特許 6967560 高分解能走査顕微鏡

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6967560

(24)【登録日】2021年10月27日

(45)【発行日】2021年11月17日

(54)【発明の名称】高分解能走査顕微鏡

(51)【国際特許分類】

   G02B 21/06 20060101AFI20211108BHJP

【ＦＩ】

   G02B21/06

【請求項の数】22

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2019-155893(P2019-155893)

(22)【出願日】2019年8月28日

(62)【分割の表示】特願2014-190341(P2014-190341)の分割

【原出願日】2014年9月18日

(65)【公開番号】特開2019-211788(P2019-211788A)

(43)【公開日】2019年12月12日

【審査請求日】2019年8月28日

(31)【優先権主張番号】10 2013 015 933.4

(32)【優先日】2013年9月19日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】506151659

【氏名又は名称】カール ツァイス マイクロスコピー ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＲＬ ＺＥＩＳＳ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ ＧＭＢＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100105957

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100068755

【弁理士】

【氏名又は名称】恩田 博宣

(74)【代理人】

【識別番号】100142907

【弁理士】

【氏名又は名称】本田 淳

(72)【発明者】

【氏名】インゴ クレッペ

(72)【発明者】

【氏名】ラルフ ネッツ

(72)【発明者】

【氏名】トーマス カルクブレナー

(72)【発明者】

【氏名】ラルフ ヴォレシェンスキー

(72)【発明者】

【氏名】ヤウヘニ ノビカウ

【審査官】 殿岡 雅仁

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３８３２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０９５７４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２４３７３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５０４２２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−０６２２６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−０２２２８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５０６２０３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／０２０６２７６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１１−５２７２１８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０２Ｂ ２１／００ − ２１／３６

Ｇ０１Ｎ ２１／６２ − ２１／７４

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

走査顕微鏡であって、
照射光を使用して試料を照射するための照射装置と、
対物レンズ瞳内もしくはその付近に、または該対物レンズ瞳と共役な平面内にある少なくとも１つの位相マスクと、前記位相マスクは、横方向の断面に沿って波面の位相に様々な影響を与えて、検出光の空間的分布を生成するための位相影響を形成する可変の横方向プロファイルを有し、前記走査顕微鏡は、光軸に沿った放射線経路を有し、前記空間的分布は、前記光軸に直交する方向および前記光軸に沿った方向のうちの少なくとも一方に生じ、
試料を横断するように照射スポットを案内し、回折限界の単一画像内に試料が撮像されるスポットを再走査する走査装置と、
撮像倍率を考慮して前記単一画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさである空間分解能で、様々な走査位置について検出平面内の単一画像を捕捉するための検出装置とを備え、
前記該検出装置（１９）が、
ピクセルを備えており、前記単一画像より大きい検出器アレイと、
前記検出器アレイの上流に配置され、前記検出平面からの放射線を非撮像的に前記検出器アレイの前記ピクセル上に分配する非撮像の再分配素子とを備え、
前記少なくとも１つの位相マスクは、試料の異なる平面に関するｚ情報が横方向に符号化されて、３Ｄスタックを計算するために試料の複数の平面が同時に記録されて、スキャン速度が増加するように、空間分布の検出点像関数を生成するように構成される、走査顕微鏡。

【請求項2】

１つの支持体上に、もしくは前後に配置された２つの支持体上に、照射放射線経路および検出光軸のうちの少なくとも１つに沿った振幅マスクおよび位相マスクの組み合わせを備える、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項3】

前記少なくとも１つの位相マスクは、両側にそれぞれ可変の位相プロファイルを有する半瞳位相マスクを含む、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項4】

前記両側でのプロファイルが互いに逆である、請求項３に記載の走査顕微鏡。

【請求項5】

前記位相マスク上に位相跳躍を有する、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項6】

異なる厚さの領域を分離するためのエッジを有する位相マスクを備える、請求項５に記載の走査顕微鏡。

【請求項7】

前記位相マスクがスパイラル位相マスクである、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項8】

位相に影響を与えるために、検出方向における検出光軸に沿った検出面の前に、断面に沿って厚さが異なるガラス板を備える、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項9】

前記位相マスクが照射放射線経路および検出放射線経路のうちの少なくとも１つに配置されている、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項10】

前記位相マスクが照射放射線経路／検出放射線経路の共通部分に配置されている、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項11】

位相に影響を与えるための分離素子を備える、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項12】

前記位相マスクが、照射方向において照射放射線経路に沿って対物レンズの上流の前記対物レンズ瞳内に配置されている、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項13】

前記位相マスクは、前記位相影響を取り消し、かつ検出方向において検出光の軸に沿って含まれるものである、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項14】

前記位相マスクおよび別の位相マスクのうちの少なくとも１つが、位相影響の逆方向のプロファイルを有する、請求項１３に記載の走査顕微鏡。

【請求項15】

少なくとも２つの検出放射線経路を有する分割を提供するために、検出方向において検出光の軸に沿って検出面の上流に二色性のビームスプリッタを備える、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項16】

検出方向において検出平面の上流に位置する、検出放射線経路におけるズーム光学系を備える、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項17】

位相および振幅のうちの少なくとも一方に影響を与える空間光変調器（ＳＬＭ）をさらに備え、前記ＳＬＭは、検出方向の検出面の上流に位置する検出放射線経路にある、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項18】

光軸に沿って少なくとも部分的な空間分割を有する異なる検出光波長で作用を及ぼすために、検出放射線経路内に位相マスクとして含まれる色的に作用する位相マスクをさらに備える、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【請求項19】

前記色的に作用する位相マスクは、照射波長に応じて位相関数が変化するように構造的に設計されている、請求項１８に記載の走査顕微鏡。

【請求項20】

前記色的に作用する位相マスクは、検出放射線経路に挿入された色的に作用する光学位相素子であり、かつ１つまたは複数のファイバー入力面と１つまたは複数の波長との間の特定の機能的な割り当てを行う、請求項１８に記載の走査顕微鏡。

【請求項21】

照射光の分布が、試料平面および空間分解検出器の検出放射線経路のうちの少なくとも一方において少なくとも部分的に空間的に重複しない、請求項１９に記載の走査顕微鏡。

【請求項22】

顕微鏡の回折限界を超える解像度を有する高解像度画像を生成するために、前記検出器からのデータを使用して回折限界の単一画像を評価する評価装置をさらに備える、請求項１に記載の走査顕微鏡。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、試料を照射するための照射装置と、試料上に点スポットもしくは線スポットを走査させるための、および、点スポットもしくは線スポットを、撮像倍率のもとで検出平面内に回折限界の静止単一画像に撮像するための撮像装置と、撮像倍率を考慮して回折限界の単一画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさである空間分解能で、様々な走査位置について検出平面内の単一画像を捕捉するための検出装置と、検出装置のデータから走査位置の単一画像の回折構造を評価するための、および、回折限界を超えて高められた分解能を有する試料の画像を生成するための評価装置と、を備えた試料の高分解能走査顕微鏡検査のための顕微鏡に関する。また、本発明は、試料の高分解能走査顕微鏡検査のための方法に関し、この方法では、試料を照射し、試料上を走査するように導かれる点スポットもしくは線スポットを単一画像に撮像し、その際、スポットを撮像倍率のもとで、回折限界で単一画像に撮像し、単一画像が検出平面内に静止しており、様々な走査位置について、撮像倍率を考慮して回折限界の単一画像の半値幅の少なくとも２倍の大きさの空間分解能で単一画像を捕捉することにより、単一画像の回折構造を捕捉し、各走査位置について単一画像の回折構造を評価し、回折限界を超えて高められた分解能を有する試料の画像を生成する。

