特許 6963577 抗シグレック−８抗体およびその使用の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6963577

(24)【登録日】2021年10月19日

(45)【発行日】2021年11月10日

(54)【発明の名称】抗シグレック−８抗体およびその使用の方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20211028BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20211028BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211028BHJP

   A61P 11/06 20060101ALI20211028BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20211028BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20211028BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20211028BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20211028BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/28ZNA

   C12P21/08

   A61K39/395 N

   A61P11/06

   A61P11/00

   A61P37/08

   A61P17/00

   !C12N15/13

【請求項の数】14

【外国語出願】

【全頁数】115

(21)【出願番号】特願2019-25337(P2019-25337)

(22)【出願日】2019年2月15日

(62)【分割の表示】特願2016-557547(P2016-557547)の分割

【原出願日】2014年12月9日

(65)【公開番号】特開2019-76115(P2019-76115A)

(43)【公開日】2019年5月23日

【審査請求日】2019年2月15日

(31)【優先権主張番号】61/913,891

(32)【優先日】2013年12月9日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516166030

【氏名又は名称】アラコス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】クリストファー アール． ベビントン

(72)【発明者】

【氏名】ルストム ファラハティ

(72)【発明者】

【氏名】フェルナンデス キャロライナ リタ ソーサ

(72)【発明者】

【氏名】デイビッド ジョン マシューズ

(72)【発明者】

【氏名】ネナド トマセヴィック

(72)【発明者】

【氏名】ジェイソン ウィリアムズ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン レオン

【審査官】 戸来 幸男

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００３−５２５６１５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５３２２５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１２０５００（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１３／１２００６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Blood，2003年，vol.101, no.12，pp.5014-5020

【文献】 Trends. Pharmacol. Sci.，2009年，vol.30, no.5，pp.240-248

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

Ｇｏｏｇｌｅ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象においてシグレック−８を発現する細胞によって媒介される疾患の処置または予防のための、ヒト化抗体を含む組成物であって、前記ヒト化抗体はヒトシグレック−８に特異的に結合し、前記抗体が、Ｆｃ領域と、前記Ｆｃ領域に連結されたＮ−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、ここで、前記組成物中の前記Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖の５０％未満がフコース残基を含有する、組成物。

【請求項2】

前記Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖のうち実質的に全てが、フコース残基を含有しない、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１または２に記載の組成物であって、
ここで、必要に応じて、前記抗体が、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項5】

前記抗体が、配列番号１１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号２３〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項４に記載の組成物。

【請求項6】

前記抗体が、配列番号２〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項7】

薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

ヒトシグレック−８に対する前記抗体の結合親和性またはアビディティーが、前記ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２または２Ｃ４の結合親和性またはアビディティーよりも高い、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも７０℃のＴｍを有し、必要に応じて、前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも７０℃から少なくとも７２℃のＴｍを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記疾患が、好酸球媒介性疾患または肥満細胞媒介性疾患である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記抗体が、アレルギー反応の１種または複数の症状を阻害し、必要に応じて、前記アレルギー反応が、Ｉ型過敏症反応である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記疾患が、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記対象が、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患う、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、その全体が参考として本明細書に援用される、２０１３年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６１／９１３，８９１号に対する優先権を主張する。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルにおける次の提出の内容は、その全体を参照により本明細書に組み入れられる：コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７０１７１２０００１４０ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ、記録された日付：２０１４年１２月９日、サイズ：１１５ＫＢ）。

【0003】

発明の分野
本発明は、抗ヒトシグレック−８抗体、およびシグレック−８を発現する細胞によって媒介される疾患を処置または予防する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン）は、主に白血球に存在し、細胞表面の複合糖質に付着したシアル酸に対するその特異性によって特徴付けられる、１回膜貫通細胞表面タンパク質である。シグレックファミリーは、哺乳動物において見出される少なくとも１５種のメンバーを含有する（Ｐｉｌｌａｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、３０巻：３５７〜３９２頁）。これらのメンバーは、シアロアドヘシン（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｏｎ）（シグレック−１）、ＣＤ２２（シグレック−２）、ＣＤ３３（シグレック−３）、ミエリン関連糖タンパク質（シグレック−４）、シグレック−５、ＯＢＢＰ１（シグレック−６）、ＡＩＲＭ１（シグレック−７）、ＳＡＦ−２（シグレック−８）およびＣＤ３２９（シグレック−９）を含む。ヒトにおいて発現されるが、マウスにおいては発現されないメンバーであるシグレック−８は、新規ヒト好酸球タンパク質を同定する試みの一環として最初に発見された。好酸球による発現に加えて、これは、肥満細胞および好塩基球によっても発現される。シグレック−８は、硫酸化グリカン、すなわち、６’−スルホ−シアリルルイスＸまたは６’−スルホ−シアリル−Ｎ−アセチル−Ｓ−ラクトサミンを認識し、肥満細胞機能を阻害することが示された細胞内免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインを含有する。

【0005】

肥満細胞と共に、好酸球は、特異的組織部位における感染の制御等、有益な機能的役割を果たす炎症性応答を促進することができる。炎症性応答において、好酸球のアポトーシスは、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ等、生存促進性サイトカインの活性により阻害され得る。しかし、アポトーシスによって急速に除去されない活性化された好酸球の増加は、既に炎症した部位における好酸球顆粒タンパク質の放出をもたらすことができ、これは、組織を損傷し、炎症をさらに増悪させることができる。チャーグ・ストラウス症候群、関節リウマチおよびアレルギー性喘息等、数種類の疾患は、好酸球活性化に関連付けられることが示された（Ｗｅｃｈｓｌｅｒら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、１３０巻（３号）：５６３〜７１頁）。現在、好酸球および肥満細胞の活性等、炎症に関与する免疫細胞の活性を制御することができる治療法の必要がある。
以前の研究は、シグレック−８が、シグレック−８の細胞外部分に対して産生された特異的マウス抗体と架橋されると、好酸球が、アポトーシスを起こすことを実証した（Ｎｕｔｋｕら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、３３６巻：９１８〜２４頁）。これらの抗体は、米国特許第８，２０７，３０５号、米国特許第８，１９７，８１１号、米国特許第７，８７１，６１２号および米国特許第７，５５７，１９１号に記載されている。しかし、依然として、高い親和性および特異性でヒトシグレック−８を認識するヒト化抗シグレック−８抗体を開発する必要がある。斯かる抗シグレック−８抗体の発見は、好酸球および／または肥満細胞の活性によって媒介される疾患のための処置の開発を可能にすることができる。
特許出願、特許公報および科学文献を含む本明細書に引用されるあらゆる参考文献は、個々の参考文献それぞれが具体的かつ個別に参照によりその全体が本明細書に組み入れられると示されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許第８，２０７，３０５号明細書

【特許文献2】米国特許第８，１９７，８１１号明細書

【特許文献3】米国特許第７，８７１，６１２号明細書

【特許文献4】米国特許第７，５５７，１９１号明細書

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ｐｉｌｌａｉら、Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、３０巻：３５７〜３９２頁

【非特許文献2】Ｗｅｃｈｓｌｅｒら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、１３０巻（３号）：５６３〜７１頁

【非特許文献3】Ｎｕｔｋｕら、Ｂｌｏｏｄ、２００３年、３３６巻：９１８〜２４頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

抗シグレック−８抗体（ヒト化抗シグレック−８抗体を含む）、これを含む組成物およびこれを使用する方法が本明細書において提供される。

【0009】

一態様において、ヒトシグレック−８に特異的に結合するヒト化抗体であって、ヒトシグレック−８に対するヒト化抗体の結合親和性および／または結合アビディティーが、ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２および／または抗体２Ｃ４の結合親和性および／または結合アビディティーよりも高いヒト化抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８は、二量体である。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８は、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合された細胞外ドメインヒトシグレック−８を含む。一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。一部の実施形態において、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８は、配列番号７４のアミノ酸配列を含む。

【0010】

一部の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含むことができる。さらなる実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６もしくは７７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従ってナンバリングされる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。一部の実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作された。一部の実施形態において、抗体は、２つの重鎖を含み、前記抗体の前記２つの重鎖のうち少なくとも１つまたは両方の重鎖は、フコシル化されていない。

【0011】

別の態様において、ヒトシグレック−８に特異的に結合するヒト化抗体であって、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約７０℃から少なくとも約７２℃のＴｍを有する抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、熱シフトアッセイにおいて約７０℃、約７１℃または約７２℃のＴｍを有する。一部の実施形態において、抗体は、キメラ２Ｃ４抗体と比較した場合に同じまたはより高いＴｍを有する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と比較した場合に同じまたはより高いＴｍを有する。

【0012】

一部の実施形態において、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態において、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含むことができる。さらなる実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６もしくは７７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従ってナンバリングされる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。一部の実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作された。一部の実施形態において、前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。

【0013】

さらに別の態様において、ヒトシグレック−８に特異的に結合するヒト化抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３および６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６または７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含むヒト化抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、配列番号１１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号２３〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態において、抗体は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含むことができる。さらなる実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、前記アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従ってナンバリングされる。一部の実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作された。一部の実施形態において、前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。

【0014】

さらに別の態様において、ヒトシグレック−８に特異的に結合するヒト化抗体であって、配列番号２〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作された。一部の実施形態において、前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。

【0015】

さらに別の態様において、ヒトシグレック−８に特異的に結合するヒト化抗体であって、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作された。一部の実施形態において、抗体の重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。

【0016】

別の態様において、ヒトシグレック−８に特異的に結合するヒト化抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、（ａ）重鎖可変領域が、（１）配列番号２６〜２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、（２）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（３）配列番号３１〜３６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、（４）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（５）配列番号３８〜４３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、（６）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３および（７）配列番号４５〜４６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４を含み、かつ／または（ｂ）軽鎖可変領域が、（１）配列番号４８〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、（２）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（３）配列番号５１〜５３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、（４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、（５）配列番号５５〜５８から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、（６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３および（７）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４を含むヒト化抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作された。一部の実施形態において、前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。

【0017】

さらに別の態様において、ヒトシグレック−８に結合し、ＡＤＣＣ活性によりシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる、単離された抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる（例えば、実施例２に記載されている細胞培養アッセイにおいて測定される）。一部の実施形態において、抗体は、治療有効量が投与されると、対象においてシグレック−８を発現する肥満細胞を枯渇させる。さらなる実施形態において、抗体は、処置前のベースラインレベルと比較した場合に、対象から得られる試料におけるシグレック−８を発現する肥満細胞の少なくとも約２０％（例えば、少なくとも）を枯渇させる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、試料は、組織試料または生体液試料となり得る。一部の実施形態において、組織試料は、皮膚、肺、骨髄および鼻ポリープからなる群から選択される１種または複数である。一部の実施形態において、生体液試料は、血液、気管支肺胞洗浄液および鼻洗浄液からなる群から選択される１種または複数である。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作することができる。一部の実施形態において、抗体の重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。さらなる実施形態において、抗体は、アルファ１，６−フコシル基転移酵素（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株において産生することができる。一部のさらなる実施形態において、抗体は、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ａｃｅｔｙｌｇｌｙｃｏｓｍｉｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株において産生することができる。さらなる実施形態において、細胞株は、ゴルジμ−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をさらに過剰発現する。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域における少なくとも１個のアミノ酸置換を含むことができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体となり得る。一部の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態において、抗体は、マウス抗体である。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができ、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができ、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、対象は、ヒトとなり得る。

【0018】

さらに別の態様において、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体が本明細書において提供される。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン１（例えば、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むドメイン１）におけるエピトープに結合することができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン３（例えば、配列番号１１４のアミノ酸配列を含むドメイン３）におけるエピトープに結合することができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン２（例えば、配列番号１１３のアミノ酸配列を含むドメイン２）におけるエピトープに結合することができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体となり得る。一部の実施形態において、抗体は、マウス抗体である。一部の実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４）である。

【0019】

別の態様において、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない、抗ヒトシグレック８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。本明細書における一部の実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における一部の実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における一部の実施形態において、抗体は、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0020】

別の態様において、ヒトシグレック−８に結合するヒト化抗体であって、活性化されたヒト好酸球の枯渇におけるＥＣ_５０が、ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２または２Ｃ４のＥＣ_５０に満たないヒト化抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、ヒト化抗体のＥＣ_５０は、ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２または２Ｃ４のＥＣ_５０の約８５％またはそれに満たない。一部の実施形態において、ヒト化抗体のＥＣ_５０は、ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２または２Ｃ４のＥＣ_５０の約８５％、約８０％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４５％、約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％もしくは約５％またはそれに満たない。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、ヒト化抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができ、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、ヒト化抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、ヒト化抗体は、配列番号２〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含むことができる。さらなる実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６もしくは７７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従ってナンバリングされる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。

【0021】

別の態様において、上述および本明細書に記載されているいずれかの抗体をコードする核酸が本明細書において提供される。さらに別の態様において、本明細書に記載されている核酸を含むベクターが本明細書において提供される。一実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。さらに別の態様において、本明細書に記載されている核酸を含む宿主細胞が本明細書において提供される。一部の実施形態において、宿主細胞は、抗体を発現および産生する。

【0022】

別の態様において、抗体を産生する方法であって、本明細書に記載されている抗体をコードする１種または複数の核酸を含む宿主細胞を、抗体を産生する条件下で培養するステップを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、本方法は、宿主細胞によって産生された抗体を回収するステップをさらに含む。本方法によって産生される抗シグレック−８抗体も本明細書において提供される。本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体の抗原結合性断片も本明細書において提供される。

【0023】

別の態様において、上述および本明細書に記載されている抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が本明細書において提供される。

【0024】

別の態様において、ヒトシグレック−８に特異的に結合する抗体またはその断片を含む組成物であって、抗体が、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に連結されたＮ−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、組成物におけるＮ−グリコシド結合型炭水化物鎖の５０％未満が、フコース残基を含有する組成物が本明細書において提供される。一部の実施形態において、Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖のうち実質的に全てが、フコース残基を含有しない。一部の実施形態において、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である。一部の実施形態において、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態において、抗体は、配列番号２〜１０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態において、抗体は、配列番号１１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号２３〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、抗体は、配列番号２〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、ヒトシグレック−８に対する抗体の結合親和性および／または結合アビディティーは、ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２または２Ｃ４の結合親和性および／または結合アビディティーよりも高くなることができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約７０℃から少なくとも約７２℃のＴｍを有することができる。一部の実施形態において、抗体は、約７０℃、約７１℃または約７２℃のＴｍを有する。一部の実施形態において、抗体は、キメラ２Ｃ４抗体と比較してた場合に同じまたはより高いＴｍを有する。一部の実施形態において、抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と比較した場合に同じまたはより高いＴｍを有する。

【0025】

別の態様において、対象においてシグレック−８を発現する細胞によって媒介される疾患を処置または予防する方法であって、対象に、有効量の本明細書に記載されている抗体もしくはその抗原結合性断片または本明細書に記載されている組成物を投与するステップを含む方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、疾患は、好酸球媒介性疾患である。一部の実施形態において、疾患は、肥満細胞媒介性疾患である。一部の実施形態において、疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される。一部の実施形態において、疾患は、乏顆粒球型喘息（ｐａｕｃｉ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｉｃ ａｓｔｈｍａ）、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、抗体は、アレルギー反応の１種または複数の症状を阻害する。一部の実施形態において、アレルギー反応は、Ｉ型過敏症反応である。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、対象は、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患っていてよい。

【0026】

別の態様において、対象においてシグレック−８を発現する肥満細胞を枯渇させる方法であって、対象に、ヒトシグレック−８に結合する有効量の抗体を投与するステップを含み、抗体が、ＡＤＣＣ活性によりシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる方法が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる（例えば、実施例２に記載されている細胞培養アッセイにおいて測定される）。一部の実施形態において、抗体は、処置前のベースラインレベルと比較した場合に、対象から得られる試料におけるシグレック−８を発現する肥満細胞の少なくとも約２０％を枯渇させる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、試料は、組織試料または生体液試料となり得る。一部の実施形態において、組織試料は、皮膚、肺、骨髄および鼻ポリープからなる群から選択される１種または複数である。一部の実施形態において、生体液試料は、血液、気管支肺胞洗浄液および鼻洗浄液からなる群から選択される１種または複数である。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作することができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、２つの重鎖を含むことができ、抗体の２つの重鎖のうち少なくとも１つまたは両方の重鎖は、フコシル化されていない。さらなる実施形態において、抗体は、アルファ１，６−フコシル基転移酵素（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株において産生することができる。一部のさらなる実施形態において、抗体は、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株において産生することができる。さらなる実施形態において、細胞株は、ゴルジμ−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をさらに過剰発現する。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域における少なくとも１個のアミノ酸置換を含むことができる。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体となり得る。一部の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含むことができる。さらなる実施形態において、抗体は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができ、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含むことができ、重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、対象は、シグレック−８を発現する細胞によって媒介される疾患を有する。一部の実施形態において、疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される。一部の実施形態において、疾患は、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される。一部の実施形態において、抗体は、アレルギー反応の１種または複数の症状を阻害する。一部の実施形態において、アレルギー反応は、Ｉ型過敏症反応である。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、対象は、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患っていてよい。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、対象は、ヒトとなり得る。

【0027】

本明細書に記載されている様々な実施形態の特性のうち１種、一部または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形作ることができることを理解されたい。本発明の上述および他の態様は、当業者には明らかになるであろう。本発明の上述および他の実施形態を次の詳細な説明によりさらに記載する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトシグレック−８に結合するヒト化抗体であって、前記ヒトシグレック−８に対する前記ヒト化抗体の結合親和性またはアビディティーが、前記ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２または２Ｃ４の結合親和性またはアビディティーよりも高い抗体。
（項目２）
ヒトシグレック−８に結合するヒト化抗体であって、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約７０℃のＴｍを有する抗体。
（項目３）
熱シフトアッセイにおいて少なくとも約７０℃から少なくとも約７２℃のＴｍを有する、項目２に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５）
配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６）
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目７）
前記ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４を含む、項目６に記載の抗体。
（項目８）
前記ヒトＩｇＧ４が、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、ここで、前記アミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従ってナンバリングされている、項目７に記載の抗体。
（項目９）
配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６もしくは７７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１０）
配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、項目１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１１）
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作されている、項目１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１２）
前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つが、フコシル化されていない、項目１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
（項目１３）
ヒトシグレック−８に結合するヒト化抗体であって、
（ａ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域、あるいは
（ｂ）重鎖可変領域および軽鎖可変領域であって、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む抗体。
（項目１４）
配列番号１１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号２３〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目１３に記載の抗体。
（項目１５）
配列番号２〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトシグレック−８に結合するヒト化抗体。
（項目１６）
配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、ヒトシグレック−８に結合するヒト化抗体。
（項目１７）
ヒトシグレック−８に結合するヒト化抗体であって、
（ａ）
（１）配列番号２６〜２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号３１〜３６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号３８〜４３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３および
（７）配列番号４５〜４６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４
を含む重鎖可変領域、および／または
（ｂ）
（１）配列番号４８〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号５１〜５３から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号５５〜５８から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３および
（７）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４
を含む軽鎖可変領域
を含む抗体。
（項目１８）
（ａ）
（１）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３および
（７）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４
を含む重鎖可変領域、および／または
（ｂ）
（１）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３および
（７）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４
を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１７に記載のヒト化抗体。
（項目１９）
（ａ）
（１）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３および
（７）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４
を含む重鎖可変領域、および／または
（ｂ）
（１）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３および
（７）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４
を含む軽鎖可変領域
を含む、項目１７に記載のヒト化抗体。
（項目２０）
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作されている、項目１３〜１９のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２１）
前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つが、フコシル化されていない、項目１３〜２０のいずれか一項に記載の抗体。
（項目２２）
項目１〜２１のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
（項目２３）
項目２２に記載の核酸を含むベクター。
（項目２４）
発現ベクターである、項目２３に記載のベクター。
（項目２５）
項目２２に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目２６）
抗体を産生する方法であって、前記抗体を産生する条件下で、項目２５に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
（項目２７）
前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収するステップをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
項目２６または２７に記載の方法によって産生された抗シグレック−８抗体。
（項目２９）
項目１〜２１および２８のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目３０）
ヒトシグレック−８に特異的に結合する抗体を含む組成物であって、前記抗体が、Ｆｃ領域と、前記Ｆｃ領域に連結されたＮ−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、ここで、前記Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖の５０％未満がフコース残基を含有する、組成物。
（項目３１）
前記Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖のうち実質的に全てが、フコース残基を含有しない、項目３０に記載の組成物。
（項目３２）
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目３０または３１に記載の組成物。
（項目３３）
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、項目３０〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
前記抗体が、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２２から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目３３に記載の組成物。
（項目３５）
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、項目３０〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
前記抗体が、配列番号１１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号２３〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目３５に記載の組成物。
（項目３７）
前記抗体が、配列番号２〜１４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、項目３０〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目３０〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
ヒトシグレック−８に対する前記抗体の結合親和性またはアビディティーが、前記ヒトシグレック−８に対する抗体２Ｅ２または２Ｃ４の結合親和性またはアビディティーよりも高い、項目３０〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約７０℃のＴｍを有する、項目３０〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
前記抗体が、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約７０℃から少なくとも約７２℃のＴｍを有する、項目４０に記載の組成物。
（項目４２）
ヒトシグレック−８に結合し、ＡＤＣＣ活性によりシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる、単離された抗体。
（項目４３）
治療有効量が投与される場合、対象においてシグレック−８を発現する肥満細胞を枯渇させる、項目４２に記載の抗体。
（項目４４）
処置前のベースラインレベルと比較した場合に、前記対象から得られる試料における前記シグレック−８を発現する肥満細胞の少なくとも約２０％を枯渇させる、項目４３に記載の抗体。
（項目４５）
前記試料が、組織試料または生体液試料である、項目４４に記載の抗体。
（項目４６）
前記組織試料が、皮膚、肺、骨髄および鼻ポリープからなる群から選択される１種または複数である、項目４５に記載の抗体。
（項目４７）
前記生体液試料が、血液、気管支肺胞洗浄液および鼻洗浄液からなる群から選択される１種または複数である、項目４５に記載の抗体。
（項目４８）
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作されている、項目４２〜４７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目４９）
前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つが、フコシル化されていない、項目４２〜４８のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５０）
アルファ１，６−フコシル基転移酵素（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株において産生される、項目４９に記載の抗体。
（項目５１）
β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株において産生される、項目４９に記載の抗体。
（項目５２）
前記細胞株が、ゴルジμ−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をさらに過剰発現する、項目５１に記載の抗体。
（項目５３）
ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域における少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、項目４８に記載の抗体。
（項目５４）
ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目４２〜５３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５５）
ヒトＩｇＧ１抗体である、項目４２〜５４のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５６）
マウス抗体である、項目４２〜５３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５７）
（ａ）（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む、項目４２〜５６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目５８）
（ａ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目５７に記載の抗体。
（項目５９）
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、項目４２〜５６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６０）
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、項目４２〜５６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６１）
ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体。
（項目６２）
前記非ヒト霊長類が、ヒヒである、項目６１に記載の抗体。
（項目６３）
（ａ）（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む、項目６１または６２に記載の抗体。
（項目６４）
前記抗体が、ヒトシグレック−８のドメイン１におけるエピトープに結合し、ここで、ドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む、項目６１〜６３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６５）
前記抗体が、ヒトシグレック−８のドメイン３におけるエピトープに結合し、ここで、ドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む、項目６１〜６３のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６６）
ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目６１〜６５のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６７）
マウス抗体である、項目６１〜６６のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６８）
ＩｇＧ１抗体である、項目６１〜６７のいずれか一項に記載の抗体。
（項目６９）
前記対象が、ヒトである、項目４３〜６０のいずれか一項に記載の抗体。
（項目７０）
項目４２〜６９のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸。
（項目７１）
項目７０に記載の核酸を含むベクター。
（項目７２）
発現ベクターである、項目７１に記載のベクター。
（項目７３）
項目７０に記載の核酸を含む宿主細胞。
（項目７４）
抗体を産生する方法であって、前記抗体を産生する条件下で、項目７３に記載の宿主細胞を培養するステップを含む方法。
（項目７５）
前記宿主細胞によって産生された前記抗体を回収するステップをさらに含む、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
項目７４または７５に記載の方法によって産生された抗シグレック−８抗体。
（項目７７）
対象においてシグレック−８を発現する細胞によって媒介される疾患を処置または予防する方法であって、項目１〜２２、２８、４２〜６９および７６のいずれか一項に記載の抗体または項目３０〜４１のいずれか一項に記載の組成物の有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
（項目７８）
前記疾患が、好酸球媒介性疾患である、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
前記疾患が、肥満細胞媒介性疾患である、項目７７に記載の方法。
（項目８０）
前記抗体が、アレルギー反応の１種または複数の症状を阻害する、項目７７に記載の方法。
（項目８１）
前記アレルギー反応が、Ｉ型過敏症反応である、項目８０に記載の方法。
（項目８２）
前記疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目８３）
前記疾患が、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目８４）
前記対象が、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患う、項目７４〜８３のいずれか一項に記載の方法。
（項目８５）
対象においてシグレック−８を発現する肥満細胞を枯渇させる方法であって、前記対象に、ヒトシグレック−８に結合する有効量の抗体を投与するステップを含み、前記抗体が、ＡＤＣＣ活性によりシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる方法。
（項目８６）
前記抗体が、処置前のベースラインレベルと比較した場合に、前記対象から得られる試料における前記シグレック−８を発現する肥満細胞の少なくとも約２０％を枯渇させる、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記試料が、組織試料または生体液試料である、項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記組織試料が、皮膚、肺、骨髄および鼻ポリープからなる群から選択される１種または複数である、項目８７に記載の方法。
（項目８９）
前記生体液試料が、血液、気管支肺胞洗浄液および鼻洗浄液からなる群から選択される１種または複数である、項目８７に記載の方法。
（項目９０）
前記抗体が、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を改善するように操作されている、項目８５〜８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目９１）
前記抗体の前記重鎖の少なくとも１または２つが、フコシル化されていない、項目８５〜９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記抗体が、アルファ１，６−フコシル基転移酵素（Ｆｕｔ８）ノックアウトを有する細胞株において産生される、項目９１に記載の方法。
（項目９３）
前記抗体が、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞株において産生される、項目９１に記載の方法。
（項目９４）
前記細胞株が、ゴルジμ−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）をさらに過剰発現する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
前記抗体が、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域における少なくとも１個のアミノ酸置換を含む、項目９０に記載の方法。
（項目９６）
前記抗体が、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である、項目８５〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１抗体である、項目８５〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記抗体が、
（ａ）（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、かつ／または（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、および／または（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域
を含む、項目８５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記抗体が、
（ａ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、項目８５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または前記軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、項目８５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記対象が、シグレック−８を発現する細胞によって媒介される疾患を有する、項目８５〜１０１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記抗体が、アレルギー反応の１種または複数の症状を阻害する、項目８５〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記アレルギー反応が、Ｉ型過敏症反応である、項目１０３に記載の方法。
（項目１０５）
前記疾患が、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０６）
前記疾患が、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
（項目１０７）
前記対象が、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患う、項目８５〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０８）
項目４２〜６９および７６のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
（項目１０９）
項目１〜２２、２８、４２〜６９および７６のいずれか一項に記載の抗体または項目３０〜４１のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図１は、ヒト化抗体の重鎖配列の比較を示す配列アライメントである。マウス２Ｅ２抗体の分子モデルにおけるＣＤＲの４Å内のフレームワーク残基を＊で表す；アクセプターヒトフレームワークにおいて異なったＣＤＲの４Å内の残基およびＶＣＩ残基を＾において強調し、マウスへのアクセプターヒトフレームワークにおけるこれらの残基の復帰変異を＠で示す；ヒト生殖系列からの体細胞変異を°で示す；これらの残基が、ＡＦ４７１５２１ ＦＷおよびｍｏｕ２Ｅ２（すなわち、マウス２Ｅ２）とは異なった場合、あるいはＡＦ４７１５２１フレームワークとは異なり、ｍｏｕ２Ｅ２（すなわち、マウス２Ｅ２）と同一である場合、アクセプターヒトフレームワークにおける相当する残基は、ヒト生殖系列に復帰変異され、＋で示す。重鎖のバージョン２において強調された配列は、最も近縁のヒト生殖系列ファミリー（すなわち、最も近縁の生殖系列配列）へのｍｏｕ２Ｅ２（すなわち、マウス２Ｅ２）ＣＤＲのストレートグラフトを表す。ｍ２Ｅ２ ＶＨは、配列番号１に相当する；ヒトＦＷ ＡＦ４７１５２１は、配列番号１２０に相当する；生殖系列Ｘ９２２１８ ＶＨ３６６は、配列番号１２１に相当する；２Ｅ２ ＲＨＡは、配列番号２に相当する；２Ｅ２ ＲＨＢは、配列番号３に相当する；２Ｅ２ ＲＨＣは、配列番号４に相当する；２Ｅ２ ＲＨＤは、配列番号５に相当する；２Ｅ２ ＲＨＥは、配列番号６に相当する；２Ｅ２ ＲＨＦは、配列番号７に相当する；２Ｅ２ ＲＨＧは、配列番号８に相当する；ＩＧＨＶ４−５９ ＦＷは、配列番号１２２に相当する；２Ｅ２ ＲＨＡ２は、配列番号９に相当する；および２Ｅ２ ＲＨＢ２は、配列番号１０に相当する。

