特許 6964579 光学キャビティＰＣＲ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6964579

(24)【登録日】2021年10月21日

(45)【発行日】2021年11月10日

(54)【発明の名称】光学キャビティＰＣＲ

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20211028BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20211028BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   C12Q1/686 Z

【請求項の数】22

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2018-503770(P2018-503770)

(86)(22)【出願日】2016年7月27日

(65)【公表番号】特表2018-521665(P2018-521665A)

(43)【公表日】2018年8月9日

(86)【国際出願番号】US2016044255

(87)【国際公開番号】WO2017019768

(87)【国際公開日】20170202

【審査請求日】2019年7月16日

(31)【優先権主張番号】62/199,069

(32)【優先日】2015年7月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506115514

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ

(74)【代理人】

【識別番号】100131451

【弁理士】

【氏名又は名称】津田 理

(74)【代理人】

【識別番号】230117802

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 浩之

(74)【代理人】

【識別番号】100167933

【弁理士】

【氏名又は名称】松野 知紘

(72)【発明者】

【氏名】リー，ルーク ピー．

(72)【発明者】

【氏名】ソン，ジュン ホ

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 特開２００４−１５６９２５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００ − １／４２

Ｃ１２Ｑ １／００ − １／７０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

流体サンプルの熱サイクルのための装置であって、前記装置は、
前記流体サンプルを保持するよう構成された複数のチャンバ壁によって画定される少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバと、
第１の基板上に配置され、前記熱サイクルチャンバの第１のチャンバ壁を画定する第１の薄膜と、
第２の基板上に配置され、前記第１のチャンバ壁に対向する第２のチャンバ壁を形成する第２の薄膜であって、前記第１のチャンバ壁および前記第２のチャンバ壁が光学キャビティを画定する、第２の薄膜と、
前記第１の基板および前記第２の基板の間に配置され、前記光学キャビティの厚みを画定する中間キャビティ層と、
前記第１の薄膜を照明するよう構成される光源であって、発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む光源と、
を備え、
前記第１の基板および前記第２の基板は、前記光源からの光を前記第１の基板および前記第２の基板を通過させるように構成された透明材料を含み、
前記第１の薄膜および前記第２の薄膜は光吸収材料を含み、第１の薄膜上に照明された光の第１の部分が前記第１の薄膜に吸収され、前記第１の薄膜上に照明された前記光の第２の部分が前記第１の薄膜を透過し、
前記第１の薄膜を透過した前記光が前記第２の薄膜を照明し、
前記第２の薄膜上に照明された前記透過光の少なくとも一部が前記第２の薄膜に吸収され、
前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への前記吸収光は、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の温度を上昇させて、前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルを加熱する、光−熱交換を生成する、
装置。

【請求項2】

前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数は、金属層を備える、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記金属層は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタニウム（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、タングステン（Ｗ）、イリジウム（Ｉｒ）、または白金（Ｐｔ）からなる群から選択される金属を備える、請求項２に記載の装置。

【請求項4】

前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数は多層金属構造を備え、
前記金属構造は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタニウム（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、タングステン（Ｗ）、イリジウム（Ｉｒ）、または白金（Ｐｔ）からなる前記群から選択される１つまたは複数の金属を備える、
請求項１に記載の装置。

【請求項5】

前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数が、グラフェン、グラファイト、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、または塗料からなる群から選択される非金属光吸収材料を備える、請求項１に記載の装置。

【請求項6】

前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数が、共振による光吸収を増加させるためのパターン化された表面を備える、請求項１に記載の装置。

【請求項7】

前記第１の基板および前記第２の基板が、ポリマーを含む、請求項１に記載の装置。

【請求項8】

前記第１の基板および前記第２の基板のうちの１つまたは複数が、ピラーアレイ、１Ｄもしくは２Ｄ格子、フォトニック結晶、または半球の１つまたは複数の形態の２Ｄまたは３Ｄマイクロ構造またはナノ構造を備える、請求項１に記載の装置。

【請求項9】

前記第１の薄膜は第１の厚さを有し、前記第２の薄膜は前記第１の厚さとは異なる第２の厚さを有する、請求項１に記載の装置。

【請求項10】

前記第１の薄膜の厚さおよび前記第２の薄膜の厚さが、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜が実質的に均一な温度上昇率を有するように、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への光の吸収速度を一致させるよう選択される、請求項９に記載の装置。

【請求項11】

前記熱サイクルチャンバ内の温度を感知するよう構成される少なくとも１つの温度センサをさらに備える、請求項１に記載の装置。

【請求項12】

前記第１の薄膜および前記第２の薄膜は、前記熱サイクルチャンバ内のＰＣＲ反応阻害を防止するために、パッシベーション層で覆われた表面を有する、請求項１に記載の装置。

【請求項13】

前記熱サイクルチャンバに結合される第１および第２のポートをさらに備え、
前記第１および第２のポートは、前記流体サンプルが前記熱サイクルチャンバに入ることを可能にするよう構成される、
請求項１に記載の装置。

【請求項14】

流体サンプルの超高速熱サイクルを実施するための方法であって、前記方法が、
対向する第１および第２の薄膜によって画定されるマイクロ流体熱サイクルチャンバを提供することであって、第１の薄膜が第１の基板に配置され、第２の薄膜が第２の基板に配置され、前記第１の基板および前記第２の基板は透明であり、
前記熱サイクルチャンバを前記流体サンプルで満たすことと、
前記第１の薄膜を、発光ダイオード（ＬＥＤ）を含む光源で照明することであって、前記光源からの光は第１の基板を通過し第１の薄膜まで達し、
前記第１の薄膜上に照明された光の第１の部分が前記第１の薄膜に吸収され、前記第１の薄膜上に照明された前記光の第２の部分が前記第１の薄膜を透過することと、
前記第１の薄膜を透過した前記光で前記第２の薄膜を照明することであって、
前記第２の薄膜を照明する前記透過光の少なくとも一部が前記第２の薄膜に吸収されることと、
前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への前記吸収光の関数として前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の温度を均一に上昇させることと、
前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の前記温度上昇の結果として、前記熱サイクルチャンバ内で前記流体サンプルを加熱することと、
を備える、方法。

【請求項15】

前記第１の薄膜の照明は、前記流体サンプルの超高速マイクロ流体ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うために間欠的に適用される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の温度を均一に上昇させることが、
前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルの前記温度を第１の期間選択された温度に上昇させるために、第１の持続期間に前記第１および第２の膜を照明することと、
前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルの前記温度を第２の期間選択された温度に上昇させるために、第２の持続期間に前記第１および第２の膜を照明することと、
前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルの前記温度を第３の期間選択された温度に上昇させるために、第３の持続期間に前記第１および第２の膜を照明することと、
前記流体サンプルを増幅するために複数のサイクルの間、照明期間のサイクルを繰り返すこと、
を備える、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記第１の薄膜は第１の厚さを有し、前記第２の薄膜は前記第１の厚さとは異なる第２の厚さを有する、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記第１の薄膜の厚さおよび前記第２の薄膜の厚さは、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜が実質的に均一な温度上昇率を有するように、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への光の吸収速度を一致させるよう選択される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記熱サイクルチャンバ内の温度を測定すること、
をさらに備える、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

