特許 6965350 糖タンパク質再構築のためのエンドグリコシダーゼ変異体及びその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6965350

(24)【登録日】2021年10月22日

(45)【発行日】2021年11月10日

(54)【発明の名称】糖タンパク質再構築のためのエンドグリコシダーゼ変異体及びその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/24 20060101AFI20211028BHJP

   C07K 1/113 20060101ALI20211028BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20211028BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20211028BHJP

   C12N 15/56 20060101ALN20211028BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20211028BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20211028BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20211028BHJP

   A61P 35/02 20060101ALN20211028BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20211028BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20211028BHJP

【ＦＩ】

   C12N9/24ZNA

   C07K1/113

   C12P21/02 B

   C12P21/08

   !C12N15/56

   !C12N15/10 200Z

   !C12N9/10

   !A61K39/395 T

   !A61P35/02

   !C07K16/00

   !A61P35/00

【請求項の数】11

【全頁数】59

(21)【出願番号】特願2019-531870(P2019-531870)

(86)(22)【出願日】2017年8月23日

(65)【公表番号】特表2020-500549(P2020-500549A)

(43)【公表日】2020年1月16日

(86)【国際出願番号】US2017048252

(87)【国際公開番号】WO2018039373

(87)【国際公開日】20180301

【審査請求日】2019年4月22日

(31)【優先権主張番号】62/378,806

(32)【優先日】2016年8月24日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】519063417

【氏名又は名称】チョ ファルマ インク

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＯ ＰＨＡＲＭＡ ＩＮＣ

(73)【特許権者】

【識別番号】596118493

【氏名又は名称】アカデミア シニカ

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＡＤＥＭＩＡ ＳＩＮＩＣＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】リン、ナンホン

(72)【発明者】

【氏名】ファン、リンヤ

(72)【発明者】

【氏名】シヴァターレ、サチン、エス

(72)【発明者】

【氏名】チェン、リツ

(72)【発明者】

【氏名】ウォン、チフォイ

(72)【発明者】

【氏名】ウ、チュンイ

(72)【発明者】

【氏名】チェン、ティン

【審査官】 濱田 光浩

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１７−０１２１５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 291, NO. 32, pp. 16508 -16518

【文献】 高島晶, 他，均一糖鎖を持つ糖鎖改変トラスツズマブ（５）EndoS2変異体の糖転移活性，第３４回日本糖質学会年会要旨集，2015年07月01日，p. 171, P-015

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ９／２４

Ｃ１２Ｐ ２１／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ１２Ｎ ９／１０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

野生型ＥｎｄｏＳ２（配列番号１）に１以上の変異を含むエンドグリコシダーゼＳ２（ＥｎｄｏＳ２）の変異体であって、
前記１以上の変異は、残基Ｔ１３８、Ｄ２２６、Ｔ２２７及び／又はＴ２２８にあり、前記ＥｎｄｏＳ２の変異体は、加水分解活性が野生型ＥｎｄｏＳ２よりも低く、トランスグリコシル化活性が野生型ＥｎｄｏＳ２よりも高い、エンドグリコシダーゼＳ２（ＥｎｄｏＳ２）の変異体。

【請求項2】

前記１以上の変異は、Ｔ１３８Ｄ、Ｔ１３８Ｅ、Ｔ１３８Ｆ、Ｔ１３８Ｈ、Ｔ１３８Ｋ、Ｔ１３８Ｌ、Ｔ１３８Ｍ、Ｔ１３８Ｎ、Ｔ１３８Ｑ、Ｔ１３８Ｒ、Ｔ１３８Ｖ、Ｔ１３８Ｗ、Ｄ２２６Ｑ、Ｔ２２７Ｑ及びＴ２２８Ｑからなる群より選択される、請求項１に記載のＥｎｄｏＳ２の変異体。

【請求項3】

前記変異体は、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３、配列番号４又は配列番号５に示される配列を含む、請求項１に記載のＥｎｄｏＳ２の変異体。

【請求項4】

活性化オリゴ糖を糖タンパク質アクセプターに結合することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＥｎｄｏＳ２の変異体を用いた工学的に改造された糖タンパク質の製造方法。

【請求項5】

前記活性化オリゴ糖は、グリカンオキサゾリンである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記グリカンオキサゾリンは、下記式を有するＮ−グリカンを含む、請求項４に記載の方法。

（式中、Ｒ^１は、β−１，４結合を介して結合した−Ｈ又はＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｒ^２及びＲ^３は、同一又は異なり、それぞれ独立して

からなる群より選択される。）

【請求項7】

前記糖タンパク質アクセプターは、ＧｌｃＮＡｃ単糖を含む請求項４に記載の方法。

【請求項8】

前記糖タンパク質アクセプターは、非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−受容体である、請求項４に記載の方法。

【請求項9】

前記糖タンパク質アクセプターは、グリコペプチド、糖タンパク質、抗体、又はその断片である、請求項４に記載の方法。

【請求項10】

前記糖タンパク質アクセプターは、コアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡＣ−ＩｇＧアクセプター又はその断片である、請求項４に記載の方法。

【請求項11】

前記ＧｌｃＮＡＣ−ＩｇＧアクセプターは、セツキシマブ、リツキシマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、１−１３１トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、ＩＧＮ１０１、ボロシキシマブ、抗ＣＤ８０ ｍＡｂ、抗ＣＤ２３ ｍＡｂ、ＣＡＴ−３８８８、ＣＤＰ−７９１、エラプトズマブ、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−０６０、ＭＤＸ−０７０、マツズマブ、ＣＰ−６７５，２０６、ＣＡＬ、ＳＧＮ−３０、ザノリムマブ、アデカツムマブ、オレゴボマブ、ニモツズマブ、ＡＢＴ−８７４、デノスマブ、ＡＭ １０８、ＡＭＧ ７１４、フォントリズマブ、ダクリズマブ、ゴリムマブ、ＣＮＴＯ １２７５、オクレリズマブ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ベリムマブ、エプラツズマブ、ＭＬＮ１２０２、ビジリズマブ、トシリズマブ、オクレリズマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ペキセリズマブ、アブシキシマブ、ラニビジムマブからなる群より選択されるモノクローナル抗体に由来する、請求項１０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、２０１６年８月２４日に出願された米国特許出願第６２／３７８，８０６号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ Ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から選択されるエンドグリコシダーゼＳ２（ＥｎｄｏＳ２）の変異体に関する。上記エンドグリコシダーゼＳ２（ＥｎｄｏＳ２）の変異体は、明確に定義された種々のＮ−グリカン（高マンノース型、ハイブリッド型、及び複合型）を有する糖タンパク質又は糖ペプチドの合成に対して、改善されたトランスグリコシル化（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）活性及び低下した加水分解活性を示す。特に、本発明の一つ以上の実施形態は、治療用抗体のグリカンの効率的な再構築におけるＥｎｄｏＳ２変異体の使用にも関する。上記使用において、Ｆｃ−ドメインに均質なグリカン組成物を形成することでエフェクター機能を増強させる。

【背景技術】

【0003】

１９８６年に最初の治療用モノクローナル抗体療法が承認されて以来、この種類のバイオ医薬品の商業パイプラインが発展してきた（１）。２０１５年の初めに、米国やヨーロッパで合計４７種類のモノクローナル抗体製品ががん、自己免疫疾患、感染症などのさまざまな疾患の治療薬として承認されている。現在の承認率で継続すると、２０２０年までに約７０種類のモノクローナル抗体製品が市場に出回るようになり、全世界での売上高は１，２００億ドル近くに達すると見込まれている（２）。モノクローナル抗体治療法では、その臨床活性がＦｃ媒介エフェクター機能に依存するため、ＦｃドメインにあるＮ−グリカンの組成は、安全性又は有効性にとって重要である（３）。多様なグリコシル化状態も薬力学的及び薬物動態学的特性に影響を及ぼす一方、他のＦｃグリカン構造要素が有害な免疫反応に関与している可能性があることが示唆されている。しかし、Ｆｃ−グリコシル化の制御は、依然として挑戦である。

【0004】

典型的なＩｇＧは、柔軟領域を介して定常領域（Ｆｃ）に結合された２つの抗原結合性断片（Ｆａｂ）から構成される。Ｆａｂドメインは、抗原認識に関与し、ＦｃドメインのＡｓｎ２９７にあるＮ−グリカンは、エフェクター細胞上の各Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩｂ）及び補体のＣｌｑ成分と相互作用して抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を含むエフェクター機能を活性化する（５−７）。ほとんど全ての治療用抗体は、保存アスパラギン残基（Ｎ２９７）にある各ホモ二量体ＦｃドメインでＮ−グリコシル化される。これらのＮ結合型グリカンは、３０を超える異なるグライコフォームをもたらし、かなりの構造的不均一性を有する典型的な二本鎖複合型であり、そのコア七糖は、コアフコース（Ｆｕｃ）、バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ Ｎ− ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ；ＧｌｃＮＡｃ）、末端ガラクトース（Ｇａｌ）、及び末端シアル酸（Ｓｉａ）（８−９）によって色々と修飾されてもよい。Ｎ−グリカンの組成物は、Ｆｃドメインの立体配座に影響を与えることができるため、抗体の安定性、薬物動態プロファイル、免疫原性、エフェクター機能、抗体媒介炎症及び補体活性化を調節することができる（１０）。例えば、コアフコースの欠失及びバイセクティングＧｌｃＮＡｃ部分の付加は、共にＦｃγｌｌｌａ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）上のエフェクター細胞に対する抗体の親和性を劇的に高め、標的をよりよく除去することができる（１０−１１）。また、末端２，６−シアル化グリカン（抗体及び静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の微量成分である）は、抗炎症特性を増強する最適化構造である（１２〜１３）。

【0005】

Ｎ−グリコシル化は、最も複雑な翻訳後修飾の一つであり、通常、組換え発現系に応じて、高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型を含むグリカン構造の著しい不均一性をもたらす（１４−１５）。市販の治療用抗体は、典型的には、グライコフォームの混合物として存在するが、それぞれの治療活性にとって最適ではない。最近、糖鎖工学は、効力を改善するためにＦｃグリコシル化を制御することに大きな注目を集めている。最も一般的な方法の一つは、発現宿主の合成経路に対するインビボ操作である。しかし、この方法によって生成されるグライコフォームは限られており、所望のグライコフォームを完全に制御することは達成できない。グリコシル化の不均一性に取り組むための別の方法は、フコシダーゼ媒介を伴うか又は伴わないエンドグリコシダーゼ［ｅｎｄｏ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ（ＥＮＧａｓｅ）］による全ての不均一なＮ−グリカンの切り取りによって、ＩｇＧのグリコシル化部位に最初のＧｌｃＮＡｃ又はＦｕｃ−ＧｌｃＮＡｃのみを残し、次いで、明確に定義されたオキサゾリンの形の活性化グリカンをＧｌｃＮＡｃアクセプターに逆転移して天然のβ−１，４結合を形成することである（１６）。

【0006】

エンドグリコシダーゼ（ＥｎｄｏＳ及びＥｎｄｏＳ２）は、ヒト病原体である化膿レンサ球菌に由来するファミリー１８グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）であり、最近、治療用抗体の糖鎖工学の注目点となっている（１７−１８）。ＥｎｄｏＳ及びＥｎｄｏＳ２は、わずか３７％の配列同一性を有するにもかかわらず、両方ともヒトＩｇＧのＮ−結合グリカンのコアにおける２つのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の間のβ−１，４−結合の加水分解を触媒することができる。さらに、両方ともＩｇＧ Ｆｃドメインにある複合型グリカンを除去することができる。しかし、ＥｎｄｏＳ２は、ＥｎｄｏＳと比較して、ハイブリッド及びオリゴマンノース構造をより大きな程度まで加水分解することができる（１９）。さらに、基質としての糖−オキサゾリンの存在下で、いくつかのＧＨ１８及びＧＨ８５のエンドグリコシダーゼは、グライコシンターゼに変換してキトビオース結合を触媒する。しかしながら、これらのグライコシンターゼ酵素の固有の加水分解活性は全体の収率を低下させる問題がある。