【0029】

【図2】図２は、ヒト化抗体の軽鎖配列の比較を示す配列アライメントである。マウス２Ｅ２抗体の分子モデルにおけるＣＤＲの４Å内のフレームワーク残基を＊で表す；アクセプターヒトフレームワークにおいて異なるＣＤＲの４Å内の残基およびＶＣＩ残基を＋で示す；マウスへのヒトＦＷにおけるこれらの残基の復帰変異を＠で示す；Ｘ９３７２１フレームワークにおいてマウスと異なる残基のヒト生殖系列への復帰変異を＃で示す。ｍ２Ｅ２ ＶＫは、配列番号１５に相当する；Ｘ９３７２１は、配列番号１２３に相当する；生殖系列Ｘ０１６６８は、配列番号１２４に相当する；ｍ２Ｅ２ ＲＫＡは、配列番号１６に相当する；ｍ２Ｅ２ ＲＫＢは、配列番号１７に相当する；ｍ２Ｅ２ ＲＫＣは、配列番号１８に相当する；ｍ２Ｅ２ ＲＫＤは、配列番号１９に相当する；ｍ２Ｅ２ ＲＫＥは、配列番号２０に相当する；ｍ２Ｅ２ ＲＫＦは、配列番号２１に相当する；およびｍ２Ｅ２ ＲＫＧは、配列番号２２に相当する。

【0030】

【図3】図３は、ヒト化抗体の軽および重鎖の両方において変異したＣＤＲ配列の比較を示す配列アライメントである。生殖系列配列により近縁になるようにバリアントにおいて変異したＣＤＲ残基を＃で示す。２Ｅ２ ＲＫＡは、配列番号１６に相当する；２Ｅ２ ＲＫＦは、配列番号２１に相当する；２Ｅ２ ＲＫＡ Ｆ−Ｙ ｍｕｔは、配列番号２３に相当する；２Ｅ２ ＲＫＦ Ｆ−Ｙ ｍｕｔは、配列番号２４に相当する；２Ｅ２ ＲＨＡは、配列番号２に相当する；２Ｅ２ ＲＨＥは、配列番号６に相当する；２Ｅ２ ＲＨＥ Ｓ−Ｇ ｍｕｔは、配列番号１１に相当する；２Ｅ２ ＲＨＥ Ｅ−Ｄ ｍｕｔは、配列番号１２に相当する；２Ｅ２ ＲＨＥ Ｙ−Ｖ ｍｕｔは、配列番号１３に相当する；および２Ｅ２ ＲＨＥ Ｅ−Ｄトリプルｍｕｔは、配列番号１４に相当する。

【0031】

【図4】図４は、表示温度で１０分間加熱され、続いて４℃に冷却され、その後にシグレック−８結合ＥＬＩＳＡを行った、キメラ２Ｃ４または２Ｅ２ ＲＨＥと２Ｅ２ ＲＫＡ、２Ｅ２ ＲＫＦ、２Ｅ２ ＲＫＡ ＣＤＲ３変異体または２Ｅ２ ＲＫＦ ＣＤＲ３変異体との組合せによってコードされる精製された候補抗体によるシグレック−８抗原結合の比較を示すグラフである。

【0032】

【図5】図５は、ｃｈ２Ｃ４（すなわち、キメラ２Ｃ４抗体）と比較した、精製された２Ｃ４候補抗体のＴｍを示すグラフである。

【0033】

【図6】図６は、−２０℃で６０分間凍結し、室温で解凍した後の、キメラおよびヒト化抗シグレック−８抗体の安定性を示すグラフである。

【0034】

【図7】図７は、抗シグレック−８抗体による好酸球の死滅を示すグラフである。総末梢血白血球を表示の抗シグレック−８および対照抗体濃度の存在下で１６時間インキュベートした。好酸球数の低下をフローサイトメトリーによりモニターし、高い側方散乱（ＳＳＣ^ＨＩ）によるＣＤ１６−陰性ＩＬ５Ｒα＋細胞の損失として定量化した。

【0035】

【図8】図８は、抗シグレック−８抗体によるヒト肥満細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシスおよびｉｎ ｖｉｖｏ枯渇を示す一連のグラフである。図８Ａ。４８時間目のＬＤＨ放出によって実証される、ヒト造血幹細胞を生着したＮＳＧＳマウスの腹膜洗浄液由来の初代ヒト肥満細胞におけるＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体、非フコシル化ＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体および低フコースキメラ１Ｈ１０ ＩｇＧ１抗体のＮＫ細胞媒介性抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性。対照は、シグレック−８に結合しないフコシル化ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体を示す。図８Ｂ。ｉｎ ｖｉｖｏにおけるシグレック−８陽性肥満細胞の枯渇。ヒト肥満細胞に匹敵するレベルで、肥満細胞の表面においてシグレック−８を選択的に発現するシグレック−８トランスジェニックマウスを、ＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体、非フコシル化ＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体、マウス１Ｃ３抗体またはシグレック−８に結合しないヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体で腹腔内（ｉｎｔｒａｐｅｒｏｔｉｎｅａｌｌｙ）処置した。１群当たりｎ＝４マウス。

【0036】

【図9】図９は、ヒト化抗シグレック−８ ＩｇＧ４抗体によるヒト化マウスにおけるＩ型過敏症反応の阻害を示すグラフである。抗ＮＰ−ＩｇＥ（右耳に送達）またはＰＢＳ対照（左耳に送達）による感作および感作２４時間後に投与したＮＰ−ＢＳＡにより、生着されたＮＳＧＳマウスの耳において受動皮膚アナフィラキシー応答を誘導した。＊で示す感作２４時間前または＠で示す感作２時間後のいずれかに、ＨＥＫＡ ＩｇＧ４またはシグレック−８に結合しないヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体でマウスを処置した。負荷後３時間または２４時間目の耳の厚さの平均変化および標準誤差を示す。ＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体処置マウスは１群当たりｎ＝５マウス、アイソタイプ対照抗体処置マウスは１群当たりｎ＝４マウス。

【0037】

【図10】図１０は、フローサイトメトリーによって実証される、ヒヒおよびヒト好酸球（ＣＤ４９^＋ＣＤ１６⁻ＳＳＣ^ｈｉｇｈ細胞）へのマウス抗シグレック−８モノクローナル抗体２Ｅ２、１Ｃ３および１Ｈ１０の結合を示す一連のヒストグラムである。ヒストグラムは、シグレック−８に結合しないマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した、抗体毎の蛍光強度に対しプロットされたヒヒまたはヒト血液好酸球の数を示す。

【発明を実施するための形態】

【0038】

Ｉ．定義
本発明に関して詳細に記載する前に、本発明が、当然ながら変動し得る特定の組成物または生命システムに限定されないことを理解されたい。本明細書で使用されている用語法が、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定を目的としないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている通り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容がそれ以外を明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」と言及される場合、２個またはそれを超える斯かる分子の組合せその他を任意選択で含む。

【0039】

用語「約」は、本明細書において、本技術分野における当業者であれば容易に分かるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書において「約」の値またはパラメータが言及される場合、該値またはパラメータそれ自体に指示される実施形態を含む（および記載する）。

【0040】

本明細書に記載されている本発明の態様および実施形態が、態様および実施形態を「含む」、「からなる」および「から本質的になる」ことを含むことが理解される。

【0041】

用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ）および単鎖分子ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖ）を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書において「抗体」と互換的に使用される。

【0042】

基本的４鎖抗体単位は、２つの同一軽（Ｌ）鎖および２つの同一重（Ｈ）鎖で構成されたヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加的なポリペプチドと共に５個の基本的ヘテロ四量体単位からなり、１０個の抗原結合部位を含有するが、ＩｇＡ抗体は、Ｊ鎖と組み合わせた、重合して多価集合体を形成することができる２〜５個の基本的４鎖単位を含む。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１個の共有結合性ジスルフィド結合によってＨ鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１個または複数のジスルフィド結合によって互いに連結される。各ＨおよびＬ鎖は、規則的に間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端において、可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）に続いて、αおよびγ鎖のそれぞれに対し３個の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）、μおよびεアイソタイプに対し４個のＣ_Ｈドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端において可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）、続いてその他端に定常ドメインを有する。Ｖ_Ｌは、Ｖ_Ｈと整列され、Ｃ_Ｌは、重鎖の第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）と整列される。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの対形成は共に、単一の抗原結合部位を形成する。異なるクラスの抗体の構造および特性に関して、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ． Ｓｔｉｅｓ、Ａｂｂａ Ｉ． ＴｅｒｒおよびＴｒｉｓｔｒａｍ Ｇ． Ｐａｒｓｏｌｗ（編）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、１９９４年、７１頁、第６章を参照されたい。

【0043】

いずれかの脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパおよびラムダと呼ばれる明らかに異なる２型の一方に割り当てることができる。その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。それぞれα、δ、ε、γおよびμと命名された重鎖を有する５クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列における相対的に軽微な差および機能に基づいてサブクラスへとさらに分割され、例えば、ヒトは、次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと名付けられた複数の多型バリアントで存在することができ（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｅｆｒａｎｃ ２００９年、ｍＡｂｓ、１巻、４号、１〜７頁において概説）、そのうちいずれかが、本発明における使用に適する。ヒト集団における共通アロタイプバリアントは、文字ａ、ｆ、ｎ、ｚによって命名されている。

【0044】

「単離された」抗体は、その産生環境（例えば、天然または組換えによる）の構成成分から同定、分離および／または回収された抗体である。一部の実施形態において、単離されたポリペプチドは、その産生環境由来のあらゆる他の構成成分との関連を含まない。組換えトランスフェクト細胞に起因するもの等、その産生環境の夾雑構成成分は、抗体の研究、診断または治療的使用に典型的に干渉する材料であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含むことができる。一部の実施形態において、ポリペプチドは、（１）例えば、ローリー方法によって決定される抗体の９５重量％超まで、一部の実施形態において、９９重量％超まで；（１）スピニングカップシークエネーターの使用により、Ｎ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーもしくは銀染色を使用した非還元もしくは還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１種の構成成分が存在しないため、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕの抗体を含む。しかし通常、単離されたポリペプチドまたは抗体は、少なくとも１回の精製ステップにより調製される。

【0045】

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書において、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る可能な天然起源の変異および／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。一部の実施形態において、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖にＣ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が、重鎖および／または軽鎖のＣ末端において切断される。一部の実施形態において、Ｃ末端切断は、重鎖からＣ末端リシンを除去する。一部の実施形態において、モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖にＮ末端切断を有する。例えば、１、２、３、４または５個のアミノ酸残基が、重鎖および／または軽鎖のＮ末端において切断される。一部の実施形態において、トランケート型のモノクローナル抗体は、組換え技法によって作成することができる。一部の実施形態において、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。一部の実施形態において、モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、複数の抗原部位に向けられている（二重特異性抗体または多特異性抗体等）。修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の性状を示し、いずれか特定の方法による抗体の産生を要求するものと解釈するべきではない。例えば、本発明に従って使用するべきモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ技術、およびヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全体を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術を含む種々の技法によって作成することができる。

【0046】

用語「裸の抗体」は、細胞傷害性部分または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。

【0047】

用語「全長抗体」、「インタクト抗体」または「全抗体」は、抗体断片とは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すように互換的に使用される。特に、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重および軽鎖を有する抗体を含む。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列バリアントとなり得る。場合によっては、インタクト抗体は、１種または複数のエフェクター機能を有することができる。

【0048】

「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、インタクト抗体の抗原結合および／または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁［１９９５年］を参照）；抗体断片から形成された単鎖抗体分子および多特異性抗体が挙げられる。

【0049】

抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２個の同一抗原結合性断片と、容易に結晶化する能力を反映する命名であるところの、残余の「Ｆｃ」断片を産生する。Ｆａｂ断片は、一方の重鎖のＨ鎖可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）および第１の定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）と共にＬ鎖全体からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一の大型のＦ（ａｂ’）_２断片を生じ、これは、異なる抗原結合活性を有し、依然として抗原を架橋することができる２個のジスルフィド結合したＦａｂ断片に大まかに相当する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１個または複数のシステインを含む数個の追加的な残基をＣ_Ｈ１ドメインのカルボキシ末端に有するという点において、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’の本明細書における命名である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は本来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片のペアとして産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。

【0050】

Ｆｃ断片は、ジスルフィドによって一体に保持された両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、ある特定の種類の細胞上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される領域でもあるＦｃ領域における配列によって決定される。

【0051】

「Ｆｖ」は、完全抗原認識および結合部位を含有する最小抗体断片である。この断片は、緊密な非共有結合性会合した１個の重および１個の軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２個のドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６個の高頻度可変性ループ（それぞれＨおよびＬ鎖由来の３個のループ）を発する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＨＶＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識および結合する能力を有する。

【0052】

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」としても省略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖へと接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。一部の実施形態において、ｓＦｖポリペプチドは、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これは、ｓＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。ｓＦｖの概説に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）を参照されたい。

【0053】

本発明の抗体の「機能断片」は、インタクト抗体の抗原結合もしくは可変領域を一般に含むインタクト抗体の部分、または修飾されたＦｃＲ結合能を保持もしくは有する抗体のＦｖ領域を含む。抗体断片の例として、抗体断片から形成された線状抗体、単鎖抗体分子および多特異性抗体が挙げられる。

【0054】

本明細書におけるモノクローナル抗体は、重および／または軽鎖の部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一または相同であるが、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一または相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）と共に、所望の生物学的活性を呈する限りにおいて、斯かる抗体の断片を特に含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年））。本明細書における目的のキメラ抗体は、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体を含み、この抗体の抗原結合領域は、例えば、目的の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生された抗体に由来する。本明細書において、「ヒト化抗体」は、「キメラ抗体」のサブセットとして使用される。

【0055】

「ヒト化」型の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一実施形態において、ヒト化抗体は、レシピエントのＨＶＲ由来の残基が、所望の特異性、親和性および／または能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナー抗体）のＨＶＲ由来の残基に置き換えられたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の事例において、ヒト免疫グロブリンのＦＲ残基は、相当する非ヒト残基に置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に存在しない残基を含むことができる。これらの修飾を為して、結合親和性等、抗体性能をさらに精緻化することができる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１、典型的には２個の可変ドメインのうち実質的に全てを含み、それによると、高頻度可変性ループの全てまたは実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリン配列のものに相当し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリン配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性、異性化、免疫原性等、抗体性能を改善する１個または複数の個々のＦＲ残基置換を含むことができるであろう。一部の実施形態において、ＦＲにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、Ｈ鎖において６個以下であり、Ｌ鎖においては、３個以下である。ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分も任意選択で含むであろう。さらなる詳細に関して、例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。例えば、ＶａｓｗａｎｉおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ＆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１巻：１０５〜１１５頁（１９９８年）；Ｈａｒｒｉｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２３巻：１０３５〜１０３８頁（１９９５年）；ＨｕｒｌｅおよびＧｒｏｓｓ、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．５巻：４２８〜４３３頁（１９９４年）；ならびに米国特許第６，９８２，３２１号および同第７，０８７，４０９号も参照されたい。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、単一の抗原部位に向けられている。一部の実施形態において、ヒト化抗体は、複数の抗原部位に向けられている。代替的ヒト化方法は、米国特許第７，９８１，８４３号および米国特許出願公開第２００６／０１３４０９８号に記載されている。

【0056】

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ「ＶＨ」および「ＶＬ」と称することができる。これらのドメインは一般に、抗体の最も可変的な部分であり（同じクラスの他の抗体と比べて）、抗原結合部位を含有する。

【0057】

用語「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」または「ＨＶ」は、本明細書において使用される場合、配列が高頻度可変性であるおよび／または構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６個のＨＶＲを含む；ＶＨにおける３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬにおける３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。ネイティブ抗体において、Ｈ３およびＬ３は、６個のＨＶＲのうち最大の多様性を表示し、Ｈ３は特に、抗体への優れた特異性の付与において特有の役割を果たすと考えられる。例えば、Ｘｕら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３巻：３７〜４５頁（２０００年）；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＷｕ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８巻：１〜２５頁（Ｌｏ編、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、２００３年））を参照されたい。実際に、重鎖のみからなる天然起源のラクダ科動物（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定的である。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６３巻：４４６〜４４８頁（１９９３年）およびＳｈｅｒｉｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．３巻：７３３〜７３６頁（１９９６年）を参照されたい。

【0058】

多数のＨＶＲの図解が使用されており、本明細書に包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＶＲは、配列可変性に基づき、最も一般的に使用されている（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１年））。Ｃｈｏｔｈｉａ ＨＶＲは、その代わりに、構造ループの位置を指す（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））。「Ｃｏｎｔａｃｔ」ＨＶＲは、利用できる複雑な結晶構造の解析に基づく。これらのＨＶＲのそれぞれに由来する残基を下に記す。

【表A】

【0059】

他に断りがなければ、可変ドメイン残基（ＨＶＲ残基およびフレームワーク領域残基）は、Ｋａｂａｔら（上掲）に従ってナンバリングする。

【0060】

「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書に定義されているＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0061】

表現「Ｋａｂａｔにおける通りの可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔにおける通りのアミノ酸位置ナンバリング」およびこれらの変種は、Ｋａｂａｔら（上掲）における抗体の編集の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用されるナンバリング方式を指す。このナンバリング方式を使用して、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮またはそれへの挿入に相当する、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含有することができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）を、また、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂおよび８２ｃ等）を含むことができる。残基のＫａｂａｔナンバリングは、「標準」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列との抗体配列の相同性領域におけるアライメントにより、所定の抗体に対して決定することができる。

【0062】

本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来するＶＬまたはＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができる、あるいは先在するアミノ酸配列変化を含有することができる。一部の実施形態において、先在するアミノ酸変化の数は、１０個もしくはそれに満たない、９個もしくはそれに満たない、８個もしくはそれに満たない、７個もしくはそれに満たない、６個もしくはそれに満たない、５個もしくはそれに満たない、４個もしくはそれに満たない、３個もしくはそれに満たないまたは２個もしくはそれに満たない。

【0063】

参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮することなく、最大パーセント配列同一性を達成した後に、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当業者の技能範囲内の様々な仕方で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等、公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大アライメントの達成に必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、配列の整列に適切なパラメータを決定することができる。例えば、所定のアミノ酸配列Ｂとの、これに関するまたはこれに対する所定のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（あるいは、所定のアミノ酸配列Ｂと、これに関しまたはこれに対し、ある特定の％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所定のアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、次の通りに計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
（式中、Ｘは、ＡおよびＢの該プログラムのアライメントにおける配列により同一マッチとしてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さが、アミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性が、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性に等しくならないことが認められよう。

【0064】

特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドにおけるエピトープ「に結合する」、「に特異的に結合する」または「に特異的な」抗体は、他のいかなるポリペプチドまたはポリペプチドエピトープにも実質的に結合することなく、この特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドにおけるエピトープに結合する抗体である。一部の実施形態において、無関係の非シグレック−８ポリペプチドへの本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体の結合は、本技術分野で公知の方法（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ））によって測定されるシグレック−８への抗体結合の約１０％未満である。一部の実施形態において、シグレック−８（例えば、二量体型のシグレック−８ Ｆｃ融合タンパク質（配列番号７４））に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦２ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．７ｎＭ、≦０．６ｎＭ、≦０．５ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍまたはそれに満たない、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。

【0065】

用語「シグレック−８」は、本明細書において、ヒトシグレック−８タンパク質を指す。この用語は、スプライスバリアントまたはアレルバリアントを含むシグレック−８の天然起源のバリアントも含む。例示的なヒトシグレック−８のアミノ酸配列を配列番号７２に示す。別の例示的なヒトシグレック−８のアミノ酸配列を配列番号７３に示す。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域に融合されたヒトシグレック−８細胞外ドメインを含む。免疫グロブリンＦｃ領域に融合された例示的なヒトシグレック−８細胞外ドメインのアミノ酸配列を配列番号７４に示す。配列番号７４における下線を引いたアミノ酸配列は、シグレック−８ Ｆｃ融合タンパク質アミノ酸配列のＦｃ領域を示す。

【化1】

【化2】

【化3】

【0066】

「アポトーシスを誘導する」または「アポトーシス性」である抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化および／または膜小胞の形成（アポトーシス小体と呼ばれる）等、標準アポトーシスアッセイによって決定されるプログラム細胞死を誘導する抗体である。例えば、本発明の抗シグレック−８抗体のアポトーシス活性は、アネキシンＶで細胞を染色することにより示すことができる。

【0067】

抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列バリアントＦｃ領域）に起因し得る生物学的活性を指し、抗体アイソタイプにより変動する。抗体エフェクター機能の例として：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；およびＢ細胞活性化が挙げられる。

【0068】

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を、抗原を有する標的細胞に特異的に結合させ、その後、細胞毒で標的細胞を死滅させることができる細胞傷害の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装（ａｒｍ）」させ、この機構による標的細胞の死滅に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）の４６４頁の表３に要約されている。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、ＡＤＣＣを増強する。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されているもの等、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＤＣＣアッセイを行うことができる。斯かるアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。その代わりにまたはその上、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９５巻：６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されているもの等、動物モデルにおいて評価することができる。ＡＤＣＣ活性および他の抗体特性を変更する他のＦｃバリアントは、Ｇｈｅｔｉｅら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５巻：６３７〜４０頁、１９９７年；Ｄｕｎｃａｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：５６３〜５６４頁、１９８８年；Ｌｕｎｄら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７巻：２６５７〜２６６２頁、１９９１年；Ｌｕｎｄら、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９巻：５３〜５９頁、１９９２年；Ａｌｅｇｒｅら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５７巻：１５３７〜１５４３頁、１９９４年；Ｈｕｔｃｈｉｎｓら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２巻：１１９８０〜１１９８４頁、１９９５年；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．４４巻：１１１〜１１７頁、１９９５年；Ｌｕｎｄら、ＦＡＳＥＢ Ｊ ９巻：１１５〜１１９頁、１９９５年；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ５４巻：１０１〜１０４頁、１９９６年；Ｌｕｎｄら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７巻：４９６３〜４９６９頁、１９９６年；Ａｒｍｏｕｒら、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２９巻：２６１３〜２６２４頁、１９９９年；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４巻：４１７８〜４１８４頁、２００；Ｒｅｄｄｙら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４巻：１９２５〜１９３３頁、２０００年；Ｘｕら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００巻：１６〜２６頁、２０００年；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６６巻：２５７１〜２５７５頁、２００１年；Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６巻：６５９１〜６６０４頁、２００１年；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２巻：５７〜６５頁．２００２年；Ｐｒｅｓｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ ３０巻：４８７〜４９０頁、２００２年；Ｌａｚａｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １０３巻：４００５〜４０１０頁、２００６年；米国特許第５，６２４，８２１号；同第５，８８５，５７３号；同第５，６７７，４２５号；同第６，１６５，７４５号；同第６，２７７，３７５号；同第５，８６９，０４６号；同第６，１２１，０２２号；同第５，６２４，８２１号；同第５，６４８，２６０号；同第６，１９４，５５１号；同第６，７３７，０５６号；同第６，８２１，５０５号；同第６，２７７，３７５号；同第７，３３５，７４２号；および同第７，３１７，０９１号に開示されているものを含む。