前記第１の薄膜および前記第２の薄膜は、前記熱サイクルチャンバ内のＰＣＲ反応阻害を防止するために、パッシベーション層で覆われた表面を有する、請求項１５に記載の方法。

【請求項21】

前記熱サイクルチャンバを前記流体サンプルで満たすことが、
前記熱サイクルチャンバに結合される第１のポートを介して流体サンプルを前記サイクルチャンバに注入すること、
を備え、
前記注入された流体サンプルが、前記熱サイクルチャンバに結合された第２のポートから空気を押し出す、
請求項１５に記載の方法。

【請求項22】

前記光学キャビティが、前記ＰＣＲ反応中に蛍光発光を発生させるよう構成される、請求項１５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／１９９，０６９号に対する優先権およびその利益を主張する。

【0002】

連邦政府支援の研究または開発に関する声明
該当せず

【0003】

コンピュータプログラム添付物の援用
該当せず

【0004】

著作権保護の対象物の通告
本特許文書中の資料の一部は、米国および他国の著作権法に基づく著作権保護の対象となる。著作権の所有者は、米国特許商標庁の公開ファイルまたは記録に記載されているように、特許文書または特許開示の複製に異論を唱えないが、それ以外のすべての著作権を留保する。著作権所有者は、本特許文書を秘密保持する権利を放棄しない。これには、連邦規則集第３７編セクション１．１４に基づく権利を含むがこれに限定されない。

【背景技術】

【0005】

１．技術分野

【0006】

本開示は、一般に、核酸増幅系、より詳細には、医学診断および生命科学のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）熱サイクル系に関する。

【0007】

２．背景技術

【0008】

エボラウイルス病（ＥＶＤ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、鳥インフルエンザＡ（Ｈ７Ｎ９）ウイルスによるヒト感染などの致命的な疾病が世界的に発生するため、迅速かつ正確な診断が急務である。多くの医療診断検査のための「ゴールドスタンダード」であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、臨床検査、環境科学、法医学、農業科学の分野において重要な技術となっている。典型的には、２つまたは３つの別個の温度の間に複数のサイクルを必要とするＰＣＲは、加熱ブロックとプラスチックＰＣＲチューブとの間の熱伝達が遅いだけでなく、ペルチェベースの加熱ブロックの熱質量が大きいため増幅ごとに１時間以上かかる。しかしながら、治療ターンアラウンドタイム（ＴＡＴ）を早くすることで、死亡率だけでなく、無意識に他の人に病気を伝える重大なリスクを低下させるため、高速／超高速ＰＣＲは、感染症、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、およびポイントオブケア（ＰＯＣ）レベルでの敗血症の時間感受性診断などの用途に非常に望ましい。

【0009】

空気加熱／冷却および毛細管または直接抵抗加熱を用いる商業用ＰＣＲシステムは、１０分以内に３０回の熱サイクルを行うことができる。しかしながら、これらのシステムは、一般に、それらの高い電力消費（最大８００〜１０００Ｗ）および重量（２０ｋｇを超える）のためにＰＯＣ試験には適していない。発展途上国やフィールドラボなどのリソースが限られた環境でのＰＯＣ試験では、高速／超高速ＰＣＲシステムは、小型化と集積化による低消費電力によって、感度、選択性、可搬性、堅牢性、シンプルさ、使いやすさといったことを特徴とするべきである。

【0010】

これらの要求を達成するために、高速／超高速ＰＣＲシステムのためのマイクロ流体アプローチは、サンプル体積（すなわち熱質量）を減少させることにより増幅時間を短縮し、迅速な熱伝達を可能にし、したがって、低電力消費でより高速の熱サイクルを可能にするために広範に研究されてきた。静的マイクロ流体ＰＣＲ熱サイクルに最も一般的に使用される方法は、マイクロ製造された薄膜ヒータおよび抵抗温度検出器（ＲＴＤ）による抵抗加熱である。消費電力は比較的少ないが、本方法は、薄膜ヒータおよびＲＴＤをチップ上に集積するために複雑な製造プロセスが必要である。

【0011】

ペルチェ熱ブロックは、迅速な加熱および冷却速度のために静的および連続フローＰＣＲの両方に広く使用されるが、より高い電力消費を必要とする。連続フローＰＣＲの場合、ＰＣＲ増幅は、反応サンプルが完全な離散温度ゾーンを通過する場合に起こる。この方法は、静的ＰＣＲよりも速い熱サイクルを生成することができるが、一般に、フロー制御のために外部シリンジポンプを必要とし、サイクル数を変更する機能がない。別のアプローチは、１０００ｎｍを超える波長で水による強力なＩＲ吸収を利用するＩＲレーザまたはフィラメントランプを使用するＰＣＲ熱サイクルのためのＰＣＲ混合物の赤外線（ＩＲ）媒介非接触選択加熱を含む。しかしながら、ＰＣＲ混合物の容量がナノリットルからマイクロリットルに増加するにつれて、ＰＣＲ溶液の急速加熱および冷却の制限のために、全熱サイクル時間も約５分から約４０分に増加する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、本明細書の目的は、小型化と集積化による低消費電力によって、感度、選択性、可搬性、堅牢性、シンプルさ、使いやすさを特徴とするＰＯＣ試験のための高速／超高速ＰＣＲシステムである。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本明細書の一態様は、迅速で正確で信頼性の高いＰＣＲベースの診断のために発光ダイオード（ＬＥＤ）によって駆動される光学キャビティＰＣＲシステムおよび方法である。一様な光吸収とその後のフォトサーマル光熱変換のために構成された２つの金属（例えば、Ａｕ）薄膜を備える光学キャビティは、ＰＣＲ熱サイクルに使用される。シミュレーション結果は、厚さ７５０ｐｍのキャビティ全体の温度差が、９４℃（変性）および６８℃（アニーリング／伸長）でそれぞれ２℃および０．２℃未満であることを示している。本明細書による光学キャビティＰＣＲは、サイクル間の温度変化が１℃未満で優れた温度精度を示し、熱質量が低く、Ａｕ薄膜の低い熱質量および高い熱伝導率のために４分以内に９４℃から６８℃まで３０回のＰＣＲ熱サイクルを達成することができる。本明細書のＬＥＤ駆動光学キャビティＰＣＲ法を用いて、核酸（ｃ−ＭＥＴ ｃＤＮＡ）増幅を、１５分以内に１０^−８ｎｇ／μＬ^−１（２コピー／μＬ）の最も低い鋳型ＤＮＡ濃度で実証した。

【0014】

本技術のさらなる態様は、本明細書の以下の部分に記載され、詳細な説明は、本技術の好ましい実施形態を制限なしに完全に開示することを目的とする。

【0015】

本明細書に記載された技術は、例示のみを目的とする以下の図面を参照することにより、より完全に理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1A】明瞭にするために、部分的に除去された上部および中間キャビティ層を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅のための光学キャビティの斜視図である。

