特許 6966424 軟骨ホーミングペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6966424

(24)【登録日】2021年10月25日

(45)【発行日】2021年11月17日

(54)【発明の名称】軟骨ホーミングペプチド

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/16 20060101AFI20211108BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20211108BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20211108BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20211108BHJP

   A61K 47/66 20170101ALI20211108BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 38/00 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 31/56 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20211108BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 19/06 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211108BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20211108BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/16ZNA

   C07K14/435

   A61K47/64

   A61K38/08

   A61K38/10

   A61K47/65

   A61K47/66

   C07K19/00

   A61K49/00

   A61K38/00

   A61K31/7088

   A61K31/56

   A61K45/00

   A61K39/395 N

   A61K39/395 D

   A61K38/43

   A61K38/18

   A61P19/02

   A61P19/06

   A61P29/00 101

   A61P35/00

   A61P31/00

   A61P17/06

   A61P43/00 101

   A61P43/00 111

   !C12N15/12

【請求項の数】36

【全頁数】161

(21)【出願番号】特願2018-510741(P2018-510741)

(86)(22)【出願日】2016年9月9日

(65)【公表番号】特表2018-527348(P2018-527348A)

(43)【公表日】2018年9月20日

(86)【国際出願番号】US2016051166

(87)【国際公開番号】WO2017044894

(87)【国際公開日】20170316

【審査請求日】2019年8月28日

(31)【優先権主張番号】62/278,929

(32)【優先日】2016年1月14日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/216,331

(32)【優先日】2015年9月9日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/385,734

(32)【優先日】2016年9月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506139369

【氏名又は名称】フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター

(73)【特許権者】

【識別番号】516081124

【氏名又は名称】ブレイズ バイオサイエンス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】オルソン， ジェイムズ

(72)【発明者】

【氏名】ストランド， アンドリュー デイビッド

(72)【発明者】

【氏名】ジラード， エミリー ジュン

(72)【発明者】

【氏名】ストロング， ローランド

(72)【発明者】

【氏名】メリン， クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】コレンティ， コリン

(72)【発明者】

【氏名】ネアーン， ナタリー

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０１３３３０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０９３４０６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５０５４４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０７５６９９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−０２３９９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１６／２１０３７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 J. Orthop. Res. (2013) vol.31, issue 7, p.1053-1058

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ｃ０７Ｋ １４／４３５

Ｃ１２Ｎ １５／１２

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチドを含んでなる組成物であって、前記ペプチドが、
ａ）配列番号３２７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または少なくとも２８アミノ酸残基および少なくとも６つのシステイン残基を含んでなるその機能的断片、あるいは
ｂ）配列番号１１１、配列番号３２５、配列番号１０９、配列番号２３８、配列番号２２、配列番号４１６、配列番号２００、配列番号４２１、配列番号２０５、配列番号３２６、配列番号１１０、配列番号２３９、配列番号２３、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号２４２もしくは配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または少なくとも２８アミノ酸残基および少なくとも６つのシステイン残基を含んでなるその機能的断片
を含んでなり、前記ペプチドがノットペプチドを含んでなり、前記ペプチドが、軟骨にホーミング、標的化、移動、蓄積、結合、保持、または指向化される、組成物。

【請求項2】

前記ペプチドが、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含んでなる、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記ペプチドが、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、または少なくとも３７残基を含んでなる、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ペプチドが、少なくとも３０残基を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ペプチドが、活性薬剤に連結される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記活性薬剤が、治療薬、検出可能剤またはそれらの組み合わせを含んでなる、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記活性薬剤が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学薬剤、フルオロフォア、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫修飾物質、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性化学、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン薬、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５または６に記載の組成物。

【請求項8】

前記ステロイドが、デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロンまたはそれらの任意の組み合わせを含んでなる、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記プロテアーゼ阻害剤が、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、またはマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでなる、請求項７または８に記載の組成物。

【請求項10】

前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ１３である、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記ペプチドが、検出可能剤、治療薬またはそれらの組み合わせにさらに連結される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物またはその塩と、薬学的に許容できる担体とを含んでなる、医薬組成物。

【請求項13】

前記医薬組成物が、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、患部内への局所的投与、関節内への投与またはそれらの任意の組み合わせのために製剤化される、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

それを必要とする対象における疾患または病状を治療する方法における使用のための組成物であって、前記組成物は、ペプチドを含んでなり、前記ペプチドが、
ａ）配列番号３２７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または少なくとも２８アミノ酸残基および少なくとも６つのシステイン残基を含んでなるその機能的断片、あるいは
ｂ）配列番号１１１、配列番号３２５、配列番号１０９、配列番号２３８、配列番号２２、配列番号４１６、配列番号２００、配列番号４２１、配列番号２０５、配列番号３２６、配列番号１１０、配列番号２３９、配列番号２３、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号２４２もしくは配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または少なくとも２８アミノ酸残基および少なくとも６つのシステイン残基を含んでなるその機能的断片
を含んでなり、前記ペプチドがノットペプチドを含んでなり、前記組成物が、投与に続いて、前記対象の軟骨に、ホーミング、標的化または移動する、組成物。

【請求項15】

前記ペプチドが、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含んでなる、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

前記ペプチドが、活性薬剤に連結される、請求項１４または１５に記載の組成物。

【請求項17】

前記活性薬剤が、治療薬、検出可能剤またはそれらの組み合わせを含む、請求項１６に記載の組成物。

【請求項18】

前記活性薬剤が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学薬剤、フルオロフォア、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫修飾物質、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性化学、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン薬、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６または１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記疾患または病状が軟骨の機能に関連する、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記疾患または病状が関節炎または狼瘡の一種である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

関節炎のタイプが関節リウマチ、変形性関節症、痛風、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記組成物がさらに、がんまたは病的領域、組織、構造または細胞を、前記それを必要とする対象の軟骨において検出することにおける使用のためのものである、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

前記疾患または前記病状が、前記それを必要とする対象の軟骨におけるがんまたは病的領域、組織、構造または細胞であり、前記がんまたは病的領域、組織、構造または細胞が、軟骨腫、脊索腫または軟骨肉腫である、請求項２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記方法が、前記対象のがんまたは病的領域、組織、構造または細胞を除去するための手術を行うことをさらに含む、請求項２２または２３に記載の組成物。

【請求項25】

それを必要とする対象の臓器または身体領域をイメージングする方法における使用のための組成物であって、
前記組成物が、活性薬剤に連結されたペプチドを含んでおり、
前記ペプチドが、
ａ）配列番号３２７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または少なくとも２８アミノ酸残基および少なくとも６つのシステイン残基を含んでなるその機能的断片、あるいは
ｂ）配列番号１１１、配列番号３２５、配列番号１０９、配列番号２３８、配列番号２２、配列番号４１６、配列番号２００、配列番号４２１、配列番号２０５、配列番号３２６、配列番号１１０、配列番号２３９、配列番号２３、配列番号２４３、配列番号２７、配列番号２４２もしくは配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または少なくとも２８アミノ酸残基および少なくとも６つのシステイン残基を含んでなるその機能的断片
を含んでなり、前記ペプチドがノットペプチドを含んでなり、前記組成物が、投与に続いて、前記対象の軟骨に、ホーミング、標的化または移動する、組成物。

【請求項26】

前記ペプチドが、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含んでなる、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記活性薬剤が、検出可能剤をさらに含む、請求項２５または２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記活性薬剤が、治療薬をさらに含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

前記活性薬剤が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学薬剤、フルオロフォア、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫修飾物質、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性化学、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン薬、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

前記その必要のある対象が、軟骨の機能に関連する疾患または病状を有する、請求項２５〜２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記疾患または病状が関節炎または狼瘡の一種である、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

関節炎のタイプが関節リウマチ、変形性関節症、痛風、強直性脊椎炎または乾癬性関節炎である、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記方法が、がんまたは病的領域、組織、構造または細胞を、前記その必要のある対象の軟骨において検出することをさらに含む、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項34】

前記方法が、前記がんを治療することをさらに含み、前記がんまたは病的領域、組織、構造または細胞が、軟骨腫、脊索腫または軟骨肉腫である、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

前記方法が、前記対象の前記がんまたは前記病的領域、組織、構造または細胞を除去するための手術を行うことをさらに含む、請求項３４に記載の組成物。

【請求項36】

前記ペプチドが配列番号３２７である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その各内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１５年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／２１６，３３１号明細書；２０１６年１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／２７８，９２９号明細書；および２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，７３４号明細書に関連する。

【背景技術】

【0002】

軟骨は、主にコラーゲンプロテオグリカン（例えば、アグリカン）、および弾性繊維をはじめとする細胞外マトリックス構成成分を産生する、特化した細胞型である軟骨細胞を含んでなる。細胞外マトリックスタンパク質は、関節、耳、鼻、および気管などの身体の軟骨に富む部分に、支持、クッション、および耐久性を提供する。軟骨は、血管を含有しない体内の少数の組織の１つであり、無血管組織と見なされる。血液の流れと拡散の組み合わせに依存する体内の多くの細胞とは異なり、軟骨細胞は拡散に依存する。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

軟骨は直接的な血液供給を有しないので、それは他の結合組織と比較して、はるかにより緩慢に成長し修復される。その結果、軟骨障害は、特に治療が困難である。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は、軟骨障害を治療するための組成物および方法に関する。本明細書に記載されるのは、対象における投与に続いて、軟骨に、ホーミング、移動、蓄積、結合、保持、または指向化、および／または結合するペプチドである。いくつかの実施形態では、本開示のホーミングペプチドは、軟化を画像化および／または診断するために検出剤を送達するために使用される。その他の実施形態では、本開示のホーミングペプチドは、活性薬剤を用いて、領域、組織、構造、またはその細胞に送達される。

【0005】

様々な態様において、本開示はノットペプチドを提供し、その中ではノットペプチドは、対象に投与時に、対象の軟骨に、ホーミング、標的化、移動、蓄積、結合、保持、または指向化される。

【0006】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる。その他の態様では、ノットペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６のいずれか１つと、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる。なおも別の態様では、ノットペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる。

【0007】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる。その他の態様では、ノットペプチドは、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つと、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる。なおも別の態様では、ノットペプチドは、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる。

【0008】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、配列番号１〜配列番号２０のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる。その他の態様では、ノットペプチドは、配列番号２１７〜配列番号２３６のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる。

【0009】

その他の態様では、ノットペプチドは、配列番号４３６〜配列番号４８２のいずれか１つと、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である。さらなる態様では、請求項１０に記載のノットペプチドであり、その中でノットペプチドは配列番号２４である。その他の態様では、ノットペプチドは、配列番号１１１である。

【0010】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、４つ以上のシステイン残基を含んでなる。さらなる態様では、ノットペプチドは、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含んでなり、その中でジスルフィド架橋の１つは、２つの他のジスルフィド架橋によって形成されたループを通過する。なおもさらなる態様では、ノットペプチドは、システイン残基間に形成される複数のジスルフィド架橋を含んでなる。その他の態様では、ノットペプチドは、ジスルフィドノットを通じてジスルフィドを含んでなる。

【0011】

いくつかの態様では、ノットペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基はＬ立体配置であり、またはその中でノットペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基はＤ立体配置である。

【0012】

いくつかの態様では、配列は、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、または少なくとも８１残基を含む。

【0013】

いくつかの態様では、任意の１つまたは複数のＫ残基はＲ残基によって置換され、またはその中で任意の１つまたは複数のＲ残基はＲ残基によって置換される。その他の態様では、任意の１つまたは複数のＭ残基は、Ｉ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置換される。なおも別の態様では、任意の１つまたは複数のＬ残基は、Ｖ、Ｉ、またはＭ残基のいずれか１つによって置換される。

【0014】

その他の態様では、任意の１つまたは複数のＩ残基は、Ｍ、Ｌ、またはＶ残基のいずれかによって置換される。なおも別の態様では、任意の１つまたは複数のＶ残基は、Ｍ、Ｉ、またはＬ残基のいずれかによって置換される。いくつかの態様では、任意の１つまたは複数のＧ残基は、Ａ残基によって置換され、またはその中では任意の１つまたは複数のＡ残基は、Ｇ残基によって置換される。その他の態様では、任意の１つまたは複数のＳ残基は、Ｔ残基によって置換され、またはその中では、任意の１つまたは複数のＴ残基はＳ残基によって置換される。

【0015】

なおも別の態様では、任意の１つまたは複数のＱ残基は、Ｎ残基によって置換され、またはその中では任意の１つまたは複数のＮ残基は、Ｑ残基によって置換される。いくつかの態様では、任意の１つまたは複数のＤ残基は、Ｅ残基によって置換され、またはその中では任意の１つまたは複数のＥ残基は、Ｄ残基によって置換される。

【0016】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、酸性領域および塩基性領域を構成する電荷分布を有する。さらなる態様では、酸性領域はｎｕｂである。その他の態様では、塩基性領域はパッチである。いくつかの態様では、ノットペプチドは、６つ以上の塩基性残基および２つ以下の酸性残基を含んでなる。いくつかの態様では、ノットペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基と少なくとも２つの正電荷アミノ酸残基とを含有する、４〜１９アミノ酸残基断片を含んでなる。

【0017】

その他の態様では、ノットペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基と、２つ以下の塩基性残基と、少なくとも２個の正電荷アミノ酸残基とを含有する、２０〜７０アミノ酸残基断片を含んでなる。なおも別の態様では、ノットペプチドは、少なくとも３つの正電荷アミノ酸残基を含んでなる。いくつかの態様では、正電荷アミノ酸残基は、Ｋ、Ｒ、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0018】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、生理学的ｐＨにおいて２を超える電荷を有する。その他の態様では、ノットペプチドは、生理学的ｐＨにおいて３．５を超える電荷を有する。なおも別の態様では、ノットペプチドは、生理学的ｐＨにおいて４．５を超える電荷を有する。いくつかの態様では、ノットペプチドは、生理学的ｐＨにおいて５．５を超える電荷を有する。その他の態様では、ノットペプチドは、生理学的ｐＨにおいて６．５を超える電荷を有する。その他の態様では、ノットペプチドは、生理学的ｐＨにおいて７．５を超える電荷を有する。

【0019】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、カリウムチャネル作動薬、カリウムチャネル拮抗薬、カリウムチャネルの一部、ナトリウムチャネル作動薬、ナトリウムチャネル拮抗薬、カルシウムチャネル作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ハドルカルシン、セラホトキシン、フエントキシン、カリオトキシン、コバトキシンまたはレクチンから選択される。

【0020】

さらなる態様では、レクチンはＳＨＬ−Ｉｂ２である。いくつかの態様では、ノットペプチドは、少なくとも１つの他のノットペプチドを有する多量体構造に配置される。

【0021】

いくつかの態様では、ノットペプチドの少なくとも１つの残基は、化学修飾を含んでなる。さらなる態様では、化学修飾は、ノットペプチドのＮ末端をブロックする。よりさらなる態様では、化学修飾は、メチル化、アセチル化、またはアシル化である。その他の態様では、化学修飾は、１つまたは複数のリジン残基またはそれらの類似体のメチル化；Ｎ末端のメチル化；または１つまたは複数のリジン残基または類似体それらのメチル化およびＮ末端のメチル化である。いくつかの態様では、ノットペプチドはアシル付加物に連結される。

【0022】

いくつかの態様では、ノットペプチドは活性薬剤に連結される。さらなる態様では、活性薬剤は、ノットペプチドのＮ末端またはＣ末端ノットペプチドと融合される。いくつかの態様では、活性薬剤は、抗体である。他の態様では、活性薬剤は、Ｆｃ領域である。なおも他の態様では、ノットペプチドはＦｃ領域と融合し、連続配列を含む。

【0023】

さらなる態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９，または１０の活性薬剤がノットペプチドに連結される。なおもさらなる態様では、ノットペプチドは、切断可能リンカーを介して活性薬剤に連結している。いくつかの態様では、ノットペプチドは、リンカーによって、ノットペプチドのＮ末端で、内部リジン残基のεアミンで、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸で、またはＣ末端で、活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、ノットペプチドは、非天然アミノ酸をさらに含んでなり、その中で非天然アミノ酸は、挿入、付加、または別のアミノ酸への置換である。

【0024】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、リンカーによって、非天然アミノ酸で活性薬剤に連結される。いくつかの態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、炭酸結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合、または炭素−窒素結合を含んでなる。さらなる態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、またはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む。その他の態様では、リンカーは加水分解的に不安定なリンカーである。なおも別の態様では、ノットペプチドは、切断不能リンカーを介して活性薬剤に連結している。

【0025】

いくつかの態様では、活性薬剤は、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学薬剤、フルオロフォア、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫修飾物質、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性化学、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン薬、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせである。

【0026】

いくつかの態様では、ＮＳＡＩＤはケトロラックである。その他の態様では、ＮＳＡＩＤはイブプロフェンである。いくつかの態様では、ステロイドはデキサメタゾンである。その他の態様では、ステロイドはブデソニドである。いくつかの態様では、活性薬剤は、プログラム細胞死を誘導する。さらなる態様では、プログラム細胞死はアポトーシスである。いくつかの態様では、活性薬剤は腫瘍壊死因子α阻害剤である。さらなる態様では、活性薬剤はＴＮＦ受容体ファミリー賦活剤である。なおもさらなる態様では、活性薬剤はＴＮＦα抗体である。いくつかの態様では、プロテアーゼ阻害剤は、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、またはマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤である。さらなる態様では、マトリックスメタロプロテアーゼはＭＭＰ１３である。

【0027】

いくつかの態様では、ノットペプチドは検出可能剤に連結している。さらなる態様では、検出可能剤は、ノットペプチドのＮ末端またはＣ末端で、ノットペプチドと融合される。なおさらなる態様では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の検出可能剤がノットペプチドに連結される。いくつかの態様では、ノットペプチドは、切断可能リンカーを介して検出可能剤に連結される。

【0028】

いくつかの態様では、ノットペプチドは、リンカーによって、ノットペプチドのＮ末端で、内部リジン残基のεアミンで、またはＣ末端で、検出可能剤に連結される。さらなる態様では、ペプチドは、非天然アミノ酸をさらに含んでなり、その中で非天然アミノ酸は、挿入、付加、または別のアミノ酸への置換である。なおもさらなる態様では、ノットペプチドは、リンカーによって、非天然アミノ酸で活性薬剤に連結される。

【0029】

なおもさらなる態様では、リンカーは、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、または炭素−窒素結合を含んでなる。いくつかの態様では、切断可能なリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、またはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含む。その他の態様では、ノットペプチドは、切断不能リンカーを介して検出可能剤に連結している。

【0030】

いくつかの態様では、検出可能剤は、フルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体、または放射性核種キレート剤である。さらなる態様では、検出可能剤は蛍光染料である。いくつかの態様では、ノットペプチドは、約９の等電点を有する。

【0031】

いくつかの態様では、ノットペプチドは配列番号２４である。その他の態様では、ノットペプチドは、配列番号１１１である。

【0032】

様々な態様において、本開示は、上記の組成物のいずれかまたはその塩と、薬学的に許容できる担体とを含んでなる、医薬組成物を提供する。

【0033】

さらなる態様では、医薬組成物は、対象への投与のために製剤化される。なおもさらなる態様では、医薬組成物は、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、またはそれらの組み合わせのための製剤である。

【0034】

様々な態様において、本開示は、上記の組成物のいずれかを構成するノットペプチドまたは上記の医薬組成物のいずれかを対象に投与するステップを含んでなる、それを必要とする対象において、病状を治療する方法を提供する。

【0035】

いくつかの態様では、組成物は、吸入、鼻腔内、経口的、局所的、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、またはそれらの組み合わせによって投与される。さらなる態様では、組成物は、投与に続いて、対象の軟骨に、ホーミング、標的化、または移動する。

【0036】

いくつかの態様では、病状は、軟骨の機能に関連する。いくつかの局面では、病状は、炎症、がん、分解、成長障害、遺伝性、裂傷、感染症、または傷害である。その他の態様では、病状は軟骨異栄養症である。なおも別の態様では、病状は、外傷性断裂または脱離である。いくつかの態様では、病状は肋軟骨炎である。その他の態様では、病状はヘルニア形成である。なおも別の態様では、病状は多発性軟骨炎である。

【0037】

その他の態様では、病状は脊索腫である。いくつかの態様では、病状は関節炎の一種である。さらなる態様では、関節炎のタイプは関節リウマチである。その他の態様では、関節炎のタイプは変形性関節症である。いくつかの態様では、病状は軟骨無形成症である。いくつかの態様では、がんは、良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫である。その他の態様では、病状は、滑液包炎、腱炎、痛風、偽痛風、関節症、または感染症である。

【0038】

いくつかの態様では、組成物は、傷害を治療するために、傷害によって損傷を受けた組織を修復するために、または傷害によって引き起こされた疼痛を治療するために投与される。さらなる態様では、組成物は、裂傷を治療するために、または裂傷によって損傷を受けた組織を修復するために投与される。

【0039】

様々な態様では、本開示は、前述のノットペプチドのいずれか１つの組成物または前述の医薬組成物を対象に投与するステップと；および対象をイメージングするステップとを含んでなる、対象の臓器または身体領域をイメージングする方法を提供する。

【0040】

いくつかの態様では、方法は、がんまたは病的領域、組織、構造または細胞を検出するステップをさらに含んでなる。さらなる態様では、方法は、対象に外科手術を実施するステップを含んでなる。さらなる態様では、方法は、がんを治療するステップを含んでなる。

【0041】

他の態様では、外科手術は、対象のがんまたは病的領域、組織、構造または細胞を除去するステップを含んでなる。さらに他の態様では、方法は、外科的除去の後に、対象のがんまたは病的領域、組織、構造、または細胞をイメージングするステップをさらに含んでなる。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
対象への投与時に、対象の軟骨にホーミング、標的化、移動、蓄積、結合、保持、または指向化される、ノットペプチドを含んでなる組成物。
（項目２）
前記ノットペプチドが、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記ノットペプチドが、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６のいずれか１つと、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目４）
前記ノットペプチドが、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目５）
前記ノットペプチドが、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目６）
前記ノットペプチドが、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つと、少なくとも８０％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記ノットペプチドが、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つと、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目８）
前記ノットペプチドが、配列番号１〜配列番号２０のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目９）
前記ノットペプチドが、配列番号２１７〜配列番号２３６のいずれか１つの配列またはその断片を含んでなる、項目１に記載の組成物。
（項目１０）
前記ノットペプチドが、配列番号４３６〜配列番号４８２のいずれか１つと、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％同一である、項目１に記載の組成物。
（項目１１）
前記ノットペプチドが配列番号２４である、項目１０に記載のノットペプチド。
（項目１２）
前記ノットペプチドが配列番号１１１である、項目１０に記載のノットペプチド。
（項目１３）
前記ノットペプチドが、４つ以上のシステイン残基を含んでなる、項目１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
前記ノットペプチドが、システイン残基間に形成された３つ以上のジスルフィド架橋を含んでなり、前記ジスルフィド架橋の１つが、他の２つのジスルフィド架橋によって形成
されたループを通過する、項目１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記ノットペプチドが、システイン残基間に形成された複数のジスルフィド架橋を含んでなる、項目１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記ノットペプチドが、ジスルフィドノットを介してジスルフィドを含んでなる、項目１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記ノットペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基がＬ立体配置であるか、または前記ノットペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基がＤ立体配置である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記配列が、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０、少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８残基、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも６１、少なくとも６２、少なくとも６３、少なくとも６４、少なくとも６５、少なくとも６６、少なくとも６７、少なくとも６８、少なくとも６９、少なくとも７０、少なくとも７１、少なくとも７２、少なくとも７３、少なくとも７４、少なくとも７５、少なくとも７６、少なくとも７７、少なくとも７８、少なくとも７９、少なくとも８０、または少なくとも８１残基を含んでなる、項目１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
任意の１つまたは複数のＫ残基がＲ残基によって置換され、または任意の１つまたは複数のＲ残基がＫ残基によって置換される、項目１〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
任意の１つまたは複数のＭ残基が、Ｉ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置換される、項目１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１）
任意の１つまたは複数のＬ残基が、Ｖ、Ｉ、またはＭ残基のいずれか１つによって置換される、項目１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
任意の１つまたは複数のＩ残基が、Ｍ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置換される、項目１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
任意の１つまたは複数のＶ残基が、Ｍ、Ｉ、またはＬ残基のいずれか１つによって置換される、項目１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
任意の１つまたは複数のＧ残基がＡ残基によって置換され、または任意の１つまたは複数のＡ残基がＧ残基によって置換される、項目１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５）
任意の１つまたは複数のＳ残基がＴ残基によって置換され、または任意の１つまたは複
数のＴ残基がＳ残基によって置換される、項目１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６）
任意の１つまたは複数のＱ残基がＮ残基によって置換され、または任意の１つまたは複数のＮ残基がＱ残基によって置換される、項目１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７）
任意の１つまたは複数のＤ残基がＥ残基によって置換され、または任意の１つまたは複数のＥ残基がＤ残基によって置換される、項目１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２８）
前記ノットペプチドが、酸性領域と塩基性領域とを構成する電荷分布を有する、項目１〜２７のいずれか一項に記載のノットペプチド。
（項目２９）
前記酸性領域がｎｕｂである、項目２８に記載のノットペプチド。
（項目３０）
前記塩基性領域がパッチである、項目２８に記載のノットペプチド。
（項目３１）
前記ノットペプチドが、６つ以上塩基性残基と２つ以下の酸性残基とを含んでなる、項目１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３２）
前記ノットペプチドが、少なくとも２つのシステイン残基と少なくとも２つの正電荷アミノ酸残基とを含有する、４〜１９アミノ酸残基断片を含んでなる、項目１〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３３）
前記ノットペプチドが、少なくとも２つのシステイン残基と２つ以下の塩基性残基と少なくとも２つの正電荷アミノ酸残基とを含有する、２０〜７０アミノ酸残基断片を含んでなる、項目１〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３４）
前記ノットペプチドが、少なくとも３つの正電荷アミノ酸残基を含んでなる、項目１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３５）
前記正電荷アミノ酸残基が、Ｋ、Ｒ、またはそれらの組み合わせから選択される、項目３２〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３６）
前記ノットペプチドが、生理学的ｐＨにおいて２を超える電荷を有する、項目１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３７）
前記ノットペプチドが、生理学的ｐＨにおいて３．５を超える電荷を有する、項目１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３８）
前記ノットペプチドが、生理学的ｐＨにおいて４．５を超える電荷を有する、項目１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３９）
前記ノットペプチドが、生理学的ｐＨにおいて５．５を超える電荷を有する、項目１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４０）
前記ノットペプチドが、生理学的ｐＨにおいて６．５を超える電荷を有する、項目１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４１）
前記ノットペプチドが、生理学的ｐＨにおいて７．５を超える電荷を有する、項目１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４２）
前記ノットペプチドが、カリウムチャネル作動薬、カリウムチャネル拮抗薬、カリウムチャネルの一部、ナトリウムチャネル作動薬、ナトリウムチャネル拮抗薬、カルシウムチャネル作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ハドルカルシン、セラホトキシン、フエントキシン、カリオトキシン、コバトキシンまたはレクチンから選択される、項目１〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４３）
前記レクチンがＳＨＬ−Ｉｂ２である、項目４２に記載の組成物。
（項目４４）
前記ノットペプチドが、少なくとも１つの他のノットペプチドを有する多量体構造に配列される、項目１〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４５）
前記ノットペプチドの少なくとも１つの残基が、化学修飾を含んでなる、項目１〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４６）
前記化学修飾が、前記ノットペプチドのＮ末端をブロックする、項目４５に記載の組成物。
（項目４７）
前記化学修飾が、メチル化、アセチル化、またはアシル化である、項目４５に記載の組成物。
（項目４８）
前記化学修飾が、
１つまたは複数のリジン残基またはそれらの類似体のメチル化；
Ｎ末端のメチル化；または
１つまたは複数のリジン残基またはそれらの類似体のメチル化およびＮ末端のメチル化
である、項目４５に記載のノットペプチド。
（項目４９）
前記ノットペプチドが、アシル付加物に連結される、項目１〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５０）
前記ノットペプチドが、活性薬剤に連結される、項目１〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５１）
前記活性薬剤が、前記ノットペプチドのＮ末端またはＣ末端で、前記ノットペプチドと融合する、項目５０に記載の組成物。
（項目５２）
前記活性薬剤が抗体である、項目５１に記載の組成物。
（項目５３）
前記活性薬剤がＦｃドメインである、項目５１に記載の組成物。
（項目５４）
Ｆｃドメインと融合した前記ノットペプチドが、連続配列を含んでなる、項目５１〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５５）
１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の活性薬剤が、前記ノットペプチドに連結される、項目５１〜５４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５６）
前記ノットペプチドが、切断可能リンカーを介して前記活性薬剤に連結される、項目５１〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５７）
前記ノットペプチドが、リンカーによって、前記ノットペプチドのＮ末端で、内部リジン残基のεアミンで、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボン酸で、またはＣ末端で、前記活性薬剤に連結される、項目５１〜５６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５８）
非天然アミノ酸をさらに含んでなり、前記非天然アミノ酸が、挿入、付加、または別のアミノ酸への置換である、項目５１〜５７のいずれか１項に記載の組成物。
（項目５９）
前記ノットペプチドが、リンカーによって、前記非天然アミノ酸で前記活性薬剤に連結される、項目５８に記載の組成物。
（項目６０）
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、炭酸結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、ジスルフィド結合、チオエステル結合または炭素−窒素結合を含んでなる、項目５１〜５９のいずれか１項に記載の組成物。
（項目６１）
前記切断可能リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、またはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含んでなる、項目６０に記載の組成物。
（項目６２）
前記リンカーが加水分解的に不安定なリンカーである、項目５７〜６１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６３）
前記ノットペプチドが、切断不能リンカーを介して前記活性薬剤に連結される、項目５１〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６４）
前記活性薬剤が、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、抗体断片、アプタマー、サイトカイン、酵素、成長因子、ケモカイン、神経伝達物質、化学薬剤、フルオロフォア、金属、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体、光増感剤、放射線増感剤、放射性核種キレート剤、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫修飾物質、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法剤、細胞毒性化学、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、グルココルチコイド、抗サイトカイン薬、鎮痛剤、デンドリマー、脂肪酸、Ｆｃ領域、またはそれらの組み合わせである、項目５１〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６５）
前記ＮＳＡＩＤがケトロラックである、項目６４に記載の組成物。
（項目６６）
前記ＮＳＡＩＤがイブプロフェンである、項目６４に記載の組成物。
（項目６７）
前記ステロイドがデキサメタゾンである、項目６４に記載の組成物。
（項目６８）
前記ステロイドがブデソニドである、項目６４に記載の組成物。
（項目６９）
前記活性薬剤がプログラム細胞死を誘導する、項目５３〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７０）
前記プログラム細胞死がアポトーシスである、項目６９に記載の組成物。
（項目７１）
前記活性薬剤が腫瘍壊死因子α阻害剤である、項目６９〜７０のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７２）
前記活性薬剤がＴＮＦ受容体ファミリー賦活剤である、項目６９〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７３）
前記活性薬剤がＴＮＦα抗体である、項目６９〜７１のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７４）
前記プロテアーゼ阻害剤が、コラゲナーゼ阻害剤、エラスターゼ阻害剤、またはマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤である、項目６４に記載の組成物。
（項目７５）
前記マトリックスメタロプロテアーゼがＭＭＰ１３である、項目７４に記載の組成物。
（項目７６）
前記ノットペプチドが、検出可能剤に連結される、項目１〜７５のいずれか１項に記載の組成物。
（項目７７）
前記検出可能剤が、前記ノットペプチドのＮ末端またはＣ末端で、前記ノットペプチドと融合する、項目７６に記載の組成物。
（項目７８）
１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の検出可能剤が、前記ノットペプチドに連結される、項目７６〜７７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７９）
前記ノットペプチドが、切断可能リンカーを介して前記検出可能剤に連結される、項目７６〜７８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８０）
前記ノットペプチドが、リンカーによって、前記ノットペプチドのＮ末端で、内部リジン残基のεアミンで、またはＣ末端で、前記検出可能剤に連結される、項目７６〜７９のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８１）
非天然アミノ酸をさらに含んでなり、前記非天然アミノ酸が、挿入、付加、または別のアミノ酸への置換である、項目７６〜８０のいずれか１項に記載の組成物。
（項目８２）
前記ノットペプチドが、リンカーによって、前記非天然アミノ酸で前記活性薬剤に連結される、項目８１に記載の組成物。
（項目８３）
前記リンカーが、アミド結合、エステル結合、カルバメート結合、ヒドラゾン結合、オキシム結合、または炭素−窒素結合を含んでなる、項目７６〜８２のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８４）
前記切断可能リンカーが、マトリックスメタロプロテイナーゼ、トロンビン、カテプシン、またはβ−グルクロニダーゼのための切断部位を含んでなる、項目８３に記載の組成物。
（項目８５）
前記ノットペプチドが、切断不能リンカーを介して前記検出可能剤に連結される、項目７６〜８４のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８６）
前記検出可能剤が、フルオロフォア、近赤外線色素、造影剤、ナノ粒子、金属含有ナノ
粒子、金属キレート、Ｘ線造影剤、ＰＥＴ薬剤、放射性同位体、または放射性核種キレート剤である、項目７６〜８５のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８７）
前記検出可能剤が蛍光染料である、項目７６〜８６のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８８）
前記ノットペプチドが約９の等電点を有する、項目１〜８７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８９）
前記ノットペプチドが配列番号２４である、項目１〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９０）
前記ノットペプチドが配列番号１１１である、項目１〜８８のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９１）
項目１〜９０のいずれか一項に記載の組成物またはその塩と、薬学的に許容できる担体とを含んでなる、医薬組成物。
（項目９２）
前記医薬組成物が、対象への投与のために製剤化される、項目９１に記載の医薬組成物。
（項目９３）
前記医薬組成物が、吸入、鼻腔内投与、経口投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、またはそれらの組み合わせのために製剤化される、項目９１〜９２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目９４）
項目１〜９０のいずれか一項に記載の組成物または項目９１〜９３のいずれか一項に記載の医薬組成物を含んでなるノットペプチドを対象に投与するステップを含んでなる、それを必要とする対象における病状を治療する方法を治療する方法。
（項目９５）
前記組成物が、吸入、鼻腔内、経口、局所、静脈内、皮下、関節内、筋肉内投与、腹腔内、またはそれらの組み合わせによって投与される、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
前記組成物が、投与に続いて、前記対象の軟骨に、ホーミング、標的化、または移動する、項目９４〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目９７）
前記病状が軟骨の機能に関連する、項目９４〜９６のいずれか一項に記載の方法。
（項目９８）
前記病状が、炎症、がん、分解、成長障害、遺伝的、裂傷、感染症、または傷害である、項目９４〜９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記病状が軟骨異栄養症である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記病状が外傷性断裂または離脱である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０１）
前記病状が肋軟骨炎である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記病状がヘルニア形成である、項目９１〜９５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０３）
前記病状が多発性軟骨炎である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０４）
前記病状が脊索腫である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記病状が関節炎の一種である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
関節炎のタイプが関節リウマチである、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
関節炎のタイプが変形性関節症である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記病状が軟骨無形成症である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０９）
前記がんが、良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
病状が、滑液包炎、腱炎、痛風、偽痛風、関節症、または感染症である、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記組成物が、傷害を治療するために、傷害によって受けた組織損傷を修復するために、または傷害によって引き起こされた疼痛を治療するために投与される、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記組成物が、裂傷を治療するために、または裂傷によって損傷を受けた組織を修復するために投与される、項目９４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
項目１〜９０のいずれか一項に記載の組成物、または項目９１〜９３のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与するステップと、
前記対象をイメージングするステップと
を含んでなる、対象の臓器または身体領域をイメージングする方法。
（項目１１４）
がんまたは病的領域、組織、構造または細胞を検出するステップをさらに含んでなる、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記対象において手術を実施するステップをさらに含んでなる、項目１１３〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１６）
前記がんを治療するステップをさらに含んでなる、項目１１３〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記手術が、前記対象のがんまたは病的領域、組織、構造または細胞を除去するステップを含む、項目１１３〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
外科的除去後に、前記対象のがんまたは病的領域、組織、構造、または細胞をイメージングするステップをさらに含んでなる、項目１１７に記載の方法。

【0042】

参照による援用
本明細書で言及され、開示され、または参照される全ての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が、あたかも具体的かつ個別に参照により援用されているかのように、その内容全体が参照により本明細書に援用される。

【0043】

本発明の新規特性は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本開示の特徴および利点のより良い理解は、その中で本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する、以下の詳細な説明およびその添付図面を参照することによって得られるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】図１は、本開示の様々なペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ａは、配列番号２６のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｂは、配列番号２８のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｃは、配列番号２４のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｄは、配列番号２３のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｅは、配列番号２７のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｆは、配列番号２５のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｇは、配列番号２２のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを例す。図１Ｈは、配列番号３１のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｉは、配列番号２１のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｊは、配列番号２９のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｋは、配列番号３０のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｌは、配列番号３２のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。図１Ｍは、配列番号２７のペプチドで処置された動物の軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図2】図２は、配列番号２４のペプチドで処置された動物の関節およびその他の軟骨中の^１４Ｃシグナルの同定を例示する。

【図3】図３は、配列番号２４のペプチドで処置された動物の肋骨、脊髄、およびその他の軟骨中の^１４Ｃシグナルの同定を例示する。

【図4】図４は、配列番号２４のペプチドで処置された動物の鼻、脊髄、気管、およびその他の軟骨中の^１４Ｃシグナル位置の同定を例示する。

【図5】図５は、配列番号２４のペプチドによる処置の２４時間後における、非損傷腎臓を有する動物軟骨中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図6】図６は、本開示のペプチドの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロファイルを示す。図６Ａは、図１Ｄおよび配列番号２３のペプチドのＨＰＬＣプロファイルを示す。図６Ｂは、図１Ｃおよび配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣプロファイルを示す。