【0069】

本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域およびバリアントＦｃ領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用されている。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基からそのカルボキシル末端に伸びるものと定義される。本発明の抗体における使用に適したネイティブ配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。単一のアミノ酸置換（ＫａｂａｔナンバリングによるＳ２２８Ｐ；ＩｇＧ４Ｐｒｏと命名）を導入して、組換えＩｇＧ４抗体において観察される異質性を消失させることができる。Ａｎｇａｌ， Ｓ．ら（１９９３年）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３０巻、１０５〜１０８頁を参照されたい。

【0070】

「非フコシル化」または「フコース欠損」抗体は、Ｆｃ領域を含むグリコシル化抗体バリアントを指し、このＦｃ領域に付着した糖質構造は、低下したフコースを有するまたはフコースを欠如する。一部の実施形態において、フコースが低下したまたはフコースを欠如する抗体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。非フコシル化またはフコース欠損抗体は、細胞株において産生される同じ抗体におけるフコースの量と比べて低下したフコースを有する。本明細書において企図される非フコシル化またはフコース欠損抗体組成物は、組成物における抗体のＦｃ領域に付着したＮ結合型グリカンの約５０％未満が、フコースを含む組成物である。

【0071】

用語「フコシル化」または「フコシル化された」は、抗体のペプチド骨格に付着したオリゴ糖内のフコース残基の存在を指す。特に、フコシル化抗体は、例えば、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＡｓｎ２９７位における（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）、抗体Ｆｃ領域に付着したＮ結合型オリゴ糖の一方または両方における最内側Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基にα（１，６）結合型フコースを含む。Ａｓｎ２９７は、免疫グロブリンにおける軽微な配列変種により、２９７位の上流または下流の約＋３アミノ酸に、すなわち、２９４〜３００位の間に位置することもできる。

【0072】

「フコシル化の程度」は、本技術分野で公知の方法によって、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ）によって評価されるＮ−グリコシダーゼＦ処理抗体組成物において同定された、全オリゴ糖と比べたフコシル化オリゴ糖のパーセンテージである。「完全にフコシル化された抗体」の組成物において、基本的に全オリゴ糖が、フコース残基を含む、すなわち、フコシル化されている。一部の実施形態において、完全にフコシル化された抗体の組成物は、少なくとも約９０％のフコシル化の程度を有する。したがって、斯かる組成物における個々の抗体は、典型的に、Ｆｃ領域における２個のＮ結合型オリゴ糖のそれぞれにフコース残基を含む。逆に、「完全非フコシル化」抗体の組成物において、基本的にいかなるオリゴ糖もフコシル化されておらず、斯かる組成物における個々の抗体は、Ｆｃ領域における２個のＮ結合型オリゴ糖のいずれにもフコース残基を含有しない。一部の実施形態において、完全非フコシル化抗体の組成物は、約１０％未満のフコシル化の程度を有する。「部分的にフコシル化された抗体」の組成物において、オリゴ糖の一部のみが、フコースを含む。組成物が、Ｆｃ領域におけるＮ結合型オリゴ糖にフコース残基を欠如する基本的にあらゆる個々の抗体も、Ｆｃ領域におけるＮ結合型オリゴ糖の両方にフコース残基を含有する基本的にあらゆる個々の抗体も含まないのであれば、斯かる組成物における個々の抗体は、Ｆｃ領域におけるＮ結合型オリゴ糖の一方または両方にフコース残基を含むことができるまたはどちらにも含まない。一実施形態において、部分的にフコシル化された抗体の組成物は、約１０％〜約８０％（例えば、約５０％〜約８０％、約６０％〜約８０％または約７０％〜約８０％）のフコシル化の程度を有する。

【0073】

本明細書における「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位およびその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合性相互作用の強度を指す。一部の実施形態において、シグレック−８（本明細書に記載されているシグレック−８−Ｆｃ融合タンパク質等、二量体の場合がある）に対する抗体の親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）により表すことができる。親和性は、本明細書に記載されている方法を含む、本技術分野で公知の一般的方法により測定することができる。

【0074】

本明細書における「結合アビディティー」は、分子（例えば、抗体）の複数の結合部位およびその結合パートナー（例えば、抗原）の結合強度を指す。

【0075】

本明細書における抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、これが産生された環境においてこれが通常関連する少なくとも１種の夾雑核酸分子から分離された核酸分子である。一部の実施形態において、単離された核酸は、産生環境と関連するあらゆる構成成分との関連を含まない。本明細書におけるポリペプチドおよび抗体をコードする単離された核酸分子は、これが天然に見出される形態または設定以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、本明細書において細胞中に天然に存在するポリペプチドおよび抗体をコードする核酸から区別される。

【0076】

用語「医薬製剤」は、活性成分の生物学的活性が有効となることを可能にするような形態の、この製剤が投与される対象にとって容認し難い毒性がある追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。斯かる製剤は無菌である。

【0077】

本明細書における「担体」は、用いられている投薬量および濃度でこれに曝露される細胞または哺乳動物にとって無毒性の、薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例として、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖、二糖および他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。

【0078】

本明細書において、用語「処置」は、臨床病理学の経過において処置されている個体または細胞の天然の経過を変更するように設計された臨床介入を指す。処置の望ましい効果は、疾患進行速度の減少、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。例えば、障害（例えば、好酸球媒介性疾患）に関連する１種または複数の症状が、軽減または排除される場合、個体はうまく「処置」される。例えば、処置が、疾患に罹った個体のクオリティ・オブ・ライフの増加、疾患処置に必要とされる他の薬物療法の用量の減少、疾患再発の頻度の低下、疾患の重症度の低減、疾患の発症もしくは進行の遅延および／または個体の生存の延長をもたらす場合、個体はうまく「処置」される。

【0079】

本明細書において、「と併せて」は、ある処置様式に加えた、別の処置様式の投与を指す。このようなものとして、「と併せて」は、個体へのある処置様式の投与の前、最中または後における、他の処置様式の投与を指す。

【0080】

本明細書において、用語「予防」は、個体における疾患の発生または再発に関する予防法の提供を含む。個体は、障害の素因がある、障害になりやすいまたは障害発症リスクがある可能性があるが、未だ障害と診断されていない。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、障害の発症を遅延させるために使用される。

【0081】

本明細書において、障害発症「リスクがある」個体は、検出可能な疾患または疾患症状を有していても有していなくてもよく、本明細書に記載されている処置方法に先立ち検出可能な疾患または疾患症状を呈していてもいなくてもよい。「リスクがある」は、個体が、本技術分野で公知の好酸球媒介性障害および／または肥満細胞媒介性障害の発症と相関する測定可能なパラメータである１種または複数のリスク因子を有することを意味する。これらのリスク因子のうち１種または複数を有する個体は、これらのリスク因子の１種または複数がない個体よりも高い障害発症確率を有する。

【0082】

「有効量」は、治療的または予防的結果を含む、所望のまたは表示の効果の達成に必要な投薬量および期間で、少なくとも有効な量を指す。有効量は、１回または複数の投与でもたらすことができる。「治療有効量」は、特定の障害の測定可能な改善をもたらすために要求される少なくとも最小濃度である。本明細書における治療有効量は、患者の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体の能力等の因子に応じて変動し得る。治療有効量は、治療的に有益な効果が、抗体のいかなる毒性または有害効果も上回る量となることもできる。「予防有効量」は、所望の予防的結果の達成に必要な投薬量および期間で有効な量を指す。典型的には、ただし必然的にではなく、予防的用量は、疾患のより早期ステージにおいてまたはそれに先立ち対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量未満となり得る。

【0083】

「慢性」投与は、延長された期間で初期治療効果（活性）を維持するために、急性様式とは対照的に継続的な様式での医薬（複数可）の投与を指す。「間欠的」投与は、中断することなく連続的に為されないが、周期性の性質の処置である。

【0084】

本明細書において、「個体」または「対象」は、哺乳動物である。処置目的のための「哺乳動物」は、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、スナネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコ等、ヒト、飼育動物および家畜、ならびに動物園、スポーツまたは愛玩動物を含む。一部の実施形態において、個体または対象は、ヒトである。

【0085】

ＩＩ．抗シグレック−８抗体および組成物
一態様において、本発明は、ヒトシグレック−８に結合する単離された抗体を提供する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、次の特徴のうち１種または複数を有する：（１）ヒトシグレック−８に結合する；（２）ヒトシグレック−８の細胞外ドメインに結合する；（３）マウス抗体２Ｅ２および／またはマウス抗体２Ｃ４よりも高い親和性でヒトシグレック−８に結合する；（４）マウス抗体２Ｅ２および／またはマウス抗体２Ｃ４よりも高いアビディティーでヒトシグレック−８に結合する；（５）熱シフトアッセイにおいて約７０℃〜７２℃またはそれより高いＴ_ｍを有する；（６）低下した程度のフコシル化を有するかまたはフコシル化されていない；（７）好酸球上に発現されたヒトシグレック−８に結合し、好酸球のアポトーシスを誘導する；（８）肥満細胞上に発現されたヒトシグレック−８に結合し、肥満細胞を枯渇させる；（９）肥満細胞上に発現されたヒトシグレック−８に結合し、肥満細胞のＦｃεＲＩ依存性活性（例えば、ヒスタミン放出、ＰＧＤ_２放出、Ｃａ^２＋フラックスおよび／またはβ−ヘキソサミニダーゼ放出等）を阻害する；（１０）ＡＤＣＣ活性を改善するように操作された；（１１）肥満細胞上に発現されたヒトシグレック−８に結合し、ＡＤＣＣ活性により肥満細胞を死滅させる（ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで）；（１２）ヒトおよび非ヒト霊長類のシグレック−８に結合する；（１３）ヒトシグレック−８のドメイン１、ドメイン２および／またはドメイン３に結合する、またはヒトシグレック−８のドメイン１、ドメイン２および／またはドメイン３を含むシグレック−８ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されている融合タンパク質）に結合する；ならびに（１４）マウス抗体２Ｅ２または２Ｃ４のＥＣ_５０に満たないＥＣ_５０で活性化された好酸球を枯渇させる。

【0086】

一態様において、本発明は、ヒトシグレック−８に結合する抗体を提供する。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８は、配列番号７２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８は、配列番号７３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン１におけるエピトープに結合し、ドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン２におけるエピトープに結合し、ドメイン２は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン３におけるエピトープに結合し、ドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８の細胞外ドメインにおける線状エピトープに結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８の細胞外ドメインにおける立体構造エピトープに結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、好酸球上に発現されるヒトシグレック−８に結合し、好酸球のアポトーシスを誘導する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、肥満細胞上に発現されるヒトシグレック−８に結合し、肥満細胞を枯渇させる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、肥満細胞上に発現されるヒトシグレック−８に結合し、肥満細胞媒介性活性を阻害する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、肥満細胞上に発現されるヒトシグレック−８に結合し、ＡＤＣＣ活性により肥満細胞を死滅させる。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、肥満細胞を枯渇させ、肥満細胞活性化を阻害する。一部の実施形態において、本明細書における抗体は、活性化された好酸球を枯渇させ、肥満細胞活性化を阻害する。

【0087】

ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する、単離された抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。霊長類交差反応性を有する抗体の同定は、非ヒト霊長類における抗シグレック−８抗体の前臨床検査に有用となるであろう。一態様において、本発明は、非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体を提供する。一態様において、本発明は、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体を提供する。一部の実施形態において、非ヒト霊長類シグレック−８は、配列番号１１８のアミノ酸配列またはその部分を含む。一部の実施形態において、非ヒト霊長類シグレック−８は、配列番号１１９のアミノ酸配列またはその部分を含む。一部の実施形態において、非ヒト霊長類は、ヒヒ（例えば、Ｐａｐｉｏ Ａｎｕｂｉｓ）である。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン１におけるエピトープに結合する。さらなる実施形態において、ヒトシグレック−８のドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン３におけるエピトープに結合する。さらなる実施形態において、ヒトシグレック−８のドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体またはヒト抗体である。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体は、マウス抗体である。一部の実施形態において、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。

【0088】

一態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、モノクローナル抗体である。一態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、抗体断片（抗原結合性断片を含む）、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖまたは（Ｆａｂ’）_２断片である。一態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体である。一態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体のいずれかは、精製されている。

【0089】

一態様において、シグレック−８に結合するマウス２Ｅ２抗体およびマウス２Ｃ４抗体と競合する抗シグレック−８抗体が提供される。マウス２Ｅ２抗体およびマウス２Ｃ４抗体と同じエピトープに結合する抗シグレック−８抗体も提供される。一態様において、シグレック−８への結合に関して本明細書に記載されているいずれかの抗シグレック−８抗体（例えば、ＨＥＫＡ、ＨＥＫＦ、１Ｃ３、１Ｈ１０、４Ｆ１１）と競合する抗シグレック−８抗体が提供される。本明細書に記載されているいずれかの抗シグレック−８抗体（例えば、ＨＥＫＡ、ＨＥＫＦ、１Ｃ３、１Ｈ１０、４Ｆ１１）と同じエピトープに結合する抗シグレック−８抗体も提供される。

【0090】

本発明の一態様において、抗シグレック−８抗体をコードするポリヌクレオチドが提供される。ある特定の実施形態において、抗シグレック−８抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。ある特定の実施形態において、斯かるベクターを含む宿主細胞が提供される。本発明の別の態様において、抗シグレック−８抗体または抗シグレック−８抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、本明細書に列挙されているもの等、好酸球媒介性障害および／または肥満細胞媒介性障害の処置のための医薬製剤である。

【0091】

一態様において、マウス抗体２Ｃ４のＨＶＲ配列のうち１、２、３、４、５または６個を含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、マウス抗体２Ｅ２のＨＶＲ配列のうち１、２、３、４、５または６個を含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲまたはＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。

【0092】

一態様において、マウス抗体１Ｃ３のＨＶＲ配列のうち１、２、３、４、５または６個を含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、マウス抗体４Ｆ１１のＨＶＲ配列のうち１、２、３、４、５または６個を含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、マウス抗体１Ｈ１０のＨＶＲ配列のうち１、２、３、４、５または６個を含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、ＨＶＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲまたはＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲである。

【0093】

一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン１におけるエピトープに結合し、ドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン２におけるエピトープに結合し、ドメイン２は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン３におけるエピトープに結合し、ドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。

【0094】

一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１５のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、配列番号１１７のアミノ酸を含む融合タンパク質に結合するが、配列番号１１６のアミノ酸を含む融合タンパク質には結合しない。

【0095】

一態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗シグレック−８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書において提供される。

【0096】

一態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗シグレック−８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書において提供される。

【0097】

一態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗シグレック−８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書において提供される。

【0098】

別の態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗シグレック−８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含み、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書において提供される。

【0099】

別の態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗シグレック−８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン２におけるエピトープに結合し、ドメイン２は、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む。

【0100】

別の態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗シグレック−８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン３におけるエピトープに結合し、ドメイン３は、配列番号１１４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する。

【0101】

別の態様において、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗シグレック−８抗体であって、重鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２および（ｉｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、かつ／または軽鎖可変領域が、（ｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２および（ｉｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８のドメイン１におけるエピトープに結合し、ドメイン１は、配列番号１１２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体は、ヒトシグレック−８および非ヒト霊長類シグレック−８に結合する。

【0102】

本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、この抗体が、ヒトシグレック−８に結合する能力を保持するのであれば、いかなる適したフレームワーク可変ドメイン配列を含むこともできる。本明細書において、重鎖フレームワーク領域は、「ＨＣ−ＦＲ１〜ＦＲ４」と命名され、軽鎖フレームワーク領域は、「ＬＣ−ＦＲ１〜ＦＲ４」と命名される。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号２６、３４、３８および４５の重鎖可変ドメインフレームワーク配列（それぞれＨＣ−ＦＲ１、ＨＣ−ＦＲ２、ＨＣ−ＦＲ３およびＨＣ−ＦＲ４）を含む。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号４８、５１、５５および６０の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列（それぞれＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３およびＬＣ−ＦＲ４）を含む。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号４８、５１、５８および６０の軽鎖可変ドメインフレームワーク配列（それぞれＬＣ−ＦＲ１、ＬＣ−ＦＲ２、ＬＣ−ＦＲ３およびＬＣ−ＦＲ４）を含む。

【0103】

一実施形態において、抗シグレック−８抗体は、フレームワーク配列および高頻度可変領域を含む重鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＨＣ−ＦＲ１〜ＨＣ−ＦＲ４配列、それぞれ配列番号２６〜２９（ＨＣ−ＦＲ１）、配列番号３１〜３６（ＨＣ−ＦＲ２）、配列番号３８〜４３（ＨＣ−ＦＲ３）および配列番号４５または４６（ＨＣ−ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗シグレック−８抗体は、フレームワーク配列および高頻度可変領域を含む重鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＨＣ−ＦＲ１〜ＨＣ−ＦＲ４配列、それぞれ配列番号２６〜２９（ＨＣ−ＦＲ１）、配列番号３１〜３６（ＨＣ−ＦＲ２）、配列番号３８〜４３（ＨＣ−ＦＲ３）および配列番号４５または４６（ＨＣ−ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は、配列番号６１のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号６２のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３は、配列番号６７〜７０から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗シグレック−８抗体は、フレームワーク配列および高頻度可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＬＣ−ＦＲ１〜ＬＣ−ＦＲ４配列、それぞれ配列番号４８または４９（ＬＣ−ＦＲ１）、配列番号５１〜５３（ＬＣ−ＦＲ２）、配列番号５５〜５８（ＬＣ−ＦＲ３）および配列番号６０（ＬＣ−ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。一実施形態において、抗シグレック−８抗体は、フレームワーク配列および高頻度可変領域を含む軽鎖可変ドメインを含み、フレームワーク配列は、ＬＣ−ＦＲ１〜ＬＣ−ＦＲ４配列、それぞれ配列番号４８または４９（ＬＣ−ＦＲ１）、配列番号５１〜５３（ＬＣ−ＦＲ２）、配列番号５５〜５８（ＬＣ−ＦＲ３）および配列番号６０（ＬＣ−ＦＲ４）を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号６４のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は、配列番号７１のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６〜２２から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号２〜１０から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３または２４から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号１１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６〜２２から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号１１〜１４から選択されるアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２３または２４から選択されるアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。これらの抗体の一実施形態において、重鎖可変ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。

【0104】

一部の実施形態において、重鎖ＨＶＲ配列は、次のものを含む：

【化4】

【0105】

一部の実施形態において、重鎖ＨＶＲ配列は、次のものを含む：

【化5】

【0106】

一部の実施形態において、重鎖ＦＲ配列は、次のものを含む：

【化6】

【0107】

一部の実施形態において、軽鎖ＨＶＲ配列は、次のものを含む：

【化7】

【0108】

一部の実施形態において、軽鎖ＨＶＲ配列は、次のものを含む：

【化8】

【0109】

一部の実施形態において、軽鎖ＦＲ配列は、次のものを含む：

【化9】

【0110】

一部の実施形態において、ヒトシグレック−８に特異的に結合する抗シグレック−８抗体（例えば、ヒト化抗シグレック−８抗体）であって、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体であり、
（ａ）
（１）配列番号２６〜２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、
（３）配列番号３１〜３６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、
（５）配列番号３８〜４３から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３および
（７）配列番号４５〜４６から選択されるアミノ酸配列を含むＨＣ−ＦＲ４
を含む重鎖可変ドメイン
および／または
（ｂ）
（１）配列番号４８〜４９から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ１、
（２）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
（３）配列番号５１〜５３から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ２、
（４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、
（５）配列番号５５〜５８から選択されるアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ３、
（６）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３および
（７）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＦＲ４
を含む軽鎖可変ドメイン
を含む抗体が本明細書において提供される。

【0111】

一態様において、配列番号２〜１０から選択される重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号１６〜２２から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、配列番号２〜１０から選択される重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号２３もしくは２４から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、配列番号１１〜１４から選択される重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号１６〜２２から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、配列番号１１〜１４から選択される重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号２３もしくは２４から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、配列番号６の重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号１６もしくは２１から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。

【0112】

一態様において、配列番号１０６〜１０８から選択される重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号１０９〜１１１から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、配列番号１０６の重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号１０９の軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、配列番号１０７の重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号１１０の軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一態様において、配列番号１０８の重鎖可変ドメインを含む、かつ／または配列番号１１１の軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。

【0113】

一部の実施形態において、配列番号２〜１４から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、配列番号１０６〜１０８から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比べて置換、挿入または欠失を含有するが、このアミノ酸配列を含む抗体は、ヒトシグレック−８に結合する能力を保持する。一部の実施形態において、置換、挿入または欠失（例えば、１、２、３、４または５アミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）において生じる。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号１０６〜１０８から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0114】

一部の実施形態において、配列番号１６〜２４から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、配列番号１０９〜１１１から選択されるアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を有するアミノ酸配列は、参照配列と比べて置換、挿入または欠失を含有するが、このアミノ酸配列を含む抗体は、ヒトシグレック−８に結合する能力を保持する。一部の実施形態において、置換、挿入または欠失（例えば、１、２、３、４または５アミノ酸）は、ＨＶＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ）において生じる。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号１６または２１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号１０９〜１１１から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。

【0115】

一部の実施形態において、図１または図３に表される重鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。

【0116】

一部の実施形態において、図２または図３に表される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。

【0117】

一態様において、本発明は、（ａ）図１もしくは図３に示すＶＨ ＨＶＲから選択される１、２もしくは３個のＶＨ ＨＶＲおよび／または（ｂ）図２もしくは図３に示すＶＬ ＨＶＲから選択される１、２もしくは３個のＶＬ ＨＶＲを含む抗シグレック−８抗体を提供する。一態様において、本発明は、図１または図３に示す重鎖可変ドメインから選択される重鎖可変ドメインおよび、図２または図３に示す軽鎖可変ドメインから選択される軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体を提供する。

【0118】

一部の実施形態において、表３に示す抗体、例えば、ＨＡＫＡ抗体、ＨＡＫＢ抗体、ＨＡＫＣ抗体等の重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインを含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。

【0119】

それぞれα、δ、ε、γおよびμと命名された重鎖を有する５クラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。γおよびαクラスは、サブクラスにさらに分けられ、例えば、ヒトは、次のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと命名される複数の多型バリアントで存在することができ（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｅｆｒａｎｃ ２００９年、ｍＡｂｓ １巻、４号１〜７頁において概説）、そのうちいずれかが、本明細書における実施形態の一部における使用に適する。ヒト集団における共通アロタイプバリアントは、文字ａ、ｆ、ｎ、ｚまたはこれらの組合せによって命名されるバリアントである。本明細書における実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含むことができる。さらなる実施形態において、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、このアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従ってナンバリングされる。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ１は、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ４は、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。

【0120】

一部の実施形態において、配列番号７５のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６もしくは７７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗シグレック−８抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖、および／または配列番号７６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含むことができる。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、肥満細胞を枯渇させ、肥満細胞活性化を阻害する。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、活性化された好酸球を枯渇させ、肥満細胞活性化を阻害する。

【0121】

１．抗体親和性
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、マウス抗体２Ｅ２および／またはマウス抗体２Ｃ４と比較した場合に、ほぼ同じもしくはより高い親和性および／またはより高いアビディティーでヒトシグレック−８に結合する。ある特定の実施形態において、本明細書に提供される抗シグレック−８抗体は、≦１μＭ、≦１５０ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦５０ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０^−８Ｍまたはそれに満たない、例えば、１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍ、例えば、１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、マウス抗体２Ｅ２および／またはマウス抗体２Ｃ４よりも約１．５倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍または約１０倍高い親和性で、ヒトシグレック−８に結合する。本明細書における一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および／または配列番号１６もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

【0122】

一実施形態において、抗シグレック−８抗体の結合親和性は、表面プラズモン共鳴アッセイにより決定することができる。例えば、ＫｄまたはＫｄ値は、固定化された抗原ＣＭ５チップにより約１０の応答単位（ＲＵ）で２５℃にてＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用することにより測定することができる。簡潔に説明すると、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｉｎｃ．）は、供給元の説明書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）により活性化される。捕捉抗体（例えば、抗ヒト−Ｆｃ）は、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で希釈され、その後、流速３０μｌ／分で注射し、抗シグレック−８抗体でさらに固定化する。動態測定のため、二量体シグレック−８の２倍系列希釈を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）において２５℃、流速およそ２５μｌ／分で注射する。会合および解離センサーグラムを同時に適合することにより、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算する。例えば、Ｃｈｅｎ， Ｙ．ら（１９９９年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．２９３巻：８６５〜８８１頁を参照されたい。

【0123】

別の実施形態において、バイオレイヤーインターフェロメトリーを使用して、シグレック−８に対する抗シグレック−８抗体の親和性を決定することができる。例示的なアッセイにおいて、シグレック−８−Ｆｃタグ付けタンパク質は、抗ヒト捕捉センサー上に固定化され、増加濃度のマウス、キメラまたはヒト化抗シグレック−８ Ｆａｂ断片と共にインキュベートされて、例えば、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ３８４ Ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）等の機器を使用して親和性測定値を得る。

【0124】

抗シグレック−８抗体の結合親和性は、例えば、関連技術分野において周知の標準技法を使用して、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７巻：２２０頁（１９８０年）に記載されているＳｃａｔｃｈａｒｄ解析によって決定することもできる。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， Ｇ．、Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．５１巻：６６０頁（１９４７年）も参照されたい。

【0125】

２．抗体アビディティー
一実施形態において、抗シグレック−８抗体の結合アビディティーは、表面プラズモン共鳴アッセイにより決定することができる。例えば、ＫｄまたはＫｄ値は、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００を使用することにより測定することができる。捕捉抗体（例えば、ヤギ−抗ヒト−Ｆｃおよびヤギ−抗マウス−Ｆｃ）は、ＣＭ５チップ上に固定化される。フローセルは、抗ヒトまたは抗マウス抗体により固定化することができる。ある温度および流速、例えば、２５℃、流速３０μｌ／分でアッセイを行う。二量体シグレック−８は、アッセイバッファーにおいて様々な濃度で、例えば、１５ｎＭ〜１．８８ｐＭに及ぶ濃度で希釈する。抗体を捕捉し、高速注射、続いて解離を行う。バッファー、例えば、５０ｍＭグリシンｐＨ１．５でフローセルを再生する。空の参照セルおよび複数のアッセイバッファー注射により結果をブランク作成し、１：１グローバルフィットパラメータにより解析する。