【図1B】図１Ａの光学キャビティにおける光吸収の概略側面図である。

【図1C】図１Ａのキャビティに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による対応する核酸増幅の模式図である。

【図2A】ＬＥＤ光源を有する図１Ａの光学キャビティＰＣＲ装置の概略斜視図である。

【図2B】図２ＡのＬＥＤ駆動光学キャビティＰＣＲ装置の概略側面図である。

【図3】図１Ａの光学キャビティの層形成の拡大側面図である。

【図4A】底のみおよびキャビティ（上部および底部）加熱のための厚さ７５０ｐｍの光学ＰＣＲチャンバ内の計算された温度分布の画像である。

【図4B】底のみおよびキャビティ（上部および底部）加熱のための厚さ７５０ｐｍの光学ＰＣＲチャンバ内の計算された温度分布の画像である。

【図4C】底のみおよびキャビティ（上部および底部）加熱のための厚さ７５０ｐｍの光学ＰＣＲチャンバ内の計算された温度分布の画像である。

【図4D】底のみおよびキャビティ（上部および底部）加熱のための厚さ７５０ｐｍの光学ＰＣＲチャンバ内の計算された温度分布の画像である。

【図5】図４Ａから図４Ｄの白い矢印に沿ったＰＣＲチャンバの温度プロファイルのプロットを示す図である。

【図6】本明細書の光学ＰＣＲチャンバのｚ軸（ｘ軸上の０ｐｍ）に沿った温度差をＰＣＲチャンバ高さの関数として示すグラフである。

【図7】異なるチャンバ高さのＬＥＤ駆動光学キャビティを使用して、９４℃から６８℃までの３０回のＰＣＲ熱サイクルの代表的な温度プロファイルを示す図である。

【図8A】チャンバ高さが変化する本明細書の光学キャビティＰＣＲ装置の３０回の熱サイクルの合計反応時間を示す図である。

【図8B】３０回のＰＣＲサイクル中の平均速度および異なるチャンバ高さに対するサンプル標準偏差を示す図である。

【図8C】異なるチャンバ高さを有する３０回の熱サイクル中の９４℃（変性）および６８℃（アニーリング／伸長）における測定された温度分布を示す図である。

【図8D】２つの位置の間の熱サイクル中の温度プロファイルの比較を示す図である。

【図9A】９５℃から６８℃の異なるサイクル数を有する本明細書の光学キャビティＰＣＲ装置（７５０ｐｍ厚のＰＣＲチャンバを有する）と比較した、ベンチトップ熱サイクラーからの２％アガロースゲル画像を示す図である。

【図9B】鋳型ＤＮＡの異なる初期濃度を有する本明細書のＰＣＲ装置からの２％アガロースゲル画像を示す図である。

【図10】本明細書の光学キャビティＰＣＲ装置と比較したベンチトップ熱サイクラーの全反応時間を要約したグラフを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下に詳述する実施形態は、ＰＣＲ混合物または同様の物質を加熱するための光学キャビティ（光学キャビティＰＣＲ）に関する。典型的なＰＣＲ感知プロセスでは、ＰＣＲ混合物は、一般に、ＰＣＲ反応に影響を及ぼすために複数の加熱および冷却サイクルを経る。したがって、標的サンプル（例えば、ＰＣＲ混合物）の迅速かつ均一な加熱は、ＰＯＣ試験に非常に有益である。以下に詳述する実施形態はＰＣＲベースの感知に関するが、本明細書の光学キャビティは、サンプルの迅速かつ均一な加熱が望まれる任意のプロセスで使用するために組み込むことができることが理解される。

【0018】

１．光学キャビティＰＣＲ構成

【0019】

図１Ａは、明瞭にするために、部分的に除去された上部およびキャビティ層を有するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅のための光学キャビティ２０を備えるＰＣＲ感知装置１０の一実施形態の斜視図である。図１Ｂは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による光吸収および対応する核酸増幅を示す、光学キャビティ２０の概略側面図である。

【0020】

一実施形態では、光学キャビティ２０は、以下、ＰＣＲベースの試験のためのＰＣＲ混合物を保持する特定の例のために使用される場合、「ＰＣＲチャンバ」と称する、マイクロ流体熱サイクルチャンバ２４の壁を画定するように離間された２つの対向する薄膜シートまたは層（下部薄膜２２ａおよび上部薄膜２２ｂ）を備える。薄膜２２ａおよび２２ｂは、好ましくは、光吸収材料を含むか、または薄膜の迅速かつ均一な加熱をもたらすように光を吸収するよう構成されている。下部薄膜２２ａと上部薄膜２２ｂとの両方がそれぞれ下部基板層１８と上部基板層１４との上に堆積される。光学キャビティ２０は、例えば、単一の熱サイクルチャンバ２４、または多重増幅用のチャンバのアレイを備えることができる。

【0021】

好適な実施形態では、薄膜２２ａおよび２２ｂの１つまたは複数がＡｕを備える。しかしながら、他の材料または組成物、例えば、銀（Ａｇ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタニウム（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、タングステン（Ｗ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）、および上記の金属から構成される任意の合金、または上記の金属もしくはその組み合わせから構成される多層金属構造を使用してもよい。

【0022】

さらに、薄膜シート２２ａおよび２２ｂは、グラフェン、グラファイト、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、または塗料などを含む非金属の光吸収材料を含むことができる。

【0023】

別の実施形態では、下部薄膜２２ａおよび上部薄膜２２ｂの１つまたは複数をパターン化して、共振による光吸収を増加させることができる。パターン化された薄膜は、平坦なポリマー基板１４、１８上に形成することができ、ピラーアレイ、１Ｄもしくは２Ｄ格子、フォトニック結晶、または半球の１つまたは複数の形態で２Ｄまたは３Ｄマイクロ構造またはナノ構造を備える。

【0024】

中間キャビティ層１６は、光学キャビティ２０の厚さを画定するために、下部基板層１８と上部基板層１４との間に配置される。好適な実施形態では、下部基板層１８および上部基板層１４はそれぞれ、アクリルガラス、例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）または光の透過を可能にする同様の物質などの透明ポリマーを含む。

【0025】

好適な実施形態によれば、下部基板層１８および上部基板層１４は、好ましくは、光が光学キャビティ２０を通過することを可能にする透明または半透明の組成物を含む。下部基板層１８および上部基板層１４は、一般的にＰＭＭＡを含むものとして本明細書で詳細に説明されるが、そのような材料の選択は例示に過ぎず、任意の数のポリマーまたは半透明／透明材料を、薄膜のためのプラットフォームとして使用するために選択することができる。下部基板層１８および上部基板層１４はまた、ピラーアレイ、１Ｄもしくは２Ｄ格子、フォトニック結晶、半球、または他のパターン化されたもしくはランダムな構造（図示せず）の１つまたは複数を含むことができる２Ｄまたは３Ｄマイクロ構造またはナノ構造を備えることができる。一実施形態では、下部基板層１８および上部基板層１４は、ナノプラズモニック構造の共振波長で照明されるように構成されたウェルの表面上のナノプラズモニック構造またはナノプラズモニック性のフィードバックレーザーキャビティと、ナノプラズモニック構造のプラズモニック光熱加熱を引き起こす持続期間とを備える。

