＸより効率的であることを示す。ＮＫ細胞活性化を、ｍＡｂの存在下または不在下で２４時間インキュベートした、ＲＡ（ｎ＝１８）及びＳＬＥ（ｎ＝２３）を有する患者からの全血液試料中で評価した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし、及びｐが少なくとも＜０．０５のとき、スピアマン相関係数、ｒ^２を、有意差ありと見なした。総ＮＫ細胞またはＣＤ１９＋細胞のパーセンテージとして、リンパ球ゲートにおけるＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞、及びＣＤ３−ＣＤ５６−ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の頻度を示す。横線は、中央値を表す。

【図4B】ＯＢＺが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞を活性化することにおいてＲＴＸより効率的であることを示す。ＮＫ細胞活性化を、ｍＡｂの存在下または不在下で２４時間インキュベートした、ＲＡ（ｎ＝１８）及びＳＬＥ（ｎ＝２３）を有する患者からの全血液試料中で評価した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし、及びｐが少なくとも＜０．０５のとき、スピアマン相関係数、ｒ^２を、有意差ありと見なした。ＲＴＸ及びＯＢＺでインキュベートした、ＲＡ及びＳＬＥを有する患者からの試料中のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の頻度、及びＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の頻度、及びＣＤ３−ＣＤ５６＋１６＋ＮＫ細胞の頻度の倍増率を示す。横線は、中央値を表す。

【図4C】ＯＢＺが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞を活性化することにおいてＲＴＸより効率的であることを示す。ＮＫ細胞活性化を、ｍＡｂの存在下または不在下で２４時間インキュベートした、ＲＡ（ｎ＝１８）及びＳＬＥ（ｎ＝２３）を有する患者からの全血液試料中で評価した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし、及びｐが少なくとも＜０．０５のとき、スピアマン相関係数、ｒ^２を、有意差ありと見なした。ＲＡ（ｎ＝１８）を有する患者からの試料中でＲＴＸ及びＯＢＺを用いてインキュベートした試料中と、またはそれらを用いることなくインキュベートした試料中との間のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の頻度の関係を示す。

【図4D】ＯＢＺが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞を活性化することにおいてＲＴＸより効率的であることを示す。ＮＫ細胞活性化を、ｍＡｂの存在下または不在下で２４時間インキュベートした、ＲＡ（ｎ＝１８）及びＳＬＥ（ｎ＝２３）を有する患者からの全血液試料中で評価した。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし、及びｐが少なくとも＜０．０５のとき、スピアマン相関係数、ｒ^２を、有意差ありと見なした。ＳＬＥ（ｎ＝２３）を有する患者からの試料中でＲＴＸ及びＯＢＺを用いてインキュベートした試料中と、またはそれらを用いることなくインキュベートした試料中との間のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の頻度の関係を示す。

【図5A】オビヌツズマブが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を引き起こすことにおいてリツキシマブより効率的であることを示す。ＲＡ（ｎ＝１８）及びＳＬＥ（ｎ＝２３）を有する患者からの試料中の、ＲＴＸ、ＯＢＺ_Ｇｌｙ、及びＯＢＺによるＢ細胞減損パーセンテージを示す全血液Ｂ細胞減損アッセイを示す。ボックス及びウィスカーは、四分位数範囲及び範囲を表し、ボックス内の横線は、中央値を表す。

【図5B】オビヌツズマブが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を引き起こすことにおいてリツキシマブより効率的であることを示す。フローサイトメトリーにより分析した、ｍＡｂを用いたか、またはそれを用いなかった２４時間のインキュベーション後のＲＡ及びＳＬＥを有する患者からの全血液試料中のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の頻度を示す。

【図5C】オビヌツズマブが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を引き起こすことにおいてリツキシマブより効率的であることを示す。フローサイトメトリーにより分析した、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートした全血液試料中のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１０７ａ＋ＮＫ細胞の頻度の相対的増加を示す。

【図5D】オビヌツズマブが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中のＮＫ細胞媒介性細胞傷害性を引き起こすことにおいてリツキシマブより効率的であることを示す。フローサイトメトリーにより分析した、ｍＡｂを用いたか、またはそれを用いなかった２４時間のインキュベーション後のＲＡ（ｎ＝１８）及びＳＬＥ（ｎ＝２３）を有する患者からの全血液試料中のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＣＤ１６＋ＮＫ細胞の頻度を示す。棒グラフに関して、誤差棒は、中央値及び四分位数範囲を表す。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１；及びｎｓ、有意差なし。

【図6A】オビヌツズマブが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中の好中球を活性化することにおいてリツキシマブより効率的であることを示す。ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を用いて、またはそれを用いることなくインキュベートしたＲＡ（ｎ＝１０）及びＳＬＥ（ｎ＝２２）を有する患者からの全血液試料の２４時間のインキュベーション後のＣＤ１５＋好中球上のＣＤ１１ｂの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。中央値及び四分位数範囲は、誤差棒により表される。

【図6B】オビヌツズマブが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中の好中球を活性化することにおいてリツキシマブより効率的であることを示す。ＲＡ及びＳＬＥ試料中で、ｍＡｂを用いてインキュベートした試料中と、またはそれを用いることなくインキュベートした試料中との間のＣＤ１５＋好中球上のＣＤ１１ｂのＭＦＩの関係を示す。

【図6C】ＲＡ及びＳＬＥ試料中で、ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートした試料中のＣＤ１５＋好中球上のＣＤ６２ＬのＭＦＩを示す。

