知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティーの特許一覧
特許6965284細胞トランスフェクション及び生存性を改善する為のナノストローウェルインサートデバイス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6965284
(24)【登録日】2021年10月22日
(45)【発行日】2021年11月10日
(54)【発明の名称】細胞トランスフェクション及び生存性を改善する為のナノストローウェルインサートデバイス
(51)【国際特許分類】
C12M 1/00 20060101AFI20211028BHJP
C12N 15/89 20060101ALI20211028BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20211028BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20211028BHJP
C12N 13/00 20060101ALN20211028BHJP
【ＦＩ】
C12M1/00 A
C12N15/89 Z
C12M1/42
C12N15/87 Z
!C12N13/00
【請求項の数】26
【全頁数】32
(21)【出願番号】特願2018-564728(P2018-564728)
(86)(22)【出願日】2017年6月9日
(65)【公表番号】特表2019-517273(P2019-517273A)
(43)【公表日】2019年6月24日
(86)【国際出願番号】US2017036806
(87)【国際公開番号】WO2017214541
(87)【国際公開日】20171214
【審査請求日】2020年5月15日
(31)【優先権主張番号】62/347,928
(32)【優先日】2016年6月9日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】503115205
【氏名又は名称】ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100107364
【弁理士】
【氏名又は名称】斉藤 達也
(72)【発明者】
【氏名】スウォボダ，リアン，ティー．
(72)【発明者】
【氏名】カオ，ユフォン
(72)【発明者】
【氏名】レアル−オルティス，セルジオ
(72)【発明者】
【氏名】ロスコエッター，ステファニー
(72)【発明者】
【氏名】メロッシュ，ニコラス，エー．
【審査官】
中村 勇介
(56)【参考文献】
【文献】
特開平１１−３４６７６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２００３−５０５０７３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第０２／０５８８４７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】
米国特許出願公開第２０１２／０２７６５７３（ＵＳ，Ａ１）
【文献】
XIE, Xi et al. ，ACS NANO，2013年04月18日，Vol. 7, No. 5，pp. 4351-4358
【文献】
CHANG, Lingqian et al. ，Lab on a Chip，2015年，Issue. 15，pp. 3147-3153
【文献】
KWAK, Minsuk et al. ，small，2015年，Vol. 11, No. 42，pp. 5600-5610
【文献】
CHANG, Lingqian et al. ，small，2015年，Vol. 11, No. 15，pp. 1818-1828
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
長期細胞成長及びトランスフェクションの為のナノストロー細胞培養システムであって、
円筒壁と、複数のナノストローが突出するメンブレンと、前記円筒壁の基部全体にわたって前記メンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤とを有し、前記ナノストローが、前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出するナノストローウェルインサートデバイスと、
前記ナノストローウェルインサートデバイスを保持するように構成されたアダプタとを有し、前記アダプタが、
底面電極を含む基部であって、前記ナノストローウェルインサートデバイスの前記円筒壁をしっかりと保持して、前記複数のナノストローが、前記底面電極の上のリザーバ貯蔵部と流体連通するように構成された基部と、
上部電極を含むカバーであって、前記基部と係合して、ナノストローウェルインサートデバイスが前記基部内に保持されたときに、前記上部電極が、間に囲まれたナノストローインサートデバイスによって前記底面電極から離れるように構成されたカバーと、
前記アダプタの外側面上の第１の電気接点であって、前記底面電極と電気通信する第１の電気接点と、
前記アダプタの前記外側面上の第２の電気接点であって、前記上部電極と電気通信する第２の電気接点とを有する、ナノストロー細胞培養システム。
円筒壁と、複数のナノストローが突出するメンブレンと、前記円筒壁の基部全体にわたって前記メンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤とを有し、前記ナノストローが、前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出するナノストローウェルインサートデバイスと、
前記ナノストローウェルインサートデバイスを保持するように構成されたアダプタとを有し、前記アダプタが、
底面電極を含む基部であって、前記ナノストローウェルインサートデバイスの前記円筒壁をしっかりと保持して、前記複数のナノストローが、前記底面電極の上のリザーバ貯蔵部と流体連通するように構成された基部と、
上部電極を含むカバーであって、前記基部と係合して、ナノストローウェルインサートデバイスが前記基部内に保持されたときに、前記上部電極が、間に囲まれたナノストローインサートデバイスによって前記底面電極から離れるように構成されたカバーと、
前記アダプタの外側面上の第１の電気接点であって、前記底面電極と電気通信する第１の電気接点と、
前記アダプタの前記外側面上の第２の電気接点であって、前記上部電極と電気通信する第２の電気接点とを有する、ナノストロー細胞培養システム。
【請求項2】
前記基部が、前記リザーバ貯蔵部と前記ナノストローウェルインサートデバイスの下部の間に空気を放出するように構成された、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記アダプタが、更に、前記基部内の前記リザーバ貯蔵部の圧力を調整するように構成された入口を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項4】
前記第１の電気接点が、前記カバーの上部にあり、前記第２の電気接点が、前記基部の下部にある、請求項１に記載のシステム。
【請求項5】
前記カバーが前記基部と係合されたとき、前記上部電極が、前記底面電極から０．２５ｃｍ〜１．２５ｃｍ離された、請求項１に記載のシステム。
【請求項6】
前記リザーバ貯蔵部が、前記底面電極上に凹面を有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項7】
前記基部が、円筒状ハウジングを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項8】
前記カバーが、前記基部の上に固定されて前記ナノストローウェルインサートデバイスが完全に囲まれるように構成された、請求項１に記載のシステム。
【請求項9】
長期細胞成長トランスフェクションの為のナノストローウェルインサートデバイスであって、
円筒壁と、
複数のハフニア（ＨｆＯ２）ナノストローが貫通するメンブレンと、
前記円筒壁の基部全体にわたって前記メンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤とを有し、前記ナノストローが、前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出する、ナノストローウェルインサートデバイス。
円筒壁と、
複数のハフニア（ＨｆＯ２）ナノストローが貫通するメンブレンと、
前記円筒壁の基部全体にわたって前記メンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤とを有し、前記ナノストローが、前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出する、ナノストローウェルインサートデバイス。
【請求項10】
前記円筒壁が、円形横断面を有する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項11】
前記円筒壁が、ポリカーボネート管、アクリル管、ポリカーボネート管又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）管のうちの１つを含む、請求項９に記載のデバイス。
【請求項12】
前記円筒壁と前記メンブレンの間に接着剤を更に有する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項13】
前記円筒壁と前記メンブレンの間にアクリル接着剤を更に有する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項14】
前記複数のハフニアナノストローが、１０ｎｍ〜１０００ｎｍの孔径を有する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項15】
前記複数のハフニアナノストローが、前記ウェル内に０．１〜２５マイクロメートル突出する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項16】
前記複数のナノストローがそれぞれ、前記デバイスの外側から、前記メンブレンを通って前記ウェル内に延在する連続チャネルを有する、請求項９に記載のデバイス。
【請求項17】
前記円筒壁の外径が、１．５ｃｍ〜０．５ｃｍである、請求項９に記載のデバイス。
【請求項18】
細胞を培養しトランスフェクトする方法であって、
ナノストローウェルインサートデバイス内で１つ以上の細胞を培養するステップであって、前記ナノストローウェルインサートデバイスが、円筒壁と、前記円筒壁の基部全体に延在してウェルを形成するメンブレンとを有し、前複数のナノストローが、前記メンブレンを通って前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出するステップと、
前記ナノストローウェルインサートデバイスをアダプタの基部に入れて、前記複数のナノストローが、前記基部内のリザーバ貯蔵部と流体連通するようにするステップであって、前記リザーバ貯蔵部が、前記基部内の底面電極と電気通信するステップと、
カバーを前記基部の上に配置するステップであって、前記カバーが上部電極を有し、それにより、前記上部電極が、前記ナノストローウェルインサートデバイス内に延在し、前記上部電極が、間の前記ナノストローウェルインサートデバイスによって前記底面電極から離されるステップと、
前記底面電極と前記上部電極の間に電圧を印加して、前記リザーバ貯蔵部から物質を、前記複数のナノストローを通して前記１つ以上の細胞内に導入するステップと、
前記アダプタから前記ナノストローウェルインサートデバイスを除去し、前記ナノストローウェルインサートデバイス内の前記１つ以上の細胞を培養するステップとを含む方法。