【0026】

図１Ａから分かるように、一対のポート２５ａ、２５ｂは、上部基板層１４および中間キャビティ層を介して光学チャンバ２０に連通している。ポート２５ａ、２５ｂは、試料またはサンプル（例えば、ＰＣＲ混合物）の分配を可能にする。一実施形態では、ＰＣＲ混合物が、第１のポート２５ａに注入され、ＰＣＲ混合物が、ＰＣＲチャンバ２４を満たす。第２のポート２５ｂは、ＰＣＲ混合物が、チャンバ全体を密閉し、第２のポート２５から出るまで、空気をチャンバから押し出すことを可能にする。１つまたは複数の流体弁および／または流体制御装置（両方とも図示せず）を用いて、ＰＣＲチャンバ２４の充填を容易にすることができる。

【0027】

図１Ｂは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸増幅のための光学キャビティ２０における光吸収の概略図を示す。光が初期強度ｌ_０で下部基板層１８（例えば、ＰＭＭＡ）を通って照明された場合、光は下部薄膜２２ａを通って反射され（Ｒ_１）、吸収され（Ａ_１）、透過される（Ｔ_１）。続いて、透過光（Ｔ_１）はチャンバ２４を通過し、上部薄膜２２ｂを通って反射され（Ｒ_２）、吸収され（Ａ_２）、透過される（Ｔ_２）。薄膜２２ａおよび２２ｂは、ＰＣＲ熱サイクルのためのプラズモニックフォトサーマル光熱変換器として作用する。吸収光Ａ_１、Ａ_２は、ＰＣＲの熱サイクルのための薄膜（例えば、Ａｕ）原子のフォトサーマル加熱に寄与する。

【0028】

図１Ｃは、薄膜の加熱の際に起こる変性、アニーリング／伸長、およびコピー（増幅）段階のＰＣＲプロセスの一実施形態を示す。

【0029】

第１のステップ（１）では、本プロセスは、薄膜２２ａ、２２ｂに光を特定の持続期間照明することにより、薄膜２２ａ、２２ｂへの光の吸収量が均一化およびそれに伴う薄膜２２ａ、２２ｂの加熱に影響を与え、それにより、チャンバ２４内の流体サンプル（例えば、ＰＣＲ混合物）の温度を、第１の期間、選択された温度に上昇させて、ＰＣＲ混合物内の変性に影響を及ぼす。

【0030】

第２のステップ（２）において、薄膜２２ａおよび２２ｂは、特定の持続期間、入力光で再度照明され、それにより、チャンバ２４内の流体サンプル（例えば、ＰＣＲ混合物）の温度を、ＰＣＲ混合物内のアニーリング／伸長に影響を与える第２の期間の間、選択された温度に上昇させる。

【0031】

第３のステップ（３）において、薄膜２２ａおよび２２ｂは、特定の持続期間、入力光で再度照明され、それにより、チャンバ２４内の流体サンプル（例えば、ＰＣＲ混合物）の温度を、ＰＣＲ混合物内のコピー／増幅に影響を与える第３の期間の間、選択された温度に上昇させる。

【0032】

一実施形態では、第３のステップが、約３０から４０サイクル繰り返される。

【0033】

このモデルに基づいて、Ａｕ膜１および２の全吸収は、式１および式２によって与えられ、

【数1】

【数2】

ここで、Ｉ_０はＬＥＤからの光の初期強度であり、Ａ_１（およびＡ_２）、Ｔ_１（およびＴ_２）、およびＲ_１（およびＲ_２）はそれぞれ薄膜２２ａ（および２２ｂ）の吸収度、透過率、および反射率である。

【0034】

Ａｕ膜の厚さは、最大の均一温度分布および最大の全光吸収（ΣＡ_{ｆｉｌｍ１}＋ΣＡ_{ｆｉｌｍ２}）の両方の薄膜（ΣＡ_{ｆｉｌｍ１}＝ΣＡ_{ｆｉｌｍ２}）で均一な光吸収を有するよう最適化される。最初に、ＬＥＤの厚さおよび発光スペクトルの異なるＡｕ薄膜の測定された吸収スペクトルから、ＬＥＤの発光波長にわたるＡｕ薄膜２２ａ、２２ｂの平均透過率、反射率、および吸収度を計算する。（表２参照）。次いで、表１に示すように、上下のＡｕ厚の組み合わせごとに吸収率（ΣＡ_{ｆｉｌｍ１}／ΣＡ_{ｆｉｌｍ２}）と全吸収量（ΣＡ_{ｆｉｌｍ１}＋ΣＡ_{ｆｉｌｍ２}）を計算する。Ａｕ薄膜２２ａの厚さ１０ｎｍとＡｕ薄膜２２ｂの厚さ１２０ｎｍの組み合わせは、吸収比（１．０６）と光の全吸収（７０％）の両方に最適であることが分かり、好ましい構成で光学キャビティ２０のためのＡｕ薄膜の厚さとして使用することができる。

【0035】

また、薄膜２２ａ、２２ｂの吸収を調整するために代替材料を使用することもできることも理解されよう。例えば、下部薄膜２２ａは、上部薄膜２２ｂよりも（より透過特性が高い）吸収性の低い材料で構成することができる。したがって、ジオメトリおよび／または材料組成を使用して、薄膜２２ａ、２２ｂの吸収特性を調整することができる。

【0036】

図２Ａは、照明または光源を備えた光学キャビティＰＣＲ装置１０の概略斜視図を示す。図２Ｂは、光学キャビティＰＣＲ装置１０の概略側面図を示す。光源は、入力光ｌ_０を光学キャビティ２０に向けるためのレンズ３０を備えている、プラットフォーム３２（例えば、４０ｍｍの円形クールベース）上に配置された一連のＬＥＤ３４（例えば、７つのＬｕｘｅｏｎ Ｒｅｂｅｌロイヤルブルー、７００ｍＡ注入電流で、４４７．５ｎｍのピーク波長、６２３０ｍＷを有するＬＥＤ）として示される。別の光源には、レーザーダイオード（ＬＤ）、タングステンランプ、蛍光灯、ハロゲンランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。光源のタイプの選択、および／または入力光Ｉ_０の波長もしくは強度の選択は、薄膜２２ａおよび２２ｂの共振周波数に影響を及ぼす可能性があり、したがって、薄膜２２ａおよび２２ｂの厚さおよび材料の選択は、入力光Ｉ_０の性質により変化する可能性があることが理解される。