【0126】

３．競合アッセイ
競合アッセイを使用して、２種の抗体が、同一もしくは立体的に重複するエピトープを認識することにより、同じエピトープに結合するか、または一方の抗体が、抗原への別の抗体の結合を競合的に阻害するか決定することができる。このようなアッセイは、本技術分野で公知である。典型的には、抗原または抗原発現細胞が、マルチウェルプレートに固定化され、標識抗体の結合を遮断する非標識抗体の能力が測定される。斯かる競合アッセイに一般的な標識は、放射性標識または酵素標識である。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、細胞（例えば、好酸球）の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、本明細書に記載されている２Ｅ２抗体と競合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、細胞（例えば、好酸球）の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、配列番号１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインおよび配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、細胞（例えば、好酸球）の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、本明細書に記載されている２Ｃ４抗体と競合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、細胞（例えば、好酸球）の細胞表面に存在するエピトープへの結合に関して、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（米国特許第８，２０７，３０５号に見出されるものと同様に）および配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（米国特許第８，２０７，３０５号に見出されるものと同様に）を含む抗体と競合する。

【0127】

４．熱的安定性
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８は、熱シフトアッセイにおいて少なくとも約７０℃、少なくとも約７１℃または少なくとも約７２℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。例示的な熱シフトアッセイにおいて、ヒト化抗シグレック−８抗体を含む試料を、ｑＰＣＲサーマルサイクラーにおいて１サイクル毎に１℃増加させつつ７１サイクルにわたり蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）と共にインキュベートして、Ｔｍを決定する。本明細書における一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、マウス２Ｅ２抗体および／またはマウス２Ｃ４抗体と比較した場合に、同様のまたはより高いＴｍを有する。本明細書における一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および／または配列番号１６もしくは２１から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、キメラ２Ｃ４抗体と比較した場合に同じまたはより高いＴｍを有する。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号８５のアミノ酸配列を含む軽鎖を有する抗体と比較した場合に同じまたはより高いＴｍを有する。

【0128】

５．生物学的活性アッセイ
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８は、好酸球のアポトーシスを誘導する。一部の他の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８は、肥満細胞を枯渇させる。細胞のアポトーシスを評価するためのアッセイは、本技術分野において周知であり、例えば、アネキシンＶによる染色およびＴＵＮＮＥＬアッセイが挙げられる。例示的な細胞アポトーシスアッセイにおいて、血液試料由来の新鮮バフィーコートを培地に再懸濁し、９６ウェルＵ字底プレートで平板培養する。抗シグレック−８抗体の一連の系列５倍希釈を各ウェルに添加し、このプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４時間より長くインキュベートする。ＰＢＳに希釈したパラホルムアルデヒドで細胞を固定し、顕微鏡を使用した検出のための好酸球に特異的なコンジュゲートされた抗体で染色する。バフィーコートが抗シグレック−８抗体の存在下でインキュベートされないときと比較した場合に、バフィーコートが抗シグレック−８抗体の存在下でインキュベートされたときの総末梢血白血球における好酸球集団を評価する。別の例示的なアッセイにおいて、血液試料から精製された好酸球（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ好酸球単離キット）を培地に再懸濁し、ＩＬ−５の存在または非存在下で一晩培養する。培養した好酸球をその後、遠心分離によって収集し、培地に再懸濁し、９６ウェルＵ字底プレートで平板培養する。抗シグレック−８抗体の一連の系列５倍希釈を各ウェルに添加し、このプレートを３７℃、５％ＣＯ_２で４時間より長くインキュベートする。本技術分野において周知の標準技法を使用して細胞を固定し、アネキシン−Ｖで染色し、顕微鏡を使用して好酸球の数を検出する。精製された細胞が抗シグレック−８抗体の存在下でインキュベートされないときと比較した場合に、精製された細胞が抗シグレック−８抗体の存在下でインキュベートされたときの試料における好酸球集団を評価する。

【0129】

一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、ＡＤＣＣ活性を誘導する。一部の他の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、ＡＤＣＣ活性によりシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる。一部の実施形態において、組成物は、非フコシル化（すなわち、アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ））抗シグレック−８抗体を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されている非フコシル化抗シグレック−８抗体を含む組成物は、部分的にフコシル化された抗シグレック−８抗体を含む組成物と比較した場合に、ＡＤＣＣ活性を増強する。ＡＤＣＣ活性を評価するためのアッセイは、本技術分野において周知であり、本明細書に記載されている。例示的なアッセイにおいて、ＡＤＣＣ活性を測定するために、エフェクター細胞および標的細胞が使用される。エフェクター細胞の例として、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞ならびにＮＫおよびＬＧＬを含むＰＢＭＣ、または好中球、好酸球およびマクロファージ等、細胞表面にＦｃ受容体を有する白血球が挙げられる。標的細胞は、評価しようとする抗体が認識できる抗原を細胞表面に発現するいずれかの細胞である。斯かる標的細胞の例は、細胞表面にシグレック−８を発現する好酸球である。斯かる標的細胞の別の例は、細胞表面にシグレック−８を発現する肥満細胞である。標的細胞は、細胞溶解の検出を可能にする試薬で標識される。標識のための試薬の例として、クロム酸ナトリウム（Ｎａ_２ ^５１ＣｒＯ_４）等、放射性物質が挙げられる。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４巻、１８１頁（１９６８年）；Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７２巻、２２７頁（１９９４年）；およびＪ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４巻、２９頁（１９９５年）を参照されたい。

【0130】

一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、肥満細胞媒介性活性を阻害する。肥満細胞トリプターゼは、総肥満細胞数および活性化のバイオマーカーとして使用されてきた。例えば、血液または尿中の総および活性トリプターゼならびにヒスタミン、Ｎ−メチルヒスタミンおよび１１−ベータ−プロスタグランジンＦ２を測定して、肥満細胞の低下を評価することができる。例えば、例示的な肥満細胞活性アッセイに関して、米国特許出願公開第２０１１０２９３６３１号を参照されたい。本明細書における実施例２に記載されているアッセイを使用して、肥満細胞における抗シグレック−８抗体のＡＤＣＣおよびアポトーシス活性を評価することもできる。

【0131】

６．融合タンパク質結合アッセイ
融合タンパク質による結合アッセイを使用して、抗体によって認識されるエピトープを決定することができる。エピトープマッピングのために融合タンパク質を使用したアッセイは、本技術分野で公知である。例えば、ヒトＩｇ−Ｆｃに融合されたシグレック−８タンパク質の部分を含む融合タンパク質を、マルチウェルプレートに固定化し、融合タンパク質に結合する抗体の能力を測定する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、配列番号１１６のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、配列番号１１８のアミノ酸配列を含む融合タンパク質に結合する。

【0132】

ＩＩＩ．抗体調製
本明細書に記載されている抗体は、抗体を作製するための本技術分野において利用できる技法を使用して調製されるが、そのうち例示的な方法について次のセクションでより詳細に記載する。

【0133】

１．抗体断片
本発明は、抗体断片を包含する。抗体断片は、酵素消化等の伝統的な手段または組換え技法によって作製することができる。ある特定の状況下で、全抗体ではなく抗体断片を使用する利点がある。ある特定の抗体断片の概説に関しては、Ｈｕｄｓｏｎら（２００３年）Ｎａｔ． Ｍｅｄ．９巻：１２９〜１３４頁を参照されたい。

【0134】

抗体断片の産生のための様々な技法が開発された。伝統的には、このような断片は、インタクト抗体のタンパク質分解的消化により得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）を参照）。しかし、このような断片は現在、組換え宿主細胞によって直接的に産生することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は全て、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、それから分泌させることができ、よって、大量のこのような断片の手軽な産生を可能にする。抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収し、化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）_２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。別のアプローチによると、Ｆ（ａｂ’）_２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片が、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の産生のための他の技法は、当業者には明らかとなろう。ある特定の実施形態において、抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および同第５，５８７，４５８号を参照されたい。ＦｖおよびｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな組み合わせ部位を有する唯一の種である；よって、これらは、ｉｎ ｖｉｖｏ使用における非特異的結合低下に適する可能性がある。ｓｃＦｖ融合タンパク質を構築して、ｓｃＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のいずれかにおけるエフェクタータンパク質の融合体を生じることができる。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編（上掲）を参照されたい。例えば抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されている「線状抗体」となることもできる。斯かる線状抗体は、単一特異性または二重特異性となり得る。

【0135】

２．ヒト化抗体
本発明は、ヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、本技術分野で公知である。例えば、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から導入された１個または複数のアミノ酸残基を有することができる。このような非ヒトアミノ酸残基は多くの場合、「移入」残基と称され、これは典型的には、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は基本的に、高頻度可変領域配列をヒト抗体の相当する配列の代わりに置換することにより、Ｗｉｎｔｅｒの方法に従って行うことができる（Ｊｏｎｅｓら（１９８６年）Ｎａｔｕｒｅ ３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ ３３２巻：３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９巻：１５３４〜１５３６頁）。したがって、斯かる「ヒト化」抗体は、キメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトなヒト可変ドメインに実質的に満たないものが、非ヒト種由来の相当する配列によって置換されている。実際には、ヒト化抗体は典型的には、いくつかの高頻度可変領域残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似性部位由来の残基によって置換されたヒト抗体である。

【0136】

ヒト化抗体の作成において使用するべき軽および重両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性の低下に重要となり得る。いわゆる「ベストフィット（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」方法によると、齧歯類（例えば、マウス）抗体の可変ドメインの配列が、公知ヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対しスクリーニングされる。続いて、齧歯類の配列に最も近縁のヒト配列が、ヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れられる（Ｓｉｍｓら（１９９３年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１巻：２２９６頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１頁）。別の方法は、軽または重鎖の特定のサブグループのあらゆるヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。いくつかの異なるヒト化抗体に同じフレームワークを使用することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９巻：４２８５頁；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２６２３頁）。

【0137】

抗体が、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しつつヒト化されることがさらに一般に望ましい。この目標を達成するため、一方法に従って、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的ヒト化産物の解析のプロセスにより調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用でき、当業者には馴染み深い。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体構造を図解および表示するコンピュータプログラムを利用できる。このような表示の点検は、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性の高い役割の解析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の解析を可能にする。このようにして、標的抗原（複数可）に対する親和性増加等、所望の抗体特徴が達成できるように、レシピエントおよび移入配列からＦＲ残基を選択し、組み合わせることができる。一般に、高頻度可変領域残基は、直接的におよび最も実質的に、抗原結合への影響に関与する。

【0138】

３．ヒト抗体
本発明のヒト抗シグレック−８抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）と公知ヒト定常ドメイン配列（複数可）を組み合わせることにより構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗シグレック−８抗体は、ハイブリドーマ方法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマおよびマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３巻：３００１頁（１９８４年）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１〜６３頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７年）；およびＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：８６頁（１９９１年）によって記載されている。

【0139】

免疫化により、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠失が、内在性抗体産生の完全阻害をもたらすことが記載されている。斯かる生殖系列変異体マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移行は、抗原負荷によるヒト抗体の産生をもたらすであろう。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７巻：３３頁（１９９３年）を参照されたい。

【0140】

遺伝子シャッフリングを使用して、非ヒト（例えば、齧歯類）抗体からヒト抗体を得ることもでき、このヒト抗体は、出発非ヒト抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従い、本明細書に記載されているファージディスプレイ技法によって得られる非ヒト抗体断片の重または軽鎖可変領域のいずれかを、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換え、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖまたはＦａｂキメラの集団を作り出す。抗原による選択は、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖまたはＦａｂの単離をもたらし、ヒト鎖は、一次ファージディスプレイクローンにおける相当する非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を修復する、すなわち、エピトープは、ヒト鎖パートナーの選択を支配する。残存非ヒト鎖を置き換えるために、このプロセスを反復すると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ ＷＯ９３／０６２１３、１９９３年４月１日公開を参照）。ＣＤＲグラフトによる非ヒト抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技法は、非ヒト起源のＦＲ残基もＣＤＲ残基も持たない完全なヒト抗体を提供する。

【0141】

４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２種の異なる抗原に対し結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。ある特定の実施形態において、結合特異性のうち一方は、シグレック−８に対するものであり、他方は、他のいずれかの抗原に向けられている。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体は、シグレック−８の２種の異なるエピトープに結合することができる。二重特異性抗体を使用して、シグレック−８を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を局在化させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）として調製することができる。

【0142】

二重特異性抗体を作成するための方法は、本技術分野で公知である。ＭｉｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７頁（１９８３年）、ＷＯ９３／０８８２９、１９９３年５月１３日公開およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、１０巻：３６５５頁（１９９１年）を参照されたい。二重特異性抗体作製のさらなる詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照されたい。二重特異性抗体は、架橋されたまたは「ヘテロコンジュゲート」抗体を含む。例えば、ヘテロコンジュゲートにおける抗体の一方は、アビジンにカップリングすることができ、他方はビオチンにカップリングすることができる。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作成することができる。適した架橋剤は、本技術分野において周知であり、多数の架橋技法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。

【0143】

５．シングルドメイン抗体
一部の実施形態において、本発明の抗体は、シングルドメイン抗体である。シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体もしくは部分または軽鎖可変ドメインの全体もしくは部分を含む単一のポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）鎖である。ある特定の実施形態において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．；例えば、米国特許第６，２４８，５１６（Ｂ１）号を参照）。一実施形態において、シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全体または部分からなる。

【0144】

６．抗体バリアント
一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましくなり得る。抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な変化を導入することにより、あるいはペプチド合成により調製することができる。斯かる修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換を含む。欠失、挿入および置換のいずれかの組合せを為して、最終構築物に到達することができるが、この最終構築物が、所望の特徴を保有することを条件とする。アミノ酸変更は、配列が作成されるときに対象抗体アミノ酸配列に導入することができる。

【0145】

変異誘発に好まれる位置である、抗体のある特定の残基または領域の同定に有用な方法は、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁によって記載されている「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。それによると、残基または標的残基の群が同定され（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕ等、荷電残基）、中性または負電荷アミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられて、抗原とアミノ酸との相互作用に影響を与える。置換に対する機能的感受性を実証するアミノ酸位置は続いて、置換部位にまたはそれに代えてさらに別のまたは他のバリアントを導入することにより精緻化される。よって、アミノ酸配列変種を導入するための部位は既定であるが、変異の性質それ自体は既定である必要はない。例えば、所定の部位における変異の性能を解析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が、標的コドンまたは領域において行われ、発現された免疫グロブリンが、所望の活性に関してスクリーニングされる。

【0146】

アミノ酸配列挿入は、１残基から１００またはそれを超える残基を含有するポリペプチドの長さに及ぶアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントは、抗体の血清半減期を増加させる酵素またはポリペプチドへの抗体のＮまたはＣ末端の融合を含む。

【0147】

ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるように変更される。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への糖質部分の付着を指す。トリペプチド配列、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘは、プロリンを除くいずれかのアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖質部分の酵素による付着の認識配列である。よって、ポリペプチドにおけるこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的グリコシル化部位を生じる。Ｏ結合型グリコシル化は、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを使用してもよいが、最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるヒドロキシアミノ酸への糖、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトースまたはキシロースのうち１種の付着を指す。

【0148】

抗体に対するグリコシル化部位の付加または欠失は、上述のトリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）のうち１種または複数が作出または除去されるように、アミノ酸配列を変更することにより簡便に達成される。変更は、本来の抗体の配列に対する１個または複数のセリンまたはスレオニン残基の付加、欠失または置換によって為すこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位のため）。

【0149】

抗体が、Ｆｃ領域を含む場合、それに付着した糖質を変更することができる。例えば、抗体のＦｃ領域に付着したフコースを欠如する、成熟糖質構造を有する抗体が、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ．）に記載されている。ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）も参照されたい。抗体のＦｃ領域に付着した糖質において二分（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する抗体は、ＷＯ２００３／０１１８７８、Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔらおよび米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕｍａｎａらにおいて参照される。抗体のＦｃ領域に付着したオリゴ糖において少なくとも１個のガラクトース残基を有する抗体は、ＷＯ１９９７／３００８７、Ｐａｔｅｌらに報告されている。そのＦｃ領域に付着した変更された糖質を有する抗体に関して、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ， Ｓ．）およびＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ， Ｓ．）も参照されたい。修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子に関して、ＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａら）も参照されたい。

【0150】

ある特定の実施形態において、グリコシル化バリアントは、Ｆｃ領域に付着した糖質構造が、フコースを欠如するまたは低下したフコースを有するＦｃ領域を含む。斯かるバリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有する。任意選択で、Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣをさらに改善する１個または複数のアミノ酸置換をそこにさらに含み、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３および／または３３４位（残基のＥｕナンバリング）における置換が挙げられる。「脱フコシル化（ｄｅｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）」または「フコース欠損」抗体に関する刊行物の例として：ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；Ｏｋａｚａｋｉら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．３３６巻：１２３９〜１２４９頁（２００４年）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．８７巻：６１４頁（２００４年）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコシル化を欠損するＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９巻：５３３〜５４５頁（１９８６年）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８（Ａ１）号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ；およびＷＯ２００４／０５６３１２（Ａ１）、Ａｄａｍｓら、特に、実施例１１）と、アルファ−１，６−フコシル基転移酵素遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．８７巻：６１４頁（２００４年））等のノックアウト細胞株と、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ）およびゴルジμ−マンノシダーゼＩＩ（ＭａｎＩＩ）を過剰発現する細胞が挙げられる。

【0151】

野生型ＣＨＯ細胞において産生された同じ抗体におけるフコースの量と比べて低下したフコースを有する抗体が、本明細書において企図される。例えば、抗体は、ネイティブＣＨＯ細胞（例えば、ネイティブＦＵＴ８遺伝子を含有するＣＨＯ細胞等、ネイティブグリコシル化パターンを産生するＣＨＯ細胞）によって産生された場合よりも少量のフコースを有する。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗シグレック−８抗体は、そのＮ結合型グリカンの約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％または１％未満がフコースを含む抗体である。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される抗シグレック−８抗体は、そのＮ結合型グリカンのいずれもフコースを含まない抗体である、すなわち、抗体は、完全にフコースを含有しない、またはフコースを持たない、またはフコシル化されていない、またはアフコシル化されている。フコースの量は、例えばＷＯ２００８／０７７５４６に記載されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に付着したあらゆる糖構造の和と比べて（例えば、複合的、ハイブリッドおよび高マンノース構造）、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することにより決定することができる。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥｕナンバリング）；しかし、Ａｓｎ２９７は、抗体における軽微な配列変種により、２９７位の約±３アミノ酸上流または下流に、すなわち、２９４〜３００位の間に位置することもできる。一部の実施形態において、抗体の重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。

【0152】

一実施形態において、抗体は、その血清半減期を改善するように変更される。抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されている通り、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）に取り込ませることができる。本明細書において、用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のｉｎ ｖｉｖｏ血清半減期の増加の原因となる、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す（ＵＳ２００３／０１９０３１１、米国特許第６，８２１，５０５号；米国特許第６，１６５，７４５号；米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第６，１６５，７４５号；米国特許第５，８３４，５９７号）。

【0153】

別の種類のバリアントは、アミノ酸置換バリアントである。このようなバリアントは、異なる残基によって置き換えられた少なくとも１個のアミノ酸残基を抗体分子に有する。置換変異誘発のための目的の部位は、高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変更も企図される。保存的置換は、表１の見出し「好まれる置換」に示す。斯かる置換が、生物学的活性に望ましい変化をもたらす場合、表１において「例示的な置換」と命名される、またはアミノ酸クラスを参照しつつさらに後述する、より実質的な変化を導入し、その産物をスクリーニングすることができる。

【表1】

【0154】

抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）例えば、シートもしくはヘリックス立体構造としての、置換の区域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、またはｃ）側鎖の嵩の維持におけるその効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は、その側鎖の特性の類似性に従ってグループ化することができる（Ａ． Ｌ． Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、７３〜７５頁、Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５年））：
（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）
（２）無電荷極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）
（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）
（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）

【0155】

あるいは、天然起源の残基は、共通側鎖特性に基づき群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0156】

非保存的置換は、これらのクラスのうちあるクラスから別のクラスへのメンバーの交換を必要とするであろう。斯かる置換された残基は、保存的置換部位または残存（非保存）部位へと導入することもできる。

【0157】

１種類の置換バリアントは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）のうち１個または複数の高頻度可変領域残基の置換に関与する。一般に、さらなる開発のために選択されるその結果得られたバリアント（複数可）は、これを作製する元になった親抗体と比べて修飾された（例えば、改善された）生物学的特性を有するであろう。斯かる置換バリアントを作製するための簡便な仕方は、ファージディスプレイを使用した親和性成熟化に関与する。簡潔に説明すると、いくつかの高頻度可変領域部位（例えば、６〜７部位）を変異させて、各部位にあらゆる可能なアミノ酸置換を作製する。このように作製された抗体は、各粒子内にパッケージされたファージコートタンパク質（例えば、Ｍ１３の遺伝子ＩＩＩ産物）の少なくとも一部への融合体として繊維状ファージ粒子からディスプレイされる。次に、ファージディスプレイされたバリアントは、その生物学的活性（例えば、結合親和性）に関してスクリーニングされる。修飾のための候補高頻度可変領域部位を同定するために、スキャニング変異誘発（例えば、アラニンスキャニング）を行って、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。その代わりにまたはその上、抗原−抗体複合体の結晶構造を解析して、抗体および抗原の間の接触点を同定することが有益となり得る。斯かる接触残基および隣接する残基は、本明細書に詳述されている技法を含む、本技術分野で公知の技法に従った置換の候補である。斯かるバリアントが作製されたら、バリアントのパネルを、本明細書に記載されている技法を含む本技術分野で公知の技法を使用したスクリーニングに付し、１種または複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択することができる。

【0158】

抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、本技術分野で公知の種々の方法によって調製される。このような方法として、天然供給源からの単離（天然起源のアミノ酸配列バリアントの場合）、または先に調製されたバリアントもしくは非バリアントバージョンの抗体のオリゴヌクレオチド媒介性（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発およびカセット変異誘発による調製が挙げられるがこれらに限定されない。

【0159】

本発明の抗体のＦｃ領域に１個または複数のアミノ酸修飾を導入し、これにより、Ｆｃ領域バリアントを作製することが望ましくなり得る。Ｆｃ領域バリアントは、ヒンジシステインの位置を含む１個または複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含むことができる。一部の実施形態において、Ｆｃ領域バリアントは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域を含む。さらなる実施形態において、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含み、このアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔにおける通りのＥＵインデックスに従ってナンバリングされる。

【0160】

本明細書および本技術分野が教示するところに従って、一部の実施形態において、本発明の抗体が、野生型カウンターパート抗体と比較して１個または複数の変更を、例えば、Ｆｃ領域に含むことができることが企図される。それにもかかわらず、このような抗体は、その野生型カウンターパートと比較した場合に、治療的有用性に必要とされる実質的に同じ特徴を保持するであろう。例えば、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている通り、例えば、変更された（すなわち、改善または縮小された）Ｃ１ｑ結合および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらすであろう、ある特定の変更をＦｃ領域に為すことができることが考えられる。Ｆｃ領域バリアントの他の例に関して、ＤｕｎｃａｎおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ ３２２巻：７３８〜４０頁（１９８８年）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；およびＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。ＷＯ００／４２０７２（Ｐｒｅｓｔａ）およびＷＯ２００４／０５６３１２（Ｌｏｗｍａｎ）は、ＦｃＲに対し改善または縮小された結合を有する抗体バリアントについて記載する。これらの特許公報の内容は、特に参照により本明細書に組み入れられる。Ｓｈｉｅｌｄｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．９巻（２号）：６５９１〜６６０４頁（２００１年）も参照されたい。増加された半減期および胎児への母系ＩｇＧの移行の原因となる、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７巻：５８７頁（１９７６年）およびＫｉｍら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４巻：２４９頁（１９９４年））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎら）に記載されている。このような抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する、１個または複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。変更されたＦｃ領域アミノ酸配列および増加または減少されたＣ１ｑ結合能を有するポリペプチドバリアントは、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号、ＷＯ９９／５１６４２に記載されている。これらの特許公報の内容は、特に参照により本明細書に組み入れられる。Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４巻：４１７８〜４１８４頁（２０００年）も参照されたい。

【0161】

７．ベクター、宿主細胞および組換え方法
本発明の抗体の組換え産生のため、これをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来手順を使用して（例えば、抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離および配列決定される。多くのベクターを利用できる。ベクターの選択は、一部には、使用するべき宿主細胞に依存する。一般に、宿主細胞は、原核生物または真核生物（一般には哺乳動物）起源のいずれかである。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ定常領域を含むいかなるアイソタイプの定常領域をこの目的のために使用してもよく、いかなるヒトまたは動物種から斯かる定常領域を得てもよいことが認められよう。

【0162】

原核生物（Ｐｒｏｋａｒｖｏｔｉｃ）宿主細胞を使用した抗体の作製：
ａ）ベクター構築
本発明の抗体のポリペプチド構成成分をコードするポリヌクレオチド配列は、標準組換え技法を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列は、ハイブリドーマ細胞等、抗体産生細胞から単離および配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド合成機またはＰＣＲ技法を使用して合成することができる。得られた後に、ポリペプチドをコードする配列は、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製および発現することができる組換えベクターに挿入する。利用できる本技術分野で公知の多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入されるべき核酸のサイズおよびベクターで形質転換されるべき特定の宿主細胞に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現またはその両方）およびこれが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて様々な構成成分を含有する。ベクター構成成分として、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸挿入物および転写終結配列が一般に挙げられるがこれらに限定されない。

【0163】

一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよび対照配列を含有するプラスミドベクターは、このような宿主に関連して使用される。ベクターは通常、複製部位と共に、形質転換細胞における表現型選択をもたらすことができるマーキング配列を保有する。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは典型的に、Ｅ．ｃｏｌｉ種に由来するプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン（Ａｍｐ）およびテトラサイクリン（Ｔｅｔ）抵抗性をコードする遺伝子を含有し、これにより、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２、その派生体または他の微生物プラスミドまたはバクテリオファージは、内在性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含有することもできるまたは含有するように修飾することもできる。特定の抗体の発現のために使用されるｐＢＲ３２２派生体の例は、Ｃａｒｔｅｒら、米国特許第５，６４８，２３７号に詳細に記載されている。

【0164】

加えて、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび対照配列を含有するファージベクターは、このような宿主に関連した形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ．ＴＭ．−１１等、バクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＥ３９２等、感受性宿主細胞の形質転換に使用することができる組換えベクターの作成において利用することができる。