ナノストローウェルインサートデバイス内で１つ以上の細胞を培養するステップであって、前記ナノストローウェルインサートデバイスが、円筒壁と、前記円筒壁の基部全体に延在してウェルを形成するメンブレンとを有し、前複数のナノストローが、前記メンブレンを通って前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出するステップと、
前記ナノストローウェルインサートデバイスをアダプタの基部に入れて、前記複数のナノストローが、前記基部内のリザーバ貯蔵部と流体連通するようにするステップであって、前記リザーバ貯蔵部が、前記基部内の底面電極と電気通信するステップと、
カバーを前記基部の上に配置するステップであって、前記カバーが上部電極を有し、それにより、前記上部電極が、前記ナノストローウェルインサートデバイス内に延在し、前記上部電極が、間の前記ナノストローウェルインサートデバイスによって前記底面電極から離されるステップと、
前記底面電極と前記上部電極の間に電圧を印加して、前記リザーバ貯蔵部から物質を、前記複数のナノストローを通して前記１つ以上の細胞内に導入するステップと、
前記アダプタから前記ナノストローウェルインサートデバイスを除去し、前記ナノストローウェルインサートデバイス内の前記１つ以上の細胞を培養するステップとを含む方法。
【請求項19】
前記配置するステップが、前記基部の上に前記カバーを配置して、前記上部電極が、前記底面電極から０．２５〜１．２５ｃｍ離れるようにするステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記電圧を印加するステップが、前記アダプタの外面上の第１の電気接点と、前記アダプタの表面の外側上の第２の電気接点との間に前記電圧を印加するステップを含み、前記第１の電気接点が、前記アダプタ内で前記上部電極と電気通信し、前記第２の電気接点が、前記アダプタ内の前記底面電極と電気通信する、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
前記電圧を印加するステップが、０．１Ｖ〜２０Ｖを印加するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項22】
前記電圧を印加するステップが、１５Ｖ未満を印加するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項23】
前記ナノストローウェルインサートデバイス内の前記細胞を撮像するステップを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項24】
前記電圧を印加するステップが、１０〜５００マイクロ秒のパルス幅を１Ｈｚ〜１０ｋＨｚのパルス周波数で印加するステップを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項25】
前記細胞を培養するステップが、複数のハフニア（ＨｆＯ２）ナノストロー上で前記細胞を培養するステップと含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項26】
前記ナノストローウェルインサートデバイスを前記基部に入れる前に前記物質を前記リザーバ貯蔵部に装填するステップを更に含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本特許出願は、２０１６年６月９日に出願され、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６２／３４７，９２８号に対する優先権を請求する。
【0002】
参照による組み込み本明細書で言及される全ての出版物及び特許出願は、個々の公開又は特許出願が、参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示される場合と同じ程度に、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載本発明は、全米科学財団によって承認された契約第１５４９６９６号での政府支援により行われた。政府は、本発明における特定の権利を有する。
【0004】
本発明は、細胞トランスフェクション及び生存性を改善する為のナノストローウェルインサートデバイスに関する。
【背景技術】
【0005】
トランスフェクション、即ち一般に、分子種の脂質二重層を越えて細胞質ゾル又は細胞核内への導入は、細胞リプログラミング、細胞内イメージング及びセンシング、分子養殖、ｓｉＲＮＡノックアウト、薬物スクリーニング、並びに薬物療法に及ぶ多数の用途を有する強力な分析ツールである。そのような広い範囲の用途に適合するように、生物学者は、新たな技術を優位にする物理的に仲介された技術と共に、生物学、化学及び物理学クラスに広く分類される従来のトランスフェクション手法を開発してきた。これらの方法は全て、細胞に対する損傷がほとんどなく且つできるだけ効率高く細胞膜を横切ることを中心に展開している。しかしながら、ほぼ半世紀の技術革新、開発及び最適化にもかかわらず、トランスフェクション分野には、細胞内に導入する為の汎用ツールがなく、即ち、既存の方法が全て、実験計画及び目的にきわめて依存する利点と欠点を有する。基本的には、理想的なトランスフェクション技術は、サイズや構造に関係なく、高スループット及び細胞生理の保全と共に、任意の細胞型へのカーゴの効率的移送を可能にする。
【0006】
ヴァンダサール（VanDersarl）ら（特許文献１）は、２０１２年にバイオナノテクノロジ分野で、細胞透過構造を含むナノ流体基板中への一般に使用されるナノ多孔性メンブレンフィルタの処理を含む、単純で更に洗練されたバイオミメティック革新、即ちナノストローについて述べた。ナノストローは、本質的に、高分子薄膜に埋め込まれた約１００ｎｍの直径を有する金属酸化物ナノチューブ構造である。ナノストロー技術は、生物活性分子のカーゴの導入（又は抽出）に不可欠な非破壊細胞内アクセスを実時間で一意に確立する。ナノストローデバイス上で培養された細胞は、自発的に浸透され、流体物質化学種の細胞内へ又は細胞からの移送に安定した外部ハンドルを提供する。更に、導入速度を高めることができる高度な浸透と電気穿孔法の組み合わせが提案された。
【0007】
ここの研究は、より幅広い見地から、一次ユーザ（即ち、学術的ナノサイエンス研究所の研究者）から、技術の開発と実際の影響の両方を加速できる隣接学術的生物学研究所などの二次ユーザに、ナノストロー技術を変換する目標によって動機づけられる。ナノバイオテクノロジー分野でのこの種の技術移転に対する障壁は、典型的には、ナノテクノロジとバイオテクノロジの両方での専門知識と共同作業を必要とするので、高い。この目的の為、本明細書に記載された方法及び装置は、トランスフェクション効率と細胞生存性の点から測定された、反復可能で均一のデバイス性能を提供できる。更に、本明細書に記載された方法と装置は、複数の細胞型にわたる最適化された性能のナノストローデバイス製造を提供できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】米国特許第９２６６７２５号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、背景技術の課題を解決するためのものである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本明細書では、メンブレンを貫通するナノチューブを含み、電気エネルギー（例えば、電気穿孔エネルギー）が印加されたときに、物質が、メンブレンを通過して、流体リザーバ貯蔵部から、ナノチューブ上に成長された細胞内に入ることができる、ナノストローウェルインサート装置（例えば、デバイスとシステム）が示される。詳細には、本明細書に記載された装置（デバイスとシステム）及び方法は、長期細胞成長生存性（＞５日）とトランスフェクション効率（例えば、＞７０％）に適応されうる。これらの装置は、トランスフェクション効率、細胞内輸送及び細胞生存性を改善する為の細胞培養プロセスに容易に一体化されうる。
【0011】
例えば、本明細書では、１つ以上のナノストローウェルインサートデバイス、及び／又はナノストローウェルインサートデバイスを保持するように構成された１つ以上のアダプタを含む、ナノストロー細胞培養システムについて述べる。長期細胞成長及びトランスフェクション用のナノストロー細胞培養システムは、ナノストローウェルインサートデバイス、及びナノストローウェルインサートデバイスを保持するように構成されたアダプタを含みうる。典型的には円筒壁、複数のナノストローが突出するメンブレン、円筒壁の基部全体にわたってメンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤を含むナノストローウェルインサートデバイスを含む、任意の適切なナノストローウェルインサートデバイスを使用でき、ナノストローは、ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく（例えば、０．１〜２５マイクロメートル、０．５〜５マイクロメートル、１〜３マイクロメートルなど）突出する。本明細書でより詳細に述べられるように、幾つかの変形物では、ハフニアから形成されたナノストローを使用すると特に有利である。ナノストローウェルインサートデバイスを保持するように構成されるアダプタは、底面電極を含む基部であって、複数のナノストローが底面電極の上のリザーバ貯蔵部と流体連通するようにナノストローウェルインサートデバイスの円筒壁をしっかりと保持するように構成された基部と、上部電極を有するカバーであって、基部と係合して、ナノストローウェルインサートデバイスが基部内に保持されたときに、例えばナノストローインサートデバイスが間に囲まれた状態で０．２５ｃｍ〜１．２５ｃｍの距離だけ上部電極が底面電極から離されるように構成されたカバーと、アダプタの外側面上の第１の電気接点であって、底面電極と電気通信する第１の電気接点と、アダプタの外側面上の第２の電気接点であって、上部電極と電気通信する第２の電気接点とを含みうる。
【0012】
ナノストローウェルインサートデバイスのいずれも円筒壁を有しうる。円筒は、任意の適切な高さ（例えば、１ｃｍ〜５ｃｍ、１ｃｍ〜３ｃｍ、１ｃｍ〜２ｃｍなど）と幅（例えば、約０．５ｃｍ〜５ｃｍ、０．５ｃｍ〜２ｃｍ、０．７５ｃｍ〜１．５ｃｍなどの外径（ＯＤ）と、０．３ｃｍ〜５ｃｍ、例えば０．３ｃｍ〜２ｃｍ、０．４ｃｍ〜１．４ｃｍなどの内径（ＩＤ））とを有しうる。円筒の横断面は、円形、楕円形、三角形、長方形、正方形、五角形、八角形などでよい。
【0013】
メンブレンは、円筒壁によって形成されたウェルの内側で複数のナノストローがメンブレンの上に０．１マイクロメートルより大きく（例えば、０．１〜２５マイクロメートル、０．５〜５マイクロメートルなど）突出する多孔質メンブレンでよい。複数のナノストローの孔径は、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ（例えば、１０ｎｍ〜９００ｎｍ、３０ｎｍ〜８００ｎｍ、７０ｎｍ〜４００ｎｍ、８０ｎｍ〜２００ｎｍ、８０ｎｍ〜１５０ｎｍなど）でよい。生体適合性接着剤は、典型的には、アクリル接着剤でよい。詳細には、生体適合性接着剤は、アクリル両面テープなどの両面テープでよい。
【0014】