【0007】

酵素活性のさらなる改善のために、エンドグリコシダーゼ変異体（ＥｎｄｏＳ変異体であるＤ２３３Ｑ及びＤ２３３Ａを含む）が開発された（１６）。これは、ＥＮＧａｓｅの活性部位における重要なモチーフ：ＧＨ１８のＤ−Ｘ−Ｅを明らかにした。このモチーフは、隣接基関与を伴う二重置換反応を触媒するＥＮＧａｓｅの触媒メカニズムを補助する。このメカニズムにおいて、Ａｓｐのカルボン酸塩によって促進されるオキサゾリニウムイオン中間体の形成を伴って、ＧｌｃＮＡｃの２−アセトアミド基は、アノマー中心の脱離基を置換する求核剤として作用する。触媒残基（グルタメート）は、脱離グリカン基をプロトン化し、求核性Ｈ_２Ｏを脱プロトン化してオキサゾリニウムイオン中間体の加水分解をもたらす一般的な酸／塩基として作用し、加水分解生成物を形成する。アスパラギン酸のカルボキシレート（ＥのＮ末端側の２番目の残基）は、オキサゾリニウムイオン中間体の形成を促進し、安定化することが報告されている。ＥｎｄｏＳのＤ２３３Ｑ変異は、トランスグリコシル化を改善し、加水分解活性を減少させることが実証された。

【0008】

上記ＥｎｄｏＳ変異体は、これまでに知られている中で最も優れたグライコシンターゼであり、均質な抗体を合成するための大きな潜在力を有する。しかしながら、出発物質の生成物への完全な変換を達成するためには通常大量の酵素が必要とされる。したがって、酵素の大規模生産及び反応後の残留酵素除去の下流精製は面倒で労力が掛かり、さらに全体的な糖鎖形成プロセスの高コストをもたらす。また、ＥｎｄｏＳ変異体のトランスグリコシル化活性は、特に対称二本鎖複合型グライコフォームに限定されるが、追加の天然修飾を有する広範囲の高マンノース型、ハイブリット型、三本鎖及び四本鎖複合型グリカン（例えば、ＧｌｃＮＡｃ上のα−ｌ，３−フコース、Ｇａｌ上のα−ｌ，２−フコース、伸長ポリＬａｃＮＡｃモチーフ、及び末端に非対称シアル化鎖）に限定されない。

【0009】

ＥｎｄｏＳ２は、広範囲のＩｇＧグリカンを加水分解する潜在力を有するため、ＩｇＧ糖鎖工学分野で大きに注目されている。ＥｎｄｏＳ及びＥｎｄｏＳ２の配列アラインメント結果に基づいて、ＥｎｄｏＳ２の部位Ｄ１８４はＥｎｄｏＳの部位Ｄ２３３と同一であると推測されている。したがって、変異体がＥｎｄｏＳ２の部位Ｄ１８４をフォーマット化して、トランスグリコシル化活性を増強し、ＥｎｄｏＳ２の加水分解活性を減少させると予想される。上記の先行技術に照らして、野生型ＥｎｄｏＳ ２の活性部位近くの部位特異的変異誘発によりＥｎｄｏＳ ２のグライコシンターゼ活性の改善に有利である。本明細書に提供されるのは、優れたグライコシンターゼ活性及び低下した加水分解活性を有するＥｎｄｏＳ２変異体である。さらに重要なことには、本発明の新型なＥｎｄｏＳ２変異体は広範囲の基質を提供し、高マンノース、ハイブリッド型、二本鎖及び三本鎖複合体型Ｎ−グリカンを活性化グリカンオキサゾリンに転移することができる。本発明のＥｎｄｏＳ２変異体は、生物物理学的及び構造的研究のために、多様なグリコシル化均質抗体、特に抗炎症活性を獲得することが期待される完全シアル化多本鎖グライコフォームの製造を容易にする。

【発明の概要】

【0010】

本発明の実施形態は、広範囲のＮ−グリカン（高マンノース型、ハイブリッド型、及び複合型）に対して低下した加水分解活性及び優れたトランスグリコシル化活性を示す選択されたＥｎｄｏＳ２の変異体に関する。これらのＥｎｄｏＳ２変異体は、均質にグリコシル化された糖ペプチド、糖タンパク質、及び治療用抗体又はそのＦｃ断片の製造に適用することができる。本発明の実施形態は、抗体−Ｆｃ領域に高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型グライコフォームを有する治療用抗体及びそのＦｃ断片の効率的なグリカン再構築を可能にする。糖鎖改変抗体は、ＦｃγｌｌｌＡ結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などのエフェクター機能及び薬理学的特性を増強させることができる。また、本発明の実施形態によれば、多種の治療用抗体のＦｃグリコシル化、特に、抗炎症活性を獲得することが期待される高度にシアル化された複合型グライコフォームの、それらのエフェクター機能に対する影響を迅速に調査することができる。

【0011】

一態様において、本発明は、ＥｎｄｏＳ２変異体を提供する。上記変異体は、少なくとも８０％の同一性を有し、広範囲のＮ−グリカン（高マンノース型、ハイブリッド型、及び複合型）の両方に対するフコシル化及び非フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプターの改善されたトランスグリコシル化活性を示す。上記変異体は、活性化オリゴ糖供与体をフコシル化及び非フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプターに効率的に転移して、グリコペプチド、糖タンパク質又は治療用抗体の新しい均質なグライコフォームを形成することができる。

【0012】

別の態様において、本発明は、顕著なトランスグリコシル化活性及び低下した加水分解活性を有するＥｎｄｏＳ２変異体を提供する。前記変異体は、Ｔ１３８、Ｄ１８２、Ｄ２２６、Ｔ２２７及びＴ２２８での変異を含む部位特異的変異を含むことが好ましいが、Ｔ１３８Ｄ（配列番号６）、Ｔ１３８Ｅ（配列番号７）、Ｔ１３８Ｆ（配列番号８）、Ｔ１３８Ｈ（配列番号９）、Ｔ１３８Ｋ（配列番号１０）、Ｔ１３８Ｌ（配列番号１１）、Ｔ１３８Ｍ（配列番号１２）、Ｔ１３８Ｎ（配列番号１３）、Ｔ１３８Ｑ（配列番号１４）、Ｔ１３８Ｒ（配列番号１５）、Ｔ１３８Ｖ（配列番号１６）、Ｔ１３８Ｗ（配列番号１７）、Ｄ１８２Ｑ（配列番号２）、Ｄ２２６Ｑ（配列番号３）、Ｔ２２７Ｑ（配列番号４）及びＴ２２８Ｑ（配列番号５）に限定されない。

【0013】

さらなる態様において、本発明は、フコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃアクセプターへの活性化オリゴ糖供与体の転移における顕著なトランスグリコシル化活性及び低下した加水分解活性を有するＥｎｄｏＳ２変異体の使用を提供する。前記活性化オリゴ糖供与体は、合成グリカンオキサゾリンを含む。一実施形態では、前記合成グリカンオキサゾリンは、高マンノース型、ハイブリッド型、及び複合型の多種のＮ−グリカンを含み、且つ下式を有する。

式中、Ｒ^１は、β−１， ４−結合を介して結合した−Ｈ又はＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｒ^２及びＲ^３は、同一又は異なり、それぞれ独立して

からなる群より選択される。

【0014】

別の態様において、本発明は、コアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−アクセプターでのトランスグリコシル化のためのＥｎｄｏＳ２変異体を提供する。上記コアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−アクセプターは、コアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−ペプチド、タンパク質、及びＩｇＧ Ｆｃドメイン又はその断片を含む。

【0015】

さらなる態様において、本発明は、コアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧでのトランスグリコシル化のためのＥｎｄｏＳ２変異体を提供する。上記ＩｇＧは、モノクローナル抗体であり、セツキシマブ、リツキシマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、１−１３１トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、ＩＧＮ１０１、ボロシキシマブ、抗ＣＤ８０ ｍＡｂ、抗ＣＤ２３ ｍＡｂ、ＣＡＴ−３８８８、ＣＤＰ−７９１、エラプトズマブ、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−０６０、ＭＤＸ−０７０、マツズマブ、ＣＰ−６７５，２０６、ＣＡＬ、ＳＧＮ−３０、ザノリムマブ、アデカツムマブ、オレゴボマブ、ニモツズマブ、ＡＢＴ−８７４、デノスマブ、ＡＭ １０８、ＡＭＧ ７１４、フォントリズマブ、ダクリズマブ、ゴリムマブ、ＣＮＴＯ １２７５、オクレリズマブ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ベリムマブ、エプラツズマブ、ＭＬＮ１２０２、ビジリズマブ、トシリズマブ、オクレリズマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ペキセリズマブ、アブシキシマブ、及びラニビズマブからなる群より選択される。

【0016】

別の態様において、本発明は、コアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−ペプチド、タンパク質、及びＩｇＧ又はＩｇＧ−Ｆｃ断片の再構築方法を提供する。上記方法は、ペプチド／タンパク質／抗体−ＧｌｃＮＡｃアクセプター又はＦｃ断片を提供し、化膿レンサ球菌ＥｎｄｏＳ２変異体の触媒作用下で活性化オリゴ糖供与体と反応することにより、異質的グリコシル化状態を有する既存ペプチド、タンパク質、及びモノクローナル抗体を実質的に純粋なグライコフォームを製造することを含む。

【0017】

さらなる態様において、本発明は、ＥｎｄｏＳ２変異体を用いて治療用ＩｇＧ又はそのＦｃ断片をグリカン再構築する方法を提供する。該方法は、以下のステップＡ及びステップＢを含む。
ステップＡにおいて、細菌性α−フコシダーゼの存在又は非存在下でエンドグリコシダーゼ（野生型ＥｎｄｏＳ２）を用いて異質的Ｎ−グリカンを担持した天然又は組換えコアフコシル化又は非フコシル化治療用ＩｇＧ又はＩｇＧ−Ｆｃ断片を処理することで、２つの還元末端ＧｌｃＮＡｃ残基の間の結合を加水分解し、コアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧアクセプターを形成する。
ステップＢにおいて、活性化オリゴ糖供与体の形態である広範囲の所定オリゴ糖構成単位をコアフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−ＩｇＧに移転して、化膿レンサ球菌ＥｎｄｏＳ２変異体を用いたトランスグリコシル化により天然β−１，４−結合を再構成することにより、所定オリゴ糖を再構築コアフコシル化又は非フコシル化ＩｇＧ又はそのＦｃ断片に結合する。

【0018】

さらなる態様において、本発明は、フコシル化又は非フコシル化糖鎖改変抗体又は抗原結合断片の組成物を提供する。上記抗体又は抗原結合断片は、Ｆｃ領域の各部位に同じＮ−グリカン構造を有するＩｇＧ分子から構成される。上記Ｎ−グリカンは、高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型であり、

からなる群より選択される。
ここで、Ｒ^１は、β−１， ４−結合を介して結合した−Ｈ又はＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｒ^２及びＲ^３は、同一又は異なり、それぞれ独立して、

からなる群より選択される。

【0019】

別の態様において、 本発明は、非修飾抗体に比べて改善されたエフェクター機能（例えば、ＦｃγｌｌｌＡとの結合及びＡＤＣＣ）を有する糖鎖改変抗体を提供する。

【0020】

本開示の別の態様は、患者のがんを治療するための医薬組成物を提供する。上記医薬組成物は、本明細書に記載の糖鎖改変抗体の組成物及び薬学的に許容される担体を含む。

【0021】

上記がんは、例えば、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及び成熟Ｂ細胞腫瘍、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度，中悪性度及び高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、リンパ節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンストロームのマクログロブリン血症及び未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）を含むが、これらに限定されない。

【0022】

本発明は、セツキシマブ、リツキシマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガミシン、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、オマリズマブ、トシツモマブ、１−１３１トシツモマブ、エファリズマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ナタリズマブ、エタネルセプト、ＩＧＮ１０１、ボロシキシマブ、抗ＣＤ８０ ｍＡｂ、抗ＣＤ２３ ｍＡｂ、ＣＡＴ−３８８８、ＣＤＰ−７９１、エラプトズマブ、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−０６０、ＭＤＸ−０７０、マツズマブ、ＣＰ−６７５，２０６、ＣＡＬ、ＳＧＮ−３０、ザノリムマブ、アデカツムマブ、オレゴボマブ、ニモツズマブ、ＡＢＴ−８７４、デノスマブ、ＡＭ １０８、ＡＭＧ ７１４、フォントリズマブ、ダクリズマブ、ゴリムマブ、ＣＮＴＯ １２７５、オクレリズマブ、ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０、ベリムマブ、エプラツズマブ、ＭＬＮ１２０２、ビジリズマブ、トシリズマブ、オクレリズマブ、セルトリズマブペゴル、エクリズマブ、ペキセリズマブ、アブシキシマブ、及びラニビズマブからなる群より選択される抗体の糖鎖工学を想定した。