【背景技術】

【0002】

このような顕微鏡あるいは顕微鏡検査方法が、例えば、非特許文献１より、もしくは従来技術に関してさらなる例証を挙げている特許文献１より知られている。
この手法では、スポットを回折限界で検出平面上に撮像することによって、分解能の向上が達成される。回折限界の撮像は、点スポットをエアリー・ディスクとして撮像する。この回折ディスクは、その構造が分解可能となるように検出平面内で捕捉される。したがって、顕微鏡の撮像性能に関して、検出側でオーバーサンプリングが行われる。点スポットの撮像の際に、エアリー・ディスクの形状が分解される。前述の文献に記載の、これに関するその開示が本明細書に完全に含まれる、回折構造の適切な評価によって、回折限界の２倍の分解能向上が達成される。

【0003】

しかし、その際、検出側では必然的に、このようにして試料上でサンプリングされる各点について、従来のレーザ走査顕微鏡（以下では、ＬＳＭとも略される）と比べて、何倍もの量の画像情報を有する単一画像を撮影しなければならない。スポットの単一画像の構造を、例えば１６ピクセルで捕捉するとすれば、スポットごとに１６倍のデータ量を有するだけでなく、通常のピンホール検出の場合にはＬＳＭの検出器上に落ちるであろう放射強度の、平均して１６分の１しか個々のピクセルが受けない。当然ながら、放射強度は単一画像の構造、例えばエアリー・ディスクにわたって均一には分配されないので、実際にはそれどころか、この構造の縁部に落ちる放射強度はｎピクセルの場合の１／ｎの平均値よりも著しく小さくなる。

【0004】

したがって、検出側において高分解能で放射量を捕捉可能にするという課題に直面する。通常顕微鏡検査で使用される従来のＣＣＤアレイでは十分なＳＮ比を達成できないので、画像撮影時間の延長はそれ自体が既にこの用途において不利であるが、そうしたとしても助けにはならない。ＡＰＤアレイもまた暗騒音が大きいという問題があるので、測定時間を延長したとしても、不十分なＳＮ比しか得られない。ＣＭＯＳ検出器についても同様であるが、この場合はさらに、スポットの回折限界の単一画像が落ちるピクセルが少な過ぎるので、検出素子のサイズの点でも不利である。ＰＭＴアレイは同様の設置空間の問題を伴っている。同様にＰＭＴアレイではピクセルが大き過ぎる。特にこの設置空間の問題は、存在するＬＳＭ構造への統合が可能である場合のみ、装置の分配のような開発努力によって実現可能であることによる。しかし、ここでは単一画像の所定のサイズが与えられている。面積がより大きい検出器は、画像を再度有意義に、つまり数倍に拡大する光学系が追加的に設けられている場合のみ実現可能であろう。回折限界の構造をさらなる撮像誤差を含めずに得ようとすれば、このような光学系は構成するのが非常に高価である。

【0005】

従来技術では、上述の検出側の高分解能に関する問題を回避する他の方法が知られている。例えば特許文献２で取り上げられている方法では、構造化された照射を用いた非線状の処理が利用されている。構造化された照射は、試料上を複数の回転位置および空間位置において移動されて、試料がこれらの様々な状態で、上述の制限を受けない広視野検出器上に撮像される。

【0006】

上述の検出器の制限を伴わずに同様に高分解能（つまり、回折限界を超えた試料画像の分解能）を達成する方法が、特許文献３および特許文献４より知られている。このＰＡＬＭと略される方法では、光学的活性化信号を用いて活性化することができるマーカ物質が使用される。マーカ物質が活性化された状態でのみ、これを励起放射線で励起して特定の蛍光放射線を放出させることができる。活性化されていない分子は、励起放射線の照射後も蛍光放射線を発しない。つまり、活性化放射線は活性化物質を、蛍光体を発するように励起可能な状態に切り替える。そのため、これは一般に切り替え信号と呼ばれている。この信号が、活性化されるマーカ分子の少なくともある部分が同様に活性化された隣接するマーカ分子から、活性化されたマーカ分子が顕微鏡の光学的分解能の尺度で分離されている、もしくは後に分離可能であるように、離れるように印加される。これは、活性化された分子の隔離と呼ばれている。この隔離された分子について、その分解能の限界の放射線分布の中心を特定し、それにより、光学的撮像によって本来可能であるよりも高い精度で分子の位置を計算によって特定することは容易である。試料全体を撮像するために、ＰＡＬＭ法では、切り替え信号の強度が所与である場合にマーカ分子が切り替え信号によって活性される確率が、全てのマーカ分子について等しいという事実を利用している。つまり、切り替え信号の強度は、所望の隔離が行われるように印加される。この工程は、蛍光を発するように励起された部分集合内に、可能な限り全てのマーカ分子が一度は含まれるまで繰り返される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】欧州特許出願公開第２３１７３６２（Ａ１）号明細書

【特許文献2】欧州特許第１１５７２９７（Ｂ１）号明細書

【特許文献3】国際公開第２００６／１２７６９２号

【特許文献4】独国特許出願公開第１０２００６０２１３１７号明細書

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】シー・ミュラーおよびジェー・エンダーライン（Ｃ．Ｍｕｅｌｌｅｒ ｕｎｄ Ｊ．Ｅｎｄｅｒｌｅｉｎ），Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０４，１９８１０１（２０１０）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の枠内では、試料上でサンプリングされるスポットが検出平面内に静止して撮像される。その後、検出平面からの放射線は非撮像的に再分配されて検出器アレイに導かれる。その際、「非撮像的」という概念は、検出平面内に存在する単一画像に関するものである。当然ながら、それにもかかわらず、この単一画像の個々の面領域を撮像原理に従って撮像することができる。その限りでは、検出器アレイと再分配素子との間には、完全に撮像する光学系が位置していてもよい。しかし、検出平面内に存在する単一画像は、再分配の際にそのようなものとして得られない。