【図6D】オビヌツズマブが、ＲＡ及びＳＬＥ患者の試料中の好中球を活性化することにおいてリツキシマブより効率的であることを示す。ＲＡ（ｎ＝１０）及びＳＬＥ（ｎ＝２２）試料中で、ｍＡｂを用いてインキュベートした試料中と、またはそれを用いることなくインキュベートした試料中との間のＣＤ１５＋好中球上のＣＤ６２ＬのＭＦＩの関係を示す。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１。ｐが少なくとも＜０．０５のとき、スピアマン相関係数、ｒ^２を、有意差ありと見なした。

【図7A】ＲＡ及びＳＬＥ試料からのＣＤ２０及びＦｃγＲＩＩｂのＢ細胞分集団中の直接細胞死、内部移行、及び発現の評価を示す。ｍＡｂを用いて、またはそれを用いることなくインキュベートしたＲＡ（ｎ＝５）及びＳＬＥ（ｎ＝４）を有する患者からの試料中の、ＩｇＤ及びＣＤ２７：（ＩｇＤ＋ＣＤ２７−ナイーブ細胞、ＩｇＤ＋ＣＤ２７＋非スイッチ型記憶細胞、ＩｇＤ−ＣＤ２７＋スイッチ型記憶細胞、及びＩｇＤ−ＣＤ２７−二重陰性細胞）の相対的発現に基づいて、全てのＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＢ細胞分集団の割合として、アネキシンＶ＋細胞の頻度を示す。

【図7B】ＲＡ及びＳＬＥ試料からのＣＤ２０及びＦｃγＲＩＩｂのＢ細胞分集団中の直接細胞死、内部移行、及び発現の評価を示す。ＳＬＥ（ｎ＝９）を有する患者からの試料中の全てのＣＤ１９＋細胞及びＢ細胞分集団上のＣＤ２０の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。

【図7C】ＲＡ及びＳＬＥ試料からのＣＤ２０及びＦｃγＲＩＩｂのＢ細胞分集団中の直接細胞死、内部移行、及び発現の評価を示す。表面蛍光消光アッセイを示す。全てのＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＢ細胞分集団における、ＳＬＥ（ｎ＝９）を有する患者からの抗ＦｃγＲＩＩ ｍＡｂ、ＡＴ１０を用いた事前のインキュベーションを行って、または行わずに、単離Ｂ細胞を用いた６時間のインキュベーション後の表面の接触可能なｍＡｂの頻度。

【図7D】ＲＡ及びＳＬＥ試料からのＣＤ２０及びＦｃγＲＩＩｂのＢ細胞分集団中の直接細胞死、内部移行、及び発現の評価を示す。ＳＬＥ（ｎ＝９）を有する患者からの試料中の全てのＣＤ１９＋Ｂ細胞及びＢ細胞分集団上のＦｃγＲＩＩｂのＭＦＩを示す。棒グラフに関して、誤差棒は、中央値及び四分位数範囲を表す。ボックス及びウィスカーは、四分位数範囲を表し、ボックス内の横線は、中央値を表す。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１。

【図8】補体依存性細胞傷害性アッセイに関するゲーティング戦略、ならびにＲＴＸ及びＯＢＺによるＣＤＣを示す。単離Ｂ細胞を室温で３０分間、ＮＨＳまたはＨＩＳと共にｍＡｂでインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。Ａｎ Ｖ＋ＰＩ＋細胞の頻度は、細胞死を表した。ＨＩＳ、加熱不活性化血清；ＮＨＳ、健常血清；ＲＴＸ、リツキシマブ；ＯＢＺ、オビヌツズマブ；Ａｎ Ｖ、アネキシンＶ；及びＰＩ、ヨウ化プロピジウム。

【図9】好中球活性化を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。２４時間のインキュベーション後、全血液試料を、フローサイトメトリーにより分析した。好中球を、前方及び側方散乱、ならびにＣＤ１５の陽性により特定した。ＣＤ１１ｂ及びＣＤ６２Ｌの平均蛍光強度を、ＣＤ１５に対して陽性であるゲーティングされた好中球で分析した。

【図10】直接細胞死を評価するためのフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。ｍＡｂを用いたか、またはそれを用いなかった、３７℃及び５％のＣＯ_２で６時間のインキュベーション後、単離Ｂ細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞を、ナイーブ（ＩｇＤ＋ＣＤ２７−）、非スイッチ型記憶細胞（ＩｇＤ＋ＣＤ２７＋）、スイッチ型記憶細胞（ＩｇＤ−ＣＤ２７＋）、及び二重陰性細胞（ＩｇＤ−ＣＤ２７−）に分類した。アネキシンＶ＋細胞の頻度は、直接細胞死を表した。

【図11】Ｂ細胞分集団における自然細胞死に対する固有感受率を示す。１０％のウシ胎仔血を補ったＲＰＭＩ中で、３７℃及び５％のＣＯ_２で６時間インキュベートした単離Ｂ細胞をフローサイトメトリーにより分析した。アネキシンＶ＋細胞の頻度は、ナイーブ（ＩｇＤ＋ＣＤ２７−）、非スイッチ型記憶細胞（ＩｇＤ＋ＣＤ２７＋）、スイッチ型記憶細胞（ＩｇＤ−ＣＤ２７＋）、及び二重陰性細胞（ＩｇＤ−ＣＤ２７−）に分類したＣＤ１９＋細胞全体及びＢ細胞分集団における直接細胞死を表した。Ａｖ、アネキシンＶ；＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意差なし。