【0023】

本発明の他の態様及び利点は、以下の説明及び添付の特許請求の範囲から明らかになろう。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】野生型ＥｎｄｏＳ２の配列及び部位特異的変異誘発のために選択された潜在的なアミノ酸残基を示す。

【図2】本発明の一実施形態に係るＥｎｄｏＳ２変異体Ｔ１３８Ｄ（配列番号６）、Ｔ１３８Ｅ（配列番号７）、Ｔ１３８Ｆ（配列番号８）、Ｔ１３８Ｈ（配列番号９）、Ｔ１３８Ｋ（配列番号１０）、Ｔ１３８Ｌ（配列番号１１）、Ｔ１３８Ｍ（配列番号１２）、Ｔ１３８Ｎ（配列番号１３）、Ｔ１３８Ｑ（配列番号１４）、Ｔ１３８Ｒ（配列番号１５）、Ｔ１３８Ｖ（配列番号１６）、Ｔ１３８Ｗ（配列番号１７）、Ｄ１８２Ｑ（配列番号２）、Ｄ２２６Ｑ（配列番号３）、Ｔ２２７Ｑ（配列番号４）、ａｎｄ Ｔ２２８Ｑ（配列番号５）のアミノ酸配列を示す。

【図3】図３（Ａ）において、カートンは、ＥｎｄｏＳとのアラインメントに基づくＳ２の触媒ドメインの推定上の３、４、５番目のβ−シートを表す。赤色に着色された触媒残基Ｅ１８６は、一般的な酸／塩基として作用する一方、Ｅ１８６を囲む変異アミノ酸部位は青色に着色されている。図３（Ｂ）は、市販のリツキシマブを基質として用いて測定された野生型ＥｎｄｏＳ２及び選択された各部位の変異体のグリカン加水分解活性の結果を示す。ＥｎｄｏＳ２変異体（５２ｎＭ）と市販のリツキシマブ（５２μΜ）とを反応させ、１２０ｍｉｎインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。元のリツキシマブ（Ｒｔｘ −グリカン）の相対百分率を示す。変異体Ｄ１８４Ｑは対照として用いられた。

【図4】ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ（６７．５μΜ）をアクセプター、α−２，６シアル化二本鎖複合型グリカン（ＳＣＴ）−オキサゾリン（２．５ｍＭ）を供与体として用いて測定された野生型ＥｎｄｏＳ２及び選択された各部位の変異体（６７．５ｎＭ）のトランスグリコシル化活性を示す。反応を２時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。リツキシマブ及びＦｃ領域（Ｒｔｘ−ＳＣＴ）におけるα−２，６シアル化二本鎖複合型グリカンの相対百分率を示す。変異体Ｄ１８４Ｑは対照として用いられた。

【図5】ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブをアクセプター、α−２，６シアル化二本鎖複合型グリカン（ＳＣＴ）−オキサゾリンを供与体として用いて測定されたＴ１３８での変異体のトランスグリコシル化活性比較を示す。Ｔ１３８変異体（６７．５ｎＭ）、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ（６７．５μΜ）及びＳＣＴ−オキサゾリン（２．５ｍＭ）を２時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。リツキシマブ及びＦｃ領域（Ｒｔｘ−ＳＣＴ）におけるα−２，６シアル化二本鎖複合型グリカンの相対百分率を示す。

【図6】ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブをアクセプター、グリカン−オキサゾリン（Ｇ１−Ｇ４）を供与体基質として用いて測定された高マンノース型Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２（グリカンＧｌ）、Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２（グリカンＧ２）及びハイブリッド型グリカン（Ｇ３及びＧ４）に対する選択されたＥｎｄｏＳ２の変異体のトランスグリコシル化活性を示す。反応過程は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりモニターされた。レーン１はマーカー、レーン２はＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブを示し、時点はＭｉｎで示され、製品％は下部に示される。

【図7】三本鎖複合型グリカンＧ５（末端ガラクトース残基を有する）及びＧ６（末端α−２，６シアル酸を有する）に対する選択されたＥｎｄｏＳ２の変異体のトランスグリコシル化活性を示す。反応は、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブをアクセプター、グリカン−オキサゾリン（Ｇ４−Ｇ５）を供与体基質として用いて行われた。反応過程は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりモニターされた。レーン１はマーカー、レーン２はＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブを示し、時点はＭｉｎで表され、製品％は底部に示される。

【図8】一連の二本鎖複合型構造に対する選択されたＥｎｄｏＳ２変異体のトランスグリコシル化活性を示す。グリカンＧ７は、末端ジガラクトースを有する二本鎖グリカンであり、グリカンＧ８は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ及び末端ジガラクトースを有する二本鎖グリカンであり、グリカンＧ９は、２つの末端ガラクトースのうちの１つにα−１，２フコースを有する二本鎖グリカンであり、グリカンＧ１０は、ＧｌｃＮＡｃ及び末端ジガラクトースのいずれにもα−１，３フコースを有する二本鎖グリカンである。トランスグリコシル化は、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブをアクセプター、グリカン−オキサゾリン（Ｇ７−Ｇ１０）を供与体基質として用いて行われた。反応過程は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりモニターされた。レーン１はマーカー、レーン２はＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブを示す。時点はＭｉｎで表される。

【図9】二本鎖複合型グリカンＧ７（末端ガラクトース残基を有する）及びＧ１６（末端α−２，６シアル酸を有する）に対する選択されたＥｎｄｏＳ２の変異体のトランスグリコシル化活性を示す。反応は、Ｆｕｃ（α−１， ６）−ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブをアクセプター、グリカン−オキサゾリン（Ｇ４及びＧ１６）を供与体基質として用いて行われた。反応過程は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりモニターされた。レーン１はマーカー、レーン２はＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブを示す。時点はＭｉｎで表され、製品％は底部に示される。

【図10】広範囲の高マンノース型、ハイブリット型及び複合型グリカンに対する選択されたＥｎｄｏＳ２変異体の基質特異性を示す。

【図11】Ｆｃ領域に多様なグライコフォームを有するリツキシマブの構造を示す。グライコフォームは、一連の高マンノース型、ハイブリット型、二本鎖及び三本鎖複合型構造を含む。

【図12】糖鎖改変（ｇｌｙｃｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）リツキシマブ（Ｒｔｘ Ｇｌ− Ｇ１６）、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ及び市販のリツキシマブのＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明の実施形態は、高マンノース型、ハイブリット型又は複合型の広範囲のＮ−グリカンを活性化オリゴ糖オキサゾリンからフコシル化又は非フコシル化ＧｌｃＮＡｃ−ペプチド、タンパク質又はＩｇＧに転移する顕著なトランスグリコシル化活性を示しながら、加水分解生成物の発生が非常に少ない選択されたＥｎｄｏＳ２変異体に関する。上記新型ＥｎｄｏＳ２変異体は、効率的に作用して、様々な明確に定義されたグライコフォームを有する均質なグリコシル化糖ペプチド、糖タンパク質、治療用抗体及びそのＦｃ断片を提供する。さらに、本発明の実施形態によれば、エフェクター機能（ＦｃγｌｌｌＡ結合及び抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）及び薬理学的特性が改善された糖鎖改変抗体が提供される。さらに、本発明の実施形態によれば、多様な治療用抗体のＦｃグリコシル化のそのエフェクター機能に対する影響を迅速に調査することができる。

【0026】

以下の説明では、本明細書の一部を構成する添付の図面を参照しながら、本発明の実施形態を実施可能な特定の例として示す。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施できるように詳細に説明されており、本発明の範囲から逸脱することなく他の実施形態が考案され、構造的、論理的及び電気的変更が行われ得ることを理解されたい。したがって、例示的な実施形態の以下の説明は限定的な意味で解釈されるべきではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。

【0027】

他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここには好ましい方法及び材料を記載する。本明細書に具体的に記載された全ての刊行物及び特許は、本発明に関連して使用され得る刊行物に報告されている化学物質、細胞系、ベクター、動物、機器、統計分析及び方法論を記載及び開示することを含むあらゆる目的のために参照により組み込まれる。本明細書中に引用された全ての参考文献は、当業者の技術水準を示すものとして解釈されるべきである。 本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。

【0028】

本発明の材料及び方法を説明する前に、本発明は記載された特定の方法論、プロトコル、材料、及び試薬に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0029】

定義

【0030】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。

【0031】

本明細書では、用語「グリカン」は、多糖、オリゴ糖又は単糖をいう。グリカンは、糖残基のモノマー又はポリマーであり得、直鎖状又は本鎖状であり得る。グリカンは、天然糖残基（例えば、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソース、アラビノース、リボース、キシロースなど）及び／又は修飾糖（例えば、２'−フルオロリボース、２'−デオキシリボース、ホスホマンノース、６'スルホＮ−アセチルグルコサミンなど）を含み得る。

【0032】

本明細書では、用語「フコース」、「コアフコース」及び「コアフコース残基」は互換的に使用され、Ｎ−アセチルグルコサミンに結合したα−ｌ，６−位置におけるフコースを指す。

【0033】

本明細書では、用語「Ｎ−グリカン」、「Ｎ−結合グリカン」、「Ｎ−結合グリコシル化」、「Ｆｃグリカン」及び「Ｆｃグリコシル化」は、互換的に使用され、Ｆｃ含有ポリペプチドのアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を介して付着したＮ−結合オリゴ糖を指す。用語「Ｆｃ含有ポリペプチド」（Ｆｃ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、Ｆｃ領域を含むポリペプチド（例えば、抗体）を指す。

【0034】

本明細書では、用語「グリコシル化パターン」及び「グリコシル化プロファイル」は互換的に使用され、Ｎ−グリカン種の特徴的な「指紋」を指す。上記Ｎ−グリカンは、糖タンパク質又は抗体から酵素的に又は化学的に放出され、さらに、例えば、ＬＣ−ＨＰＬＣ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳなどにより糖質構造が分析されたものである。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． １， Ｎｏ． １（２００５）， ｐｐ． ２８−５７におけるレビュー（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0035】

本明細書では、用語「糖鎖改変Ｆｃ」は、酵素的又は化学的に改変又は改造されたＦｃ領域上のＮ−グリカンをいう。本明細書で用いられる用語「Ｆｃ糖鎖工学」は、糖鎖改変Ｆｃを調製するために用いられる酵素又は化学プロセスである。

【0036】

Ｆｃ領域のグリコシル化プロファイルの記載では、用語「均質」、「同質」、「同質的」及び「均質的」は、互換的に使用され、痕跡量の前駆体Ｎ−グリカンを含まない、１つの所望のＮ−グリカン種によって表される単一のグリコシル化パターンを意味することを意図している。

【0037】

本明細書では、用語「ＩｇＧ」、「ＩｇＧ分子」、「モノクローナル抗体」、「免疫グロブリン」、及び「免疫グロブリン分子」は、互換的に使用される。

【0038】

本明細書では、用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体をいう。好ましいＦｃＲは、ヒトＦｃＲの天然配列である。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）を結合する受容体であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む（これらの受容体の対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む）ＦｃγＲＩＩ受容体は、類似するアミノ酸配列を有するが細胞質ドメインが異なるＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（ｒｅｖｉｅｗ Ｍ． ｉｎ Ｄａｅｒｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５：２０３−２３４（１９９７））。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２６：３３０−４１（１９９５）に記載されている。本明細書で用いられる用語「ＦｃＲ」には、将来同定されるものを含む他のＦｃＲも含まれる。この用語は、胎児への母体ＩｇＧの伝達に関与する新生児受容体であるＦｃＲｎも含む（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１７：５８７（１９７６）ａｎｄ Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：２４９（１９９４））。

【0039】

用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用によって生じる生化学的事象を指す。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体ＢＣＲ）の下方制御などを含む。このようなエフェクター機能は、当該分野で公知の種々のアッセイを用いて評価され得る。

【0040】

本明細書では、用語「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、細胞傷害性の一形態を指す。分泌されたＩｇが特定の細胞傷害性細胞（例えば、天然キラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した後、これらの細胞傷害性エフェクター細胞を抗原保有標的細胞に特異的に結合させ、細胞毒素で標的細胞を殺すことができる。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させ、このような殺傷に絶対に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の第４６４頁の表３に要約される。目的分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，５００，３６２又はＵ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，８２１，３３７に記載されているインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及び天然キラー（ＮＫ）細胞を含む。或いは、目的分子のＡＤＣＣ活性はインビボで評価されてもよい（例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示された動物モデル）。