【図7】図７は、配列番号２１〜配列番号３３のペプチドの免疫原性プロファイルを示す。

【図8】図８は、図１Ｂおよび配列番号２８のペプチドの三次元構造および線構造を示す。

【図9】図９は、図１Ａ〜１Ｍの配列および配列番号Ｘを発現するコンストラクトの例示的構造を示し、Ｘは、配列番号２１〜配列番号３３のペプチドのいずれか１つであり得る。

【図10】図１０は、本開示のペプチドを製造する方法の概略図を示す。

【図11】図１１は、軟骨にホーミングしない１００ナノモルの放射性標識ＧＳ−ハイナントキシン（ＧＳＫＣＬＰＰＧＫＰＣＹＧＡＴＱＫＩＰＣＣＧＶＣＳＨＮＮＣＴ）（配列番号４３３）ペプチド投与の２４時間後における、マウス切片からの白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１１Ａは、１００ナノモルの配列番号４３３投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図１１Ｂは、^１４Ｃシグナルが、配列番号４３３の放射性標識ペプチドを同定する、図１１Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【図12】図１２は、実施例によって示される軟骨ホーミング体、および配列番号９、配列番号２４、配列番号２３、配列番号２７、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２５、配列番号２１、配列番号３０、配列番号１０、配列番号２９、配列番号３１、配列番号２２、および配列番号３３のアライメントを示す。

【図13】図１３は、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１３Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図１３Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１３Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【図14】図１４は、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１４Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図１４Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１４Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【図15】図１５は、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの冷凍後肢切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１５Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１５Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１５Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１５Ｃは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、オートラジオグラフィー画像を示す。図１５Ｄは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１５Ｅは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１５Ｄに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１５Ｆは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１５Ｇは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１５Ｆに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【図16】図１６は、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの冷凍後肢切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１６Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１６Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１６Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１６Ｃは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１６Ｄは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後における、マウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１６Ｃに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１６Ｅは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１６Ｆは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１６Ｅに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１６Ｇは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、オートラジオグラフィー画像を示す。

【図17】図１７は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウスの白色光画像および対応する全身蛍光画像を示す。図１７Ａは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモル配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図１７Ｂは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウス中の蛍光シグナルを示す、図１７Ａに示される切片に対応する全身蛍光画像を示す。図１７Ｃは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図１７Ｄは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウス中の蛍光シグナルを示す、図１７Ｃに示される切片に対応する全身蛍光画像を示す。図１７Ｅは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図１７Ｆは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウス中の蛍光シグナルを示す、図１７Ｅに示される切片に対応する全身蛍光画像を示す。

【図18】図１８は、Ｃｙ５．５フルオロフォア（配列番号１１１Ａ）にコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチドを投与されたマウスの投与の２４時間後における、白色光画像および対応する全身蛍光画像を示す。図１８Ａは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の画像を示す。図１８Ｂは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の２４時間後における、図１８Ａに示される切片に対応するマウス中の蛍光シグナルを示す。図１８Ｃは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図１８Ｄは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の２４時間後における、図１８Ｃに示される切片に対応するマウス中の蛍光シグナルを示す。図１８Ｅは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図１８Ｆは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の２４時間後における、図１８Ｅに示される切片に対応するマウス中の蛍光シグナルを示す。

【図19】図１９は、Ｃｙ５．５フルオロフォア（配列番号１１１Ａ）にコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチドを投与されたマウスの投与の４８時間後における、白色光画像および対応する全身蛍光画像を示す。図１９Ａは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の４８時間後における、マウスの凍結切片の画像を示す。図１９Ｂは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の４８時間後における、図１９Ａに示される切片に対応するマウス中の蛍光シグナルを示す。図１９Ｃは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の４８時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図１９Ｄは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の４８時間後における、図１９Ｃに示される切片に対応するマウス中の蛍光シグナルを示す。

【図20】図２０は、Ｃｙ５．５フルオロフォア（配列番号１１１Ａ）にコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチドのペプチド（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ）を投与されたマウスの投与の７２時間後における、白色光画像および対応する全身蛍光画像を示す。図２０Ａは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の７２時間後における、マウスの凍結切片の画像を示す。図２０Ｂは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の７２時間後における、図２０Ａに示される切片に対応するマウス中の蛍光シグナルを示す。図２０Ｃは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の７２時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図２０Ｄは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の７２時間後における、図２０Ｃに示される切片に対応するマウス中の蛍光シグナルを示す。

【図21A-D】図２１は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）の投与後における、第１のマウスからの単離された後肢、および第２のマウスからの単離された後肢のＩＶＩＳ蛍光イメージングを示す。低シグナル強度の領域は細い実線で示され、中シグナル強度の領域は太い販売線（ｓｏｌｄ ｌｉｎｅ）で示され、高シグナル強度の領域は細い点線で示される。図２１Ａは、ペプチド投与の３時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｂは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）のペプチド投与の３時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。図２１Ｃは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）のペプチド投与の２４時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｄは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）のペプチド投与の２４時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。

【図21E-H】図２１は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）の投与後における、第１のマウスからの単離された後肢、および第２のマウスからの単離された後肢のＩＶＩＳ蛍光イメージングを示す。低シグナル強度の領域は細い実線で示され、中シグナル強度の領域は太い販売線（ｓｏｌｄ ｌｉｎｅ）で示され、高シグナル強度の領域は細い点線で示される。図２１Ｅは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）のペプチド投与の４８時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｆは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）のペプチド投与の４８時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。図２１Ｇは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）のペプチド投与の７２時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｈは、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）の投与の７２時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。

【図22】図２２は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２２Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２２Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２２Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識投与の５分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２２Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図23】図２３は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２３Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２３Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、図２３Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２３Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２３Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、図２３Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２３Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２３Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、図２３Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図24】図２４は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２４Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２４Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２４Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２４Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図25】図２５は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２５Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２５Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２５Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２５Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２５Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２５Ｃに示される切片に対応する、マウスの異なる凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２５Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図26】図２６は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２６Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２６Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２６Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２６Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２６Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２６Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２６Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２６Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２６Ｅに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図27】図２７は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２７Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２７Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２７Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図２７Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２７Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図２７Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２７Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２７Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図28】図２８は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２８Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２８Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図２８Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２８Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２８Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図２８Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２８Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２８Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図２８Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図29】図２９は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２９Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２９Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２９Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図２９Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図30】図３０は、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３０Ａは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３０Ｂは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３０Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３０Ｃは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３０Ｄは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３０Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３０Ｅは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３０Ｆは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３０Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図31】図３１は、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３１Ａは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３１Ｂは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３１Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３１Ｃは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３１Ｄは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３１Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３１Ｅは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３１Ｆは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３１Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図32】図３２は、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３２Ａは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３２Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３２Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３２Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図33】図３３は、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３３Ａは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３３Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３３Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３３Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３３Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３３Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３３Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３３Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３３Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図34】図３４は、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３４Ａは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３４Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３４Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３４Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３４Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３４Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３４Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３４Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３４Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図35】図３５は、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３５Ａは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３５Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３５Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３５Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３５Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３５Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３５Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３５Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３５Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図36】図３６は、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３６Ａは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３６Ｂは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３６Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３６Ｃは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３６Ｄは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３６Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３６Ｅは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３６Ｆは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３６Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図37】図３７は、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３７Ａは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｂは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３７Ｃは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｄは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３７Ｅは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｆは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３７Ｇは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｈは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図38】図３８は、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド（ＧＳＮＦＫＶＥＧＡＣＳＫＰＣＲＫＹＣＩＤＫＧＡＲＮＧＫＣＩＮＧＲＣＨＣＹＹ）投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３８Ａは、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３８Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３８Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３８Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３８Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３８Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図39】図３９は、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３９Ａは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３９Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３９Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図３９Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３９Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３９Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図40】図４０は、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド（ＧＳＤＲＤＳＣＩＤＫＳＲＣＳＫＹＧＹＹＱＥＣＱＤＣＣＫＫＡＧＨＮＧＧＴＣＭＦＦＫＣＫＣＡ）投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４０Ａは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４０Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４０Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４０Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４０Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４０Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図41】図４１は、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４１Ａは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４１Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４１Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４１Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４１Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４１Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図42】図４２は、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド（ＧＳＧＶＰＩＮＶＲＳＲＧＳＲＤＳＬＤＰＳＲＲＡＧＭＲＦＧＲＳＩＮＳＲＳＨＳＴＰ）投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４２Ａは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｂは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４２Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４２Ｃは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｄは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４２Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４２Ｅは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｆは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４２Ｅに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４２Ｇは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｈは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４２Ｇに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図43】図４３は、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４３Ａは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｂは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４３Ｃは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｄは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４３Ｅは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｆは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４３Ｇは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｈは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図44】図４４は、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４４Ａは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４４Ｂは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４４Ｃは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４４Ｄは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４４Ｅは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図４４Ｆは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。図４４Ｇは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４４Ｈは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。

【図45】図４５は、計算されたＥｘｐａｓｙ ｐＩに対してプロットされた、本開示の様々なペプチドの軟骨ホーミングを示す。

【図46】図４６は、Ｒ実装を用いて計算されたＳｉｌｌｅｒｏ ｐＩに対してプロットされた、本開示の様々なペプチドの軟骨ホーミングを示す。

【図47】図４７は、ジスルフィド結合性がＣ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、およびＣ３−Ｃ６と標識される、軟骨ホーミングペプチドの「ヒッチン」クラスのトポロジーを描写する。

【図48】図４８は、配列番号２８、配列番号２３、および配列番号２７のペプチドの構造解析を示す。図４８Ａは、配列番号２８のペプチドの構造解析を示し、正電荷の連続表面および正電荷残基の位置を示す。図４８Ｂは、配列番号２３のペプチドの構造解析を示し、正電荷の連続表面および正電荷残基の位置を示す。図４８Ｃは、配列番号２７のペプチドの構造解析を示し、正電荷の連続表面および正電荷残基の位置を示す。図４８Ｄは、配列番号１１１のペプチドの構造解析を示し、正電荷の連続表面および正電荷残基の位置を示す。

【図49】図４９は、異なる緩衝液条件における、配列番号２４および配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図４９Ａは、ＰＢＳ中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｂは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｃは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシンおよび１ｍｇ／ｍｌの阻害剤中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｄは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシン、１ｍｇ／ｍｌの阻害剤、およびＤＴＴ中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｅは、ＰＢＳ中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｆは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｇは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシンおよび１ｍｇ／ｍｌの阻害剤中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｈは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシン、１ｍｇ／ｍｌの阻害剤、およびＤＴＴ中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。

【図50】図５０は、配列番号４８６と配列番号２３９、配列番号４８６と配列番号４８７、および配列番号４８６と配列番号４２２のアライメントを示す。図５０Ａは、配列番号４８６のペプチドと配列番号２３９のペプチドとのアライメントを示す。枠線は、保存された正電荷残基を描写する。図５０Ｂは、配列番号４８６のペプチドと配列番号４８７のペプチドとのアライメントを示す。枠線は、保存された正電荷残基を描写する。図５０Ｃは、配列番号４８６ペプチドと配列番号４２２のペプチドとのアライメントを示す。枠線は、保存された正電荷残基を描写する。

【図51】図５１は、配列番号２４３のペプチドと配列番号４２３のペプチドとのアライメントを示す。枠線は、保存された正電荷残基を描写する。

【図52】図５２は、ＳＰＴＤ、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）および２０μｇのペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびトリス緩衝液を使用した非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図53】図５３は、ＳＰＴＤ、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）および２０μｇのペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびトリス緩衝液を使用した非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図54】図５４は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号４８３（ＧＳＩＳＩＧＩＫＣＳＰＳＩＤＬＣＥＧＱＣＲＩＲＫＹＦＴＧＹＣＳＧＤＴＣＨＣＳＧ）のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図55】図５５は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図56】図５６は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図57】図５７は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号３２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図58】図５８は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号４８５（ＧＳＥＣＬＧＦＧＫＧＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＮＬＶＣＳＲＫＨＲＷＣＫＹＥＩＧＫ）のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図59】図５９は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図60】図６０は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２０５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図61】図６１は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図62】図６２は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図63】図６３は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図64】図６４は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９８のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図65】図６５は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２０６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図66】図６６は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【図67】図６７は、様々なペプチドのＨＰＬＣクロマトグラム、および直接注入エレクトロスプレー質量分析後における様々なペプチドの質量分析結果を示す。試験された全てのペプチドは、還元条件下および非還元条件下で示される。図６７Ａは、配列番号４８３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．５分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、８．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｂは、配列番号２２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。６．４分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、５．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｃは、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。ピークは、非還元条件下および還元条件のペプチドが重複していることを示す。図６７Ｄは、配列番号３２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．４分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、９．０分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｅは、配列番号４８５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．４分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、８．１分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｆは、配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。８．２分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、５．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｇは、配列番号２０５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。６．６分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、５．６分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｈは、配列番号１９５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．５分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、８．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｉは、配列番号１９６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。ピークは、非還元条件下および還元条件のペプチドが重複していることを示す。図６７Ｊは、配列番号１９７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。８．５分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、７．７分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｋは、配列番号１９８のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．７分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、６．７分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｌは、配列番号２０６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。８．２分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、７．２分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｍは、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ピークは、非還元条件下および還元条件のペプチドが完全に重複していることを示す。

【図68】図６８は、マウスへのペプチド投与後における、血漿中の配列番号２４の放射性標識ペプチドの濃度を示す。図６８Ａは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、血漿中のペプチドの濃度を示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には、０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図６８Ｂは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、血漿中投与されたペプチド用量の回収パーセントを示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図６８Ｃは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの胃管栄養法による経口投与後に、タンデムＨＰＬＣおよび液体シンチレーション計数によって測定された、血漿中のペプチドおよびペプチド断片ピークの強度を示す。^１４Ｃの送達用量は、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には、０．５、１、および３時間が含まれた。

【図69】図６９は、マウスへのペプチド投与後の尿中の配列番号２４の放射性標識ペプチドの濃度を示す。図６９Ａは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、尿中のペプチドの濃度を示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図６９Ｂは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの胃管栄養法による経口投与後に、タンデムＨＰＬＣおよび液体シンチレーション計数によって測定された、尿中のペプチドおよびペプチド断片ピークの強度を示す。^１４Ｃの送達用量は、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には、０．５、１、３、８、２４、および４８時間が含まれた。

【図70】図７０は、マウスへのペプチド投与後の尿中の配列番号２４の放射性標識ペプチドの濃度を示す。図７０Ａは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、糞便中のペプチドの濃度を示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図７０Ｂは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの胃管栄養法による経口投与後に、タンデムＨＰＬＣおよび液体シンチレーション計数によって測定された、糞便中のペプチドおよびペプチド断片ピークの強度を示す。^１４Ｃの送達用量は、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には、３および８時間が含まれた。

【図71】図７１は、還元剤、プロテイナーゼ、および／または人工胃液条件への曝露後における、２つのペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図７１Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｂは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｃは、人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｄは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｅは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン、０．５Ｍトリス、およびＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレーストレースを示す。図７１Ｆは、ＰＢＳ中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｇは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｈは、人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｉは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｊは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン、０．５Ｍトリス、およびＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレーストレースを示す。

【図72】図７２は、酸化的、還元的、および酸性条件をはじめとする一連の条件への曝露後における、ならびにプロテイナーゼへの曝露後における、配列番号１１１および配列番号４３４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図７２Ａは、還元条件および酸性条件下における、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７２Ｂは、５００Ｕペプシン中の１０ｍＭのＤＴＴ、５００Ｕペプシン、５０Ｕトリプシン中の１０ｍＭのＤＴＴ、および５０Ｕトリプシンをはじめとする、還元剤とプロテアーゼの様々な組み合わせの下における、配列番号１１１ペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７２Ｃは、５００Ｕペプシン、５０Ｕトリプシン、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）中の非還元（ＮＲ、酸化条件）、およびＮＲをはじめとする、様々なプロテアーゼ条件下における、配列番号４３４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。

【図73】図７３は、配列番号４３６〜配列番号４８２のｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリー内のペプチドアライメントを示す。囲み内および太字の残基は、配列の相対的な保存を示す一方で、囲み外および太字でない残基は、配列変動性がより高い領域を示す。

【図74】図７４は、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ ２構造クラスファミリーに由来する配列番号４３６のペプチドと、本開示の配列番号２４の軟骨ホーミングペプチドとのアライメントを示す。星印は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示し、コロンは、類似性の高いグループ（Ｇｏｎｎｅｔ ｐｏｉｎｔ ａｃｃｅｐｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＰＡＭ）２５０マトリックスにおける０．５を超える得点）間の保存を示し、ピリオドは、類似性の低いグループ（Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおける≦０．５の得点）間の保存を示す。

【発明を実施するための形態】

【0045】

本開示は、一般に、軟骨治療のための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書の組成物および方法は、対象への投与に続いて、軟骨に、ホーミング、標的化、指向化、保持、蓄積、移動、および／または結合する、ペプチドを利用する。いくつかの実施形態では、本開示の軟骨ホーミングペプチドは、活性薬剤を用いて、軟骨または組織またはその細胞に送達される。活性薬剤は、軟骨または組織またはその細胞に対して、治療効果を発揮し得る。例えば、特定の実施形態では、活性薬剤は、抗炎症剤を軟骨または組織またはその細胞に局所送達できるようにする。別の例として、活性薬剤は、軟骨のイメージングのために使用され得るフルオロフォアである。特定の実施形態では、ペプチドそれ自体が、治療応答を誘導する。

【0046】

軟骨障害は、特に治療が困難である。薬物投与のための直接経路は、静脈内、関節内、または経口であり得る。しかし、軟骨は無血管であり得て、したがって薬物の静脈内投与は、軟骨に到達できない。変形性関節症などの軟骨疾患のための薬物は、例えば、関節内への直接注射など、患部内に局所的に直接注射され得る。軟骨障害の治療を目的とする少数の薬物のみが、治療的に実現性のあることが証明されており、失敗の主な理由は、標的組織へのアクセスの欠如である。標的組織へのアクセスの欠如はまた、薬物が、標的領域、組織、構造または細胞に、ホーミング、標的化、または指向化、保持および／または結合し得る場合に必要とされるよりも高い用量の投与をもたらし得る。したがって、軟骨の病状の治療は、しばしば、高濃度の非特異的薬物の使用を必要とする。さらに、いくつかの治療薬が関節障害の治療において関心が持たれているが、薬物の全身投与によって引き起こされる副作用のレベルのために問題がある（ＤａｎｃｅｖｉｃａｎｄＭｃＣｕｌｌｏｃｈ、ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ１６：４２９（２０１４））。

【0047】

軟骨に接触できる特異的で効力がある薬剤は、特定の領域、組織、細胞、および構造を選択的に標的化して化合物を送達することによって、多くの治療の非特異性に対抗し得る。このような薬物はまた、イオンチャネル、タンパク質−タンパク質相互作用、細胞外マトリックス再形成（すなわち、プロテアーゼ阻害）などを調節するのに有用であり得る。このような標的治療は、より低い用量、副作用の低減、患者コンプライアンスの改善、および治療結果の改善を可能にし得て、それは軟骨の急性疾患だけでなく、慢性疾患においてもまた有利であろう。

【0048】

本開示は、軟骨に効果的に接触し得るノッチンに由来するペプチドのクラスを記載し、それは軟骨の病状を治療するために、直接的に、または活性薬物、ペプチド、または分子の担体としてのどちらかで使用され得る。例えば、変形性関節症は、骨の端部を覆う軟骨の薄化に関連する軟骨の病状であり、骨を関節内の骨に直接接触させる。時間経過と共に、骨端部は摩擦レベルの増加を被り、それは骨端部の侵食を引き起こす。変形性関節症を患っている個人は、動きが減少し疼痛が増加する。骨の関節および末端で軟骨と接触し、軟骨細胞と相互作用して細胞外マトリックスタンパク質の発現の増加を誘導し得る治療用ペプチドは、例えば、産生速度、産生量、コラーゲンを分解するタンパク質の阻害、既存のコラーゲンタンパク質の完全性を維持するその他のタンパク質の発現の促進、またはその他の機序を通じて、コラーゲンの発現を増加させることで、変形性関節症の治療と予防において使用され得る。ペプチドはまた、骨、破骨細胞，骨芽細胞ｓ、靱帯、筋肉、腱、および滑液包などの近傍組織または細胞に影響を及ぼし得る。本開示のペプチドを使用して、様々な病状の症状が治療され得る。本開示のペプチドは、軟骨細胞、軟骨、細胞外マトリックス、コラーゲン、ヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒａｎｏｎ）、アグリカン（軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質（ＣＳＰＣＰ）としても知られている）、または細胞外マトリックスのその他の成分、関節中のその他の成分、および軟骨性組織に、結合し得る

【0049】

また本明細書に記載されるのは、軟骨の特定の領域、組織、構造または細胞に、選択的にホーミング、標的化、指向化、移動、保持、または蓄積および／または結合するペプチドであり、それは、慢性疾患または軟骨傷害または本明細書に記載されるようなその他の治療適応症に起因する、疼痛（例えば、関節痛の）管理を助け、低下させ、除去または低減する。軟骨の１つまたは複数の特定の領域、組織、構造または細胞にホーミング、標的化、移動、指向化、保持、または蓄積および／または結合するするペプチドは、例えば、疼痛薬をの使用および有効性をしばしば制限する副作用などの、非特異的で潜在的にネガティブな影響がより少ない。さらに、このようなペプチドは、既存の薬物を軟骨の特定の領域、組織、構造または細胞に直接標的化し、薬剤の軟骨との接触を助け、または局所濃度を増加させることで、それらの用量を減少させ、有効性を増加させ得る。ペプチドそれ自体が疼痛を調節し得て、またはそれは疼痛を調節する薬剤にコンジュゲートされ得る。このような疼痛調節は、炎症、自己免疫応答、疼痛受容体に対する直接的または間接的作用、細胞殺傷、またはプログラム細胞死の調節などの様々な機序によって機能してもよい（病的細胞または組織などのアポトーシスおよび／または非アポトーシス経路を介するかどうかに関わりなく（Ｔａｉｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ１２７（Ｐｔ１０）：２１３５−４４（２０１４））。

【0050】

軟骨の特定の領域、組織、構造体または細胞に、ホーミング、標的化、指向化、移動、保持、蓄積、または結合する本開示のペプチドは、異なる程度の効率でそうし得る。ペプチドは、血液または筋肉などのその他の部位よりも、軟骨中でより高い濃度を有し得る。ペプチドは、軟骨中で、血液中のシグナルの百分率としてのシグナルを有するとして記録され得る。例えば、２００％の軟骨中のシグナルは、軟骨中のシグナルが血液中のシグナルの２倍高いことを示す。いくつかの実施形態では、軟骨ホーミング特性を有するペプチドは、放射性濃度測定によって＞１７０％の軟骨シグナルを有し得る。その他の実施形態では、軟骨ホーミング体であるペプチドは、放射性濃度測定によって＞２００％の軟骨シグナルを有し得る。その他の実施形態では、より効率的な軟骨ホーミング体であるペプチドは、放射性濃度測定によって＞３００％の軟骨シグナルを有し得る。その他の実施形態では、より効率的な軟骨ホーミング体であるペプチドは、放射性濃度測定によって＞４００％の軟骨シグナルを有し得る。その他の実施形態では、最強の軟骨ホーミング体であるペプチドは、放射性濃度測定によって＞５００％の軟骨シグナルを有し得る。

【0051】

軟骨の特定の領域、組織、構造または細胞に、選択的にホーミング、標的化、指向化、移動、保持または蓄積および／または結合するペプチドは、対象へのペプチドの投与後に存在し得る。対象は、ヒトまたはａ非ヒト動物であり得る。

【0052】

本明細書に開示されるペプチドは、イメージングのためにフルオロフォアなどの活性剤として、または炎症を治療するために抗炎症剤などの薬剤を関節に輸送するために使用され得る。

【0053】

本明細書に開示されるペプチドは、生体外で軟骨外植片に結合するために使用され得る。軟骨外植片は、ヒトまたは動物などの任意の対象に由来し得る。軟骨外植片へのペプチド結合の評価は、生体内で軟骨に効率的にホーミングしてもよいペプチドをスクリーニングするために使用され得る。

【0054】

本開示の追加的な態様および利点は、本開示の例示的な実施形態が示され、記載される以下の詳細な説明から、当業者には明らかになるであろう。理解されうるように、本開示は、その他の異なる実施形態が可能であり、いずれも本開示から逸脱することなく、いくつかの詳細が様々な点で変更可能である。したがって、図面および説明は本質的に例示的であって、制限的ではないと見なされるべきである。

【0055】

本明細書の用法では、天然Ｌ−鏡像異性アミノ酸の略号は従来通りであり、次のようである：アラニン（Ａ、Ａｌａ）；アルギニン（Ｒ、Ａｒｇ）；アスパラギン（Ｎ、Ａｓｎ）；アスパラギン酸（Ｄ、Ａｓｐ）；システイン（Ｃ、Ｃｙｓ）；グルタミン酸（Ｅ、Ｇｌｕ）；グルタミン（Ｑ、Ｇｌｎ）；グリシン（Ｇ、Ｇｌｙ）；ヒスチジン（Ｈ、Ｈｉｓ）；イソロイシン（Ｉ、Ｉｌｅ）；ロイシン（Ｌ、Ｌｅｕ）；リジン（Ｋ、Ｌｙｓ）；メチオニン（Ｍ、Ｍｅｔ）；フェニルアラニン（Ｆ、Ｐｈｅ）；プロリン（Ｐ、Ｐｒｏ）；セリン（Ｓ、Ｓｅｒ）；スレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）；トリプトファン（Ｗ、Ｔｒｐ）；チロシン（Ｙ、Ｔｙｒ）；バリン（Ｖ、Ｖａｌ）。典型的に、Ｘａａは任意のアミノ酸を示し得る。いくつかの実施形態では、Ｘは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）であり得る。

【0056】

本開示のいくつかの実施形態は、任意の標準または非標準アミノ酸またはその類似体のＤアミノ酸残基を考察する。アミノ酸配列が一連の三文字または一文字のアミノ酸略称として表される場合、標準的用法および慣例に従って、左方向がアミノ末端方向であり、右方向がカルボキシ末端方向である。

【0057】

ペプチド
ノッチンは、通常、約２０〜約８０アミノ酸長の範囲のペプチドのクラスであり、しばしば緻密型構造に折り畳まれる。ノッチンは、典型的には、いくつかの分子内ジスルフィド架橋によって特徴付けられ、β鎖および他の二次構造を含有してもよい、複合三次構造に組み立てられる。ジスルフィド結合の存在は、ノッチンに顕著な環境安定性を与え、それらが極端な温度およびｐＨに耐えて、血流のタンパク質分解酵素に抵抗できるようにする。

【0058】

ノッチンの配列構造および相同性のより幅広い試験は、それらが全ての種類の動植物における収束進化によって生じたことを明らかにする。動物では、それらは通常、毒液、例えば、クモおよびサソリの毒液に典型的に見いだされ、イオンチャネルの調節に関与するとされている。このクラスのペプチドの多くは、プロテアーゼ阻害剤であり得て、したがって軟骨にホーミングし、また軟骨を破壊するコラーゲナーゼまたはマトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼ１３（ＭＭＰ１３））も阻害し得る。植物のノッチンタンパク質は、動物のタンパク質分解酵素を阻害し、または抗菌活性を有し得て、ノッチンが植物の天然防御において機能し得ることが示唆される。このクラスのペプチドの多くは、抗菌活性を有し得て、したがってこれらのうちの１つは、軟骨にホーミングし、また微生物感染症も治療し得る。したがって、ノッチンペプチドはイオンチャネルと相互作用し得て、したがって軟骨にホーミングし、また増殖、機械的シグナル伝達、およびその他の機能をもたらすことが知られている軟骨細胞などのイオンチャネルと相互作用（結合、遮断、活性化）し得る（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ，Ａｌｉ Ｍｏｂａｓｈｅｒｉ，ｉｎ Ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｏｎ Ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ Ｖｏｌｕｍｅ １，２００８，ｐｐ １５７−１７８）。

【0059】

本開示のノットペプチドは、特定の利点を提供する。例えば、ジスルフィド結合の存在は、ノットペプチドに顕著な環境安定性を与え、それらが極端な温度およびｐＨに耐え、血流、胃腸管およびその他の箇所のタンパク質分解酵素に抵抗できるようにする。ノットペプチドの分解に対する抵抗性は、免疫原性を低下させる観点から有益であり得る。ノットペプチドの剛性はまた、標的に結合する際に柔軟なペプチドが生じる「エントロピーのペナルティ」を支払うことなく、標的に結合することを可能にする。ノットペプチドは、抗体様の親和性で標的に結合し得る。ノットペプチドは、複数の軟骨領域、組織、構造または細胞の活性を調節し得る。軟骨の領域、組織、構造のいくつかとしては、以下が挙げられる：（ａ）弾性軟骨；（ｂ）関節軟骨および骨端軟骨のような硝子軟骨；（ｃ）線維軟骨；（ｄ）上記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの細胞または細胞型。ノッチンペプチドが軟骨にホーミングし得る領域のいくつかとしては、膝、臀部またはまたは指、鼻軟骨、脊髄軟骨、気管軟骨、および肋骨軟骨などの関節が挙げられる。様々な局面において、軟骨成分は、アグリカンおよびＩＩ型コラーゲンを含む。さらに、いくつかの実施形態では、ノットペプチドは細胞に浸透し得る。その他の実施形態では、ノットペプチドは、その他の各種分子と比較して、より迅速なクリアランスおよび細胞内取り込みを示す。

【0060】

本開示は、これらのノットペプチド（またはノッチン）を含んでなり、またはそれらに由来するペプチドを提供する。本明細書の用法では、「ノットペプチド」という用語は、「ノッチン」および「オプチド」という用語と同義であると見なされる。

【0061】

本開示のペプチドは、システインアミノ酸残基を含んでなり得る。場合によっては、ペプチドは少なくとも４個のシステインアミノ酸残基を有する。場合によっては、ペプチドは少なくとも６個のシステインアミノ酸残基を有する。他の事例では、ペプチドは少なくとも８個のシステインアミノ酸残基を有する。ペプチドは少なくとも１０個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１２個のシステインアミノ酸残基、少なくとも１４個のシステインアミノ酸残基、または少なくとも１６個のシステインアミノ酸残基を有する。

【0062】

ノットペプチドは、ジスルフィド架橋を含んでなり得る。ノットペプチドは、その中で残基の５％以上が分子内ジスルフィド結合を形成するシステインである、ペプチドであり得る。ジスルフィド結合ペプチドは、薬物スキャフォールドであり得る。いくつかの実施形態では、ジスルフィド架橋は阻害剤ノットを形成する。ジスルフィド架橋は、例えば、システイン１と４、２と５、または３と６との間などのシステイン残基間で形成され得る。場合によっては、１つのジスルフィド架橋は、他の２つのジスルフィド架橋によって形成されるループを通過して、例えば、阻害剤ノットを形成する。その他の場合には、ジスルフィド架橋は任意の２つのシステイン残基間に形成され得る。

【0063】

本開示は、ペプチドスキャフォールドをさらに含み、これは例えば、軟骨を標的化しホーミングし得る追加的なペプチドを生成するための出発点として使用され得る。いくつかの実施形態では、これらのスキャフォールドは、様々なノットペプチド（またはノッチン）に由来し得る。特定の実施形態では、ノットペプチドは複合三次構造に構築され、これはいくつかの分子内ジスルフィド架橋によって特徴付けられ、必要に応じてβ鎖およびαらせんなどのその他の二次構造を含有する。例えば、ノットペプチドは、いくつかの実施形態では、ジスルフィドノットを介するジスルフィドによって特徴付けられる、小さなジスルフィドに富むタンパク質を含む。このノットは、例えば、１つのジスルフィド架橋が、他の２つのジスルフィドと相互接続骨格とによって形成される大環状分子を通過する場合に得られる。いくつかの実施形態では、ノットペプチドとしては成長因子システインノット、またはインヒビターシステインノットが挙げられる。その他の可能なペプチド構造としては、βシートなしに２つのジスルフィド架橋によって連結される２つの平行らせんを有するペプチド（例えば、ヘプトキシン）が挙げられる。

【0064】

ノットペプチドは、Ｌ立体配置にある少なくとも１つのアミノ酸残基を含んでなり得る。ノットペプチドは、Ｄ立体配置にある少なくとも１つのアミノ酸残基を含んでなり得る。いくつかの実施形態では、ノットペプチドは１５〜４０アミノ酸残基長である。その他の実施形態では、ノットペプチドは１１〜５７アミノ酸残基長である。さらなる実施形態では、ノットペプチドは少なくとも２０アミノ酸残基長である。

【0065】

これらの種類のペプチドは、毒素または毒液が存在するかまたはそれに関連することが知られているクラスのタンパク質に由来し得る。場合によっては、ペプチドは、サソリまたはクモに関連する毒素または毒液に由来し得る。ペプチドは、様々な属および種のクモおよびサソリの毒液および毒素に由来し得る。例えば、ペプチドは、レイウルス・キンクエストリアツス・ヘブラオイス（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｂｒａｅｕｓ）、ブツス・オシタヌス・ツネタヌス（Ｂｕｔｈｕｓ ｏｃｃｉｔａｎｕｓ ｔｕｎｅｔａｎｕｓ）、ホッテントッタ・ジュダイクス（Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ ｊｕｄａｉｃｕｓ）、メソブツス・オイポイス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）、ブツス・オッシタヌス・イスラエリス（Ｂｕｔｈｕｓ ｏｃｃｉｔａｎｕｓ ｉｓｒａｅｌｉｓ）、ハドルルス・ゲルトスキ（Ｈａｄｒｕｒｕｓ ｇｅｒｔｓｃｈｉ）、アンドロクトヌス・アウストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、セントルロイデス・ノキシウス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｎｏｘｉｕｓ）、ヘテロメトルス・ラオチクス（Ｈｅｔｅｒｏｍｅｔｒｕｓ ｌａｏｔｉｃｕｓ）、オピストフタルムス・カリナツス（Ｏｐｉｓｔｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ）、ハプロペルマ・スクミドチ（Ｈａｐｌｏｐｅｌｍａ ｓｃｈｍｉｄｔｉ）、イソメトルス・マクラツス（Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、グランモストラ・ロセア（Ｇｒａｍｍｏｓｔｏｌａ ｒｏｓｅａ）、またはその他の適切な属または種のサソリに由来する毒液または毒素であり得る。いくつかの場合において、ペプチドは、ブツス・マルテンシイ・カルシュ（Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ Ｋａｒｓｈ）（サソリ）毒素に由来し得る。

【0066】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのメンバーである。ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーとしては、配列番号４３６〜配列番号４８２のいずれか１つのペプチドが挙げられる。本開示の軟骨ホーミング（ｈｏｍｏｉｎｇ）ペプチドは、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーメンバーの任意のペプチドの変異型であり得る。いくつかの実施形態では、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーの変異型である本開示の例示的軟骨ホーミングペプチドは、配列番号２４のペプチドである。その他の実施形態では、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーの変異型である本開示の例示的軟骨ホーミングペプチドは、配列番号１１１のペプチドである。その他の実施形態では、変異型ペプチドは、構造クラスｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのペプチドと少なくとも３０％同一である。いくつかの実施形態では、変異型ペプチドは、構造クラスｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのペプチドと、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％または９５％同一である。いくつかの実施形態では、変異型ペプチドは、構造クラスｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーのペプチドと、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％同一である。ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーは、様々なサソリ毒の一部として見いだされるペプチドファミリーメンバーを含んでなり、しばしばカリウムチャネルを遮断するように機能する。ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２ファミリーの特徴としては、少なくとも１２０のファミリーメンバーを有するノッチン１（ＣＬ００５４）族のメンバーに関連する特徴が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、平均ファミリーメンバーアミノ酸残基長は、３１．４アミノ酸残基で、コンセンサス配列に対するファミリーメンバー配列相同性の平均同一性は４６％であり、ファミリーメンバーは少なくとも次の生物に由来する：ティティウス・コスタツス（Ｔｉｔｙｕｓ ｃｏｓｔａｔｕｓ）、セントルロイデス・ノキシウス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｎｏｘｉｕｓ）、ティティウス・セルラツス（Ｔｉｔｙｕｓ ｓｅｒｒｕｌａｔｕｓ）、メソブツス・ジボスス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ）、セントルロイデス・エレガンス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、ホッテントッタ・ジュダイクス（Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ ｊｕｄａｉｃｕｓ）、メソブツス・オイポイス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｅｕｐｅｕｓ）、パラブツス・トランスバアリクス（Ｐａｒａｂｕｔｈｕｓ ｔｒａｎｓｖａａｌｉｃｕｓ）、イソメトロイデス・ベスクス（Ｉｓｏｍｅｔｒｏｉｄｅｓ ｖｅｓｃｕｓ）、ホッテントッタ・タムルス・シンジクス（Ｈｏｔｔｅｎｔｏｔｔａ ｔａｍｕｌｕｓ ｓｉｎｄｉｃｕｓ）、セントルロイデス・マルガリタツス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｍａｒｇａｒｉｔａｔｕｓ）、セントルロイデス・スフスス・スフスス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｓｕｆｆｕｓｕｓ ｓｕｆｆｕｓｕｓ）、ブツス・オッシタヌス・イスラエリス（Ｂｕｔｈｕｓ ｏｃｃｉｔａｎｕｓ ｉｓｒａｅｌｉｓ）、セントルロイデス・リンピズス・リンピズス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｌｉｍｐｉｄｕｓ ｌｉｍｐｉｄｕｓ）、レイウルス・キンクエストリアツス・ヘブラオイス（Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｂｒａｅｕｓ）、オドントブツス・ドリア（Ｏｄｏｎｔｏｂｕｔｈｕｓ ｄｏｒｉａｅ）、メソブツス・タムルス（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ）、ティティウス・スチグムルス（Ｔｉｔｙｕｓ ｓｔｉｇｍｕｒｕｓ）、リカス・ムクロナツス（Ｌｙｃｈａｓ ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）、アンドロクトヌス・アウストラリス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、オルトキルス・スクロビクロスス（Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ）、メソブツス・マルテンシイ（Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ）、アンドロクトヌス・マウレタニクス・マウレタニクス（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ｍａｕｒｅｔａｎｉｃｕｓ ｍａｕｒｅｔａｎｉｃｕｓ）、セントルロイデス・リンバツス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ ｌｉｍｂａｔｕｓ）、イソメトルス・マクラツス（Ｉｓｏｍｅｔｒｕｓ ｍａｃｕｌａｔｕｓ）、ティティウス・ジスクレパンス（Ｔｉｔｙｕｓ ｄｉｓｃｒｅｐａｎｓ）、アンドロクトヌス・アモロイキシ（Ａｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ ａｍｏｒｅｕｘｉ）、ブツス・オシタヌス・ツネタヌス（Ｂｕｔｈｕｓ ｏｃｃｉｔａｎｕｓ ｔｕｎｅｔａｎｕｓ）、ティティウス・トリビタツス（Ｔｉｔｙｕｓ ｔｒｉｖｉｔｔａｔｕｓ）、およびティティウス・オブスクルス（Ｔｉｔｙｕｓ ｏｂｓｃｕｒｕｓ）（アマゾンサソリ）。