ナノストローウェルインサートデバイスを保持するように構成されたアダプタは、一般に、１つ以上のナノストローウェルインサートデバイスをアダプタ内に固定し、それにより、メンブレンの下部側（例えば、ナノストローの下部開口）がそれ自体で底面電極と電気通信するリザーバ貯蔵部に流体連通するように構成される。アダプタの内側面は、ナノストローウェルインサートデバイスの円筒壁及び／又は下部リムと結合してキャビティ内に固定し、それにより、ナノストローウェルインサートデバイスがリザーバ貯蔵部に対して支持されるように構成されうる。リザーバ貯蔵部は、少なくとも部分的にキャビティの下部で底面電極によって形成されうる。アダプタは、一般に、リザーバ貯蔵部とナノストローウェルインサートの下部の間から空気を放出して、例えば、メンブレンの下部とリザーバ貯蔵部の間の空気（例えば、泡）の閉じ込めを防ぐように適応されうる。
【0015】
アダプタのカバーは、典型的には、ナノストローウェルインサートデバイスの上に嵌まって基部と結合し、ナノストローウェルインサートデバイスをアダプタ内に密閉する。アダプタのカバーは、一般に、基部の上に固定されてナノストローウェルインサートデバイスがそこに完全に密閉されるように構成されうる。
【0016】
カバーは、また、上部電極を保持し、間のナノストローウェルインサートデバイスによって上部電極を底面電極から所定の離間距離に位置決めし、それにより、デバイスのメンブレンのナノストローの上に成長する任意の細胞が、上部電極と底面電極の間に位置決めされるように構成される。カバーは、摩擦嵌め、スナップ嵌め、ねじ込み嵌めなどで基部に固定されうる。アダプタの外側の電気接点は、細胞を破壊することなく、流体内の物質をリザーバ貯蔵部からナノチューブを介して１つ以上の細胞内に制御可能に（及び高い効率で）導入するようにエネルギーを印加する電圧源に接続されうる。
【0017】
例えば、第１の電気接点はカバーの上部にあってもよく、第２の電気接点は基部の下部にあってもよい。カバーが基部と係合されたとき、上部電極は、例えば０．３ｃｍ〜０．８ｃｍだけ底面電極から離されうる。
【0018】
上部電極は、底面電極の表面積より小さい表面積を有しうる。両方の電極は、白金及び／又はアルミニウムを含む任意の導電材料（同じでも異なってもよい）でよい。例えば、上部電極は、０．１〜０．４ｃｍ（例えば、０．１〜０．３ｃｍ、０．１〜０．２５ｃｍ、０．１２〜０．２２ｃｍ、０．１５〜０．２ｃｍなど）の直径を有する円盤電極（又は円盤面）でよく、底面電極は、ナノストローウェルインサートデバイス下部メンブレンの下部のほとんど（＞８０％、＞９０％、１００％）を覆う平面電極でよい。リザーバ貯蔵部は、少なくとも部分的に底面電極の１つ以上の側面によって形成されうる。例えば、底面電極は、リザーバ貯蔵部の全て又は一部分を形成する凹面を有してもよく、その凹面内に、物質（例えば、１つ以上の細胞にトランスフェクトされる物質を含む流体）が、ナノストローウェルインサートデバイスの下部と接するように配置される。
【0019】
言及されたように、本明細書では、長期細胞成長及びトランスフェクションの為のナノストローウェルインサートデバイスについて述べる。アダプタのナノストローウェルインサートデバイスはどれも、システムから独立に使用されてもシステムの一部として使用されてもよい。例えば、ナノストローウェルインサートデバイスは、円筒壁、複数のハフニア（ＨｆＯ２）ナノストローが貫通するメンブレン、及び円筒壁の基部全体にわたってメンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤を含み、ナノストローは、ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく（例えば、０．５〜５マイクロメートルなど）突出する。
【0020】
円筒壁は、詳細にはポリカーボネート管を含む任意の適切な材料でよい。言及されたように、ナノストローウェルインサートデバイスは、また、メンブレンと円筒壁（管）の間に接着剤を有し、例えば、円筒壁とメンブレンとの間に、両面アクリルテープのようなアクリル接着剤が使用されうる。
【0021】
複数のハフニアナノストローは、１０ｎｍ〜１０００ｎｍ（例えば、１０ｎｍ〜９００ｎｍ、３０〜５００ｎｍ、例えば、７０ｎｍ〜１３０ｎｍ、８０ｎｍ〜１２０ｎｍなど）の孔径を有する。複数のハフニアナノストローは、ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく（例えば、０．１〜２５マイクロメートル、０．１〜５マイクロメートル、０．５〜３マイクロメートルなど）突出する。典型的には、複数のナノストローはそれぞれ、デバイスの外側から、メンブレンを通してウェル内に延在する連続チャネルを有する。
【0022】
本明細書に記載された装置及び方法は、典型的にはナノストローを指すが、本明細書に記載された方法と装置はナノワイヤと共にも使用されうる。
【0023】
本明細書には、本明細書に記載された装置のいずれかを使用して細胞を成長させ及び／又はトランスフェクトする方法が記載される。例えば、本明細書には、細胞を培養しトランスフェクトする方法が記載され、この方法は、ナノストローウェルインサートデバイス内で１つ以上の細胞を５日より長く培養するステップであって、ナノストローウェルインサートデバイスが、円筒壁と、円筒壁の基部全体に延在してウェルを形成するメンブレンとを有し、複数のナノストローが、メンブレンを貫通し、ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく（例えば、０．５〜５マイクロメートルなど）突出するステップと、ナノストローウェルインサートデバイスをアダプタの基部に入れて、複数のナノストローが基部内のリザーバ貯蔵部と流体連通するようにするステップであって、リザーバ貯蔵部が基部内の底面電極と電気通信するステップと、基部の上にカバーを配置するステップであって、カバーが上部電極を有し、従って、上部電極が、ナノストローウェルインサートデバイス内に延在し、上部電極が、底面電極から０．２５〜１．２５ｃｍだけ離されるステップと、底面電極と上部電極の間に電圧を印加して、物質をリザーバ貯蔵部から、複数のナノストローを通して１つ以上の細胞内に導入するステップと、アダプタからナノストローウェルインサートを除去し、ナノストローウェルインサート内で１つ以上の細胞を培養するステップとを含む。
【0024】
電圧の印加は、アダプタの外側面上の第１の電気接点と、アダプタの外側面上の第２の電気接点との間に電圧を印加するステップを含んでもよく、第１の電気接点は、アダプタ内で上部電極と電気通信し、第２の電気接点は、アダプタ内で底面電極と電気通信する。電圧は、約０．１Ｖ〜２０Ｖでよく、詳細には１５Ｖ以下を含む。
【0025】
これらの方法のいずれも、電圧を印加して標的物質を細胞内に導入する前又は後に、ナノストローウェルインサートデバイス内で１つ以上の細胞を撮像するステップを含みうる。電圧を印加するステップは、例えば１０〜５００マイクロ秒（例えば、５０〜４００マイクロ秒、７０〜３００マイクロ秒、１００〜２００マイクロ秒など）のパルス幅を、例えば１Ｈｚ〜１０ｋＨｚ（例えば、１５Ｈｚから８００Ｈｚ、２０Ｈｚ〜４００Ｈｚ、１０Ｈｚ〜２５０Ｈｚなど）のパルス周波数で印加するステップを含みうる。刺激の全持続時間は、１〜６００秒でよい（例えば、パルスを有する正味時間は、２０秒〜１２０秒、２５秒〜１００秒、３０秒〜８０秒、４０秒〜６０秒などでよい）。
【0026】
細胞を培養するステップは、複数のハフニア（ＨｆＯ２）ナノストロー上で細胞を培養するステップを含みうる。一般に、培養するステップは、マルチウェルディッシュ（例えば、２、４、６、８、１６、３２個などのマルチウェルディッシュ）内でナノストローウェルインサートデバイスによって培養するステップを含むことができ、成長媒体は、一般に、両方ともナノストローウェルインサートデバイス内（例えば、ウェル内）に配置されてもよく、マルチウェルディッシュ内のナノストローウェルインサートデバイスのまわりに配置されてもよい。マルチウェルディッシュのカバーは、ナノストローウェルインサートデバイスの上に配置されうる。
【0027】
これらの方法のいずれでも、方法は、また、ナノストローウェルインサートデバイスを基部に入れる前に物質をリザーバ貯蔵部に装填するステップを含みうる。
【0028】
本発明の新規の特徴は、以下の特許請求の範囲で詳細に説明される。本発明の特徴と利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される実例となる実施形態を明らかにする以下の詳細な説明と以下の図面を参照することにより得られる。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1A】ナノストローウェルインサートの一例を概略的に示す図である。
【図1B】このインサートの分解図であり、典型的な寸法で示す。
【図2A】細胞を培養し試験する為のナノストローウェルインサートの別の概略図である。トランスフェクションの際の汎用ナノストローウェルインサートデバイスを示す。この例では、デバイスは、下部に取り付けられて培養ウェルを作成するナノストローメンブレンを有するポリカーボネート管から成る。細胞は、ウェル内に媒体を有するデバイスウェル内で直接培養される。電気穿孔法によるトランスフェクションの場合、デバイスは、導入される分子種（ここでは、溶液中の小球、例えば水中のＤＮＡ／ＲＮＡとして示される）を含むメンブレンの下のカーゴリザーバと接触配置される。２つの白金電極の両側に電気パルスを発射して細胞膜に孔を開け、細胞内アクセスを可能にする（図２Ａで、細胞とナノストローは一律の倍率で描かれていない）。
【図2B】走査型電子顕微鏡によって撮像されたナノストローを示す図であり、ストロー長さは典型的には１〜３マイクロメートル、外径は約１００ｎｍである。
【図2C】乃至
【図2D】ナノストローメンブレン上のシクロ固定ＣＨＯ細胞の擬似カラーＳＥＭ像を示し、実際のデバイス原理を示す図である。これらのナノストローは、細胞膜を自発的に貫通することが実証されており、印加された電気パルスが導入効率を高めうる。
【図3B】図２Ａ乃至図２Ｄに示されたナノストローウェルインサートデバイスの典型的な技術パラメータを示す表である。図３Ａと図３Ｂの表に提供された値が単なる一例を示し、本明細書でより詳細に述べるように、他の例が使用されうることに注意されたい。
【図4A】乃至
【図4C】ナノストローウェルインサートデバイスを形成するプロセスフローの概略図である。図４Ａで、ＰＣＴＥメンブレンが、ｐ型（１００）シリコンキャリアウェハ上に取り付けられる。図４Ｂ．１乃至図４Ｂ．４は、ナノストローを含むメンブレンの製造を示す。図４Ｃ．１乃至図４Ｃ．３は、培養プレート内の生物学的試験の準備ができたナノストローウェルインサートデバイスの組立体を示す。
【図5】ナノストローインサートの製造の概略を示すグラフである。
【図6A】乃至
【図6D】基板上のアルミナ層の原子層堆積を示す図である。このプロセスは、一般に、レイヤ・バイ・レイヤ薄膜成長（layer-by-layer film growth）を生成する反応性ガス前駆体の交互パルスを含む。図６Ａで、アルミニウム支持前駆体（ＴＭＡ、又はトリメチルアルミニウム）の添加によってＡｌ２Ｏ３薄膜プロセスが開始される。図６Ｂで、ＴＭＡ前駆体が、基板上の自然吸着表面水酸基と反応してアルミニウムを酸素と結合し、副生成物としてメタンを放出する。図６Ｃで、全て又はほとんど全ての表面酸素部分がＴＭＡ前駆体分子と反応した後で、Ｈ２Ｏ蒸気がチャンバに送り込まれる。図６Ｄで、水分子が、表面アルミナ原子と反応してアルミナＡｌ２Ｏ３の「単一層」を形成する。このプロセスは、所望の膜厚が達成されるまで繰り返される。
【図7A】Ａｌ２Ｏ３薄膜を成長させる為に使用されうるＳａｖａｎｎａｈ １００装置（ケンブリッジ・ナノテック）を示す図である。
【図7C】品質管理の為に圧力プロファイルを使用して前駆体パルスとチャンバパージ特性を監視する図である。
【図7D】乃至
【図7E】５点楕円偏光法による厚さ均一性試験報告を示す図であり、標準ＡＬＤ堆積プロトコルによるシリコン上の厚さ１０ｎｍ±１ｎｍのアルミナ膜を示す。
【図8A】乃至