【0041】

市場から入手可能及び／又は現在臨床試験の各段階で利用可能な治療用タンパク質の約３分の２はモノクローナル抗体である。このようなモノクローナル抗体のうち、３０種類の抗体及びその誘導体は、主に腫瘍性疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患などのさまざまな症状の治療に承認されている。しかし、天然及び組換え糖タンパク質のグリカンの微小不均一性は、糖タンパク質に基づく薬物の開発の大きな障害となる。タンパク質又は抗体の発現中にグリコシル化状態を制御することは非常に困難である。それは、タンパク質又は抗体の発現では、典型的には、ペンダントオリゴ糖の構造のみが異なるグリライフォームの混合物を生成し、且つこの混合物は異なる生物学的活性を有する可能性があるためである。最近、治療用抗体の糖鎖工学に対する大きな注目を引き起こす２つの酵素は、ヒト病原体化膿レンサ球菌に由来するＥｎｄｏＳとＥｎｄｏＳ２である（Ｃｏｌｌｉｎ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ ２００１ ；Ｓｊｏｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。この酵素は、抗体上のＮ結合型グリカンを加水分解することによって免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のエフェクター機能を無効にする細菌性免疫回避因子として最初に発見された。

【0042】

ＩｇＧの各ＣＨ２ドメイン上の複合Ｎ結合型オリゴ糖は、Ｆｃ領域の構造、さらにＦｃ受容体との相互作用にとって極めて重要である（Ｋｒａｐｐ ｅｔ ａｌ． ２００３；Ｗｏｏｆ ａｎｄ Ｂｕｒｔｏｎ ２００４）。ＩｇＧ−Ｆｃドメインのオリゴ糖鎖は、いくつかのＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、マンノース（Ｍａｎ）残基、最終的にガラクトース（Ｇａｌ）及びフコース（Ｆｕｃ）残基、並びにシアル酸（Ｓｉａ又はＮＡＮＡ（Ｎ−アセチルノイラミン酸））を含む。ＧｌｃＮＡｃは、αｌ-６Ｆｕｃを有するか否かにも関わらず、Ａｓｎ２９７に結合している。ＧｌｃＮＡｃβ１−４は、上記最初のＧｌｃＮＡｃに結合している。次いで、Ｍａｎα１−６及びＭａｎα１−３の２つのアームが結合しているｍａｎβ１−４が見出される。両方のアームは、共にさらなるＧｌｃＮＡｃβ１−２を含み、ＧｌｃＮＡｃβ１−２にＧａｉβ１−４が結合していてもよいが、結合していなくてもよい。したがって、糖鎖は、０、１又は２個のガラクトース残基（それぞれＧ０、Ｇ１、及びＧ２グライコフォームとして定義される）を含み得る。バイセクティングＧｌｃＮＡｃβ１−４の存在及び末端ガラクトース残基の一方若しくは両方のシアル酸又はＧａｌα１-３残基によるキャッピングを含むさらなる変形が生じる。エンドグリコシダーゼを用いたＦｃ-グリカンの酵素的切断は、Ｆｃ領域を変形させ、Ｆｃγ受容体に結合するＩｇＧを劇的に減少させる（Ａｌｌｈｏｒｎ ｅｔ ａｌ． ２００８）。それらの３７％の配列同一性にもかかわらず、ＥｎｄｏＳ及びＥｎｄｏＳ２の両方は、ヒトＩｇＧのＮ-結合グリカンのコアにおける２つのＮ-アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）間のβ-１，４結合の加水分解を触媒する。しかし、複合型グリカンに加えて、ＥｎｄｏＳ２は、ハイブリッド及びオリゴマンノース構造に対する加水分解がＥｎｄｏＳよりも強い（Ｓｊｏｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ． ２０１５）。

【0043】

１９８０年代に最初の抗体療法が導入されて以来、臨床試験で２４０を超える治療用抗体があり、この分野は着実に拡大している（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ ２０１０）。抗体機能に対するＩｇＧ−Ｆｃグリカンの役割は、モノクローナル治療用抗体の成長分野で大きな注目を集めている。したがって、治療用抗体の効力を向上させるために、選択されたＦｃγ受容体と特異的に相互作用するＦｃ-グリカンの糖鎖工学は主な焦点となっている（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． ２０１３； Ｂｏｕｒｎａｚｏｓ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｍｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ． ２０１４； Ｑｕａｓｔ ａｎｄ Ｌｉｉｎｅｍａｎｎ ２０１４）。エフェクター機能に対するいくつかの重要なグリカン修飾の影響は、以下の通りである。ｉ）還元末端ＧｌｃＮＡｃ残基に結合したコアフコース残基の欠如がＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の増加、したがって抗体依存性細胞傷害性の増加をもたらす（Ｉｉｄａｅｔ ａｌ． ２００６）。ｉｉ）ＩｇＧ上のシアル酸リッチグリカンは、樹状細胞及びマクロファージ上のＤＣ−ＳＩＧＮ受容体との相互作用の増大を通じてＩｇＧの抗炎症反応を増大させることが報告されている（Ａｎｔｈｏｎｙ ｅｔ ａｌ． ２００８；Ａｎｔｈｏｎｙ ａｎｄ Ｒａｖｅｔｃｈ ２０１０； Ｐｉｎｃｅｔｉｃ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。ｉｉｉ）バイセクティングＧｌｃＮＡｃは、そのホモローグ対応物と比較して強いＡＤＣＣを誘導する。近年、ＩｇＧのＦｃグリコシル化状態を制御するためのバイオテクノロジーツールに対する改良は、所定のグライコフォームを有する治療用抗体の開発を容易にする。したがって、機能的及び構造的研究のために、目的ペプチド、タンパク質及び抗体を高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型の広範囲のＮ−グリカンに結合する糖鎖工学の分野において、本発明のＥｎｄｏＳ２変異体は、大きな進歩を遂げた。

【0044】

本発明の特徴及び利点は、以下の非限定的な実施例によってさらに十分に示される。当業者であれば、これらの実施例は説明のためだけのものであり、本発明の範囲から逸脱することなく他の修正及び変形が可能であることを理解するであろう。

【0045】

実施例
ペプチド、治療用タンパク質及びインタクトＩｇＧ又はそのＦｃ断片の糖鎖工学のためのＥｎｄｏＳ２変異体の調製

【0046】

これまで、グライコシンターゼは、加水分解中のオキサゾリニウムイオン中間体形成の促進に関与する重要なアスパラギン（Ａｓｎ）残基の部位特異的変異の誘発によって、いくつかのＧＨ８５エンドグリコシダーゼ（ＥＮＧａｓｅｓ）（例えば、ＥｎｄｏＡ、ＥｎｄｏＭ、ＥｎｄｏＤなど）から調製されている。

【0047】

化膿レンサ球菌由来のＥｎｄｏＳは、グリコシドヒドロラーゼファミリー１８（ＧＨ１８）に属する。このファミリーには、ＥｎｄｏＦｌ、ＥｎｄｏＦ２及びＥｎｄｏＦ３も含まれる。これらのＧＨ１８酵素は、ヒトＩｇＧ上のアスパラギン結合二本鎖グリカンを切断してモノＧｌｃＮＡｃ抗体を産生するそれらの効率的な加水分解活性により知られている。ＥｎｄｏＳは、グリカンオキサゾリンを基質として用いてキトビオース結合を合成するためのグライコシンターゼとしても機能することができるが、これらの酵素の固有の加水分解活性が大きな障害となるため、合成糖タンパク質の収率の大幅な低下をもたらす恐れがある。酵素活性のさらなる改善により、ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑを含むエンドグリコシダーゼ変異体が開発される。これにより、ＥＮＧａｓｅの活性部位に重要なモチーフ（ＧＨ１８のＤ−Ｘ−Ｅ）が提供される。このモチーフは、隣接基が関与して二重置換反応を行うＥＮＧａｓｅの触媒メカニズムをサポートする。このメカニズムにおいて、ＧｌｃＮＡｃの２−アセトアミド基は、Ａｓｐのカルボン酸塩によって促進されるオキサゾリニウムイオン中間体の形成を伴って、アノマー中心における脱離基を置換するための求核剤として作用する。触媒残基（グルタメート）は、脱離アグリカン基をプロトン化し、求核性Η_２０を脱プロトン化する一般的な酸／塩基として作用することで、オキサゾリニウムイオン中間体を加水分解して加水分解生成物を形成する。アスパラギン酸のカルボキシレート（ＥのＮ末端側の２つの残基）は、オキサゾリニウムイオン中間体の形成を促進及び安定化することが報告されている。ＥｎｄｏＳのＤからＱへの変異は、トランスグリコシル化を改善しながら、加水分解活性を低減させることができることが実証された。

【0048】

変異体ＥｎｄｏＳ Ｄ２３３Ｑ及びＤ２３３Ａは均質な抗体を合成する大きな可能性を示しているが、効率的な反応を達成するために大量の酵素の添加が必要とされる。酵素の調製及び反応後の酵素除去工程は、面倒で労力が掛かる。最近、ＥｎｄｏＳ２は、新型な酵素として化膿レンサ球菌の別の血清型から同定された。ＥｎｄｏＳ触媒所有物において、複合型Ｎ−グリカンに対するＥｎｄｏ−Ｐ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性に加えて、ＥｎｄｏＳ２はＥｎｄｏＳと比較してハイブリッド型及びオリゴマンノース型構造を大きい程度で切断することができる（Ｊｏｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ， ２０１３ ａｎｄ ２０１５）。

【0049】

ＥｎｄｏＳ２は、ＥｎｄｏＳと３７％の配列同一性のみ有する。ＥｎｄｏＳ構造は、触媒ドメインにおいて共通の（β／α）_８バレル立体配座を採用する。これら２つの酵素のアラインメントに基づくと、ＥｎｄｏＳ２の４番目のβ−シートに位置する残基Ｅｌ８６は、ＥｎｄｏＳの一般的な酸／塩基Ｄ２３５に対応する。

【0050】

ＥｎｄｏＳ２のトランスグリコシル化の触媒効率を調べるために、触媒部位近傍のアミノ酸の変換がトランスグリコシル化を調節するか否かを調べた。触媒ドメイン近傍のいくつかの残基を選択し、部位特異的変異誘発によって変異させた。変異した残基は、３番目のβ−シート上のＴ１３８、４番目のβ−シート上のＤ１８２、５番目のβ−シート上のＤ２２６、Ｔ２２７及びＴ２２８を含む（図３Ａ）。テストしたＥｎｄｏＳ２変異体は、Ｔ１３８Ｄ（配列番号６）、Ｔ１３８Ｅ（配列番号７）、Ｔ１３８Ｆ（配列番号８）、Ｔ１３８Ｈ（配列番号９）、Ｔ１３８Ｋ（配列番号１０）、Ｔ１３８Ｌ（配列番号１ １）、Ｔ１３８Ｍ（配列番号１２）、Ｔ１３８Ｎ（配列番号１３）、Ｔ１３８Ｑ（配列番号１４）、Ｔ１３８Ｒ（配列番号１５）、Ｔ１３８Ｖ（配列番号１６）、Ｔ１３８Ｗ（配列番号１７）、Ｄ１８２Ｑ（配列番号２）、Ｄ２２６Ｑ（配列番号３）、Ｔ２２７Ｑ（配列番号４）及びＴ２２８Ｑ（配列番号５）を含む（図２及び表１）。これらの変異体は、大腸菌内でＨｉｓ−タグ融合タンパク質として高収率で発現され、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性カラムで精製することができる。活性部位近傍の変異がトランスグリコシル化活性を劇的に改善しながらエンドグリコシダーゼ活性を低下させ、顕著なグライコシンターゼ効率をもたらすことが観察されている。また、これらの変異体は、ごくわずかな加水分解生成物で複合型Ｎ-グリカンを活性化グリカンオキサゾリンから脱グリコシル化されたインタクト抗体に転移することができる。

【0051】

以下の表１には、種々のＥｎｄｏＳ２変異体の配列を示す。

【0052】

【表1】

【0053】

本発明の実施形態によれば、新型のＥｎｄｏＳ２変異体は、配列番号２−１７に示される配列からなる群より選択される配列を含む。これらの変異体は、改善されたトランスグリコシル化活性及び低下した加水分解活性を示すため、活性化オリゴ糖供与体をコアＧｌｃＮＡｃ−アクセプター（フコシル化又は非フコシル化）に転移することを効率的に触媒することができる。

【0054】

いくつかの好ましい実施形態によれば、ＥｎｄｏＳ２変異体は、配列番号２−１７の配列と少なくとも８０％（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％又は９８％）の配列同一性を有することができ、所望のトランスグリコシル化活性有するか、又はトランスグリコシル化活性を有するその断片を含む。