【0067】

いくつかの実施形態では、軟骨ホーミングペプチドは、配列ＧＳＸＶＸＸＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＸＰＣＫＲＸＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸＸＸ（配列番号９）のファミリーのメンバーであり、その中でこの配列は、
ＧＳＧＶＰＩＮＶＫＣＲＧＳＲＤＣＬＤＰＣＫＫＡ−ＧＭＲＦＧＫＣＩＮＳＫ−ＣＨＣＴＰ−−（配列番号２４）、
ＧＳ−ＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡ−ＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫ−ＣＤＣＴＰＫ−（配列番号２３）、
ＧＳＱＶＱＴＮＶＫＣＱＧＧＳ−ＣＡＳＶＣＲＲＥＩＧＶＡＡＧＫＣＩＮＧＫ−ＣＶＣＹＲＮ−（配列番号２７）、
ＧＳ−−−−−ＩＳＣＴＧＳＫＱＣＹＤＰＣＫＲＫＴＧＣＰＮＡＫＣＭＮＫＳ−ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２６）、
ＧＳＥＶ−−−ＩＲＣＳＧＳＫＱＣＹＧＰＣＫＱＱＴＧＣＴＮＳＫＣＭＮＫＶ−ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２８）、
ＧＳＡＶＣＶＹＲＴ−−−−−−ＣＤＫＤＣＫＲＲ−ＧＹＲＳＧＫＣＩＮＮＡ−ＣＫＣＹＰＹＧ（配列番号２５）、
ＧＳ−−−−ＧＩＶＣ−−−ＫＶＣＫＩＩＣＧＭＱ−ＧＫＫＶＮＩＣＫＡＰＩＫＣＫＣＫＫＧ−（配列番号２１）、および
ＧＳＱＩＹＴＳＫＥＣＮＧＳＳＥＣＹＳＨＣＥＧＩＴＧＫＲＳＧＫＣＩＮＫＫ−ＣＹＣＹＲ−−（配列番号３０）
の配列に見られる最も一般的な要素に基づき、残基ＫおよびＲ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、およびＶ；ＧおよびＡ；ＳおよびＴ；ＱおよびＮ残基は、配列中で独立して相互交換されてもよく、Ｘは、独立して、任意の数の任意のアミノ酸であり得て、または皆無のアミノ酸であり得る。Ｎ末端ＧＳ配列は、本開示のペプチドの間に含まれ得るか、または除外され得る。

【0068】

その他の実施形態では、ペプチドは、配列ＧＳＸＸＸＧＣＶＸＸＸＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＸＸＸＫＫＣＫＸＸＸＸＸＸ（配列番号１０）のファミリーのメンバーであり、その中で配列は、
ＧＳ−−−ＡＣＫＧＶＦＤＡＣＴＰＧＫＮＥＣＣ−ＰＮＲＶＣＳＤＫ−Ｈ−−−−ＫＷＣＫＷＫＬ−−−（配列番号２９）、
ＧＳ−−−ＧＣＬＥＦＷＷＫＣＮＰＮＤＤＫＣＣＲＰＫＬＫＣＳＫＬＦ−−−−−ＫＬＣＮＦＳＦＧ−−（配列番号３１）、
ＧＳＳＥＫＤＣＩＫＨＬＱＲＣＲ−ＥＮＫＤＣＣ−−ＳＫＫＣＳＲＲ−ＧＴＮＰＥＫＲＣＲ−−−−−−（配列番号２２）、および
ＧＳ−−−ＧＣＦＧＹ−−ＫＣＤＹＹ−ＫＧＣＣＳＧＹＶ−ＣＳＰＴＷ−−−−−ＫＷＣＶＲＰＧＰＧＲ（配列番号３３）の配列に見られる最も一般的な要素に基づき、
残基ＫおよびＲ；Ｍ、Ｉ、Ｌ、およびＶ；ＧおよびＡ；ＳおよびＴ；ＱおよびＮ残基は、配列中で独立して相互交換されてもよく、Ｘは、独立して、任意の数の任意のアミノ酸であり得て、または皆無のアミノ酸であり得る。Ｎ末端ＧＳ配列は、本開示のペプチドの間に含まれ得るか、または除外され得る。

【0069】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ^１ＩＸ^２Ｘ^３ＫＣＸ^４ＧＳＫＱＣＸ^５ＤＰＣＫＸ^６Ｘ^７Ｘ^８ＧＸ^９ＲＸ^１０ＧＫＣＸ^１１ＮＫＫＣＫＣＸ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４Ｘ^１５（配列番号１）を含んでなり、式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８、Ｘ^９、Ｘ^１０、Ｘ^１１、Ｘ^１２、Ｘ^１３、Ｘ^１４およびＸ^１５は、それぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、または皆無である。場合によっては、ペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ^１ＩＸ^２Ｘ^３ＫＣＸ^４ＧＳＫＱＣＸ^５ＤＰＣＫＸ^６Ｘ^７Ｘ^８ＧＸ^９ＲＸ^１０ＧＫＣＸ^１１ＮＫＫＣＫＣＸ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４Ｘ^１５（配列番号２）を含んでなり、式中、Ｘ^１はＰまたはＲから選択され、式中、Ｘ^２はＰまたはＮから選択され、式中、Ｘ^３はＶまたはＩから選択され、式中、Ｘ^４はＳ、Ｔ、ＲまたはＫから選択され、式中、Ｘ^５はＹまたはＬから選択され、式中、Ｘ^６はＱ、ＲまたはＫから選択され、式中、Ｘ^７はＡ、ＫまたはＲから選択され、式中、Ｘ^８はＴまたはＡから選択され、式中、Ｘ^９はＣまたはＭから選択され、式中、Ｘ^１０はＦまたはＮから選択され、式中、Ｘ^１１はＭまたはＩから選択され、式中、Ｘ^１２はＹまたはＴから選択され、式中、Ｘ^１３はＧまたはＰはから選択され、式中、Ｘ^１４はＣまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^１５はＧまたは皆無から選択される。

【0070】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３Ｘ^４ＩＸ^５ＣＸ^６ＧＳＫＱＣＹＸ^７ＰＣＫＸ^８Ｘ^９ＴＧＣＸ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２ＫＣＸ^１３Ｘ^１４ＫＸ^１５ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号３）を含んでなり、式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８、Ｘ^９、Ｘ^１０、Ｘ^１１、Ｘ^１２、Ｘ^１３、Ｘ^１４、およびＸ^１５は、それぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、または皆無である。場合によっては、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３Ｘ^４ＩＸ^５ＣＸ^６ＧＳＫＱＣＹＸ^７ＰＣＫＸ^８Ｘ^９ＴＧＣＸ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２ＫＣＸ^１３Ｘ^１４ＫＸ^１５ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号４）を含んでなり、式中、Ｘ^１はＧまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^２はＳまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^３はＥ、Ｇまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^４はＶ、Ｓ、または皆無から選択され、式中、Ｘ^５はＲまたはＳから選択され、式中、Ｘ^６はＳまたはＴから選択され、式中、Ｘ^７はＧまたはＤから選択され、式中、Ｘ^８はＱまたはＲから選択され、式中、Ｘ^９はＱまたはＫから選択され、式中、Ｘ^１０はＴまたはＰから選択され、式中、Ｘ^１１はＮまたはＱから選択され、式中、Ｘ^１２はＳまたはＡから選択され、式中、Ｘ^１３はＭまたはＬから選択され、式中、Ｘ^１４はＮまたはＱから選択され、式中、Ｘ^１５はＶまたはＳから選択される。

【0071】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３ＶＸ^４ＩＸ^５ＶＸ^６ＣＸ^７Ｘ^８ＳＸ^９Ｘ^１０ＣＬＸ^１１ＰＣＫＸ^１２ＡＧＭＲＦＧＫＣＸ^１３ＮＸ^１４ＫＣＸ^１５ＣＴＰＸ^１６（配列番号５）を含んでなり、式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８、Ｘ^９、Ｘ^１０、Ｘ^１１、Ｘ^１２、Ｘ^１３、Ｘ^１４、Ｘ^１５、Ｘ^１６は、それぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、または皆無である。場合によっては、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３ＶＸ^４ＩＸ^５ＶＸ^６ＣＸ^７Ｘ^８ＳＸ^９Ｘ^１０ＣＬＸ^１１ＰＣＫＸ^１２ＡＧＭＲＦＧＫＣＸ^１３ＮＸ^１４ＫＣＸ^１５ＣＴＰＸ^１６（配列番号６）を含んでなり、式中、Ｘ^１はＧまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^２はＧ、Ｓまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^３はＧ、Ｓまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^４はＰまたはＲから選択され、式中、Ｘ^５はＮまたはＰから選択され、式中、Ｘ^６はＫまたはＳから選択され、式中、Ｘ^７はＲまたはＫから選択され、式中、Ｘ^８はＧまたはＨから選択され、式中、Ｘ^９はＲまたはＧから選択され、式中、Ｘ^１０はＤまたはＱから選択され、式中、Ｘ^１１はＤまたはＫから選択され、式中、Ｘ^１２はＫまたはＤから選択され、式中、Ｘ^１３はＩまたはＭから選択され、式中、Ｘ^１４はＳまたはＧから選択され、式中、Ｘ^１５はＨまたはＤから選択され、式中、Ｘ^１６はＫまたは皆無から選択される。

【0072】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列ＸＶＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＰＣＫＲＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸ（配列番号７）またはＸＧＣＶＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＫＫＣＫＸ（配列番号８）を含んでなり、式中、各文字は、それぞれ個別に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、式中、Ｘは皆無のアミノ酸でありまたは１〜１０アミノ酸長のペプチド断片であり、その中では、このようなペプチド断片中の各アミノ酸は、いずれの場合にも任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり得る。

【0073】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ^１ＩＸ^２Ｘ^３ＲＣＸ^４ＧＳＲＱＣＸ^５ＤＰＣＲＸ^６Ｘ^７Ｘ^８ＧＸ^９ＲＸ^１０ＧＲＣＸ^１１ＮＲＲＣＲＣＸ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４Ｘ^１５（配列番号１１）を含んでなり、式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８、Ｘ^９、Ｘ^１０、Ｘ^１１、Ｘ^１２、Ｘ^１３、Ｘ^１４ａｎｄＸ^１５は、それぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、または皆無である。場合によっては、ペプチドは、配列ＧＳＧＶＸ^１ＩＸ^２Ｘ^３ＲＣＸ^４ＧＳＲＱＣＸ^５ＤＰＣＲＸ^６Ｘ^７Ｘ^８ＧＸ^９ＲＸ^１０ＧＲＣＸ^１１ＮＲＲＣＲＣＸ^１２Ｘ^１３Ｘ^１４Ｘ^１５（配列番号１２）を含んでなり、式中、Ｘ^１はＰまたはＲから選択され、式中、Ｘ^２はＰまたはＮから選択され、式中、Ｘ^３はＶまたはＩから選択され、式中、Ｘ^４はＳ、Ｔ、ＲまたはＫから選択され、式中、Ｘ^５はＹまたはＬはから選択され、式中、Ｘ^６はＱ、ＲまたはＫから選択され、式中、Ｘ^７はＡ、ＫまたはＲから選択され、式中、Ｘ^８はＴまたはＡから選択され、式中、Ｘ^９はＣまたはＭから選択され、式中、Ｘ^１０はＦまたはＮから選択され、式中、Ｘ^１１はＭまたはＩから選択され、式中、Ｘ^１２はＹまたはＴから選択され、式中、Ｘ^１３はＧまたはＰから選択され、式中、Ｘ^１４はＣまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^１５はＧまたは皆無から選択される。

【0074】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３Ｘ^４ＩＸ^５ＣＸ^６ＧＳＲＱＣＹＸ^７ＰＣＲＸ^８Ｘ^９ＴＧＣＸ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２ＲＣＸ^１３Ｘ^１４ＲＸ^１５ＣＲＣＹＧＣＧ（配列番号１３）を含んでなり、式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８、Ｘ^９、Ｘ^１０、Ｘ^１１、Ｘ^１２、Ｘ^１３、Ｘ^１４、およびＸ^１５は、それぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、または皆無である。場合によっては、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３Ｘ^４ＩＸ^５ＣＸ^６ＧＳＲＱＣＹＸ^７ＰＣＲＸ^８Ｘ^９ＴＧＣＸ^１０Ｘ^１１Ｘ^１２ＲＣＸ^１３Ｘ^１４ＲＸ^１５ＣＲＣＹＧＣＧ、（配列番号１４）を含んでなり、式中、Ｘ^１はＧまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^２はＳまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^３はＥ、Ｇまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^４はＶ、Ｓ、または皆無から選択され、式中、Ｘ^５はＲまたはＳから選択され、式中、Ｘ^６はＳまたはＴから選択され、式中、Ｘ^７はＧまたはＤから選択され、式中、Ｘ^８はＱまたはＲから選択され、式中、Ｘ^９はＱ、ＲまたはＫから選択され、式中、Ｘ^１０はＴまたはＰから選択され、式中、Ｘ^１１はＮまたはＱから選択され、式中、Ｘ^１２はＳまたはＡから選択され、式中、Ｘ^１３はＭまたはＬから選択され、式中、Ｘ^１４はＮまたはＱから選択され、式中、Ｘ^１５はＶまたはＳから選択される。

【0075】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３ＶＸ^４ＩＸ^５ＶＸ^６ＣＸ^７Ｘ^８ＳＸ^９Ｘ^１０ＣＬＸ^１１ＰＣＲＸ^１２ＡＧＭＲＦＧＲＣＸ^１３ＮＸ^１４ＲＣＸ^１５ＣＴＰＸ^１６（配列番号１５）を含んでなり、式中、Ｘ^１、Ｘ^２、Ｘ^３、Ｘ^４、Ｘ^５、Ｘ^６、Ｘ^７、Ｘ^８、Ｘ^９、Ｘ^１０、Ｘ^１１、Ｘ^１２、Ｘ^１３、Ｘ^１４、Ｘ^１５、Ｘ^１６は、それぞれ個々に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、または皆無である。場合によっては、ペプチドは、配列Ｘ^１Ｘ^２Ｘ^３ＶＸ^４ＩＸ^５ＶＸ^６ＣＸ^７Ｘ^８ＳＸ^９Ｘ^１０ＣＬＸ^１１ＰＣＲＸ^１２ＡＧＭＲＦＧＲＣＸ^１３ＮＸ^１４ＲＣＸ^１５ＣＴＰＸ^１６（配列番号１６）を含んでなり、式中、Ｘ^１はＧまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^２はＧ、Ｓまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^３はＧ、Ｓまたは皆無から選択され、式中、Ｘ^４はＰまたはＲから選択され、式中、Ｘ^５はＮまたはＰから選択され、式中、Ｘ^６はＲ、ＫまたはＳから選択され、式中、Ｘ^７はＲまたはＫから選択され、式中、Ｘ^８はＧまたはＨから選択され、式中、Ｘ^９はＲまたはＧから選択され、式中、Ｘ^１０はＤまたはＱから選択され、式中、Ｘ^１１はＤ、Ｒ、またはＫから選択され、式中、Ｘ^１２はＫ、Ｒ、またはＤから選択され、式中、Ｘ^１３はＩまたはＭから選択され、式中、Ｘ^１４はＳまたはＧから選択され、式中、Ｘ^１５はＨまたはＤから選択され、式中、Ｘ^１６はＫ、Ｒ、または皆無から選択される。

【0076】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、配列ＸＶＸＶＲＣＸＧＳＲＱＣＸＰＣＲＲＸＧＸＲＸＧＲＣＩＮＲＲＸＣＲＣＹＸ（配列番号１７）またはＸＧＣＶＸＲＣＲＰＧＸＲＸＣＣＸＰＸＲＲＣＳＲＲＦＧＸＲＲＣＲＸ（配列番号１８）を含んでなり、式中、各文字は、それぞれ個別に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり、式中、Ｘは皆無のアミノ酸でありまたは１〜１０アミノ酸長のペプチド断片であり、その中では、このようなペプチド断片中の各アミノ酸は、いずれの場合にも任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体であり得る。

【0077】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、ペプチド断片配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、および配列番号１９４の１つまたは複数を含んでなる。

【0078】

表１は、本開示に従ったいくつかの例示的ペプチドを列挙する。

【0079】

【表1】

[この文献は図面を表示できません]

【0080】

【表2】

[この文献は図面を表示できません]

【0081】

【表3】

[この文献は図面を表示できません]

【0082】

【表4】

[この文献は図面を表示できません]

【0083】

【表5】

[この文献は図面を表示できません]

【0084】

【表6】

[この文献は図面を表示できません]

【0085】

【表7】

[この文献は図面を表示できません]

【0086】

【表8】

[この文献は図面を表示できません]

【0087】

【表9】

[この文献は図面を表示できません]

【0088】

【表10】

[この文献は図面を表示できません]

【0089】

【表11】

[この文献は図面を表示できません]

【0090】

【表12】

[この文献は図面を表示できません]

【0091】

【表13】

[この文献は図面を表示できません]

【0092】

【表14】

[この文献は図面を表示できません]

【0093】

配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれかまたはその断片において、任意の１つまたは複数のＫ残基は残基によって置換され得て、または任意の１つまたは複数のＲ残基はＫ残基によって置換され得る。配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれかまたは任意のその断片において、任意の１つまたは複数のＭ残基は、Ｉ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置換され得て、任意の１つまたは複数のＬ残基は、Ｖ、Ｉ、またはＭ残基のいずれか１つによって置換され得て、任意の１つまたは複数のＩ残基は、Ｍ、Ｌ、またはＶ残基のいずれか１つによって置換され得て、または任意の１つまたは複数のＶ残基は、Ｉ、Ｌ、またはＭ残基のいずれか１つによって置換され得る。任意の実施形態では、少なくともの１つアミノ酸は、ペプチドまたはペプチド断片中で、単独でまたは組み合わせで、Ｋ／Ｒ、Ｍ／Ｉ／Ｌ／Ｖ、Ｇ／Ａ、Ｓ／Ｔ、Ｑ／Ｎ、およびＤ／Ｅのように相互交換され得て、式中、各文字は、それぞれ個別に任意のアミノ酸またはアミノ酸類似体である。場合によっては、ペプチドは１つのみのリジン残基を含み、またはリジン残基を含まないことができる。配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれかまたは任意のその断片において、Ｘは、独立して任意の数の任意のアミノ酸または皆無のアミノ酸であり得る。場合によっては、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、および配列番号１９８〜配列番号２１６のペプチドと同様に、最初の２つのＮ末端アミノ酸ＧＳを含み得て、またはこのようなＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、任意のその他の１つまたは２つのアミノ酸によって置換され得る。その他の場合には、ペプチドは、配列番号２１７〜配列番号４１０、配列番号４１２、および配列番号４１４〜配列番号４３２のペプチドと同様に、最初の２つのＮ末端アミノ酸ＧＳを含まない。場合によっては、ペプチドのＮ末端は、アセチル基などによってブロックされ、他の場合は、ペプチドのＣ末端は、アミド基などによってブロックされる。

【0094】

場合によっては、ペプチドは、配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つ、またはその機能的断片である。その他の実施形態では、本開示のペプチドは、配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つと、９９％、９５％、９０％、８５％、または８０％の相同性を有するペプチドをさらに含んでなる。さらなる実施形態では、ペプチド断片は、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６残基長の配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つの連続断片を含んでなり、その中ではペプチド断片は、ペプチドの任意の部分から選択される。いくつかの実施形態では、このようなペプチド断片は軟骨に接触して、およびペプチドおよびペプチド−活性薬剤コンジュゲートについて本明細書に記載されるものの特性を示す。

【0095】

本開示のペプチドは、負のアミノ酸残基をさらに含んでなり得る。場合によっては、ペプチドは、２以下の負のアミノ酸残基を有する。その他の場合には、ペプチドは、４つ以下の負のアミノ酸残基、３つ以下の負のアミノ酸残基、または１つ以下の負のアミノ酸残基を有する。負のアミノ酸残基は、任意の負電荷アミノ酸残基から選択され得る。負のアミノ酸残基は、ＥまたはＤ、またはＥとＤの双方の組み合わせのいずれかから選択され得る。

【0096】

本開示のペプチドは、塩基性アミノ酸残基をさらに含んでなり得る。いくつかの実施形態では、塩基性残基がペプチド配列に付加されて、生理学的ｐＨにおける電荷を増加させる。付加される塩基性残基は、任意の塩基性アミノ酸であり得る。付加される塩基性残基は、ＫまたはＲ、またはＫまたはＲの組み合わせから選択され得る。

【0097】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、酸性領域および塩基性領域を構成する電荷分布を有する。酸性領域は、ｎｕｂであり得る。ｎｕｂは、ペプチドの三次元構造から延長したペプチドの部分である。塩基性領域は、パッチであり得る。パッチはペプチドの一部であり、それはペプチドの三次元構造に特徴的な特定のトポロジーを指定しない。さらなる実施形態では、ノットペプチドは、６個以上の塩基性残基および２個以下の酸性残基であり得る。

【0098】

本開示のペプチドは、正電荷アミノ酸残基をさらに含んでなり得る。場合によっては、ペプチドは少なくとも２個の正電荷残基を有する。その他の場合には、ペプチドは、少なくとも３個の正電荷残基、少なくとも４個の正電荷残基、少なくとも５個の正電荷残基、少なくとも６個の正電荷残基、少なくとも７個の正電荷残基、少なくとも８個の正電荷残基または少なくとも９個の正電荷残基を有する。正電荷残基は、任意の正電荷アミノ酸残基から選択され得る。正電荷残基は、ＫまたはＲのどちらか、またはＫとＲの組み合わせから選択され得る。

【0099】

さらに、本明細書のペプチドは、少なくとも２個のシステイン残基、および少なくとも２個のまたは３個の正電荷アミノ酸残基（例えば、アルギニンまたはリジンまたはヒスチジン、あるいはアルギニンまたはリジンまたはヒスチジンの任意の組み合わせ）を含有する上記の配列のいずれかの、４〜１９アミノ酸残基断片を含んでなり得る。その他の実施形態では、本明細書のペプチドは、少なくとも２個のシステイン残基、２個以下の塩基性残基、および少なくとも２個または３個の正電荷アミノ酸残基（例えば、アルギニンまたはリジンまたはヒスチジン、あるいはアルギニンまたはリジンまたはヒスチジンの任意の組み合わせ）を含有する上記の配列のいずれかの、２０〜７０アミノ酸残基断片である。いくつかの実施形態では、このようなペプチド断片は軟骨に接触して、およびペプチドおよびペプチド−活性薬剤コンジュゲートについて本明細書に記載されるものの特性を示す。

【0100】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数のジスルフィド結合を含有して、中性ｐＨで正の正味電荷を有し、生理学的ｐＨでは、ペプチドは、例えば、−５、−４、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、または＋５などの正味電荷を有し得る。正味電荷がゼロであれば、ペプチド非電荷または両性イオン性であり得る。場合によっては、ペプチドは、生理学的ｐＨで正電荷を有し得る。場合によっては、ペプチドは、生理学的ｐＨで≧＋２、生理学的ｐＨで≧＋３．５、生理学的ｐＨで≧＋４．５の電荷を有し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つまたは複数のジスルフィド結合を含有して、中性ｐＨで正の正味電荷を有し、正味電荷は、＋０．５以下、＋１以下、＋１．５以下、＋２以下、＋２．５以下、＋３以下、＋３．５以下、＋４以下、＋４．５以下、＋５以下、＋５．５以下、＋６以下、＋６．５以下、＋７以下、＋７．５以下、＋８以下、＋８．５以下、＋９以下、＋１０以下であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、生理学的ｐＨで負の正味電荷を有し、正味電荷は、−０．５以下、−１以下、−１．５以下、−２以下、−２．５以下、−３以下、−３．５以下、−４または以下、−４．５以下、−５以下、−５．５以下、−６以下、−６．５以下、−７以下、−７．５以下、−８以下、−８．５以下、−９以下、−１０以下であり得る。場合によっては、ペプチド内の１つまたは複数の変異の操作は、生理学的ｐＨで等電点、電荷、表面電荷またはレオロジーが変化したペプチドをもたらす。サソリまたはクモ由来のペプチドに対するこのような変異の操作は、例えば、正味電荷を１、２、３、４、または５低下させ、または正味電荷を１、２、３、４、または５増加させることによって、複合体の正味電荷を変化させ得る。このような場合、遺伝子操作された変異は、軟骨と接触するペプチドの能力を促進してもよい。ペプチドのレオロジーおよび効力を改善するのに適したアミノ酸修飾は、保存的または非保存的変異を含み得る。ペプチドは、ペプチドがそれに由来する毒液または毒素の配列と比較して、最大で１アミノ酸変異、最大で２アミノ酸変異、最大で３アミノ酸変異、最大で４アミノ酸変異、最大で５アミノ酸変異、最大で６アミノ酸変異、最大で７アミノ酸変異、最大で８アミノ酸変異、最大で９アミノ酸変異、最大で１０アミノ酸変異、または別の適切な数の変異を含んでなり得る。その他の場合には、ペプチドまたはその機能的断は、ペプチドがそれに由来する毒液または毒素の配列と比較して、少なくとも１アミノ酸変異、少なくとも２アミノ酸変異、少なくとも３アミノ酸変異、少なくとも４アミノ酸変異、少なくとも５アミノ酸変異、少なくとも６アミノ酸変異、少なくとも７アミノ酸変異、少なくとも８アミノ酸変異、少なくとも９アミノ酸変異、少なくとも１０アミノ酸変異、または別の適切な数の変異を含んでなる。いくつかの実施形態では、ペプチド内で変異を操作して、生理学的ｐＨにおいて所望の電荷または安定性を有するペプチドが提供され得る。

【0101】

いくつかの実施形態において、電荷は軟骨のホーミングにおいて役割を果たし得る。溶液および生体内での本開示のペプチドの相互作用は、ノッチンペプチドの等電点（ｐＩ）および／または溶液のｐＨ、またはそれがある局所環境の影響を被り得る。溶液中のペプチドの電荷は、タンパク質の溶解度に、ならびに生体内分布、生物学的利用能、および全体的な薬物動態などのパラメータに、影響を及ぼし得る。さらに、正電荷分子は、負荷電分子と相互作用し得る。本明細書で開示されるペプチドなどの正電荷分子は、ヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒａｎｏｎ）およびアグリカンをはじめとする、軟骨中の負荷電細胞外マトリックス分子などの負荷電分子と相互作用し、結合し得る。正電荷残基はまた、受容体の負荷電残基や、細胞表面のイオンチャネル細孔の電気陰性領域などの、その他のタンパク質および分子の特定の領域と相互作用し得る。したがって、ペプチドのｐＩは、本開示のペプチドが軟骨に効率的にホーミングし得るかどうかに影響を及ぼし得る。ｐＩと軟骨ホーミングとの間の相関関係を同定することは、本開示のリードペプチド候補を同定する上で重要なストラテジーであり得る。ペプチドのｐＩは、Ｅｘｐａｓｙ ｐＩ ｃａｌｃｕｌａｔｏｒおよびＳｉｌｌｅｒｏ法をはじめとする、いくつかの異なる方法を用いて計算され得る。Ｅｘｐａｓｙ ｐＩは、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，に記載されているようにアミノ酸のｐＫａ値を計算することによって判定され得て、１５°Ｃまたは２５°Ｃで、９．２Ｍおよび９．８Ｍの尿素を添加した固定化ｐＨ勾配ゲル環境におけるｐＨ４．５からｐＨ７．３の間のポリペプチド移動を調べることによって定義された（Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．１４（１０）：１０２３−３１（１９９３））。ｐＩを計算するＳｉｌｌｅｒｏの方法は、多項式の解と各アミノ酸の個々のｐＫａｓを伴い得る。この方法は、変性条件（尿素）を使用しない（Ｓｉｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．１７９（２）：３１９−３５（１９８９））。これらのｐＩ計算方法を用いて、対象への投与後におけるペプチドシグナルの軟骨対血液比を定量化することは、電荷および軟骨ホーミングにおける傾向または相関を同定するためのストラテジーとなり得る。いくつかの実施形態では、生物学的ｐＨ（約ｐＨ７．４）を超えるｐＩを有するペプチドは、軟骨への効率的なホーミングを示し得る。いくつかの実施形態では、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、または少なくとも１１のｐＩを有するペプチドは、軟骨に効率的にホーミングし得る。その他の実施形態では、１１〜１２のｐＩを有するペプチドは、軟骨に最も効率的にホーミングし得る。特定の実施形態では、ペプチドは、約９のｐＩを有し得る。その他の実施形態では、ペプチドは、８〜１０のｐＩを有し得る。いくつかの実施形態では、より塩基性の高いペプチドは、軟骨により効率的にホーミングし得る。その他の実施形態では、高いｐＩだけでは、ペプチドの軟骨ホーミングを引き起こすのに十分でない場合がある。

【0102】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドの三次構造および静電気は、軟骨のホーミングに影響を及ぼし得る。電荷分布の構造解析または分析は、軟骨ホーミングなどの生物学的機能において重要な残基を予測するためのストラテジーであり得る。例えば、軟骨にホーミングする本開示のいくつかのペプチドは、本明細書で「ヒッチン」と定義される構造クラスにグループ分けされ得て、Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、およびＣ３−Ｃ６間のジスルフィド結合の特性を共有し得る。３つのジスルフィド結合（Ｃ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、およびＣ３−Ｃ６）を介して結ばれたペプチドの折り畳みトポロジーは、ジスルフィドの三次元配列に基づいて構造ファミリーに分類され得る。ノッチンは、Ｃ１−Ｃ４およびＣ２−Ｃ５ジスルフィド結合によって形成される大環状分子を通過するＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合を有し、ヒッチンは、Ｃ１−Ｃ４およびＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合によって形成される大員環を通過するＣ２−Ｃ５ジスルフィド結合を有し、なおもその他の構造ファミリーは、Ｃ２−Ｃ５およびＣ３−Ｃ６ジスルフィド結合によって形成される大員環を通過するＣ１−Ｃ４ジスルフィド結合を有する。これらのシステイン残基における保存されたジスルフィド結合、一次配列同一性および／または構造相同性を有する「ヒッチン」クラスペプチドの変異型は、軟骨にホーミングし得るその他の潜在的ノッチンペプチド候補を同定または予測する方法であり得る。さらに、カルシンファミリーのペプチドのメンバーおよび関連メンバーもまた、「ヒッチン」クラスのペプチドとは異なる三次構造を有するにもかかわらず、軟骨ホーミングし得る。カルシンペプチドは、構造的に、ノッチンジスルフィド連結性およびトポロジーを有するノッチンペプチドのサブセットであるが、リアノジン受容体（ＲｙＲ）に結合して活性化する機能に基づいてさらに分類される。これらの受容体は、筋肉内のカルシウムの流入および流出を調節するように作用する、カルシウムチャネルである（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５７（３）：３９２−４０３．（２００９））。保存された重要な残基を有するカルシンファミリーのペプチドの変異型は、軟骨にホーミングする有望な候補を予測する一方法であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドの構造分析は、様々なプロテアーゼまたは還元剤による緩衝液中での分解に対する耐性について、ペプチドを評価することによって判定され得るペプチド表面の電荷密度の分布の構造解析はまた、軟骨にホーミングし得る有望な候補を予測するためのストラテジーであり得る。陽性表面電荷の大きいパッチを有するペプチド（ｐＨ７．５の場合）は、軟骨にホーミングし得る。

【0103】

関連する構造相同体のＮＭＲ溶液構造、Ｘ線結晶学、または結晶構造を使用して、ペプチドが軟骨にホーミングする能力を保ちながら、折り畳み、安定性および製造可能性を改善し得る、変異ストラテジーに関する情報を提供し得る。それらを用いて、一群の構造的に相同的なスキャフォールドの３Ｄファーマコフォアが予測され、ならびに関連タンパク質の可能な移植領域が予測されて、改善された特性を有するキメラが作製され得る。例えば、このストラテジーを使用して、改善された特性を有する薬物を設計するために、またはペプチドの折り畳みおよび製造可能性を複雑にする有害な変異を修正するために使用され得る、重要なアミノ酸位置およびループを同定し得る。これらの重要なアミノ酸位置およびループが保持され得る一方で、ペプチド配列中のその他の残基は変異されて、ペプチドの機能、ホーミング、および活性が、改善、変更、除去、または別の様式で修飾され得る。

【0104】

さらに、２つ以上のペプチドの一次配列と三次配列との比較を用いて、配列および３Ｄ折り畳みパターンを明らかにし得て、それを活用してペプチドが改善され、これらのペプチドの生物学的活性が解析され得る。例えば、軟骨にホーミングする２つの異なるペプチドスキャフォールドを比較することで、改善された折り畳み特性を有する変異型を設計するなどの遺伝子操作ストラテジーの指針となり得る、保存されたファルマコフォアの同定をもたらし得る。例えば、重要なファルマコフォアは、結合に重要であり得る、芳香族残基または塩基性残基を含んでなり得る。

【0105】

改善されたペプチドはまた、ＴＥＰＩＴＯＰＥおよびＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎによって予測される免疫原性情報などの免疫原性（ｉｍｍｕｎｇｅｎｉｃｉｔｙ）情報に基づいて遺伝子操作され得る。ＴＥＰＩＴＯＰＥは、位置特異的重み行列を用いて、ペプチドが５１個の異なるＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合するかどうかの予測規則を提供する計算的アプローチであり、ＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎは、ポケットの類似性に基づいて、既知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子から、未知の結合特異性を有するＨＬＡ−ＤＲ分子に外挿する、ＴＥＰＩＴＯＰＥを用いる方法である。例えば、ＴＥＰＩＴＯＰＥおよびＴＥＰＩＴＯＰＥｐａｎは、軟骨にホーミングするペプチドの免疫原性を用いて判定し得る。高い免疫原性を有するペプチドと低い免疫原性を有するペプチドとの比較は、低い免疫原性を有する変異型を設計するための遺伝子操作ストラテジーの指針となり得る。

【0106】

本開示のペプチドは、ナトリウムチャネルに結合し得る。ペプチドは、カルシウムチャンネルに結合し得る。ペプチドは、カリウムチャネルおよび／またはナトリウムチャネルを遮断し得る。ペプチドは、カルシウムチャネルを遮断し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、カリウムチャネルおよび／またはナトリウムチャネルを活性化し得る。その他の実施形態では、ペプチドは、カルシウムチャネルを活性化し得る。なおもその他の実施形態では、ペプチドは、カリウムチャネル作動薬、カリウムチャネル拮抗薬、カリウムチャネルの一部、ナトリウムチャネル作動薬、ナトリウムチャネル拮抗薬、カルシウムチャネル作動薬、カルシウムチャネル拮抗薬、ハドルカルシン、セラホトキシン、フエントキシン、カリオトキシン、コバトキシンまたはレクチンであり得る。いくつかの実施形態では、レクチンは、ＳＨＬ−Ｉｂ２であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、イオンチャネルまたは塩化物チャネルと相互作用し、結合し、それを阻害し、不活性化し、またはその発現を変化させ得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎａｖ１．７イオンチャネルと相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｋｖ１．３イオンチャネルと相互作用し得る。なおもその他の実施形態では、ペプチドは、プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼと相互作用し、がん細胞移動または転移を阻害し，抗菌活性を有し、または抗腫瘍活性を有する。マトリックスメタロプロテイナーゼに作用するのに加えて、ペプチドは、その他の可能なプロテアーゼ（例えば、エラスターゼ）と相互作用し得る。

【0107】

いくつかの実施形態では、ペプチドは、軟骨またはその構造またはその近傍に、その他の治療効果を有する。関節軟骨中のβデフェンシン発現は、免疫調節機能ならびに（ａｓ ｗｅ ｗｅｌｌ ａｓ）変形性関節症、全身性エリテマトーデスや関節リウマチなどの自己免疫リウマチ性障害と相関し得る（Ｖｏｒｄｅｎｂａｅｕｍｅｎ ａｎｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ０１１，Ｖａｒｏｇａ ２００４およびＶａｒｏｇａ ２００５）。いくつかの実施形態では、ペプチドまたはそれらの変異体は、βデフェンシンを阻害し、βデフェンシンを補足し、βデフェンシンの競合阻害剤であり、βデフェンシン標的の活性化を遮断または活性化し（ａｃｔｉｖｅ ｏｒ ｂｌｏｃｋ）、免疫モジュレーターとして、または自己免疫、関節炎、感染症、およびその他の関節障害を治療するために使用される。