【0010】

「回折限界」という概念は、アッベの理論による回折限界に限定されるものではなく、実際の不十分さまたは制限によって理論上の最大値を２０％下回る場合も含まれる。その場合も、単一画像はここでは回折構造と呼ばれる構造を有している。この構造がオーバーサンプリングされる。

【0011】

この原理によって、単一画像にサイズが適合しない検出アレイを使用することが可能になる。検出器アレイの少なくとも１つの面積は、捕捉対象の単一画像より大きい、もしくは、小さいことが有利である。様々な幾何学的構成という概念には、検出器アレイの様々な面積だけでなく、検出平面内の単一画像の寸法の高さおよび幅に関して様々なアスペクト比を有する配置も含まれる。追加的に、検出器アレイのピクセルは、要求される分解能に対して大き過ぎてもよい。検出器アレイのピクセル配置の輪郭が、検出平面内で単一画像が有する輪郭と基本的に異なっていることも許容される。最後に、本発明によれば、検出器アレイは検出平面内の単一画像とサイズが異なっている。この方法における再分配あるいは顕微鏡における再分配素子によって、単一画像とそのサイズによってもたらされる寸法の制限およびピクセル・サイズの制限を考慮する必要なく、検出器アレイを選定することが可能になる。特に、検出器アレイとして、検出器行を使用することができる。

【0012】

ＬＳＭは通常、それぞれが異なるサンプリング空間、つまり異なる走査位置に割り当てられた多数の単一画像からのスポットを用いて試料をサンプリングすることによって画像を生成する。

【0013】

本発明による構想は、レーザ走査顕微鏡検査に関して知られているように、並列形式においても、複数のスポットについて同時に実施することができる。そうすれば、試料上の複数のスポットが走査によってサンプリングされ、複数のスポットの単一画像が検出平面上に隣接して静止する。次にこれらのスポットは、面積が相応のサイズである共通の再分配素子によって、あるいは複数の個々の再分配素子によって再分配され、相応のサイズの個々のまたは複数の個々の検出器アレイ上に導かれる。

【0014】

以下の説明は、例示的に単一の点スポットを用いたサンプリングを中心としている。ただし、これは制限として解釈すべきではなく、説明される特徴および原理は、複数の点スポットの並列なサンプリングならびに線スポットの使用についても類似的に有効である。後者はもちろん線の延在方向に交差する方向のみの回折限界であるので、本明細書のこれに関する特徴は一方向（線の延在方向に交差する方向）のみに有効である。

【0015】

本発明による手法によって、ＩＳＭ法を満足のいく速度かつ妥当な装置コストで実施することができる。本発明によって、高分解能顕微鏡原理に関して、これまでになかった幅広い応用分野が開拓される。

【0016】

再分配あるいは再分配素子を実現するための１つの可能性は、光ファイバー束を使用することである。これを好適には、多モード光ファイバーとして形成してもよい。この束は、その輪郭が検出平面内の回折限界の単一画像の面積に足りる、検出平面内に配置された入口を有している。これに対して、光ファイバーの出口は、上流に検出器アレイが配置された、入口の幾何学的配置とは異なる幾何学的配置で設けられている。その際、光ファイバーの出口側端部を、検出器アレイのピクセル上に直接導いてもよい。検出器行、例えばＡＰＤ行またはＰＭＴ行に楽に差し込めるように、束の出口がプラグ内に束ねられていれば特に有利である。

【0017】

本発明を理解する上で重要なことは、検出平面内の単一画像を分解するのに用いられる検出器アレイのピクセルと画像ピクセルとを区別することである。概して、各画像ピクセルは検出器アレイのピクセルに正確に割り当てられているが、これらの配置の点で両者は異なっている。中でも本発明の特徴は、検出平面において放射線が画像ピクセルに吸収され、この画像ピクセルがそのサイズおよび配置の点で単一画像のオーバーサンプリングを行うことである。このようにして、単一画像が回折限界で生成されることから回折構造となる、単一画像の構造が分解される。再分配素子は、画像ピクセルが設けられた入口側を有している。入口側は検出平面内に位置している。再分配素子は、各画像ピクセルの放射線を検出器アレイのピクセルへ導く。画像ピクセルから検出器アレイのピクセルへの割り当ては、画像構造を保持しないので、単一画像に関する再分配は非撮像的である。つまり、本発明はまた、汎用的な顕微鏡において、検出装置が、画像ピクセルによって放射線が吸収される、検出平面に位置する入口側を有する非撮像的な再分配素子を備えていることを特徴とする。再分配素子は、画像ピクセルにて吸収された放射線が検出器アレイのピクセルに導かれる出口側をさらに備えており、その際、単一画像に関して、放射線が入口側から出口側へ非撮像的に再分配される。同様に、本発明による方法は、汎用的な方法において、放射線が検出平面内で画像ピクセルによって吸収され、この放射線が単一画像に関して非撮像的に検出器アレイのピクセルに再分配されることを特徴とする。検出器アレイは、そのピクセルの配置およびサイズの点で、検出平面内の画像ピクセルの配置および／もしくはサイズと異なっている。さらに、再分配素子の検出平面内の画像ピクセルは、回折限界に関して単一画像の回折構造がオーバーサンプリングされるように設けられる。

【0018】

高感度の検出器アレイにおいて、放射強度の差が大きい場合に、隣接するピクセルがクロストークによる干渉を示すことが知られている。これを回避するために、好ましい発展構成では、光ファイバーが、出口に隣接する光ファイバーが入口にも隣接するように、入口から出口に導かれる。回折限界の単一画像は急激な放射強度の変化を示さないので、再分配素子のこのような構成によって、隣接して位置する検出器アレイのピクセルが受ける放射強度の差が可能な限り小さくなることが自動的に保証され、その結果、クロストークが最小化される。

【0019】

光ファイバーに基づく再分配の代わりに、再分配素子に様々に傾けられたミラー素子を有するミラーを備えてもよい。このようなミラーは、例えばファセット・ミラー、ＤＭＤ、または適応ミラーとして構成することができる。その際、最後の２つの変形例では、相応の設定もしくは制御によってミラー素子の傾きが確保される。ミラー素子は、検出平面からの放射線を、幾何学的構成がミラー素子の幾何学的構成とは異なる検出器アレイのピクセル上に導く。

【0020】

ミラー素子は、光ファイバー束の入口における光ファイバーのように、単一画像の回折構造の分解の点で画像ピクセルとなる。（もはや）検出器アレイのピクセル・サイズではなく、ミラー素子のサイズがオーバーサンプリングにとって決定的である。その限りでは、複数の単一検出器の配置は常に検出平面内の画像ピクセルとは異なっている（つまり、より大きい）ので、ここではこれらの単一検出器からなるグループもまた検出器アレイとして理解される。