【図8D】高分子基板上に酸化物材料を高いサイクル数で原子層堆積させる為の１つの可能なメカニズムを示す図である。図８Ａで、ガス前駆体の拡散は、限界サイクル数と凹凸拡散が表面粗さとして表された後で遮断される。図８Ｅで分かるように、楕円偏光法によって測定されたシリコン上のアルミナ蒸着の厚さは、ＳＥＭから推定された厚さと同等である。ＳＥＭからの厚さ観察は、幾つかの考えられるアーティファクト源から歪められることがあり、ＡＬＤ真空状態の間に高分子ガス放出からの非晶質材料が付着することがあり、ＳＥＭ調製の為の銀／金スパッタリングが厚さを加え、撮像中に著しい表面電荷を加える。しかしながら、開孔は、ＳＥＭによって容易に撮像され、品質管理に役立つ。
【図9】シリカナノストロー（孔径１００ｎｍ）を示すＳＥＭである。シリカ構造上の細胞生存性はかなり優れていたが、トランスフェクションの為の標準生物学的プロトコルは、比較可能なアルミナストローほど効率的ではなかった。
【図10A】乃至
【図10C】ハフニアナノストローの製造及び特性決定を示す図である。図１０Ａで、ハフニアナノストローは、Ｓａｖａｎｎａｈ ２００（ケンブリッジ・ナノテック）を使用して首尾よく製造された。図１０Ｂと図１０Ｃは、ハフニアナノストローの異なる倍率のＳＥＭ像を示し、ストロー長さ全体に沿って均一な直径を有するように見えるきれいな開孔を示す。
【図11A】乃至
【図11D】本明細書に記載されたようなナノストローウェルインサート装置の少なくとも一部分を組み立てる１つの方法を示す。図１１Ａは、管状体（例えば、ポリカーボネート管）と接着剤（両面テープとして示された）を示し、図１１Ｂは、底面に接着剤を有する管状体を示し、図１１Ｃでは、基板上のナノストローが、両面テープによって管状体に取り付けられる。図１１Ｄに、インサートがウェルに挿入されて示される。
【図12】モデル細胞株内への核酸導入の発現の為の標準トランスフェクションプロトコルの例を示す図である。この例では、方法は、発現に転置が必要かどうかにより、典型的には滅菌から画像解析まで２４〜７２時間かかる。トランスフェクションステップは、滅菌、細胞培養、電気穿孔法、細胞インキュベーション、及び光学顕微鏡検査を含む。
【図13】本明細書に記載された改善されたナノストローウェルインサート装置内の培養を含む、より長い（例えば、５日より長くかかる）細胞培養及びトランスフェクションの方法を示す図である。
【図14A】乃至
【図14G】本明細書に記載された装置と方法を使用するモデル細胞株内への核酸の導入を示す図である。
【図15A】ナノストローウェルインサート及び電気穿孔アダプタ又はキャリアを含む装置の例を示す図である。
【図15B】アダプタ／キャリアの基部に挿入されたウェルインサートを示す図である。
【図15C】細胞が培養されたナノストローウェルインサートを保持する閉じたアダプタ／キャリアを示す図である。アダプタ／キャリア及び密閉ナノストローウェルインサートは、電流を送る為に電気穿孔装置内に入れることを含む、培養細胞を保護しながら保持され操作されうる。
【発明を実施するための形態】
【0030】
トランスフェクション、即ち外部物質（典型的には核酸）の生細胞の細胞質ゾル及び／又は核への導入と統合は、細胞リプログラミング、細胞内イメージング及びセンシング、分子ファーミング、ｓｉＲＮＡノックアウト、薬物スクリーニング、及び薬物療法を含む、幅広い最新の生物学的、生物医学的及び生物工学的手法に不可欠な技術である。
【0031】
ヴァンダサール（VanDersarl）らは、分子カーゴの細胞内導入及び抽出の為に細胞内への連続流体アクセスを確立する単純なバイオミメティックナノ構造、即ち「ナノストロー」を報告してきた。ナノストローは、幅広く使用されている高分子メンブレンフィルタに埋め込まれた、約１００ｎｍの直径を有する金属酸化物ナノチューブ構造物である。ナノストローデバイス上で培養された細胞は、自発的に貫通され、流体材料化学種の細胞内への導入時に安定した外部ハンドルを提供する。ナノストローは、比較的短い時間スケールで分子をイオンから６０００塩基対ＤＮＡ構造に首尾良く導入することが実証されている。更に、既存の文献は、当該のカーゴを導入する為に電気穿孔法とナノストローアクセスを統合した複合効果を強調している。ナノストロープラットフォームの安定性、多用性及び非侵襲性は、この技術を、細胞の基礎生物学の理解を目的とする細胞内アクセスの為の普遍的解決策の有望な候補にしている。
【0032】
図４のＢ１〜Ｂ４は、ナノストローメンブレン製造の概要を示し、三段階工程を示す。トラックエッチドメンブレンフィルタ（Ｂ．１）が、金属酸化物原子層堆積法によって被覆される（Ｂ．２）。堆積工程に続いて、上部金属酸化物表面層が、プラズマ内で反応性イオンエッチングされる（Ｂ．３）。ナノストロー長は、支持高分子マトリクスに対して選択的な酸素プラズマエッチングによって制御される（Ｂ．４）。開始トラックエッチドメンブレン孔径が選択された場合は、ストロー長、密度、外径、内径の全てのナノストロー寸法を調整できる。
【0033】
モデル細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３）の細胞膜を介した物質の導入／抽出の一貫した確認にもかかわらず、ストロー細胞質ゾルの自然浸透イベントが１０％未満（約５〜１５浸透／細胞）の確率で起こることが最近報告された。連続的に漏れのあるアクセスは、細胞にとって好ましくなく有害なことがあるが、浸透性を高めるには、設計と最適化を確実に複雑にしうる誘導電界が必要になる。詳細には、電気穿孔法は、浸透及び導入イベントを高めることを実証したが、内部観察によって、平方センチメートルデバイス領域（約１００，０００細胞／単一層）に関して比較的不均一な空間トランスフェクション効率（ＴＥ）が報告された。比較的起こりそうもない自然浸透と誘導電界に対する空間的に不均一なトランスフェクション効率は、既存のデバイス製造にとって問題が多いことが分かっている。
【0034】
本明細書では、これらの問題の多くに取り組みうるナノストロー装置及び方法について述べる。例えば、本明細書に記載された方法及び装置は、免疫細胞リプログラミングや幹細胞修正などの種々様々な生物学用途で使用されうる。本明細書に記載されたナノストローツールは、高い均一性を有することができ、詳細には、従来のデバイスと比較して高い細胞生存性を提供しうる。
【0035】
細胞間導入の為のナノストローウェルインサートの作成は、５段階プロセスであり、そのプロセスは、（１）シリコンキャリアウェハ上のトラックエッチド高分子メンブレンフィルタの取り付けと位置決め（図４Ａ）と、（２）トラックエッチドナノ多孔性高分子メンブレン上への金属酸化物の共形原子層堆積（ＡＬＤ）（図４ Ｂ．１及びＢ．２）と、高分子を露出させるＡＬＤの上面の方向性イオンエッチング（図４ Ｂ．３）と、ナノストロー長さ（例えば、１〜３マイクロメートル）を制御する高分子メンブレンの酸素プラズマエッチング（図４ Ｂ．４）と、粘着環状テープによるナノストローウェルインサートデバイスの組み立てと過剰ナノストローメンブレンのトリミング（図４ Ｃ．１〜Ｃ．３）である。
【0036】
図５に示されたように、ナノストローインサートの作成は、固定寸法、柔軟寸法及びフォームファクタに関する検討に基づいて３つの作成節に分割されうる。市販の高分子メンブレンは、ナノストロー密度（例えば、１０６孔／ｃｍ２〜１０９孔／ｃｍ２）、ストロー外径（例えば、５０ｎｍ〜１０μｍ）、メンブレン厚さ（例えば、５μｍ〜２０μｍ）などの一連の一定開始寸法を提供する。壁厚さ、内径、ストロー高さ、粗さ、先端鋭さ、生物学的適合性（機能化）などの融通性のある寸法／特性は、ＡＬＤの材料選択並びにそれぞれの堆積及びエッチング処理パラメータによって管理される。例えば、図２Ａ乃至図２Ｄを参照されたい。様々なマイクロ流体設計が使用されうるが、本明細書に記載されたナノストローウェルインサート装置は、本明細書に記載されたように構成されうる。
【0037】
図５は、ナノストローウェルインサート作成の節を示すプロセスフローである。原料物質（ステップＩ）調製で始まり、次にナノストロー製造（ステップＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶ）及びデバイス組み立て（ステップＶ）で終わる。最初の節（即ち、原料物質）は、高分子材料及び／又は密度の選択と調製を含みうる。第２の節の処理ステップ（即ち、ナノストロー製造）は、内径、長さ及びストロー材料などのナノストロー寸法に合うように調整されうる。第３の節（デバイス組み立て）は、デバイスフォームファクタを設定できる。
【0038】
従来の方法と比較して、本明細書に示された方法は、均一なナノストローウェルデバイスと、標準細胞株による７５パーセントを超える一貫したトランスフェクション効率の両方を達成できる。
【0039】
トラックエッチド高分子は、相対的な可用性と産業経験により選択されうる。最終的に、高分子材料は、後述されるように、細胞培養、堆積及びプラズマプロセス条件に適合しなければならない。ポリカーボネート（ＰＣ）トラックエッチド（ＰＣＴＥ）メンブレンは、大規模ろ過と細胞培養用途に使用されてきた。従って、ＰＣＴＥは、本明細書に記載されたナノストロー製造の為のナノ多孔性メンブレン基板の一例である。ＰＣＴＥに加えて、本明細書では、発明者が、適したガラス遷移温度と高い透明度の為に製造、培養及び撮像条件に適していることを確認したＰＥＴ（即ち、ポリエチレンテレフタレート）の基板について述べる。
【0040】
一例では、使用されうる典型的な方法は、ＰＣ薄膜のロール・ツー・ロール製造法である。この方法は、ＰＣ薄膜を所定の厚さ（約５〜２０μｍ）に押し出し成形し、その薄膜を特定密度（ナノストロー製造では２〜４ｘ１０７孔／ｃｍ２）のβ粒子透過に晒すことからなる。孔が導入された後、プロセスエンジニアは、紫外線と塩基性水溶液（１Ｍ ＮａＯＨ）の組み合わせで孔を所望の直径（＜１００ｎｍ）にウェットエッチングし、選択した湿潤剤で改質して疎水性を調整する。典型的に使用される湿潤剤の一例は、細胞培養の表面親水性を高める為に使用されるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。
【0041】
処理したＰＣＴＥを取り出して、追加処理ステップの前に、メンブレンを、手術はさみを使って１．５ｃｍｘ１．５ｃｍの正方形片に切断し、ｐ型（１００）シリコンウェハ上に田の字型に位置決めし、カプトン処理テープで角に取り付ける。正方形の長さは、ナノストローウェルデバイスのサイズによって、メンブレン正方形１つ当たり４つのデバイスを作成できるように（即ち、１６デバイス／ウェハ）決定される。ある程度の隙間メンブレン材料がデバイス製造に犠牲になるが、メンブレンは、品質保証プロトコルを更に開発するバッチ内処理条件をログ記録する為に、このように位置決めされる。更に、残りの隙間メンブレン材料は、しばしばＳＥＭなどの破壊的特性決定に使用される。実質的にナノストローに細胞毒素を持たせるナノストロー表面化学特性を変化させる為に、銀パッタリングが観察された。しかしながら、品質管理手順を開発する方向で、金の方が高い生体適合性であることが実証されているので、ストローモルフォロジとトランスフェクション実行との関連を調べる為に金スパッタリングが使用され可能性がある。
【0042】
原子層堆積（ＡＬＤ）は、熱的に及び／又はプラズマ（ＰＥＡＬＤ）若しくはラジカル種の利用によって強化されうる化学蒸着技術である。原子層エピタキシ（又は、ＡＬＥ）技術は、１９９０年代終わりに非エピタキシャル堆積を含むように改良され、最近では原子層堆積と呼ばれてきた。ＡＬＤは、一般に、ＭＯＳＦＥＴ技術用の金属酸化物高ｋゲート材料と高分子用の研磨材／保護被覆を含むがこれらに限定されない様々な薄膜技術に使用される。近年のＡＬＤの開発と使用可能化は、拡張性のある処理技術の進歩と、広範囲の処理材料及び前駆体とを特徴とし、この両方が、コスト効果と材料適合性の点でＡＬＤ用途の市場を拡大した。