【0108】

本開示は、本明細書に記載の様々なペプチドの多量体もまた包含し得る。多量体の例としては、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体などが挙げられる。多量体は、複数の同一サブユニットから形成されるホモマー、または複数の異なるサブユニットから形成されるヘテロマーであり得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、少なくとも１つのその他のペプチド、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のその他のペプチドを有する多量体構造に配置される。特定の実施形態では、多量体構造のペプチドは、それぞれ同一配列を有する。代替の実施形態では、多量体構造のペプチドの一部または全部が、異なる配列を有する。

【0109】

本開示は、ペプチドスキャフォールドをさらに含み、これは例えば、追加的なペプチドを生成するための出発点として使用され得る。いくつかの実施形態では、これらのスキャフォールドは、様々なノットペプチドまたはノッチンに由来し得る。スキャフォールドのための、いくつかの適切なペプチドとしては、クロロトキシン、ブラゼイン、サーキュリン、ステクリスプ、ハナトキシン、ミッドカイン、ヘフトキシン、ジャガイモカルボキシペプチダーゼインヒビター、バブルプロテイン、アトラクチン、α−ＧＩ、α−ＧＩＤ、μ−ＰＩＩＩＡ、ω−ＭＶＩＩＡ、ω−ＣＶＩＤ、χ−ＭｒＩＡ、ρ−ＴＩＡ、コナントキンＧ、コンツラキンＧ、ＧｓＭＴｘ４、マルガトキシン、ｓｈＫ、毒素Ｋ、キモトリプシンインヒビター（ＣＴＩ）、およびＥＧＦエピレギュリンコアが挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0110】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチド配列には、追加のアミノ酸で挟まれる。１つまたは複数の追加的なアミノ酸は、例えば，所望の生体内電荷、等電点、化学的結合部位、安定性、または生理学的な性質をペプチドにもたらし得る。

【0111】

配列相同性を同定することは、軟骨のホーミング機能を維持する重要な残基を判定するために重要であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、保存された正荷電残基の同定は、作製される任意の相同変異型における軟骨のホーミングを保存する上で重要であり得る。その他の実施形態では、塩基性または芳香族ダイアドの同定は、相同変異型におけるＫｖイオンチャネルとの相互作用および活性を保存する上で重要であり得る。

【0112】

２つ以上のペプチドは、ある程度の相同性の程度を共有し得て、生体内で類似した特性を共有し得る。例えば、ペプチドは、本開示のペプチドと、ある程度の相同性を共有し得る。場合によっては、本開示のペプチドは、第２のペプチドと、最高約２０％のペアワイズ相同性、最高約２５％のペアワイズ相同性、最高約３０％のペアワイズ相同性、最高約３５％のペアワイズ相同性、最高約４０％のペアワイズ相同性、最高約４５％のペアワイズ相同性、最高約５０％のペアワイズ相同性、最高約５５％のペアワイズ相同性、最高約６０％のペアワイズ相同性、最高約６５％のペアワイズ相同性、最高約７０％のペアワイズ相同性、最高約７５％のペアワイズ相同性、最高約８０％のペアワイズ相同性、最高約８５％のペアワイズ相同性、最高約９０％のペアワイズ相同性、最高約９５％のペアワイズ相同性、最高約９６％のペアワイズ相同性、最高約９７％のペアワイズ相同性、最高約９８％のペアワイズ相同性、最高約９９％のペアワイズ相同性、最高約９９．５％のペアワイズ相同性、または最高約９９．９％のペアワイズ相同性を有し得る。場合によっては、本開示のペプチドは、第２のペプチドと、少なくとも約２０％のペアワイズ相同性、少なくとも約２５％のペアワイズ相同性、少なくとも約３０％のペアワイズ相同性、少なくとも約３５％のペアワイズ相同性、少なくとも約４０％のペアワイズ相同性、少なくとも約４５％のペアワイズ相同性、少なくとも約５０％のペアワイズ相同性、少なくとも約５５％のペアワイズ相同性、少なくとも約６０％のペアワイズ相同性、少なくとも約６５％のペアワイズ相同性、少なくとも約７０％のペアワイズ相同性、少なくとも約７５％のペアワイズ相同性、少なくとも約８０％のペアワイズ相同性、少なくとも約８５％のペアワイズ相同性、少なくとも約９０％のペアワイズ相同性、少なくとも約９５％のペアワイズ相同性、少なくとも約９６％のペアワイズ相同性、少なくとも約９７％のペアワイズ相同性、少なくとも約９８％のペアワイズ相同性、少なくとも約９９％のペアワイズ相同性、少なくとも約９９．５％のペアワイズ相同性、少なくとも約９９．９％のペアワイズ相同性を有し得る。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅなどの様々な方法およびソフトウエアプログラム、または別の適切な方法またはアルゴリズムを用いて、２つ以上のペプチド間の相同性を判定し得る。

【0113】

なおもその他の場合、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つのペプチドの変異型核酸分子は、コードされるペプチドアミノ酸配列と配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つのアミノ酸配列との配列同一性または相同性の判定によって、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイによって同定され得る。このようなペプチド変異型は、（１）洗浄ストリンジェンシーが、５５〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．５×〜２×ＳＳＣに相当するストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２（または先の配列の任意の補体）のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、（２）配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％を超える配列同一性または相同性を有するペプチドをコードする、核酸分子を含み得る。代案としては、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つのペプチド変異型は、（１）洗浄ストリンジェンシーが、５０〜６５℃で０．１％ＳＤＳを含む０．１×〜０．２×ＳＳＣに相当する高度にストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２（または先の配列の任意の補体）のいずれか１つのヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズしたままであり、（２）配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または９５％を超える配列同一性または相同性を有するペプチドをコードする核酸分子として特徴付けられ得る。

【0114】

配列同一性百分率または相同性は、従来法によって判定され得る。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏ．４８：６０３（１９８６）、およびＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい。簡潔に述べると、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、およびＨｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（同上）の「ＢＬＯＳＵＭ６２」重み行列を用いて、２つのアミノ酸配列が整列され、アライメントスコアが最適化される。次に配列同一性または相同性が、（［完全一致の総数］／［より長い配列長＋２つの配列を整列させるためにより長い配列に導入されたギャップ数］）（１００）として計算される。

【0115】

さらに、２つのアミノ酸配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在する。例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの「ＦＡＳＴＡ」類似性検索アルゴリズムは、本明細書で開示されるペプチドのアミノ酸配列と、ペプチド変異型のアミノ酸配列とによって共有される、配列同一性または相同性のレベルを調べるのに適した、タンパク質アライメント法である。ＦＡＳＴＡアルゴリズムは、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）、およびＰｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）によって説明される。簡潔に述べると、ＦＡＳＴＡは、保存的アミノ酸置換、挿入、または欠失を考慮することなく、クエリー配列（例えば、配列番号１）と、最高密度の同一性（ｋｔｕｐ変数が１の場合）または対の同一性（ｋｔｕｐ＝２の場合）のどちらかを有する試験配列とによって共有される領域を同定することによって、最初に配列類似性が特徴付けられる。次に、最高密度の同一性を有する１０の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、全ての対合アミノ酸の類似性を比較することによって再スコアされ、領域の末端は最も高いスコアに寄与する残基のみを含むように「トリミング」される。「カットオフ」値（配列長およびｋｔｕｐ値に基づく所定の式によって計算される）より大きいスコアを有するいくつかの領域が存在する場合、トリミングされた初期領域を調べて、領域を結合させてギャップとの近似整列を形成させ得るかどうかが判定される。最後に、２つのアミノ酸配列の最高スコア領域が、アミノ酸の挿入および欠失を許容する、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ−Ｓｅｌｌｅｒｓアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４（１９７０）；Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｓｉａｍ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２６：７８７（１９７４））の修正を用いて整列される。ＦＡＳＴＡ分析のための例示的なパラメーターは、ｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー＝１０、ギャップ延長ペナルティー＝１、および置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２である。これらのパラメータは、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３（１９９０）の補遺２で説明されるように、スコアリングマトリックスファイル（「ＳＭＡＴＲＩＸ」）を修正することにより、ＦＡＳＴＡプログラムに導入され得る。

【0116】

ＦＡＳＴＡを用いて、上で開示されるような比率を用いて、核酸分子の配列同一性または相同性が判定され得る。ヌクレオチド配列の比較のために、ｋｔｕｐ値は１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３の範囲であり得て、その他のパラメータは上記のように設定される。

【0117】

「保存的アミノ酸置換」である一般的なアミノ酸のいくつかの例は、以下の群のそれぞれの中のアミノ酸の間の置換によって例示される：（１）グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（２）フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、（３）セリンおよびスレオニン、（４）アスパラギン酸塩およびグルタミン酸、（５）グルタミンおよびアスパラギン、および（６）リジン、アルギニン、およびヒスチジン。ＢＬＯＳＵＭ６２表は、関連タンパク質の５００を超えるグループの高度に保存された領域に相当する、タンパク質配列断片の約２，０００の局所的な多重アライメントからのアミノ酸置換マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５（１９９２））。したがって、ＢＬＯＳＵＭ６２置換頻度を用いて、本発明のアミノ酸配列に導入されてもよい保存的アミノ酸置換が定義され得る。（上で考察されるように）化学的性質のみに基づいてアミノ酸置換を設計することも可能であるが、用語「保存的アミノ酸置換」は、好ましくは、−１より大きいＢＬＯＳＵＭ６２値によって表される置換を指す。例えば、置換が０、１、２または３のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる場合、アミノ酸置換は保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１、２または３）のＢＬＯＳＵＭ６２値によって特徴付けられる一方で、より好ましい保存的アミノ酸置換は、少なくとも２のＢＬＯＳＵＭ６２値（例えば、２または３）によって特徴付けられる。

【0118】

構造的完全性を維持するのに重要な領域またはドメイン内にあるアミノ酸残基の判定が、判定され得る（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｉｄ．．．ｃａｎ ｂｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．）これらの領域内では、程度の差はあるもの、変化に耐えて分子の全体的な三次構造を維持し得る、特定の残基を判定し得る。配列構造を分析する方法としては、アミノ酸またはヌクレオチドの高い同一性または相同性を有する複数の配列の整列、および利用可能なソフトウェア（例えば、Ｉｎｓｉｇｈｔ ＩＩ．ＲＴＭ．ｖｉｅｗｅｒ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｏｏｌｓ；ＭＳＩ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を用いたコンピュータ分析、二次構造の傾向、二成分パターン、相補的充填、および埋没極性相互作用が挙げられるが、これに限定されるものではない（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３７２−６（１９９５）およびＣｏｒｄｅｓ，Ｍ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：３−１０（１９９６））。一般に、分子への修正を設計し、または特定の断片を同定する場合、構造の判定は、典型的には、修飾分子の活性を評価することを伴い得る。

【0119】

配列アライメントを用いて、２つの生物学的配列（タンパク質または核酸）間の機能的、構造的および／または進化的関係を示してもよい、類似性領域が同定される。対照的に、多重配列アラインメント（ＭＳＡ）は、３つ以上の生物学的配列のアライメントである。ＭＳＡアプリケーションの結果から相同性が推定され、配列間の進化的関係が評価され得る。当業者は、本明細書の用法では、「配列相同性」および「配列同一性」および「パーセント（％）配列同一性」および「パーセント（％）配列相同性」が同義的に使用されており、必要に応じて、参照ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対する、配列の関連性または多様性を意味することを認識するであろう。

【0120】

化学修飾
ペプチドは、様々な方法の１つまたは複数で、化学的に修飾し得る。いくつかの実施形態では、ペプチドが変異して、機能が付加され、機能が欠失され、または生体内挙動が変更され得る。ジスルフィド結合間の１つまたは複数のループを修飾または置換して、その他のペプチドからの活性成分を含め得る（Ｍｏｏｒｅ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，５０３，ｐ．２２３−２５１，２０１２に記載されるように）。アミノ酸はまた、半減期を増加させ、生体内結合挙動を修飾または付加または欠失させ、新たな標的機能を追加し、表面電荷および疎水性を変更し、またはコンジュゲーション部位を可能にするなどのために変異させ得る。Ｎ−メチル化は、本開示のペプチドにおいて生じ得るメチル化の一例である。いくつかの実施形態では、ペプチドは遊離アミン上のメチル化によって修飾され得る。例えば、完全メチル化は、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムによる還元的メチル化の使用を通じて達成されてもよい。

【0121】

化学修飾は、例えば、ペプチドの半減期を延長し、または生体内分布または薬物動態プロファイルを変化させ得る。化学修飾は、ポリマー、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、生体高分子、ポリアミノ酸、脂肪酸、デンドリマー、Ｆｃ領域、パルミチン酸またはミリスチン酸（ｍｙｒｉｓｔｏｌａｔｅ）などの単純飽和炭素鎖、またはアルブミンを含んでなり得る。Ｆｃ領域を有するペプチドの化学修飾は、融合Ｆｃ−ペプチドであり得る。ポリアミノ酸としては、例えば、反復される単一アミノ酸（例えば、ポリグリシン）を有するポリアミノ酸配列、およびパターンに従っても従わなくてもよい混合ポリアミノ酸配列（例えば、ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｙ−ａｌａ）を有するポリアミノ酸配列、または前述の任意の組み合わせが挙げられる。

【0122】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、修飾がペプチドの安定性および／または半減期を増加させるように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部アミノ酸への疎水性部分の結合を使用して、本開示のペプチドの半減期を延長させ得る。他の実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、血清半減期に影響を及ぼし得る翻訳後修飾（例えば、メチル化および／またはアミド化）を含み得る。いくつかの実施形態では、単純炭素鎖（例えば、ミリストイル化および／またはパルミトイル化（ｐａｌｍｉｔｙｌａｔｉｏｎ）による）は、融合タンパク質またはペプチドにコンジュゲートされ得る。いくつかの実施形態では、単純炭素鎖は、融合タンパク質またはペプチドが、非コンジュゲート材料から容易に分離されるようにしてもよい。例えば、非コンジュゲート材料から融合タンパク質またはペプチドを分離するために用いられてもよい方法としては、溶媒抽出および逆相クロマトグラフィーが挙げられるが、これに限定されるものではない。親油性部分は、血清アルブミンへの可逆的結合を介して半減期を延長させ得る。コンジュゲートされた部分は、例えば、血清アルブミンへの可逆的結合を通じてペプチドの半減期を延長させる親油性部分であり得る。いくつかの実施形態では、親油性部分は、コレステン、コレスタン、コレスタジエン、およびオキシステロールをはじめとする、コレステロールまたはコレステロール誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ミリスチン酸（テトラデカン酸）またはその誘導体にコンジュゲートされ得る。その他の実施形態では、本開示のペプチドは、半減期修飾剤に結合される（例えば、コンジュゲートされる）。半減期修飾剤の例としては、ポリマー；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ヒドロキシエチルデンプン；ポリビニルアルコール；水溶性ポリマー；両性イオン性水溶性ポリマー；水溶性ポリ（アミノ酸）；プロリン、アラニンおよびセリンの水溶性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、およびセリンを含有する水溶性ポリマー；Ｆｃ領域；脂肪酸；パルミチン酸；またはアルブミンに結合する分子が挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0123】

いくつかの実施形態では、配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６または配列番号１９８〜配列番号２１６の最初の２つのＮ末端アミノ酸（ＧＳ）は、別の分子へのコンジュゲーションまたは融合を促進するための、ならびにこのようなコンジュゲートまたは融合された分子からの切断を容易にするための、スペーサーまたはリンカーの役割を果たす。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質またはペプチドは、例えば、ペプチドの特性を修飾しまたは変化させ得る、その他の部分にコンジュゲートさせ得る。

【0124】

活性薬剤コンジュゲート
本開示に従ったペプチドは、軟骨の疾患、障害または負傷の治療で使用するための薬剤にコンジュゲートまたは融合され得る。例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、機能的能力を提供する活性薬剤などの別の分子に融合され得る。活性薬剤の配列とペプチドの配列とを含有するベクターの発現を通じて、ペプチドが活性薬剤と融合され得る。様々な実施形態において、ペプチドの配列および活性薬剤の配列は、同一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から発現される。様々な実施形態において、ペプチドの配列および活性薬剤の配列は、連続配列を含んでなり得る。ペプチドおよび活性薬剤は、融合ペプチドにおいて、それらの機能的能力が別々に発現された場合と比較して、同様の機能的能力をそれぞれ維持し得る。

【0125】

さらに、例えば、特定の実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、機能的能力を提供する活性薬剤などの別の分子に付着される。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の活性薬剤が、ペプチドに連結され得る。複数の活性薬剤は、複数のリジン残基および／またはＮ末端にコンジュゲートさせるなどの方法によって付着させ得て、または複数のポリマーまたは活性薬剤をデンドリマーなどのスキャフォールドに連結させて、次に薬剤−スキャフォールドをペプチドに付着させることによって、付着させ得る（例えば、Ｙｕｒｋｏｖｅｔｓｋｉｙ，Ａ．Ｖ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７５（１６）：３３６５−７２（２０１５）に記載されている。活性薬剤の例としては、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣剤、ポリヌクレオチド、ポリリボヌクレオチド、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、抗体、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、抗体フラグメント、アプタマー、サイトカイン、インターフェロン、ホルモン、酵素、成長因子、チェックポイント阻害剤、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＣＤ抗原、ａａケモカイン（ａａ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）、神経伝達物質、イオンチャネル阻害剤、Ｇタンパク質共役型受容体阻害剤、Ｇタンパク質共役型受容体賦活剤、化学薬剤、放射線増感剤、放射線防護体、放射性核種、治療用小分子、ステロイド、コルチコステロイド、抗炎症剤、免疫修飾物質、補体結合ペプチドまたはタンパク質、腫瘍壊死因子阻害剤、腫瘍壊死因子賦活剤、腫瘍壊死因子受容体ファミリー作動薬、腫瘍壊死受容体拮抗薬、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）可溶性受容体または抗体、カスパーゼプロテアーゼ賦活剤または阻害剤、ＮＦ−κＢａＲＩＰＫ１および／またはＲＩＰＫ３阻害剤または賦活剤（例えば、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ＴＬＲ−３および／またはＴＬＲ−４、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などを通じた）、細胞死受容体リガンド（例えば、Ｆａｓリガンド）または、ＴＮＦ受容体ファミリー（例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、リンフォトキシンβ受容体／ＴＮＦＲＳ３、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６、デコイ受容体３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９、ＤＲ４（細胞死受容体４／ＴＮＦＲＳ１０Ａ）、ＤＲ５（細胞死受容体５／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）、デコイ受容体１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、デコイ受容体２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａの受容体）、ＯＰＧ（オステオプロテゲリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＤＲ３（細胞死受容体３／ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＴＷＥＡＫ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ、ＴＡＣｌ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＡＦＦ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス／ＴＮＦＲＳＦ１４）、神経成長因子受容体／ＴＮＦＲＳＦ１６、ＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原／ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＧＩＴＲ（グルココルチコイド−ＴＮＦ受容体／ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＡＪ（毒性およびＪＮＫ誘導物質／ＴＮＦＲＳＦ１９）、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＤＲ６（細胞死受容体６／ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦＲＳＦ２３、エクトジスプラシンＡ２イソ型受容体／ＴＮＦＲＳ２７、エクトジスプラシン１、および無汗性受容体、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーリガンドをはじめとする−ＴＮＦα、リンフォトキシン−α、腫瘍壊死因子膜型、腫瘍壊死因子脱落型、ＬＩＧＨＴ、リンフォトキシンβ_２α_１ヘテロ三量体、ＯＸ−４０リガンド、化合物１［ＰＭＩＤ：２４９３０７７６］、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、ＣＤ３０リガンド、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫリガンド、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ＴＬ６、エクトジスプラシンＡ２、エクトジスプラシンＡ１、ＴＩＭＰ−３阻害剤、ＢＣＬ−２ファミリー阻害剤、ＩＡＰ攪乱物質、プロテアーゼ阻害剤、アミノ糖、化学療法薬（アポトーシスまたは非アポトーシス経路を通じて作用するかどうかに関わりなく）（Ｒｉｃｃｉ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １１（４）：３４２−５７（２００６））、細胞毒性化学物質、毒素、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブメシレート）、プロトン、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｕｚｉｍａｂ）（抗血管剤）、エルロチニブ（ＥＧＦＲ阻害剤）、抗感染症薬、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌薬、アミノグリコシド、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、スタチン、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー、生体高分子、多糖類、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、ポリエチレングリコール、脂質、デンドリマー、脂肪酸、またはＦｃドメインまたはＦｃ領域、またはその活性断片または修飾が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記の活性薬剤の任意の組合せは、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートと同時送達され得る。さらに、いくつかの実施形態では、陽子線治療法または切除放射線療法などのその他の併用療法が、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートと共に、それを必要とする対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、直接、またはリンカーを介して、活性薬剤に共有結合または非共有結合される。ＴＮＦ遮断薬、炎症を引き起こして、クローン病、潰瘍性大腸炎、関節リウマチ、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、および尋常性乾癬などの免疫系疾患をもたらし得る、体内の実体であるＴＮＦの活性を遮断することによって免疫系を抑制する。このクラスの薬物としては、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）、エンブレル（エタネルセプト）、Ｈｕｍｉｒａ（アダリムマブ）、Ｃｉｍｚｉａ（セルトリズマブペゴル）、およびＳｉｍｐｏｎｉ（ゴリムマブ）が挙げられる。本明細書で開示されるペプチドは、軟骨に、ホーミング、分散、標的化、指向化、保持、蓄積、移動および／または結合させるために使用され得て、したがって付着または融合した活性薬剤を局在化するためにも使用され得る。さらに、ノットクロロトキシンペプチドは、細胞に内在化され得る（Ｗｉｒａｎｏｗｓｋａ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔ．，１１： ２７（２０１１））。したがって、活性薬剤ペプチドコンジュゲートまたは融合ペプチドの細胞内移行、細胞内局在、および内部移行後の細胞内輸送は、活性薬剤結合体コンジュゲートまたは融合体の有効性における重要要素であり得る（Ｄｕｃｒｙ，Ｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２０１３）；およびＳｉｎｇｈ，Ｓ．Ｋ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．３２（１１）：３５４１−３５７１（２０１５））。本明細書の実施形態で使用するのに適する例示的なリンカーは、以下でさらに詳細に考察される。

【0126】

本開示のペプチドまたは融合ペプチドは、組織または体液からペプチドを回収するための、親和性ハンドル（例えば、ビオチン）を提供するなどのその他の役割を果たし得る、その他の部分にコンジュゲートされ得る。例えば、本開示のペプチドまたは融合ペプチドはまた、ビオチンにコンジュゲートされ得る。半減期の延長に加えて、ビオチンは、組織またはその他の部位から、ペプチドまたは融合ペプチドを回収するための親和性ハンドルとしても作用し得る。いくつかの実施形態では、検出可能な標識および親和性ハンドルの双方として作用し得る、蛍光性ビオチンコンジュゲートを用い得る。市販の蛍光性ビオチンコンジュゲートの非限定的例としては、Ａｔｔｏ ４２５−ビオチン、Ａｔｔｏ ４８８−ビオチン、Ａｔｔｏ ５２０−ビオチン、Ａｔｔｏ−５５０ビオチン、Ａｔｔｏ ５６５−ビオチン、Ａｔｔｏ ５９０−ビオチン、Ａｔｔｏ ６１０−ビオチン、Ａｔｔｏ ６２０−ビオチン、Ａｔｔｏ ６５５−ビオチン、Ａｔｔｏ ６８０−ビオチン、Ａｔｔｏ ７００−ビオチン、Ａｔｔｏ ７２５−ビオチン、Ａｔｔｏ ７４０−ビオチン、フルオレセインビオチン、ビオチン−４−フルオレセイン、ビオチン−（５−フルオレセイン）コンジュゲート、およびビオチン−Ｂ−フィコエリトリン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ビオシチン、ＡＬＥＸＡ粉末（ｆｌｏｕｒ）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４９、ルシファーイエローカダベリンビオチン−Ｘ、ルシファーイエロービオシチン、オレゴングリーン４８８ビオシチン、ビオチン−ローダミン、およびテトラメチルローダミンビオシチンが挙げられるいくつかのその他の例では、コンジュゲートは、化学発光化合物、コロイド金属、ルミネセンス化合物、酵素、放射性同位体、および常磁性標識を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドはまた、別の分子にも付着され得る。例えば、ペプチド配列はまた、別の活性薬剤（例えば、小分子、ペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗体、アプタマー、サイトカイン、成長因子、神経伝達物質、先行するものいずれかの活性断片または修飾、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、アシル付加物、化学リンカー、または糖など）にも付着され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、活性薬剤に、融合、または共有結合、または非共有結合され得る。

【0127】

さらに、毒素または毒液から誘導された２つ以上のペプチド配列が、特定のペプチド上に存在し得て、または特定のペプチドと融合され得る。ペプチドは、様々な技術によって生体分子に組み込まれ得る。ペプチドは、アミド結合などの共有結合形成などの化学転換によって、組み込まれ得る。ペプチドは、例えば、固相または溶液相ペプチド合成によって組み込まれ得る。ペプチドは、生体分子をコードする核酸配列を調製することによって組み込まれ得て、その中で核酸配列は、ペプチドをコードする部分配列を含む。部分配列は、生体分子をコードする配列に加え得て、または生体分子をコードする配列の部分配列を置換し得る。

【0128】

検出可能薬剤コンジュゲート
ペプチドは、イメージング、研究、治療学、セラノスティクス、医薬品、化学療法、キレート療法、標的化薬物送達、および放射線療法に使用される薬剤にコンジュゲートさせ得る。薬剤は検出可能薬剤であり得る。いくつかの実施形態では、ノッチンペプチドは、例えば、金属、放射性同位体、色素、フルオロフォアまたはイメージングで使用され得る別の適切な材料などの検出可能薬剤にコンジュゲートされる。放射性同位体の非限定的例としては、α放射体、β放射体、陽電子放射体、およびγ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、およびイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５または鉛−２１２である。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、６５０ｎｍ〜４０００ｎｍの波長の電磁放射を発する蛍光剤であり、このような放射は薬剤を検出するために使用されている。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、本開示でコンジュゲート分子として使用され得る蛍光剤であり、ＤｙＬｉｇｈｔ−６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ−７５０、ＶｉｖｏＴａｇ−７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ−８００、ＩＲＤｙｅ−８００、ＶｉｖｏＴａｇ−６８０、Ｃｙ５．５、またはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）をはじめとする蛍光染料の非限定的例からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、近赤外線染料は、しばしばシアニン染料を含む。本開示のコンジュゲート分子として使用される蛍光染料の追加的な非限定的例としては、アクリジン（ａｃｒａｄｉｎｅ）オレンジまたはイエロー、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒおよびそのあらゆる誘導体、７−アクチノマイシンＤ、８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸、ＡＴＴＯ色素およびそのあらゆる誘導体、オーラミン−ローダミン染色およびそのあらゆる誘導体、ベンゾアントロン（ｂｅｎｓａｎｔｒｈｏｎｅ）、ビマン、９−１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン（ｎａｔｈｔｈａｃｅｎｅ）、ビスベンズイミド、ブレインボウ、カルセイン、カルボキシフルオレセイン（ｃａｒｂｏｄｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）およびそのあらゆる誘導体、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセンおよびそのあらゆる誘導体、ＤＡＰＩ、ＤｉＯＣ６、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒｓおよびそのあらゆる誘導体、エピコッコノン、臭化エチジウム、ＦｌＡｓＨ−ＥＤＴ２、Ｆｌｕｏ色素およびそのあらゆる誘導体、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅおよびそのあらゆる誘導体、フルオレセインおよびそのあらゆる誘導体、Ｆｕｒａおよびそのあらゆる誘導体、ＧｅｌＧｒｅｅｎおよびそのあらゆる誘導体、ＧｅｌＲｅｄおよびそのあらゆる誘導体、蛍光タンパク質およびそのあらゆる誘導体、例えばｍＣｈｅｒｒｙなどのｍイソ型タンパク質およびそのあらゆる誘導体、ヘプタメチン（ｈｅｔａｍｅｔｈｉｎｅ）色素およびそのあらゆる誘導体、ヘキスト（ｈｏｅｓｃｈｓｔ）染色、イミノクマリン、インディアンイエロー、ｉｎｄｏ−１およびそのあらゆる誘導体、ラウルダン、ルシファーイエローおよびそのあらゆる誘導体、ルシフェリンおよびそのあらゆる誘導体、ルシフェラーゼおよびそのあらゆる誘導体、メロシアニン（ｍｅｒｃｏｃｙａｎｉｎｅ）およびそのあらゆる誘導体、ナイル染料およびそのあらゆる誘導体、ペリレン、フロキシン、フィコ色素およびそのあらゆる誘導体、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）、ピラニン、ローダミンおよびそのあらゆる誘導体、リボグリーン、ＲｏＧＦＰ、ルブレン、スチルベンおよびそのあらゆる誘導体、スルホローダミンおよびそのあらゆる誘導体、ＳＹＢＲおよびそのあらゆる誘導体、ｓｙｎａｐｔｏ−ｐＨｌｕｏｒｉｎ、テトラフェニルブタジエン、テトラナトリウムトリス、テキサスレッド、チタンイエロー、ＴＳＱ、ウンベリフェロン、ビオラントロン、黄色蛍光タンパク質（ｙｅｌｌｏｗ ｆｌｕｒｏｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＹＯＹＯ−１が挙げられる。その他の適切な蛍光染料としては、フルオレセインおよびフルオレセイン染料（例えば、フルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’、５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭなど）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、フィコエリトリン、エリスロシン、エオシン、ローダミン染料（例えば、カルボキシテトラメチル−ローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリンおよびクマリン染料（例えば、メトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、オレゴングリーン染料（例えば、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、など）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、スペクトラムレッド、スペクトラムグリーン、シアニン染料（例えば、ＣＹ−３、Ｃｙ−５、ＣＹ−３．５、ＣＹ−５．５など）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ染料（例えば、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ３５０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５３２、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５４６、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５６８、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ５９４、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６３３、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６６０、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ６８０など）、ＢＯＤＩＰＹ染料（例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅｓ（例えば、ＩＲＤ４０、ＩＲＤ ７００、ＩＲＤ ８００など）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。追加的な適切な検出可能薬剤は、ＰＣＴ／ＵＳ第１４／５６１７７号明細書に記載される。放射性同位体の非限定的例としては、α放射体、β放射体、陽電子放射体、およびγ放射体が挙げられる。いくつかの実施形態では、金属または放射性同位体は、アクチニウム、アメリシウム、ビスマス、カドミウム、セシウム、コバルト、ユウロピウム、ガドリニウム、イリジウム、鉛、ルテチウム、マンガン、パラジウム、ポロニウム、ラジウム、ルテニウム、サマリウム、ストロンチウム、テクネチウム、タリウム、およびイットリウムからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、金属は、アクチニウム、ビスマス、鉛、ラジウム、ストロンチウム、サマリウム、またはイットリウムである。いくつかの実施形態では、放射性同位体は、アクチニウム−２２５または鉛−２１２である。

【0129】

本開示のその他の実施形態は、放射線増感剤または光増感剤にコンジュゲートされたペプチドを提供する。放射線増感剤の例としては、ＡＢＴ−２６３、ＡＢＴ−１９９、ＷＥＨＩ−５３９、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、ゲムシタビン、エタニダゾール、ミソニダゾール、チラパザミン、および核酸塩基誘導体（例えば、ハロゲン化プリンまたはピリミジン、例えば、５−フルオロデオキシウリジン）が挙げられるが、これに限定されるものではない。光増感剤の例としては、照射発熱蛍光性分子またはビーズ、ポルフィリンおよびポルフィリン誘導体（例えば、クロリン、バクテリオクロリン，イソバクテリオクロリン、フタロシアニン、およびナフタロシアニン）、金属ポルフィリン、金属フタロシアニン、アンゲリシン、カルコゲンアピリリウム（ｃｈａｌｃｏｇｅｎａｐｙｒｒｉｌｌｉｕｍ）染料、クロロフィル、クマリン、フラビンとアロキサジンおよびリボフラビンなどの関連化合物、フラーレン、フェオホルビド、ピロフェオホルビド、シアニン（例えば、メロシアニン５４０）、フェオフィチン、サフィリン、テキサフィリン、プルプリン、ポルフィセン、フェノチアジニウム、メチレンブルー誘導体、ナフタルイミド、ナイルブルー誘導体、キノン、ペリレンキノン（例えば、ヒペリシン、ヒポクレリン、およびセルコスポリン）、ソラレン、キノン、レチノイド、ローダミン、チオフェン、ベルジン（ｖｅｒｄｉｎｓ）、キサンテン染料（例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル）、ポルフィリンの二量体およびオリゴマー形態、および５−アミノレブリン酸などのプロドラッグが挙げられるが、これに限定されるものではない。有利なことに、このアプローチは、治療薬（例えば、薬物）および電磁エネルギー（例えば、放射線または光）の双方を同時に用いて、病的細胞（例えば、がん細胞）の高度に特異的な標的化を可能にする。いくつかの実施形態では、ペプチドは、例えば、直接、またはリンカーを介して、薬剤に共有結合、または非共有結合される。本明細書の実施形態で使用するのに適する例示的なリンカーは、以下でさらに詳細に考察される。

【0130】

リンカー
軟骨にホーミング、標的化、移動、保持、蓄積、および／または結合、または指向化する本開示に従ったペプチドは、リンカーを介して、またはリンカー非存在下で直接、小分子、第２のペプチド、タンパク質、抗体、抗体断片、アプタマー、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、フルオロフォア、放射性同位体、放射性核種キレート剤、ポリマー、生体高分子、脂肪酸、アシル付加物、化学リンカー、または糖または本明細書に記載されるその他の活性薬剤などの別の部分（例えば、活性薬剤）に付着され得る。

【0131】

ペプチドは、共有結合によって別の分子に直接付着し得る。例えば、ペプチドは、より大きなポリペプチドまたはペプチド分子のアミノ酸配列末端に付着し、またはリジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基の側鎖などの側鎖に付着する。付着は、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素一重、二重または三重結合、ジスルフィド結合、またはチオエーテル結合を介し得る。いくつかの実施形態では、開示されるペプチドそれ自体の類似領域（アミノ酸配列の末端；リジン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン酸、非天然アミノ酸残基、またはグルタミン酸残基側鎖などのアミノ酸側鎖、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、カルバメート結合、炭素−窒素結合、トリアゾール、大環状分子、オキシム結合、ヒドラゾン結合、炭素−炭素一重、二重または三重結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、または本明細書に記載されるようなリンカーを介するなど）を使用して、別の分子が連結されてもよい。

【0132】

リンカーを介する付着は、別の分子とペプチドとの間のリンカー部分の組み込みを伴ってもよい。ペプチドおよび別の分子は、どちらもリンカーに共有結合的に付着され得る。リンカーは切断可能、切断不能、自己犠牲、親水性、または疎水性であり得る。リンカーは、１つが別の分子に結合して１つがペプチドに結合する少なくとも２つの官能基と、２つの官能基間の連結部分とを有し得る。

【0133】

付着のための官能基の非限定的例としては、アミド結合、エステル結合、エーテル結合、炭酸結合、カルバメート結合、またはチオエーテル結合を形成できる官能基を挙げることが出来る。このような結合を形成できる官能基の非限定的例としては、アミノ基；カルボキシル基；ヒドロキシル基；アルデヒド基；アジ化物基；アルキンおよびアルケン基；ケトン；ヒドラジド；酸フッ化物、塩化物、臭化物、およびヨウ化物などの酸ハロゲン化物；対称性、混合、および環式酸無水物をはじめとする酸無水物；炭酸塩；シアノ、スクシンイミジル、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミジルなどの離脱基に結合するカルボニル官能基；ヒドロキシル基；スルフヒドリル基；および例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリルやまたはハロゲン化物、メシレート、トシレート、トリフレート、エポキシド、リン酸エステル、硫酸エステル、およびベシレートなどのベンジル離脱基を有する分子が挙げることが出来る。

【0134】

連結部分の非限定的例としては、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ポリエーテル、ポリエステルなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシカルボン酸、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリペプチド、切断可能ペプチド、バリン−シトルリン、アミノベンジルカルバメート、Ｄ−アミノ酸、およびポリアミンが挙げられ、これらのいずれも未置換であるか、またはハロゲン、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、アミノ基、ニトロ基、ニトロソ基、シアノ基、アジド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホンアミド基、カルボキシル基、カルボキサルデヒド基、イミン基、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、ハロアルケニル基、アルキニル基、ハロアルキニル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、アラルキル基、アリールアルコキシ基、ヘテロシクリル基、アシル基、アシルオキシ基、カルバメート基、アミド基、ウレタン基、エポキシドおよびエステル基などの置換基の任意の数で置換される。

【0135】

リンカーの非限定的な例としては、

【化1】

[この文献は図面を表示できません]