【0165】

本発明の発現ベクターは、ポリペプチド構成成分のそれぞれをコードする２個またはそれを超えるプロモーター−シストロンペアを含むことができる。プロモーターは、その発現をモジュレートするシストロンの上流（５’）に位置する非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２種のクラス、誘導性および構成的に分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば、栄養素の存在もしくは非存在または温度変化に応答して、その制御下でシストロンの転写のレベル増加を開始するプロモーターである。

【0166】

種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、本発明のベクターへと単離されたプロモーター配列を挿入することにより、選択されたプロモーターは、軽または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作動可能に連結することができる。ネイティブプロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方を使用して、標的遺伝子の増幅および／または発現を方向付けることができる。一部の実施形態において、一般に、ネイティブ標的ポリペプチドプロモーターと比較した場合に、より優れた転写および発現された標的遺伝子のより高い収量を可能にするため、異種プロモーターが利用される。

【0167】

原核生物宿主による使用に適したプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、β−ガラクタマーゼ（ｇａｌａｃｔａｍａｓｅ）およびラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系ならびにｔａｃまたはｔｒｃプロモーター等のハイブリッドプロモーターを含む。しかし、細菌において機能的な他のプロモーター（他の公知細菌またはファージプロモーター等）も同様に適する。これらのヌクレオチド配列は発表されているため、当業者であれば、任意の必要とされる制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、操作可能にこれらを標的の軽および重鎖をコードするシストロンにライゲーションすることができる（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら（１９８０年）Ｃｅｌｌ ２０巻：２６９頁）。

【0168】

本発明の一態様において、組換えベクター内の各シストロンは、膜を横切っての発現されたポリペプチドのトランスロケーションを方向付ける分泌シグナル配列構成成分を含む。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成成分となり得る、あるいはベクターに挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部となり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列となるべきである。異種ポリペプチドにとってネイティブなシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核生物宿主細胞のため、シグナル配列は、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡおよびＭＢＰからなる群から例えば選択される原核生物シグナル配列によって置換される。本発明の一実施形態において、発現系の両方のシストロンで使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはそのバリアントである。

【0169】

別の態様において、本発明に係る免疫グロブリンの産生は、宿主細胞の細胞質において起こることができ、したがって、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在を必要としない。これに関して、免疫グロブリン軽および重鎖は、細胞質内で発現され、フォールドされ、アセンブルされて、機能的免疫グロブリンを形成する。ある特定の宿主系統（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ｔｒｘＢ−系統）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質条件を提供し、これにより、発現されたタンパク質サブユニットの適切なフォールディングおよびアセンブリを可能にする。ＰｒｏｂａおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｇｅｎｅ、１５９巻：２０３頁（１９９５年）。

【0170】

本発明の抗体は、分泌され適切にアセンブルされた本発明の抗体の収量を最大化するために、発現されたポリペプチド構成成分の定量的な比をモジュレートすることができる発現系を使用することにより産生することもできる。斯かるモジュレーションは、少なくとも一部には、ポリペプチド構成成分の翻訳強度を同時にモジュレートすることにより達成される。

【0171】

翻訳強度をモジュレートするための一技法は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号に開示されている。これは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）のバリアントを利用する。所定のＴＩＲのため、一連のアミノ酸または核酸配列バリアントをある範囲の翻訳強度で作り出し、これにより、特異的な鎖の所望の発現レベルにこの因子を調整するための簡便な手段を提供することができる。ＴＩＲバリアントは、アミノ酸配列を変更し得るコドン変化をもたらす従来の変異誘発技法によって作製することができる。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列の変化は、サイレントである。ＴＩＲにおける変更は、例えば、シグナル配列における変更と共に、シャインダルガーノ配列の数またはスペーシングの変更を含むことができる。変異体シグナル配列を作製するための一方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）、コード配列の開始における「コドンバンク」の作製である。これは、各コドンの第３のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができる；その上、ロイシン、セリンおよびアルギニン等、一部のアミノ酸は、バンクの作成において複雑さを加えることができる複数の第１および第２の位置を有する。この変異誘発方法は、Ｙａｎｓｕｒａら（１９９２年）ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４巻：１５１〜１５８頁に詳細に記載されている。

【0172】

一実施形態において、ベクターのセットが、その中のシストロン毎にある範囲のＴＩＲ強度で作製される。この限定されたセットは、各鎖の発現レベルの比較と共に、様々なＴＩＲ強度組合せ下における所望の抗体産物の収量をもたらす。ＴＩＲ強度は、Ｓｉｍｍｏｎｓら、米国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されている通り、レポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度比較に基づき、所望の個々のＴＩＲが選択されて、本発明の発現ベクター構築物において組み合わされる。

【0173】

本発明の抗体の発現に適した原核生物宿主細胞は、グラム陰性またはグラム陽性生物等、古細菌および真正細菌を含む。有用な細菌の例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｒｈｉｚｏｂｉａ、ＶｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａまたはＰａｒａｃｏｃｃｕｓが挙げられる。一実施形態において、グラム陰性細胞が使用される。一実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、本発明のための宿主として使用される。Ｅ．ｃｏｌｉ系統の例として、系統Ｗ３１１０（Ｂａｃｈｍａｎｎ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９８７年）、１１９０〜１２１９頁；ＡＴＣＣ寄託番号２７，３２５）および遺伝子型Ｗ３１１０ ΔｆｈｕＡ（ΔｔｏｎＡ）ｐｔｒ３ ｌａｃ Ｉｑ ｌａｃＬ８ ΔｏｍｐＴΔ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１ ｋａｎＲを有する系統３３Ｄ３を含むその派生体（米国特許第５，６３９，６３５号）が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉλ １７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）およびＥ．ｃｏｌｉ ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）等、他の系統およびその派生体も適している。これらの例は、限定的ではなく説明的である。定義された遺伝子型を有する上述の細菌のうちいずれかの派生体を構築するための方法は、本技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８巻：３０９〜３１４頁（１９９０年）に記載されている。細菌の細胞におけるレプリコンの複製能（ｒｅｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ）を考慮に入れて適切な細菌を選択することが一般に必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７またはｐＫＮ４１０等、周知のプラスミドが、レプリコンの供給に使用される場合、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＳｅｒｒａｔｉａまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種は、宿主として適切に使用することができる。典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌するべきであり、望ましくは、追加的なプロテアーゼ阻害剤を細胞培養において取り込むことができる。

【0174】

ｂ）抗体産生
宿主細胞は、上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するための、必要に応じて修飾された従来の栄養培地において培養される。

【0175】

形質転換は、ＤＮＡが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体により複製可能となるような、原核生物宿主へのＤＮＡの導入を意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換は、斯かる細胞に適切な標準技法を使用して行われる。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁障壁を含有する細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための別の方法は、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技法は、エレクトロポレーションである。

【0176】

本発明のポリペプチドの産生に使用される原核細胞は、本技術分野で公知の、選択された宿主細胞の培養に適した培地において育成される。適した培地の例として、ルリアブロス（ＬＢ）に必要な栄養素補充物質を加えたものが挙げられる。一部の実施形態において、培地は、発現ベクターの構築に基づき選ばれる選択用薬剤も含有して、この発現ベクターを含有する原核細胞の成長を選択的に可能にする。例えば、アンピシリン抵抗性遺伝子を発現する細胞の成長のために、培地にアンピシリンが添加される。

【0177】

炭素、窒素および無機リン酸塩源に加えて任意の必要な補充物質が、単独でまたは複合的窒素源等の別の補充物質もしくは培地との混合物として導入されて、適切な濃度で含まれていてもよい。任意選択で、培養培地は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトールおよびジチオスレイトールからなる群から選択される１種または複数の還元剤を含有することができる。

【0178】

原核生物宿主細胞は、適した温度で培養される。ある特定の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉの成長のため、成長温度は、約２０℃から約３９℃、約２５℃から約３７℃の範囲であるか、または約３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜約９に及ぶいずれかのｐＨとなり得る。ある特定の実施形態において、Ｅ．ｃｏｌｉのため、ｐＨは、約６．８〜約７．４または約７．０である。

【0179】

誘導性プロモーターが、本発明の発現ベクターにおいて使用される場合、タンパク質発現は、プロモーターの活性化に適した条件下で誘導される。本発明の一態様において、ＰｈｏＡプロモーターが、ポリペプチドの転写を制御するために使用される。したがって、形質転換された宿主細胞は、誘導のためのリン酸塩制限培地において培養される。ある特定の実施形態において、リン酸塩制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ．培地である（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２年）２６３巻：１３３〜１４７頁を参照）。本技術分野で公知の通り、用いられているベクター構築物に従って、種々の他の誘導因子を使用することができる。

【0180】

一実施形態において、本発明の発現されたポリペプチドは、宿主細胞の周辺質に分泌され、そこから回収される。タンパク質回収は、典型的には、一般に、浸透圧ショック、超音波処理または溶解等の手段による微生物の崩壊に関与する。細胞が崩壊されたら、細胞デブリまたは細胞全体は、遠心分離または濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーによってさらに精製することができる。あるいは、タンパク質は、培養培地へと輸送され、そこに単離されてもよい。細胞をこの培養物から除去し、産生されたタンパク質のさらなる精製のために培養上清を濾過および濃縮することができる。発現されたポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロットアッセイ等、一般的に公知の方法を使用してさらに単離および同定することができる。

【0181】

本発明の一態様において、抗体産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。様々な大規模フェドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵手順が、組換えタンパク質の産生のために利用できる。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの容量、ある特定の実施形態において、約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。このような発酵槽は、酸素および栄養素、特にグルコースを分布させるための撹拌機羽根車を使用する。小規模発酵は一般に、およそ１００リットル以下の容積測定的容量の発酵槽における発酵を指し、約１リットル〜約１００リットルに及び得る。

【0182】

発酵プロセスにおいて、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が適した条件下で所望の密度、例えば、約１８０〜２２０のＯＤ５５０まで成長した後に開始され、このステージにおいて、細胞は定常期初期にある。本技術分野で公知かつ上述の通り、用いられているベクター構築物に従って、種々の誘導因子を使用することができる。誘導に先立ちより短い期間、細胞を育成することができる。細胞は通常、約１２〜５０時間誘導されるが、より長いまたはより短い誘導時間を使用してもよい。

【0183】

本発明のポリペプチドの産生収量および質を改善するために、様々な発酵条件を修飾することができる。例えば、分泌された抗体ポリペプチドの適切なアセンブリおよびフォールディングを改善するために、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤおよび／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を有するペプチジルプロリルｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−イソメラーゼ）等、シャペロンタンパク質を過剰発現する追加的なベクターを使用して、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞において産生された異種タンパク質の適切なフォールディングおよび溶解度を容易にすることが実証された。Ｃｈｅｎら（１９９９年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７４巻：１９６０１〜１９６０５頁；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０８３，７１５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第６，０２７，８８８号；ＢｏｔｈｍａｎｎおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５巻：１７１００〜１７１０５頁；ＲａｍｍおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（２０００年）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７５巻：１７１０６〜１７１１３頁；Ａｒｉｅら（２００１年）Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３９巻：１９９〜２１０頁。

【0184】

発現された異種タンパク質（特に、タンパク質分解に感受性のタンパク質）のタンパク質分解を最小化するために、タンパク質分解酵素を欠損したある特定の宿主系統を本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞系統を修飾して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩおよびこれらの組合せ等、公知の細菌プロテアーゼをコードする遺伝子に遺伝的変異（複数可）を生じることができる。いくつかのＥ．ｃｏｌｉプロテアーゼ欠損系統を利用することができ、例えば、Ｊｏｌｙら（１９９８年）（上掲）；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，２６４，３６５号；Ｇｅｏｒｇｉｏｕら、米国特許第５，５０８，１９２号；Ｈａｒａら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ、２巻：６３〜７２頁（１９９６年）に記載されている。

【0185】

一実施形態において、タンパク質分解酵素を欠損し、１種または複数のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドにより形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ系統が、本発明の発現系における宿主細胞として使用される。

【0186】

ｃ）抗体精製
一実施形態において、本明細書における産生された抗体タンパク質は、さらに精製されて、さらなるアッセイおよび使用のために実質的に均一な調製物を得る。本技術分野で公知の標準タンパク質精製方法を用いることができる。次の手順は、適した精製手順に例示的である：免疫親和性またはイオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、ＤＥＡＥ等、シリカまたはカチオン交換樹脂におけるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈殿および例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を使用したゲル濾過。

【0187】

一態様において、固相に固定化されたプロテインＡが、本発明の抗体産物の免疫親和性精製のために使用される。プロテインＡは、抗体のＦｃ領域に高親和性で結合する、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ由来の４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Ｌｉｎｄｍａｒｋら（１９８３年）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．６２巻：１〜１３頁。プロテインＡが固定化される固相は、ガラスもしくはシリカ表面を含むカラム、またはポア制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ）ガラスカラムまたはケイ酸カラムであり得る。一部の適用において、カラムは、グリセロール等の試薬でコーティングされて、夾雑物の非特異的接着性を予防する可能性がある。

【0188】

精製の第１のステップとして、上述の細胞培養物に由来する調製物をプロテインＡ固定化固相にアプライして、プロテインＡへの目的の抗体の特異的結合を可能にすることができる。続いて、固相を洗浄して、固相に非特異的に結合した夾雑物を除去する。最後に、溶出により固相から目的の抗体を回収する。

【0189】

真核生物宿主細胞を使用した抗体の作製：
真核生物宿主細胞における使用のためのベクターは一般に、次の非限定的構成成分のうち１種または複数を含む：シグナル配列、複製起点、１種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列。

【0190】

ａ）シグナル配列構成成分
真核生物宿主細胞における使用のためのベクターは、目的の成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有する、シグナル配列または他のポリペプチドを含有することもできる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞により認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）配列となり得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列およびウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。斯かる前駆体領域のためのＤＮＡは、抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠でライゲーションされる。

【0191】

ｂ）複製起点
一般に、複製起点構成成分は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない。例えば、ＳＶ４０起点は、典型的には、初期プロモーターを含有するという理由でのみ使用することができる。

【0192】

ｃ）選択遺伝子構成成分
発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも命名される選択遺伝子を含有することができる。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートもしくはテトラサイクリンに対する抵抗性を付与する、（ｂ）関連する場合、栄養要求性欠乏を補完する、または（ｃ）複合培地から得ることができない重大な栄養素を供給するタンパク質をコードする。

【0193】

選択スキームの一例は、宿主細胞の成長を停止させるための薬物を利用する。異種遺伝子による形質転換が成功した細胞は、薬物抵抗性を付与するタンパク質を産生し、これにより、この選択レジメンを生き残る。斯かる優性選択の例は、薬物、ネオマイシン、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンを使用する。

【0194】

哺乳動物細胞に適した選択可能マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等、抗体核酸を取り込む能力のある細胞の同定を可能にするマーカーである。

【0195】

例えば、一部の実施形態において、ＤＨＦＲ選択遺伝子で形質転換された細胞は先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート（Ｍｔｘ）を含有する培養培地において全形質転換体を培養することにより同定される。一部の実施形態において、野生型ＤＨＦＲが用いられる場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性を欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９０９６）。

【0196】

あるいは、抗体、野生型ＤＨＦＲタンパク質およびアミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）等の別の選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内在性ＤＨＦＲを含有する野生型宿主）は、アミノグリコシド系抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシンまたはＧ４１８等、この選択可能マーカーのための選択用薬剤を含有する培地における細胞成長により選択することができる。米国特許第４，９６５，１９９号を参照されたい。宿主細胞は、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）を欠損した細胞株を含む、ＮＳ０、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶまたは派生体を含むことができる。哺乳動物細胞のための選択可能マーカーとしてのＧＳの使用のための方法は、米国特許第５，１２２，４６４号および米国特許第５，８９１，６９３号に記載されている。

【0197】

ｄ）プロモーター構成成分
発現およびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、目的のポリペプチド（例えば、抗体）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含有する。プロモーター配列は、真核生物で公知である。例えば、実際ではあらゆる真核生物遺伝子は、転写が開始される部位からおよそ２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始から７０〜８０塩基上流に見出された別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは、いかなるヌクレオチドでもよい。大部分の真核生物遺伝子の３’端には、コード配列の３’端へのポリＡテイルの付加のためのシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列がある。ある特定の実施形態において、これらの配列のいずれかまたは全てを、真核生物発現ベクターに適切に挿入することができる。

【0198】

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２等）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびサルウイルス４０（ＳＶ４０）等、ウイルスのゲノムから、あるいは異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御される、ただし、斯かるプロモーターは、宿主細胞系と適合性であること。

【0199】

ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含有するＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。この系の修飾は、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのマウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現について記載するＲｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７巻：５９８〜６０１頁（１９８２年）も参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。

【0200】

ｅ）エンハンサーエレメント構成成分
高等真核生物による本発明の抗体をコードするＤＮＡの転写は、多くの場合、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）から現在公知である。しかし典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用されるであろう。例として、複製起点の後方（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、マウスサイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後方のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントについて記載するＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ ２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列に対し５’位または３’位においてベクターにスプライスすることができるが、一般に、プロモーターから５’の部位に位置する。

【0201】

ｆ）転写終結構成成分
真核生物宿主細胞において使用される発現ベクターは、転写の終結およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含有することもできる。斯かる配列は、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および場合により３’非翻訳領域から一般的に利用できる。このような領域は、抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。有用な転写終結構成成分の１種は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに開示されている発現ベクターを参照されたい。

【0202】

ｇ）宿主細胞の選択および形質転換
本明細書におけるベクターにおけるＤＮＡのクローニングまたは発現に適した宿主細胞は、脊椎動物宿主細胞を含む、本明細書に記載されている高等真核生物細胞を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の繁殖は、ルーチン手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系列（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓系列（懸濁培養における育成のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ＣＨＯＫ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞または派生体およびヒトヘパトーマ系列（Ｈｅｐ Ｇ２）である。

【0203】

宿主細胞は、抗体産生のために上述の発現またはクローニングベクターにより形質転換され、プロモーターを誘導するため、形質転換体を選択するため、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために、必要に応じて修飾された従来の栄養培地において培養される。

【0204】

ｈ）宿主細胞の培養
本発明の抗体の産生に使用される宿主細胞は、種々の培地において培養することができる。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）およびダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）等、市販の培地は、宿主細胞の培養に適する。加えて、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ．５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同第４，６５７，８６６号；同第４，９２７，７６２号；同第４，５６０，６５５号；もしくは同第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または米国再発行特許（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｒｅ．）３０，９８５に記載されている培地のいずれかを宿主細胞のための培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれも、ホルモンおよび／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子等）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩等）、バッファー（ＨＥＰＥＳ等）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジン等）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物等）、微量元素（マイクロモル濃度範囲内の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義）ならびにグルコースまたは等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。他のいずれかの補充物質が、当業者に公知の適切な濃度で含まれていてもよい。温度、ｐＨその他等、培養条件は、発現のために選択された宿主細胞により以前に使用された条件であり、当業者には明らかとなろう。

【0205】

ｉ）抗体の精製
組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内に産生することができる、あるいは培地に直接的に分泌することができる。抗体が、細胞内に産生される場合、第１のステップとして、宿主細胞または溶解された断片のあらゆる粒子状デブリは、例えば、遠心分離または限外濾過により除去することができる。抗体が、培地に分泌される場合、斯かる発現系から得た上清は、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して先ず濃縮することができる。ＰＭＳＦ等、プロテアーゼ阻害剤が、タンパク質分解を阻害するために前述ステップのいずれかに含まれていてよく、抗生物質が、偶発的な夾雑物の成長を予防するために含まれていてよい。

【0206】

細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析および親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、親和性クロマトグラフィーが、簡便な技法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在するいずれかの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、全マウスアイソタイプおよびヒトγ３に推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．５巻：１５６７ １５７５頁（１９８６年））。親和性リガンドが付着するマトリックスは、アガロースであってよいが、他のマトリックスも利用できる。ポア制御ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン等、機械的に安定的なマトリックスは、アガロースにより達成され得るものよりも速い流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体が、ＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が、精製に有用である。イオン交換カラムにおける分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカにおけるクロマトグラフィー、ヘパリンにおけるクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム等）におけるＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿等、タンパク質精製のための他の技法も、回収しようとする抗体に応じて利用できる。

【0207】

任意の予備的精製ステップ（複数可）の後に、目的の抗体および夾雑物を含む混合物は、例えば、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で行われる約２．５〜４．５の間のｐＨの溶出バッファーを使用した低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにより、さらなる精製に付すことができる。

【0208】

一般に、研究、検査および臨床用途における使用のための抗体を調製するための様々な方法論は、本技術分野において十分に確立されており、上述の方法論と一貫しており、および／または当業者によって特定の目的の抗体に適切であると考慮される。

【0209】

非フコシル化抗体の産生
フコシル化の程度が低下した抗体を調製するための方法が本明細書に提供されている。例えば、本明細書において企図される方法として、タンパク質フコシル化が欠損した細胞株の使用（例えば、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞、アルファ−１，６−フコシル基転移酵素遺伝子ノックアウトＣＨＯ細胞、β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩを過剰発現する細胞およびゴルジμ−マンノシダーゼＩＩをさらに過剰発現する細胞等）および抗体の産生に使用される細胞培養培地におけるフコースアナログ（複数可）の添加が挙げられるがこれらに限定されない。Ｒｉｐｋａら、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９巻：５３３〜５４５頁（１９８６年）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８（Ａ１）号、Ｐｒｅｓｔａ， Ｌ；ＷＯ２００４／０５６３１２（Ａ１）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉら、Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ．８７巻：６１４頁（２００４年）；および米国特許第８，５７４，９０７号を参照されたい。抗体のフコース含量を低下させるための追加的な技法は、米国特許出願公開第２０１２／０２１４９７５号に記載されているＧｌｙｍａｘｘ技術を含む。抗体のフコース含量を低下させるための追加的な技法は、抗体の産生に使用される細胞培養培地における１種または複数のグリコシダーゼ阻害剤の添加も含む。グリコシダーゼ阻害剤は、α−グルコシダーゼＩ、α−グルコシダーゼＩＩおよびα−マンノシダーゼＩを含む。一部の実施形態において、グリコシダーゼ阻害剤は、α−マンノシダーゼＩの阻害剤である（例えば、キフネンシン）。

【0210】

本明細書において、「コアのフコシル化」は、Ｎ結合型グリカンの還元末端におけるＮ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」）へのフコースの付加（「フコシル化」）を指す。斯かる方法によって産生された抗体およびその組成物も提供される。

【0211】

一部の実施形態において、Ｆｃ領域（またはドメイン）に結合した複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖のフコシル化が低下される。本明細書において、「複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖」は、典型的に、アスパラギン２９７（Ｋａｂａｔの番号に従う）に結合されるが、複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖は、他のアスパラギン残基に連結されてもよい。「複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖」は、コア構造の非還元末端にマンノースのみが取り込まれた高マンノース型の糖鎖を除外するが、１）コア構造の非還元末端側が、ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（「ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ」とも称される）の１個または複数の分枝を有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が、シアル酸、二分Ｎ−アセチルグルコサミンその他を任意選択で有する複合型；または２）コア構造の非還元末端側が、高マンノースＮ−グリコシド結合型糖鎖および複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖の両方の分枝を有するハイブリッド型を含む。

【0212】

一部の実施形態において、「複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖」は、コア構造の非還元末端側が、ガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（「ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ」とも称される）の０、１個または複数の分枝を有し、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側が、シアル酸、二分Ｎ−アセチルグルコサミンその他等の構造を任意選択でさらに有する複合型を含む。

【0213】

本方法によると、典型的には、ごく微量のフコースが、複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖（複数可）に取り込まれる。例えば、様々な実施形態において、組成物中、抗体の約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満または約１％未満が、フコースによりコアがフコシル化されている。一部の実施形態において、組成物中、抗体の実質的に全てが、フコースによりコアがフコシル化されていない（すなわち、約０．５％未満が、フコシル化されている）。一部の実施形態において、組成物中、抗体の約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超または約９９％超が、フコシル化されていない。

【0214】

一部の実施形態において、Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖の実質的に全てが、フコース残基を含有しない（すなわち、約０．５％未満が、フコース残基を含有する）抗体が本明細書において提供される。一部の実施形態において、抗体重鎖の少なくとも１または２つがフコシル化されていない抗体が本明細書において提供される。

【0215】

上述の通り、種々の哺乳動物宿主−発現ベクター系を利用して、抗体を発現させることができる。一部の実施形態において、培養培地は、フコースを補充されない。一部の実施形態において、有効量のフコースアナログが、培養培地に添加される。この文脈において、「有効量」は、抗体の複合Ｎ−グリコシド結合型糖鎖へのフコース取り込みを、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％減少させるのに十分なアナログの量を指す。一部の実施形態において、本方法によって産生された抗体は、フコースアナログの非存在下で培養された宿主細胞から産生された抗体と比較した場合に、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％または少なくとも約５０％のコアがフコシル化されていないタンパク質（例えば、コアのフコシル化が欠如している）を含む。

【0216】

フコースが糖鎖の還元端におけるＮ−アセチルグルコサミンに結合されていない糖鎖、対、フコースが糖鎖の還元端におけるＮ−アセチルグルコサミンに結合されている糖鎖の含量（例えば、比）は、例えば、実施例に記載されている通りに決定することができる。他の方法は、ヒドラジン分解または酵素消化（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３巻：Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｔｕｄｙｉｎｇ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｕｇａｒ Ｃｈａｉｎ（Ｊａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ）、Ｒｅｉｋｏ Ｔａｋａｈａｓｈｉ編集（１９８９年）を参照）、放出された糖鎖の蛍光標識または放射性同位元素標識と、続くクロマトグラフィーによる標識された糖鎖の分離を含む。また、放出された糖鎖の組成は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ方法によって鎖を解析することにより決定することができる（例えば、Ｊ． Ｌｉｑ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．６巻：１５５７頁（１９８３年）を参照）（全般的には、米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号を参照）。

【0217】

ＩＶ．組成物
一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体のいずれかを含む組成物（例えば、医薬組成物）も本明細書に提供される。一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体を含む組成物であって、抗体が、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に連結されたＮ−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖の約５０％未満が、フコース残基を含有する組成物が本明細書において提供される。一部の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体を含む組成物であって、抗体が、Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域に連結されたＮ−グリコシド結合型炭水化物鎖とを含み、Ｎ−グリコシド結合型炭水化物鎖の実質的に全てが、フコース残基を含有しない組成物が本明細書において提供される。