【0021】

ＬＳＭでは、所望の分解能に応じて様々な対物レンズが使用される。対物レンズの交換によって、検出平面内の単一画像の面積が変化する。そのため、撮像方向において検出平面の上流に、単一画像のサイズを検出装置のサイズに適合させるズーム光学系を配置することが好ましい。このようなズーム光学系は、大幅に１００％に満たないパーセント範囲内で単一画像のサイズを変化させる。つまり、冒頭で不利であると説明した単一画像のサイズの増倍よりも、非常に容易に実行可能である。

【0022】

好ましくは、試料の照射は、通常のＬＳＭと同様に走査によって行われる。これは必須ではないが、そうすれば最大の分解能向上が得られる。試料を走査によって照射する場合は、照射装置と撮像装置とが共通の走査装置を有していることが目的に適っている。この走査装置は、試料上に照射スポットを導き、試料が撮像される、照射スポットと一致するスポットを、同時に検出器に関して再び走査するので、単一画像が検出平面に静止する。このような構成では、ズーム光学系を、照射装置および撮像装置の共通部分に置くことができる。そうすれば、ズーム光学系によって、単一画像を検出平面内の検出器のサイズに適合させることが可能になるだけでなく、追加的に、利用可能な照射放射線を、対物レンズの選択に伴い変化し得る対物レンズ瞳に、エッジ損失なく完全に結合させることができる。

【0023】

冒頭で既に言及したように、隣接して位置する検出器アレイのピクセル間の、放射強度に応じたクロストークを、光ファイバー束を用いた再分配の際に、束内の光ファイバーの適切な配置によって低減することができる。追加的または代替的に、較正を行うことも可能である。このために、各光ファイバーに次々に放射線を当て、隣接するピクセルにおける干渉信号を捕捉する。このようにして、後の試料の顕微鏡検査の際に隣接して位置するピクセルの放射強度に応じたクロストークを補正するのに用いられる、較正マトリクスが作成される。

【0024】

追加的に、単一画像の回折構造の分解によって、試料のサンプリング時にそれに沿ってスポットが移動される、スポットの移動方向が特定される。この移動方向は、基本的にスキャナの機構（例えば、走査ミラーもしくは可動試料テーブルの機構）から知られているが、ここでは、機械的原因による残留不確実性が生じる。この不確実性は、検出器アレイの個々のピクセルの信号を、相互相関関数を用いて評価することによって排除することができる。その際、試料内の隣接して位置する画像ピクセルに関して、スポットの回折限界の撮像をある程度重複させ、ただしその中心は隣接していることが役に立つ。このような画像ピクセルの信号を相互相関関数で評価すれば、スキャン機構の不可避の公差に起因して不可避的に残る残留不確実性を、低減あるいは完全に排除できる。

【0025】

向上した分解能の他に、個々の検出素子（検出平面内の画像ピクセルに割り当てられている）の測定列からの信号の空間的および時間的な相関関数を介して、スポットによって捕捉される検出体積内の蛍光体の時間的変化を捕捉することができる。例えば、蛍光相関分光法の場合のように、時間的な相関関数から拡散係数を決定することができ、また、画像ピクセル間の空間的相関関係を含めることによって、方向付けられた拡散および拡散障壁が視覚化される。さらに、蛍光分子の移動経過は、トラッキング用途にとっても重要である。というのも、トラッキング用途では照射スポットが蛍光分子の移動に追従するはずであるからである。ここで説明される配置によって、既にピクセル露光時間内に、移動方向を高精度で特定することが可能になる。そのため、発展構成として、試料内に点スポットもしくは線スポットが静止している際に回折限界の単一画像の時間的変化を特定および評価することによって、試料内の時間的変化を捕捉することが好ましい。

【0026】

また、本発明による手法によって、走査による照射において、例えば位相フィルタを用いて照射分布を変更することが可能になる。これにより非常に容易に、ゴングら（Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ．），Ｏｐｔ．Ｌｅｔ．，３４，３５０８（２００９）に記載されているような方法を実現することができる。

【0027】

本明細書において方法が説明される限り、顕微鏡の運用におけるこれらの工程が制御装置によって実行される。
なお、上述の特徴および以下にこれから説明される特徴は提示された組み合わせにおいてのみでなく、本発明の枠から逸脱することなく、他の組み合わせにおいて、もしくは単独でも使用可能である。

【0028】

以下では本発明を、同様に本発明に本質的な特徴を開示するものである添付図面を参照しながら、例示的により詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】高分解能顕微鏡検査のためのレーザ走査顕微鏡の概略図。

【図2】図１の顕微鏡の検出装置の拡大図。

【図3】検出平面内の検出装置１９の可能な実施形態の上面図。

【図4】検出平面内の検出装置１９の可能な実施形態の上面図。

【図5】検出器フィールドのサイズを適合させるためのズーム光学系による、図１の顕微鏡の発展構成の図。

【図6】ズーム光学系に関して、および多色撮像のための発展構成に関して、図５の顕微鏡の変形である図。

【図7】検出装置に該当する変形である、図１の顕微鏡の変形の図。

【図8】図７の検出装置１９の変形の図。

【図9】照射の２Ｄ強度分布による、瞳およびそれに属する断面における位相関数／振幅関数の例の図。

【図10】ａ） 照射の２Ｄ強度分布による、ランプが対向して配置された瞳およびそれに属する断面における半瞳位相ランプの例の図、ｂ） 焦点における２Ｄ強度分布の図、ｃ） 焦点から２００ｎｍ外側の２Ｄ強度分布の図。

【図11】ａ） 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、１つの経路および２つの経路のうちの少なくとも一方における補償されていない位相関数の図、ｂ） 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、位相マスクを通って両方向に伝播する光についての補償された位相関数の図、ｃ） 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、位相マスクを通って両方向に伝播する光についての補償された位相関数の図。

【図12】図１１ａ）による位相マスクの上面図。

【図13】超高速高感度空間分解検出装置と対物レンズ瞳内の振幅マスク／位相マスクとを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【図14】超高速高感度空間分解検出装置と対物レンズ瞳内の検出放射線経路に振幅マスク／位相マスクとを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【図15】超高速高感度空間分解検出装置と、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイール内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスクとを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【図16】超高速高感度空間分解検出装置と、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイールおよび調節可能な検出光学系内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスクとを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【図17】超高速高感度空間分解検出装置と、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイール内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスクと、スペクトル空間分解２チャンネル検出とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【図18】超高速高感度空間分解検出装置と、対物レンズ瞳内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスクと、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイール内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスクとを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【発明を実施するための形態】

【0030】

図１は、試料２の顕微鏡検査のために形成されたレーザ走査顕微鏡１の概略図である。レーザ走査顕微鏡（以下ＬＳＭと略する）１は、制御装置Ｃによって制御され、照射放射線経路３および撮像放射線経路４を含んでいる。照射放射線経路は、試料２内のスポットを照射し、撮像照射経路４は、検出のためにこのスポットを回折限界で撮像する。照射放射線経路３および撮像放射線経路４は多数の素子を共有している。しかしこのことは、試料２の走査によるスポット照射と同様に、それほど必須ではない。試料を広範囲照射してもよい。