が挙げられ、
式中、各ｎは、独立して０〜約１，０００；１〜約１，０００；０〜約５００；１〜約５００；０〜約２５０；１〜約２５０；０〜約２００；１〜約２００；０〜約１５０；１〜約１５０；０〜約１００；１〜約１００；０〜約５０；１〜約５０；０〜約４０；１〜約４０；０〜約３０；１〜約３０；０〜約２５；１〜約２５；０〜約２０；１〜約２０；０〜約１５；１〜約１５；０〜約１０；１〜約１０；０〜約５；または１〜約５である。いくつかの実施形態では、各ｎは、独立して０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。いくつかの実施形態では、ｍは、１〜約１，０００；１〜約５００；１〜約２５０；１〜約２００；１〜約１５０；１〜約１００；１〜約５０；１〜約４０；１〜約３０；１〜約２５；１〜約２０；１〜約１５；１〜約１０；または１〜約５である。いくつかの実施形態では、ｍは、０、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、または約５０である。

【0136】

いくつかの場合において、リンカーはコハク酸リンカーであり得て、薬剤はエステル結合、または２つのメチレン炭素を間に有するアミド結合を介して、ペプチドに付着され得る。その他の場合には、リンカーは、ヒドロキシヘキサン酸または乳酸などのヒドロキシル基およびカルボン酸の双方を有する、任意のリンカーであり得る。

【0137】

リンカーは、切断可能または切断不能リンカーであり得る。切断可能リンカーの使用は、例えば、軟骨への標的化後における、ペプチドからのコンジュゲートされた部分（例えば、治療薬）の放出を可能にする。場合によっては、例えば、バリン−シトルリンリンカーなどのように、リンカーは酵素切断可能である。いくつかの実施形態では、リンカーは、自己犠牲部分を含有する。その他の実施形態では、リンカーは、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、トロンビン、またはカテプシンのための切断部位など、特定のプロテアーゼのための１つまたは複数の切断部位を含む。代案としては、または組み合わせて、リンカーは、ｐＨ、還元または加水分解などのその他の機序によって切断可能である。（本明細書に記載のその他の切断可能リンカーの中でも）加水分解的に不安定なリンカーは、ペプチドから活性薬剤を放出する観点から有利であり得る。例えば、ペプチドとのコンジュゲート形態にある活性剤は活性でなくてもよいが、軟骨への標的化後におけるコンジュゲートからの放出時には、活性剤は活性である。

【0138】

リンカーの加水分解速度は、調節され得る。例えば、非障害エステルを有するリンカーの加水分解速度は、エステルカルボニルの隣に嵩高い基を有するリンカーの加水分解と比較して、より迅速である。嵩高い基は、メチル基、エチル基、フェニル基、環、またはイソプロピル基、または立体バルクを提供する任意の基であり得る。場合によっては、立体バルクは、ケトロラクによってなど、薬物自体によって、そのカルボン酸を介してコンジュゲートされた際に提供され得る。リンカーの加水分解速度は、軟骨中のコンジュゲートの滞留時間に応じて調節され得る。例えば、ペプチドが比較的迅速に軟骨から除去される場合、リンカーは、迅速に加水分解するように調節され得る。対照的に、例えば、ペプチドが軟骨中でより長い滞留時間を有する場合、より緩慢な加水分解速度は、活性薬剤の延長された送達を可能にできる。これは、ペプチドを使用して、軟骨に薬物を送達する場合に重要であり得る。”Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ ｐｒｏｄｒｕｇ ｆｏｒ ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ”Ｓｃｉ Ｒｅｐ ２０１５，５，１２０２３ Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，は、修飾された加水分解速度の例を提供する。

【0139】

ペプチド安定性
本開示のペプチドは、様々な生物学的条件において安定であり得る。例えば、配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２任意のペプチドは、還元剤、プロテアーゼ、酸化的条件、または酸性条件に対する抵抗性を示し得る。

【0140】

場合によっては、生物学的分子（ペプチドおよびタンパク質など）は、治療機能を提供し得るが、このような治療機能は、生体内環境によって引き起こされる不安定性によって減少し、または妨げられる。（Ｍｏｒｏｚ ｅｔ ａｌ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ １０１：１０８−２１（２０１６）、Ｍｉｔｒａｇｏｔｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １３（９）：６５５−７２（２０１４）、Ｂｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒ Ｄｅｌｉｖ（１１）：１４４３−６７（２０１３）、Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２４（１）：６３−９２（２００７）、Ｈａｍｍａｎ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＤｒｕｇｓ１９（３）：１６５−７７（２００５））。例えば、消化管は、低ｐＨ（例えば．ｐＨ〜１）領域、還元性環境、またはペプチドおよびタンパク質を分解し得るプロテアーゼに富む環境を含有し得る。口、眼、肺、鼻腔内窩洞、関節、皮膚、膣鎖、粘膜、および血清などの身体のその他の領域におけるタンパク質分解活性もまた、機能的に活性なペプチドおよびポリペプチドの送達に対する障害であり得る。さらに、血清中のペプチドの半減期は、ある程度はプロテアーゼのために非常に短くあり得て、その結果、ペプチドは、妥当な投与レジメンを投与した場合に、持続的な治療効果を有するには、あまりにも迅速に分解され得る。同様に、リソソームなどの細胞コンパートメント内のタンパク質分解活性、およびリソソームおよび細胞質ゾル内の還元活性は、ペプチドおよびタンパク質を分解し得て、その結果、それらは、細胞内標的に対して治療機能を提供できないこともある。したがって、還元剤、プロテアーゼ、および低ｐＨに抵抗性のペプチドは、生体内で増強された治療効果を提供し、または共配合されまたはコンジュゲートされた活性薬剤の治療有効性を増強できてもよい。

【0141】

さらに、薬物の経口送達は、この投与方法によって提示される機能的に活性なペプチドおよびポリペプチドの送達に対する障害にもかかわらず、身体の特定の領域（例えば、結腸がん、過敏性腸疾患、感染症、代謝障害、および便秘症などの消化管における疾患）を標的化するために望ましくあり得る。例えば、薬物の経口送達は、非経口送達と比較して、患者の服用により便利な剤形を提供することによって、服薬遵守を高め得る。経口送達は、大きな治療濃度域を有する治療レジメンにおいて有用であり得る。したがって、還元剤、プロテアーゼ、および低ｐＨに抵抗性のペプチドは、それらの治療機能を無効にすることなく、ペプチドの経口送達を可能にすることができる。

【0142】

還元剤抵抗性ペプチド
本開示のペプチドは、ペプチドの折り畳まれた状態を保持するために不可欠であり得るジスルフィド架橋に関与し得る、１つまたは複数のシステインを含有し得る。還元剤がある生物学的環境へのペプチドの曝露は、ペプチドの展開、および機能性と生物活性の喪失をもたらし得る。例えば、グルタチオン（ＧＳＨ）は、体内および細胞内の多くの領域に存在し得て、ジスルフィド結合を還元し得る還元剤である。別の例として、ペプチドは、経口投与後における胃腸上皮を時に超えるペプチドの輸送中の細胞内移行時に、還元され得る。ペプチドは、消化管の様々な部分に曝露されると還元され得る。胃腸管は還元性環境であり得て、それはジスルフィド結合の還元のために、ジスルフィド結合を有する治療分子が最適な治療有効性を有する能力を阻害し得る。ペプチドはまた、エンドソームまたはリソソームによる内部移行、または細胞質ゾル、またはその他の細胞コンパートメントへの内部移行の後などの、細胞への侵入時に還元され得る。ジスルフィド結合の還元およびペプチドの展開は、機能性の喪失につながり、または生物学的利用能、ピーク血漿濃度、生物活性、および半減期などの重要な薬物動態パラメータに影響を及ぼし得る。ジスルフィド結合の還元はまた、プロテアーゼによる引き続く分解に対するペプチドの感受性の増加につながり、投与後に、無傷のペプチドの急速な喪失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、還元抵抗性のペプチドは無傷のままであり得て、より容易に還元されるペプチドと比較して、身体の様々な区画において、および細胞において、より長期にわたって機能的活性を付与し得る。．

【0143】

特定の実施形態では、本開示のペプチドは、還元剤抵抗性の特徴について分析され、安定なペプチドが同定され得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、例えば、０．００００１Ｍ〜０．０００１Ｍ、０．０００１Ｍ〜０．００１Ｍ、０．００１Ｍ〜０．０１Ｍ、０．０１Ｍ〜０．０５Ｍ、０．０５Ｍ〜０．１Ｍなどの異なるモル濃度の還元剤に１５分以上曝露された後に、無傷のままであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド安定性を判定するために使用される還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール、（還元型）グルタチオン（ＧＳＨ）、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％のペプチドが、還元剤への曝露後に無傷のままである。

【0144】

プロテアーゼ抵抗性ペプチド
本開示のペプチドの安定性は、プロテアーゼ分解抵抗性によって判定され得る。ペプチダーゼまたはプロテイナーゼとも称されるプロテアーゼは、隣接するアミノ酸間の結合を破壊することによってペプチドおよびタンパク質を分解し得る酵素であり得る。特定のアミノ酸を標的化する特異性を有するプロテアーゼのファミリーとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、エステラーゼ、血清プロテアーゼ、およびアスパラギンプロテアーゼが挙げられる。さらに、メタロプロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、チトクロームＰ４５０酵素、およびカテプシンもまた、ペプチドおよびタンパク質を消化し得る。プロテアーゼは、血液、粘膜、肺、皮膚、胃腸管、口、鼻、眼、および細胞の区画に、高濃度で存在し得る。プロテアーゼの誤調節はまた、関節リウマチおよびその他の免疫障害などの様々な疾患に存在し得る。プロテアーゼによる分解は、治療分子の生物学的利用能、生体内分布、半減期、および生物活性を低下させ得て、その結果、それらは、治療機能を果たすことができない。いくつかの実施形態では、プロテアーゼに対して抵抗性であるペプチドは、生体内で合理的に耐容される濃度で、治療活性をより良好に提供し得る。

【0145】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、任意のクラスのプロテアーゼによる分解に抵抗し得る。特定の実施形態では、本開示ペプチドは、ペプシン（胃に見いだされ得る）、トリプシン（十二指腸に見いだされ得る）、血清プロテアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗する。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、肺プロテアーゼ（例えば、セリン、システイニル、およびアスパルチルプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、好中球エラスターゼ、α−１アンチトリプシン、分泌性ロイコプロテアーゼ阻害剤、エラフィン）、またはそれらの任意の組み合わせによる分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、ペプチド安定性を判定するのに使用されるプロテアーゼは、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％のペプチドが、プロテアーゼへの曝露後に無傷のままである。配列番号２１２、配列番号２４、および配列番号１１１のペプチドは、プロテアーゼ分解に対してそれらをより抵抗性にする、特定の構造的性質を有し得る。例えば、配列番号２４および配列番号１１２のペプチドは、プロテアーゼおよび化学分解に対する抵抗性に関連し得る、前述の「ヒッチン」トポロジーを示す。

【0146】

酸性条件下におけるペプチド安定性
本開示のペプチドは、酸性である生物学的環境に投与され得る。例えば、経口投与後に、ペプチドは、胃および消化（ＧＩ）管の胃液中の酸性環境条件を経験し得る。胃のｐＨは約１〜４に及び得て、消化管のｐＨは酸性から正常生理学的ｐＨの範囲にわたり、上部消化管から結腸にかけて低下する（ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ）。さらに、膣、後期エンドソーム、およびリソソームもまた、ｐＨ７未満のような酸性ｐＨ値を有し得る。これらの酸性条件は、折り畳まれていない状態へのペプチドおよびタンパク質の変性をもたらし得る。ペプチドおよびタンパク質の展開は、その他の酵素による引き続く消化に対する感受性の増加、ならびにペプチドの生物学的活性の喪失をもたらし得る。

【0147】

特定の実施形態では、本開示のペプチドは、酸性条件下で、および酸性条件をシミュレートする緩衝液中で、変性および分解に抵抗し得る。特定の実施形態では、本開示のペプチドは、ｐＨ１未満、ｐＨ２未満、ｐＨ３未満、ｐＨ４未満、ｐＨ５未満、ｐＨ６未満、ｐＨ７未満、またはｐＨ８未満の緩衝液中の変性または分解に抵抗し得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１〜３のｐＨで無傷のままである。特定の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、ｐＨ１未満、ｐＨ２未満、ｐＨ３未満、ｐＨ４未満、ｐＨ５未満、ｐＨ６未満、ｐＨ７未満、またはｐＨ８未満の緩衝液への曝露後に無傷のままである。その他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、ｐＨ１〜３の緩衝液への曝露後に無傷のままである。その他の実施形態では、本開示のペプチドは、人工胃液（ｐＨ１〜２）中の変性または分解に抵抗性であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも５〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０〜１００％のペプチドが、人工胃液への曝露後に無傷のままである。いくつかの実施形態では、人工胃液またはクエン酸緩衝液などの低ｐＨ溶液を使用して、ペプチド安定性を判定し得る。

【0148】

高温におけるペプチド安定性
本開示のペプチドは、高温の生物学的環境において投与され得る。例えば、経口投与後に、ペプチドは体内で高温を経験し得る。体温は３６℃〜４０℃に及び得る。高温は、ペプチドおよびタンパク質の折り畳まれていない状態への変性をもたらし得る。ペプチドおよびタンパク質の展開は、その他の酵素による引き続く消化に対する感受性の増加、ならびにペプチドの生物学的活性の喪失をもたらし得る。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、２５°Ｃ〜１００℃の温度で無傷のままであり得る。高温は、ペプチドのより迅速な分解をもたらし得る。より高い温度での安定性は、熱帯環境または冷蔵へのアクセスが限られた地域における、ペプチドの貯蔵を可能にする。特定の実施形態では、５％〜１００％のペプチドは、６ヶ月間〜５年間にわたる２５°Ｃへの曝露後に無傷のままであり得る。５％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる７０°Ｃへの曝露後に、無傷のままであり得る。５％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる１００°Ｃへの曝露後に、無傷のままであり得る。その他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、６ヶ月間〜５年間にわたる２５°Ｃへの曝露後に無傷のままである。その他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる７０°Ｃへの曝露後に無傷のままである。その他の実施形態では、少なくとも５％〜１０％、少なくとも１０％〜２０％、少なくとも２０％〜３０％、少なくとも３０％〜４０％、少なくとも４０％〜５０％、少なくとも５０％〜６０％、少なくとも６０％〜７０％、少なくとも７０％〜８０％、少なくとも８０％〜９０％、または少なくとも９０％〜１００％のペプチドは、１５分間〜１時間にわたる１００°Ｃへの曝露後に無傷のままである。

【0149】

ペプチドの薬物動態学
本開示のペプチドのいずれかの薬物動態は、異なる投与経路を通じたペプチドの投与後に判定され得る。例えば、本開示のペプチドの薬物動態パラメータは、静脈内、皮下、筋肉内、直腸、エアロゾル、眼部、肺、経皮、膣、眼、経鼻、経口、舌下、吸入、皮膚、クモ膜下腔内、鼻腔内、関節内、腹膜、バッカル、滑液、または局所投与の後に定量化され得る。本開示のペプチドは、放射性標識またはフルオロフォアなどの追跡剤を使用して、分析され得る。例えば、本開示の放射性標識ペプチドは、様々な投与経路を通じて投与され得る。血漿、尿、糞便、任意の臓器、皮膚、筋肉、およびその他の組織などの様々な生物学的サンプルにおけるペプチド濃度または用量回収率は、ＨＰＬＣ、蛍光検出技術（ＴＥＣＡＮ定量、フローサイトメトリー、ｉＶＩＳ）、または液体シンチレーション計数をはじめとする、一連の方法を用いて判定され得る。

【0150】

本明細書に記載される方法および組成物は、任意の経路を通じた対象へのペプチド投与の薬物動態に関連し得る。薬物動態は、方法およびモデル、例えばコンパートメントモデルまたは非コンパートメント法を用いて記述され得る。コンパートメントモデルとしては、単コンパートメントモデル、２コンパートメントモデル、多コンパートメントモデルなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。モデルは、異なるコンパートメントに分類され得て、対応するスキームによって記述され得る。例えば、１つのスキームは、吸収、分布、代謝、および排泄（ＡＤＭＥ）スキームである。別の例として、別のスキームは、遊離、吸収、分布、代謝、および排泄（ＬＡＤＭＥ）スキームである。いくつかの態様では、代謝および排泄は、排泄コンパートメントと称される１つのコンパートメントに分類され得る。例えば、遊離は、送達系からの組成物の活性部分の遊離を含み得て、吸収は、対象による組成物の活性部分吸収を含み得て、分布は、血漿を通じた、異なる組織への、組成物の代謝または不活性化をはじめとする代謝への、最後に組成物または組成物代謝産物の排泄または排出をはじめとする排泄への、組成物の分布が挙げられる。対象に静脈内投与される組成物は、組織分布および代謝／排出の側面をはじめとするが、これに限定されるものではない、多相薬物動態学的プロファイルの対象となり得る。したがって、組成物の血漿または血清濃度の減少は、例えば、α相およびβ相を含む二相性であることが多く、時にはγ、δまたはその他の相が観察される。

【0151】

薬物動態学には、対象へのペプチドの投与に関連する少なくとも１つのパラメータを判定することが含まれる。いくつかの態様では、パラメータは、少なくとも用量（Ｄ）、投与間隔（τ）、曲線下面積（ＡＵＣ）、最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）、後続の用量が投与される前に到達した最小濃度（Ｃ_ｍｉｎ）、最小時間（Ｔ_ｍｉｎ）、極大到達時間Ｃｍａｘ（Ｔ_ｍａｘ）、分布容積（Ｖ_ｄ）、定常状態分布容積（Ｖ_ｓｓ）、時間０における逆外挿された濃度（Ｃ_０）、定常状態濃度（Ｃ_ｓｓ）、排除速度定数（ｋ_ｅ）、輸液速度（ｋ_ｉｎ）、クリアランス（ＣＬ）、生物学的利用能（ｆ）、変動（％ＰＴＦ）、および排出半減期（ｔ_１／２）を含む。

【0152】

特定の実施形態では、配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれかのペプチドは、経口投与後に最適薬物動態パラメータを示す。その他の実施形態では、配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれかのペプチドは、経口投与、吸入、鼻腔内投与、局所投与、静脈内投与、皮下投与、関節内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、またはそれらの任意の組み合わせなどの任意の投与経路後に、最適薬物動態パラメータを示す。

【0153】

いくつかの実施形態では配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２の任意のペプチドは、０．５〜１２時間のまたはＣ_ｍａｘ到達時点である１〜４８時間の平均Ｔ_ｍａｘ；ペプチドを経口経路により対象に投与した後の対象における０．１％〜１０％の血清中の平均生物学的利用能；消化管への送達のための対象への経口投与後の０．１％未満の血清中の平均生物学的利用能；非経口投与後の１０〜１００％の血清中の平均生物学的利用能；対象へのペプチド投与後の対象における、０．１時間〜１６８時間の、または０．２５時間〜４８時間の平均ｔ_１／２；対象へのペプチド投与後のペプチドの０．５〜１００Ｌ／時間または０．５〜５０Ｌ／時間の平均クリアランス（ＣＬ）；対象へのペプチドの全身性のまたは必要に応じてなし全身的取り込みなしの、またはそれらの任意の組み合わせの投与後の対象における、２００〜２０，０００ｍＬの平均分布容積（Ｖ_ｄ）を示す。

【0154】

製造方法
様々な発現ベクター／宿主系が、本明細書に記載のペプチドの組換え発現の製造に利用され得る。このようなシステムの非限定的例としては、本明細書に記載のペプチドまたはペプチド融合タンパク質／キメラタンパク質をコードする核酸配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、細菌などの微生物；前述の核酸配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された、酵母；前述の核酸配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された、昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）で感染された、または前述の核酸配列を含有する組換えプラスミド（例えば、Ｔｉプラスミド）発現ベクターで形質転換された、植物細胞系；または二重微小染色体において安定して増幅される（例えば、ＣＨＯ／ｄｈｆｒ、ＣＨＯ／グルタミンシンセターゼ）または不安定に増幅される（例えば、マウス型細胞株）のどちらかである、遺伝子操作されて前述の核酸配列の複数コピーを含有する細胞株を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス）で感染された、動物細胞系が挙げられる。ペプチドのジスルフィド結合の形成および折り畳みは、発現中または発現後、またはその双方で起こり得る。

【0155】

宿主細胞は、本明細書に記載の１つまたは複数のペプチドを発現するように適応させ得る。宿主細胞は、原核、真核、または昆虫細胞であり得る。場合によっては、宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節でき、または所望の特定の様式で遺伝子またはタンパク質産物を修飾およびプロセシングできる。例えば、特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質（例えば、メタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーターのための亜鉛およびカドミウムイオン）の存在下で増加され得る。場合によっては、ペプチド産物の修飾（例えば、リン酸化）およびプロセシング（例えば、切断）は、ペプチドの機能にとって重要であり得る。宿主細胞は、ペプチドの翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的な機序を有し得る。場合によっては、ペプチドを発現するために使用される宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。

【0156】

細胞ベースまたはウイルスベースのサンプルの場合、生物を精製前に処理して、標的ポリペプチドを保存および／または遊離させ得る。いくつかの実施形態では、細胞は固定剤を用いて固定される。いくつかの実施形態では、細胞は溶解される。細胞材料は、有意な割合の細胞を破壊することなく細胞物質の表面および／または細胞間の隙間からタンパク質を除去するように、処理され得る。例えば、細胞間空隙および／または植物細胞壁内に位置するタンパク質を除去するために、細胞材料は液体緩衝液に浸漬され得て、または植物材料の場合は真空に曝露され得る。細胞材料が微生物である場合、タンパク質は微生物培養液から抽出され得る。代案としては、ペプチドは封入体に充填させることができる。封入体は、培地中の細胞成分からさらに分離され得る。いくつかの実施形態では、細胞は破壊されない。細胞またはウイルス粒子の付着および／または精製のために、細胞またはウイルスによって提示される細胞またはウイルスペプチドが使用され得る。組換え系に加えて、ペプチドはまた、タンパク質およびペプチド合成に用いられる様々な既知の技術を用いて、無細胞系においても合成され得る。

【0157】

場合によっては、宿主細胞は、薬物の付着点を有するペプチドを産生する。結合点は、リジン残基、Ｎ末端、システイン残基、システインジスルフィド結合、または非天然アミノ酸を含み得る。ペプチドはまた、固相ペプチド合成または溶液相ペプチド合成などにより、合成的に製造され得る。ペプチドは、合成中または合成後、またはその双方において、折り畳まれ得る（ジスルフィド結合の形成）。ペプチド断片は、合成的または組換え的に生成され得、次に、合成的に組換え的にまたは酵素を介して共に連結され得る。

【0158】

図１０は、図９で示され、本開示全体を通じて記載されるような、本明細書で提供される配列番号１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のコンストラクトなどの、本開示のペプチドを発現するコンストラクトを製造する方法の概略図を示す。

【0159】

その他の態様では、本開示のペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成法（“Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，”ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）に従って、従来の固相化学合成技術によって調製され得る。

【0160】

ペプチドの医薬組成物
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の任意のペプチドと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、抗酸化剤、溶解剤、緩衝液、オスモライト、塩類、界面活性剤、アミノ酸、封入剤、増量剤、抗凍結剤、および／または賦形剤などのその他の化学成分との組み合わせであり得る。医薬組成物は、本明細書に記載のペプチドの生物への投与を容易にする。薬学的組成物は、医薬組成物として治療有効量で、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸内、煙霧剤、非経口、眼科用、肺、経皮、膣、眼、経鼻、口腔、舌下、吸入、皮膚、クモ膜下腔内、鼻腔内、および局所投与をはじめとする様々な形態および経路によって投与され得る。医薬組成物は、例えば、本明細書に記載のペプチドを直接臓器に、必要に応じてデポーに注射することによって、局所的または全身的な様式で投与され得る。

【0161】

非経口注射は、ボーラス注射または持続注入のために製剤化され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の滅菌懸濁液、溶液またはエマルジョンとしての非経口注射に適した形態であり得て、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤化剤を含有し得る。非経口投与のための医薬製剤としては、水溶性形態の本明細書に記載のペプチドの水溶液が挙げられる。本明細書に記載のペプチドの懸濁液は、油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油または合成脂肪酸エステルなどの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液はまた、本明細書に記載のこのようなペプチドの溶解性を高めおよび／または凝集を減少させる、適切な安定剤または薬剤も含有して、高度に濃縮された溶液の調製ができるようにし得る。代案としては、本明細書中に記載のペプチドは、例えば、滅菌発熱物質非含有水などの適切なビヒクルによる使用前の再構成のために凍結乾燥され得て、または粉末形態であり得る。いくつかの実施形態では、精製ペプチドは静脈内投与される。

【0162】

本開示のペプチドは、外科手術中に、脳または脳組織または癌細胞などの臓器または臓器組織または細胞に直接適用され得る。本明細書に記載の組換えペプチドは、局所的に投与され得て、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、香膏、クリーム、および軟膏などの様々な局所投与可能な組成物に調合され得る。このような医薬組成物は、溶解剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液、および保存料を含有し得る。

【0163】

本明細書で提供される治療または使用方法の実施において、本明細書に記載の（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｈｅｒｅｉｎ）ペプチドの治療有効量は、免疫系に影響を及ぼす病状に罹患している対象に、医薬組成物中で投与され得る。いくつかの実施形態では、対象はヒトなどの哺乳類である。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康状態、使用される化合物の効力、およびその他の要素に応じて広範に変動し得る。

【0164】

医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への加工を容易にする、賦形剤および助剤を含んでなる、１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。処方は、選択された投与経路に応じて修正され得る。本明細書に記載のペプチドを含んでなる医薬組成物は、例えば、ペプチドを組換え系において発現させ、ペプチドを精製し、ペプチドを凍結乾燥し、混合し、溶解し、顆粒化し、糖衣丸を製造し、研和し、乳化し、カプセル化し、封入し、または圧縮加工することによって製造し得る。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤、および本明細書に記載の化合物を遊離塩基または薬理的に許容可能な塩形態として含み得る。

【0165】

本明細書に記載の化合物を含んでなる本明細書に記載のペプチドを調製する方法は、本明細書に記載のペプチドを１つまたは複数の不活性な薬学的に許容可能な賦形剤または担体と共に調合して、固体、半固体または液体組成物を形成するステップを含む。固体組成物としては、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤、および坐薬が挙げられる。これらの組成物はまた、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、およびその他の薬理的に許容可能な添加剤などの微量の無毒の補助物質を含有し得る。

【0166】

薬理的に許容可能な賦形剤の非限定的例は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）に見いだされ得る。

【0167】

医薬組成物の投与
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載の任意の毒液または毒素に由来するペプチドと、担体、安定剤、希釈剤、分散剤、懸濁剤、増粘剤、および／または賦形剤などのその他の化学成分との組み合わせであり得る。医薬組成物は、本明細書に記載のペプチドの生物への投与を容易にする。薬学的組成物は、医薬組成物として治療有効量で、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、直腸内、煙霧剤、非経口、眼科用、肺、経皮、膣、眼、経鼻、口腔、吸入、皮膚、関節内、クモ膜下腔内、鼻腔内、および局所投与をはじめとする様々な形態および経路によって投与され得る。医薬組成物は、例えば、本明細書に記載のペプチドを直接臓器に、必要に応じてデポーに注射することによって、局所的または全身的な様式で投与され得る。

【0168】

非経口注射は、ボーラス注射または持続注入のために製剤化され得る。医薬組成物は、油性または水性ビヒクル中の滅菌懸濁液、溶液またはエマルジョンとしての非経口注射に適した形態であり得て、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような製剤化剤を含有し得る。非経口投与のための医薬製剤としては、水溶性形態の本明細書に記載のペプチドの水溶液が挙げられる。本明細書に記載のペプチドの懸濁液は、油性注射懸濁液として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、ゴマ油または合成脂肪酸エステルなどの脂肪油、オレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームなどが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。懸濁液はまた、本明細書に記載のこのようなペプチドの溶解性を高めおよび／または凝集を減少させる、適切な安定剤または薬剤も含有して、高度に濃縮された溶液の調製ができるようにし得る。代案としては、本明細書中に記載のペプチドは、例えば、滅菌発熱物質非含有水などの適切なビヒクルによる使用前の再構成のために凍結乾燥され得て、または粉末形態であり得る。いくつかの実施形態では、精製ペプチドは静脈内投与される。本明細書に記載のペプチドは、対象に投与され得て、例えば、軟骨などの臓器に、ホーミング、標的化、移動、保持、および／または結合、指向化する。

【0169】

本開示のペプチドは、外科手術中に、軟骨または軟骨組織または細胞などの臓器または臓器組織または細胞に直接適用され得る。本明細書に記載の組換えペプチドは、局所的に投与され得て、溶液、懸濁液、ローション、ゲル、ペースト、薬用スティック、香膏、クリーム、および軟膏などの様々な局所投与可能な組成物に調合され得る。このような医薬組成物は、溶解剤、安定剤、張度増強剤、緩衝液、および保存料を含有し得る。

【0170】

本明細書で提供される治療または使用方法の実施において、本明細書に記載の本明細書に記載の本明細書に記載の（ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｈｅｒｅｉｎ）ペプチドの治療有効量は、病状に罹患している対象に医薬組成物中で投与される。場合によっては、医薬組成物は、例えば、免疫系、炎症反応、またはその他の生理学的影響などの動物の生理機能に影響を及ぼすであろう。いくつかの実施形態では、対象はヒトなどの哺乳類である。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢および相対的な健康状態、使用される化合物の効力、およびその他の要素に応じて広範に変動し得る。

【0171】

医薬組成物は、活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への加工を容易にする、賦形剤および助剤を含んでなる、１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して製剤化され得る。処方は、選択された投与経路に応じて修正され得る。本明細書に記載のペプチドを含んでなる医薬組成物は、例えば、ペプチドを組換え系において発現させ、ペプチドを精製し、ペプチドを凍結乾燥し、混合し、溶解し、顆粒化し、糖衣丸を製造し、研和し、乳化し、カプセル化し、封入し、または圧縮加工することによって製造し得る。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤、および本明細書に記載の化合物を遊離塩基または薬理的に許容可能な塩形態として含み得る。

【0172】

本明細書に記載の化合物を含んでなる本明細書に記載のペプチドを調製する方法は、本明細書に記載のペプチドを１つまたは複数の不活性な薬学的に許容可能な賦形剤または担体と共に調合して、固体、半固体または液体組成物を形成するステップを含む。固体組成物としては、例えば、粉末、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤、および坐薬が挙げられる。これらの組成物はまた、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、およびその他の薬理的に許容可能な添加剤などの微量の無毒の補助物質を含有し得る。

【0173】

薬理的に許容可能な賦形剤の非限定的例は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ Ｅ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ １９７５；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄ Ｌａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ １９９９）に見いだされ得る。

【0174】

イメージングおよび外科的方法におけるペプチドの使用
本開示は一般的に、体内で、特定の領域、組織、構造、または細胞に、ホーミング、標的化、移動、保持、蓄積、および／または結合、または指向化するペプチドに関する。本開示は、このようなペプチドを使用する方法にも関する。これらのペプチドは、軟骨に接触する能力を有し、それによってこれらは様々な用途のために有用になる。特に、ペプチドは、ペプチドが向けられた生体分子の部位特異的調節に応用され得る。このようなペプチドの最終用途としては、例えば、イメージング、研究、治療学、セラノスティクス、医薬品、化学療法、キレート療法、標的化薬物送達、および放射線療法が挙げられ得る。いくつかの用途として、標的化薬物送達およびイメージングも挙げられる。

【0175】

いくつかの実施形態では、本開示は、がん、がん組織、または腫瘍組織を検出する方法を提供し、方法は、目的の組織を、検出可能剤にコンジュゲートされた本開示のペプチドに接触させるステップと、ペプチドの結合レベルを測定するステップとを含んでなり、正常組織と比較して上昇した結合レベルは、組織が、がん組織または腫瘍組織であることの徴候である。

【0176】

いくつかの実施形態では、本開示は、対象の臓器または身体領域または領域、組織または構造をイメージングする方法を提供し、方法は、本明細書で開示されるペプチドまたは医薬組成物を対象に投与するステップと、対象をイメージングするステップとを含んでなる。いくつかの実施形態では、このようなイメージングを使用して、軟骨の機能に関連する病状が検出される。場合によっては、病状は、炎症、がん、分解、成長障害、遺伝的、裂傷または傷害、または別の適切な病状である。場合によっては、病状は、軟骨異栄養症、外傷性断裂または脱離、軟骨を含有する身体領域における手術後疼痛、肋軟骨炎、ヘルニア形成、多発性軟骨炎、関節炎、変形性関節症、関節リウマチ、強直性脊椎炎（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは「狼瘡」）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、痛風、軟骨無形成症、または別の適切な病状である。場合によっては、病状は、軟骨のがんまたは腫瘍に関連する。場合によっては、病状は、転移性かどうかに関わりなく、軟骨腫または軟骨肉腫の一種、または別の適切な病状である。例えばがんに関連するものなどのいくつかの実施形態では、イメージングは、対象の病的領域、組織、構造または細胞の外科的除去に関連してもよい。

【0177】

さらに、本開示は、検出可能剤にコンジュゲートされた本開示のペプチドを使用した、病的または炎症組織、がん、がん組織、または腫瘍組織の術中イメージングおよび切除のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、病的または炎症組織、がん、がん組織、または腫瘍組織は、本開示のペプチドを使用して、がん、がん組織、または腫瘍組織の術中視覚化を可能にする、蛍光イメージングによって検出可能である。いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１つまたは複数の検出可能剤にコンジュゲートされる。さらなる実施形態では、検出可能剤は、ペプチドと結合した蛍光性部分を含んでなる。別の実施形態では、検出可能剤は放射性核種を含んでなる。いくつかの実施形態では、開腹手術中にイメージングが得られる。さらなる実施形態では、イメージングは、内視鏡検査またはその他の非侵襲的外科的手法を用いて達成される。

【0178】

軟骨障害の治療
「有効量」という用語は、本明細書の用法では、治療される疾患または病状の１つまたは複数の症状をある程度緩和する、投与された薬剤または化合物の十分な量を指し得る。その結果は、疾患の徴候、症状、または原因の減少および／または緩和、または生体系の任意のその他の所望の改変であり得る。このような薬剤または化合物を含有する組成物は、予防、増強および／または治療処置のために投与され得る。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの技術を用いて判定され得る。

【0179】

本開示の方法、組成物、およびキットは、病状の症状を予防し、治療し、阻止し、逆転させ、または改善する方法を含んでなり得る。治療は、対象（例えば、個人、飼育動物、野生動物、または疾患または病状に罹患した実験動物）を本開示のペプチドで治療することを含んでなり得る。疾患の治療において、ペプチドは対象の軟骨と接触し得る。対象は、ヒトであり得る。対象は、ヒト；チンパンジーまたはその他の類人猿またはサル種などの非ヒト霊長類；畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜；ウサギ、イヌ、およびネコなどの飼育動物；ラット、マウス、およびモルモットなどの齧歯類をはじめとする実験動物などであり得る。対象は、任意の年齢であり得る。対象は、例えば、高齢者、成人、青年、前青年期、小児、幼児、乳児、または子宮内胎児であり得る。

【0180】

治療は、疾患の臨床的発症前に、対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後に、対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、６ヶ月間、１２ヶ月間、または２年間以上後に、対象に提供され得る。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、１ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月、２年間以上にわたり、対象に提供されてもよい。治療は、疾患の臨床的発症後、１日、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、または２年間未満の後に、対象に提供されてもよい。治療はまた、臨床試験においてヒトを治療することも含み得る。治療は、本開示全体を通じて記載される医薬組成物の１つまたは複数などの医薬組成物を、対象に投与するステップを含んでなり得る。治療は、毎日１回の投与を含んでなり得る。治療は、静脈内、皮下、筋肉内、吸入、皮膚的、関節内注射、経口的、クモ膜下腔内、経皮的、鼻腔内、腹膜経路経由、または例えば局所的関節内注射経路を通じた直接関節上または関節内、または適用の注射経路のいずれかで、本開示のペプチドを対象に送達することを含んでなり得る。治療は、静脈内、関節内注射、非経口的、経口的、腹膜経路経由、または軟骨上、軟骨付近くまたは軟骨内へ直接、のいずれかで、ペプチド−活性薬剤複合体を対象に投与することを含んでなり得る。