【0055】

他の好ましい実施形態では、本発明のＥｎｄｏＳ２変異体の変異部位は、残基１３３−１４３、残基１７７−１８７、残基２２１−２３３からなる群より選択される領域に位置する。

【0056】

さらに他の好ましい実施形態では、本発明のＥｎｄｏＳ２変異体は、Ｔ１３８Ｄ（配列番号６）、Ｔ１３８Ｅ（配列番号７）、Ｔ１３８Ｆ（配列番号８）、Ｔ１３８Ｈ（配列番号９）、Ｔ１３８Ｋ（配列番号１０）、Ｔ１３８Ｌ（配列番号１１）、Ｔ１３８Ｍ（配列番号１２）、Ｔ１３８Ｎ（配列番号１３）、Ｔ１３８Ｑ（配列番号１４）、Ｔ１３８Ｒ（配列番号１５）、Ｔ１３８Ｖ（配列番号１６）、Ｔ１３８Ｗ（配列番号１７）、Ｄ１８２Ｑ（配列番号２）、Ｄ２２６Ｑ（配列番号３）、Ｔ２２７Ｑ（配列番号４）及びＴ２２８Ｑ（配列番号５）を含む。

【0057】

ＥｎｄｏＳ２及びその変異体のグリカン加水分解活性

【0058】

市販のリツキシマブを基質としてＥｎｄｏＳ２変異体のグリカン加水分解活性を測定した。リツキシマブは、治療用抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であり、モデルｍＡｂとしてＥｎｄｏＳ２変異体の加水分解活性及び潜在トランスグリコシル化活性の検出に用いられた。市販のリツキシマブの主なＦｃグリカンは、０−２個のガラクトース部分（Ｇ０Ｆ、ＧＩＦ及びＧ２Ｆグライコフォームと呼ばれる）を有するコアフコシル化二本鎖複合型オリゴ糖である。リツキシマブを野生型ＥｎｄｏＳ２及びＥｎｄｏＳ２変異体で１：１０００のモル比（酵素：リツキシマブ）で処理した。グリカン加水分解過程は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にモニターされた。

【0059】

野生型ＥｎｄｏＳ２による処理は、迅速な脱グリコシル化を引き起こし、これにより、グリコシル化部位（Ｎ２９７）に対応するＧｌｃＮＡｃ−Ｆｃ Ｎ−グリカンが生成される。これらの結果は、インタクトＩｇＧに対する野生型ＥｎｄｏＳ２の顕著なＦｃグリカン−加水分解活性を確認し、ｍＡｂのグリコシル化再構築のための第一段階（加水分解）における有用性を示唆している。しかし、野生型（ＷＴ）ＥｎｄｏＳ２と比較して、ＥｎｄｏＳ２変異体による処理は、低下した加水分解活性を示した。特に、Ｔ１３８及びＤ２２６での変異体は、２時間のインキュベーション期間中、極めて低い又はほとんどないＮ−グリカン加水分解能力を示し、Ｄ１８２Ｑでの変異は、ＷＴ ＥｎｄｏＳ２と比較して、反応速度が６０倍以上減少したことを示した。これらの結果は、残基Ｄ１８２、Ｔ１３８及びＤ２２６は、グリコシドヒドロラーゼ活性に重要であることを示している（図３）。

【0060】

２，６−シアル化二本鎖複合型（ＳＣＴ）オキサゾリンを供与体基質として用いたＥｎｄｏＳ２及びその変異体のトランスグリコシル化能力の調査

【0061】

次いで、図４に示すように、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブをアクセプター、α−２，６−シアル化二本鎖複合型（ＳＣＴ）オキサゾリンを供与体基質として用いて、ＥｎｄｏＳ２及びその変異体のトランスグリコシル化能力を調べた。グリコシル化再構築過程は、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりモニターされた。ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ及びＳＣＴ−オキサゾリン（供与体／アクセプター、１：１、重量比）と野生型ＥｎｄｏＳ２及びその変異体（酵素／抗体、１：１０００、モル比）とのインキュベーションをＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターしたところ、野生型ＥｎｄｏＳ２に対応するトランスグリコシル化生成物の一過性形成を示している。これは、野生型酵素による生成物の迅速なその場での加水分解のためであると考えられる。加水分解能力の喪失にもかかわらず、全ての選択された変異体（Ｔ１３８Ｑ、Ｄ１８２Ｑ、Ｄ２２６Ｑ、Ｔ２２７Ｑ及びＴ２２８Ｑ）は、顕著なトランスグリコシル化活性を有する。これらの結果は、ＥｎｄｏＳ２変異体が新型な効率的なグライコシンターゼであり、生成物の加水分解がなく、複合型Ｎ−グリカンを用いて脱グリコシル化インタクトＩｇＧをグリコシル化することを可能にすることを示している。

【0062】

トランスグリコシル化活性に対するＴ１３８での様々なアミノ酸残基の影響

【0063】

部位Ｔ１３８での強力なトランスグリコシル化活性のみを示すが加水分解活性を欠く最適アミノ酸残基を同定するために、この部位で様々な変異を行った。次いで、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブをアクセプター、α−２，６−シアル化二本鎖複合型（ＳＣＴ）オキサゾリンを供与体基質として用いてこれらの変異体のトランスグリコシル化能力を調べた（図５）。Ｔ１３８（６７．５ｎＭ）での種々の変異体を６７．５μΜ ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ及び２．５ｍＭ ＳＣＴ−オキサゾリンと２時間インキュベートした。生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ（ＩｇＧ）及びリツキシマブ−ＳＣＴ（ＩｇＧ −グリカン）の相対百分率を図５に示す。試験した変異体のうち、Ｔ１３８Ｅ、Ｔ１３８Ｒ、Ｔ１３８Ｗ、Ｔ１３８Ｍ及びＴ１３８Ｑが最大のトランスグリコシル化能を示した。

【0064】

高マンノース型、ハイブリッド型、及び複合型の広範囲のＮ−グリカンを用いたＥｎｄｏＳ２変異体のトランスグリコシル化効率

【0065】

ヒトＩｇＧ分子は、そのそれぞれのＦｃ ＣＨ２ドメインにＮ−グリカンを含む。これらのグリカンは、高マンノース型、ハイブリッド型、及び複合型を含む。Ｆｃ Ｎ−グリカンの組成は、抗体の炎症促進活性及び抗炎症活性の重要な決定因子であることが実証されている。例えば、コアフコースの欠如及びバイセクティングＧｌｃＮＡｃ部分の結合は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の原因である受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）に対する抗体の親和性を劇的に高める。高マンノース型グリカンを含む組換えＩｇＧ分子は、ヒトの血液中でより早く除去され、低下した熱安定性を示した。また、高マンノース型及びハイブリッド型グリカンを含むＩｇＧ分子は、ＣＨ２ドメインにおいてより高い立体配座柔軟性を示した。異なる高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型のＦｃ-グリカンを有するＩｇＧを産生するための最も一般的な方法は、哺乳動物、植物、及び酵母宿主細胞を含む様々な発現系を使用することである。しかし、このような発現系は、通常、単一のグリカン構造ではなく、グライコフォームの混合物を提供する。したがって、生物物理学的及び構造的研究のための治療用抗体の純粋なグライコフォームを得ることは、グリカン工学分野において非常に興味深い。したがって、ペプチド、タンパク質、及びＩｇＧのＧｌｃＮＡｃアクセプターへの異なる高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型グリカンの効率的な転移を可能にするグライコシンターゼが必要とされている。
_９

【0066】

次いで、一連の高マンノース型、ハイブリッド型、及び複合型グリカンオキサゾリンを用いて本発明のＥｎｄｏＳ２変異体のトランスグリコシル化能力を調査した（表２）。その結果、シアル化複合型Ｎ−グリカンオキサゾリンに加えて、ＥｎｄｏＳ２変異体は、抗体糖鎖工学のために高マンノース型Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ−オキサゾリン（Ｇｌ）、Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ−オキサゾリン（Ｇ２）、ハイブリッド型グリカンＧ３及びＧ４、二本鎖及び三本鎖複合型グリカンＧ５−Ｇ１６を転移して対応する均質なグライコフォームを形成するのに同等に効率的であることを示している。この研究において、リツキシマブをモデル抗体として用いた。しかし、当業者に理解できるように、他の糖タンパク質も同様に修飾することができる。これらの結果は、シアル化複合型Ｎ−グリカンオキサゾリンに加えて、ＥｎｄｏＳ２変異体は、高マンノース型、ハイブリット型、及び三本鎖複合型グリカンの転移において同等に効率的であることを示している。

【0067】

表２には、選択されたＥｎｄｏＳ２変異体のトランスグリコシル化活性の調査に用いられた種々のグリカンオキサゾリンの構造を示す。

【0068】

【表2】

【0069】

複合型グリカンは、Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃコアに存在する本鎖の数によって二本鎖、三本鎖、四本鎖型に分けられる。三本鎖又は四本鎖型グリカンが嵩高いが、一般的には、二本鎖グリカンオキサゾリンを受容するグライコシンターゼであれば、三本鎖又は四本鎖型グリカンオキサゾリンも受容することができる。これらの新規ＥｎｄｏＳ２変異体の有効性を証明するために、一連の複合型グリカンオキサゾリン（表２）をトランスグリコシル化に使用した。ここでリツキシマブをモデル抗体として使用した。結果を図７−８に示す。これらの結果は、ＥｎｄｏＳ２グライコシンターゼ変異体が多様な高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型グリカンをＩｇＧ−Ｆｃ領域に転移する顕著なトランスグリコシル化効率を有することを示している。したがって、本発明のＥｎｄｏＳ２グライコシンターゼ変異体は、生成物加水分解活性を欠いている（又は最小限にしている）ため、異なる治療用抗体を効率的及び完全にトランスグリコシル化することでそれらのエフェクター機能を増強させることができる。

【0070】

本発明は、広範囲のＮ−グリカン（高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型を含む）に対して優れたトランスグリコシル化活性を示す選択されたＥｎｄｏＳ２変異体を開示する。

【0071】

好ましい実施形態において、高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型のＮ−グリカンは、表２の一般式によって示されるように、活性化オキサゾリンの形態である。
_９

【0072】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の高マンノース型Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ， Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ， Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ， Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ， Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ及びＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される。好ましい実施形態において、高マンノース型Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃである。

【0073】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のハイブリッド型Ｎ−グリカンは、α−１，３アームに少なくとも１つのα−２，６−又はα−２，３末端シアル酸を含み、ここで、α−１，６アームは、トリマンノース残基を含む。

【0074】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のハイブリッド型Ｎ−グリカンは、α−１，３アームに少なくとも１つの末端ガラクトースを含み、ここで、α−１，６アームは、トリマンノース残基を含む。

【0075】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のハイブリッド型Ｎ−グリカンは、α−１，３アームに少なくとも１つの末端ＧｌｃＮＡｃを含み、ここで、α−１，６アームは、トリマンノース残基を含む。

【0076】

いくつかの実施形態において、上記複合型グリカンは、二本鎖、三本鎖、及び四本鎖複合型である。

【0077】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−２，６又はα−２，３末端シアル酸を含む。好ましい実施形態において、Ｎ−グリカンは、２つのα−２，６及び／又は α−２，３末端シアル酸を含む。

【0078】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つの末端ガラクトース又はＧｌｃＮＡｃを含む。好ましい実施形態において、Ｎ−グリカンは、２つの末端ガラクトース及び／又はＧｌｃＮＡｃを含む。

【0079】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−ｌ，２−フコースを含む。好ましい実施形態において、Ｎ−グリカンは、２つのα−１，２−フコースを含む。

【0080】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−ｌ，３−フコースを含む。好ましい実施形態において、Ｎ−グリカンは、２つのα−ｌ，３−フコースを含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、二等分ＧｌｃＮＡｃを含む。

【0082】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのＬａｃＮＡｃ繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、Ｎ−グリカンは、２つのＬａｃＮＡｃ繰り返し単位を含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の三本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−２，６又はα−２，３末端シアル酸を含む。好ましい実施形態において、Ｎ−グリカンは、３つのα−２−６及び／又はα−２，３末端シアル酸を含む。

【0084】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の三本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つの末端ガラクトース又はＧｌｃＮＡｃを含む。好ましい実施形態において、Ｎ−グリカンは、３つの末端ガラクトース及び／又はＧｌｃＮＡｃを含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、上記複合型グリカンは、α−１，３又はα−１，６アームのいずれかに非対称本鎖を含む二本鎖及び三本鎖複合型である。