【0218】

任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と、所望の程度の純度を有する活性成分とを混合することにより、貯蔵のための治療用製剤が調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｋｌｉｎｓ， Ｐｕｂ．、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｐａ．２０００年）。許容される担体、賦形剤または安定剤は、用いられている投薬量および濃度ではレシピエントに対し無毒性であり、バッファー、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、二亜硫酸ナトリウム含む抗酸化剤；保存料、等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）、安定剤、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ＥＤＴＡ等のキレート剤および／または非イオン性界面活性剤を含む。

【0219】

特に、安定性がｐＨ依存性である場合、バッファーを使用して、治療上の有効性を最適化する範囲にｐＨを制御することができる。バッファーは、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭに及ぶ濃度で存在することができる。本発明による使用に適した緩衝剤は、有機および無機酸ならびにこれらの塩の両方を含む。例えば、クエン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、シュウ酸塩、乳酸塩、酢酸塩である。その上、バッファーは、ヒスチジンおよびＴｒｉｓ等のトリメチルアミン塩で構成され得る。

【0220】

保存料を添加して微生物の成長を予防することができ、これは典型的には、約０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲内で存在する。本発明による使用に適した保存料は、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノールおよびｍ−クレゾールを含む。

【0221】

「安定剤」として公知の場合もある等張化剤は、組成物における液体の張度を調整または維持するために存在することができる。タンパク質および抗体等、大型の荷電生体分子と共に使用される場合、これは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、これにより、分子間および分子内相互作用の可能性を減らすことができるため、多くの場合「安定剤」と命名される。等張化剤は、他の成分の相対量を考慮に入れつつ、約０．１％〜約２５重量％の間または約１〜約５重量％の間のいずれかの量で存在することができる。一部の実施形態において、等張化剤は、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトール等、多価糖アルコール、三価またはより高次の糖アルコールを含む。

【0222】

追加的な賦形剤は、次のうち１種または複数として機能し得る薬剤を含む：（１）増量剤、（２）溶解促進剤（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）、（３）安定剤および（４）変性または容器壁への接着を予防する薬剤。斯かる賦形剤は、次のものを含む：多価糖アルコール（上に列挙）；アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リシン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等、アミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイノシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール等、有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム等、含硫還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン等、低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドン等、親水性ポリマー；単糖（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノース等、三糖；ならびにデキストリンまたはデキストラン等、多糖。

【0223】

非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても公知）は、治療剤の可溶化を助けると共に、撹拌誘導性凝集から治療タンパク質を保護するために存在することができ、これは、活性治療タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤をせん断表面応力に曝露させることもできる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌまたは約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲内で存在する。一部の実施形態において、非イオン性界面活性剤は、約０．００１％〜約０．１％ｗ／ｖまたは約０．０１％〜約０．１％ｗ／ｖまたは約０．０１％〜約０．０２５％ｗ／ｖの範囲内で存在する。

【0224】

適した非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０等）、ポロクサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８等）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０等）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素付加ヒマシ油１０、５０および６０、グリセロールモノステアレート、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース（ｃｅｌｌｕｏｓｅ）ならびにカルボキシメチルセルロースを含む。使用することができるアニオン性洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウムおよびスルホン酸ジオクチルナトリウムを含む。カチオン性洗剤は、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムを含む。

【0225】

製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用するためには、無菌でなければならない。製剤は、滅菌濾過膜を通した濾過により滅菌することができる。本明細書における治療用組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能な共栓を有するバイアルに入れられる。

【0226】

投与の経路は、適した方式での長期間に及ぶ単一または複数のボーラスまたは注入、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内もしくは関節内経路による注射または注入、局所的投与、吸入または徐放もしくは延長放出手段による等、公知かつ受け入れられた方法に従う。

【0227】

本明細書における製剤は、処置されている特定の適応症の必要に応じて、１種より多くの活性化合物、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有する化合物を含有することもできる。その代わりにまたはそれに加えて、組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカインまたは成長阻害薬剤を含むことができる。斯かる分子は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて適切に存在する。

【0228】

Ｖ．処置方法
対象においてシグレック−８を発現する細胞によって媒介される疾患を処置または予防するための方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体（例えば、ヒト化抗シグレック−８抗体）またはその組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、対象（例えば、ヒト患者）は、好酸球媒介性障害と診断された、または好酸球媒介性障害の発症リスクがある。一部の実施形態において、対象（例えば、ヒト患者）は、肥満細胞媒介性障害と診断された、または肥満細胞媒介性障害の発症リスクがある。一部の実施形態において、対象は、好酸球媒介性障害または肥満細胞媒介性障害を有する。

【0229】

好酸球を枯渇または低下させる方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体（例えば、ヒト化抗シグレック−８抗体）を投与するステップを含む方法が、本明細書に提供される。一部の実施形態において、好酸球の枯渇または低下は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料）における好酸球集団数を、抗体による処置前の対象由来の試料における好酸球集団数と比較することにより測定される。一部の実施形態において、好酸球の枯渇または低下は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料）における好酸球集団数を、抗体処置なしの別の対象由来の試料における好酸球集団数または抗体処置なしの対象由来の試料における平均好酸球集団数と比較することにより測定される。一部の実施形態において、試料は、組織試料（例えば、肺試料、鼻ポリポーシス試料等）である。一部の実施形態において、好酸球の枯渇または低下は、活性化された好酸球のアポトーシスによるものである。好酸球は、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３３、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびレプチン等が挙げられるがこれらに限定されない、サイトカインまたはホルモンにより活性化または感作することができる。一部の実施形態において、好酸球の枯渇または低下は、休止した好酸球のアポトーシスによるものである。一部の実施形態において、好酸球の枯渇または低下は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によるものである。一部の実施形態において、炎症性メディエーターの好酸球産生が、予防または低下される。例示的な炎症性メディエーターとして、活性酸素種、顆粒タンパク質（例えば、好酸球カチオン性タンパク質、主要塩基性タンパク質、好酸球由来神経毒、好酸球ペルオキシダーゼ等）、脂質メディエーター（例えば、ＰＡＦ、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２等）、酵素（例えば、エラスターゼ）、増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β等）、ケモカイン（例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ４、エオタキシン等）およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−３３、ＴＮＦ−α等）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0230】

肥満細胞を枯渇または低下させる方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体（例えば、ヒト化抗シグレック−８抗体）を投与するステップを含む方法も、本明細書に提供される。一部の実施形態において、肥満細胞の枯渇または低下は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料または生体液試料）における肥満細胞集団数を、抗体による処置前の対象由来の試料における肥満細胞集団数と比較することにより測定される。一部の実施形態において、肥満細胞の枯渇または低下は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料または生体液試料）における肥満細胞集団数を、抗体処置なしの別の対象由来の試料における肥満細胞集団数または抗体処置なしの対象由来の試料における平均肥満細胞集団数と比較することにより測定される。一部の実施形態において、試料は、組織試料（例えば、皮膚試料、肺試料、骨髄試料、鼻ポリポーシス試料等）である。一部の実施形態において、試料は、生体液試料（例えば、血液試料、気管支肺胞洗浄液試料および鼻洗浄液試料）である。一部の実施形態において、肥満細胞の枯渇または低下は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）によるものである。一部の実施形態において、肥満細胞の枯渇または低下は、肥満細胞から産生される予め形成または新たに形成された炎症性メディエーターの低下または予防である。例示的な炎症性メディエーターとして、ヒスタミン、Ｎ−メチルヒスタミン、酵素（例えば、トリプターゼ、キマーゼ、カテプシン（ｃａｔｈｅｓｐｉｎ）Ｇ、カルボキシペプチダーゼ等）、脂質メディエーター（例えば、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、ロイコトリエンＢ４、ロイコトリエンＣ４、血小板活性化因子、１１−ベータ−プロスタグランジンＦ２等）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１１（すなわち、エオタキシン）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０等）およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１５、ＩＬ−３３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ等）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0231】

対象においてシグレック−８を発現する肥満細胞を枯渇させる方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体（例えば、ヒト化抗シグレック−８抗体）を投与するステップを含み、抗シグレック−８抗体が、ＡＤＣＣ活性によりシグレック−８を発現する肥満細胞を死滅させる方法も、本明細書に提供される。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、処置前のベースラインレベルと比較した場合に、対象から得られる試料におけるシグレック−８を発現する肥満細胞の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％を枯渇させる。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、処置前のベースラインレベルと比較した場合に、対象から得られる試料におけるシグレック−８を発現する肥満細胞の少なくとも約２０％を枯渇させる。一部の実施形態において、肥満細胞の枯渇または死滅は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料または生体液試料）における肥満細胞集団数を、抗体による処置前の対象由来の試料における肥満細胞集団数と比較することにより測定される。一部の実施形態において、肥満細胞の枯渇または死滅は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料または生体液試料）における肥満細胞集団数を、抗体処置なしの別の対象由来の試料における肥満細胞集団数または抗体処置なしの対象由来の試料における平均肥満細胞集団数と比較することにより測定される。一部の実施形態において、試料は、組織試料（例えば、皮膚試料、肺試料、骨髄試料、鼻ポリポーシス試料等）である。一部の実施形態において、試料は、生体液試料（例えば、血液試料、気管支肺胞洗浄液試料および鼻洗浄液試料）である。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、ＡＤＣＣ活性を改善するように操作された。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、ＡＤＣＣ活性を改善するＦｃ領域における少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、抗体の重鎖の少なくとも１または２つは、フコシル化されていない。一部の実施形態において、肥満細胞の枯渇または死滅は、肥満細胞から産生される予め形成または新たに形成された炎症性メディエーターの低下または予防である。例示的な炎症性メディエーターとして、ヒスタミン、Ｎ−メチルヒスタミン、酵素（例えば、トリプターゼ、キマーゼ、カテプシンＧ、カルボキシペプチダーゼ等）、脂質メディエーター（例えば、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、ロイコトリエンＢ４、ロイコトリエンＣ４、血小板活性化因子、１１−ベータ−プロスタグランジンＦ２等）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１１（すなわち、エオタキシン）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０等）およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−３３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ等）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0232】

肥満細胞媒介性活性を阻害する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体（例えば、ヒト化抗シグレック−８抗体）を投与するステップを含む方法も、本明細書に提供される。一部の実施形態において、肥満細胞媒介性活性の阻害は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料または血液試料）における肥満細胞媒介性活性を、抗体による処置前の対象由来の試料における肥満細胞媒介性活性と比較することにより測定される。一部の実施形態において、肥満細胞媒介性活性の阻害は、抗体による処置後の対象由来の試料（例えば、組織試料または生物学的試料）における肥満細胞媒介性活性を、抗体処置なしの別の対象由来の試料における肥満細胞媒介性活性または抗体処置なしの対象由来の試料における平均肥満細胞媒介性活性と比較することにより測定される。一部の実施形態において、試料は、組織試料（例えば、皮膚試料、肺試料、骨髄試料、鼻ポリポーシス試料等）である。一部の実施形態において、試料は、生体液試料（例えば、血液試料、気管支肺胞洗浄液試料および鼻洗浄液試料）である。一部の実施形態において、肥満細胞媒介性活性の阻害は、肥満細胞脱顆粒の阻害である。一部の実施形態において、肥満細胞媒介性活性の阻害は、気道平滑筋収縮の阻害である。一部の実施形態において、肥満細胞媒介性活性の阻害は、肥満細胞におけるカルシウムフラックスの阻害である。一部の実施形態において、肥満細胞媒介性活性の阻害は、肥満細胞からの予め形成または新たに形成された炎症性メディエーターの放出の阻害である。例示的な炎症性メディエーターとして、ヒスタミン、Ｎ−メチルヒスタミン、酵素（例えば、トリプターゼ、キマーゼ、カテプシンＧ、カルボキシペプチダーゼ等）、脂質メディエーター（例えば、プロスタグランジンＤ２、プロスタグランジンＥ２、ロイコトリエンＢ４、ロイコトリエンＣ４、血小板活性化因子、１１−ベータ−プロスタグランジンＦ２等）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ１１（すなわち、エオタキシン）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ１０等）およびサイトカイン（例えば、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−３３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ等）が挙げられるがこれらに限定されない。

【0233】

疾患の予防または処置のため、活性薬剤の適切な投薬量は、上に定義されている通り、処置しようとする疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬剤が予防または治療目的のいずれで投与されるか、以前の治療法、対象の臨床歴および薬剤に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存するであろう。薬剤は、一度に、または一連の処置にわたって対象に適切に投与される。本明細書に記載されている方法の一部の実施形態において、記載されている抗シグレック−８抗体の投与間の間隔は、約１ヶ月間またはそれより長い。一部の実施形態において、投与間の間隔は、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間またはそれより長い。本明細書において、投与間の間隔は、ある抗体投与と次の抗体投与との間の期間を指す。本明細書において、約１ヶ月間の間隔は、４週間を含む。したがって、一部の実施形態において、投与間の間隔は、約４週間、約８週間、約１２週間、約１６週間、約２０週間、約２４週間またはそれより長い。一部の実施形態において、処置は、複数の抗体投与を含み、投与間の間隔は変動し得る。例えば、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約１ヶ月間であり、その後の投与間の間隔は、約３ヶ月間である。一部の実施形態において、第１の投与と第２の投与との間の間隔は、約１ヶ月間であり、第２の投与と第３の投与との間の間隔は、約２ヶ月間であり、その後の投与間の間隔は、約３ヶ月間である。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、平坦な（ｆｌａｔ）用量で投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、用量当たり約１５０〜約４５０ｍｇの投薬量で対象に投与される。一部の実施形態において、抗シグレック−８抗体は、用量当たり約１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇおよび４５０ｍｇのいずれかの投薬量で対象に投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投薬量で対象に投与される。一部の実施形態において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇまたは１０．０ｍｇ／ｋｇのいずれかの投薬量で対象に投与される。上述の投薬頻度のいずれを使用してもよい。

【0234】

本明細書において企図される処置方法は、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体による、好酸球媒介性障害および／または肥満細胞媒介性障害の処置である。好酸球媒介性障害は、好酸球遊走、走化性、発生または顆粒化に関連する障害または疾患を含む。同様に、肥満細胞媒介性障害は、肥満細胞遊走、走化性、作製または顆粒化に関連する障害または疾患を含む。本発明の製剤で処置可能な好酸球媒介性障害および／または肥満細胞媒介性障害は、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹（例えば、慢性特発性蕁麻疹および慢性自発性蕁麻疹）、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群を含む。本発明の製剤で処置可能な好酸球媒介性障害および／または肥満細胞媒介性障害は、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）も含む。

【0235】

本明細書における方法の一部の実施形態において、本明細書に提供される抗シグレック−８抗体は、アレルギー反応の１種または複数の症状を阻害する。一部の実施形態において、アレルギー反応は、Ｉ型過敏症反応である。

【0236】

アレルギー性鼻炎結膜炎または枯草熱としても公知のアレルギー性鼻炎は、吸入性アレルゲンに対するアトピー性反応の最も一般的な症状発現であり、その重症度および持続時間は多くの場合、アレルゲンへの曝露の強度および長さと相関する。これは慢性疾患であり、いかなる年齢で最初に出現することもできるが、発病は通常、小児期または青年期の間である。典型的な発作は、大量の水様鼻漏、発作的なくしゃみ、鼻閉塞ならびに鼻部および口蓋のそう痒からなる。後鼻腔粘液ドレナージも、咽頭炎、咳払いおよび咳を引き起こす。結膜および眼瞼の激しいそう痒、発赤、流涙ならびに羞明を伴うアレルギー性眼瞼結膜炎の症状も存在し得る。重度の発作は、多くの場合、全身性倦怠感、脱力感、疲労、場合によっては、激しいくしゃみ期間の後の筋痛を伴う。

【0237】

可逆性閉塞性気道疾患としても公知の喘息は、呼吸刺激物質および気管支収縮剤化学物質に対する気管気管支樹の応答性亢進によって特徴付けられ、自発的にまたは処置により可逆性である喘鳴、呼吸困難、胸部絞扼感および咳の発作を生じる。これは、気道全体に関与する慢性疾患であるが、時折の軽度一過性エピソードから重度慢性の生命に関わる気管支閉塞へと重症度が変動する。喘息発作の身体的兆候は、頻呼吸、聞き取れる喘鳴および呼吸副筋の使用を含む。末梢血および鼻分泌物における好酸球のレベル上昇と同様に、速い脈拍および血圧上昇も典型的に存在する。喘息およびアトピーは共存し得るが、喘息患者の約半数のみが、同様にアトピー性であり、さらにより少ないパーセンテージのアトピー患者が喘息も有する。しかし、喘息は、特に小児期において、非アトピー性個体よりも頻繁にアトピー性個体の間で起こるという点において、アトピーおよび喘息は、完全に無関係とは限らない。喘息はさらに、２種のサブグループ、外因性喘息および内因性喘息へと歴史的に分類されている。加えて、喘息は、気道の慢性炎症、異なる患者間の頻度で環境的トリガーに応答して変動する急性増悪に関与する。重症例において、気道の慢性再造形が起こり得る。

【0238】

アレルギー性、アトピー性または免疫性喘息としても公知の外因性喘息は、通常、乳児期または小児期である年少期に喘息を一般に発症する患者の説明である。湿疹またはアレルギー性鼻炎を含むアトピーの他の症状発現が多くの場合共存する。喘息性発作は、花粉の季節において、動物の存在下で、またはハウスダスト、羽毛枕もしくは他のアレルゲンへの曝露下で起こり得る。皮膚検査は、原因となるアレルゲンに対する陽性膨疹・紅斑反応を示す。興味深いことに、血清総ＩｇＥ濃度は頻繁に上昇するが、正常の場合もある。非アレルギー性または特発性（ｉｄｏｐａｔｈｉｃ）喘息としても公知の内因性喘息は、典型的には、顕性呼吸感染後に成人期において最初に起こる。症状は、花粉の季節または他のアレルゲンへの曝露とは無関係な慢性または再発性気管支閉塞を含む。皮膚検査は、通常のアトピー性アレルゲンに対し陰性であり、血清ＩｇＥ濃度は正常である。追加的な症状は、痰血液および好酸球増加症を含む。本特許出願の目的のため、「好酸球媒介性障害」は、アレルギー性および非アレルギー性喘息の両方を含む。一部の実施形態において、好酸球媒介性障害（複数可）および／または肥満細胞媒介性障害（複数可）の対象は、吸入コルチコステロイド、短時間作用型β２アゴニスト、長時間作用型β２アゴニストまたはこれらの組合せによって適切に制御されていない喘息を患う。

【0239】

湿疹、神経皮膚炎、アトピー性湿疹またはベニエ痒疹としても公知のアトピー性皮膚炎は、アトピーの家族性および免疫性特色を有する患者のサブセットに特異的な一般的な慢性皮膚障害である。本質的特色は、ある特定の部位に偏向した特徴的な対称的に分布した皮膚噴出物を誘導する、そう痒性皮膚炎症性応答である。アトピー性皮膚炎は、アレルギー性鼻炎および喘息ならびに高ＩｇＥレベル、皮膚炎の重症度と関連するため、皮膚型のアトピーとして分類されるが、しかし、皮膚検査におけるアレルゲンへの曝露と必ずしも相関するとは限らず、脱感作（他のアレルギー性疾患とは異なり）は、有効な処置ではない。高血清ＩｇＥは、アレルギー性喘息の診断にとって確証的であるが、正常レベルは、これを排除しない。疾患の発病は、いかなる年齢で起こることもでき、病変は、紅斑性浮腫性丘疹またはプラークと鱗屑と共に急性的に始まる。そう痒は、水疱（ｗｅｅｐｉｎｇ）および痂皮、続いて慢性苔癬化をもたらす。細胞レベルでは、急性病変は、浮腫性（ｅｄｅｍｏｕｓ）であり、真皮に単核細胞、ＣＤ４リンパ球が浸潤する。好中球、好酸球、形質細胞および好塩基球は稀であるが、脱顆粒肥満細胞が存在する。慢性病変は、上皮肥厚化、角化症および不全角化を特色とし、真皮に単核細胞、ランゲルハンス細胞および肥満細胞が浸潤する。小神経の神経周膜の関与を含む、線維症の病巣部分も存在し得る。

【0240】

蕁麻疹および血管浮腫は、表在性皮膚血管におけるヒスタミン刺激された受容体に起因する身体的腫脹、紅斑およびそう痒を指し、全身性アナフィラキシーの特質的皮膚特色である。全身性アナフィラキシーは、薬物、昆虫毒または食物に起因する、複数の臓器で同時に起こるＩｇＥ媒介性反応の発生である。これは、アレルゲン誘導性肥満細胞負荷ＩｇＥによって突然に引き起こされ、様々な生体臓器の機能における深刻な生命に関わる変更をもたらす。血管崩壊、急性気道閉塞、皮膚血管拡張および浮腫ならびに胃腸管および尿生殖器筋痙攣が、ほぼ同時に起こるが、必ずしも同じ程度で起こるとは限らない。アナフィラキシーの病態は、血管浮腫および過膨脹した肺を含み、粘膜が気道を塞ぎ、限局的無気肺となる。細胞レベルでは、肺は、急性喘息発作のときと同様と思われ、気管支粘膜下腺の過分泌、粘膜および粘膜下浮腫、気管支周囲血管性うっ血ならびに気管支壁における好酸球増加症を伴う。肺浮腫および出血が存在し得る。気管支筋痙攣、過膨脹、さらには肺胞の破裂も存在し得る。ヒトアナフィラキシーの重要な特色は、喉頭、気管、喉頭蓋および下咽頭の粘膜固有層における浮腫、血管性うっ血および好酸球増加症を含む。アレルゲンへの曝露は、経口摂取、注射、吸入または皮膚もしくは粘膜との接触によるものとなり得る。反応は、アレルゲンへの曝露後の数秒または数分以内に始まる。最初に恐怖または切迫した破滅の感覚、続いて急速に、１種または複数の標的臓器系：心血管、呼吸、皮膚または胃腸管における症状が生じ得る。アナフィラキシーの原因となるアレルゲンは、アトピーと一般的に関連するアレルゲンとは異なる。食物、薬物、昆虫毒またはラテックスは、一般的な供給源である。食物アレルゲンは、甲殻類、軟体動物（例えば、ロブスター、エビ、カニ）、魚類、マメ科植物（例えば、ピーナッツ、エンドウマメ、豆、甘草）、種子（例えば、ゴマ、綿実、キャラウェイ、マスタード、亜麻仁、ヒマワリ）、堅果、液果、卵白、ソバおよびミルクに存在するアレルゲンを含む。薬物アレルゲンは、異種タンパク質およびポリペプチド、多糖ならびにハプテン薬に存在するアレルゲンを含む。昆虫アレルゲンは、ミツバチ、イエロー・ジャケット（ｙｅｌｌｏｗ ｊａｃｋｅｔ）、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）、カリバチ（ｗａｓｐ）およびアカヒアリを含むＨｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ昆虫を含む。エピネフリンは、アナフィラキシーのための典型的な処置であるが、抗ヒスタミン薬または他のヒスタミン遮断薬が、典型的に、重症度の低い蕁麻疹または血管浮腫（ａｎｇｉｏｅｄｅｍｉｃ）反応のために処方される。

【0241】

鼻ポリポーシスは、鼻腔へと成長して飛び出す炎症組織によって特徴付けられる、上気道の慢性炎症性疾患であり、正確な病因は不明であるが、成人の１〜５％の間の有病率を有することが公知である（Ｓｅｔｔｉｐａｎｅ Ｇ Ａ：Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎａｓａｌ ｐｏｌｙｐｓ．、Ａｌｌｅｒｇｙ Ａｓｔｈｍａ Ｐｒｏｃ、１９９６年、１７巻：２３１〜２３６頁）。鼻ポリポーシスは、典型的には、２０歳またはそれより年上の男性において呈し、鼻閉塞、嗅覚鈍麻および再発性感染を引き起こし、通年性アレルギー性鼻炎よりも有意に大きい影響をクオリティ・オブ・ライフに与える（Ｌｉら、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ Ｎａｓａｌ Ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ａｌｌｅｒｇｏｌ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２００９年；１９巻（４号）：２７６〜２８２頁）。鼻ポリポーシスの全患者の最大３分の１が、喘息であると報告されるが、喘息患者の７％のみが、鼻ポリポーシスを有する。鼻ポリポーシスに関係付けられる優勢である細胞型は、好酸球および肥満細胞を含む。

【0242】

ＶＩ．製造品またはキット
別の態様において、本明細書に記載されている抗シグレック−８抗体を含む、製造品またはキットが提供される。製造品またはキットは、本発明の方法における抗体の使用のための説明書をさらに含むことができる。よって、ある特定の実施形態において、製造品またはキットは、個体における好酸球媒介性障害および／または肥満細胞媒介性障害を処置または予防するための方法であって、有効量の抗シグレック−８抗体を個体に投与するステップを含む方法における抗シグレック−８抗体の使用のための説明書を含む。ある特定の実施形態において、個体は、ヒトである。一部の実施形態において、個体は、喘息、アレルギー性鼻炎、鼻ポリポーシス、アトピー性皮膚炎、慢性蕁麻疹、肥満細胞症、好酸球性白血病および好酸球増加症候群からなる群から選択される疾患を有する。ある特定の実施形態において、個体は、乏顆粒球型喘息、急性または慢性気道過敏症、好酸球性食道炎、チャーグ・ストラウス症候群、サイトカインに関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する炎症、シグレック−８を発現する細胞に関連する悪性病変、物理的蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、圧迫性蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、食物アレルギーおよびアレルギー性気管支肺アスペルギルス症（ＡＢＰＡ）からなる群から選択される疾患を有する。

【0243】

製造品またはキットは、容器をさらに含むことができる。適した容器は、例えば、ボトル、バイアル（例えば、デュアルチャンバーバイアル）、シリンジ（シングルまたはデュアルチャンバーシリンジ等）および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチック等、種々の材料でできていてよい。容器は、製剤を保持する。

【0244】

製造品またはキットは、容器に貼られたまたは付随する、製剤の再構成および／または使用に関する指示を示すことができるラベルまたは添付文書をさらに含むことができる。ラベルまたは添付文書は、製剤が、個体における好酸球媒介性障害および／または肥満細胞媒介性障害を処置または予防するための、皮下、静脈内または他の様式の投与に有用であるまたは意図されることをさらに示すことができる。製剤を保持する容器は、使い捨てバイアルであっても多重使用バイアルであってもよく、これは、再構成された製剤の反復投与を可能にする。製造品またはキットは、適した希釈液を含む第２の容器をさらに含むことができる。製造品またはキットは、他のバッファー、希釈液、フィルター、針、シリンジおよび添付文書と使用説明書を含む、商業的、治療的および使用者の見地から望ましい他の材料をさらに含むことができる。