【0181】

本開示のペプチドで治療され得る軟骨疾患または病状のタイプとしては、炎症、疼痛管理、抗感染、疼痛緩和、抗サイトカイン、がん、傷害、分解、遺伝的基礎、再構築、過形成、外科的傷害／外傷などが挙げられる。本開示のペプチドで治療され得る軟骨疾患または病状の例としては、肋軟骨炎、椎間板ヘルニア、再発性多発性軟骨炎、関節軟骨の損傷、あらゆる様式のリウマチ性疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたは「狼瘡」）、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）、変形性関節症、痛風など）、ヘルニア形成、軟骨無形成症、良性または非がん性の軟骨腫、悪性またはがん性の軟骨肉腫、軟骨異栄養症（Ｃｈｏｎｄｒｉｏｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ）、膝蓋軟骨軟化症、肋軟骨炎、拇趾硬直症、股唇裂傷、離断性骨軟骨炎（Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒｉｔｉｓ ｄｉｓｓｅｃａｎｓ）、骨軟骨異形成症、半月軟骨裂傷、鳩胸、漏斗胸、軟骨疾患、軟骨軟化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、骨頭すべり症、離断性骨軟骨炎、軟骨異形成症、肋軟骨炎、軟骨膜炎、骨軟骨腫、膝変形性関節症、指変形性関節症、手関節変形性関節症、腰変形性関節症、脊椎変形性関節症、軟骨軟化症、変形性関節症易罹患性、足関節変形性関節症、脊椎症、二次性軟骨肉腫、変形性関節症に見られる小型の不安定結節、骨端症、原発性軟骨肉腫、軟骨障害、強皮症、コラーゲン障害、軟骨異形成症、ティーツェ症候群、フランソワの皮膚軟骨角膜ジストロフィー、多発性骨端異形成１、多発性骨端異形成２、多発性骨端異形成３、多発性骨端異形成４、多発性骨端異形成５、骨化耳軟骨−精神遅滞−筋力低下−骨変化、骨膜軟骨肉腫、手根足根骨軟骨腫症、軟骨無形成症、遺伝性軟骨腫症ＩＩ、遺伝性軟骨腫症、軟骨異形成症−−性的発達障害、軟骨腫、脊索腫、アテロオステオジェネシスＩ型、アテロオステオジェネシスＩＩＩ型、アテロオステオジェネシスＩＩ型、濃化軟骨無形成症、家族性指骨関節症、異軟骨骨症−腎炎、眼角隔離症を伴う鼻翼軟骨コロボーマ、鼻翼軟骨形成不全−コロボーマ−眼角隔離症、ピエール・ロバン症候群−胎児軟骨異形成症、異常脊椎軟骨内腫症、局所的軟骨無形成症−腹筋異形成症、離断性骨軟骨炎、家族性関節軟骨石灰化症、気管気管支軟化症、軟骨炎、異軟骨骨症、ジェキア・コズロウスキー骨格異形成症、軟骨異栄養症、頭蓋−骨関節症、ティーツェ症候群、股関節形成不全−外軟骨腫、ベッセル・ハーゲン病、軟骨腫症（良性）、内軟骨腫症（良性）、アパタイト結晶沈着に起因する軟骨石灰化症、マイエンベルグ・アルトヘル・ユーリンガー症候群、内軟骨腫症−小人症−聴覚消失、早発性成長板閉鎖（例えば、小人症、傷害、思春期の座瘡に対するレチノイド療法などの治療、またはＡＣＬ修復に起因する）、アストレー・ケンダル症候群、滑液膜骨軟骨腫症、発達遅延および黒色表皮腫を伴う重症軟骨形成不全症、軟骨石灰化症、スタネスク症候群、家族性離断性骨軟骨炎、軟骨無形成症１Ａ型、軟骨無形成症２型、ランガー・サルディーノ型軟骨無形成症、軟骨無形成症１Ｂ型、軟骨無形成症１Ａおよび１Ｂ型、ＩＩ型軟骨無形成症−軟骨低発生症、軟骨無形成症、軟骨無形成症３型、軟骨無形成症４型、軟骨石灰化症１、軟骨石灰化症２、軟骨石灰化症家族性関節、捻曲性骨異形成症、線維性軟骨発生症、低軟骨形成症、ケテル症候群、マフッチ症候群、変形性関節症易罹患性６、変形性関節症易罹患性５、変形性関節症易罹患性４、変形性関節症易罹患性３、変形性関節症易罹患性２、変形性関節症易罹患性１、偽性軟骨形成不全症、カリフラワー耳、肋軟骨炎、成長板破断、漏斗胸、敗血症関節炎、痛風、偽痛風（カルシウムピロリン酸沈着症またはＣＰＰＤ）、痛風性関節炎、関節中のまたはその付近の細菌またはウイルスまたは真菌感染症、滑液包炎、腱炎、関節症、または別の軟骨または関節疾患または病状が挙げられる。

【0182】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、関節炎の関節を標的化するために対象に投与され得る。その他の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、関節炎の関節を治療するために対象に投与され得る。

【0183】

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のペプチドの有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法を提供する。

【0184】

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のペプチドの有効量と、薬学的に許容できる担体とを含んでなる医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法を提供する。

【0185】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドを使用して、軟骨肉腫が治療され得る。軟骨肉腫は、軟骨産生細胞のがんであり、しばしば骨および関節に見いだされる。それは、骨および軟質組織肉腫のファミリーに含まれる。特定の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートの投与を使用して、軟骨肉腫を有する対象を画像化し、診断し、または標的化および治療し得る。本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲート投与（ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ）は、軟骨肉腫を治療するために、切除放射線療法または陽子線治療法と組み合わせて使用され得る。対象は、ヒトまたは動物であり得る。

【0186】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートを使用して、脊索腫が治療され得る。特定の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートの投与を使用して、脊索腫を有する対象を画像化し、診断し、または標的化および治療し得る。本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートの投与（ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ）は、脊索腫を治療するために、イマチニブメシレートなどのチロシンキナーゼ阻害剤、および切除放射線療法または陽子線治療法と組み合わせて使用され得る。本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートの投与（ａｄｍｉｎｓｔｒａｔｉｏｎ）は、脊索腫を治療するために、ベバシズマブなどの抗血管剤およびエルロチニブなどの上皮成長因子受容体阻害剤と組み合わせて使用され得る。対象は、ヒトまたは動物であり得る。

【0187】

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のペプチドの有効量を対象に投与するステップを含んでなる、細胞の浸潤活性を阻害する方法を提供する。

【0188】

いくつかの実施形態では、本開示のペプチドは、１つまたは複数の治療薬にコンジュゲートされる。さらなる実施形態では、治療薬は、例えば、グルココルチコイドやコルチコステロイドなどの抗炎症薬、例えばコラゲナーゼ阻害剤などの阻害剤、またはマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（すなわち、ＭＭＰ−１３阻害剤）、アミノ糖、ビタミン（例えばビタミンＤ）、および抗生物質、抗ウイルス、または抗真菌剤、スタチン、免疫修飾物質、放射性同位体、毒素、酵素、感作薬物、干渉ＲＮＡをはじめとする核酸、抗体、血管新生阻害剤、シスプラチン、代謝拮抗薬、有糸分裂阻害剤、成長因子阻害剤、パクリタキセル、テモゾロマイド、トポテカン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロカルバジン、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、アルトレタミン、メトトレキサート、メルカプトプリン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、ペントスタチン、シタラビン、アザシチジン、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド（ａｍｉｎｏｇｌｕｔｈｉｍｉｄｅ）、アナストロゾール、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ミトタンおよびアミホスチン、およびそれらの同等物、ならびにフォトアブレーションから選択されるが、これに限定されるものではない、化学療法剤、抗がん剤、または抗がん剤である。これらの活性剤のいくつかは、標的細胞におけるアポトーシスなどのプログラム細胞死を誘導し、それによって症状を改善し、または疾患を寛解させる。アポトーシスは、例えば、化学療法剤、抗炎症薬、コルチコステロイド、ＮＳＡＩＤＳ、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）修飾因子、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）ファミリー修飾因子をはじめとする多くの活性薬剤によって誘導され得る。いくつかの実施形態では、などの本開示のペプチドを使用して、カスパーゼ、アポトーシス（ａｐｏｐｔｓｉｓ）賦活剤および阻害剤、ＸＢＰ−１、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、Ｂｃｌ−ｗ、および本明細書で開示されるその他のものなどの活性薬剤が、細胞死または細胞殺傷の経路に標的化され得る。その他の実施形態では、治療薬は、任意の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）である。ＮＳＡＩＤは、ケトロラックまたはインドメタシンまたはエトドラク、またはトルメチン（ｔｏｌｅｍｅｔｉｎ）などの任意の複素環式酢酸誘導体、ナプロキセンなどの任意のプロピオン酸誘導体、任意のエノール酸誘導体、任意のアントラニル酸誘導体、セレコキシブなどの任意の選択的ＣＯＸ−２阻害剤、任意のスルホンアミド（ｓｕｌｆｏｎａｎｉｌｉｄｅｓ）、任意のサリチル酸塩、アセクロフェナク、ナブメトン、スリンダク、ジクロフェナク、またはイブプロフェンであり得る。他の実施形態では、治療剤は、デキサメタゾン、ブデソニド、トリアムシノロン、コルチゾン、プレドニゾン、レドニゾロン、トリアムシノロンヘキサアセトニドまたはメチルプレドニゾロンなどの任意のステロイドである。その他の実施形態では、治療薬は、アセトアミノフェン、オピオイド、局所麻酔薬、抗うつ剤、グルタミン酸受容体拮抗薬（ａｎａｔａｇｏｎｉｓｔｓ）、アデノシン、または神経ペプチド（ｎｅｕｒｏｐｅｔｉｄｅｓ）であるなどの疼痛緩和剤である。いくつかの実施形態では、治療は、デキサメタゾン−ペプチドコンジュゲートおよびＮＳＡＩＤの双方が、患者に投与される治療のように、上記の治療剤のいずれかとペプチドコンジュゲートとの組み合わせを投与することからなる。軟骨を標的とする本開示のペプチドを使用して、例えば、軟骨の裂傷、傷害（すなわち、スポーツ傷害）、遺伝学的要因、分解、薄化、炎症、がんまたは任意のその他の疾患または病状をはじめとする、本明細書に記載されるような任意の疾患または病状などの疾患状態が治療され得て、または特に治療的活性物質が標的化されて、これらの疾患が治療され得る。その他の場合には、本開示のペプチドを使用して、外傷性断裂、離脱、肋軟骨炎（ｃｈｏｓｔｏｃｈｏｎｄｒｉｔｉｓ）、椎間板ヘルニア、再発性および非再発性多発性軟骨炎、関節軟骨の損傷、変形性関節症、関節炎または軟骨無形成症が治療され得る。場合によっては、ペプチドまたはペプチド−活性薬剤を使用して、軟骨細胞内への拡散により軟骨に接触させ、次に抗腫瘍機能、標的化毒性、転移阻害を有することなどによって、例えば良性軟骨腫または悪性軟骨肉腫などの軟骨中のがんを標的化し得る。さらに、このようなペプチドまたはペプチド−活性薬剤を使用して、病変中でも特に、腫瘍および転移をはじめとする軟骨病変が、標識、検出、または画像化され得て、それは、様々な外科的手法を通じて、またはプログラム細胞死または殺滅細胞を誘導するペプチド−活性薬剤を標的化することで、除去されてもよい。

【0189】

本明細書に記載の、毒液または毒素由来のペプチド、ペプチド、修飾ペプチド、標識ペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、および医薬組成物は、予防的および／または治療的処置のために投与され得る。治療用途では、組成物は、疾患または病状の症状を治癒させまたは少なくともある程度阻止するのに、または病状を治癒、回復、改善、または寛解させるのに十分な量で、疾患または病状に既に罹患している対象に投与され得る。本明細書中に記載されるこのようなペプチドはまた、病状を予防（全体的または部分的）して、それが発症、罹患、または悪化する可能性を軽減するためにも投与され得る。この用途のために有効な量は、疾患または病状の重症度および経過、以前の治療、対象の健康状態、体重、薬物に対する応答、および主治医の判断に基づいて変動し得る。毒液または毒素由来ペプチド、ペプチド、修飾ペプチド、標識ペプチド、ペプチド−活性薬剤コンジュゲート、および本明細書に記載される医薬組成物は、ペプチドの標的化ホーミングおよび任意のコンジュゲートの局所送達を可能にする。例えば、ステロイドにコンジュゲートされたペプチドは、伝統的な全身性ステロイドよりも有意に効果的で毒性が低いステロイドの局所送達を可能にする。ＮＳＡＩＤにコンジュゲートされたペプチドは、別の例である。この場合、ＮＳＡＩＤに結合したペプチドはＮＳＡＩＤの局所送達を可能にし、それは、より低いＮＳＡＩＤ用量の投与を可能にして、それは引き続いて毒性がより低い。活性薬剤を関節に送達することにより、疼痛緩和はより迅速であり得て、より長期間持続してもよく、標的化なしの全身性投与よりも、低い全身性用量および標的外の望まれない影響で得られ得る。

【0190】

軟骨を標的化する本開示のペプチドを使用して、本明細書に記載されるような軟骨損傷または障害、または任意のその他の軟骨または関節病状に関連する疼痛が治療または管理され得る。ペプチドは、直接的に、または活性薬物、ペプチド、または分子の担体として使用され得る。例えば、イオンチャネルは疼痛に関連し得て、関節炎などの病態において活性され得るので、イオンチャネルと相互作用するペプチドを直接使用して、疼痛が緩和され得る。別の実施形態では、ペプチドは、抗炎症活性を有する活性薬剤にコンジュゲートされ、その中でペプチドは、活性薬剤の局所送達のための担体の役割を果たして、疼痛を緩和する。

【0191】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、対象の軟骨の病状を治療する方法を提供し、方法は、配列番号１またはその断片を含んでなるペプチドの治療有効量を対象に投与するステップを含んでなる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドは、対象の軟骨の病状を治療する方法を提供し、方法は、配列番号２〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれか１つのペプチドまたはその断片を対象に投与するステップを含んでなる。

【0192】

本明細書に記載の複数のペプチドは、任意の順序で、または同時に投与され得る。場合によっては、毒素または毒液から誘導されたペプチドの複数の機能的断片は、任意の順序で、または同時に投与され得る。同時であれば、本明細書に記載の複数のペプチドは、静脈内注射のような単一の一体化形態で、または後続する静脈内投与などの複数の形態で提供され得る。

【0193】

ペプチドはキットとしてパッケージされ得る。いくつかの実施形態では、キットは、ペプチドの使用または投与に関する書面による指示を含む。

【実施例】

【0194】

以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態をさらに説明するために含まれ、本開示の範囲を限定するためには使用されないものとする。

【0195】

実施例１
ペプチドの製造
本実施例は、ノッチンペプチドの製造方法を提供する。サソリおよびクモのノッチンペプチド由来のペプチドは、公表された方法論を用いて哺乳類細胞培養において生成した。（Ａ．Ｄ．Ｂａｎｄａｒａｎａｙｋｅ，Ｃ．Ｃｏｒｒｅｎｔｉ，Ｂ．Ｙ．Ｒｙｕ，Ｍ．Ｂｒａｕｌｔ，Ｒ．Ｋ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｄ．Ｒａｗｌｉｎｇｓ．２０１１．Ｄａｅｄａｌｕｓ：ａ ｒｏｂｕｓｔ，ｔｕｒｎｋｅｙ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｃｉｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．（３９）２１，ｅ１４３）。

【0196】

ペプチド配列をＤＮＡに逆翻訳し、合成して、標準的分子生物学技術を用いて、シデロカリンとインフレームでクローン化した。（Ｍ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ，Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．２０１２ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ．）。得られたコンストラクトをレンチウイルス内にパッケージし、ＨＥＫ２９３細胞に形質移入して増殖させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって単離し、タバコエッチウイルスプロテアーゼで切断して、逆相クロマトグラフィーによって均質性に精製した。精製に続いて、各ペプチドを凍結乾燥して凍結保存した。

【0197】

実施例２
ペプチドの放射性標識
本実施例は、ノッチンペプチドの放射標識を記載する。いくつかのノッチン（クモおよびサソリに由来するいくつかの配列）を、標準技術を用いて、^１４Ｃホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元的メチル化によって、放射性標識した。ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２５４（１１）：４３５９−６５（１９７９）を参照されたい。配列は、Ｎ末端にアミノ酸「Ｇ」および「Ｓ」を有するように操作した。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖ９１：１９８３ ｐ．５７０およびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５４（１１）：１９７９ ｐ．４３５９を参照されたい。過剰なホルムアルデヒドを使用して、完全なメチル化（全ての遊離アミンのジメチル化）を確実にした。標識されたペプチドは、Ｓｔｒａｔａ−Ｘカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ ８Ｂ−Ｓ１００−ＡＡＫ）上での固相抽出によって単離し、５％メタノール添加水で洗浄して、２％ギ酸添加メタノール中に回収した。溶媒は、引き続いて穏やかな加熱および窒素ガス流を用いて、ブローダウン蒸発器内で除去した。

【0198】

実施例３
腎臓結紮と併せたペプチドの投与
本実施例は、腎臓結紮と併せて、マウスにノッチンペプチドを投与するための投薬計画を記載する。体重２０ｇ〜２５ｇのメスハーラン胸腺欠損ヌードマウスに、様々な用量のペプチドを尾静脈注射（ノッチン当たりｎ＝２マウス）によって投与した。配列番号２１〜配列番号３３の１３個の軟骨ホーミングペプチドの配列を表１に示す。実験は、二重反復試験で実施した。腎臓を結索して、ペプチドの腎臓濾過を防止した。各ペプチドは、リジンおよびＮ末端をメチル化することによって放射性標識されるので、実際の結合剤は、メチルまたはジメチルリジンおよびメチル化またはジメチル化アミノ末端を含有してもよい。

【0199】

メスハーラン胸腺欠損ヌードマウスに、１０〜２５ｕＣｉの^１４Ｃを担持する、５０〜１００ナノモルの各ペプチドの標的用量を麻酔下で投与した。各ペプチドは、動物を安楽死させて切片化する前に、動物内で自由に循環させた。

【0200】

実施例４
腎臓結紮と併せたペプチドホーミング
本実施例は、ペプチド投与に先だって腎臓が結索されたマウスの軟骨へのペプチドホーミングを例示する。実施例３における投与期間の終了時に、マウスをヘキサン／ドライアイス浴内で凍結し、次にカルボキシメチルセルロースのブロック中で凍結させた。動物全身の矢状切片を調製し、その結果、薄い凍結切片がイメージングに利用可能となった。脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部胃腸管、下部胃腸管、骨、骨髄、生殖路、眼、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、およびその他の各種組織などの組織のイメージングをはじめとする、動物の薄い凍結切片を、ミクロトームを用いて得て、冷凍庫内で乾燥させ、ホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）プレートに約１０日間曝露させた。

【0201】

これらのプレートを発色させて、各臓器からのシグナル（濃度計測）を、各動物の心臓の血液中に見られるシグナルに対して正規化した。その組織中の血液から予測されるシグナルよりも暗い、組織中のシグナルは、領域、組織、構造または細胞におけるペプチド蓄積を示唆する。例えば、軟骨は無血管であり、微量の血液を含有する。心室と対比して、少なくとも１７０％のシグナルの軟骨中の比率を、顕著な軟骨への標的化の基準レベルとして選択したが、これはまた切片画像中の軟骨性組織中の明確な蓄積とも相関していた。図１は、結索腎臓を有する動物への投与の３時間後における、配列番号２１〜配列番号３３のペプチドの軟骨中の組織分布を示す。図２は、関節およびその他の軟骨中の配列番号２４のペプチド分布の位置を同定する。図３は、肋骨、脊髄、およびその他の軟骨中の配列番号２４のペプチド分布の位置を同定する。図４は、鼻、脊髄、気管、およびその他の軟骨中の配列番号２４のペプチド分布の位置を同定する。図３〜４は、関節軟骨および骨端軟骨などの硝子軟骨、ならびに線維軟骨への、配列番号２４のホーミングを示す。

【0202】

さらに、ペプチドは、治療後数時間にわたり軟骨に保持され得る。配列番号２４のペプチドを実施例３のように放射性標識し、１００ナノモルのペプチドを非損傷腎臓を有するマウスに注射した。図５は、投与の２４時間後における、配列番号２４のペプチドの軟骨中の保持および組織分布を示す。比較のために、図１１は、１００ナノモルの配列番号４３３の放射標識ペプチドの投与の２４時間後におけるマウスの切片からの白色光および対応するオートラジオグラフィー画像を示し、それは軟骨にホーミングせず、骨髄に見られた。図１１Ａは、１００ナノモルの配列番号４３３投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図１１Ｂは、^１４Ｃシグナルが、配列番号４３３の放射性標識ペプチドを同定する、図１１Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【0203】

表２は、投与の３時間後における、血中レベルと比較した、配列番号２１〜配列番号３３のペプチドの中性ｐＨにおける正味電荷、および軟骨（Ｃ）および筋肉（Ｍ）への移動を要約する。「軟骨」の項目は、組織切片内の心室の血液シグナルと比較して、軟骨中のシグナルの百分率を反映する。軟骨ホーミング体であるペプチドは＞１７０％の軟骨シグナルを有し、効率的な軟骨ホーミング体であるペプチドは＞３００％の軟骨シグナルを有し得て、および強力な軟骨ホーミング体であるペプチドは＞５００％の軟骨シグナルを有する。配列番号４８４は、ＧＳＥＣＬＧＦＧＫＧＣＮＰＳＮＤＱＣＣＫＳＳＮＬＶＣＳＲＫＨＲＷＣＫＹＥＩＧＫのアミノ酸配列に対応する。

【0204】

【表15】

[この文献は図面を表示できません]

【0205】

表２に示されるように、生理学的ｐＨで顕著な正電荷を有する配列は、軟骨中のより高い蓄積を示した。これらの配列の多くは、共通要素を共有する。これらの共通要素は、折り畳まれたペプチドの三次元構造の特定の部分に正電荷またはその他の結合要素を配置することによってペプチドに軟骨ホーミングをもたらす、配列の部分に相当してもよい。例えば、Ｋ残基またはＲ残基は、特に、折り畳まれたペプチドの折り畳みおよびループ位置を決定するＣ残基に関して、ホーミングのための正しい表面領域に正電荷を位置づけるために、配列の特定の部分に優先的に位置するかもしれない。しかしながら、これらの配列の一部のみがホーミングに重要であってもよく、または配列のその他の側面がホーミングに重要であってもよい。

【0206】

共通要素を含有する２つの例示的配列は、ＧＳＸＶＸＸＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＸＰＣＫＲＸＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸＸＸ（配列番号９）およびＧＳＸＸＸＧＣＶＸＸＸＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＸＸＸＫＫＣＫＸＸＸＸＸＸ（配列番号１０）であり、式中、Ｘは、独立して任意の数の任意のアミノ酸または皆無のアミノ酸であり得る。図１２は、配列番号９とそれに共通要素配列が基づくペプチド配列との配列アライメント、および配列番号１０とそれに共通要素配列が基づくペプチド配列との配列アライメントを示す。配列ＧＳＸＶＸＸＸＶＫＣＸＧＳＫＱＣＸＸＰＣＫＲＸＸＧＸＲＸＧＫＣＩＮＫＫＸＣＫＣＹＸＸＸ（配列番号９）は、以下の配列中に見られる最も一般的な要素に基づく配列である：
ＧＳＧＶＰＩＮＶＫＣＲＧＳＲＤＣＬＤＰＣＫＫＡ−ＧＭＲＦＧＫＣＩＮＳＫ−ＣＨＣＴＰ−−（配列番号２４）、
ＧＳ−ＶＲＩＰＶＳＣＫＨＳＧＱＣＬＫＰＣＫＤＡ−ＧＭＲＦＧＫＣＭＮＧＫ−ＣＤＣＴＰＫ−（配列番号２３）、
ＧＳＱＶＱＴＮＶＫＣＱＧＧＳ−ＣＡＳＶＣＲＲＥＩＧＶＡＡＧＫＣＩＮＧＫ−ＣＶＣＹＲＮ−（配列番号２７）、
ＧＳ−−−−−ＩＳＣＴＧＳＫＱＣＹＤＰＣＫＲＫＴＧＣＰＮＡＫＣＭＮＫＳ−ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２６）、
ＧＳＥＶ−−−ＩＲＣＳＧＳＫＱＣＹＧＰＣＫＱＱＴＧＣＴＮＳＫＣＭＮＫＶ−ＣＫＣＹＧＣＧ（配列番号２８）、
ＧＳＡＶＣＶＹＲＴ−−−−−−ＣＤＫＤＣＫＲＲ−ＧＹＲＳＧＫＣＩＮＮＡ−ＣＫＣＹＰＹＧ（配列番号２５）、
ＧＳ−−−−ＧＩＶＣ−−−ＫＶＣＫＩＩＣＧＭＱ−ＧＫＫＶＮＩＣＫＡＰＩＫＣＫＣＫＫＧ−（配列番号２１）、および
ＧＳＱＩＹＴＳＫＥＣＮＧＳＳＥＣＹＳＨＣＥＧＩＴＧＫＲＳＧＫＣＩＮＫＫ−ＣＹＣＹＲ−−（配列番号３０）。
配列ＧＳＸＸＸＧＣＶＸＸＸＸＫＣＲＰＧＸＫＸＣＣＸＰＸＫＲＣＳＲＲＦＧＸＸＸＸＫＫＣＫＸＸＸＸＸＸ（配列番号１０）は、以下の配列中に見られる最も一般的な要素に基づく配列である：
ＧＳ−−−ＡＣＫＧＶＦＤＡＣＴＰＧＫＮＥＣＣ−ＰＮＲＶＣＳＤＫ−Ｈ−−−−ＫＷＣＫＷＫＬ−−−（配列番号２９）、
ＧＳ−−−ＧＣＬＥＦＷＷＫＣＮＰＮＤＤＫＣＣＲＰＫＬＫＣＳＫＬＦ−−−−−ＫＬＣＮＦＳＦＧ−−（配列番号３１）、
ＧＳＳＥＫＤＣＩＫＨＬＱＲＣＲ−ＥＮＫＤＣＣ−−ＳＫＫＣＳＲＲ−ＧＴＮＰＥＫＲＣＲ−−−−−−（配列番号２２）、および
ＧＳ−−−ＧＣＦＧＹ−−ＫＣＤＹＹ−ＫＧＣＣＳＧＹＶ−ＣＳＰＴＷ−−−−−ＫＷＣＶＲＰＧＰＧＲ（配列番号３３）。
破線「−」は、その位置にアミノ酸がないことを示す。以下の残基は、配列番号９または配列番号１０において独立して相互交換されてもよい：任意のＫおよび任意のＲ；任意のＭ、任意のＩ、任意のＬ、および任意のＶ；任意のＧおよび任意のＡ；任意のＳおよび任意のＴ；および任意のＱおよび任意のＮ。これらの相互交換可能なアミノ酸のセットは、軟骨へのホーミングを阻害することなくそれらを相互交換可能する特性において類似性を有する。例えば、ＫとＲはどちらも生理的ｐＨで正電荷を提供し、したがって軟骨へのホーミングのために必要な電荷を提供してもよいので、任意のＫは任意のＲで相互交換され得て、ＳとＴはどちらも水素結合に利用可能なヒドロキシル基を有するので、任意のＳは任意のＴで相互交換され得る。Ｎ末端ＧＳ配列は、本開示のペプチド間に含まれていてもいなくてもよい。

【0207】

内部断片ＫＣＩＮ（配列番号３１７）およびＫＫＣＫ（配列番号３１８）、ＰＣＫＲ（配列番号３１９）、ＫＲＣＳＲＲ（配列番号３２０）、およびＫＱＣ（配列番号３２１）を有する、ＧＫＣＩＮＫＫＣＫＣ（配列番号３１６）断片などの共通の要素を有する特定の断片もまた認められた。以下の残基は、配列番号１０１〜配列番号１０５または配列番号３１６〜配列番号３２１において独立して相互交換されてもよい：任意のＫおよび任意のＲ；任意のＭ、任意のＩ、任意のＬ、および任意のＶ；およびＧおよび任意のＡ；任意のＳおよび任意のＴ；および任意のＱおよび任意のＮ。

【0208】

ＲおよびＫ残基の優位性は、ペプチドのＣ末端部分ならびに断片中に認められ、ペプチドの高い正電荷と相関した。

【0209】

表１の配列番号２１および配列番号３３ペプチドは、潜在的に拡散によって、軟骨の領域、組織、構造または細胞に特異的に移動することが見いだされた、サソリ毒（例えば、ブツス・マルテンシイ・カルシュ（Ｂｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉｉ Ｋａｒｓｈ）に由来する。図６Ａおよび６Ｂは、配列番号２３および配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣプロファイルを示す。

【0210】

実施例５
治療薬とのペプチドホーミング
本実施例は、ノッチンペプチドにコンジュゲートされた特定の例示的治療薬を記載する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成して、次に、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎに記載されるものなどの当該技術分野で公知の技術を使用して、パクリタキセルまたはトリアムシノロンアセトニドなどの例示的薬物にコンジュゲートする。ペプチド当たり１つまたは複数の薬物をコンジュゲートし、または平均でペプチド当たり１つ未満の薬物をコンジュゲートする。

【0211】

これらの薬物と、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のいずれかのペプチドとの共役は、薬物を対象の軟骨に標的化する。１つまたは複数の薬物−ペプチドコンジュゲートをヒトまたは動物に投与する。

【0212】

実施例６
変形性関節症の治療
本実施例は、本開示のペプチドを使用して、変形性関節症を治療するための方法を記載する。この方法は、変形性関節症に伴う急性および／または慢性症状のための治療として使用する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成して、次に、直接使用し、またはトリアムシノロンアセトニドおよびデキサメタゾンなどの抗炎症化合物にコンジュゲートする。得られたペプチドまたはペプチド−薬物コンジュゲートを医薬組成物中で皮下、静脈内、または経口投与し、または患者の関節に直接注射して、軟骨を標的化する。製剤は、軟骨における曝露時間を増加させるために、物理的にまたは化学的に修飾し得る。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２から選択される。１つまたは複数の抗炎症ペプチドコンジュゲートをヒトまたは動物に投与する。

【0213】

実施例７
軟骨分解の治療
本実施例は、本開示のペプチドを使用して、軟骨分解を治療および／または予防するための方法を記載する。この方法は、軟骨分解に伴う急性および／または慢性症状のための治療として使用される。軟骨の進行性の分解または薄化は、一つには、小分子薬物および抗体などの分子が無血管軟骨に典型的に到達しないため、治療が困難である。本開示のペプチドは、そのホーミングおよび／または天然の活性のために使用され、または変異されて、ＭＭＰプロテアーゼ阻害などの活性を生じる。これは、組換え的に発現させまたは化学的に合成して、次に、直接使用し、またはＭＭＰ活性阻害剤（例えば、ＭＭＰ１３、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、または本明細書に記載されるようなその他の薬剤）などの細胞外マトリックスを標的とする化合物にコンジュゲートする。得られたペプチドまたはペプチド−薬物コンジュゲートを医薬組成物中で皮下、静脈内、または経口投与し、または患者の関節に直接注射して、細胞外マトリックスを標的化する。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２から選択される。１つまたは複数の細胞外マトリックス標的コンジュゲートをヒトまたは動物に投与する。

【0214】

実施例８
軟骨損傷の治療
本実施例は、本開示のペプチドを用使用して、軟骨損傷を治療するための方法を記載する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成して、次に、直接使用し、またはトリアムシノロンおよびデキサメタゾンをはじめとするが、これに限定されるものではない、本明細書に記載されるものなどの治療用化合物にコンジュゲートする。得られたペプチドまたはペプチド−薬物コンジュゲートは、医薬組成物中で患者に投与して、軟骨を標的化する。ペプチドは、Ｓ配列番号（Ｓ ＳＥＱ ＩＤ）２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２から選択される。１つまたは複数の治療用化合物ーペプチドコンジュゲートをヒトまたは動物に投与する。

【0215】

実施例９
関節リウマチの治療
本実施例は、関節リウマチを治療する方法を記載する。この方法は、関節リウマチに伴う急性および／または慢性症状のための治療として使用される。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成して、次に、直接使用し、またはトリアムシノロンおよびデキサメタゾンなどの抗炎症化合物にコンジュゲートする。ペプチドが直接使用される場合、ペプチドは、例えば、Ｋｖ１．３などのイオンチャネルに結合し、またはそれを阻害し得る。得られたペプチドまたはペプチド−薬物コンジュゲートを医薬組成物中で患者に投与して、軟骨を標的化する。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２から選択される。１つまたは複数の抗炎症化合物−ペプチドコンジュゲートをヒトまたは動物に、皮下、静脈内、または経口投与し、または関節に直接注射する。

【0216】

実施例１０
痛風の治療
本実施例は、本開示のペプチドを使用して、痛風を治療するための方法を記載する。この方法は、痛風に伴う急性および／または慢性症状のための治療として使用される。本開示のペプチドを発現させて、痛風治療薬として医薬組成物中で患者に投与する。本開示のペプチドを組換え的にまたは化学的に合成し、次に、直接使用し、または非ステロイド系抗炎症薬、コルヒチン、ステロイド、またはウリカーゼにコンジュゲートする。配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２から選択されるペプチドを医薬組成物中で患者に投与し、ペプチドは痛風に罹患した軟骨を標的化する。１つまたは複数のペプチドをヒトまたは動物に、皮下、静脈内、または経口投与し、または関節に直接注射する。

【0217】

実施例１１
疼痛の治療または管理
本実施例は、軟骨損傷または障害に伴う疼痛を治療または管理するための方法を記載する。この方法は、軟骨損傷または障害に伴う急性および／または慢性症状の治療として使用される。本開示のペプチドを発現させ、傷害または本明細書に記載されるようなその他の軟骨または関節病状の結果としての疼痛のための治療薬として、医薬組成物中で患者に投与する。本開示のペプチドは、Ｎａｖ１．７などのイオンチャネルを阻害する。配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２から選択されたペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成する。代案としては、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６または配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２のペプチドを変異させ、軟骨ホーミング機能は維持させるが、Ｎａｖ１．７などのイオンチャネル阻害を追加しまたは増加させる。発現または合成に続いて、ペプチドを直接使用し、またはＮＳＡＩＤにコンジュゲートする。ペプチドの投与に続いて、ペプチドは疼痛の影響を受けた軟骨を標的化する。１つまたは複数のペプチドをヒトまたは動物に、皮下、静脈内、または経口投与し、または関節に直接注射する。

【0218】

実施例１２
ペプチドの免疫原性
本実施例は、本開示の特定のペプチドの免疫原性の評価を記載する。免疫原性は、ネットワークベースの整列アルゴリズムを用いて予測した（“ＮＮ−ａｌｉｇｎ．Ａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ−ｂａｓｅｄ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｐｅｐｔｉｄｅ ｂｉｄｉｎｇ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ”，Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ．ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９ Ｖｏｌ １０，ｐ２９６）。アルゴリズムは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨ２−ＩＡｂ ＭＨＣＩＩクラスの２４個の対立遺伝子に対して、配列番号２１〜配列番号３３の配列を有する無傷のノッチンタンパク質に適用した。図７は、表１に列挙された配列番号２１〜配列番号３３の配列を有するペプチドのＭＨＣクラスＩＩペプチド結合予測を示す。ｙ軸はｌｏｇ（ｎＭ）単位を有するペプチドに対する、ＭＨＣクラスＩＩペプチド結合予測の予測親和性を示し、その中で＜５０ｎＭの親和性は、強い結合を予測する。配列番号２１〜配列番号３３を有するペプチドのうち、シミュレートした結合の８２．３％（２８４／３４５）は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩペプチドとの間で５０ｎＭよりも弱い結合を示した。弱い結合体の高含量は、ペプチドがヒトに投与された場合に、より低い免疫原性を有すると予測されることを示唆する。

【0219】

相加的な無傷の軟骨ホーミングペプチドについて、コンピュータを用いて免疫原性を評価した。表３は、無傷の軟骨ホーミングペプチド配列のＭＨＣクラスＩＩペプチド結合予測を示す。予測値は、ネットワークベースのアライメントアルゴリズムを使用して得た。アルゴリズムは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＬＡ−ＤＱ、およびＨ２−ＩＡｂ ＭＨＣＩＩクラスの２８の対立遺伝子に対して、無傷のノッチンペプチドを用いて行った。無傷のノッチンペプチドのいくつかは、ＭＨＣクラスＩＩの強力な結合体であると予測されたが、配列番号１１１のペプチド中のＣ末端プロリン、または配列番号１９９のペプチド中のグリシンなどの高い免疫原性を有することが知られている特定の配列を除外すると、ＭＨＣＩＩ対立遺伝子への結合が減少した。一例として、配列番号２０９〜配列番号２１０のペプチドは、それぞれ、配列番号１１１および配列番号１１０のペプチドと９０％の相同性有し、ＭＨＣＩＩ対立遺伝子への低い結合のために免疫原性がより低い。別の例では、配列番号２１１のペプチドは、配列番号１１４のペプチドと８３％の相同性を有し、ＭＨＣＩＩ対立遺伝子への低い結合のために免疫原性がより低い。

【0220】

【表16】

[この文献は図面を表示できません]

【0221】

実施例１３
ケトロラックペプチドコンジュゲート
本実施例は、乳酸リンカーを用いた、ケトロラクとノッチンペプチドとのコンジュゲーションを記載する。以下の反応スキーム（Ｉ）で示されるように、コンジュゲートを（Ｒ，Ｓ）−ケトロラック、乳酸、およびノッチンペプチド（Ｒ、Ｓ）の混合物から製造する：

【化2】

[この文献は図面を表示できません]

次に、上に示されるケトロラック−乳酸−ペプチドコンジュゲートをリジンまたはノッチンペプチドのＮ末端と反応させて、ケトロラック−乳酸リンカーコンジュゲートを作製する。ノッチンペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２のペプチドから選択される。

【0222】

ケトロラックは現在、鏡像異性混合物として投与されており、その中で、単一のラセミ立体中心を有する鏡像異性体は、分離が非常に困難である。反応スキーム（Ｉ）のように、２つのキラル中心を有するジアステレオマーは、Ｌ−乳酸などのキラルリンカーの付加によって生成される。ジアステレオマーは容易に分離されるので、乳酸リンカーに結合したケトロラックの活性鏡像異性体は、ノッチンペプチドへのコンジュゲーションの前に精製され得る。化学合成は、例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ａｎｄ ｉｎ“Ｋｅｔｏｒｏｌａｃ−ｄｅｘｔｒａｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：”Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍ．５７（２００７）４４１−４５０，Ｖｙａｓ，Ｔｒｉｖｅｄｉ，ａｎｄ Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉに記載されるような、当該分野で公知の任意のコンジュゲーション技術を使用し得る。コンジュゲートは抗炎症活性を示し、または遊離ケトロラックがコンジュゲートから放出されて、抗炎症活性を提供し得る。遊離ケトロラックは、エステル結合の加水分解などの、投与後に起こる加水分解から発生し得る。軟骨ホーミングペプチドを含有するコンジュゲートを投与することにより、ケトロラック単独の全身性投与によって達成されるよりも高い、関節へのケトロラック送達のＡＵＣが達成されてもよい。