【0031】

ＬＳＭ１では、試料２の照射が、それ以上には機能的に必要ではない偏向ミラー６およびレンズ７を介してミラー８上に結合されるレーザ光５を用いて行われる。ミラー８は、レーザ光５が、反射角度のもとで発光フィルタ９に落ちるようにする。図示を明確にするために、レーザ光５についてはその主軸のみが描かれている。

【0032】

発光フィルタ９での反射後、レーザ光５はスキャナ１０によって２軸に偏向されて、レンズ１１および１２によって対物レンズ１３を通って試料２のスポット１４に集束される。その際、スポットは図１の図示では点状であるが、線状のスポットも可能である。スポット１４において励起された蛍光放射線が対物レンズ１３、レンズ１１および１２を介して再びスキャナ１０に到達し、その後撮像方向において再び静止した光線が存在する。この光線は、スポット１４の蛍光放射線をその波長に関して選択する機能、特に、例えば励起放射線として使用可能なレーザ光５の照射放射線から蛍光放射線を分離する機能を有する発光フィルタ９および１５を通って落ちる。レンズ１６は、スポット１４が全体として、検出平面１８に位置する回折限界の画像１７に撮像されるようにする。検出平面１８は、試料２のスポット１４が位置する平面と共役な平面である。スポット１４の画像１７は、検出平面１８において、以下に図２から図４に基づいてより詳細に説明される検出装置１９によって撮影される。ここで重要なことは、検出装置１９が、検出平面１８内のスポット１４の回折限界の画像１７を空間的に分解することである。

【0033】

検出平面１８における検出断面上のスポットの強度分布（ガウス分布）が、その下に１８ａとして図１に示されている。
制御装置Ｃは、ＬＳＭ１の全ての構成要素、特にスキャナ１０および検出装置１９を制御する。制御装置は様々な走査位置について、各個々の画像１７のデータを記録し、その回折構造を分析して試料２の高分解能の全体画像を生成する。

【0034】

図１のＬＳＭは、例示的に、試料上でサンプリングされる唯一のスポットを示している。しかし、例えば図１の紙面に対して垂直に延在する、線スポットによるサンプリングも可能である。また、図１のＬＳＭを、試料内の隣接して位置する複数の点スポットがサンプリングされるように構成することも可能である。その場合、これらの点スポットに対応する単一画像１７が、検出平面１８内に同様に隣接することになる。その場合、検出装置１９は、隣接して位置する単一画像１７を検出平面１８内で捕捉するために相応に構成されている。

【0035】

図２では検出装置１９が拡大されて図示されている。この検出装置は、検出器アレイ２４に供給する光ファイバー束２０から構成されている。光ファイバー束２０は単一光ファイバー２１から形成されている。光ファイバー２１の両端は、検出平面１８内に位置する光ファイバー束入口２２を形成している。したがって、光ファイバー２１の個々の端部は、スポット１４の回折限界の画像１７を撮影するのに用いられるピクセルである。図１の実施形態ではスポット１４が例示的に点スポットであるので、画像１７は、図１および図２において検出平面１８によって示されている円の内部にその面積が位置するエアリー・ディスクである。つまり、光ファイバー束入口２２の面積は、エアリー・ディスクの面積が覆われる程の大きさである。光ファイバー束２０内の個々の光ファイバー２１の出口は、光ファイバー束入口２２とは異なる幾何学的配置で、つまり、光ファイバー２１の出口側の端部が内部に隣接して位置する、長さ方向に延在するプラグ２３の形で配置されている。プラグ２３は、検出器セル２４の幾何学的配置に適合するように構成されている。すなわち、光ファイバー２１の各出口側の端部が、検出器行のピクセル２５のちょうど前に位置している。

【0036】

再分配素子の幾何学的面積は非常に基本的である。すなわち、図４ではファイバー束によって行われているが、その実施方法に関わらず、再分配素子の幾何学的面積は、入口側で単一画像（あるいは、複数の点スポットの場合には隣接して位置する単一画像）の面積に適合している。再分配素子は、サンプリング原理の尺度で、単一画像１７の強度分布が回折限界に関してオーバーサンプリングされるように、検出平面１８から放射線を吸収する機能を有している。つまり再分配素子は、検出平面１８内に位置するピクセル（図３の構成では光ファイバーの入口端部によって形成されている）を有しており、このピクセルが、検出平面１８における撮像倍率を考慮して回折限界から得られる分解可能な最小構造の少なくとも２分の１倍の大きさである。

【0037】

もちろん、プラグ２３の使用は、ピクセル２５の前に光ファイバー２１の出口側の端部を配置するための多くの可能性のうちの１つに過ぎない。他の接続を用いることも同様に可能である。また、個々のピクセル２５を光ファイバー２１と直接融合させてもよい。検出器行２４を用いることさえ必須ではない。この代わりに、各ピクセル２５に対して個々の検出器を使用してもよい。

【0038】

図３および図４は、光ファイバー束入口２２の可能な実施形態を示している。光ファイバー２１を、光ファイバー束入口２２において互いに融合させてもよい。これにより、より高い充填率が得られる。すなわち、光ファイバー束入口２２における個々の光ファイバー２１間の空隙が最小化される。他方では、融合によって、隣接する光ファイバー間にある程度のクロストークがもたらされる。これを回避したければ、光ファイバーを接着すればよい。図４に示されているように、光ファイバー２１の端部を四角形に配置することも可能である。

【0039】

好ましくは、個々の光ファイバー２１は、光ファイバー束入口２２に隣接して位置する光ファイバー２１が、検出器アレイ２４においても隣接して位置するように、検出器アレイ２４の個々のピクセル２５に割り当てられる。この手法によって、例えば放射線によって、または個々のピクセル２５の信号処理において生じ得る、隣接するピクセル２５間のクロストークが最小化される。検出器アレイ２４が１つの行であれば、検出平面１８の上面視で単一光ファイバーを互いに接続する螺旋体によって、一連の単一光ファイバーを検出器行上に固定することにより、相応な配置が得られる。

【0040】

図３はさらに、光ファイバー束入口２２において光ファイバー２１の配置の隅部に位置するブラインド・ファイバー２６を示している。このブラインド・ファイバーは検出器アレイのピクセル２５上には導かれていない。ブラインド・ファイバーの位置には信号の評価に必要な信号強度が存在しない。これにより、光ファイバー２１の数および検出器行２４もしくは検出器アレイ内のピクセル２５の数を、例えば３２ピクセルで処理できるように、低減することができる。このような検出器行２４は、レーザ走査顕微鏡において他に既に使用されており、その利点は、このようなレーザ走査顕微鏡において信号評価電子機器を１度のみ保持すればよく、既に存在している検出器行２４と、検出装置１９によって追加される別の検出器行２４とを切り替えることができる。