【0086】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のハイブリッド型、二本鎖及び三本鎖複合型Ｎ−グリカンは、α−２，６又はα−２，３末端シアル酸を含む。好ましい実施形態において、ハイブリッド型、二本鎖及び三本鎖複合型Ｎ−グリカンは、α−２，６末端シアル酸を含む。

【0087】

エフェクター機能を改善できる多様な非フコシル化グライコフォームを提供するためのリツキシマブの糖鎖工学

【0088】

リツキシマブは、主にＢ細胞リンパ腫の９５％の表面に見られるＣＤ２０タンパク質を標的とするモノクローナル抗体である。リツキシマブは、Ｂ細胞を破壊することで、過剰な数のＢ細胞、過活動Ｂ細胞、又は機能不全Ｂ細胞を特徴とする疾患を治療するために使用される。リツキシマブは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で産生され、通常、グリコシル化パターンの異質な混合物（類似の生物学的特性を示さない）を含む。抗体内のＦｃグリコシル化の多様性は、Ｆｃエフェクター機能の多様性をもたらし得る。したがって、Ｆｃグリカンにおけるこの不均一性は、ＩｇＧ分子のＦｃ受容体及びＣ１ｑへの結合に影響を与えることで抗体エフェクター機能に影響を与えるような機能的な結果をもたらす。これにより、患者に望ましくない影響を与える可能性があり、安全上の懸念となる。

【0089】

したがって、改善された抗ＣＤ２０抗体を用いてモノクローナル抗体療法を改善する必要がある。グリコシル化パターンの異質な混合物中のいくつかの特定のグライコフォームは、所望の生物学的機能を付与できることが知られている。さらに、複合型グライコフォームの場合、コアフコース及びバイセクティングＧｌｃＮＡｃのような修飾物以外に、くつかの天然の修飾物（外側ＧｌｃＮＡｃ上のα−１，２フコース、ガラクトース上のα−１，３フコース、ポリＬａｃＮＡｃモチーフ、三本鎖及び四本鎖）の、生物学的活性に対する効果についてまだ探求されていない。したがって、治療目的のために、明確に定義されたグリカン構造及び配列を含む所望のグライコフォームの治療用抗体を作製することは非常に興味深い。

【0090】

本明細書に記載されているのは、治療用モノクローナル抗体と比較してより強力な生物学的活性を示す最適化されたグライコフォームを有する機能的に活性な糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体である。

【0091】

本開示は、Ｆｃ糖鎖工学によって抗ＣＤ２０モノクローナル抗体から調製される新型なクラスの抗ＣＤ２０抗体を特徴とする。個々の糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、均質な集団、並びに明確なグリカン構造及び配列を有する同じＦｃグリカンを含む。本発明に係る糖鎖改変抗ＣＤ２０は、その親抗体のように、細胞膜上のヒトＣＤ２０抗原の同一のエピトープに特異的に結合する。また、同じ抗体の均質な集団はすべて同じエフェクター結合部位を有する。

【0092】

本明細書で用いられる用語「親抗体」は、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体の調製に用いられる抗ＣＤ２０モノクローナル抗体を指す。親抗体は、細胞培養（哺乳動物細胞培養、ピキア酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）又は昆虫細胞株など）によって得ることができる。好ましくは、親抗体は、哺乳動物細胞培養によって製造される。例示的な親抗体は、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オクレリズマブ、１１Ｂ８又は７Ｄ８（ＷＯ２００４／０３５６０７に開示）を含むが、これらに限定されない。

【0093】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の例示的な糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖を有する。好ましい実施形態において、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、それぞれリツキシマブの軽鎖配列及び重鎖配列を含む。

【0094】

表３には、リツキシマブの重鎖配列及び軽鎖配列を示す。

【0095】

【表3】

【0096】

いくつかの実施形態において、Ｎ−グリカンは、リツキシマブのＦｃ領域のＡｓｎ−２９７に結合される。

【0097】

本発明に係るＮ−グリカンは、高マンノース型、ハイブリット型、二本鎖及び三本鎖複合型構造を有することができ、ここで、上記Ｎ−グリカン構造は、以下の一般式を有する。

式中、Ｒ^１は、β−１，４結合を介して結合した−Ｈ又はＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｒ^２及びＲ^３は、同一又は異なり、それぞれ独立して

からなる群より選択される。

【0098】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＮ−グリカンは、追加の鎖内置換基（「バイセクティング」ＧｌｃＮＡｃ、α−１，２フコース、α−１，３フコース（α−２，３及び／又はα−２，６シアル酸の有無にも関わらず）を含む）を有してもよく、伸長ポリＬａｃＮＡｃモチーフであり得る。

【0099】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の高マンノース型Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ、ａｎｄ Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃからなる群より選択される。好ましい実施形態において、上記高マンノース型Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃである。

【0100】

いくつかの実施形態において、本発明に記載のハイブリッド型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−２，６若しくはα−２，３末端シアル酸、少なくとも１つの末端ガラクトース又はα− １，３アーム上の少なくとも１つの末端ＧｌｃＮＡｃを含み、α−１，６アームはトリマンノース残基を含む。

【0101】

いくつかの実施形態において、複合型グリカンは、二本鎖、三本鎖又は四本鎖複合型である。

【0102】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−２，６又はα−２，３末端シアル酸を含む。好ましい実施形態において、上記Ｎ−グリカンは、２つのα−２，６及び／又はα−２，３末端シアル酸を含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つの末端ガラクトース又はＧｌｃＮＡｃを含む。好ましい実施形態において、上記Ｎ−グリカンは、２つの末端ガラクトース及び／又はＧｌｃＮＡｃを含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−１，２フコースを含む。好ましい実施形態において、上記Ｎ−グリカンは、２つのα−１，２フコースを含む。

【0105】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−１，３フコースを含む。好ましい実施形態において、上記Ｎ−グリカンは、２つのα−１，３フコースを含む。

【0106】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを含む。

【0107】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の二本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのＬａｃＮＡｃ繰り返し単位を含む。好ましい実施形態において、上記Ｎ−グリカンは、２つのＬａｃＮＡｃ繰り返し単位を含む。

【0108】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の三本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つのα−２，６又はα−２，３末端シアル酸を含む。好ましい実施形態において、上記Ｎ−グリカンは、３つのα−２，６及び／又はα−２，３末端シアル酸を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、本発明に記載の三本鎖複合型Ｎ−グリカンは、少なくとも１つの末端ガラクトース又はＧｌｃＮＡｃを含む。好ましい実施形態において、上記Ｎ−グリカンは、３つの末端ガラクトース及び／又はＧｌｃＮＡｃを含む。

【0110】

いくつかの実施形態において、上記複合型グリカンは、α−１，３又はα−１，６アームのいずれかにおける非対称本鎖を含む二本鎖、三本鎖又は四本鎖複合型である。

【0111】

いくつかの実施形態において、本発明に記載のハイブリッド型及び二本鎖若しくは三本鎖複合型Ｎ−グリカンは、α−２，６又はα−２，３末端シアル酸を含む。好ましい実施形態において、上記ハイブリッド型、二本鎖、三本鎖及び四本鎖Ｎ−グリカンは、α−２，６末端シアル酸を含む。

【0112】

好ましくは、本発明の実施形態に係るＮ−グリカンは、コアフコースを含まない。

【0113】

表４には、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体の例示的なＮ−グリカンを示す。本開示の実施形態は、 本明細書に列挙されたＮ−グリカンのうちのいずれかを含み得るか又は除外し得る。

【0114】

【表4】

【0115】

糖鎖改変リツキシマブの生物学的機能

【0116】

様々な抗体のＦｃグリコシル化は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び循環半減期を含むエフェクター媒介機能に大きく影響する。ＡＤＣＣ増強は、治療用抗体薬効力を改善するための重要な戦略であり、有効な薬用量を下げることができるため、薬剤費を削減することができる。本発明に記載の糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、ヒトＣＤ２０発現細胞に対するアポトーシスを含む細胞増殖阻害活性を有する。いくつかの実施形態において、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、その親抗体と比較して、より強力な細胞増殖阻害活性を示す。
ＦｃγＲＩＩＩＡと糖鎖改変リツキシマブとの結合

【0117】

表５には、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体及びリツキシマブの例示的なＦｃγＲＩＩＩＡ結合を示す。

【0118】

【表5】

【0119】

ＦｃγＲＩＩＩＡ結合は、当該分野で公知のアッセイにより測定することができる。例示的なアッセイは実施例に記載される。Ｆｃ受容体結合は、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体とリツキシマブとの相対比として決定することができる。例示的な実施形態におけるＦｃ受容体結合は、少なくとも２．５倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、２０倍、３０倍又はそれ以上増加する。高マンノース型Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２グライコフォームは、所望の結合を提供することができない。しかし、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グライコフォームは、非修飾リツキシマブよりも優れている。両方のハイブリッド型グライコフォームは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を２〜３倍のみ増強することができた。興味深いことに、二本鎖型及び三本鎖型を含むすべての複合型グライコフォームは、元のリツキシマブと比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を３０倍以上増強した。α−１，３フコースにＧｌｃＮＡｃを有することは、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合に大きな影響を示さなかった。しかし、１，２フコースは、結合能力をわずかに低下させた。さらに、三本鎖グライコフォームのような複数の本鎖を有するグライコフォームは、結合に対する大きな影響を示さなかった。しかしながら、シアル酸含有量が増加したグリカンは抗炎症活性を得る可能性があると考えられている。

【0120】

リツキシマブと比較して、結合データは、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体、特に複雑なグライコフォームを有するものがＦｃγＲＩＩＩＡに対してより強い結合親和性を示すことを示した。
糖鎖改変リツキシマブのＡＤＣＣ活性

【0121】

本発明の糖鎖改変リツキシマブのＡＤＣＣ活性は、親抗体のＡＤＣＣ活性と比較して、少なくとも３倍、好ましくは、少なくとも９倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらに好ましくは少なくとも１２倍、さらにより好ましくは少なくとも２０倍、最も好ましくは少なくとも３０倍増加した。

【0122】

表６には、選択された糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体及び市販リツキシマブの例示的な増強されたＡＤＣＣ活性を示す。例示的なアッセイは実施例に記載される。

【0123】

【表6】

【0124】

本発明に開示された一連の糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体、特に複合グライコフォームを有する抗体は、親抗体（リツキシマブ）と比較して増強されたＡＤＣＣ活性を示す。本発明の糖鎖改変抗体は、Ｂ細胞又はＢ細胞によって産生される抗体が関与するＢ細胞媒介悪性腫瘍及び免疫学的疾患のための治療薬として優れた効果を示す。本発明の目的は、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体を用いて治療薬を開発することである。

【0125】

まとめると、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、リツキシマブと比較して、増強されたＡＤＣＣ活性及びより強いＦｃγＲＩＩＩＡ結合親和性を示す。本発明のグライコ抗体（ｇｌｙｃｏａｎｔｉｂｏｄｙ）は、単独で使用する場合、又は２つ以上のそのような抗体を含む組成物として必要に応じて化学療法などの他の治療と組み合わせる場合のいずれにも、優れた臨床応答を提供することができる。ＡＤＣＣ増強された糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、Ｂ細胞リンパ腫及び他の疾患に対する代替治療法を提供することができる。本発明の糖鎖改変抗体は、増強されたエフェクター機能を有することで、より低い濃度、より少ない頻度で投与され得ることにより、抗体毒性及び／又は抗体耐性の発生の可能性を減少させるため、現在の投与経路及び現在の治療計画を変更するために有利に使用することができる。さらに、改善されたエフェクター機能は、組み換え宿主系で産生された対応する抗ＣＤ２０モノクローナル抗体による治療に対して以前は抵抗性又は難治性であった臨床的適応症の治療のために新しいアプローチを提供する。
抗ＣＤ２０抗体の糖鎖工学の方法

【0126】

本発明の糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、Ｆｃ糖鎖工学により市販又は前臨床若しくは臨床開発中の任意の抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（「親抗体」）から調製することができる。Ｆｃ糖鎖工学は、酵素的又は化学酵素的に処理され得る。好ましい実施形態において、上記親抗体は、リツキシマブである。

【0127】

糖鎖改変抗体中のＮ−グリカンは、好ましくは脱フコシル化されている。

【0128】

本明細書に開示されるのは、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体などの糖鎖改変抗体を調製するための改良された方法を含む。本発明の方法は、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体をα−フコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼに接触することで、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有する脱フコシル化抗体を生成するステップ（ａ）と、適切な条件下で糖質部分をＧｌｃＮＡｃに付加するステップ（ｂ）とを含む。

【0129】

いくつかの実施形態において、本発明の方法に係る抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、リツキシマブである。