【0223】

実施例１４
イブプロフェンペプチドコンジュゲート
本実施例は、ＰＥＧリンカーを用いたイブプロフェンとノッチンペプチドとのコンジュゲーションを記載する。コンジュゲートは、イブプロフェンと、”Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ｔｏ ｅｘｔｅｎｄ ｔｈｅ ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ，２０１１，７９：３５９−３７３，Ｎａｙａｋ ａｎｄ Ｊａｉｎに記載されるように、加水分解され得るエステル結合を形成するＰＥＧリンカーとを用いて、製造される。フィッシャーエステル化を用いて、イブプロフェンと、例えばトリエチレングリコールなどの短いＰＥＧとをコンジュゲートさせ、イブプロフェン−エステル−ＰＥＧ−ＯＨを得る。

【0224】

上に示されるようなＰＥＧ−イブプロフェンコンジュゲートの調製に続いて、ＰＥＧのヒドロキシル部分をＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）で活性化し、イブプロフェン−エステル−ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートを形成し、それを次にリジンと、またはノッチンペプチドのＮ末端と反応させ、イブプロフェン−エステル−ＰＥＧ−ペプチドコンジュゲートを形成する。ノッチンペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２の任意の１つのペプチドから選択される。コンジュゲートは抗炎症活性を示し、または遊離イブプロフェンがコンジュゲートから放出されて、抗炎症活性を提供し得る。遊離イブプロフェンは、エステル結合の加水分解などの、投与後に起こる加水分解から発し得る。

【0225】

イブプロフェン−ペプチドコンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。

【0226】

実施例１５
デキサメタゾンペプチドコンジュゲート
本実施例は、デキサメタゾンを本開示のペプチドと結合させる様々な方法を記載する。配列番号１１１のペプチドを組換え的に発現させた。デキサメタゾンは、ジカルボン酸リンカーを用いて、本開示のペプチドに容易にコンジュゲートされた。デキサメタゾンを無水コハク酸と最初に反応させてヘミコハク酸に変換することによって、ペプチド−デキサメタゾンコンジュゲートを製造した。次に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の存在下において、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｎｉｎｏｐｒｏｐｙｌ））カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用して、ヘミコハク酸を、活性エステルを含有するコハク酸カルボン酸に変換した。次に、この活性エステルをリジンと、またはノッチンペプチドのＮ末端と反応させて、デキサメタゾン−カルボン酸−ペプチドコンジュゲートを作製した。”Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｄｒｕｇ ｃａｒｒｉｅｒｓ ａｎｄ ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９４，５，３３９−３４７，Ｐｏｕｙａｎｉ ａｎｄ Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ，およびＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｂｙ Ｇｒｅｇ Ｈｅｒｍａｎｓｏｎに記載されるものなどの方法を使用し得る。

【0227】

標準的なカップリング試薬化学を使用して、デキサメタゾンを本開示のペプチドに共役させることにより、ペプチド−デキサメタゾンコンジュゲートを調製した。例えば、デキサメタゾンコンジュゲートは、不活性雰囲気下で、無水ＤＭＳＯ中において、デキサメタゾンヘミグルタレート（ｈｅｍｉｇｌｕｔｅｒａｔｅ）と１．０５モル当量の１，１’−カルボニルジイミダゾールとを反応させることによって作製した。３０分後、無水ＤＭＳＯ中の過剰なデキサメタゾンを２モル当量の無水トリメチルアミンと共に添加した。ペプチド−デキサメタゾンコンジュゲートのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを作製して、後でアミン含有担体と反応させるための常温保存可能な中間体を形成した。エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）によって、Ｎ末端デキサメタゾン−ペプチドコンジュゲート（配列番号１１１Ｂ）を１０ｐｐｍ以内の誤差で確認した。

【0228】

上述の方法を使用して、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２をはじめとする本開示の配列のいずれかのノッチンペプチドをデキサメタゾンにコンジュゲートする。

【0229】

実施例１６
ペプチドコンジュゲート加水分解
本実施例は、調節可能な加水分解速度を有する、ノッチンペプチドコンジュゲートの調製を記載する。コハク酸無水物を使用する代わりにその他の分子を使用し、最終的な加水分解性エステルに隣接する炭素における加水分解に立体障害を与える修正を加えて、実施例１５に記載されるデキサメタゾンコンジュゲートを合成する。１つの例示的コンジュゲートでは、テトラメチルコハク酸無水物を用いてデキサメタゾンコンジュゲートを合成してヒンダードエステルを作製し、これは加水分解速度の低下を引き起こすする。別の例示的コンジュゲートでは、隣接する炭素に１つのメチル基が存在する。別の例示的コンジュゲートでは、隣接する炭素に２つのメチル基が存在する。別の例示的コンジュゲートでは、隣接する炭素に１つのエチル基が存在する。別の例示的コンジュゲートでは、隣接する炭素に２つのエチル基が存在する。したがって、これらの例示的なコンジュゲートにおける加水分解速度は、実施例１５のコンジュゲートと比較して調節され、早期切断を防止して、大部分のペプチド−デキサメタゾンコンジュゲートが軟骨中に蓄積することを確実にする。

【0230】

得られたペプチドコンジュゲートをヒトまたは動物に、皮下、静脈内、経口投与し、または関節に直接注射して疾患を治療する。

【0231】

実施例１７
イオンチャネルに対するペプチドの影響
本実施例は、本開示のノッチンペプチドとイオンチャネルの間の相互作用を記載する。イオンチャネルは疼痛と関連し得て、関節炎などの病態で活性化され得る。本開示のペプチドを発現させて医薬組成物中で患者に投与し、イオンチャネルと関連があり、イオンチャネルに結合、遮断、または相互作用することで治療可能な関節病状または疾患を治療する。Ｎａｖ１．７などのイオンチャネルは、本開示のペプチドによって阻害される。配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２から選択される所与のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成する。発現または合成に続いて、ペプチドを直接使用し、または本明細書に記載されるものなどの治療用化合物にコンジュゲートして使用する。本開示のペプチドは、イオンチャネルと選択的に相互作用し、またはイオンチャネルと相互作用するように変異される。例えば、本開示のペプチドはＮａｖ１．７に結合し、または本開示のペプチドはＮａｖ１．７を遮断する。ペプチドをヒト対象投与すると、関節近くの組織中のＮａｖ１．７シグナル伝達が低下し、それによって疼痛緩和が提供される。

【0232】

実施例１８
腎臓結紮なしのペプチドの投与
本実施例は、腎臓結紮なしのマウスにノッチンペプチドを投与するための投薬計画を記載する。投与されたペプチドは、表１に示されるような配列番号２４の配列を有した。ペプチドは、リジンおよびＮ末端をメチル化することによって放射性標識されるので、実際の結合剤は、メチルまたはジメチルリジンおよびメチル化またはジメチル化アミノ末端を含有してもよい。

【0233】

メスハーラン胸腺欠損ヌードマウスに、１０〜２５μＣｉの^１４Ｃを担持する１００ｎｍｏｌの各ペプチドの標的用量を尾静脈注射によって投与した。各ペプチドは、動物を安楽死させて切片化する前に４時間または２４時間にわたり、動物内で自由に循環させた。

【0234】

実施例１９
非損傷腎臓と併せたペプチドホーミング
本実施例は、非損傷腎臓を有する動物における、軟骨へのペプチドホーミングを例示する。実施例１８の４時間または２４時間の投薬期間の終わりに、マウスをヘキサン／ドライアイスバス内で凍結させ、次いでカルボキシメチルセルロースのブロック内で凍結させた。動物全身の矢状切片を調製し、その結果、薄い凍結切片がイメージングに利用可能となった。脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部胃腸管（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｋ）、下部胃腸管（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｋ）、骨、骨髄、生殖路、眼、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、およびその他の各種組織などの組織のイメージングをはじめとする、動物の薄い凍結切片を、ミクロトームを用いて得て、冷凍庫内で乾燥させ、ホスフォイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）プレートに約１０日間曝露させた。

【0235】

これらのプレートを発色させた。その組織中の血液から予測されるシグナルよりも暗い、組織中のシグナルは、領域、組織、構造または細胞におけるペプチド蓄積を示唆する。例えば、軟骨は無血管であり、微量の血液を含有する。図１３Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図１３Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１３Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【0236】

図１４Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図１４Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１４Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【0237】

図１５Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１５Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１５Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１５Ｃは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、オートラジオグラフィー画像を示す。図１５Ｄは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１５Ｅは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１５Ｄに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１５Ｆは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１５Ｇは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１５Ｆに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。

【0238】

図１６Ａは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１６Ｂは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１６Ａに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１６Ｃは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１６Ｄは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後における、マウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１６Ｃに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１６Ｅは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの後肢の凍結切片の白色光画像を示す。図１６Ｆは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、図１６Ｅに対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図１６Ｇは、^１４Ｃシグナルが、１００ナノモル投与の２４時間後におけるマウスの足関節および指軟骨中の配列番号２４の放射性標識ペプチド分布を同定する、オートラジオグラフィー画像を示す。

【0239】

実施例２０
軟骨ホーミングペプチドの全身蛍光および分離四肢蛍光
本実施例は、ペプチドフルオロフォアコンジュゲート投与後のマウス軟骨へのペプチドホーミングを例示する。配列番号１１１のペプチドは、色素上の活性ＮＨＳエステルを介してペプチドのＮ末端に近赤外フルオロフォアであるシアニン５．５の１分子に化学的にコンジュゲートさせた。体重２０〜２５ｇのメスハーラン（Ｈａｌａｎｄ）胸腺欠損ヌードマウスに、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた、配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）の各１０ナノモルの用量を投与し、尾静脈注射によって投与した。各実験は二連で実施した（１群あたりｎ＝２匹）。Ｃｙ５．５フルオロフォア（配列番号１１１Ａ）にコンジュゲートされた配列番号１１１のペプチドは、動物を安楽死させる前に、記載される時間にわたり、動物内で自由に循環させた。マウスは、全身イメージングにおいて、および単離された後肢イメージングにおいて、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）蛍光のペプチド分布について評価した。

【0240】

投与期間終了時の全身蛍光（ＷＢＦ）については、マウスをヘキサン／ドライアイス浴内で凍結し、次に、カルボキシメチルセルロースの凍結ブロック内に包埋した。動物全身の矢状切片を調製し、イメージングのための薄い凍結切片をもたらした。薄い凍結切片を、ミクロトームを用いて得て、組織を可視化できるようにした。切片は、イメージングに先だって、冷凍庫で乾燥させた（ｄｅｓｓｉｃａｔｅ）。次に、１６９μｍ分解能、中品質、７００チャネル、Ｌ−２．０強度の設定で、Ｌｉ−Ｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナーでスキャンされた蛍光切片上で、ＷＢＦを実施した。

【0241】

単離された後肢蛍光調査のために、投与期間の終わりにマウスをＣＯ_２窒息により安楽死させた。右後肢を股関節部で除去し、１秒間の露出長さおよび焦点高さ０．５ｃｍで、Ｓｅｐｃｔｒｕｍ ＩＶＩＳ画像装置（ｅｘ／ｅｍ：６７５ｎｍ．７２０ｎｍ）上で画像化した。四肢は、皮膚を除去し、筋肉を除去して画像化した。

【0242】

図１７は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の３時間後における、マウスの白色光画像（左）および対応する全身蛍光画像（右）を示す。この実験および結果を第２のマウスで再現した（画像図示せず）。

【0243】

図１８は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の２４時間後における、マウスの白色光画像（左）および対応する全身蛍光画像（右）を示す。この実験および結果を第２のマウスで再現した（画像図示せず）。

【0244】

図１９は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の４８時間後における、マウスの白色光画像（左）および対応する全身蛍光画像（右）を示す。この実験および結果を第２のマウスで再現した（画像図示せず）。図２０は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与の７２時間後における、マウスの白色光画像（左）および対応する全身蛍光画像（右）を示す。この実験および結果を第２のマウスで再現した（画像図示せず）。これらのＷＢＦ画像は、３時間および２４時間目における、椎間板（ＩＶＤ）中のおよび関節および軟骨性組織中の、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた配列番号１１２ペプチド（配列番号１１１Ａ）の蛍光分布を示した。

【0245】

図２１は、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた１０ナノモルの配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）の投与後における、第１のマウスからの単離された後肢、および第２のマウスからの単離された後肢のＩＶＩＳ蛍光イメージングを示す。図２１Ａは、ペプチド投与の３時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｂは、ペプチド投与の３時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。図２１Ｃは、ペプチド投与の２４時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｄは、ペプチド投与の２４時間後における、第１のマウス（ｍｏｕｅｓ）および第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。図２１Ｅは、ペプチド投与の４８時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｆは、ペプチド投与の４８時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。図２１Ｇは、ペプチド投与の７２時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの皮膚を除去した右後肢を示す。図２１Ｈは、ペプチド投与の７２時間後における、第１のマウスおよび第２のマウスからの筋肉を除去した右後肢を示す。試験した全ての時点で、単離された右後肢の膝関節において、ペプチド蛍光が観察された。

【0246】

表４は、マウスにおける、Ｃｙ５．５フルオロフォアにコンジュゲートされた配列番号１１１のペプチド（配列番号１１１Ａ）投与後の様々な時点における、ＩＶＤ軟骨中の蛍光シグナルを要約する。

【0247】

【表17】

[この文献は図面を表示できません]

【0248】

実施例２１
軟骨ホーミングペプチドの全身オートラジオグラフィー
本実施例は、放射能標識ペプチド投与の５分〜４８時間後のマウス軟骨へのペプチドホーミングを例示する。放射性標識ペプチドからのシグナルは、試験した各時点で、あらゆる全てのタイプの軟骨中に見いだされた。各ペプチドは、実施例２に記載されているように、Ｎ末端でリジンをメチル化することによって放射性標識した。したがって、ペプチドは、メチルまたはジメチルリジンと、メチル化またはジメチル化アミノ末端とを含有してもよい。体重２０〜２５ｇのメスハーラン（Ｈａｌａｎｄ）胸腺欠損ヌードマウスに、１００ナノモルの用量の放射性標識ペプチドを尾静脈注射によって投与した。実験は二連で実施した（１群あたりｎ＝２匹）。一部の動物では、腎臓を結索して放射性標識（ｒａｄｉｏｌａｂｌｅｄ）ペプチドの腎臓濾過を妨げて、血漿半減期を延長させた。各ペプチドは、動物を安楽死させて切片化する前に、記載される時間にわたり、動物内で自由に循環させた。

【0249】

全身オートラジオグラフィー（ＷＢＡ）矢状薄切法は、次のようにして実施した。投与期間の終了時に、マウスをヘキサン／ドライアイス浴内で凍結し、次に凍結カルボキシメチルセルロースのブロック中に包埋した。動物全身の矢状切片を調製し、イメージングのための薄い凍結切片をもたらした。薄い凍結切片を、ミクロトームを用いて得て、脳、腫瘍、肝臓、腎臓、肺、心臓、脾臓、膵臓、筋肉、脂肪、胆嚢、上部胃腸管、下部胃腸管、骨、骨髄、生殖器官、眼、軟骨、胃、皮膚、脊髄、膀胱、唾液腺、その他などの組織を可視化できるようにした。切片は、イメージングに先だって、冷凍庫で乾燥させた（ｄｅｓｓｉｃａｔｅ）。

【0250】

オートラジオグラフィーイメージングのために、テープで取り付けた薄切片を凍結乾燥させ、放射性サンプルを７日間にわたりホスフォイメージャー（ｐｈｏｐｈｏｉｍａｇｅｒ）に曝露した。これらのプレートを発色させて、各臓器からのシグナル（濃度計測）を、各動物の心臓の血液中に見られるシグナルに対して正規化した。その組織中の血液から予測されるシグナルよりも暗い、組織中のシグナルは、領域、組織、構造または細胞における蓄積を示唆する。

【0251】

図２２は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２２Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２２Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２２Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識投与の５分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２２Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２２Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の５分後における、図２２Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0252】

図２３は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２３Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２３Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、図２３Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２３Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２３Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、図２３Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２３Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２３Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３０分後における、図２３Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0253】

図２４は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２４Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２４Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２４Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２４Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２４Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の１時間後における、図２４Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0254】

図２５は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２５Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２５Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２５Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図５６Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２５Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２５Ｃに示される切片に対応する、マウスの異なる凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２５Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0255】

図２６は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２６Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２６Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２６Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２６Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２６Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２６Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２６Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２６Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図２６Ｅに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0256】

図２７は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２７Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２７Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２７Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図２７Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２７Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図２７Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２７Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２７Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の８時間後における、図２７Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0257】

図２８は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２８Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２８Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図２８Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２８Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２８Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図２８Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２８Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２８Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図２８Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0258】

図２９は、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図２９Ａは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２９Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２９Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図２９Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図２９Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１１の放射性標識ペプチド投与の４８時間後における、図２９Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0259】

表５は、血液の百分率として、ＩＶＤおよび膝関節中の配列番号２４および配列番号１１１の放射性標識ペプチドのシグナルを示す。ペプチドは５分以内に関節に到達してもよいので、ペプチドまたはコンジュゲートされた活性薬剤からの治療効果が迅速に始まってもよい。４８時間で検出された薬剤の継続的な存在のためにおよび／または長期間持続する薬物動力学効果のために、治療効果は長期間持続し得る。

【0260】

【表18】

[この文献は図面を表示できません]

【0261】

配列番号１１１の放射性標識ペプチドは、全ての時点（５分間〜４８時間）で椎間板（ＩＶＤ）および滑膜関節中で観察される。 ＩＶＤ中のシグナル対背景比は、２４時間でピークに達した。膝関節中のシグナル対背景比は、８時間でピークに達した。ＩＶＤ中のシグナルは、骨に隣接する軟骨の周辺から、内側に進行することが観察された。

【0262】

図３０は、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３０Ａは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３０Ｂは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３０Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３０Ｃは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３０Ｄは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３０Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３０Ｅは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３０Ｆは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３０Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0263】

図３１は、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３１Ａは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３１Ｂは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３１Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３１Ｃは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３１Ｄは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３１Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３１Ｅは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３１Ｆは、１００ナノモルの配列番号１０９の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３１Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0264】

図３２は、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３２Ａは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３２Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３２Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３２Ｇは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３２Ｈは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３２Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0265】

図３３は、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３３Ａは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３３Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３３Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３３Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３３Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３３Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３３Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３３Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１０の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３３Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0266】

図３４は、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３４Ａは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３４Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３４Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３４Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３４Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３４Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３４Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３４Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３４Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0267】

図３５は、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３５Ａは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３５Ｂは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３５Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３５Ｃは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３５Ｄは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３５Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３５Ｅは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３５Ｆは、１００ナノモルの配列番号１１４の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３５Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0268】

図３６は、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３６Ａは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３６Ｂは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３６Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３６Ｃは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３６Ｄは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３６Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３６Ｅは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３６Ｆは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３６Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0269】

図３７は、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３７Ａは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｂは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３７Ｃは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｄは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３７Ｅは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｆは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３７Ｇは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３７Ｈは、１００ナノモルの配列番号２００の放射性標識ペプチド投与の２４時間後における、図３７Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0270】

表６は、血液中のシグナルの百分率として、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１４、および配列番号２００の放射性標識ペプチドの滑膜関節中のシグナルを示す。

【0271】

【表19】

[この文献は図面を表示できません]

【0272】

表７は、椎間板（ＩＶＤ）中における、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１４、および配列番号２００の放射性標識ペプチドのシグナルを示す。

【0273】

【表20】

[この文献は図面を表示できません]

【0274】

配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１４、および配列番号２００のペプチドシグナルは、全て軟骨中でシグナルを示し、軟骨ホーミング特性を示した。表６および表７に示される全てのペプチドは、その中で全てのリジン（Ｋ）残基がアルギニン（Ｒ）残基に変異した、本開示のその他のペプチドの変異型であった。配列番号１０９のペプチドは、配列番号２２のペプチドのＫからＲ変異型であり、配列番号１１０のペプチドは、配列番号２３のペプチドのＫからＲ変異型であり、配列番号１１４のペプチドは、配列番号２７のペプチドのＫからＲ変異型であり、配列番号２００のペプチドは、配列番号８６のペプチドのＫからＲ変異型である。これらのデータは、軟骨ホーミングペプチドのＫからＲ変異型が、軟骨ホーミング特性を維持することを示す。配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１４および配列番号２００の放射標識ペプチドシグナルは、放射性標識ペプチド投与の３時間後において、ＩＶＤおよび関節軟骨中の蓄積を示した。配列番号１０９および配列番号２００からの放射標識ペプチドシグナルは、３〜２４時間にわたり、ＩＶＤおよび関節軟骨中で維持されまたは増加した。配列番号１１０からの放射性標識ペプチドシグナルは、３〜２４時間にわたり、ＩＶＤおよび関節軟骨中で減少した。配列番号１１４の放射性標識ペプチドは滞留時間の短縮を示し、シグナルは２４時間目に検出限界に近かった。配列番号１１０もまた、２４時間目に関節およびＩＶＤ軟骨に存在した。配列番号１０９が、軟骨中で最も高いシグナル示し、配列番号２００、配列番号１１０、次に配列番号１１４がそれに続いた。３時間および２４時間目における、血液の百分率としての滑膜関節中の配列番号１１１のペプチドのシグナル（表５）は、強度において配列番号２００と配列番号１１０のペプチド（表６）の間に格付けされた。３時間および２４時間目における、血液の百分率としてのＩＶＤ中の配列番号１１１のペプチドのシグナル（表５）は、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１４、および配列番号２００ペプチド（表７）のいずれよりも高かった。

【0275】

図３８は、１００ナノモルの配列番号１９５（ＧＳＮＦＫＶＥＧＡＣＳＫＰＣＲＫＹＣＩＤＫＧＡＲＮＧＫＣＩＮＧＲＣＨＣＹＹ）の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３８は、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３８Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３８Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３８Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３８Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９５の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３８Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0276】

図３９は、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図３９Ａは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図３９Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３９Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図３９Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図３９Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９６の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図３９Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0277】

図４０は、１００ナノモルの配列番号１９７（ＧＳＤＲＤＳＣＩＤＫＳＲＣＳＫＹＧＹＹＱＥＣＱＤＣＣＫＫＡＧＨＮＧＧＴＣＭＦＦＫＣＫＣＡ）の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４０Ａは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４０Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４０Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４０Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４０Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９７の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４０Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0278】

図４１は、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４１Ａは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４１Ｂは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４１Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４１Ｃは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４１Ｄは、１００ナノモルの配列番号１９８の放射性標識ペプチド投与の３時間後における、図４１Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0279】

配列番号４３４は、ペプチドとセリン残基とのジスルフィド結合を形成するシステイン残基は変異消去されるが、配列の残りの部分は維持することによって、ペプチドのノットスキャフォールドが除去された、配列番号１１１の直線化バージョンである。図４２は、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４２Ａは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｂは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４２Ａに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４２Ｃは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｄは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４２Ｃに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４２Ｅは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｆは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４２Ｅに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４２Ｇは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、結索腎臓を有するマウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４２Ｈは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４２Ｇに示される切片に対応する、結索腎臓を有するマウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0280】

図４３は、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４３Ａは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｂは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４３Ｃは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｄは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４３Ｅは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｆは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４３Ｇは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４３Ｈは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の３時間後における、図４３Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0281】

図４４は、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスからの凍結切片の白色光画像および対応するオートラジオグラフィー画像を示す。図４４Ａは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの凍結切片の白色光画像を示す。図４４Ｂは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ａに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４４Ｃは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４４Ｄは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ｃに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４４Ｅは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の画像を示す。図４４Ｆは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ｅに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。図４４Ｇは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、マウスの異なる凍結切片の白色光画像を示す。図４４Ｈは、１００ナノモルの配列番号４３４の放射性標識直線化ペプチド投与の２４時間後における、図４４Ｇに示される切片に対応する、マウスの凍結切片中の^１４Ｃシグナルを示す。^１４Ｃシグナルは、マウスの軟骨中の放射標識ペプチド分布を同定する。

【0282】

表８は、血液中シグナルの百分率として、直線化放射性標識配列番号４３４ペプチドからの椎間板（ＩＶＤ）中のシグナルの定量化を示す。

【0283】

【表21】

[この文献は図面を表示できません]

【0284】

配列番号１１１ペプチドの直線化バージョンである配列番号４３４のペプチドは、折り畳まれたノットペプチド（配列番号１１１）よりもはるかに低い程度で、軟骨にホーミングした。配列番号１１１の折り畳まれたノットペプチドのシグナルは、配列番号４３４の直線化ペプチド（表８）と比較して、３時間目に約２０倍高く、２４時間目に約５０倍高かった（表５）。これらの結果は、軟骨へのホーミングが、一次配列またはペプチドの電荷の変化に加えて、立体配座、または三次構造の変化にも関連し得ることを示す。すなわち、場合によっては、折り畳まれたノッチンペプチドは、（変異システイン残基を除き）同じ一次配列の折り畳まれていない線状化ペプチドと比較して、例示的な軟骨ホーミング体であり得る。

【0285】

実施例２２
ブデソニドペプチドコンジュゲート
本実施例は、本開示のペプチドのブデソニドへのコンジュゲーションを記載する。ブデソニドは、ジカルボン酸リンカーを介して、本明細書で開示される任意のペプチドに、容易にコンジュゲートされる。ジカルボン酸リンカーは、コハク酸などの直鎖状ジカルボン酸であり、または無水コハク酸などの関連環式酸無水物である。無水物との反応は、単純な条件下で進行し得る。例えば、ブデソニドと５モル濃度当量のグルタル酸無水物との反応は、室温において無水ピリジン中で実施される。ジカルボン酸との反応は、標準的なカルボジイミド共役法を用いて実施し得る。例えば、ブデソニドを１モル当量のジメチルコハク酸酸、１モル当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（または別のカルボジイミド）、および０．２モル濃度当量の４０−ジメチルアミノピリジンと反応させる。

【0286】

実施例１６に記載したのと同じ方法を用いて、ペプチド−ブデソニドコンジュゲートの加水分解速度を調節し、早期切断を防止して、大部分のペプチド−ブデソニドコンジュゲートが軟骨に蓄積することを確実にする。

【0287】

標準的なカップリング試薬化学を使用して、ブデソニドを本開示のペプチドに共役させることにより、ペプチド−ブデソニドコンジュゲートを調製する。ブデソニドのＮＨＳコハク酸エステルを製造するためのプロトコルは、実施例１５に記載されるようなデキサメタゾンのものと同様である。ペプチド−ブデソニドコンジュゲートのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを作製して、後でアミン含有担体と反応させるための常温保存可能な中間体を形成する。

【0288】

ノッチンペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、または配列番号４１４〜配列番号４３２から選択される配列の任意のペプチドであり得る。

【0289】

実施例２３
ペプチド電荷および軟骨ホーミング
本実施例は、本開示のペプチドの電荷、そしてそれがどのように軟骨ホーミングと相関するかを記載する。表９は、本開示のペプチドにおける、Ｅｘｐａｓｙ ｐＩおよびＭＹｐＩをはじめとする様々な方法によって計算された、リジンの数、およびｐＩを示す。ｐＩは等電点を指し、ペプチドの正味電荷がゼロになるｐＨである。

【0290】

【表22】

[この文献は図面を表示できません]

【0291】

図４５は、計算されたＥｘｐａｓｙ ｐＩに対してプロットされた、本開示の様々なペプチドの軟骨ホーミングを示す。（Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．１４（１０）：１０２３−３１（１９９３）およびＢｊｅｌｌｑｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．１５（３−４）：５２９−３９（１９９４）に記載されるように計算された）。ｙ軸Ｃ：Ｂ比は、軟骨対血液比を示す。図４６は、Ｒ実装を用いて計算されたＳｉｌｌｅｒｏ ｐＩに対してプロットされた、本開示の様々なペプチドの軟骨ホーミングを示す。（Ｓｉｌｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．３６（２）：１５７−６６（２００６）、およびＲｉｃｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６（６）：２７６−７（２０００）に記載されるように計算された）。これらの図は、ＥｘｐａｓｙまたはＳｉｌｌｅｒｏ法による〜８．５〜９．５の範囲のｐＩを有するペプチドが、軟骨のホーミングに望ましくあり得ることを示す。

【0292】

ポアソン・ボルツマン分布を用いた構造ベースの３Ｄモデル化アプローチもまた採用して、本開示の様々なペプチドのｐＩを同定した。このアプローチは、表１０で要約したような、折り畳まれていない状態のペプチドの生物学的ｐＨ（ｐＨ７）における電荷と、全体的ｐＩとを同定した。確認された軟骨ホーミング体の３Ｄ構造は、Ｘ線結晶学によって判定し、または様々な相同体ベースのアプローチを用いてモデル化した。構造は、ＰＤＢ２ＰＱＲパッケージ（１）および適応型ポアソン・ボルツマン（Ｐｏｓｉｓｓｏｎ−Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）ソルバーソフトウェアパッケージ（２）を用いて分析した。これらの構造は図２に示され、そこではそれらは静電気表面として描画される（Ｄｏｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ Ｊｕｌ；３５（Ｗｅｂ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５２２−４５（２００７）、およびＢａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９８（１８）：１００３７−４１（２００１）もまた参照されたい）。

【0293】

【表23】

[この文献は図面を表示できません]

【0294】

実施例２４
軟骨ホーミングペプチドの構造および静電気
本実施例は、本開示の軟骨ホーミングペプチドの構造的特徴および静電気を記載する。複数の軟骨ホーミング候補（例えば、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２７、および配列番号２８）の一次配列および予測された三次構造の解析は、生物学的機能を維持するために重要であってもよい、それらの構造の興味深い側面を明らかにした。いくつかの軟骨ホーミング候補は、本明細書で「ヒッチン」として同定された構造クラスに分類された。図４７は、ジスルフィド結合性がＣ１−Ｃ４、Ｃ２−Ｃ５、およびＣ３−Ｃ６と標識される、軟骨ホーミングペプチドの「ヒッチン」クラスのトポロジーを描写する。配列番号２４、配列番号２３、配列番号２７、および配列番号２８のペプチドは、「ヒッチン」クラスの軟骨ホーミングペプチドの例である。この情報は、一次配列同一性または類似性（ｓｉｍｉｌａｒｌｙ）および／または構造相同性のどちらかに基づく、軟骨ホーミングタンパク質の潜在的な同定または予測を可能にした。軟骨にホーミングすることが判明した「ヒッチン」ペプチドに加えて、配列番号２２および配列番号２０５のペプチドなどのその他のペプチドが軟骨にホーミングし、カルシンとして知られている小型タンパク質のクラスに属する。データは、このカルシンファミリーのメンバーが、別個の三次構造を有するにもかかわらず、軟骨にホーミングしてもよいことを示唆する。このファミリーの関連するメンバーとしては、配列番号２０２〜配列番号２０５および配列番号２２のペプチドが挙げられ、また軟骨にホーミングしてもよい。このファミリーのメンバーはまた、イオンチャネルおよびリアノジン受容体などの軟骨中の細胞内標的を調節できてもよい。

【0295】

さらなる構造解析に際して、軟骨ホーミングタンパク質の多くは、図４８に示すように、溶媒接触可能表面領域の大部分を占める正電荷の連続表面を有することが確認された。この機能を維持するためには、タンパク質表面の正電荷残基の位置およびそれらの局在化が重要であり得る。

【0296】

実施例２４に示すように、「ヒッチン」またはカルシントポロジーを共有し、正の表面電荷の大きな連続領域を有し、および／または他の軟骨ホーミングペプチドと同様のｐＩ値を有する他のペプチドもまた、軟骨にホーミングすると予測されてもよい。例えば、場合によってはこれらとしては、配列番号７２〜配列番号７５、配列番号２０６、配列番号２０８〜配列番号２１３、配列番号２８８〜配列番号２９１、配列番号４２２、または配列番号４２４〜配列番号４２９のペプチドが挙げられる。

【0297】

図４９は、異なる緩衝液条件における、配列番号２４および配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図４９Ａは、ＰＢＳ中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｂは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｃは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシンおよび１ｍｇ／ｍｌの阻害剤中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｄは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシン、１ｍｇ／ｍｌの阻害剤、およびＤＴＴ中の配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｅは、ＰＢＳ中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｆは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｇは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシンおよび１ｍｇ／ｍｌの阻害剤中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図４９Ｈは、ＰＢＳ中の５０Ｕのトリプシン、１ｍｇ／ｍｌの阻害剤、およびＤＴＴ中の配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。

【0298】

図７１は、還元剤、プロテイナーゼ、および／または人工胃液条件への曝露後における、２つのペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図７１Ａは、ＰＢＳ中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｂは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｃは、人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｄは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｅは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン、０．５Ｍトリス、およびＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣトレーストレースを示す。図７１Ｆは、ＰＢＳ中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｇは、ＰＢＳ中のＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｈは、人工胃液（ＳＧＦ）中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｉは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７１Ｊは、ＳＧＦ中の５００Ｕペプシン、０．５Ｍトリス、およびＤＴＴ中でインキュベートされた、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレーストレースを示す。

【0299】

図７２は、酸化的、還元的、および酸性条件をはじめとする一連の条件への曝露後における、ならびにプロテイナーゼへの曝露後における、配列番号１１１および配列番号４３４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。配列番号４３４のペプチドは、配列番号１１１のノッチンペプチドの直線化バージョンである。配列番号４３４のペプチドは、配列番号１１１のノッチンペプチドと同じアミノ酸配列を有するが、全てのシステインがセリンに変異している。図７２Ａは、還元条件および酸性条件下における、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７２Ｂは、５００Ｕペプシン中の１０ｍＭのＤＴＴ、５００Ｕペプシン、５０Ｕトリプシン中の１０ｍＭのＤＴＴ、および５０Ｕトリプシンをはじめとする、還元剤とプロテアーゼの様々な組み合わせの下における、配列番号１１１ペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７２Ａ〜Ｂは、配列番号１１１のペプチドが、ｐＨ１で、還元剤、トリプシン、およびペプシンに対する強い分解抵抗性を示すことを示す。図７２Ｃは、５００Ｕペプシン、５０Ｕトリプシン、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）中の非還元（ＮＲ、酸化条件）、およびＮＲをはじめとする、様々なプロテアーゼ条件下における、配列番号４３４のペプチドのＨＰＬＣトレースを示す。図７２Ｃは、これらの様々な条件において、直線化ペプチドがより分解され易いことを示す。これらのデータは、配列番号１１２のペプチド中のシステイン残基によって提供されるノッチン構造が、安定性を提供する重要要素であることを示す。

【0300】

既知の軟骨ホーミングペプチドの構造もまた、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを使用して、主要パラメータを系統的に変化させ、軟骨ホーミング特性を有すると予測される相同配列を同定するために使用した。全体的な配列同一性百分率の設定、ジスルフィド架橋の保存のためのシステインの保存、および正および／または負荷電残基の保存をはじめとする、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴにおける３つの基準を調節して、潜在的な新規配列を同定した。配列番号２０８〜配列番号２１３のペプチドは、配列番号２４に対して相同的であると同定され、軟骨ホーミング特性を有すると予測される。

【0301】

実施例２５
軟骨細胞内のペプチド局在
本実施例は、非損傷腎臓を有する動物における、軟骨内の軟骨細胞への本開示のペプチドの結合を例示する。一実施形態では、実施例２０および実施例２１に記載したように、動物に投与して処理する。動物全身矢状切片を調製し、染色およびイメージングに利用できる薄い凍結切片をもたらす。投与期間の終了時に動物を安楽死させ、染色および画像診断法で使用するために、軟骨を除去する。標準的な染色技術を用いて、薄い凍結切片または生軟骨外植片中で、以下の軟骨成分の１つまたは複数を同定する：コラーゲン原線維、グリコサミノグリカン、または軟骨細胞。本開示のペプチドは、軟骨中の軟骨細胞に局在することが見いだされる。局在性は、顕微鏡検査で視覚化して確認する。

【0302】

別の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド−薬物コンジュゲートは、ヒトに投与されて、軟骨中の軟骨細胞に局在化する。

【0303】

実施例２６
軟骨細胞外マトリックス中のペプチド局在
本実施例は、軟骨細胞外マトリックス中の本開示のペプチドの局在化を例示する。本開示のペプチドは、非損傷腎臓を有する動物において、軟骨内の細胞外マトリックスに結合する。実施例２５に記載するように、薄い凍結切片または生軟骨外植片を取得し、染色して、視覚化する。本開示のペプチドは、軟骨中で細胞外マトリックスに局在することが見いだされる。局在性は、顕微鏡検査で視覚化して確認する。

【0304】

別の実施形態では、本開示のペプチドまたはペプチド−薬物コンジュゲートは、ヒトに投与されて、軟骨細胞外マトリックスに局在化する。

【0305】

実施例２７
軟骨外植片へのペプチド結合
本実施例は、培養物中でヒトおよび動物の軟骨外植片に結合する、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲーションを例示する。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２の任意の１つのペプチドから選択される。ペプチドを組換え的に発現しまたは化学的に合成して、放射性標識後に、またはフルオロフォアまたは治療用化合物へのコンジュゲーション後に、直接使用する。本開示のペプチドコンジュゲートのペプチドをヒトまたは動物に由来する軟骨外植片と共にインキュベートする。ペプチドコンジュゲートのペプチドは、軟骨外植片に結合することが見いだされる。結合は、液体シンチレーション計数、共焦点顕微鏡検査、免疫組織化学検査、ＨＰＬＣ、またはＬＣ／ＭＳをはじめとするが、これに限定されない様々な方法を用いて確認する。

【0306】

実施例２８
関節炎関節へのペプチドホーミング
本実施例は、関節炎を有するヒトまたは動物における、軟骨へのペプチドホーミングを例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成して、放射性標識後に、またはフルオロフォアまたは治療用化合物へのコンジュゲーション後に、直接使用する。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２の任意の１つのペプチドから選択される。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートをヒトまたは動物に、皮下、静脈内、または経口投与し、または関節に直接注射する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、軟骨にホーミングする。