【0041】

図４によれば、基本形状が四角形である光ファイバーが束に使用される。これらの光ファイバーは同様に検出平面において高い被覆率を有しており、つまり、効率的に放射線を集める。

【0042】

図５は図１のＬＳＭ１の発展構成を示しており、このＬＳＭでは検出平面１８の上流にズーム光学系２７が配置されている。図１の構成では検出平面１８が配置されていた共役な平面が、今では中間像平面２８を形成しており、この平面からズーム光学系２７が放射線を吸収して検出平面１８に導く。ズーム光学系２７によって、画像１７を最適に検出装置１９の入口の面積に適合させることができる。

【0043】

図６は図１のレーザ走査顕微鏡のさらなる変形を示している。まずここでは、ズーム光学系がズーム光学系２９として、照射放射線経路３および撮像放射線経路４によって通過される放射線経路の部分に位置するように配置されている。これにより、画像１７のサイズを検出装置１９の入口側に適合させることができるだけでなく、撮像放射線経路４に関して対物レンズ１３の瞳の充填およびレーザ光５の利用を適合させることができるという利点が得られる。

【0044】

追加的に図６では、放射線を２つの別々の色チャンネルに分離するビーム・スプリッタを発光フィルタ９の下流に配置することによって、ＬＳＭ１が２つのチャンネルを持つように形成されている。色チャンネルの対応する素子はそれぞれ、図１のＬＳＭ１で撮像方向において発光フィルタ９の下流に配置されていた素子にそれぞれ対応している。図６の図示では、２つの色チャンネルが、符号の末尾「ａ」あるいは「ｂ」によって区別されている。

【0045】

もちろん、２つの色チャンネルを有する実施方法は、ズーム光学系２９の使用とは無関係である。しかし、この組み合わせには、両方の色チャンネルにおいてそれぞれ独立して設けなければならず、それにより二重に利用可能となるズーム光学系２７が、１度しか必要にならないという利点がある。しかし、当然ながら、ズーム光学系２７を図１による構成においても使用して、ズーム光学系２９を用いずに図６のＬＳＭ１を実現してもよい。

【0046】

図７は、検出装置１９に関して図１のＬＳＭ１の変形を示している。
今では検出装置１９が、個々のファセット３１を支持するファセット・ミラー３０を備えている。ファセット３１は、画像１７の分解能の点で、光ファイバー束入口２２における光ファイバー２１の端部に対応している。個々のファセット３１は、その放射線入射の光軸に対する傾きの点で互いに異なっている。レンズ３２およびミニレンズ・アレイ３３、ならびにビーム重畳にのみ使用される偏向ミラー３４とともに、各ファセット３１は単一画像１７の面部分を検出器アレイ２４のピクセル２５上に撮像する。その際、ファセット３１の配向に応じて、検出器アレイ２４を好ましくは２Ｄアレイとしてもよいが、検出器行も可能である。

【0047】

図８は、図７の検出装置１９の発展構成を示しており、この構成では、放射線を特に良好に検出器行上に分配する屈折素子３５がレンズ３２の上流に配置されている。
既に言及したように、検出器アレイ２４は、その幾何学的形状に関して、さらなる制限なく選定することができる。その場合、当然ながら、検出装置１９内の再分配素子を対応する検出器アレイに適合させなければならない。画像１７を分解するのに用いられる個々のピクセルは、究極的にはそのサイズに関して、検出器アレイ２４によって規定されるのではなく、検出平面１８からの放射線の再分配を行う素子によって規定される。エアリー・ディスクの場合、回折限界の撮像ではディスクの直径が、公式によれば１．２２λ／ＮＡであり、ここで、λは撮像される放射線の平均の波長、ＮＡは対物レンズ１３の開口数である。その場合、半値幅は０．１５λ／ＮＡである。高分解能を達成するには、検出の際の空間分解能をこの半値幅の２倍の大きさにする、すなわち半値幅を２度サンプリングすることで足りる。したがって、ファセット素子３１あるいは光ファイバー束入口２２における光ファイバー２１の端部は、回折限界の単一画像の半値幅の、最大で半分の大きさであってもよい。もちろんこれは、光学系が対物レンズ１３に応じて作用する撮像倍率の考慮した場合に有効である。つまり、もっとも単純な場合には、半値幅当たり検出平面１８内の４×４アレイのピクセルで十分過ぎる程であろう。

【0048】

図５および図６に基づいて説明したズーム光学系によって、スポット１４の回折限界の画像１７の回折分布が検出装置１９の入口面を最適に満たすような適合が可能になる他、さらに別の運用形式、つまり、検出平面１８内に２つ以上のエアリー・ディスクが撮像される運用形式もまた可能になる。検出装置１９上に２つ以上のエアリー・ディスクが撮像される測定では、試料２のさらなる深さ平面からの光を、検出装置１９の外側のピクセルにおいて検出する。その際、画像を処理する過程で、ＬＳＭ１の深さ分解能に影響を与えることなく、追加的な信号強度が得られる。したがって、ズーム光学系２７あるいは２９によって、画像のＳＮ比と深さ分解能との間の妥協点を設定することが可能になる。