【0037】

Ｋ型熱電対２８を有する基準チャンバ２６は、光学キャビティ２０の隣に配置される。基準チャンバ２６および光学キャビティ２０は、光学キャビティ２０および基準チャンバ２６の両方が同じ光強度を受けて、フォトサーマル加熱が同じ速度で行われることを保証するために、レンズ３０の焦点距離で入力光ビームＩ_０ウエスト（例えば、φ＝１２ｍｍ）によって覆われるよう構成される。光学キャビティ２０と基準チャンバ２６の両方は、光吸収を最大にするためにレンズ３０の焦点距離（この構成ではレンズの上面から２５ｍｍ離れた位置）に配置される。一実施形態では、レンズ３０は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｏｐｔｉｃｓ ７ Ｃｅｌｌ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｏｐｔｉｃアレイを含む。

【0038】

基準チャンバ２６は、チャンバ内の温度の基準を提供するために、図２Ａの構成で使用されることが理解される。しかしながら、ＰＯＣ試験のための好ましい構成では、本明細書の装置は、基準チャンバ２６なしで、光学キャビティ２０、または複数の、もしくは多重化された光学キャビティのアレイのみを含むことができる。そのような場合、チャンバ２４の温度に関するフィードバックは、温度センサ（図示せず）または他の感知手段を介して取得することができる。

【0039】

図３は、光学キャビティ層および基板層の積層の拡大図を示す。一実施形態では、薄膜２２ａおよび２２ｂのそれぞれは、金属層または光吸収材料によるＰＣＲ反応阻害を防止するために、パッシベーション層２３で覆われる。パッシベーション２３層は、酸化物薄膜、薄いポリマー層、または薄いタンパク質層などを含むことができる。中間キャビティ層１６は高さｈを有し、上部ＰＭＭＡ層１４および下部ＰＭＭＡ層１８は高さｈ_ｓを有する。本明細書の装置を試験するために使用される１つの例示的な実施形態では、（全キャビティ長４ｍｍに対して）ｈ_ｓ＝１．４ｍｍ、Ｌ_１＝６ｍｍ、Ｌ_２＝４ｍｍ、キャビティ厚ｈを、１００ｐｍ、２００ｐｍ、４００ｐｍ、および７５０ｐｍから変化させた。上記の寸法は１つの潜在的な実施形態の例示であるが、他の構成も考えられることが理解される。

【0040】

以下でさらに詳細に説明する試験では、高速モード、オートゼロ、および冷接点補償（図示せず）を備えたナショナルインスツルメンツ（ＮＩ）９２１３ １６チャネル熱電対モジュールを使用して、タイプＫ熱電対２８から正確な温度を取得した。温度サイクルは、ＬａｂＶＩＥＷプログラムによりすべて制御された、ＬＥＤ３４、８０ｍｍ冷却ファン（図示せず）、ソースメータ（図示せず）、および熱電対２８を使用して行った。

【0041】

１つの例示的な構成では、厚さ１ｍｍのポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）シートを、光学キャビティ２０の上部基板層１４および下部基板層１８で使用し、ならびに中間キャビティ層１６のための１００、２００、４００、および７５０Ｍｍ厚のＰＭＭＡシートを、ＶｅｒｓａＬＡＳＥＲ ＶＬ−２００レーザ切断システム（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｃ．、Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ、ＡＺ、ＵＳＡ）で切断した。上部基板層１４をオーブン内に５６℃で６時間インキュベートして、レーザ切断による損傷領域のアニーリングを可能にした。下部基板層１８および中間キャビティ層１６は、最初に、１０分間のＰＭＭＡシートのＵＶ／オゾン処理後、０．２メートルトンの圧力で１４０°Ｆで行われる熱接着を使用して互いに接合された。次いで、底部（キャビティチャンバ層と結合した）および上部層を７０％エタノールで１０分間２回洗浄し、脱イオン（ＤＩ）水ですすぎ、Ｎ_２を用いて乾燥させた。異なる厚さ（１０、２０、４０、８０、および１２０ｎｍ）のＡｕ薄膜２２ａ、２２ｂを、２×１０^−７Ｔｏｒｒのベース圧力下で電子ビーム（Ｅ−ビーム）蒸着によって底部および上部ＰＭＭＡシート上に堆積させた。Ａｕ薄膜によるＰＣＲ反応阻害を防ぐために、厚さ５０ｎｍのＳｉＯ_２パッシベーション層をＲＦスパッタリングによってＡｕ薄膜２２ａ、２２ｂ上に堆積させた。最後に、１０分間のＰＭＭＡシートのＵＶ／オゾン処理後に１４０°Ｆで０．２メートルトンの圧力で行われた熱接着を使用して、底部（キャビティチャンバ層と結合された）および上部層を一緒に結合して光学キャビティ２０ＰＣＲチャンバ２４を形成した。

【0042】

一実施形態では、光学キャビティ２０は、リアルタイム光学キャビティＰＣＲのためのＰＣＲ反応の間に蛍光発光のレージング用に構成することができる。そのような構成は、従来のリアルタイムＰＣＲと比較して、リアルタイムキャビティＰＣＲの感度をさらに高めることができる。

【0043】

２．実験結果

【0044】

ａ．光学キャビティＰＣＲの温度均一性のシミュレーション

【0045】

ＣＯＭＳＯＬを用いた一組の熱伝達シミュレーションを実施して、ＰＣＲ熱サイクル中の光学キャビティ２０内の温度均一性を特徴づけた。図４Ａから図４Ｄは、底のみおよびキャビティ（上部および下部）加熱のための厚さ７５０ｐｍのＰＣＲチャンバ内の計算された温度分布を示す。図４Ａおよび図４Ｃは、底部のみを加熱した場合の計算された温度分布を示し、図４Ｂおよび図４Ｄは、ＰＣＲチャンバ２４内での上部および底部（キャビティ）加熱の場合の計算された温度分布を示し、チャンバの中心（ｘ軸上に０ｐｍ、ｚ軸上に３７５ｐｍ）の温度が、それぞれ、変性のために９４℃に達し、アニール／伸長のために６８℃に達する。

【0046】

図４Ａから図４Ｄは、本明細書の装置の光学キャビティ（上部および底部）加熱が、底部のみの加熱、特に９４℃での加熱よりもより均一な温度分布を提供するという明確な説明を提供する。チャンバの高さにわたる温度勾配（白い矢印に沿った）が図５にプロットされている。本明細書によるキャビティ加熱は、それぞれ、９４℃および６８℃での底部のみの加熱の場合の１４．４℃および０．４℃の温度差と比較して、僅か１．９℃および０．２℃の差でより良好な温度均一性を示す。

【0047】

図６を参照すると、温度均一性に対するＰＣＲチャンバの高さの影響もまた調査した。ＰＣＲチャンバの高さが減少するにつれて、チャンバの高さにわたる温度差（ΔＴ＝Ｔ_ｍａｘ−Ｔ_ｍｉｎ）は、底部のみおよびキャビティ加熱構成の両方で減少し、これは、熱伝達は、より薄いＰＣＲチャンバ内のより小さな体積に対してより効果的であり得るためである。さらに、本明細書の装置のキャビティ加熱が、変性温度およびアニーリング／伸長温度の両方で、すべてのチャンバ高さのずっと小さな温度差を示すことは注目に値する。したがって、本明細書によるキャビティ加熱を用いることにより、効率的で信頼できる核酸増幅のためにＰＣＲ混合物の均一な加熱が可能になる。