【0245】

具体的な実施形態において、本発明は、単一用量投与単位のためのキットを提供する。斯かるキットは、シングルまたはマルチチャンバーの両方の予め充填されたシリンジを含む、治療抗体の水性製剤の容器を含む。例示的な予め充填されたシリンジは、Ｖｅｔｔｅｒ ＧｍｂＨ、ドイツ、ラーフェンスブルクから入手できる。

【0246】

本明細書における製造品またはキットは、第２の医薬を含む容器を任意選択でさらに含み、この場合、抗シグレック−８抗体が、第１の医薬であり、この物品またはキットは、有効量で第２の医薬で対象を処置するための、ラベルまたは添付文書における説明書をさらに含む。例示的な第２の医薬は、抗ＩｇＥ抗体、抗ヒスタミン薬、気管支拡張薬、グルココルチコイド、ＮＳＡＩＤ、うっ血除去薬、咳止め薬、鎮痛薬、ＴＮＦ−アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、免疫抑制剤、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１３アンタゴニスト、二重ＩＬ−４／ＩＬ−１３アンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、Ｂ細胞表面マーカーに結合する抗体および／またはＢＡＦＦアンタゴニストとなり得る。

【0247】

別の実施形態において、自動注射装置における投与のための、本明細書に記載されている製剤を含む製造品またはキットが本明細書において提供される。自動注射器は、起動すると、患者または管理者の追加的な必要な動作なしでその内容物を送達する注射装置として説明することができる。送達速度が一定でなければならず、送達時間が僅かな間よりも長い場合、これは、治療用製剤のセルフメディケーションに特に適する。

【0248】

本発明は、次の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。しかし、実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈するべきではない。本明細書に記載されている実施例および実施形態が、単なる説明目的であり、これを踏まえた様々な修正または変更が、当業者に示唆され、本願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれるべきであることが理解される。

【実施例】

【0249】

シグレック（シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン）は、主に白血球上に存在する１回膜貫通細胞表面タンパク質である。シグレックファミリーのメンバーであるシグレック−８は、新規ヒト好酸球タンパク質を同定する試みの一環として最初に発見された。ヒト好酸球による発現に加えて、これは、肥満細胞によっても発現される。シグレック−８は、硫酸化グリカン、６’−スルホ−シアリルルイスＸを認識し、肥満細胞機能を阻害することが示された細胞内免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）ドメインを含有する。シグレック−８に対するマウス抗体、２Ｅ２および２Ｃ４抗体は、米国特許第８，２０７，３０５号；米国特許第８，１９７，８１１号、米国特許第７，８７１，６１２号および米国特許第７，５５７，１９１号に記載されている。マウス抗シグレック−８ ２Ｃ４抗体の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、例えば、米国特許第８，２０７，３０５号においてそれぞれ配列番号２および配列番号４として見出すことができる。

【0250】

（実施例１）
キメラ抗シグレック−８抗体の作製および特徴付け
マウス２Ｅ２抗体およびマウス２Ｃ４抗体からキメラ抗体を作製し、その後、ヒトシグレック−８への結合活性に関して解析した。

【0251】

方法および結果
キメラ２Ｅ２抗体（ｃｈ２Ｅ２）およびキメラ２Ｃ４抗体（ｃｈ２Ｃ４）の作製
キメラ２Ｅ２抗体（ｃｈ２Ｅ２）の作製のため、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、急速凍結したマウスハイブリドーマ２Ｅ２細胞ライセートを処理して、製造元のプロトコールに従って全ＲＮＡを単離した。製造元のプロトコールに従って第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、単離されたＲＮＡの３μｇ試料を逆転写して２Ｅ２ ｃＤＮＡを産生した。２Ｅ２ ｃＤＮＡをその後、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ反応物における配列を確認した。免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡおよびカッパ軽鎖可変領域（ＶＬ）を、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲマスターミックスを使用してＰＣＲ増幅した。各ＰＣＲ反応の結果は、単一の増幅産物であり、製造元のプロトコールに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してこれを精製し、免疫グロブリン鎖毎の配列を得た。カッパ軽鎖可変領域のコンセンサス配列を２Ｅ２ ＶＫと命名し、重軽鎖可変領域のコンセンサス配列を２Ｅ２ ＶＨと命名した。２Ｅ２ ＶＫタンパク質配列は、ＧｌｎがＧｌｕに置き換えられた第１の残基を除いて、マウス２Ｃ４ ＩｇＧ１抗体（Ｋｉｋｌｙら、Ｊ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００年；１０５巻：１０９３〜１１００頁を参照）と同一であったが、２Ｅ２ ＶＨタンパク質配列は、２Ｃ４と完全に同一であった。

【0252】

キメラ発現ベクターの構築は、リガーゼ非依存的クローニングを使用した、ＩｇＧ／カッパ定常領域ベクターへの増幅された可変領域のクローニングを必要とした。簡潔に説明すると、ｐＣＭＶベクターをＢｆｕＡ１（ＢｓＰＭ１）で消化し、消化されたベクターをゲル電気泳動によって精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよび１００ｍＭ ｄＡＴＰとのインキュベーションにより、ベクターにおける適合性オーバーハングを作製した。挿入物のため、リーダー配列の３’端、すなわち、フォワードプライマーまたは定常領域（ＩｇＧ１またはカッパ）の開始、すなわち、リバースプライマーと、続く可変領域（各方向における）の開始を含有するプライマーを用いて、２Ｅ２ ｃＤＮＡから抗体配列をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、増幅された挿入物を精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよび１００ｍＭ ｄＴＴＰとのインキュベーションにより、挿入物における相補的オーバーハングを作製した。ベクターおよび挿入物を室温でインキュベートし、化学的にコンピテントなＴＯＰ１０細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の形質転換に使用し、この細菌をその後、カナマイシンを含有する培養プレートで平板培養した。数個のクローンを単離し、ＰＣＲによってコロニーをスクリーニングした。正確なサイズのＰＣＲ産物を含有するクローンを選択し、ミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを単離し、ＤＮＡを配列決定した。

【0253】

キメラ２Ｃ４抗体（ｃｈ２Ｃ４）の作製のため、２Ｃ４重鎖可変領域（ＶＨ）およびカッパ軽鎖可変領域（ＶＫ）を合成し（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）、キメラ２Ｅ２抗体のクローニングに使用した同じ方法を適用した。Ｅｘｐｉ２９３発現系キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に提供されるＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３試薬を使用して、製造元のプロトコールに従い、Ｅｘｐｉ２９３トランスフェクション培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗生物質において成長するＥｘｐｉ２９３懸濁細胞（ヒト胚性腎臓細胞）を、ｃｈ２Ｅ２重鎖およびｃｈ２Ｅ２カッパ軽鎖をコードする構築物またはｃｈ２Ｃ４重鎖およびｃｈ２Ｃ４カッパ軽鎖をコードする構築物（各１μｇ ＤＮＡ）でコトランスフェクトした。６ウェルプレート内の２ｍｌ成長培地において細胞を７日間育成し、その後、培地を収集し、ＥＬＩＳＡにより組換えタンパク質発現に関してアッセイした。

【0254】

キメラ抗体のシグレック−８結合活性
キメラ２Ｅ２およびキメラ２Ｃ４ ＩｇＧ１Ｋ抗体による組換えヒトシグレック−８細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の結合をＥＬＩＳＡにより測定した。シグレック−８結合アッセイのため、ウェル当たり３０μＬの０．４μｇ／ｍＬシグレック−８ ＥＣＤで一晩４℃にてコーティングし、続いて洗浄バッファー（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）におけるウェル洗浄によりコーティング溶液を除去し、９０μＬの５％ＢＳＡ／ＴＢＳ溶液で２時間室温にてブロッキングすることにより、３８４ウェルＳｐｅｃｔｒａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を調製した。０．２％ＢＳＡ／ＴＢＳにおけるキメラ抗体（ｃｈ２Ｅ２またはｃｈ２Ｃ４）またはマウス抗体（ｍ２Ｅ２またはｍ２Ｃ４）の３倍系列希釈（出発濃度は５０００ｎｇ／ｍＬ）を、各コーティングされたウェルに添加した。このプレートを２時間室温でインキュベートし、ウェルをその後洗浄し、続いて、０．２％ＢＳＡ／ＴＢＳ溶液に希釈したヤギ抗ヒトＦｃペルオキシダーゼコンジュゲート（１：１００００希釈）または抗マウスＦｃペルオキシダーゼコンジュゲート（１：３００００希釈）を添加した。プレートを４５分間室温でインキュベートし、続いて洗浄し、各ウェルに３０μＬ Ｋ−ｂｌｕｅ ＨＲＰ基質（ＳｋｙＢｉｏ Ｌｔｄ）を添加した。室温１５分間のインキュベーション後に、各ウェルへの１０μＬのＲｅｄ Ｓｔｏｐ溶液（ＳｋｙＢｉｏ Ｌｔｄ）の添加により反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーＰＨＥＲＡＳｔａｒ ＦＳ（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して、６５０ｎｍにおける実験試料の光学密度を読み取った。

【0255】

両方のキメラ抗体が、匹敵するＥＣ_５０値で完全シグレック−８ ＥＣＤに結合した。キメラ抗体ｃｈ２Ｅ２は、マウス抗体ｍ２Ｅ２と比較した場合に、より低いＥＣ_５０値でシグレック−８ ＥＣＤに結合した（表２）。

【表2】

【0256】

（実施例２）
ヒト化抗シグレック−８抗体の作製および特徴付け
キメラ抗体２Ｅ２およびキメラ抗体２Ｃ４の配列を使用して、マウス２Ｅ２抗体のヒト化バージョンを設計した。

【0257】

方法および結果
ヒト化抗シグレック−８抗体の設計
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｄａｔａｂａｓｅ ２００９（Ｌｅｆｒａｎｃ， ＭＰ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２００３年、３１巻（１号）：３０７〜１０頁）およびＫａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ５ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（最終アップデート１９９９年１１月１７日）（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、１９９１年、１〜３２４２頁）から得たヒトおよびマウス免疫グロブリンのタンパク質配列を使用して、Ｋａｂａｔアライメントにおけるヒト免疫グロブリン配列のデータベースを編集した。編集されたデータベースは、１０，９０６種のＶＨおよび２，９１２種のＶＫ配列を含有した。

【0258】

Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）に含まれるＭｏｄｅｌｌｅｒプログラム（Ｅｓｗａｒら、Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００６年、第５章：第５．６節）を使用して、マウス抗体２Ｃ４可変領域の相同性モデルが計算された。抗体ｐｄｂ構造データベース（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）解析によって決定される通り、１ａ７Ｏ．ｐｄｂ、１ｄｑｄ．ｐｄｂおよび１ＯＲＳ．ｐｄｂの原子座標は、それぞれＶＨ、ＶＬおよび骨格／界面のための最高フレームワーク同一性配列鋳型であった。これらの鋳型を使用して、フレームワークの３０種の初期モデルを作製し、最低エネルギーモデルを使用して、２０種のループモデル（全ＣＤＲループが含まれる）を作製し、Ｋａｂａｔ定義を使用してその５種の最良のループ鋳型により、最終マウス２Ｃ４モデルを最終的に作製した。

【0259】

ヒト化は、適したヒトＶ領域の同定を必要とした。Ｇｉｂｂｓ配列解析プログラム（ＭＲＣＴ）を使用して、様々な選択判断基準を使用して、２Ｃ４ ＶＨおよびＶＫタンパク質配列によりヒトＶＨおよびＶＫデータベースを照合した。Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏプログラム（Ａｃｃｅｌｒｙｓ）を使用して、マウス抗体２Ｃ４の最終相同性モデルにおけるＣＤＲ残基の４Å内のフレームワーク（ＦＷ）残基（Ｋａｂａｔ定義）を同定し、「４Å ＣＤＲエンベロープ」と命名した。２Ｃ４ ＶＨに対し高い４Å ＣＤＲエンベロープおよび／またはＶＣＩ同一性を保有した、２Ｃ４とＣＤＲ１、２および３長さ同一性を共有するヒトＶＨ配列は存在しなかった。ＡＦ４７１５２１は、鍵となるフレームワーク残基（１９／２４ ４Åエンベロープおよび１８／２２ ＶＣＩ）の最高同一性スコアを有する、１４残基のＣＤＲ３サイズを有する次善の候補であったが、他の配列は、追加的な差を有し、そのためより低い優先順位になった。しかし、ＡＦ４７１５２１は、その生殖系列ＶＨ遺伝子Ｘ９２２１８から１１個の体細胞変異を有した。体細胞変異を軽減するため、生殖系列とは異なるおよび／またはマウスにおいて保存されていない、いずれかのフレームワーク残基をヒト生殖系列配列に復帰変異させた。したがって、６個のフレームワーク残基を生殖系列に復帰変異させ、生殖系列と異なる残る５残基は、鍵となるフレームワーク残基であり、マウス配列と同一であった。

【0260】

適したアクセプターヒトフレームワークは、２Ｃ４抗体の相同性モデルを使用して同定されたため、２Ｅ２抗体のＣＤＲをアクセプターヒトフレームワークにグラフトすることにより、合成タンパク質およびＤＮＡ配列を設計した。２Ｅ２ＲＨＡの初期設計は、２Ｅ２ ＶＨ由来のＣＤＲ１、２および３をＡＦ４７１５２１のアクセプターＦＷにグラフトすることであった。ＡＦ４７１５２１のＦＷ配列への２Ｅ２ ＶＨ ＣＤＲのインターカレーション（灰色の陰）は、初期ヒト化バリアントの２Ｅ２ＲＨＡの設計をもたらした（図１）。Ｋａｂａｔの２４、４８、４９、６７および６８位における５個の４ÅのＣＤＲエンベロープ／ＶＣＩ残基は、２Ｅ２ＲＨＡにおいて保存されておらず、これらをヒト化バージョン２Ｅ２ＲＨＢにおいてマウスの等価な残基に復帰変異させた、または次のバリアントにおいて一度に１種を変異させた：配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでアセンブルし、２Ｅ２ＲＨＡ〜２Ｅ２ＲＨＧと命名した（図１）。

【0261】

軽鎖をヒト化するために、重鎖と同様のプロセスでヒトカッパ鎖を同定した。ＡＹ８６７２４６は、４Å ＣＤＲエンベロープ／ＶＣＩにおいて２Ｅ２ ＶＫに対し最高の同一性を有する配列であったが、６個の体細胞変異を有していた。２１／２５ ４Åエンベロープおよび１５／１７ ＶＣＩならびに最も近い生殖系列ＶＫ遺伝子、Ｘ０１６６８からの唯一の体細胞変異を含有したＸ９３７２１を支持して、ＡＹ８６７２４６を廃棄した。Ｘ９３７２１由来のフレームワークを使用して、ヒト化構築物のためのＤＮＡおよびタンパク質を設計した。２Ｅ２ ＶＫ由来のＣＤＲ１、２および３（灰色の陰）を、Ｘ９３７２１のアクセプターＦＷにグラフトして、２Ｅ２ＲＫＡを作製した（図２）。バリアント２Ｅ２ＲＫＢにおけるまたは個々に次のバリアントにおける等価なマウス残基に復帰変異された、２Ｅ２ＲＫＡにおける４個のマッチしない４Å ＣＤＲエンベロープ残基、３、４７、５８および７１が存在した：配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでアセンブルし、２Ｅ２ＲＫＡ〜２Ｅ２ＲＫＧと命名した（図２）。

【0262】

ヒト化抗シグレック−８抗体の作製
２Ｅ２ＲＨＡおよび２Ｅ２ＲＫＡの遺伝子を合成し（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）、ヒト配列にコドン最適化した。天然ヒトフレームワーク配列ＡＦ４７１５２１およびＸ９３７２１、それぞれ重および軽鎖、ならびに天然マウスＣＤＲ配列をｉｎ ｓｉｌｉｃｏでアセンブルし、２Ｅ２ＲＨＡ〜２Ｅ２ＲＨＧおよび２Ｅ２ＲＫＡ〜２Ｅ２ＲＫＧと命名した。ソフトウェアアルゴリズム（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用して、ヒト細胞によって優先的に利用されるコドンを使用するようにサイレント変異誘発により配列を最適化し、合成した。ＲＨＡ／ＢおよびＲＫＡ／Ｂ構築物を、キメラ抗体のＰＣＲ増幅に関する実施例１の上述の通り、発現ベクターおよび挿入物に対する特異的プライマーによりＰＣＲ増幅し、キメラ抗体の作製に関して実施例１に記載されている通り、リガーゼ非依存的クローニング反応によりＩｇＧ／カッパ定常領域ベクターへと挿入し、ＴＯＰ１０細菌の形質転換に使用した。ＲＫＡおよびＲＨＡをその後、製造元のプロトコールに従って、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用したＰＣＲ変異誘発により修飾して、全ヒト抗体バリアントを得た（図１、図２、表３、表４および表５）。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表4-1】

【表4-2】

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【0263】

クローンを配列決定し、製造元のプロトコールに従ってプラスミドミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰｕｒｅＹｉｅｌｄプラスミドマキシプレップシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、発現プラスミドＤＮＡを調製した。ヒト化またはキメラＶＨおよびＶＫをコードする発現プラスミド調製物を使用して、実施例１における上述の通り、Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。細胞を無血清培地において７日間培養し、その上で、細胞由来の馴化培地を収集し、ＥＬＩＳＡによりアッセイして、抗体の産生を確認した。

【0264】

ヒト化ＶＨおよびＶＫ構築物にコードされる抗体によるシグレック−８結合
ヒト化設計に伴う何らかの著しい問題を同定する試みにおいて、基本のヒト化重および軽鎖を、そのキメラカウンターパートとペアにした。シグレック−８抗原を使用して、実施例１に記載されている通り、ＥＬＩＳＡにより抗体結合を測定した。２Ｅ２ＲＨＢは、キメラ軽鎖とペアになった場合、ＲＨＡ重鎖よりも強力であると思われたが、重鎖キメラ構築物（ｃＶＨ）に会合したＲＫＢ構築物は、ペア化ｃＶＫ構築物の両方よりも高い効力でシグレック−８抗原に結合した。これらの結果は、重および軽鎖両方のためのヒト化設計が、おおよそ正確であり、全てシグレック−８に結合したが、さらなる研究が、より優れた結合特徴を有する追加的なヒト化抗体の同定に必要とされることを確認した。

【0265】

キメラカウンターパートと組み合わせた完全ヒト化抗体によるシグレック−８結合
完全ヒト化抗体重および軽鎖を組み合わせ、キメラ抗体と比較して、４Åおよびカノニカルフレームワーク残基ならびに界面残基の置き換えが、２Ｅ２のヒト化成功に十分であるか決定した。Ｅｘｐｉ２９３細胞を、異なるヒト化重鎖ベクターに会合した異なるヒト化軽鎖ベクターの組合せでコトランスフェクトした。シグレック−８抗原を使用して、実施例１に記載されている通り、ＥＬＩＳＡにより抗体結合を測定した。キメラ対照と比較した、シグレック８へのこれらの抗体の結合は、ＨＢＫＡおよびＨＢＫＢが、ＨＡＫＡおよびＨＡＫＢよりも優れた組合せであると思われることを示した（表６）。

【0266】

完全ヒト化抗体によるシグレック−８結合
重鎖における単一アミノ酸置換の相対的な重要性を決定するために、ヒト化重鎖ＲＨＣ（Ａ２４Ｖ）、ＲＨＤ（Ｖ４８Ｌ）、ＲＨＥ（Ｓ４９Ｇ）、ＲＨＦ（Ｆ６７Ｌ）およびＲＨＧ（Ｔ６８Ｓ）を全軽鎖バリアントと組み合わせて発現させ、ＲＨＡおよびＲＨＢバージョンならびにキメラ抗体対照と比較した。シグレック−８ ＥＣＤに結合するこれらの抗体の結果は、これらのヒト化抗体組合せが全て、ファミリーＲＨＡ、ＲＨＦおよびＲＨＧ（全軽鎖バリアントと）を除いて、同じ効力でシグレック−８に結合したことを示唆した（表６）。

【0267】

次に、単一アミノ酸置換により、ＲＫＡからＲＫＢに軽鎖を変化させると、抗体結合に影響を与えるか決定した。キメラ抗体ならびにＲＫＡおよびＲＫＢバージョンと比較した場合に、軽鎖ＲＫＣ（Ｖ３Ｉ）、ＲＫＤ（Ｖ４８Ｌ）、ＲＫＥ（Ｌ４７Ｗ）およびＲＫＦ（Ｅ５８Ｖ）と全重鎖バリアントとの組合せからなる抗体の結合を評価した。結合のパターンに有意に影響を与えた軽鎖バリアントが存在するようには思われなかった（表６）。加えて、全重鎖バリアントと組み合わせて、軽鎖生殖系列残基Ｆ７１Ｙ（ＲＫＧ）の関連性も試験したところ、結果は、この残基が概して、大幅な結合減退を引き起こしたことを実証した。

【0268】

ＨＥＫＡおよびＨＥＫＦが、シグレック−８に対する最良の候補抗体であると思われた。したがって、ＥＬＩＳＡを行って、対照としてのキメラ抗体ならびにＨＥＫＡおよびＨＥＫＦの両方と比較した場合に、抗原に最高の効力で結合した抗体を再検査した。結果は、ヒト化重およびヒト化軽鎖の異なる組合せが、ＲＨＡとの組合せは別として、シグレック−８と同様の仕方で結合したことを示した（表６）。結果は、ＨＥＫＡおよびＨＥＫＦが、非常に優れた候補であり、キメラ陽性対照と有利に比較され、フレームワークに最小マウス残基を有したことを強調した。

【0269】

２Ｅ２ＲＨバージョン２およびＣＤＲ変異バリアントの作製
その後のヒト化重鎖は、最も近縁の生殖系列遺伝子に基づき作製した。２Ｅ２ＶＨと最も類似の生殖系列であるＩＧＨＶ４−５９生殖系列配列（図１）を使用して、マウスＣＤＲのグラフトを設計し、上述の他の構築物と同じ方式で合成（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）および調製して、第１のバージョンのＲＨＡおよびＲＨＢ鎖との比較のためのヒト化抗体を作製した。加えて、抗体が、生殖系列に変化されたある特定のＣＤＲ３残基に耐容性を示し得るか決定するために、部位特異的変異誘発により、ＲＨＥバリアント重鎖のＣＤＲ３に３個の変異を導入し（単一およびトリプル変異）、ＲＫＡおよびＲＫＦ軽鎖のＣＤＲ３に１個の変異（図３）を導入した。上述の同じ方法を使用して、ＲＨＥ変異またはＲＫＡ／ＲＫＦ変異を含有する抗体を発現させ、相補鎖の完全パネルと組み合わせた。

【0270】

ヒト生殖系列にグラフトされた重鎖ＣＤＲを、他の重鎖バージョンと比較した。ストレートグラフト（ＲＨＡ２）は、抗原への結合を完全に崩壊し、マウスに復帰変異した４Å／ＶＣＩ残基を有する生殖系列フレームワーク（ＲＨＢ２）は、第１のＲＨＢバリアントと非常に同様に挙動したが、ＲＨＢの５個と比較して１０個のマウス残基を含有した。結合データは、両方の鎖のＣＤＲ３における変異の導入の影響を図解し、重鎖における変異が、シグレック−８への結合に有害な効果を有した一方、軽鎖変異も、単独では、さらなる改善をもたらさなかったが、最良の抗体が、ＲＨＢ（全マウス復帰変異）およびＲＨＥ、重鎖候補を含有する抗体であったことを示唆した（表６）。

【表6-1】

【表6-2】

注記：各段は、１つの実験を表す；ＮＡは、入手不可能を示す。

【0271】

高温に対するヒト化候補抗体の熱安定性
ヒト化抗体の熱安定性を比較した。抗体を、−２０〜８５℃に変動する、より高い温度に１０分間付し、室温へと冷却し、各候補のＥＣ８０濃度におけるＥＬＩＳＡアッセイにおいて評価した。リード抗体候補は、安定的に思われた（図４）。ＨＥＫＡ／ＫＦとＣＤＲＬ３（すなわち、軽鎖のＣＤＲ３）変異抗体は、６８℃において完全に不活性であったが、キメラは、７０℃で不活性であり、この温度において、リード候補ＨＥＫＡおよびＨＥＫＦは、依然として２５〜５０％活性を有し、７５℃でようやく完全不活性を示した。

【0272】

ヒト化候補抗体Ｔｍの決定
リード抗体の融解温度を決定するために、キメラ、ＨＥＫＡ、ＨＥＫＦおよびＣＤＲＬ３（すなわち、軽鎖のＣＤＲ３）変異を有する同じヒト化候補を、２ステップ親和性クロマトグラフィーおよびゲル濾過システムにおいて精製し、熱シフトアッセイにおいて検査した。２種の異なる濃度で抗体を蛍光色素（Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ）と共に、ｑＰＣＲサーマルサイクラーにおいてサイクル毎に１℃増加させつつ７１サイクルインキュベートした。Ｔｍは、５０％最大蛍光の温度として定義された。キメラおよび５種のヒト化抗体のＴｍは、熱安定性アッセイで得られた結果を確認した：最も安定的な抗体は、検査した他のヒト化抗体よりも高いＴｍを有するＨＥＫＡおよびＨＥＫＦであった。ＨＥＫＡは、キメラ抗体よりも高いＴｍを有する（図５および表７）。

【表7】

【0273】

ヒト化候補抗体の親和性およびアビディティー
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を使用したＳＰＲ解析により、抗体アビディティー決定を行った。マウス、キメラおよびヒト化抗シグレック−８抗体へのヒトシグレック−８ ＥＣＤタンパク質の結合をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００において測定した。捕捉抗体（ヤギ−抗ヒト−Ｆｃおよびヤギ−抗マウス−Ｆｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ製）を製造元のプロトコール（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＧＥ）に従ってＣＭ５チップに固定化した。フローセル１、２および３を抗ヒトで、フローセル４を抗マウス抗体で固定化した。アッセイを２５℃、流速３０μｌ／分で行った。アッセイバッファーは、超純水において作成した２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ポリソルベート２０、１０％グリセロール、０．１％ＢＳＡであった。二量体シグレック−８（単量体および多量体シグレック−８の不純物は、分子ふるいクロマトグラフィーにより除去した）を、アッセイバッファーにおいて１５ｎＭから１．８８ｐＭへと２倍希釈で希釈した。およそ１２０ＲＵの変化まで抗体を捕捉した。６分間高速注射、続いて１２０分間解離を行った。フローセルを５０ｍＭグリシンｐＨ１．５で再生した。結果は、空の参照セルおよび複数のアッセイバッファー注射により二重にブランク作成し、１：１グローバルフィットパラメータにより解析した。