【0049】

文献
［１］ ハインツマン アール（Ｈｅｉｎｔｚｍａｎｎ Ｒ．）；クレマー シー（Ｃｒｅｍｅｒ Ｃ．）：Ｌａｔｅｒａｌｌｙ Ｍｏｄｕｌａｔｅｄ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ ｇｒａｔｉｎｇ；Ｉｎ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＳＰＩＥ，Ｖｏｌ．３５６８（１９９８）
［２］シャオ エル（Ｓｈａｏ Ｌ．）；クナー ピー（Ｋｎｅｒ Ｐ．）；ヘスパー イー（Ｈｅｓｐｅｒ Ｅ．）；グスタフソン・マッツ ジー エル（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ Ｍａｔｓ Ｇ．Ｌ．）：Ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ３Ｄ−ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｌｉｖｅ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ；Ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．８（２０１１）
［３］バーテロら（Ｂｅｒｔｅｒｏ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎ Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ ３，１９５（１９８８）
［４］シェパードら（Ｓｈｅｐｐａｒｄ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎ Ｏｐｔｉｋ ８０，Ｎｏ．２，５３（１９８２）
［５］グロホマリキら（Ｇｒｏｃｈｍａｌｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎ Ｊ．Ｏｐｔ．Ｓｏｃ．Ａｍ．Ａ １０，１０７４（１９９３）
［６］シー ビー ミュラーら（Ｃ．Ｂ．Ｍｕｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｉｎ Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．１０４，１９８１０１（２０１０）
［７］ヨーク エー ジー（Ｙｏｒｋ Ａ．Ｇ．）；パレク エス エイチ（Ｐａｒｅｋｈ Ｓ．Ｈ．）；ノガレ ディー ディー（Ｎｏｇａｒｅ Ｄ．Ｄ．）；フィッシャー アール エス（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｒ．Ｓ．）；テンプリン ケー（Ｔｅｍｐｒｉｎｅ Ｋ．）；ミオネ エム（Ｍｉｏｎｅ Ｍ．）；シトニス エー ビー（Ｃｈｉｔｎｉｓ Ａ．Ｂ．）；コームズ シー エー（Ｃｏｍｂｓ Ｃ．Ａ．）；シュロフ エイチ（Ｓｈｒｏｆｆ Ｈ．）：Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｉｎ ｌｉｖｅ，ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｖｉａ ｍｕｌｔｉｆｏｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；Ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．９（２０１２）
［８］パヴァーニ エス アール ピー（Ｐａｖａｎｉ Ｓ．Ｒ．Ｐ．）およびピーストゥン アール（Ｐｉｅｓｔｕｎ Ｒ．）：Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｏｔａｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ；Ｉｎ Ｏｐｔｉｃｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ １６（２００８），ｐ．３４８４
ＤＥ１０２００６０２６２０４Ａ１，ＤＥ１０２００８０５９３２８Ａ１
レーザ走査顕微鏡（ＬＳＭ）では、検出器の上流のいわゆるピンホールを回折限界（≦エアリー／４）よりも著しく小さいサイズに縮小することによって、分解能の向上が達成される。その場合、この顕微鏡は共焦点レーザ走査顕微鏡と呼ばれる。「エアリー」は、回折限界の照射スポットの第１の零点によって定義され、光学の文献では定着した概念である。

【0050】

汎用的な蛍光ＬＳＭの場合、高い分解能を得るための現行の方法には決定的な欠点がある。それは、試料に由来する検出される光子の数が少ないことに起因してＳＮ比が非常に悪いことであり、このため、実際には分解能の改善を全く達成することができなくなる。

【0051】

汎用的な蛍光ＬＳＭの別の欠点は、広視野顕微鏡検査方法と比較しても低い画像撮影速度である。
しかし、今では、同時により良好なＳＮ比でレーザ走査顕微鏡の分解能を高めることも可能である。このためには、より多数の光子を検出可能であるより大きいピンホール直径（約１エアリー）と、サブ・エアリー空間分解検出とを用いて作業しなければならない。画像撮影後には、特別なアルゴリズムを用いてデータの再分類および相殺が行われる。その結果、試料画像において分解能が高められる。このコリン・シェパード（Ｃｏｌｉｎ Ｓｈｅｐｐａｒｄ）の方法は、文献では「変位したサブ・エアリー検出値の蓄積（Ａｋｋｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｃｈｏｂｅｎｅｒ Ｓｕｂ−Ａｉｒｙ−Ｄｅｔｅｋｔｏｒｗｅｒｔｅ）」とも呼ばれている［３〜７］。

【0052】

上述の方法は、蛍光性の試料に対して機能するだけでなく、コヒーレントに相互作用する材料試料を画像化するためにも使用することができる。ここで、この方法には、検出光子量に関してはほとんど利点がない。むしろ、本質的に全体の伝達関数が２倍の帯域幅を有する瞳関数によって与えられることに利点がある。つまり、より高い物体周波数が、より低い物体周波数と同等に重視される。

【0053】

コヒーレントに相互作用する材料試料へのこの方法の適用性に関して、振幅および位相をも、サブ・エアリー空間分解を用いて高いサンプリング率で測定しなければならないという前提がある。

【0054】

以下では、特に蛍光顕微鏡検査について考察する。
図１〜図８には、ファイバー束およびＰＭＴアレイに基づいた、高速高感度低ノイズ多素子検出装置が記載されており、ＬＳＭについて同時に良好なＳＮ比で分解能を改善することが可能である。

【0055】

画像撮影速度、およびＬＳＭにおける用途への照射光分布の適合可能性を改善し、それによりこれらを従来のＬＳＭに対する利点として確立することを、本発明の課題とみなすことができる。
９．解決法
サブ・エアリー空間分解検出装置を備えたＬＳＭと同様に、原理上の制限により、軸外検出素子について照射点像関数（照射（強度）ＰＳＦ）と検出点像関数（検出（強度）ＰＳＦ）との間に相対的なずれが生じる。

【0056】

軸外検出素子（束の外側のファイバー）は、試料平面において照射点像関数に対して若干ずれた点像関数を有している。
全ての検出光５３をＰＭＴアレイ６１上に再分配する、ファイバー束アレイ６４から構成されたサブ・エアリー空間分解検出装置６０の技術的に好ましい１実施形態が、特に有利であることが証明されている。

【0057】

従来の場合、照射および検出についての点対称な点像関数が用いられる。それにより、例えば試料の回転もしくは走査方向の回転を可能にする、他の必要とされる光学的構成要素を含む技術コストが回避される。点像関数は数学的により容易に記述することができるので、相殺もより容易になる。

【0058】

従来技術に対する改良として、および、これにより本質的な違いとして、ここに記載される本発明による解決法では、照射ＰＳＦおよび検出ＰＳＦのうちの少なくとも一方の形状が能動的かつ適切に構造化される。これにより、多数の使途が可能になり、さらには点像関数を特定の用途および特定の試料特性に適合させることも可能になる。

【0059】

本発明による実施形態には、ある用途に最適な技術的パラメータ間の妥協点の選定が要求される境界条件が課せられている。例えば、検出素子の数が限られているため、光学的分解能と、照射光を用いた試料のサンプリング速度との間の妥協点を見出すことが必要であると証明されている。

【0060】

したがって、本発明による方法の核心は、照射点像関数および検出点像関数のうちの少なくとも一方の有利な構成にある。
本発明は、独立請求項の特徴によって特徴付けられる。

【0061】

好ましい発展構成は、従属請求項の対象である。
ａ）横方向に速度が最適化された照射ＰＳＦ
照射ＰＳＦ形状を、瞳あるいは瞳付近において、もしくは対物レンズ瞳と光学的に共役な平面において、空間的位相変調によって変化させることにより（図９〜図１５）、ＰＳＦの周波数成分によって、相殺後にも引き続き検出平面６３内の約１エアリーのピンホール直径で少なくとも典型的な共焦点分解が達成可能になる。同時に、ＰＳＦは可能な限り広い面積を覆わなければならない。このようにして、本発明によれば、比較的広い試料領域からの試料光の平行化された検出によって、大幅により高い画像撮影速度を達成することができる。したがって、疑似の超高速ミニ・カメラである超高速高感度検出装置６０の長所が有効に利用される。