【0130】

Ｎ−グリカン中のオリゴ糖の可変部分を切り取るために、任意の適切なエンドグリコシダーゼを使用することができる。本明細書で使用されるエンドグリコシダーゼの例には、ＥｎｄｏＳ２が含まれる。

【0131】

上記ステップ（ａ）によれば、単一のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するフコシル化抗体が形成される。その後、ＥｎｄｏＳ２変異体はトランスグリコシル化を媒介し、広範囲の選択された糖質部分をＧｌｃＮＡｃに付加して糖鎖を延長させる。これにより、グライコ抗体の均質な集団は製造される。本明細書に記載のトランスグリコシラーゼの例には、配列番号２−１７に示される配列を有する選択されたＥｎｄｏＳ２変異体が含まれる。

【0132】

いくつかの実施形態において、本発明の実施形態に係る糖質部分は、高マンノース型， ハイブリッド型、及び複合型の多様なＮ−グリカンを含み、以下の一般式を有する。

ここで、Ｒ^１は、β−１，４結合を介して結合した−Ｈ又はＮ−アセチルグルコサミンであり、Ｒ^２及びＲ^３は、同一又は異なり、それぞれ独立して

からなる群より選択される。

【0133】

いくつかの実施形態において、上記糖質部分は、糖オキサゾリンである。

【0134】

適切な反応条件は、反応混合物を少なくとも２０分間、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、９０分間又は１００分間、好ましくは６０分間未満反応させることを含む。反応は、好ましくは室温で、より好ましくは約２０°Ｃ、２５°Ｃ、３０°Ｃ、３５°Ｃ、４０°Ｃ又は４５°Ｃ、最も好ましくは約３７°Ｃで行われる。
医薬製剤

【0135】

本発明の抗体を含む治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を、１つ以上の任意の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより、水溶液、凍結乾燥製剤又は他の乾燥製剤として調製され、保存され得る（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ．（１９８０））。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに無毒である必要があり、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン及び他の有機酸）、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸及びメチオニン）、防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール及びｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン）、単糖、二糖類及び他の糖質（例えば、グルコース、マンノース又はデキストリン）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）、及び／又は非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ^TM、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ^TM又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む。

【0136】

本開示の製剤は、治療される特定の適応症に応じて、２つ以上の活性化合物を含み得る。上記活性化合物は、互いに悪影響を及ぼさない相補活性を有する化合物を含むが、これに限定されない。このような分子は、意図する目的に有効な量の組み合わせとして適切に存在する。

【0137】

特に、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子とナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、活性成分をそれぞれコアセルベーション技術又は界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えば、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリメタクリル酸メチルマイクロカプセル）に封入してもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。

【0138】

インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。滅菌は、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。

【0139】

徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例としては、本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリビニルアルコール））、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ３，７７３，９１９）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ^TM（乳酸−グリコール酸共重合体及び酢酸ロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ ａｃｅｔａｔｅ）からなる注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日を超える分子の放出を可能にするが、特定のヒドロゲルは短い期間でタンパク質を放出する。カプセル化された免疫グロブリンは、体内において、３７℃の湿気に長期間さらされると、変性又は凝集し、生物学的活性が失われたり、免疫原性が変化したりする恐れがある。関与するメカニズムに応じて、免疫グロブリンの安定化のために合理的な戦略を設計することができます。例えば、凝集メカニズムがチオ−ジスルフィド交換による分子間Ｓ - Ｓ結合形成であることが発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、含水率の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス組成物の開発によって達成することができる。

【0140】

凍結乾燥前製剤中の抗体の量は、所望の投与量、投与形態などを考慮して決定される。選択されたタンパク質がインタクト抗体（全長抗体）である場合、例示的な出発タンパク質濃度は、約２ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約２０ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬである。タンパク質は一般に溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、ｐＨが約４〜８、好ましくは約５〜７のｐＨ緩衝溶液中に存在してもよい。例示的な緩衝剤としては、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸及び他の有機酸が挙げられる。緩衝液濃度は、例えば緩衝液及び製剤（例えば再構成製剤）の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、又は約３ｍＭ〜約１５ｍＭであってもよい。以下に示すように、好ましい緩衝剤は凍結保護特性を有するヒスチジンである。コハク酸も有用な緩衝剤である。

【0141】

凍結保護剤は、凍結乾燥前製剤に添加される。好ましい実施形態において、凍結保護剤は、スクロース又はトレハロースなどの非還元糖である。凍結乾燥前製剤中の凍結保護剤の量は、一般に、再構成時に得られる製剤が等張になるような量である。しかし、高張再構成製剤にも適用である。また、凍結乾燥時に許容できない量のタンパク質の分解／凝集が起こらないように、凍結保護剤の量は少なすぎてはならない。凍結保護剤が糖（スクロース又はトレハロースなど）であり、タンパク質が抗体である場合、例示的な凍結乾燥前製剤中の凍結保護剤濃度は、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、好ましくは約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、最も好ましくは約５０ｍＭ〜約１００ｍＭである。

【0142】

タンパク質と凍結保護剤との比は、各タンパク質と凍結保護剤との組み合わせについて選択される。選択されたタンパク質を抗体、糖（例えば、スクロース又はトレハロース）を凍結保護剤として及び高タンパク質濃度の等張再構成製剤を生成する場合、抗体に対する凍結防止剤のモル比は、抗体１モルに対して凍結防止剤が約１００〜約１５００モルであり、好ましくは抗体１モルに対して凍結防止剤が約２００〜約１０００モルであってもよい。例えば、抗体１モルに対して凍結防止剤は約２００〜約６００モルである。

【0143】

本発明の好ましい実施形態では、凍結乾燥前製剤に界面活性剤を添加することが望ましい。あるいは、又はさらに、凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤に界面活性剤を添加することができる。例示的な界面活性剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０又は８０）、ポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、トリトン、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムオクチルグリコシド、ラウリルスルホベタイン、ミリスチルスルホベタイン、リノレイルスルホベタイン又はステアリルスルホベタイン、ラウリルサルコシン、ミリスチルサルコシン、リノレイルサルコシン又はステアリルサルコシン、リノレイルベタイン、ミリスチルベタイン又はセチルベタイン、ラウロアミドプロピルベタイン、コカミドプロピルベタイン、リノールアミドプロピルベタイン、ミリスタミドプロピルベタイン、パルミドプロピルベタイン、又はイソステアルアミドプロピルベタイン（例えば、ラウラミドプロピルベタイン）、リスタミドプロピルジメチルアミン、パルミドプロピルジメチルアミン、又はイソステアルアミドプロピルジメチルアミン、メチルココイルタウリン酸ナトリウム又はメチルオレイルタウリン酸二ナトリウム、ＭＯＮＡＱＵＡＴ^ＴＭシリーズ（Ｍｏｎａ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｐａｔｅｒｓｏｎ， Ｎ．Ｊ．）、ポリエチルグリコール、ポリプロピレングリコール、エチレンとプロピレングリコールの共重合体（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃｓ、ＰＦ６８など）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。添加される界面活性剤の量は、再構成タンパク質の凝集を減少させ、再構成後の粒子の形成を最小にするような量である。例えば、界面活性剤は、凍結乾燥前製剤中に約０．０１〜０．５％、好ましくは約０．００５〜０．０５％の量で存在してもよい。

【0144】

本発明の特定の実施形態では、凍結乾燥保護剤（スクロース又はトリハロースなど）と増量剤（例えば、マンニトール又はグリシン）との混合物が凍結乾燥前製剤の調製に使用される。増量剤は、過度のポケットが形成されることなく、均一な凍結乾燥ケーキを製造することができる。

【0145】

Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ．（１９８０）に記載されている他の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤は、製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさない限り、凍結乾燥前製剤（及び／又は凍結乾燥製剤及び／又は再構成製剤）に含まれてもよい。許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、その投与量及び濃度がレシピエントに対して無毒であり、緩衝剤、防腐剤、共溶媒、抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニン）、ＥＤＴＡなどのキレート剤、金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）、ポリエステルなどの生分解性ポリマー、及び／又はナトリウムなどの塩形成対イオンを含む。

【0146】

本明細書に記載の医薬組成物及び製剤は、安定であることが好ましい。「安定な」製剤／組成物は、その中の抗体が貯蔵時にその物理的及び化学的安定性、完全性を本質的に保持できるものである。タンパク質の安定性を測定するための様々な分析技術は、当該分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ， ２４７−３０１， Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ Ｅｄ．， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， Ｐｕｂｓ．（１９９１）ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ａ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ． １０： ２９−９０（１９９３）に開示されている。安定性は、選択された温度で選択された期間測定することができる。

【0147】

インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前後に、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。混合物全体の滅菌は、例えば、オートクレーブを用いてタンパク質を除く成分を約１２０℃で約３０分間処理することによって達成することができる。

【0148】

タンパク質、凍結保護剤及び必要に応じて他の成分を混合した後、製剤を凍結乾燥する。Ｈｕｌｌ ５０（登録商標）（Ｈｕｌｌ、米国）又はＧＴ ２０（登録商標）（Ｌｅｙｂｏｌｄ-Ｈｅｒａｅｕｓ、ドイツ）などの多くの異なる凍結乾燥機がこの目的のために利用可能である。凍結乾燥は、製剤を凍結させ、続いて一次乾燥に適した温度で凍結内容物から氷を昇華させることによって達成される。この条件下では、生成物温度は製剤の共融点又は崩壊温度より低い。典型的には、一次乾燥のための棚温度は約−３０〜２５℃の範囲である（生成物が一次乾燥の間に凍結状態に維持される）。適切な圧力は、一般に約５０〜２５０ｍＴｏｒｒである。乾燥に必要な時間は、主に製剤、試料を収容する容器の大きさ及び種類（例えば、ガラスバイアル）、並びに液体の体積によって決定され、数時間から数日（例えば４０〜６０時間）である。二次乾燥段階は、主に容器の種類及び大きさ、ならびに使用されるタンパク質の種類に応じて、約０〜４０℃で実施され得る。なお、本発明において、二次乾燥工程は省略されてもよい。例えば、凍結乾燥の水分除去段階全体にわたる棚温度は、約１５〜３０℃（例えば、約２０°Ｃ）であり得る。二次乾燥に必要な時間及び圧力は、例えば、温度及び他のパラメーターに応じて、適切な凍結乾燥ケーキを製造するものである。二次乾燥時間は、生成物中の所望の残留水分レベルによって決定されるが、典型的には少なくとも約５時間（例えば１０〜１５時間）かかる。圧力は、一次乾燥工程の圧力と同じであってもよい。凍結乾燥条件は、製剤及びバイアルの大きさに応じて変わってもよい。

【0149】

いくつかの例において、容器内でタンパク質製剤を凍結乾燥することが望ましい。これにより、容器内でタンパク質を再構成することができるため、移転ステップの必要がない。この例における容器は、例えば、３、５、１０、２０、５０又は１００ｃｃのバイアルである。一般的には、凍結乾燥により、凍結乾燥製剤中の水分含量が約５％未満、好ましくは約３％未満に減少される。

【0150】

所望の段階で、典型的にはタンパク質を患者に投与する必要があるときに、凍結乾燥製剤は、再構成製剤中のタンパク質濃度が少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ（例えば、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約４００ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは約８０ｍｇ／ｍＬ〜約３００ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは約９０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬ）となるように希釈剤で再構成することができる。再構成製剤中の高タンパク質濃度は、再構成製剤の皮下投与に特に有利である。しかし、静脈内投与などの他の投与経路では、再構成製剤中のタンパク質濃度を低くすることが望ましい場合がある（例えば、再構成製剤中のタンパク質濃度は約５〜約５０ｍｇ／ｍＬ、約１０〜約４０ｍｇ／ｍＬである）。特定の実施形態では、再構成製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤中のものよりも顕著に高い。例えば、再構成製剤中のタンパク質濃度は、凍結乾燥前製剤の約２〜４０倍、好ましくは３〜１０倍、最も好ましくは３〜６倍（例えば、少なくとも３倍又は少なくとも４倍）であってもよい。

【0151】

再構成は一般に、完全な水和を確実にするために約２５℃の温度で行われるが、所望に応じて他の温度を使用してもよい。再構成に必要な時間は、例えば希釈剤の種類、賦形剤及びタンパク質の量に依存する。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌食塩水、リンゲル液又はブドウ糖溶液が挙げられる。希釈剤には、必要に応じて防腐剤を含んでもよい。例示的な防腐剤は上に記載されているが、好ましい防腐剤は、ベンジル又はフェノールアルコールなどの芳香族アルコールである。使用される防腐剤の量は、異なる防腐剤濃度についてタンパク質との適合性及び防腐剤の有効性を測定することによって決定される。例えば、芳香族アルコール（ベンジルアルコールなど）である場合、防腐剤は、約０．１〜２．０％、好ましくは約０．５〜１．５％、最も好ましくは約１．０〜１．２％の量で存在することができる。好ましくは、再構成製剤は、１バイアルあたりサイズ＞１０μｍの粒子が６０００個未満である。
治療への使用