【0048】

ｂ．ＬＥＤ駆動光学キャビティＰＣＲ熱サイクラー

【0049】

図７は、異なるチャンバ高さのＬＥＤ駆動光学キャビティを使用して、９４℃から６８℃までの３０回のＰＣＲ熱サイクルの代表的な温度プロファイルを示す。キャビティ高さｈが減少するにつれて３０ＰＣＲサイクルの合計時間は減少し、１００ｐｍ厚の光学キャビティ２０ＰＣＲチャンバ２４での最小時間（平均２３５．５秒）を達成し、図８Ａに示されたように０．９８９９の調整されたＲ_２値で良好な直線性を示す。

【0050】

熱サイクル結果を用いて、加熱および冷却速度を計算した。図８Ｂに示すように、３０のＰＣＲサイクルおよびサンプル標準偏差の間の平均速度を得た。１００ｐｍ厚のＰＣＲチャンバ２４から、７．５０±０．４６℃秒^−１および６．３５±０．４９℃秒^−１の最も速い加熱および冷却速度が得られた。

【0051】

図８Ｃは、異なるチャンバ高さを有する３０回の熱サイクル中の９４℃（変性）および６８℃（アニーリング／伸長）における測定された温度分布を示す。各ＰＣＲサイクルで達成される最高および最低温度は、９４℃で１℃未満、６８℃で０．５℃未満に変化し、市販のベンチトップ熱サイクラーと同等の温度精度を示す。特に、厚さ５０ｎｍのＳｉＯ_２層を介したＡｕ薄膜とＰＣＲ混合物との間の熱量の低下および熱の高速伝達のために、キャビティＰＣＲのオーバーシュートおよびアンダーシュートはベンチトップ熱サイクラー（９４℃で約２℃、６８℃で約４℃）と比較して、非常に低く（９４℃で０．８５℃、６８℃で０．２５℃）、ベンチトップ熱サイクラーは高速熱サイクル用に設計されていないため、高速サイクルが行われる。

【0052】

位置１（基準チャンバ２６）および２（光学キャビティＰＣＲチャンバ２４）の両方のチャンバを同じ速度で確実に加熱するために、Ｋ型熱電対２８を有する基準チャンバ２６を両方の位置に配置し、熱サイクルを行った。図８Ｄは、位置１および２の間の熱サイクル中の温度プロファイルの比較を示しており、両方の位置が、薄いＡｕ層のフォトサーマル加熱のためにＬＥＤから同じ強度の光を受けることが明確に分かる。

【0053】

ｃ．光学キャビティＰＣＲを用いた核酸増幅

【0054】

本明細書のＬＥＤ駆動光学キャビティＰＣＲシステムおよび方法を検証するために、核酸（ｃ−ＭＥＴ ｃＤＮＡ、肺癌バイオマーカー）の増幅が実証された。

【0055】

ヒトＨＧＦＲまたはｃ−ＭＥＴ ｃＤＮＡをＰＣＲのための鋳型として使用した。推奨濃度の従来のベンチトップＰＣＲの場合、ＰＣＲ反応は、０．０８μＬのＫＡＰＡ２Ｇ ＤＮＡポリメラーゼ、４μＬの５×ＫＡＰＡ２Ｇ緩衝液Ａ、０．４μＬのｄＮＴＰ混合物、１μＬの各順方向および逆方向ｃ−ＭＥＴプライマー（ストック溶液１０μＭ）、６．７μＬ ＢＳＡ（最終濃度１０μｇ μＬ^−１ＢＳＡの場合は３％ｗ／ｖストック溶液）、および２μＬの鋳型ｃＤＮＡからなる。水を加えて最終容量を２０μＬとした。高速サイクルキャビティＰＣＲにおける増幅効率を高めるために、高濃度のポリメラーゼおよびプライマーを使用した。キャビティＰＣＲのＰＣＲ反応は、０．４μＬのＫＡＰＡ２Ｇ ＤＮＡポリメラーゼ、２μＬの５×ＫＡＰＡ２Ｇ緩衝液Ａ、０．２μＬのｄＮＴＰ混合物、１μＬの各順方向および逆方向ｃ−ＭＥＴプライマー（ストック溶液１００μＭ）、３．３μＬのＢＳＡ（最終濃度１０μｇ μＬ^−１ＢＳＡの場合は３％ｗ／ｖストック溶液）、および１μＬの鋳型ＤＮＡからなる。再び、反応が最終容量１０μＬになるまで水を加えた。ｃ−ＭＥＴ ｃＤＮＡの濃度もまた変化し、１０−８ｎｇ μＬ^−１（２コピー／μＬ）に低下させた。

【0056】

熱サイクルの間に気泡が形成されないことを確実にするために、チャンバ２４の他方の側の第２のポート２５が流体で満たされるまで、ＰＣＲ混合物をピペットおよび第１のポート２５を用いて光学キャビティ２０ＰＣＲチャンバ２４に装填した。２つのポート２５を、ＰＣＲシーリングテープでシールして、気泡の形成または流体の損失を確実に防止した。光学キャビティ２０は、厚さ１２０ｎｍのＡｕ膜を上部に有する基準チャンバ２６と一列に配置し、これは、均一な光吸収と、Ａｕ薄膜の最大総吸収のための最適な構成である。増幅後、１０μＬのＰＣＲ産物（ピペットを用いてキャビティＰＣＲチャンバから回収）と１０μＬのＥ−Ｇｅｌサンプル充填バッファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）との混合物を、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ ＤＮＡゲル染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＥ−Ｇｅｌ ２％アガロースゲルに充填し、Ｅ−Ｇｅｌ ｉＢａｓｅ Ｐｏｗｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で実行し、Ｅ−Ｇｅｌ Ｓａｆｅ Ｉｍａｇｅｒ Ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒでゲル画像を撮った。５０ｂｐのＤＮＡラダーを用いて、生成物のサイズを確認した。基準ＰＣＲシステムには、ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムを備えたＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃ１０００ＴＭ熱サイクラーを使用した。ＰＣＲは、ベンチトップについては２０μＬ容量で行い、異なるチャンバ厚さでのキャビティＰＣＲについては５μＬおよび１０μＬ容量で行った。ｃ−ＭＥＴ ｃＤＮＡに加えて、λ−ＤＮＡは、初期キャビティＰＣＲ最適化のためのＰＣＲの鋳型としても使用した。Ｚ−ＴａｑＴＭ ＤＮＡポリメラーゼを用いて１０４塩基対（ｂｐ）λ−ＤＮＡ標的を増幅するＰＣＲ反応には、０．５μＬのＺ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、５μＬの１０×Ｚ−Ｔａｑ緩衝液、４μＬのｄＮＴＰ混合物、４．５μＬの１０μＭのプライマー（それぞれ）、および１０μＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（５０μｇ）が含まれ、ＰＣＲグレード水で５０μＬにした。鋳型λ−ＤＮＡの最終濃度は、０．０１ｎｇ μＬ^−１から１０ｎｇ μＬ^−１まで変化した。