【0043】
ＡＬＤの基本原理は、加熱基板上の薄膜のレイヤ・バイ・レイヤ成長である。この堆積方法で、２つの化学的前駆体が、その高い相対的反応性より選択され、表面における反応を制御する為にプロセスチャンバに連続的に導入される。基本的には、各反応ステップは自己停止する。最初のステップは、基板表面を第１の反応物前駆体に露出させ、次に反応物を送り出すことを含む。この露出中、第１の反応物は、実質的に、基板表面に吸着された分子の「単一層」で残る。次に、チャンバが真空にされ、第２の反応物がチャンバに導入される。この第２の前駆体は、第１の反応物の単一層と反応し、求められている固体薄膜の１つの層（典型的には完全より少ない層）を形成する。この後、残りの第２の反応物と任意の気相反応生成物が、チャンバから除去される。図６Ａ乃至図６Ｄに示されたこのプロセスは、所望の厚さの薄膜を成長させる為に、必要に応じて何度も繰り返される。
【0044】
原子層堆積は、従来、他の化学蒸着技術よりやや遅い堆積速度（約１オングストローム／分）を特徴とするが、ＡＬＤの利点には、原子レベルでの「デジタル」厚み制御（例えば、ＡＬＤサイクル数を変化させることによって薄膜厚さをアトミックに制御できる）と、高分子や紙などのあまり頑丈でない基板との適合を可能にする比較的低い温度と圧力、地形学的基板上の高アスペクト比の共形薄膜成長（ガス前駆体がどの露出面にも到達でき、即ち、被覆領域は、非ＰＥＡＬＤプロセスの場合に、見通し線蒸気源によって限定されない）と、規模経済性を有する比較的安価な堆積とが含まれる。ロール・ツー・ロール被覆と並列空間処理によって、超高速堆積（約０．５ｎｍ／秒、従来のＡＬＤの速度の約３００倍）が達成されうる。
【0045】
本明細書に記載されたナノストロー作成は、この共形薄膜堆積を選択エッチングと共に利用して、高アスペクト比構造を成長させるナノメートル分解能を強化できる。
【0046】
ＡＬＤプロセスを制御する為のパラメータは、系全体の温度設定点、前駆体（Ａｌ２Ｏ３ではＴＭＡとＨ２Ｏ）流れ特性、及び系平衡の為の遅延時間を含みうる。薄膜均一性は、ＡＬＤプロセス開始前のメンブレンの酸素プラズマクリーニングによって高められうる。使用された標準薄膜成長パラメータから、ｐ型シリコン上に５％以内のウェハ均一性を有するほぼ１０ｎｍ＋／１ｎｍの堆積が得られた（例えば図７Ｄの５点解析を参照）。シリコン上のＡｌ２Ｏ３薄膜厚を、３オングストローム分解能を有する楕円偏光法によって測定した。シリコン上のアルミナ堆積厚は、ポリカーボネート上の堆積厚と相関するように使用された。実際のＡＬＤ厚さは、ＦＥＩ走査電子顕微鏡（例えば、図８Ｅ、電子ビームに垂直を参照）を使って、完全に製造されたナノストローの側壁厚として測定された。
【0047】
図７で、図７Ａに示されたＳａｖａｎｎａｈ ２００（ケンブリッジ・ナノテック）を使って標準Ａｌ２Ｏ３薄膜を成長させた。図７Ｂは、図７Ａに示されたデバイスを動作させる為のユーザインタフェースを示す。図７Ｃで、圧力プロファイルを使用して、品質管理の為に前駆体パルス及びチャンバパージ特性を監視する。図７Ｄと図７Ｅは、５点楕円偏光法の厚さ均一性試験報告を示し、標準ＡＬＤ堆積プロトコルによるシリコン上の厚さ１０ｎｍ＋／−１ｎｍのアルミナ薄膜を示す。
【0048】
原子層堆積によって薄膜を堆積させるとき（＜１０ｎｍ）、基板表面特性を検討することが重要なことが多い。詳細には、高分子上のＡＬＤの場合、表面粗さは、自己制限的なレイヤ・バイ・レイヤ成長に達するまでに高分子材料中に拡散する初期ＡＬＤサイクル（１５〜３０サイクル）に起因しうる。限界サイクル数を超えると、ＡＬＤ材料は、最終的に、高分子中への拡散障壁として働き、連続成長が進行しうる。文献によって示されたような高分子上のＡＬＤ核形成／成長の仕組みを図８Ａ乃至図８Ｄに示す。
【0049】
実験的観察、インピーダンス分光法、及びＳＥＭから、実際の堆積厚さが、１５〜３０ｎｍになると考えられ、これは、楕円偏光法によって測定されたシリコンウェハ上の１０ｎｍの堆積とほぼ一致する（例えば、図８Ｅを参照）。これらの厚さ評価の差は、図８Ａ乃至図８Ｅに示されたメカニズムの検討によって正当化され、初期核形成相におけるＴＭＡ前駆体の拡散フロントが、高分子上に拡散障壁が既にあった場合に予想される望ましい１０ｎｍ堆積に実質的に加わることがある。高アスペクト比のＳＥＭでは、絶縁材料が、スパッタ材料厚さ及び電子ビームからの表面帯電の形で人工物に加わることがある。即ち、ＡＬＤ厚さのＳＥＭ評価は、定性的に理解されなければならない。
【0050】
主にナノストローの外側壁に生物学的表面相互作用が起こる。細胞接着と表面粗さとの強い相関関係を支援する証拠があり、我々のモデルは、ＡＬＤプロセスによる表面粗さが、実際に、ナノストロー細胞浸透に有益でありうることを示す。これは、バッチ内の空間的に均一なデバイストランスフェクション効率の観察と一致する。
【0051】
前述したように、ナノストローは、これまでアルミナによって表現され最適化されていた。驚いたことに、望ましい特性を有するナノストローが、シリカ又はハフニア（ＨｆＯ２）を含む他の材料から形成されうることが分かった。これらの材料は、より容易に拡大縮小され、培養物内の細胞生存性とトランスフェクション効率の両方の性能を改善できる。
【0052】
シリカ（ＳｉＯ２）ナノストローは、シリカの観察される生体適合性と表面化学によって、ＴＥとＣＶ両方の点で適切に動作することが予想された。驚いたことに、そのようなストローの生体適合性は高かったが、トランスフェクション効率は著しく低かった。シリカ結晶構造は、シラン化学反応によって細胞適合性を示すように容易に機能化されうる。更に、等電点（即ち、水溶液中の材料の表面電荷が中立のｐＨ）は、アルミナのものよりかなり低い（約２〜３対約８〜９）。
【0053】
ナノストロー媒介導入の溶液条件が、生体適合性（即ち、約ｐＨ７で緩衝された）でなければならず、またストローを介して細胞内に通される均一帯電材料を取得（又は、「粘着性」を検査）すべきでないので、ナノストローとして機能するときにナノストロー材料の等電点を材料の特性と関連付けできることが期待されうる。シリカ表面は、負に帯電され、それに対して、アルミナ表面は、バルク溶液に対して正になる。アルミナの場合、正に帯電した面が、負に帯電した核酸（即ち、プラスミドＤＮＡ）の導入にとって不利な意味合いを有することがあるので、このカーゴが、導入プロトコル中にナノストロー内の結合と詰まりの高い可能性を有することがある。
【0054】
図９は、シリカナノストロー材料の例を示す。孔径１００ｎｍナノストローのシリカナノストロー製造を示した。シリカ構造上の細胞生存性は優れていたが、トランスフェクションの標準生物学的プロトコルは最適ではないことが分かった。また、ポリカーボネート上のシリカＡＬＤは、前駆体ガスと高分子基板の適合性が低かった。吸着カバレッジ時間は、ポリカーボネート上のシリカの方がポリカーボネート上のアルミナより遅かった。吸着時間のこの差は、ポリカーボネートに吸着されたシリカ前駆体の方が、ポリカーボネートに吸着されたアルミニウム前駆体より活動化障壁が高いことに起因しうる。この吸着障壁を説明する為に、ポリカーボネートの融点（約１５０℃）を侵さないが、シリカ原子層堆積は、酸化還元表面化学特性により適合するようにプラズマ強化された。実質的な吸着カバレッジの為に、前駆体ＴＤＭＡＳ、又はトリ（ジメチルアミノ（dimethlyamino））シラン、及びＨ２Ｏが、基板との界面においてプラズマ相で使用された。プラズマ相の材料化学種は、気相と違うふうに挙動した。このプロトコルによる１つの努力目標は、次のサイクルステップに進む前に完全なステップカバレッジと共形被覆を保証するように、シリコン支持プラズマのストロー内への到達を可能にすることであった。これは、典型的には、層へのより高いプラズマ照射量（約１０４Ｌ）によって妨げられる。ナノストローデバイス用のポリカーボネート上のＳｉＯ２ ＡＬＤは、摂氏６０〜１００度のＡＬＤ窓で実証された。しかしながら、より高いプラズマ照射量とシリカ層の原子スケール表面粗さの関係を、処理中のポリカーボネートメンブレン品質を保つ状況で、よく調査しなければならない。
【0055】
驚いたことに、ハフニア（ＨｆＯ２）ナノストローは、アルミナと比較されたとき、予想に反して有利であることが分かった。ＰＣＴＥメンブレンの低温ハフニア（ＨｆＯ２）ＡＬＤパラメータは、アルミナパラメータに類似する。ハフニア前駆体（テトラキス（ジエチルアミノ）ハフニウム（ＴＤＥＡＨ）及びＨ２Ｏ）は、アルミナナノストローに関して前述されたように、熱的に強化されうる。例えば、Ｓａｖａｎｎａｈ ２００ ＡＬＤシステム（上の図７Ａを参照）は、同様に使用されうる。しかしながら、アルミナストローと同等サイズのハフニアナノストローの使用は、より高いＴＥを有した。これは、ハフニアの等電点が約７であり、従って、水溶液中で導入中に表面化学特性がほとんど中立でありうるからである。中立の表面化学特性は、溶液中で帯電分子を引き寄せず、従って、カーゴが詰まる可能性が低い。
【0056】
ハフニアは、アルミナの場合と同様に、塩素系エッチ化学物質（ＢＣｌ３）に加えてフッ素系エッチ化学物質（ＣＦ４）によって反応性イオンエッチングされうる（前述のように）。フッ素化学物質による利点は、塩素系エッチ化学物質の維持と関連したコスト、労力及びリスクと比較した調整と維持の相対的容易さにある。
【0057】
図１０は、ハフニアナノストローを示す。図１０Ａに示されたように、ハフニアナノストローは、アルミナ系ナノストローと類似の処理パラメータを利用するＳａｖａｎｎａｈ ２００（ケンブリッジ・ナノテック）を使って首尾よく製造された。図１０Ｂで、ハフニアナノストローはきれいな開孔があり、ストロー長さ全体に沿って均一径を有するように見え、これは図１０Ｃにも示される。ハフニアには、低温堆積、比較的中立な等電点、及びフッ素系エッチ化学物質との潜在的適合性という利点がある。
【0058】
ナノストロー作成は、ＡＬＤ速度が比較的遅いにもかかわらず、より高い処理量に拡張されうる。熱的に強化されたＡＬＤリアクタ内の堆積速度は、様々なプロセスガスを並列に投入する為の時間制限領域から空間領域並びに大きい基板領域にわたって移動することによって著しく高められうる。３６００ＡＬＤ被覆ウェハ／時間もの高い処理量が報告された。更に、柔軟な高分子基板の使用は、ロール・ツー・ロール処理へのＡＬＤ被覆を可能にしうる。
【0059】
本明細書に記載されたナノストローはどれも、ナノストローを形成するときに異方性ドライエッチング法を使用して上部金属酸化物層をエッチングすることにより形成されうる。例えば、ドライエッチング技術は、異方性エッチプロファイルを生成でき、選択性と指向性により近年好まれている。エッチングプロセスは、一般に、スパッタエッチング、化学エッチング又はガス化（gasificaiton）、加速イオンアシストエッチング、側壁保護イオン強化エッチング、及び反応性イオンエッチングの５つのカテゴリに分類されうる。
【0060】
用語「反応性イオンエッチング」は、しばしば異方性エッチングを指す為に使用されてきたが、これは完全に正しいわけではない。低密度プラズマ（即ち、電流密度０．０１〜１ｍＡ／ｃｍ２を有する）では、実用的エッチング速度を達成するにはイオン衝突が少なすぎる。しかしながら、イオン束で衝撃する最近の高密度プラズマエッチングシステムでは（１〜１０ｍＡ／ｃｍ２の電流密度を有する）、基板を壊滅させるのに十分な濃度の「空腹イオン」が作成されうる。そのような場合に用語「反応性イオンエッチング」が適切である。
【0061】
プラズマエッチングの重要な検討事項の１つは、薄膜／基板内の温度上昇である。表面に衝突するプラズマエッチング化学種とスパッタリング原子は、例えば、蒸発源から出る同等の原子よりはるかに高エネルギーである。イオン衝突、凝縮及び反応の際、解放された過剰エネルギーが、基板を介して放散されなければならず（真空中の熱放散が輻射なので）、そうでないと過度に加熱されて薄膜品質が低下しうる。