【0152】

本明細書に記載の糖鎖改変抗体は、がんを有する患者の治療に適用できる。治療方法は、患者に有効量の本発明の糖鎖改変抗体又は医薬組成物を投与することを含む。がんの例には、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫及び成熟Ｂ細胞腫瘍、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、低悪性度，中悪性度及び高悪性度（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、リンパ節辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、有毛細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性疾患、ワルデンストロームのマクログロブリン血症、及び未分化大細胞型リンパ腫（ＡＬＣＬ）が含まれるが、これらに限定されない。

【0153】

特定の実施形態において、上記がんは、非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。

【0154】

さらに、本明細書に記載の糖鎖改変抗体は、自己免疫疾患又は炎症性疾患を有する患者の治療に適用できる。治療方法は、患者に有効量の本発明の糖鎖改変抗体又は医薬組成物を投与することを含む。自己免疫又は炎症性疾患の例には、慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経障害、重症筋無力症、血管炎、糖尿病、レイノー症候群、クローン病、潰瘍性大腸炎、胃炎、橋本甲状腺炎、強直性脊椎炎、Ｃ型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎、慢性局所脳炎、水疱性類天疱瘡、血友病Ａ、膜増殖性糸球体腎炎、成人及び若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎、慢性じんましん、原発性胆汁性肝硬変、視神経脊髄炎、グレイブス甲状腺機能亢進症、水疱性類天疱瘡、膜増殖性糸球体腎炎、チャーグシュトラウス症候群、喘息、乾癬性関節炎、皮膚炎、呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、ブドウ膜炎、湿疹、アテローム性動脈硬化症、白血球接着不全、若年発症糖尿病、ライター病、ベーチェット病、溶血性貧血、アトピー性皮膚炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全、急性感染性単核球症、ＨＩＶ及びヘルペス関連疾患、全身性硬化症、シェーグレン症候群と糸球体腎炎、皮膚筋炎、ＡＮＣＡ、再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、固形臓器移植拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、自己免疫性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）、ギランバレー症候群、大血管血管炎、巨細胞（タカヤス）動脈炎、中型血管炎、川崎病、結節性多発動脈炎が含まれるが、これらに限定されない。

【0155】

特定の実施形態では、自己免疫疾患又は炎症性疾患は慢性関節リウマチである。

【0156】

これらの治療方法において、糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体は、単独で、又は二次抗体などの二次治療剤、あるいは化学療法剤又は免疫抑制剤と組み合わせて投与することができる。二次抗体は、ＣＤ２０もしくは異なるＢ細胞抗原、又はＮＫもしくはＴ細胞抗原に結合することができる。

【0157】

以下の特定の実施例を用いて本発明の実施形態をさらに説明する。当業者に理解できるように、以下の実施例は説明のものに過ぎず、本発明の範囲から逸脱することなく他の修正及び変形が可能であることを理解するであろう。例えば、本発明のＥｎｄｏＳ２変異体は、抗体を含む如何なる糖タンパク質又は糖ペプチドの糖鎖工学処理に使用され得る。本明細書に記載の具体例は抗ＣＤ２０抗体を使用する。しかし、当業者であれば、他の糖タンパク質又は抗体も同様に使用できることを理解すべきである。
材料及び方法

【0158】

モノクローナル抗体リツキシマブは、商業的供給源から購入されるか又は自主製造される。高マンノース型、ハイブリッド型及び複合型のＮ−グリカンは、以前に報告された手順に従って合成された（２０、２１）。

【0159】

ＥｎｄｏＳ２及び変異体のクローン構築、過剰発現及び精製

【0160】

化膿レンサ球菌ＧＡＳ ＮＺ１３１由来のＥｎｄｏＳ２コード遺伝子であるｎｄｏＳ２を合成し、ｐＥＴ２８ａ発現ベクターにサブクローニングした。ｎｄｏＳ２のシグナルペプチド配列（アミノ酸１〜３６）のＮ末端は、Ｈｉｓ６タグによって置き換えられた。製造業者の説明書（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｎｄｏＳ２発現ベクターをテンプレート、所望の変異を含むオリゴヌクレオチド対をプライマーとして用いてＰＣＲ反応を実施した）に従って部位特異的変異誘発によりｎｄｏＳ２の変異体を生成させる。次に、増幅したＤＮＡをＤｐｎＩで処理し、ＤＨ５αコンピテントセルに形質転換した。変異配列をＤＮＡ配列決定（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）によって確認した。発現のためにＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換した後、細胞を０．１ｍＭイソプロピル−Ｐ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、Ｈｉｓ６タグを有する組換えＥｎｄｏＳ２変異タンパク質を２０℃で１６時間発現させ、６５００ｒｐｍで３０分間の遠心分離によりペレット化した。細胞を溶解緩衝液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）中に再懸濁し、そして超音波処理装置を用いて破砕した（１０分間、４秒オン／５秒オフ、Ｃｈｒｏｍ Ｔｅｃｈ）。全細胞溶解物を１００００ｒｐｍで４５分間遠心分離し、可溶性組換えＥｎｄｏＳ２及び変異体タンパク質を、Ｎｉ - ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた固定化金属イオンクロマトグラフィーによって精製した。アミコン超遠心フィルター１０ｋＤａにより溶出したタンパク質を収集し、貯蔵緩衝液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）において濃縮した。濃縮タンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、タンパク質濃度をＮａｎｏ−Ｄｒｏｐ ２０００ｃ分光光度計を使用して定量した。野生型ＥｎｄｏＳ２の過剰発現の収率は約３５ｍｇ／Ｌであり、変異体の収率は約２５ ｍｇ ／ Ｌであった。
市販のリツキシマブを用いたＧｌｃＮＡｃ-リツキシマブの調製。

【0161】

リツキシマブ（２．５ｍｇ、商業的供給源）を１．２５ｍｌ ５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、３７°ＣでＥｎｄｏＳ２（１２５μｇ）及びフコシダーゼ（２．５ｍｇ）と共に２２時間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により重鎖上のＮ−グリカンが完全に切り取られたと確認された後、反応混合物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）で予め平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−アガロース樹脂カラム上のアフィニティークロマトグラフィーにかけた。洗浄後、結合したＩｇＧを１０ｍｌの５０ｍＭグリシンＨＣｌ ｐＨ３．０で溶出した。溶出画分を直ちに１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．３）で中和し、遠心濾過（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ）により濃縮してＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ（１．９３ｍｇ）を得た。生成物をトリプシン処理し、糖ペプチド（ＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ及びＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）をナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して、ＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブのグリコシル化パターンを確認した。
グリカン−オキサゾリンの調製

【0162】

それぞれのグリカン（３〜５ｍｇ）の溶液、２-クロロ-１，３-ジメチルイミダゾリニウムクロリド（ＤＭＣ）（６〜１０ｍｇ）、及びＥｔ_３Ｎ（１０〜２０ｕＬ）を水（３００〜５００ｕＬ）に溶解し、４°Ｃで１時間撹拌した。反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通過させ、ゲル濾過クロマトグラフィーにより０．０５％ＥｔＮ水溶液で溶出する。生成物Ｇ１〜Ｇ１６（グリカンオキサゾリン）を含有する画分を合わせ、凍結乾燥して白色粉末（２．５〜４ｍｇ、収率約８０〜９０％）を得た。
ＥｎｄｏＳ２及びその変異体の加水分解活性のアッセイ

【0163】

５２μΜリツキシマブ（４００μｇ）及び５２ｎＭ ＥｎｄｏＳ２（又はその選択された変異タンパク質）を含む溶液を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、７００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。所定の時点で、２μｇの試料を採取し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。加水分解したグリカンを有するリツキシマブは、ＰＡＧＥ上での移動がより速い。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ上のバンドの強度に基づいて、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いて加水分解生成物の相対百分率を計算した（図３）。
ＳＣＴ−オキサゾリンを供与体基質として用いたＥｎｄｏＳ２及びその変異体のトランスグリコシル化活性のアッセイ

【0164】

６７．５μΜモノＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ（４００μｇ）及び２．５ｍＭシアル化複合型グリカン（ＳＣＴ）−オキサゾリン（２００μｇ）を１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、６７．５ｎＭ ＥｎｄｏＳ２（又はその選択された変異タンパク質）と共に７００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。所定の時点で、２μｇの試料を採取し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。グリコシル化リツキシマブは、ＰＡＧＥ上での移動がより遅い。ＳＤＳ-ＰＡＧＥ上のバンドの強度に基づいて、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを用いてリツキシマブ−ＳＣＴの相対百分率を計算した。
ＥｎｄｏＳ２変異体を用いた種々のグリカンオキサゾリンを含むＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブに対するトランスグリコシル化

【0165】

一般手順：ＥｎｄｏＳ２変異体（１６．８μΜ）とＧｌｃＮＡｃ−リツキシマブ（２ ｍｇ、０．３３７ｍＭ）との混合物を溶解した１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にグリカンオキサゾリン（２〜３ｍｇ）を加え、３７°Ｃ、７００ｒｐｍで振盪しながら１〜２時間インキュベートした。０．１ｍＭのＥＤＴＡ溶液を加えて反応を停止した。プロテインＡアフィニティーカラムにより反応混合物を精製し、次いで、陰イオン交換カラムｃａｐｔｏ Ｑにより所望の生成物である糖鎖改変抗ＣＤ２０リツキシマブを収集した。生成物をトリプシン処理し、糖ペプチド（ＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲ及びＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）をナノスプレーＬＣ／ＭＳを用いて分析して所望のグリコシル化パターンを確認した。

【0166】

表７には、リツキシマブグライコフォームのそれぞれの調製について最適化された反応条件を示す。

【0167】

【表7】

【0168】

ＦｃγＲＩＩＩＡに対する糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体の結合親和性
ＥＬＩＳＡによりＦｃγＩＩＡ受容体に対するリツキシマブの再構築グライコフォームの親和性を調べた。

【0169】

マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）９６ウェル透明平底ポリスチレンハイバインド、＃９０１８）を、５０ｍＭ重炭酸塩／炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ１０）で希釈した５０ｎｇ／ウェルの組換え可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡで４℃でコーティングし、一夜放置した。次いでプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、５％ＢＳＡを含むＰＢＳＴで室温で反応を１時間ブロックした。糖鎖改変抗体（Ｒｔｘ Ｇ１−Ｇ１６）の結合活性を出発濃度１００μｇ／ｍｌ（２％のＢＳＡ／ＰＢＳＴ）で連続８倍希釈することで測定した。プレートを室温で１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、各ウェルに西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した１００μｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ（２％ ＢＳＡ／ＰＢＳＴ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｅ、＃１０９-０３５-０８８）を加え、室温で３０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、各ウェルに１００μｌのＴＭＢ基質（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ＃００−４２０１−５６）を加え、得られたプレートを室温で暗所で１５分間インキュベートした。ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで吸光度の値を測定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ， ＵＳＡ）。
糖鎖改変抗ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣ活性

【0170】

カルセイン放出アッセイにより抗体媒介ＡＤＣＣを評価した。標的細胞として、ＢＣＲＣからＲａｊｉ細胞（ヒトバーキットリンパ腫細胞株）を入手した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して健康なボランティアの血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として分離した。１０μＭカルセイン−アセトキシメチルエステル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標的細胞（１×１０^６／ｍｌ）を３７°Ｃで３０分間標識した。洗浄した後、標識した標的細胞を１×１０^４細胞／ウェル（５０μｌ）の密度で９６ウェルプレートに分布した。様々な濃度の抗体及び２５：１のＥ ／ Ｔ比のエフェクター細胞（２．５×１０^５／ウェル）を加えた。３７°Ｃで４時間インキュベートした後、細胞を遠心分離によって沈降させ、１５０μｌの上清を回収し、蛍光マイクロプレートリーダーにより分析してカルセインの放出を測定した。最大放出のために、細胞を１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で溶解した。実験結果の蛍光値から培地バックグラウンドの蛍光値を差し引いた。

【0171】

本発明を限られた数の実施形態に関して説明してきたが、当業者であれば、本明細書に開示した本発明の範囲から逸脱しない他の実施形態を想到できることを理解するであろう。 したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。

【0172】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]