【0057】

図９Ａは、９５℃から６８℃での異なるサイクル数を有するベンチトップ熱サイクラー（ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システムを有するＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃ１０００ ＴＭｎｅｔｙサイクラー）およびキャビティＰＣＲ（７５０μｍ厚ＰＣＲチャンバ２４を有する）からの２％アガロースゲル画像を示す（ポイント１：ベンチトップ１０^−４ｎｇ μＬ^−１および３０サイクル、ポイント２：ベンチトップＮＴＣ、ポイント３：２０サイクルでのキャビティ、ポイント４：３０サイクルでのキャビティ、ポイント５：４０サイクルでのキャビティ、ポイント５：ＮＴＣでのキャビティ）。

【0058】

ベンチトップＰＣＲのために、３段階熱サイクルプロトコールを使用した。図９Ａは、サイクル数が増加するにつれて、光学キャビティ２０のバンド強度が増加するという明確な傾向を示している。

【0059】

図９Ｂは、鋳型ＤＮＡの異なる初期濃度を有するキャビティＰＣＲ産物からの２％アガロースゲル画像を示す（ポイント１は、１０^−５ｎｇ μＬ^−１、ポイント２は、１０^−７ｎｇ μＬ^−１、ポイント３は、１０^−７ｎｇ μＬ^−１、ポイント４は、１０^−８ｎｇ μＬ^−１、ポイント５は、ＮＴＣ）．濃度が変化すると、バンド強度に明確な傾向が存在する。さらに、４０サイクルのキャビティＰＣＲは、１５分以内に１０^−８ｎｇ μＬ^−１（２コピー／μＬ^−１）のように低い増幅が可能であった。

【0060】

ベンチトップおよびキャビティＰＣＲの全反応時間を図１０に要約する。ＫＡＰＡ２Ｇ Ｆａｓｔ ＰＣＲキットの全反応時間は、従来のＰＣＲアッセイよりもすでに２０〜７０％短縮されているが、本明細書に従ってキャビティＰＣＲを使用することにより、全反応時間の７０〜８０％を短縮することができる。

【0061】

高速かつ高感度な核酸増幅に加えて、光学キャビティ２０は高度に反復可能かつ再現可能である。堅牢なＬＥＤ駆動光学キャビティＰＣＲの実証により、本明細書のシステムおよび方法は、迅速で、正確で、信頼できる核酸増幅を必要とするＰＯＣプラットフォームへの実装のための理想的な候補になる。

【0062】

３．要約

【0063】

本明細書の光学キャビティＰＣＲ装置１０は、高速ＰＣＲ熱サイクルだけでなく、従来のベンチトップＰＣＲシステムと比較しても信頼性のある核酸増幅において有効であった。１回の調査を実行可能にするには、３０分以内に試験結果を提供することが非常に望ましい。本明細書の光学キャビティＰＣＲ装置１０は、本装置が、４〜１０分以内に３０回のＰＣＲ熱サイクルを達成し、１５分以内に１０^−８ｎｇ μＬ^−１（２コピー／μＬ）という低い核酸濃度を増幅することができる。

【0064】

光学キャビティ２０のＡｕ薄膜の厚さを最適化することにより、光学キャビティ２０の上部および底部の薄いＡｕ層２２ａ、２２ｂに光吸収を均一に吸収させることができ、９４℃と６８℃とでそれぞれ１．９℃と０．２℃との差で優れた温度均一性が得られた。その結果、本明細書の光学キャビティＰＣＲ装置１０は、優れた温度均一性および正確な温度精度のため、優れた反復性および再現性を示す。一般に、熱サイクルの駆動がより高速になるほど、熱慣性によるＰＣＲサンプル全体にわたる温度の変動が大きくなる。しかしながら、光学キャビティＰＣＲでは、１．３μＬ〜１０μＬの範囲の異なるサンプル容量で、温度精度に著しい差はない。これは、低い熱質量だけでなく、厚さ５０ｎｍの薄いＳｉＯ_２パッシベーション層を介したＡｕ薄膜とＰＣＲ混合物との間の速い熱伝達にも起因する可能性がある。

【0065】

単一ＰＣＢ上に７つのＬＥＤを使用して、基準およびキャビティＰＣＲチャンバを同じ速度で加熱するための広いビームウェストを使用したため、試験された装置の消費電力は比較的高かった（約２０Ｗ）。しかしながら、基準チャンバ２６および光学キャビティ２０（または、多重化構成における個々の光学キャビティ２０）のそれぞれに２つの３Ｗ ＬＥＤを使用することによって、電力消費をさらに低減することができる（約６Ｗ）。本明細書の実施形態は、蛍光検出を使用する定量的リアルタイムＰＣＲならびに高スループットの多重増幅を可能にする複数のＰＣＲウェルおよび複数のＬＥＤを統合することに焦点を当てている。

【0066】

結論として、ＬＥＤ駆動光学キャビティＰＣＲ熱サイクラーによる新規な超高速ＰＣＲが実証された。キャビティの上部および底部の両方の厚さの異なるＡｕ薄膜は、底部のみの加熱フォトニックＰＣＲよりも高い光−熱変換効率および温度均一性で改善が見られる。総増幅時間を制御すると、ｃ−ＭＥＴ遺伝子と市販のベンチトップ熱サイクラーとの同等の核酸増幅が実証された。ｃ−ＭＥＴ遺伝子の超高速増幅により、９４℃（変性）と６８℃（アニーリング／伸長）の間の熱サイクルは、超高速加熱を用いて、３０サイクルで４〜１０分以内に達成された。さらに、本キャビティＰＣＲプラットフォームの反復性および再現性を実証した。このシンプルで堅牢な超高速キャビティＰＣＲ熱サイクラーがＰＯＣ診断に適していることを提案する。

【0067】

本明細書の記載から、本開示は、以下を含むがこれに限定されない複数の実施形態を包含することが理解されよう。

【0068】

１．流体サンプルの熱サイクルのための装置であって、前記装置は、
前記流体サンプルを保持するよう構成された複数のチャンバ壁によって画定される少なくとも１つのマイクロ流体熱サイクルチャンバと、
第１の基板上に配置され、前記熱サイクルチャンバの第１のチャンバ壁を画定する第１の薄膜と、
第２の基板上に配置され、前記第１のチャンバ壁に対向する第２のチャンバ壁を形成する第２の金属薄膜と、
前記第１の薄膜を照明するよう構成される光源と、
を備え、
前記第１の薄膜上に照明された光の第１の部分が前記第１の薄膜に吸収され、前記第１の薄膜上に照明された前記光の第２の部分が前記第１の薄膜を透過し、
前記第１の薄膜を透過した前記光が前記第２の薄膜を照明し、
前記第２の薄膜上に照明された前記透過光の少なくとも一部が前記第２の薄膜に吸収され、
前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への前記吸収光は、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の温度を上昇させて、前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルを加熱するよう構成される、
装置。