【0062】
プラズマ中に浸された薄膜又は基板表面からの原子のエッチング又は除去は、物理手段と化学手段の両方によって行われる。イオンエネルギーと圧力の変化によって、支配的な材料除去プロセスがシフトする。例えば、物理的スパッタエッチングは、最低圧力（約１ｍｔｏｒｒ）と最高エネルギー（ｋｅＶ）で起こる。表面破損メカニズムによるイオンアシストエッチングは、もっと低いエネルギー且つ少し高い圧力（約５０ｍｔｏｒｒ）で起こる。いずれの場合も、表面エッチングは、異方性になる傾向がある。しかしながら、約１ｔｏｒｒの高い圧力での化学的エッチングによって、高エネルギーイオン衝撃が排除され、その結果、薄膜の攻撃が等方性になる。実際のプラズマエッチングプロセスでイオン種の多くの塊が大きいので、そのイオン種の動きは、高周波電界と同相でないことがある。その結果、一般に、イオン変位振幅とエネルギーが低すぎてスパッタリングを引き起こすことができなくなる。
【0063】
ＰｌａｓｍａＱｕｅｓｔ ＥＣＲエッチャでは、電子サイクロトロン共鳴効果によってプラズマが作成される。マイクロ波は、ガス中の電子のサイクロトロン共鳴周波数に同調される。このマイクロ波は、原子内電子を、原子から十分な動力学的エネルギーを剥ぎ取ることができるポイントまで励起し、ガスをイオン化する。これにより、放電なしでまたプラズマ内のイオンの温度を著しく高めることなく、プラズマを作成できる。従って、得られたプラズマは、低い温度と低い密度を有し、また、高いイオン分画を有し、これは、本明細書に記載されたナノストローを形成するプラズマエッチングを含む高分子基板上のプラズマエッチングに役立ちうる。
【0064】
本明細書に記載されたナノストローの製造は、典型的には、酸化を含む。ガス（例えば、Ｏ２１０％、Ａｒ９０％）のイオン化によって生成された電子は、電界内でエネルギーを得る。これらの高エネルギー電子と中性ガス分子間のその後の衝突によって、分子へのエネルギー移動が起こり、活性原子、遊離基、イオン及び自由電子が化学的に作成される。分離され無害な燃焼生成物は、ガス流出口で取り出される。このプロセスは、有毒化学物質を使用せずに周囲温度近くで行われ、これは、高分子にとってアルミナ、シリカ、ハフニアなどの金属酸化物構造の選択性が高い。
【0065】
プラズマ酸化のメカニズムが提供された場合、特性（即ち、エッチング速度、選択性、粗さなど）は、高周波電力（Ｗ）、チャンバ圧力（ｍＴｏｒｒ）、ガス分圧（ｍＴｏｒｒ）、チャンバ温度、基板温度などのプラズマ特性の関数でありうる。
【0066】
標準エッチプロトコルは、１．０〜１．５ナノストロー長さ（３０〜４５度の視角を計算に入れて）を得る４つの連続エッチサイクルを含む。今日まで、このナノストロー長さ範囲で、性能の明らかな特異的傾向は内部的に観察されていない。
【0067】
ナノストローウェルインサートは、本明細書に記載された任意のナノストローを使用して製造又は組み立てられうる。例えば、図１１Ａ乃至図１１Ｄは、本明細書に記載された改善方法を使用して組み立てられたナノストローの一例を示す。図１１Ａに、両面環状テープ１１０１、ポリカーボネート（ＰＣ）管１１０３、及びナノストローメンブレン１１０５を含むナノストローウェルインサート装置の構成要素を示す。デバイス組み立ては、ＰＣ管の切断又は形成と、両面テープのそれぞれの寸法への切断又は形成を必要とする。図１１Ｂで、両面テープが、管と結合され、管をナノストローメンブレン（ナノストローが管に向く状態で向けられた）に突き刺してもよい。必要に応じて、図１１Ｃに示されたように、余剰材料１１０５’がトリムされうる。図１１Ｄは、既存の培養ウェルプレート１１０７に一体化されたナノストローウェルインサートデバイスを示す。従って、ナノストローウェルインサートの組み立ては、両面環状テープの一方の側をポリカーボネートチューブウェルの一端にテープ留めすること、両面テープの反対側をナノストローメンブレンにテープ留めすること（ナノストローがデバイスに垂直）、及び必要に応じて、標準トリミングツールを使ってナノストローウェルインサートの縁から余分なナノストローメンブレンを切断しトリミングすることを含みうる。
【0068】
組み立て後、ナノストローウェルインサートデバイスを７０％エタノール水溶液で洗浄し、１０〜１５分間空気乾燥させ、１５分間紫外線で殺菌できる。ナノストローウェルインサートは、既存の６、１２及び２４ウェルプレートに容易に嵌まり、撮像しやすい。
【0069】
切断／トリミングプロセスは、金属ダイカッタによって、又はポリカーボネートチューブウェルへの直接炭酸ガスレーザ溶接によって、大規模にバッチ実行されうる。更に、チューブウェルの寸法は、人間工学的考察を考慮して設計されうる。
【0070】
本明細書に記載されたナノストローウェルインサートデバイスのいずれかを含む装置はどれも、細胞培養、詳細には長期細胞培養（例えば、５日間を超える）に使用され、細胞の内部構造にアクセスする（例えば、物質を細胞内にトランスフェクトする）為にいつでも使用されうる。以前に記載され特性決定されたナノストローデバイスと異なり、これらの装置は、細胞生存性に著しく影響を及ぼすことなく、少なくとも３週間以内を含む５日より長い期間使用されてもよく、更に、この期間中のいつでも、ナノストロー構造を使用して内部細胞材料にアクセス（例えば、材料の導入、材料の除去など）できる。
【0071】
例えば、図１２は、モデル細胞株の為の短期間の従来の標準細胞培養プロトコルを示す（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａなど）。組み立て後、ナノストローウェルインサートデバイスを、例えば７０％エタノール水溶液で殺菌し、１０〜１５分間空気乾燥し、１５分間紫外線（λ＝３０５ｎｍ）下に配置してもよい。一般的に言って、標準プロトコルは、３５０μｌの「通常」媒体（例えば、１０％牛血清（ＦＢＳ）とインビトロゲン（Invitrogen）社（Ｃａｔ＃ １０５６４）からのＤＭＥＭ媒体と１Ｘ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｐ／Ｓ）を加えたもの）に４時間（典型的には、一晩培養）にわたってナノストローメンブレンの上で細胞を培養することを必然的に伴う。ナノストローウェルインサート装置は、３５０μｌの１Ｘ通常媒体の浴槽を収容する２４ウェルプレート内に配置されうる（ナノストローデバイスの外部で分配される）。電気穿孔法／トランスフェクションの後、細胞は、光学顕微鏡による解析の前に、更に１２〜４８時間培養される。
【0072】
本明細書に記載されたように形成されたものを含む装置が、特に前述されたものと比較されたとき、特にアルミナナノストローを含む組織培養の為に特に長い生存期間（例えば、５日を超える）を有するように示されたので、細胞は、長期間培養されうる。例えば、図１３は、本明細書に記載されたナノストローウェルインサート装置を使用する１つの方法を示す。図１３で、インサートを最初に殺菌し、次に細胞培養の為に調製する。例えば、細胞培養媒体が、インサートデバイス内に追加されてもよく、インサートは、十分に適応された従来のマルチウェルディッシュに入れられてもよい。追加の細胞培養媒体（同じか又は異なる媒体）が、インサートが入れられたディッシュに追加されてもよく、カバーが提供される。細胞もインサートデバイスに追加されうる。その後、細胞は、詳細にはきわめて長い時間（＞５日）を含む所望の時間期間、培養されうる。これは、ナノストローデバイスの従来の変形物と対照的であり、従来の変形物では、細胞生存性が３〜４日後に劇的に低下した（例えば、この期間より長く残存する細胞が半分未満）。本明細書に記載された装置は、５日後に＞５０％（例えば、＞６０％、＞７０％など）の生存性を有しうる。
【0073】
本明細書に記載されたナノストローウェルインサートデバイスは、前述されたように、マルチウェルディッシュと共に使用するように十分に適応されていることに加えて、特に、ナノストローウェルインサートデバイスを確実に保持できる電気穿孔アダプタと共に使用するように適応されうる。電気穿孔アダプタ（本明細書では「細胞キャップ」と呼ばれる）は、後でより詳しく述べられ、一般に、ナノストローウェルインサートデバイスの下部が、底面電極とインサートデバイスの下部との間の泡／蒸気形成を防ぐようにも構成された所定の距離だけ底面電極から離されるように、インサートデバイスが挿入され、較正されたカーゴ領域の上に保持されうる円筒体を有してもよい。キャップ部分は、第２の（上部）電極が下部電極から一定の所定距離に保持され、インサートデバイス内に突出するように円筒体の上に配置されうる。電気穿孔アダプタ（細胞キャップ）の壁は絶縁されうる（例えば、断熱、電気絶縁など）。また、キャップは、（例えば、電気穿孔装置に）輸送されうるように装置を封止でき、上部電極及び底面電極と通信する外部接点を有することができ、それにより、電気穿孔が、装置の外部から実行されてもよく、カーゴ（例えば、プラスミド、タンパク質など）を、底面電極の上のカーゴ溶液領域からナノストローを通して細胞まで制御可能に輸送する。
【0074】
ナノストローウェルインサートデバイスと電気穿孔アダプタ（細胞キャップ）を最適化する為、トランスフェクション効率（ＴＥ）と細胞生存性（ＣＶ）に影響を及ぼすと考えられる要素を定量化した。これらの中で、試験された要素は、密集度、上部電極形状、電極間距離、印加電圧と刺激持続時間、上部溶液の浸透圧モル濃度、電気穿孔法前の洗浄媒体であった。密集度は、２５，０００細胞から２００，０００細胞まで試験し、最良ＴＥ及びＣＶは２５，０００細胞であった。
【0075】
ナノストローデバイス上の細胞に加えられる電界強度に対して電極距離が重要な役割を果たすことが分かった。０．２５ｃｍ〜１．２５ｃｍの距離を試験し、０．５ｃｍが比較的高いＴＥ及びＣＶを示した。ＴＥとＣＶは、電界強度の高さに反比例した（即ち、電極間距離が短いほど、印加電圧が高く、刺激持続時間が長い）。モデル細胞株は、８０％を超えるＣＶで最大１５Ｖの印加電圧まで生存したが、このしきい電圧より上では細胞死が急速に増えた。電極形状は、平面設計、点設計及び螺旋状設計の間で、性能に大きく影響しないことが分かった。電気穿孔直前の新しい媒体とより低い浸透圧モル濃度の溶液との交換（ＰＢＳ対「通常」媒体）は、より健全な細胞とより高いトランスフェクション率を示した。
【0076】
従って、幾つかの変形物では、ナノストローウェルインサートデバイス及び／電気穿孔アダプタに組み込まれる電極の使用は、ＴＥとＣＶの両方の強化に重要でありうる。例えば、上部電極と底面電極の間の距離（２つの間にナノストロー基板を有する）は、最適には、０．２５ｃｍ〜１．２５ｃｍであり、例えば、印加電圧が＜１５Ｖのときは０．３ｃｍ〜０．８ｃｍでなければならない。この範囲外（例えば、＞１．２５ｃｍ）で、細胞生存性は、特に培養時間が長い場合に急激に低下した。
【0077】
例えば、モデル細胞株内の核酸を使用する電気穿孔トランスフェクションプロトコルを使用して、本明細書に記載された装置を検査した。電気穿孔法による各トランスフェクションの前に、標準Ｋｉｍｗｉｐｅを使用して、下側Ｐｔ電極（底面電極）を７０％エタノール水溶液で洗浄した。６０μｌの液体導入前駆体（例えば、核酸、プラスミド、タンパク質、蛍光染料、ＣＯ＋２などのカーゴ溶液）を導入リザーバ内に滴下した（図２Ａを参照）。事前培養ナノストローウェルデバイスを導入前駆体ホルダ（例えば、電気穿孔アダプタ／細胞キャップ）に入れることができ、また僅かな圧力を加えてナノストローメンブレンの下部への液体導入前駆体の完全な濡れを保証できる。次に、上部Ｐｔ電極を、ナノストローウェルデバイス溶液内に、下部Ｐｔ電極の約０．７ｃｍ上まで下げた。過去の観察から、電気印加前に１分間とることは重要である。これにより、単純拡散によってナノストローメンブレンが導入前駆体で完全に濡れることが保証される。