【0274】

マウス２Ｅ２およびキメラ２Ｅ２抗体のアビディティーは、それぞれ２８ｐＭおよび１６ｐＭであると決定された（表８）。ヒト化抗体のアビディティーは、ＨＥＫＡが１７ｐＭ、ＨＥＫＦが２１ｐＭであり、この結果は、ヒト化が、結合活性の保持および増強に成功したことを示した。

【表8】

【0275】

バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により抗体親和性決定も行った。ヒトシグレック−８タンパク質へのマウス、キメラおよびヒト化抗シグレック−８抗体Ｆａｂ断片の結合をＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ３８４において測定した。アッセイバッファーにおいて２５℃で１０００のＲＰＭにてアッセイを行った。ＨＢＳバッファーと１×ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｋｉｎｅｔｉｃｓバッファーを、ストック溶液（それぞれＢｉａｃｏｒｅ ＢＲ−１０６７０、ＦｏｒｔｅＢｉｏ１８−１３２）から超純水において作成した。Ｆａｂ断片（製造元の仕様書に従いＴｈｅｒｍｏ−Ｐｉｅｒｃｅ固定化パパインで抗体を消化した）を、アッセイバッファーにおいて５０ｎＭから１．５６ｎＭへと２倍希釈で希釈した。シグレック−８−Ｆｃタグ付けタンパク質を、およそ１．２のｎｍ変化まで、アッセイバッファーにおいて１００ｎＭで抗ヒト捕捉センサーに３分間固定化した。２分間会合と、続く１０分間解離を行った。結果は、空の参照ＡＨＣセンサーによりブランク作成し、ＦｏｒｔｅＢｉｏ解析ソフトウェアにおいて１：１グローバルフィットパラメータにより解析した。

【0276】

マウス２Ｅ２およびキメラ２Ｅ２ Ｆａｂ断片の親和性は、それぞれ５３６ｐＭおよび５８５ｐＭであると決定された（表９）。ヒト化抗体の親和性は、ＨＥＫＡが４６４ｐＭ、ＨＥＫＦが５９２ｐＭであり、この結果は、ヒト化が、これら２種のヒト化抗体の結合活性の保持に成功したことを示した。ＨＥＫＡは、このアッセイにおいてマウスおよびキメラ２Ｅ２よりも高いシグレック−８に対する一価親和性を有した。ヒト化抗体バリアント、ＨＥＫＡｍｕｔおよびＨＥＫＦｍｕｔの親和性は、それぞれ９０２ｐＭおよび１１６０ｐＭのＫＤによるピコモル濃度範囲でもあった。

【表9】

【0277】

ヒト化候補抗体の溶解度
遠心分離フィルター装置（Ａｍｉｃｏｎ ３０Ｋ ４ｍＬ、４０００ｇ、５分間 − 最初の濃縮；Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ０．５ｍＬ ３Ｋ、１４０００ｇ − 次の濃縮）を使用して、精製されたキメラおよび候補抗体を逐次的に濃縮し、各ステップで濃度を測定した。全試料を沈殿することなく総計で最大２１〜２４倍に濃縮し、ＥＬＩＳＡにより検査したところ、シグレック−８に対する結合効力を失ったものはないことが示された。抗体は、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬまでの濃度で沈殿する傾向がなかった。特に、ｃｈ２Ｅ２の溶解度は、少なくとも１８ｍｇ／ｍＬであり、ＨＥＫＡは、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、ＨＥＫＦは、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、ＨＥＫＡｍｕｔは、少なくとも２９ｍｇ／ｍＬ、ＨＥＫＦｍｕｔは、少なくとも１７ｍｇ／ｍＬであった。

【0278】

ヒト化候補抗体の凝集
解析に先立ち試料を濾過し、いかなる塩またはタンパク質沈殿も除去し、濃度を再度測定した。続いて、これを０．４ｍＬ／分で、ＨＰＬＣシステムにおける分子ふるいカラムへと注射し、多角度光散乱により解析して、絶対モル質量を決定し、凝集をチェックした。全バリアントが、１３４．９〜１３８．２ｋＤａに及ぶ平均分子量による凝集の徴候を示さなかったが、この結果は、この解析におけるＩｇＧ単量体の予想の範囲であった（表１０）。

【0279】

全試料は、単分散（Ｍｗ／Ｍｎ＜１．０５）であった。しかし、分布解析プロットは、グリコシル化バリアント（ｃｈ２Ｃ４、ＨＥＫＡおよびＨＥＫＦＭｕｔ）の存在を示した。分布解析プロットは、全試料における約１０５〜１２０ｋＤａ種の存在も示し、これは、崩壊した抗体または低グリコシル化バリアントである可能性がある。質量回収は、８２．９〜１０２．８％（計算された質量を注射された質量で割る）の間であり、この結果は、優れたタンパク質回収を示し、試料は、カラムに固着したりまたは不溶性の凝集体を含有したりしなかったようであり、このような凝集体はガードカラムによって保持されたものと予想される。全体的に見て、データは、解析した抗シグレック−８抗体試料のいずれにも有意な凝集が存在しないことを示した（表１０）。

【表10】

【0280】

ヒト化候補抗体の凍結融解安定性
精製されたキメラｃｈ２Ｃ４抗体、ヒト化ＨＥＫＡおよびＨＥＫＦ抗体ならびにヒト化ＨＥＫＡｍｕｔおよびＨＥＫＦｍｕｔ抗体バリアントを、６０分間−２０℃に付し、室温で解凍し、候補毎にＥＣ８０濃度におけるＥＬＩＳＡアッセイにおいて使用した。ＨＥＫＡが、このアッセイにおいて最高の安定性を示した（図６）。

【0281】

非フコシル化抗体のＡＤＣＣ活性
材料
ＲＢＣ溶解バッファー（１０×ＲＢＣ溶解バッファー）：製造元の指示通りに１×へと希釈（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、００−４３００−５４）。

【0282】

ＰＢＳ：ＤＰＢＳ、Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋不含（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００２８．０２）。

【0283】

完全ＲＰＭＩ：滅菌濾過したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ＦＢＳ含有。

【0284】

９６ウェルＵ字底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、３５３０７７）。

【0285】

ＬＤＨアッセイ：ＣｙｔｏＴｏｘ ９６非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）。

【0286】

固定バッファー：ＰＢＳにおける１〜４％パラホルムアルデヒド。ＰＢＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｄｉａｔｏｍ、５０−９８０−４８８）において希釈することにより１６％パラホルムアルデヒド（ＥＭグレード、メタノール不含）から調製。

【0287】

方法
好酸球における抗シグレック−８抗体のＡＤＣＣおよびアポトーシス活性を検査するために、新鮮末梢血白血球（ＰＢＬ）を、キメラおよびマウス２Ｅ２抗体と共にインキュベートした。低フコースキメラ２Ｅ２ ＩｇＧ１抗体は、好酸球の最も強力な死滅を示し、フコシル化キメラ２Ｅ２ ＩｇＧ１よりも有意に高い効力を有し、低フコース型の抗体のより高いＡＤＣＣ活性と一貫した（図７）。

【0288】

総末梢血白血球における抗シグレック−８抗体活性の評価のため、収集から２４時間未満の採取されたドナー血液から標準方法によってＰＢＬを得て、完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁する。細胞を計数し、完全ＲＰＭＩ培地において１０×１０^６／ｍＬとなるよう調整し、無菌９６ウェルＵ字底プレートで１００μＬ／ウェルにて平板培養する。抗シグレック−８抗体を０．０００１ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの間の濃度で添加する。プレートを２００ｇで１分間遠心分離し、加湿３７℃インキュベーター内で５％ＣＯ_２にて＞４時間インキュベートする。フローサイトメトリーによって細胞集団を評価して、例えば、表１１に示す試薬を使用し、フローサイトメトリーによって評価して、好酸球および好塩基球の枯渇を査定する。ＣＣＲ３陽性、ＣＤ１６陰性顆粒細胞（高い側方散乱）の細胞の除去を使用して、好酸球の枯渇を検出することができる。好塩基球数は、例えば、ＣＣＲ３陽性低側方散乱細胞の解析により決定することができる。

【表11-1】

【表11-2】

【0289】

精製された好酸球におけるアポトーシスを誘導する抗シグレック−８抗体の能力の評価のため、血液試料からの収集から２４時間未満に採取した新鮮バフィーコートまたは等価な血液製剤を使用する。製造元の説明書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ好酸球単離キット、１３０−０９２−０１０）に従って好酸球の精製を行う。精製された好酸球を１×１０^６／ｍＬで完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、ＩＬ−５（約１ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの濃度で）の存在または非存在下で一晩培養する。翌日、プレートまたはフラスコの反復した洗浄により、培養された好酸球を収集する。細胞を２００〜４００ｇで１０分間未満遠心分離し、１×１０^６／ｍＬで完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁する。好酸球を１００μＬ／ウェルで無菌９６ウェルＵ字底プレートで平板培養する。完全ＲＰＭＩ培地に調製した１００ｕＬの２×試薬を各ウェルに添加し、上述通りに希釈物を調製する。プレートを２００ｇで１分間遠心分離し、加湿３７℃インキュベーター内で５％ＣＯ_２にて≧４時間インキュベートする。製造元の説明書に従ってアネキシン−Ｖ染色を行い、アポトーシスおよび壊死細胞をフローサイトメトリーによって解析する。

【0290】

単離された肥満細胞における抗シグレック−８抗体のＡＤＣＣおよびアポトーシス活性の評価のため、ヒト肥満細胞は、公開されたプロトコール（Ｇｕｈｌら、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０１１年、７５巻：３８２〜３８４頁；Ｋｕｌｋａら、Ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００１年（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．））に従ってヒト組織から単離する、または例えばＹｏｋｏｉら、Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２００８年、１２１巻：４９９〜５０５頁に記載されている通りに、ヒト造血幹細胞から分化させる。精製された肥満細胞を１×１０^６／ｍＬで無菌９６ウェルＵ字底プレートにおける完全ＲＰＭＩ培地に再懸濁し、０．０００１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの間に及ぶ濃度の抗シグレック−８抗体の存在または非存在下で３０分間インキュベートする。精製されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または新鮮ＰＢＬありまたはなしで、試料をさらに４〜１６時間インキュベートして、ＡＤＣＣを誘導する。肥満細胞を検出するための蛍光コンジュゲート抗体（ＣＤ１１７およびＦｃεＲ１）ならびに生きているおよび死んでいるまたは瀕死の細胞を識別するためのアネキシン−Ｖおよび７ＡＡＤを使用したフローサイトメトリーにより、アポトーシスまたはＡＤＣＣによる細胞死滅を解析する。製造元の説明書に従ってアネキシン−Ｖおよび７ＡＡＤ染色を行う。

【0291】

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒト化抗体の好酸球枯渇活性の評価
マウス２Ｅ２抗体と比較した場合の正常ヒト血液由来の好酸球のシグレック−８媒介性枯渇を誘導するその能力に関してヒト化抗体をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。

【0292】

収集後２４時間未満に採取されたヒトドナー血液から得た末梢血白血球（ＰＢＬ）を、完全ＲＰＭＩ培地［（１０％胎仔ウシ血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０４９１−０１））］に再懸濁した。５０ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ−５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０５−ＩＬ−０２５）を補充した完全ＲＰＭＩ培地に、１ｍＬ当たり１０^７となるよう細胞を調整し、１００μＬ／ウェルで無菌９６ウェルＵ字底プレートで平板培養した。０．１ｐｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ（すなわち、１ｐｇ／ｍＬ、１０ｐｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬおよび１０μｇ／ｍＬ）に及ぶ濃度で抗シグレック−８抗体を添加して、用量応答および５０％最大好酸球枯渇（ＥＣ_５０）をもたらす濃度を決定した。プレートを２００ｇで１分間遠心分離し、加湿３７℃インキュベーター内で５％ＣＯ_２にて１６時間インキュベートした。ＩＬ−５の存在下における抗シグレック−８抗体によるＰＢＬの１６時間インキュベーションは、シグレック−８媒介性アポトーシスに対し好酸球を感作した。フローサイトメトリーにより細胞集団を評価して、好酸球の枯渇を査定した。ＣＣＲ３陽性顆粒（高い側方散乱）細胞の除去により好酸球枯渇を検出した。

【0293】

ＨＥＫＡｍｕｔ ＩｇＧ１抗体を除く被験ヒト化抗体のそれぞれは、ヒト好酸球の枯渇に関して、マウス２Ｅ２抗体と比較した場合に等価なまたは増加した効力（すなわち、より低いＥＣ_５０）を示した（表１２）。ＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体およびＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体は、同様の効力を示したため、ヒト好酸球の枯渇に関する抗体効力は、アイソタイプに依存しなかった。

【表12】

平均ＥＣ５０は、２回の独立的アッセイの好酸球枯渇に必要とされる平均最大半量抗体濃度を示す。

【0294】

活性アイソタイプを有する抗シグレック−８抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒト肥満細胞のＡＤＣＣ媒介性死滅を誘導することができる
強力なＦｃ受容体媒介性ＡＤＣＣ活性を有するヒト化抗シグレック−８抗体を作製するために、フコシル基転移酵素８を欠損するＣＨＯ細胞株（Ｌｏｎｚａ、ポテリジェント（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ）ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞）からＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体を発現させて、α１，６フコースを欠如する糖質を有する抗体（すなわち、非フコシル化抗体）を作製した。ＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体とは異なるシグレック−８の細胞外領域を認識する、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有するマウスモノクローナル抗シグレック−８抗体（すなわち、１Ｃ３抗体）を実施例３に記載されている通りに作製した。キメラ１Ｈ１０抗体は、マウスモノクローナル抗体１Ｈ１０のＶ−領域およびヒトＩｇＧ１カッパ定常領域を含有する。１０μＭキフネンシンの存在下で培養したヒト２９３ＴＳ細胞株からキメラ１Ｈ１０抗体を発現させて、低フコース抗体を作製し、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。

【0295】

ヒト肥満細胞に対しＮＫ細胞媒介性ＡＤＣＣ活性を誘導する非フコシル化ＨＥＫＡ ＩｇＧ１およびキメラ１Ｈ１０低フコース抗体の能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ヒト造血幹細胞を生着した免疫不全ＮＳＧＳマウスの腹膜腔の洗浄により、初代ヒト肥満細胞を単離した。１０μｇ／ｍｌの非フコシル化ＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体、キメラ１Ｈ１０低フコース抗体、ＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体またはアイソタイプ対照ヒトＩｇＧ１抗体と、精製したヒトＣＤ５６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫエフェクター細胞と共に、エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比１０．７５：１で肥満細胞を４８時間インキュベートした。ＣｙｔｏＴｏｘ ９６細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１７８０）を使用して、ＬＤＨ放出によりＡＤＣＣ活性を決定した。非フコシル化ＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体およびキメラ１Ｈ１０低フコース抗体は、４８時間後にヒト肥満細胞の顕著なＡＤＣＣ媒介性死滅を誘導した（図８Ａ）。非フコシル化または低フコース抗シグレック−８抗体によって誘導されたＬＤＨ放出は、溶解溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ１８２１）を使用して誘導された最大ＬＤＨ放出の３８〜５３％であった。

【0296】

肥満細胞、好酸球および好塩基球の表面においてヒトシグレック−８が選択的に発現されるトランスジェニックマウスモデルにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでシグレック−８陽性肥満細胞を枯渇させる抗シグレック−８抗体の能力を評価した。腹腔内注射により１００μｇのＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体、ＨＥＫＡ ＩｇＧ１非フコシル化ヒト化抗体、マウス１Ｃ３抗体（マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ）またはヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体でマウスを２回処置した。２回の腹腔内注射を４８時間置いて投与し、第２の注射の４８時間後に、腹膜の洗浄により腹膜肥満細胞を単離した。非フコシル化ＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体およびマウス１Ｃ３抗体投与は、腹膜肥満細胞の有意な枯渇をもたらした。対照的に、ＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体は、有意な肥満細胞枯渇を示さず、活性アイソタイプが、肥満細胞のｉｎ ｖｉｖｏ枯渇に必要とされることを示す（図８Ｂ）。これらの結果は、シグレック−８の細胞外ドメインの異なる領域に対し指向された、活性アイソタイプ、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプまたはヒトＩｇＧ１非フコシル化アイソタイプを有する２種の異なる抗シグレック−８抗体が、ｉｎ ｖｉｖｏでシグレック−８陽性肥満細胞を枯渇させることができることを実証する。

【0297】

シグレック−８は、急速に内部移行され、したがって、ＡＤＣＣ活性の誘導に適さないと記載されているため、これらの結果は予想外であった。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ．、２００９年、３０巻（５号）：２４０〜２４８頁を参照されたい。

【0298】

ヒト化抗シグレック−８は、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト肥満細胞によって媒介されるＩｇＥ誘導性受動皮膚アナフィラキシー反応を阻害する
ヒト造血幹細胞（ＨＳＣ）の生着後に大量のヒト肥満細胞を作製することができる免疫不全マウスが記載されている（Ｔａｎａｋａら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１２年、１８８巻（１２号）：６１４５〜５５頁）。ＮＳＧＳと命名されたマウス系統（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖遺伝子の欠失を有する非肥満糖尿病／重度複合免疫不全（ＮＯＤ ＳＣＩＤ）マウスの派生体である（ＮＳＧマウス）。ＮＳＧＳマウスはその上、ヒト造血幹細胞の生着を容易にするため、３種のヒトサイトカイン（幹細胞因子［ＳＣＦ］、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ）についてトランスジェニックである。ＮＳＧＳマウスの生着後に、ヒトＣＤ３４^＋細胞は、ヒト好酸球および増強された数のヒト肥満細胞を作製する。生着ＮＳＧＳマウスにおける両方の細胞型は、ヒト末梢血および組織から単離される相当する細胞型におけるレベルに匹敵するレベルでシグレック−８を発現する。よって、このようなマウスは、ｉｎ ｖｉｖｏでのヒト細胞における抗シグレック−８抗体の活性の評価のための魅力的なモデルを提供する。

【0299】

肥満細胞活性における抗シグレック−８抗体の効果をｉｎ ｖｉｖｏで評価するために、ヒト化ＮＳＧＳマウスにおけるＩｇＥ媒介性耳腫脹モデルを確立した。このモデルにおいて、ハプテンコンジュゲートウシ血清アルブミン（ＮＰ−ＢＳＡ）の全身性注射の２４時間前の、片耳への特異的モノクローナル抗ハプテンＩｇＥ（抗ＮＰ ＩｇＥ）の注射により、受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）、Ｉ型過敏症反応を誘導した。ヒトイプシロン定常領域を有するキメラ抗ＮＰ ＩｇＥを使用して、ハプテンに対するヒト肥満細胞特異的応答が生じることを確実にし、耳の厚さの変化により、即時型および後期浮腫性応答を測定した。

【0300】

アッセイの８〜１２週間前に、ＮＳＧＳマウスにヒトＣＤ３４^＋ＨＳＣを生着した。ヒト定常領域を有するキメラモノクローナル抗ＮＰ ＩｇＥを、１００ｎｇの用量でマウスの右耳に皮内注射して、マウス皮膚肥満細胞ではなくヒト肥満細胞を感作し、ＰＢＳを左耳に皮内注射した。２４時間後、０．５ｍｇ ＮＰ−ＢＳＡの静脈内注射によりＰＣＡを誘導した。抗ＮＰ ＩｇＥによる感作２４時間前または感作２時間後に、静脈内注射により、０．１ｍｇ抗シグレック−８抗体（すなわち、ＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体）またはヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照抗体をマウスに投薬した。誘導後最大４時間目および誘導後２４時間目の時点で耳の厚さを測定して、それぞれ初期および後期耳腫脹応答を決定した。

【0301】

ＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるこのＰＣＡにおける初期および後期皮膚性アレルギー反応の両方を予防または阻害した（図９）。このモデルにおいて、初期反応は、肥満細胞脱顆粒およびヒスタミン放出に依存するが、後期反応は、サイトカインを含むｄｅ ｎｏｖｏ合成されたメディエーターの肥満細胞分泌ならびに好酸球および好塩基球浸潤に依存する。ＨＥＫＡ ＩｇＧ４抗体は、抗ＮＰ ＩｇＥを感作２４時間前または感作２時間後のいずれかに投薬した場合、ヒト化ＮＳＧＳマウスにおけるＰＣＡ応答も予防または阻害した（図９）。抗体処置の有害効果は、これらの実験経過において観察されなかった。

【0302】

（実施例３）
マウス抗シグレック−８抗体の作製および特徴付け
シグレック−８の細胞外領域は、３個の免疫グロブリン様ドメインで構成される：リガンドに結合する特有のＮ末端Ｖ−セットドメイン（ドメイン１）と、続く２個のＣ−セットドメイン（ドメイン２および３）。抗体１Ｃ３は、ヒトシグレック−８の組換え細胞外ドメイン（配列番号７４）に対して産生されたＩｇＧ２ａ重鎖およびカッパ軽鎖を有するマウスモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体１Ｈ１０および４Ｆ１１は、ヒトシグレック−８の組換え細胞外ドメイン（配列番号７４）に対して産生されたマウスＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖抗体である。表１３を参照されたい。これらの抗体は、ヒト（配列番号７４）および非ヒト霊長類（配列番号１１８）由来の組換えシグレック−８配列に結合した抗体のハイブリドーマスクリーニングから同定された。

【表13】

【0303】

抗シグレック−８抗体のエピトープを含む領域を同定するために、ヒトＩｇ−Ｆｃに融合されたシグレック−８細胞外ドメインのそれぞれを含有する融合タンパク質を発現させ、ＣＨＯ細胞から精製した。抗体結合の決定のためのＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトドメイン１（配列番号１１５）、ドメイン１および２（配列番号１１６）；またはドメイン１、２および３（配列番号１１７）を含有する融合タンパク質を使用した。一部の実験において、アヌビスヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ）由来のシグレック−８（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）参照配列ＸＰ＿００９１９３３７０．１）の細胞外ドメイン１、２および３（配列番号１１８）を含有する融合タンパク質と比較した場合の、ヒトシグレック−８に対する抗体の特異性を評価した。

【0304】

抗体結合アッセイのため、ＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｎｕｎｃ）を０．２μｇ／ｍｌの融合タンパク質で一晩４℃にてコーティングし、ＰＢＳに溶解した２％ＢＳＡで１時間室温にてブロッキングした。１μｇ／ｍｌの抗体を添加し、プレートを２時間室温にてインキュベートした。プレートの洗浄後に、西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を添加し、プレートを１時間インキュベートした。二次抗体は、ヒト化抗体に対しては抗ヒトＨ＋Ｌ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７０９−０３５−１４９）、またはマウス抗体に対しては抗マウスＨ＋Ｌ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号７１５−０３５−１５１）であった。プレートをＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０−１Ｌ）で発色させた。

【0305】

マウス２Ｅ２抗体およびＨＥＫＡ ＩｇＧ１抗体は、ドメイン１融合タンパク質に結合し、これら２種の抗体のエピトープが、Ｎ末端リガンド結合ドメインに存在することを示す（表１４）。対照的に、マウス１Ｃ３抗体は、ドメイン１およびドメイン２融合タンパク質に結合したが、ドメイン１融合タンパク質への検出可能な結合を実証せず、この抗体のエピトープが、ドメイン２にあることを示す（表１４）。

【表14】

【0306】

マウス４Ｆ１１および１Ｈ１０抗体は、ヒトシグレック−８およびアヌビスヒヒ（Ｐａｐｉｏ ａｎｕｂｉｓ）由来の予測されるシグレック−８タンパク質配列（国立バイオテクノロジー情報センター参照配列ＸＰ＿００９１９３３７０．１）に結合した。ドメイン融合タンパク質のＥＬＩＳＡスクリーニングにおいて、また、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットにおいて、４Ｆ１１は、ヒトシグレック−８ドメイン１における線状エピトープを認識し、１Ｈ１０は、ヒトシグレック−８ドメイン３における配列を含む線状エピトープを認識した。１Ｃ３は、ヒトシグレック−８ドメイン２における変性した配列を認識せず、これが、立体構造エピトープを認識したことを示す。抗体４Ｆ１１および１Ｈ１０は、それぞれ５．９および４１ｎｇ／ｍｌのＥＣ_５０で、５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−５の存在下でヒト末梢血白血球からの強力な好酸球枯渇を示す（表１５）。ヒトシグレック−８に特異的なマウス１Ｃ３抗体およびマウス２Ｅ２抗体は、ヒヒシグレック−８と交差反応しなかった。

【表15】

平均ＥＣ５０は、２回の独立的アッセイの好酸球枯渇に必要とされる平均最大半量抗体濃度を示す。

【0307】

ヒトおよびヒヒ好酸球への抗体の結合をフローサイトメトリーにより決定した。ヒトまたはヒヒ末梢血白血球調製物を、飽和量の抗シグレック−８モノクローナル抗体２Ｅ２、１Ｃ３および１Ｈ１０またはマウスＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体で標識した。抗シグレック−８抗体を二次抗マウスＩｇＧ Ｈ＋Ｌ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７により可視化した。高粒度散乱と共にＣＤ４９ｄおよびＣＤ１６に対する霊長類交差反応性モノクローナル抗体を使用して、好酸球を同定した。マウス１Ｈ１０抗体は、ヒヒおよびヒト好酸球に結合した一方、マウス２Ｅ２および１Ｃ３抗体は、ヒト好酸球に結合したが、ヒヒ好酸球と交差反応しなかった（図１０）。ヒトシグレック−８に結合する他のモノクローナルマウス抗シグレック−８抗体は、非ヒト霊長類シグレック−８を認識しないことが示されていたため、これらの結果は予想外であった。Ｈｕｄｓｏｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０１１年、３１巻（６号）：１０４５〜５３頁を参照されたい。
配列

【化10】

【化11】

【化12】

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【化60】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]