【0307】

実施例２９
非ヒト動物における軟骨へのペプチドホーミング
本実施例は、非ヒト動物における、軟骨にホーミングする本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートを例示する。非ヒト動物としては、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、およびその他の非ヒト動物が挙げられるが、これに限定されるものではない。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成して、放射性標識後に、またはフルオロフォアまたは治療用化合物へのコンジュゲーション後に、直接使用する。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２の任意の１つのペプチドから選択される。得られたペプチドまたはペプチドコンジュゲートを非ヒト動物に、皮下、静脈内、または経口投与し、または関節に直接注射する。生体内分布は、ＬＣ／ＭＳ、オートラジオグラフィー、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）、または蛍光イメージングによって評価する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、非ヒト動物において軟骨にホーミングする。

【0308】

実施例３０
軟骨肉腫の治療
本実施例は、本開示のペプチドを使用した軟骨肉腫の治療を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成させて、放射性標識後に、またはフルオロフォアへのまたはパクリタキセルまたはモノメチルオーリスタチンＥなどの治療用化合物へのコンジュゲーション後に、直接使用する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートを軟骨肉腫の治療薬として、医薬組成物中で対象に投与する。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２の任意の１つのペプチドから選択される。本開示の１つまたは複数のペプチドまたはペプチドコンジュゲートを対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり得る。医薬組成物を皮下、静脈内、経口投与し、または関節に直接注射する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、軟骨肉腫に罹患した軟骨を標的化する。

【0309】

実施例３１
改善されたペプチド変異型を判定する方法
本実施例は、スキャフォールドペプチドの一次配列および三次構造を比較および分析することによって、ペプチド変異型を改善する方法を判定する方法を示す。図５０Ａ〜図５０Ｃは、配列番号２３９と整列させた配列番号４８６、配列番号４８７と整列させた配列番号４８６、および配列番号４２２と整列させた配列番号４８６の配列を示す。２つのスキャフォールドの配列アラインメントを用いて、軟骨のホーミングに重要であってもよい、保存された正電荷残基（ボックス内に示される）を同定した。配列番号４２２のペプチドは軟骨にホーミングし、類似位置の正電荷残基または類似位置のシステインを有するその他のペプチドもまた、軟骨にホーミングすると予測される。

【0310】

サソリ由来の多くの軟骨ホーミングペプチドは、Ｋｖイオンチャネルを調節すると予測される。図５１は、配列番号４２３と整列させた配列番号２４３の配列を示す。２つのスキャフォールドの配列アライメントを用いて、Ｋｖイオンチャネル（配列番号４２３のＫ２７およびＹ３６）との相互作用に関与してもよい塩基性／芳香族のダイアドを同定した。Ｋ２７からアラニン、アルギニンまたはグルタミン酸への変異は、イカＫｖ１Ａイオンチャネルに対する活性を破壊した。Ｋ２７およびＹ３６は、ホーミングを維持または改善するために、軟骨中の滞留時間を維持または改善するために、またはＫｖなどのイオンチャネルの調節を維持または改善するために、維持すること、または本開示の軟骨ホーミングペプチドに付加することが望ましくあってもよい。対照的に、Ｋ３７および３６は、Ｋｖのなどのイオンチャネルとの相互作用を減少させるために、軟骨ホーミングペプチドから変異欠失することが望ましくあってもよい。塩基性残基または芳香族残基のどちらかの破壊は、イオンチャネル活性を排除する。別の例では、Ｄアミノ酸が結合を低減または排除すると予測される。

【0311】

実施例３２
ペプチド−Ｆｃタンパク質融合体
本実施例は、ペプチド−Ｆｃタンパク質融合体の作製および使用を例示する。配列番号１１１のペプチドをＨＥＫ２９３細胞中のヒトＩｇＧ１ Ｆｃタンパク質の配列で組換え発現させて、配列番号４３５

【化3】

[この文献は図面を表示できません]

の配列を得た。

【0312】

本開示の任意のペプチドの配列は、分泌シグナル配列をＮ末端に、Ｆｃ配列をＣ末端に付加することにより、マウスまたはヒトＦｃのどちらかとの融合タンパク質として発現される。これにより、分泌特性が改善された二価分子が生じる。より大型のペプチド−Ｆｃ融合体は、様々な哺乳動物または昆虫細胞株において発現され、研究試薬および治療薬として有用である。

【0313】

配列番号１１１のペプチドに対するＦｃ融合は、配列番号４３５の配列をもたらし、半減期を延長し、ペプチドの軟骨への生体内分布を改善する。本開示の任意のペプチドは、Ｆｃタンパク質と同時発現されて、より長い半減期および軟骨への改善されたホーミングを有するＦｃ融合ペプチドを生じる。配列番号４３５中出は、分泌シグナル配列ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号４８５）の後に配列番号１１１のペプチドが続き、Ｆｃタンパク質の配列がそれに続く。切断は不正確であり得て、配列番号４３５の位置２０または位置２１で切断をもたらす。

【0314】

実施例３３
脊索腫の治療
本実施例は、本開示のペプチドを使用した脊索腫の治療を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成させて、放射性標識後に、またはフルオロフォアへのまたはパクリタキセルまたはモノメチルオーリスタチンＥなどの治療用化合物へのコンジュゲーション後に、直接使用する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートを軟骨肉腫の治療薬として、医薬組成物中で対象に投与する。ペプチドは、配列番号２１〜配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９８〜配列番号２１６、配列番号２３７〜配列番号４１０、配列番号４１２、配列番号４１４〜配列番号４３２の任意の１つのペプチドから選択される。本開示の１つまたは複数のペプチドまたはペプチドコンジュゲートを対象に投与する。対象は、ヒトまたは動物であり得る。医薬組成物を皮下、静脈内、経口投与し、または関節に直接注射する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、脊索腫に罹患した軟骨を標的化する。

【0315】

実施例３４
ペプチド検出可能剤コンジュゲート
本実施例は、ペプチドの色素標識を記載する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成して、次に、ＤＣＣまたはＥＤＣを用いて、ペプチドのＮ末端がＮＨＳエステルを介して検出可能剤にコンジュゲートさせ、ペプチド−検出可能剤コンジュゲートを作製する。検出可能剤は、Ｃｙ５．５などのシアニン色素などのフルオロフォア色素、またはＡｌｅｘａ６４７などのＡｌｅｘａフルオロフォアである。

【0316】

ペプチド検出可能剤コンジュゲートを対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。投与後に、ペプチド検出可能剤コンジュゲートは軟骨にホーミングする。対象、または対象からの生検は画像化して、ペプチド検出可能剤コンジュゲートの軟骨への局在性を視覚化し得る。いくつかの態様では、投与後における軟骨中のペプチド検出可能剤コンジュゲートの可視化は、関節炎、軟骨障害、または何らかの軟骨障害の診断をもたらす。

【0317】

実施例３５
切断可能リンカーを有するペプチドコンジュゲート
本実施例は、切断可能リンカーを有するノッチンペプチドコンジュゲートの調製物を記載する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成する。標準１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｌｃｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（ＤＣＣ）ベースの化学反応、または塩化チオニルまたは亜リン酸塩化物ベースの生体バイオコンジュゲーション化学反応を用いて、ペプチドをエステル結合などの切断可能リンカーを介して、検出可能薬剤または活性薬剤にコンジュゲートする。リンカーは、エステラーゼ、ＭＭＰ、カテプシンＢ、プロテアーゼ、またはトロンビンによって切断される。

【0318】

得られたペプチドコンジュゲートをヒトまたは動物に、皮下、静脈内、経口投与し、または関節に直接注射して疾患を治療する。ペプチドは、消化のみによって、切断剤によって、検出可能薬剤または活性薬剤から切断される。

【0319】

実施例３６
ペプチドおよびペプチドコンジュゲートの関節内投与
本実施例は、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートの関節内投与を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成する。場合によっては、ペプチドを検出可能薬剤または活性薬剤に、引き続いてコンジュゲートする。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートを、関節内投与を通じて、それを必要とする対象に投与する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートの小さなサイズのために、およびペプチドまたはペプチドコンジュゲートによる軟骨成分の結合のために、ペプチドまたはペプチドコンジュゲートは軟骨に浸透する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、軟骨に結合し、軟骨中の滞留時間は、この結合のためにより長い。必要に応じて、注射された材料は凝集、結晶化、または複合体形成し、デポー効果をさらに延長して、より長い滞留時間に寄与する。

【0320】

実施例３７
迅速な疼痛緩和のための治療
本実施例は、本開示のペプチドまたはペプチドコンジュゲートを用いて、関節リウマチまたは変形性関節症が治療された患者における、迅速な疼痛緩和を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成し、次に、ペプチドのＮ末端を、ＮＨＳエステルを介して活性薬剤にコンジュゲートさせ、ペプチド−活性薬剤コンジュゲートを作製する。いくつかの態様では、活性薬剤は、リドカインである。場合によっては、ペプチドのみを対象に投与する。

【0321】

ペプチドまたはペプチド−活性薬剤コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与する。対象は、ヒトまたは非ヒト動物である。それを必要とする対象は、関節リウマチまたは変形性関節症を有する。ペプチドまたはペプチドコンジュゲートを、静脈内を通じて送達する。投与時に、ペプチドまたはペプチドコンジュゲートは、軟骨に迅速にホーミングする。被験者は、５分から１時間以内に迅速な疼痛緩和鎮痛を経験し、疼痛緩和（ｐａｉｎ ｒｅｌｉｅｖｅ）は３時間を超えて持続し得る。

【0322】

実施例３８
安定なペプチドを生成するための残基の選択的変異
本実施例は、製造または貯蔵中の安定性の向上など、安定性を高めたペプチドを製造するための残基の選択的変異を例示する。本開示のペプチドを組換え的に発現させまたは化学的に合成する。Ｍｅｔ残基をバリン、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＩｌｅに変異させ、酸化を防止する。Ａｓｎ−Ｐｒｏ配列を任意のその他の残基（システイン以外）に変異させ、切断反応を回避する。Ａｓｎ−ＧｌｙまたはＡｓｎ−Ｓｅｒ、および／またはＡｓｎ−Ｐｒｏを任意のその他の残基（システイン以外）で置換して、脱アミドを低減する。Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ａｓｐ−Ｓｅｒ、またはＡｓｐ−Ｐｒｏを任意のその他の残基（システイン以外）で置換して、切断反応を低減する。

【0323】

本開示のペプチドの一次配列中の上記変異は、製造中、貯蔵中、そしてそれを必要とする対象への投与後における、ペプチド安定性を向上させる。

【0324】

実施例３９
ペプシン消化抵抗性ペプチド
本実施例は、ペプシン抵抗性ペプチドを示す。配列番号２４ペプチドおよび配列番号１１１のペプチドを、５００μｌのｄｄＨ_２Ｏで、２ｍｇ／ｍｌの原液濃度に懸濁した。人工胃液（ｐＨ１．０５）中の１２．５μｇペプチドおよび２０μｇペプシンを使用して反応物を調製し、３７．５℃で３０分間インキュベートした。１００ｍＭのトリス塩基および１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）の最終濃度で、反応をクエンチした。Ｃ−１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０Ｂカラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣを用いて、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）をサンプルに実行した。サンプルは、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ添加水）および溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ添加アセトニトリル）の移動相を用いる勾配法によって分析した。溶媒Ｂを、移動相の５％から４５％に、１０分間かけて上昇させた。ペプチドは、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度で検出した。

【0325】

図５２は、ＳＰＴＤ、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）および２０μｇのペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５３は、ＳＰＴＤ、ｐＨ１．０５の人工胃液（ＳＧＦ）および２０μｇのペプシン（Ｐ）、ＳＧＦ、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５２は、配列番号２４の無傷ペプチドであることが判明した６．５分前後のピーク溶出を示し、１．５分前後のピーク溶出はＤＴＴ、２．５分前後のピーク溶出は酸化ＤＴＴであった。無傷ペプチドピークは、ＤＴＴ溶液、ＳＧＦ溶液、ＳＧＦおよびＰ溶液、およびＳＰＴＤ溶液中で観察されたことから、配列番号２４のペプチドは、分解に強い抵抗性を示すと判定された。配列番号１１１のペプチドを示す図５３もまた、試験した様々な条件において同様に高度に耐性であることが判明した。

【0326】

実施例４０
トリプシン消化抵抗性ペプチド
本実施例は、トリプシン消化抵抗性ペプチドを示す。様々なペプチドを５００μｌのｄｄＨ_２Ｏで、２ｍｇ／ｍｌの原液濃度に懸濁した。２５ｍＭトリス／７５ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）中の１２．５μｇのペプチドおよび５μｇのトリプシンを使用して反応物を調製し、３７．５°Ｃで３０分間インキュベートした。５μｇの大豆トリプシンインヒビターおよび１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で、反応物をクエンチしたＣ−１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０Ｂカラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣを用いて、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）をサンプルに実行した。サンプルは、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ添加水）および溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ添加アセトニトリル）の移動相を用いる勾配法によって分析した。溶媒Ｂを、移動相の５％から４５％に、１０分間かけて上昇させた。

【0327】

図５４は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件（出発ペプチド、ＤＴＴ、Ｔ、またはＩによる処理なし）をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号４８３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ＤＴＴは、１．５分付近および２．５分付近（還元型および酸化型）で溶出され、ＮＲトレースは、無傷ペプチドが８．７５分付近で溶出されたことを示す。ＤＴＴ溶液中のペプチドを示すトレースは、８．７５分に無傷ペプチド、いくらかの還元型ペプチドを１０分付近で示し、この配列番号４８３のペプチドが、ＤＴＴよる還元にある程度抵抗性であることを示す。トリプシン添加ペプチドを示トレースは、無傷ペプチドおよび分解ペプチドを示し、この場合も配列番号４８３のペプチドが、トリプシンよる分解にある程度抵抗性であることを実証する。図５５は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５６は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５７は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号３２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【0328】

図５８は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号４８５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図５９は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６０は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２０５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６１は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６２は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【0329】

図６３は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６４は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１９８のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６５は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号２０６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図６６は、２５ｍＭのトリス、５μｇの大豆トリプシンインヒビター、および１０ｍＭＤＴＴ（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）中の５μｇのトリプシンのＨＰＬＣクロマトグラム；ならびに（Ｔ、Ｉ、ＤＴＴ）、（Ｔ，Ｉ）、ＤＴＴ、および非還元（ＮＲ）条件をはじめとする様々な溶液に懸濁された、１２．５μｇの配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。

【0330】

実施例４１
還元剤抵抗性ペプチド
本実施例は、還元剤抵抗性ペプチドを示す。いくつかのペプチドをで、５００μｌのｄｄＨ_２Ｏで、２ｍｇ／ｍｌの原液濃度に懸濁した。反応物は、原液からの１２．５μｇのペプチドをＰＢＳ中の１０ｍＭのＤＴＴ溶液に添加し、室温で３０分間インキュベートして調製した。Ｃ−１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０Ｂカラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣを用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣをサンプルに実行した。サンプルは、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ添加水）および溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ添加アセトニトリル）の移動相を用いる勾配法によって分析した。溶媒Ｂを、移動相の５％から４５％に、１０分間かけて上昇させた。

【0331】

図６７は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉ Ｃｌａｓｓｉｃ（登録商標）質量分光計上における、様々なペプチドのＨＰＬＣクロマトグラム、および直接注入エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）後における様々なペプチドの質量分析結果を示す。ペプチドをＨＰＬＣによって分画し、さらなるサンプル調製をせずに、ＣＴＣＰＡＬ（登録商標）オートサンプラーを用いて、５μｌのサンプルを１ｍｇ／ｍｌで質量分光計に注入した。代案としては、ペプチドが凍結乾燥粉末として提供される場合、サンプルを１００％水に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ＥＳ−ＭＳへの注入に先だって、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｚｉｐｔｉｐ Ｃ１８（登録商標）カラムを使用してペプチドを脱塩した。５つの標準ペプチドの混合物の５ｐｍｏｌを使用して質量分光計を較正し、１０ｐｐｍ未満の誤差で高精度の質量測定を達成した。ペプチドジスルフィド結合形成の確認は、ｍ／ｚ同位体の分布および正確な電荷を分析することによって達成した。試験された全てのペプチドは、還元条件下および非還元条件下で示される。非還元条件下において同一滞留時間で溶出した一部または全部のペプチドを示すＤＴＴ還元後のペプチドトレースは、ペプチドがＤＴＴよる還元に抵抗性であったことを示唆した。図６７Ａは、配列番号４８３のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．５分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、８．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｂは、配列番号２２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。６．４分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、５．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｃは、配列番号２４のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。ピークは、非還元条件下および還元条件のペプチドが重複していることを示す。図６７Ｄは、配列番号３２のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．４分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、９．０分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｅは、配列番号４８５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．４分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、８．１分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｆは、配列番号２７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。８．２分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、５．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｇは、配列番号２０５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。６．６分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、５．６分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｈは、配列番号１９５のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．５分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、８．４分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｉは、配列番号１９６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。ピークは、非還元条件下および還元条件のペプチドが重複していることを示す。図６７Ｊは、配列番号１９７のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。８．５分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、７．７分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｋは、配列番号１９８のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。９．７分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、６．７分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｌは、配列番号２０６のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。８．２分付近のピークは、非還元条件下のペプチドであり、７．２分付近のピークは、還元されたペプチドを示す。図６７Ｍは、配列番号１１１のペプチドのＨＰＬＣクロマトグラムおよび質量分析の結果を示す。ピークは、非還元条件下および還元条件のペプチドが完全に重複していることを示す。

【0332】

実施例４２
ペプチドの静脈内および経口投与
本実施例は、経口投与後に消化管を通って糞便に至る、無傷ペプチドの通過をはじめとする、本開示のペプチドの静脈内および経口投与を記載する。６〜８週齢のメスハーラン胸腺欠損ヌードマウスに、配列番号２４の放射性標識ペプチドを静脈内または経口投与した。配列番号２４の放射性標識ペプチドを４．８μＣｉ／２０ナノモルの用量で静脈内（ＩＶ）投与した。配列番号２４の放射性標識ペプチドを２４μＣｉ／１００ナノモルの用量で経口投与した（ＰＯ）。様々な時点でマウスをＣＯ_２窒息によって安楽死させ、血液、尿、および糞便をはじめとする生体液を採取した。尿は、ＣＯ_２窒息直前に、腹部動悸によって（ｂｅ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｐａｌｐｉｔａｔｉｏｎ）採取した。血液は、ＣＯ_２窒息直後に心臓穿刺によって収集し、遠心分離して血漿を分離した。糞便は、ＣＯ_２窒息の前または後のどちらかに、結腸動悸によって採取した。ＨＰＬＣによってサンプルを分析し、血漿、尿、および糞便中出回収された無傷ペプチドの濃度または用量を定量化した。ＨＰＬＣ分析では、最初に、尿サンプルを水で１：２０の比率に希釈し、血漿サンプルを水で１：５の比率に希釈した。糞便サンプルは、トリス緩衝液に溶解し、遠心分離して不溶性画分を除去し、上清を水で１：１の比率に希釈した。

【0333】

表１１は、研究デザインの要約を示す。

【0334】

【表24】

[この文献は図面を表示できません]

【0335】

図６８は、マウスへの投与後における、血漿中の配列番号２４の放射性標識ペプチドの濃度を示す。図６８Ａは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、血漿中のペプチドの濃度を示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図６８Ｂは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、血漿中投与されたペプチド用量の回収パーセントを示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図６８Ｃは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの胃管栄養法による経口投与後に、タンデムＨＰＬＣおよび液体シンチレーション計数によって測定された、血漿中のペプチドおよびペプチド断片ピークの強度を示す。^１４Ｃの送達用量は、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には、０．５、１、および３時間が含まれた。これらのデータは、ＩＶ投与による用量の１０％に至る血漿濃度と、ＰＯ投与による用量の１％に至る血漿濃度で、血漿中における少なくとも５０時間に至る、投与されたペプチドからの放射性シグナルの検出を示す。無傷ペプチドが６分付近で溶出されたのに対し、Ｎ末端Ｇｌｙ残基などの切断断片は１分付近で溶出された。したがって、血漿中に検出された放射能のほぼ一部の全て（ｓｏｍｅ ｏｆ ａｌｌ ｏｆ）は、投与されたペプチドの断片に起因した。

【0336】

図６９は、マウスへのペプチド投与後の尿中の配列番号２４の放射性標識ペプチドの濃度を示す。図６９Ａは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、尿中のペプチドの濃度を示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図６９Ｂは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの胃管栄養法による経口投与後に、タンデムＨＰＬＣおよび液体シンチレーション計数によって測定された、尿中のペプチドおよびペプチド断片ピークの強度を示す。^１４Ｃの送達用量は、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には、０．５、１、３、８、２４、および４８時間が含まれた。

【0337】

図７０は、マウスへのペプチド投与後の糞便中の配列番号２４の放射性標識ペプチドの濃度を示す。図７０Ａは、液体シンチレーション計数を用いて^１４Ｃシグナルを測定することによって定量化された、２０ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの静脈内（ＩＶ）投与後、および１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの経口（ＰＯ）投与後における、糞便中のペプチドの濃度を示す。^１４Ｃの送達用量は、静脈内投与では４．８μＣｉ、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には０．０８、０．５、１、３、８、２４、４８時間が含まれ、各時点で３匹のマウスを試験した。図７０Ｂは、１００ナノモルの配列番号２４の放射性標識ペプチドの胃管栄養法による経口投与後に、タンデムＨＰＬＣおよび液体シンチレーション計数によって測定された、糞便中のペプチドおよびペプチド断片ピークの強度を示す。^１４Ｃの送達用量は、経口投与では２４μＣｉであった。試験した時点には、３および８時間が含まれた。これらのデータは、配列番号２４の無傷ペプチドが、経口投与後に糞便中で検出されたことを示し、一部の無傷ペプチドが消化管を通過したことを示唆する。

【0338】

実施例４３
軟骨ホーミングペプチドを同定するためのｐＦａｍ００４５１に対する配列アラインメント
本実施例は、ｐＦａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーに対する配列アラインメントによって、新規軟骨ホーミングペプチドを同定するための方法を記載する。ｐＦａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスは、配列同一性の類似性によって関連するペプチドのファミリーである。図７３は、配列番号４３６〜配列番号４８２のｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリー内のペプチドアライメントを示す。囲み内および太字の残基は、配列の相対的な保存を示す一方で、囲み外および太字でない残基は、配列変動性がより高い領域を示す。ｐＦａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿構造クラスファミリーとの造的類似性に基づいて、配列番号４３６を軟骨ホーミング候補ペプチドとして同定した。図７４は、ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ ２構造クラスファミリーに由来する配列番号４３６のペプチドと配列番号２４配列との配列アライメントを示す。星印は、単一の完全に保存された残基を有する位置を示し、コロンは、類似性の高いグループ（Ｇｏｎｎｅｔ ｐｏｉｎｔ ａｃｃｅｐｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ（ＰＡＭ）２５０マトリックスにおける０．５を超える得点）間の保存を示し、ピリオドは、類似性の低いグループ（Ｇｏｎｎｅｔ ＰＡＭ ２５０マトリックスにおける≦０．５の得点）間の保存を示す。ｐｆａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーペプチドとの構造的類似性（ｓｉｍｉｌｉａｒｉｔｉｅｓ）に基づいて、配列番号１１１もまた、軟骨ホーミング候補として同定した。

【0339】

ｐＦａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーをスキャフォールドとして使用し、軟骨ホーミング特性を有する変異型ペプチドを同定する。ｐＦａｍ００４５１：ｔｏｘｉｎ＿２構造クラスファミリーの任意のメンバーを使用して、相同性、保存された残基、または保存されたシステイン残基に基づいて、新規軟骨ホーミングペプチドを予測する。

【0340】

実施例４４
温度安定性ペプチド
本実施例は、高温におけるペプチド安定性を例示する。ペプチドを最初に、５００μｌのｄｄＨ_２Ｏで、２ｍｇ／ｍｌの原液濃度に懸濁した。原液からの６．２５μｌのペプチドを９５μｌのｄｄＨ_２Ｏと共に添加することによって反応物を調製し、サーモサイクラー内で、室温、７０°Ｃ、または１００°Ｃで１時間インキュベートした。次にＣ−１８ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０Ｂカラムを装着したＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣを用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣをサンプルに実行した。サンプルは、溶媒Ａ（０．１％ＴＦＡ添加水）および溶媒Ｂ（０．１％ＴＦＡ添加アセトニトリル）の移動相を用いる勾配法によって分析した。溶媒Ｂを、移動相の５％から４５％に、１０分間かけて上昇させた。

【0341】

室温で（２５°Ｃ）、７０°Ｃ、または１００°Ｃで１時間のインキュベーション後に、配列番号２８および配列番号４８３のペプチドをＨＰＬＣによって分析した。７０℃で１時間のインキュベート後に、配列番号４８３および配列番号２８のペプチドは、室温でインキュベートしたサンプルとほぼ同じＨＰＬＣ溶出時間およびピーク高さを示し、ペプチドが熱誘導分解に抵抗性であることを示した。１００°Ｃで１時間のインキュベーション後に、配列番号４８３および配列番号２８のペプチドは、最初の溶出時間に溶出されたペプチド量の低下によって証明された様々な程度の分解を受けた。

【0342】

本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され説明されたが、このような実施形態は単なる例示として提供されることが当業者には明らかであろう。本開示は、本明細書で提供される特定の実施例によって制限されることは意図されない。本開示を前述の明細書を参照して説明したが、本明細書の実施形態の説明および図解が、限定的意味で解釈されることは意図されない。本開示から逸脱することなく、当業者には多数の変動、変更、および置換が可能である。さらに、本開示の全ての実施形態は、様々な条件および変数に依存する、本明細書に記載の特定の描写、構成または相対比率に限定されないものと理解すべきである。本明細書に記載された本開示の実施形態に対する様々な代替物が、本開示の実施において用いられてもよいものと理解すべきである。したがって、本開示はまた、このような代替物、修正、変種、または同等物も網羅することが想定される。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造およびそれらの同等物が、それによってカバーされることが意図される。

【図1A】

[この文献は図面を表示できません]

【図1B】

[この文献は図面を表示できません]

【図1C】

[この文献は図面を表示できません]

【図1D】

[この文献は図面を表示できません]

【図1E】

[この文献は図面を表示できません]

【図1F】

[この文献は図面を表示できません]

【図1G】

[この文献は図面を表示できません]

【図1H】

[この文献は図面を表示できません]

【図1I】

[この文献は図面を表示できません]

【図1J】

[この文献は図面を表示できません]

【図1K】

[この文献は図面を表示できません]

【図1L】

[この文献は図面を表示できません]

【図1M】

[この文献は図面を表示できません]

【図2】

[この文献は図面を表示できません]

【図3】

[この文献は図面を表示できません]

【図4】

[この文献は図面を表示できません]

【図5】

[この文献は図面を表示できません]

【図6】

[この文献は図面を表示できません]

【図7】

[この文献は図面を表示できません]

【図8】

[この文献は図面を表示できません]

【図9】

[この文献は図面を表示できません]

【図10】

[この文献は図面を表示できません]

【図11A】

[この文献は図面を表示できません]

【図11B】

[この文献は図面を表示できません]

【図12】

[この文献は図面を表示できません]

【図13A】

[この文献は図面を表示できません]

【図13B】

[この文献は図面を表示できません]

【図14A】

[この文献は図面を表示できません]

【図14B】

[この文献は図面を表示できません]

【図15A】

[この文献は図面を表示できません]

【図15B】

[この文献は図面を表示できません]

【図15C】

[この文献は図面を表示できません]

【図15D】

[この文献は図面を表示できません]

【図15E】

[この文献は図面を表示できません]

【図15F】

[この文献は図面を表示できません]

【図15G】

[この文献は図面を表示できません]

【図16A】

[この文献は図面を表示できません]

【図16B】

[この文献は図面を表示できません]

【図16C】

[この文献は図面を表示できません]

【図16D】

[この文献は図面を表示できません]

【図16E】

[この文献は図面を表示できません]

【図16F】

[この文献は図面を表示できません]

【図16G】

[この文献は図面を表示できません]

【図17A】

[この文献は図面を表示できません]

【図17B】

[この文献は図面を表示できません]

【図17C】

[この文献は図面を表示できません]

【図17D】

[この文献は図面を表示できません]

【図17E】

[この文献は図面を表示できません]

【図17F】

[この文献は図面を表示できません]

【図18A】

[この文献は図面を表示できません]

【図18B】

[この文献は図面を表示できません]

【図18C】

[この文献は図面を表示できません]

【図18D】

[この文献は図面を表示できません]

【図18E】

[この文献は図面を表示できません]

【図18F】

[この文献は図面を表示できません]

【図19A】

[この文献は図面を表示できません]

【図19B】

[この文献は図面を表示できません]

【図19C】

[この文献は図面を表示できません]

【図19D】

[この文献は図面を表示できません]

【図20A】

[この文献は図面を表示できません]

【図20B】

[この文献は図面を表示できません]

【図20C】

[この文献は図面を表示できません]

【図20D】

[この文献は図面を表示できません]

【図21A-D】

[この文献は図面を表示できません]

【図21E-H】

[この文献は図面を表示できません]

【図22A】

[この文献は図面を表示できません]

【図22B】

[この文献は図面を表示できません]

【図22C】

[この文献は図面を表示できません]

【図22D】

[この文献は図面を表示できません]

【図22E】

[この文献は図面を表示できません]

【図22F】

[この文献は図面を表示できません]

【図22G】

[この文献は図面を表示できません]

【図22H】

[この文献は図面を表示できません]

【図23A-23B】

[この文献は図面を表示できません]

【図23C-23D】

[この文献は図面を表示できません]

【図23E-23F】

[この文献は図面を表示できません]

【図24A】

[この文献は図面を表示できません]

【図24B】

[この文献は図面を表示できません]

【図24C】

[この文献は図面を表示できません]

【図24D】

[この文献は図面を表示できません]

【図24E】

[この文献は図面を表示できません]

【図24F】

[この文献は図面を表示できません]

【図24G】

[この文献は図面を表示できません]

【図24H】

[この文献は図面を表示できません]

【図25A】

[この文献は図面を表示できません]

【図25B】

[この文献は図面を表示できません]

【図25C】

[この文献は図面を表示できません]

【図25D】

[この文献は図面を表示できません]

【図25E】

[この文献は図面を表示できません]

【図26A】

[この文献は図面を表示できません]

【図26B】

[この文献は図面を表示できません]

【図26C】

[この文献は図面を表示できません]

【図26D】

[この文献は図面を表示できません]

【図26E】

[この文献は図面を表示できません]

【図26F】

[この文献は図面を表示できません]

【図27A】

[この文献は図面を表示できません]

【図27B】

[この文献は図面を表示できません]

【図27C】

[この文献は図面を表示できません]

【図27D】

[この文献は図面を表示できません]

【図27E】

[この文献は図面を表示できません]

【図27F】

[この文献は図面を表示できません]

【図27G】

[この文献は図面を表示できません]

【図27H】

[この文献は図面を表示できません]

【図28A】

[この文献は図面を表示できません]

【図28B】

[この文献は図面を表示できません]

【図28C】

[この文献は図面を表示できません]

【図28D】

[この文献は図面を表示できません]

【図28E】

[この文献は図面を表示できません]

【図28F】

[この文献は図面を表示できません]

【図29A】

[この文献は図面を表示できません]

【図29B】

[この文献は図面を表示できません]

【図29C】

[この文献は図面を表示できません]

【図29D】

[この文献は図面を表示できません]

【図29E】

[この文献は図面を表示できません]

【図29F】

[この文献は図面を表示できません]

【図29G】

[この文献は図面を表示できません]

【図29H】

[この文献は図面を表示できません]

【図30A】

[この文献は図面を表示できません]

【図30B】

[この文献は図面を表示できません]

【図30C】

[この文献は図面を表示できません]

【図30D】

[この文献は図面を表示できません]

【図30E】

[この文献は図面を表示できません]

【図30F】

[この文献は図面を表示できません]

【図31A】

[この文献は図面を表示できません]

【図31B】

[この文献は図面を表示できません]

【図31C】

[この文献は図面を表示できません]

【図31D】

[この文献は図面を表示できません]

【図31E】

[この文献は図面を表示できません]

【図31F】

[この文献は図面を表示できません]

【図32A】

[この文献は図面を表示できません]

【図32B】

[この文献は図面を表示できません]

【図32C】

[この文献は図面を表示できません]

【図32D】

[この文献は図面を表示できません]

【図32E】

[この文献は図面を表示できません]

【図32F】

[この文献は図面を表示できません]

【図32G】

[この文献は図面を表示できません]

【図32H】

[この文献は図面を表示できません]

【図33A】

[この文献は図面を表示できません]

【図33B】

[この文献は図面を表示できません]

【図33C】

[この文献は図面を表示できません]

【図33D】

[この文献は図面を表示できません]

【図33E】

[この文献は図面を表示できません]

【図33F】

[この文献は図面を表示できません]

【図34A】

[この文献は図面を表示できません]

【図34B】

[この文献は図面を表示できません]

【図34C】

[この文献は図面を表示できません]

【図34D】

[この文献は図面を表示できません]

【図34E】

[この文献は図面を表示できません]

【図34F】

[この文献は図面を表示できません]

【図35A】

[この文献は図面を表示できません]

【図35B】

[この文献は図面を表示できません]

【図35C】

[この文献は図面を表示できません]

【図35D】

[この文献は図面を表示できません]

【図35E】

[この文献は図面を表示できません]

【図35F】

[この文献は図面を表示できません]

【図36A】

[この文献は図面を表示できません]

【図36B】

[この文献は図面を表示できません]

【図36C】

[この文献は図面を表示できません]

【図36D】

[この文献は図面を表示できません]

【図36E】

[この文献は図面を表示できません]

【図36F】

[この文献は図面を表示できません]

【図37A】

[この文献は図面を表示できません]

【図37B】

[この文献は図面を表示できません]

【図37C】

[この文献は図面を表示できません]

【図37D】

[この文献は図面を表示できません]

【図37E】

[この文献は図面を表示できません]

【図37F】

[この文献は図面を表示できません]

【図37G】

[この文献は図面を表示できません]

【図37H】

[この文献は図面を表示できません]

【図38A】

[この文献は図面を表示できません]

【図38B】

[この文献は図面を表示できません]

【図38C】

[この文献は図面を表示できません]

【図38D】

[この文献は図面を表示できません]

【図39A】

[この文献は図面を表示できません]

【図39B】

[この文献は図面を表示できません]

【図39C】

[この文献は図面を表示できません]

【図39D】

[この文献は図面を表示できません]

【図40A】

[この文献は図面を表示できません]

【図40B】

[この文献は図面を表示できません]

【図40C】

[この文献は図面を表示できません]

【図40D】

[この文献は図面を表示できません]

【図41A】

[この文献は図面を表示できません]

【図41B】

[この文献は図面を表示できません]

【図41C】

[この文献は図面を表示できません]

【図41D】

[この文献は図面を表示できません]

【図42A】

[この文献は図面を表示できません]

【図42B】

[この文献は図面を表示できません]

【図42C】

[この文献は図面を表示できません]

【図42D】

[この文献は図面を表示できません]

【図42E】

[この文献は図面を表示できません]

【図42F】

[この文献は図面を表示できません]

【図42G】

[この文献は図面を表示できません]

【図42H】

[この文献は図面を表示できません]

【図43A】

[この文献は図面を表示できません]

【図43B】

[この文献は図面を表示できません]

【図43C】

[この文献は図面を表示できません]

【図43D】

[この文献は図面を表示できません]

【図43E】

[この文献は図面を表示できません]

【図43F】

[この文献は図面を表示できません]

【図43G】

[この文献は図面を表示できません]

【図43H】

[この文献は図面を表示できません]

【図44A】

[この文献は図面を表示できません]

【図44B】

[この文献は図面を表示できません]

【図44C】

[この文献は図面を表示できません]

【図44D】

[この文献は図面を表示できません]

【図44E】

[この文献は図面を表示できません]

【図44F】

[この文献は図面を表示できません]

【図44G】

[この文献は図面を表示できません]

【図44H】

[この文献は図面を表示できません]

【図45】

[この文献は図面を表示できません]

【図46】

[この文献は図面を表示できません]

【図47】

[この文献は図面を表示できません]

【図48】

[この文献は図面を表示できません]

【図49】

[この文献は図面を表示できません]

【図50】

[この文献は図面を表示できません]

【図51】

[この文献は図面を表示できません]

【図52】

[この文献は図面を表示できません]

【図53】

[この文献は図面を表示できません]

【図54】

[この文献は図面を表示できません]

【図55】

[この文献は図面を表示できません]

【図56】

[この文献は図面を表示できません]

【図57】

[この文献は図面を表示できません]

【図58】

[この文献は図面を表示できません]

【図59】

[この文献は図面を表示できません]

【図60】

[この文献は図面を表示できません]

【図61】

[この文献は図面を表示できません]

【図62】

[この文献は図面を表示できません]

【図63】

[この文献は図面を表示できません]

【図64】

[この文献は図面を表示できません]

【図65】

[この文献は図面を表示できません]

【図66】

[この文献は図面を表示できません]

【図67】

[この文献は図面を表示できません]

【図68】

[この文献は図面を表示できません]

【図69】

[この文献は図面を表示できません]

【図70】

[この文献は図面を表示できません]

【図71】

[この文献は図面を表示できません]

【図72】

[この文献は図面を表示できません]

【図73】

[この文献は図面を表示できません]

【図74】

[この文献は図面を表示できません]

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]