【0078】
拡散の為の時間をとった後で、直流電気をナノストローウェルデバイスの両側（例えば、電気穿孔法ホルダ／細胞キャップの両側）に印加した。標準電極構成は、下部電極と上部電極がそれぞれ負と正である。負に帯電した前駆体は、上部溶液と細胞培養内に上方に電気的に駆動されうる。標準ＤＣパルスプロファイルは、電圧１０Ｖ、個々のパルス幅２００μｓ、周波数２０Ｈｚ、全処理持続時間４０秒である。電気パルス印加後、ナノストローウェルデバイスが、開けられた電気穿孔内への化学種の拡散を可能にする為に、更に少しの間、導入前駆体と接したままである。次に、デバイスは、更に１２〜４８時間培養器内に戻された後で撮像される。
【0079】
図１４Ａ乃至図１４Ｆは、前述されたような製造及び実験パラメータ最適化によってモデル細胞株内への核酸の導入を強化できることを示す。図１４Ａで、緑色蛍光ヒーラ細胞内へのオリゴヌクレオチド導入が示される（ヒーラ細胞密集度を示す為に緑色チャネル開花（florescence）が使用される）。図１４Ｂで、赤色色素トランスフェクションを示す為に撮像に赤色チャネルが使用され、図１４Ｃで、トランスフェクション効率を定量化する為にマージされた緑色及び赤色チャネルを示す。この例では、ＴＥ＞９０％であり、この高いＴＥ結果は、前述のナノストローウェルインサートプラットフォームを使用して再現可能であり極めて効率的であった。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞緑色蛍光ＣＨＯ細胞内へのプラスミド導入も調べた。この例では、ＨＥＫ ２９３Ｔモデル細胞株内へのｐＥＧＦＰ導入は、＞７５％の効率を示した。図１４Ｄでは、細胞識別の為にＨｏｅｓｃｈｓｔ染色を撮像する為に青色チャネルが使用され、図１４Ｅでは、ｐＥＧＦＰ発現の撮像に緑色チャネルが使用され、ＴＥの定量化に蛍光が使用された。更に、緑色蛍光ＣＨＯ細胞内へのｐｍＣｈｅｒｒｙ導入による標準トランスフェクションプロトコルによってＴＥが＞７５％となる（図１４Ｆに、ＣＨＯ細胞識別の為の緑色チャネルを示し、図１４Ｇに、ｐｍＣｈｅｒｒｙプラスミド発現の為の赤色チャネルとＴＥ定量化の為の蛍光を示す）。全ての光学像は、それぞれ同じ露出（２００ｍｓ）で撮影され、複数の倍率（図１４Ａ乃至図１４Ｃは２０倍、図１４Ｄ乃至図１４Ｇは１０倍）で撮像された。
【0080】
図１Ａ乃至図１Ｂに戻り、ナノストローウェルインサートデバイス１０１を示す。この例では、ナノストローウェルインサートデバイスは、ポリカーボネートなどのインサート（好ましくは透明）材料で形成された円筒体１０３を含む。ナノストロー含有基板１０５は、両面テープ１０７によって円筒体の下部の上に取り付けられ、細胞が成長されうるウェルを形成する。ナノストロー材料は、詳細には、ハフニアなどの材料で形成されたナノストローでよい。図１Ｂは、ナノストローウェルインサートデバイス１０１の分解図であり、円筒体１０３、両面テープ１０７及びナノストローメンブレン（membraned）１０５の典型的な寸法を示す。
【0081】
図２Ａ乃至図２Ｄは、ナノストローウェルインサート装置の別の例を示す。図２Ａに、トランスフェクション中の汎用ナノストローウェルインサートデバイスが示される。インサートデバイスは、述べたように、適合する導入前駆体ホルダ（例えば、電気穿孔アダプタ／細胞キャップ）と共に使用されうる。図２Ａで、装置のインサート部分は、図１Ａ乃至図１Ｂに関して前述されたように、下部に取り付けられて培養ウェルを作成するナノストローメンブレン２０５を備えたポリカーボネート管２０３から成る。細胞は、媒体を有するデバイスウェル内で直接培養されうる（上側媒体は、トランスフェクションプロトコルで前述されたように「通常媒体」である）。インサート装置は、導入前駆体ホルダ（例えば、電気穿孔アダプタ／細胞キャップ）にニトロ化され（nitrated ）てもよく、ホルダ／アダプタは別個でもよい。図２Ａでは、電気穿孔法によるトランスフェクションの為、インサートは、導入される分子種を含むカーゴリザーバ２０９と接触されうる（ここで、溶液中の小球、例えば、典型的には水中のＤＮＡ／ＲＮＡとして示される）。カーゴリザーバは、ホルダ／アダプタ内に形成され、底面電極２１１とインサートのメンブレンの下部との間にできる泡を防ぐように構成され、これは、この泡がトランスフェクションに有害な影響を及ぼしうるからである。
【0082】
電気パルスは、この例では白金電極として示された上部電極と下部電極の間に発射されてもよく、これは、ナノストローを通した細胞内アクセスを可能にする孔を細胞膜に開けうる。
【0083】
図２Ａ乃至図２Ｄは、ナノストロー上に成長する細胞を含むナノストローメンブレンの一部を構成しうるナノストローの走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を示す。この例では、ストローの長さは、典型的には、１〜３マイクロメートルであり、外径は約１００ｎｍである。図２Ｃ乃至図２Ｄで、ＳＥＭ画像は、実際のデバイス原理を示す為にナノストローメンブレン上のクライオ固定ＣＨＯ細胞を示す。ナノストローは、細胞膜を自然発生的に貫通することが実証されており、電気パルスは、導入効率を高める「バルブ」として働く。
【0084】
次に図１５Ａ乃至図１５Ｃに移ると、ナノストローウェルインサートデバイスと互換／適合導入前駆体ホルダ（例えば、電気穿孔アダプタ／細胞キャップ）を含む装置が示される。図１５Ａは、ホルダ（電気穿孔アダプタ又は細胞キャップ１５００とも呼ばれる）に挿入されたナノストローウェルインサート１５０１を示す。ナノストローウェルインサートは、実質的に、図１Ａ乃至図１Ｂ及び図２Ａで前述されたようなものである。電気穿孔アダプタは、細長い円筒体１５１５内にインサートを固定するように構成され、従って、インサートの下部は、平坦で底面電極１５１３と平行である。底面電極は、アダプタの下部全体にわたって固定され、リザーバ貯蔵部１５０３を保持し形成する為に平坦又は凹面でよい。述べたように、アダプタは、ナノストローウェルインサートのメンブレンと底面電極との間に泡が閉じ込められるのを防ぐように構成されてもよく、例えば、アダプタは、インサート内のメンブレンの平坦な底と貯蔵部１５０３との間から空気が漏れることを可能にする為に、側面内及び／又は側面を通る１つ以上のチャネルを有しうる。
【0085】
一般に、電気穿孔アダプタは、円筒チャンバ内にインサートを確実に保持するように構成され、上部電極１５０９を有するキャップ１５０５は、デバイス内に保持されたときにインサートの上に取り付けられうる。キャップは、摩擦ばめ及び／又は機械的、磁気的又は他の取り付け（例えば、ねじ留め、スナップ留めなど）によって適所に保持されうる。詳細には、キャップは、上部電極をインサートの上の所定の位置に少なくとも部分的に保持できる。電気穿孔アダプタ全体は、上部電極と底面電極との分離距離を、本明細書で述べたように最適に維持できる（例えば、０．３〜０．８ｃｍ、又は約０．５ｃｍ）。
【0086】
上部電極１５０９と底面電極１５１３は、示されたようにアダプタ内に位置決めされてもよいが、アダプタの外側上の電気接点に対する１つ以上の接続を有してもよく、従って、インサートが、アダプタの無菌内部チャンバ内に保持された場合でも、装置全体を手作業で保持し操作でき、その操作は、前述したように電極全体に電流を流す為に電気穿孔装置内に入れることを含む。
【0087】
本明細書に記載された方法（ユーザインタフェースを含む）はいずれも、ソフトウェア、ハードウェア又はファームウェアとして実現されてもよく、プロセッサ（例えば、コンピュータ、タブレット、スマートフォンなど）によって実行されうる１組の命令を記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体として示されてもよく、その１組の命令は、プロセッサによって実行されたときに、プロセッサに、表示、ユーザとの通信、解析、パラメータ（タイミング、周波数、強度などを含む）の修正、決定、警告などを含むがこれらに限定されない任意のステップの実行も制御させる。
【0088】
特徴形状又は要素が、本明細書で別の特徴形状又は要素「上（ｏｎ）」あると言及されるとき、他の特徴形状又は要素のすぐ上にあってもよく、介在する特徴形状及び／又は要素が存在してもよい。これと対照的に、特徴形状又は要素が、別の特徴形状又は要素の「すぐ上」にあると言及されたときは、介在する特徴形状も要素も存在しない。また、特徴形状又は要素が、別の特徴形状又は要素に「接続」、「取り付け」又は「結合」されるように言及されたとき、他の特徴形状又は要素に直接接続、取り付け又は結合されてもよく、介在する特徴形状又は要素が存在してもよいことを理解されよう。これと対照的に、特徴形状又は要素が、別の特徴形状又は要素に「直接接続」、「直接取り付け」又は「直接結合」されるように言及されたとき、介在特徴形状又は要素は存在しない。一実施形態に言及又は図示されたが、そのように言及又は図示された特徴形状及び要素は他の実施形態に適用できる。また、別の特徴形状に「隣接して」配置された構造又は特徴形状に対する参照が、隣接する特徴形状の上又は下に重なる部分を有しうることは当業者によって理解されよう。
【0089】
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を示す為であり、本発明を限定するものではない。例えば、本明細書で使用されるとき、単数形「a」、「an」及び「the」は、文脈が他の状況を明確に示さない限り、複数形も含むように意図される。更に、用語「有する」及び「含む」（「comprises」及び「comprising」）は、本明細書で使用されるとき、述べた特徴形状、ステップ、操作、要素及び／又は構成要素の存在を示すが、１つ以上の他の特徴形状、ステップ、操作、要素、構成要素及び／又はそのグループの存在又は追加を妨げないことを理解されよう。本明細書で使用されるとき、用語「及び／又は」は、関連付けられた列挙項目の１つ以上の項目のいずれか及び全ての組み合わせを含み、「／」として短縮されうる。
【0090】
「下に」（「under」、「below」、「lower」）、「上に」（「over」、「upper」）などの空間的相対語は、本明細書では、図に示されたような１つの要素又は特徴形状の別の要素又は特徴形状に対する関係を示す説明を容易にする為に使用されうる。空間的相対語が、図に描かれた向きの他に、使用又は操作におけるデバイスの様々な向きを包含するように意図されることが理解されよう。例えば、図内のデバイスが反転された場合、他の要素又は特徴形状の「下に」（「under」又は「beneath」）と言及された要素は、他の要素又は特徴形状の「上に」（「over」）に向けられる。従って、典型的用語「下に」（「under」）は、上（over）と下（under）の両方の向きを含みうる。デバイスは、違うふうに向けられてもよく（９０度回転されるか他の向き）、本明細書で使用される空間的相対的記述子は、それに対応して解釈される。同様に、用語「上方へ」（「upwardly」）、「下方へ」（「downwardly」）、「垂直に」（「vertical」）、「水平に」（「horizontal」）などは、本明細書では、特に断らない限り、説明の為にのみ使用される。
【0091】
用語「第１」と「第２」は、本明細書では、様々な特徴形状／要素（ステップを含む）について述べる為に使用されることがあり、これらの特徴形状／要素は、文脈で特に断らない限り、これらの用語によって限定されない。これらの用語は、ある特徴形状／要素を別の特徴形状／要素と区別する為に使用されうる。従って、本発明の教示から逸脱することなく、後述される第１の特徴形状／要素が第２の特徴形状／要素と呼ばれることがあり、同様に、後述される第２の特徴形状／要素が第１の特徴形状／要素と呼ばれることがある。
【0092】