【0069】

２．前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数は、金属層を備える、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0070】

３．前記金属層は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタニウム（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、タングステン（Ｗ）、イリジウム（Ｉｒ）、または白金（Ｐｔ）からなる群から選択される金属を備える、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0071】

４．前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数は多層金属構造を備え、
前記金属構造は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、ニッケル（Ｎｉ）、チタニウム（Ｔｉ）、クロム（Ｃｒ）、ゲルマニウム（Ｇｅ）、パラジウム（Ｐｄ）、ルテニウム（Ｒｕ）、タングステン（Ｗ）、イリジウム（Ｉｒ）、または白金（Ｐｔ）からなる前記群から選択される１つまたは複数の金属を備える、
前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0072】

５．前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数が、グラフェン、グラファイト、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、または塗料からなる群から選択される非金属光吸収材料を備える、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0073】

６．前記第１の薄膜および前記第２の薄膜のうちの１つまたは複数が、共振による光吸収を増加させるためのパターン化された表面を備える、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0074】

７．前記第１の基板および前記第２の基板のうちの１つまたは複数が、少なくとも前記第１の基板を介して前記第１の薄膜へ前記照明光を透過させるよう構成される半透明材料を備える、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0075】

８．前記第１の基板および前記第２の基板のうちの１つまたは複数が、ピラーアレイ、１Ｄもしくは２Ｄ格子、フォトニック結晶、または半球の１つまたは複数の形態の２Ｄまたは３Ｄマイクロ構造またはナノ構造を備える、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0076】

９．前記第１の薄膜は第１の厚さを有し、前記第２の薄膜は前記第１の厚さとは異なる第２の厚さを有する、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0077】

１０．前記第１の薄膜の厚さおよび前記第２の薄膜の厚さが、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜が実質的に均一な温度上昇率を有するように、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への光の吸収速度を一致させるよう選択される、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0078】

１１．前記熱サイクルチャンバ内の温度を感知するよう構成される少なくとも１つの温度センサをさらに備える、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0079】

１２．前記第１の薄膜および前記第２の薄膜は、前記熱サイクルチャンバ内のＰＣＲ反応阻害を防止するために、パッシベーション層で覆われた表面を有する、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0080】

１３．前記光源は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レーザーダイオード（ＬＤ）、タングステンランプ、蛍光灯、ハロゲンランプ、水銀ランプ、キセノンランプ、メタルハライドランプ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0081】

１４．前記熱サイクルチャンバに結合される第１および第２のポートをさらに備え、
前記第１および第２のポートは、前記流体サンプルが前記熱サイクルチャンバに入ることを可能にするよう構成される、
前述したあらゆる態様に記載の装置。

【0082】

１５．流体サンプルの超高速熱サイクルを実施するための方法であって、前記方法が、
対向する第１および第２の薄膜によって画定されるマイクロ流体熱サイクルチャンバを提供することと、
前記熱サイクルチャンバを前記流体サンプルで満たすことと、
前記第１の薄膜を光源で照明することであって、
前記第１の薄膜上に照明された光の第１の部分が前記第１の薄膜に吸収され、前記第１の薄膜上に照明された前記光の第２の部分が前記第１の薄膜を透過することと、
前記第１の薄膜を透過した前記光で前記第２の薄膜を照明することであって、
前記第２の薄膜を照明する前記透過光の少なくとも一部が前記第２の薄膜に吸収されることと、
前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への前記吸収光の関数として前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の温度を均一に上昇させることと、
前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の前記温度上昇の結果として、前記熱サイクルチャンバ内で前記流体サンプルを加熱することと、
を備える、方法。

【0083】

１６．前記第１の薄膜の照明は、前記流体サンプルの超高速マイクロ流体ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うために間欠的に適用される、前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0084】

１７．前記第１の薄膜および前記第２の薄膜の温度を均一に上昇させることが、
前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルの前記温度を第１の期間選択された温度に上昇させるために、第１の持続期間に前記第１および第２の膜を照明することと、
前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルの前記温度を第２の期間選択された温度に上昇させるために、第２の持続期間に前記第１および第２の膜を照明することと、
前記熱サイクルチャンバ内の前記流体サンプルの前記温度を第３の期間選択された温度に上昇させるために、第３の持続期間に前記第１および第２の膜を照明することと、
前記流体サンプルを増幅するために複数のサイクルの間、照明期間のサイクルを繰り返すこと、
を備える、前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0085】

１８．前記第１の薄膜は第１の厚さを有し、前記第２の薄膜は前記第１の厚さとは異なる第２の厚さを有する、前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0086】

１９．前記第１の薄膜の厚さおよび前記第２の薄膜の厚さは、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜が実質的に均一な温度上昇率を有するように、前記第１の薄膜および前記第２の薄膜への光の吸収速度を一致させるよう選択される、前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0087】

２０．前記熱サイクルチャンバ内の温度を測定すること、
をさらに備える、前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0088】

２１．前記第１の薄膜および前記第２の薄膜は、前記熱サイクルチャンバ内のＰＣＲ反応阻害を防止するために、パッシベーション層で覆われた表面を有する、前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0089】

２２．前記熱サイクルチャンバを前記流体サンプルで満たすことが、
前記熱サイクルチャンバに結合される第１のポートを介して流体サンプルを前記サイクルチャンバに注入すること、
を備え、
前記注入された流体サンプルが、前記熱サイクルチャンバに結合された第２のポートから空気を押し出す、
前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0090】

２３．前記光学キャビティが、前記ＰＣＲ反応中に蛍光発光を発生させるよう構成される、前述したあらゆる態様に記載の方法。

【0091】

本明細書の記載には多くの詳細が含まれるが、これらは、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきものではなく、現時点で好ましい実施形態のいくつかの例を提供したものにすぎない。したがって、本開示の範囲は、当業者に明らかになりうる他の実施形態をすべて包含することを認識されたい。

【0092】

特許請求の範囲において、要素を単数の要素として参照しているものは、特段の記載がない限り「１つおよび１つのみ」を意味しているものではなく、「１つ以上」を意味することを意図している。当業者に知られている開示された実施形態の要素と構造的、化学的および機能的に等価のものはすべて、本明細書に参照により明確に援用されたものとされ、本特許請求の範囲に包含されるものとする。さらに、本開示にない要素、構成部品または方法ステップは、その要素、構成部品または方法ステップが特許請求の範囲に明確に記載されているか否かにかかわらず、公にされるためのものであることが意図される。本願の請求項の要素は、「〜するための手段」という表現を用いて明確に要素を記載していない限り、「ミーンズ・プラス・ファンクション」として解釈されるべきではない。本願の請求項の要素は、「〜するためのステップ」という表現を用いて明確に要素を記載していない限り、「ステップ・プラス・ファンクション」として解釈されるべきではない。

【表1】

【表2】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図9A】

【図9B】

【図10】