以下の本明細書とクレーム全体にわたって、文脈が特に必要としない限り、語「有する」及び「含む」（「comprise」及び「comprises」や「comprising」などの変化形）は、方法及び文献で共用されうる様々な構成要素（例えば、デバイスと方法を含む構成物と装置）を意味する。例えば、用語「comprising」は、述べた任意の要素又はステップを含むが他の任意の要素又はステップを排除しないことを理解されたい。
【0093】
一般に、本明細書に記載された装置及び方法はいずれも、包括的であるように理解されるべきであるが、構成要素及び／又はステップの全て又は一部は排他的でもよく、様々な構成要素、ステップ、副構成要素又はサブステップ「から成る（consisting of）」、あるいは「実質的にからなる（consisting essentially of）」として表現されうる。
【0094】
例で使用されるときを含む本明細書及びクレームで使用されるとき、特に明示的に示されない限り、全ての数は、語「約」（「about」）又は「略」（「approximately」）が明確に現れない場合でも、これらの語が前置されたように読まれるうる。句「約」（「about」）又は「略」（「approximately」）は、大きさ及び／又は位置を示すときに、表示された値及び／又は位置が、値及び／又は位置の妥当な予想範囲内にあることを示す為に使用されうる。例えば、数値は、表示値の＋／−０．１％（又は値の範囲）、表示値の＋／−１％（又は値の範囲）、表示値の＋／−２％（又は値の範囲）、表示値の＋／−５％（又は値の範囲）、表示値の＋／−１０％（又は値の範囲）の値を有しうる。本明細書に示された任意の数値は、文脈で特に示されない限り、約（about）又は略（approximately）その値を含むことを理解されたい。例えば、値「１０」が開示された場合、「約１０」も開示される。本明細書に列挙された任意の数値範囲は、そこに包含される全てのサブ範囲を含むように意図される。また、当業者によって適切に理解されるように、値が開示されたとき、その値「以下」の値、「以上」の値、及び値の間のあり得る範囲も開示されることを理解されたい。例えば、値「Ｘ」が開示された場合、「Ｘ以下」並びに「Ｘ以上」（例えば、Ｘが数値である場合）も開示される。また、本出願全体にわたって、データが幾つかの異なる形式で提供され、このデータが、終点と始点を表わし、データ点の任意の組み合わせの範囲を表すことを理解されたい。例えば、特定のデータ点「１０」と特定のデータ点「１５」が開示された場合、１０と１５の間の値と同様に、１０及び１５を超える値、１０及び１５以上の値、１０及び１５未満の値、１０及び１５以下の値、並びに１０及び１５と等しい値が検討されることを理解されたい。また、２つの特定単位間の各単位も開示されることを理解されたい。例えば、１０と１５が開示された場合、１１、１２、１３及び１４も開示される。
【0095】
以上、様々な説明的実施形態を述べたが、クレームに記載されたような本発明の範囲から逸脱せずに、様々な実施形態に対する幾つかの変更のいずれも行われうる。例えば、記載された様々な方法ステップが実行される順序は、しばしば代替実施形態で変更されることがあり、他の代替実施形態では、１つ以上の方法ステップが全て省略されてもよい。種々の装置及びシステム実施形態の任意の特徴は、幾つかの実施形態に含まれ、他の実施形態に含まれ得ない。従って、以上の説明は、基本的に例示的な目的で提供され、本発明の範囲をクレームに示されたように限定するように解釈されるべきでない。
【0096】
本明細書に含まれる例と説明図は、限定ではなく例証として、内容が実施されうる特定の実施形態を示す。言及されたように、本開示の範囲から逸脱せずに構造的及び論理的代用及び変更を行えるように他の実施形態を利用し導出でき。本明細書では、本発明の内容のそのような実施形態は、単に便宜上、及び本出願の範囲を単独の発明又は発明的概念に自発的に限定する意図なしに（実際に１つ以上が開示された場合）、用語「発明」によって個別又は集合的に参照されうる。従って、本明細書で特定の実施形態を示し述べてきたが、同じ目的を達成する為に設計されたいかなる構成も特定の実施形態に代用されうる。この開示は、様々な実施形態の任意及び全ての適応物又は変形物を範囲に含むように意図される。以上の実施形態の組み合わせ、及び本明細書に具体的に記載されていない他の実施形態は、以上の説明を検討することで当業者に明らかになる。〔付記１〕
長期細胞成長及びトランスフェクションの為のナノストロー細胞培養システムであって、
円筒壁と、複数のナノストローが突出するメンブレンと、前記円筒壁の基部全体にわたって前記メンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤とを有し、前記ナノストローが、前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出するナノストローウェルインサートデバイスと、
前記ナノストローウェルインサートデバイスを保持するように構成されたアダプタとを有し、前記アダプタが、
底面電極を含む基部であって、前記ナノストローウェルインサートデバイスの前記円筒壁をしっかりと保持して、前記複数のナノストローが、前記底面電極の上のリザーバ貯蔵部と流体連通するように構成された基部と、
上部電極を含むカバーであって、前記基部と係合して、ナノストローウェルインサートデバイスが前記基部内に保持されたときに、前記上部電極が、間に囲まれたナノストローインサートデバイスによって前記底面電極から離れるように構成されたカバーと、
前記アダプタの外側面上の第１の電気接点であって、前記底面電極と電気通信する第１の電気接点と、
前記アダプタの前記外側面上の第２の電気接点であって、前記上部電極と電気通信する第２の電気接点とを有する、ナノストロー細胞培養システム。
〔付記２〕
前記基部が、前記リザーバ貯蔵部と前記ナノストローウェルインサートの下部の間に空気を放出するように構成された、付記１に記載のシステム。
〔付記３〕
前記アダプタが、更に、前記基部内の前記リザーバ貯蔵部の圧力を調整するように構成された入口を有する、付記１に記載のシステム。
〔付記４〕
前記第１の電気接点が、前記カバーの上部にあり、前記第２の電気接点が、前記基部の下部にある、付記１に記載のシステム。
〔付記５〕
前記カバーが前記基部と係合されたとき、前記上部電極が、前記底面電極から０．２５ｃｍ〜１．２５ｃｍ離された、付記１に記載のシステム。
〔付記６〕
前記リザーバ貯蔵部が、前記底面電極上に凹面を有する、付記１に記載のシステム。
〔付記７〕
前記基部が、円筒状ハウジングを有する、付記１に記載のシステム。
〔付記８〕
前記カバーが、前記基部の上に固定されて前記ナノストローウェルインサートデバイスが完全に囲まれるように構成された、付記１に記載のシステム。
〔付記９〕
長期細胞成長トランスフェクションの為のナノストローウェルインサートデバイスであって、
円筒壁と、
複数のハフニア（ＨｆＯ２）ナノストローが貫通するメンブレンと、
前記円筒壁の基部全体にわたって前記メンブレンを接続してウェルを形成する生体適合性接着剤とを有し、前記ナノストローが、前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出する、ナノストローウェルインサートデバイス。
〔付記１０〕
前記円筒壁が、円形横断面を有する、付記９に記載のデバイス。
〔付記１１〕
前記円筒壁が、ポリカーボネート管、アクリル管、ポリカーボネート管又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）管のうちの１つを含む、付記９に記載のデバイス。
〔付記１２〕
前記円筒壁と前記メンブレンの間に接着剤を更に有する、付記９に記載のデバイス。
〔付記１３〕
前記円筒壁と前記メンブレンの間にアクリル接着剤を更に有する、付記９に記載のデバイス。
〔付記１４〕
前記複数のハフニアナノストローが、１０ｎｍ〜１０００ｎｍの孔径を有する、付記９に記載のデバイス。
〔付記１５〕
前記複数のハフニアナノストローが、前記ウェル内に０．１〜２５マイクロメートル突出する、付記９に記載のデバイス。
〔付記１６〕
前記複数のナノストローがそれぞれ、前記デバイスの外側から、前記メンブレンを通って前記ウェル内に延在する連続チャネルを有する、付記９に記載のデバイス。
〔付記１７〕
前記円筒壁の外径が、１．５ｃｍ〜０．５ｃｍである、付記９に記載のデバイス。
〔付記１８〕
細胞を培養しトランスフェクトする方法であって、
ナノストローウェルインサートデバイス内で１つ以上の細胞を培養するステップであって、前記ナノストローウェルインサートデバイスが、円筒壁と、前記円筒壁の基部全体に延在してウェルを形成するメンブレンとを有し、前複数のナノストローが、前記メンブレンを通って前記ウェル内に０．１マイクロメートルより大きく突出するステップと、
前記ナノストローウェルインサートデバイスをアダプタの基部に入れて、前記複数のナノストローが、前記基部内のリザーバ貯蔵部と流体連通するようにするステップであって、前記リザーバ貯蔵部が、前記基部内の底面電極と電気通信するステップと、
カバーを前記基部の上に配置するステップであって、前記カバーが上部電極を有し、それにより、前記上部電極が、前記ナノストローウェルインサートデバイス内に延在し、前記上部電極が、間の前記ナノストローウェルインサートによって前記底面電極から離されるステップと、
前記底面電極と前記上部電極の間に電圧を印加して、前記リザーバ貯蔵部から物質を、前記複数のナノストローを通して前記１つ以上の細胞内に導入するステップと、
前記アダプタから前記ナノストローウェルインサートを除去し、前記ナノストローウェルインサート内の前記１つ以上の細胞を培養するステップとを含む方法。
〔付記１９〕
前記配置するステップが、前記基部の上に前記カバーを配置して、前記上部電極が、前記底面電極から０．２５〜１．２５ｃｍ離れるようにするステップを含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２０〕
前記電圧を印加するステップが、前記アダプタの外面上の第１の電気接点と、前記アダプタの表面の外側上の第２の電気接点との間に前記電圧を印加するステップを含み、前記第１の電気接点が、前記アダプタ内で前記上部電極と電気通信し、前記第２の電気接点が、前記アダプタ内の前記底面電極と電気通信する、付記１８に記載の方法。
〔付記２１〕
前記電圧を印加するステップが、約０．１Ｖ〜２０Ｖを印加するステップを含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２２〕
前記電圧を印加するステップが、１５Ｖ未満を印加するステップを含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２３〕
前記ナノストローウェルインサートデバイス内の前記細胞を撮像するステップを更に含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２４〕
前記電圧を印加するステップが、１０〜５００マイクロ秒のパルス幅を１Ｈｚ〜１０ｋＨｚのパルス周波数で印加するステップを含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２５〕
前記細胞を培養するステップが、複数のハフニア（ＨｆＯ２）ナノストロー上で前記細胞を培養するステップと含む、付記１８に記載の方法。
〔付記２６〕
前記ナノストローウェルインサートデバイスを前記基部に入れる前に前記物質を前記リザーバ貯蔵部に装填するステップを更に含む、付記１８に記載の方法。
【符号の説明】
【0097】
１０１ ナノストローウェルインサートデバイス１０３ 円筒体
１０５ ナノストローメンブレン
１０７ 両面テープ
２０３ ポリカーボネート管
２０５ ナノストローメンブレン
２０９ カーゴリザーバ
２１１ 底面電極