【0062】

本発明によれば、走査の際の速度の利点が、「より粗い」ピクセルの調節（走査ステップ）によって得られる。これはつまり、撮影速度の絶対的な向上が、低速の走査軸の平行化によってのみもたらされることを意味する。しかし、高速の走査軸を平行化すれば、平行化によって照射時間を短縮できるので、撮影速度を相対的な向上が可能になる。しかしこのことは、最大速度にまだ達していない場合にのみ有効である。最大速度に達すれば、同じピクセル数でＳＮ比を高める、もしくは逆に同じＳＮ比でピクセル数を高速軸において減少させる、のいずれかが可能である。

【0063】

本発明による位相板の簡単な好ましい実施形態は、πステップ位相マスク（図９ａ）によって与えられる。この位相マスクは、板の中心にπ位相跳躍を有しており、２つの互いに近接して位置する、ほぼフーリエ限界の照射スポットを生成する。つまり、このようなマスクを用いれば、サンプリング速度を２倍に速めることができる。高ＮＡ対物レンズを使用する場合、偏極ベクトルを位相跳躍エッジに対して平行に向けなければならない。そうでなければ、中心に位置する最小値が零に達しない。

【0064】

本発明による位相板の別の好ましい実施形態は、ｎ・２πスパイラル位相マスクによって与えられる（図９ｂおよび図９ｃ）。このような位相マスクは、ドーナツ型の形状で試料平面内に照射光分布を生じさせる。ドーナツ照射リングは、従来のＬＳＭの通常の照射ＰＳＦと同様に急な側面を有しているが、その広がりによってフーリエ限界の照射スポットの４倍の大きさの面積を覆う。ドーナツ型の外径および内径を変化させることによって、平行化の程度、およびこれによって速度増加分を調節することができる。ドーナツ照射リングによって生成される検出光は、検出装置６０上に撮像される。

【0065】

スパイラル位相マスクと組み合わせた高ＮＡ対物レンズには、ドーナツ型を生成するための円偏光が必要である。
３つ以上のスポット（≧３）を生成するために、照射放射線経路に適切な位相板を組み込むことも考えられる。

【0066】

ｂ）軸方向に速度が最適化されたＰＳＦ
本発明によれば、位相マスクを介して検出ＰＳＦ形状を構成することにより、検出ＰＳＦの周波数成分によって、相殺後にも引き続き少なくとも典型的な共焦点分解が達成可能となり、同時に、ｚ情報を異なる平面にわたって横方向に符号化および最大化することにより、所与の横方向の分解能について可能な限り多くのＺ平面が画像に寄与するようになる（図１０）。検出ＰＳＦはｚ位置に応じた横方向の楕円形になるので、これは例えば、円柱レンズを用いることによって達成される。

【0067】

検出放射線経路内の適切な位相マスクによって生じさせることが可能なＰＳＦの傾斜、または螺旋状のＰＳＦ形状（ピストゥン、メルナー（Ｐｉｓｔｕｎ，Ｍｏｅｒｎｅｒ）［８］、ゾラーおよびバデリー（Ｓｏｅｌｌｅｒ＆Ｂａｄｄｅｌｅｙ））（図１３）によっても、この方法を実施することができる。

【0068】

ｚ方向に可能な限り点像関数全体の急なエッジを生じさせるために照射ＰＳＦ形状を追加的に変調すれば、結果として異なるｚ平面への測定信号の割り当ての負担が軽減される。

【0069】

ｃ）改善されたｚ分解能／コントラストがより良好なｚ分解能
さらに、本発明によれば、位相マスクを介して検出ＰＳＦ形状を変更することにより、ＰＳＦの周波数成分によって、相殺後にも引き続き少なくとも典型的な共焦点分解が維持可能となり、ただし、ｚ情報が異なる平面にわたって横方向に符号化および最大化されることにより、所与の横方向の分解能について、可能な限り少ないＺ平面が画像に寄与し、ｚ方向のｚＰＳＦの導出が可能な限り量的に大きくなる。これに関する解決法の例は、螺旋形状である［８］。

【0070】

上述の効果を、検出光分布に対して可能な限り分離した照射光分布を生じさせることによって強めることができる。つまり、これに関して、２つの異なるマスクが、一方は照射放射線経路において、他方は検出放射線経路において使用される。

【0071】

ｄ）（ほぼ共焦点分解を用いた）空間分解検出装置上の二色の照射色画像化
位相マスクを構成することによって、照射波長に応じて位相関数が異なることにより、照射光学系の焦点において、同時に異なる波長で適用された照射光分布が、試料平面において、および最後には空間分解検出器（ファイバー束）上においても、その空間的な重複が可能な限り少なくなる。その際、本発明によれば、位相関数を生成する光学素子用の最適化可能な適合装置が、色素粒子に応じて適切に調節可能な照射波長の組み合わせのために形成されていることが有利である。

【0072】

その際、位相マスクを使用した照射点像関数および検出点像関数の帯域幅は、回折限界の照射点像関数および検出点像関数と本質的には異ならないので、典型的な共焦点分解を達成することができる。

【0073】

画像データの空間的およびスペクトル的分離のための、画像データの記録に続く相殺は、色分解アルゴリズムを使用して行うことができる。
ｅ）空間分解検出装置（ファイバー束／アレイ検出器）上での多色画像化
ファイバー束内のファイバーと蛍光色スペクトルの波長との間の特定の割り当てを可能にする、色的に作用する光学位相素子を検出放射線経路に挿入することも考えられる（スペクトル検出器の概念）。その際、位相マスクを使用した検出点像関数の帯域幅はやはり回折限界の検出点像関数と本質的には異ならないので、典型的な共焦点分解を達成することができる。

【0074】

照射光分布および検出光分布のうちの少なくとも一方の生成の他に、本発明にとって本質的な１態様は、用途に適合した光分布の構成における柔軟性である。光分布の形状の他に、実用においては中でも照射および検出の波長が変化する。

【0075】

上述の両方の特徴（形状および波長）の点での高度の柔軟性は、空間光変調器によってもたらされる。これに関して、ピクセル化された液晶およびマイクロ・ミラーに基づいた変調器が挙げられる。

【0076】

柔軟性に関する単純な要件は、位相マスクを用いた平行化された運用モードから通常の共焦点モードに切り替え可能でなければならないことである。スライドもしくはレボルバーのような単純な機械的解決手段が、この場合の実施形態である。

【0077】

以下では本発明のさらなる特徴および利点を、添付の概略図を参照して説明する。
本発明は基本的に、対物レンズ瞳平面もしくはその付近に配置された、その横方向の断面に沿った位相において波面に様々な影響を与える素子に基づいており、これにより、物体平面（試料）には変化させることが可能な空間的構造が生じる。このような素子は、大抵の場合、「位相板」もしくは「位相マスク」と呼ばれ、伝達格子の場合のようにエッチングされた凹部を備えた石英ガラスのコーティングおよびエッチングのうちの少なくとも一方によって、または伝達素子の異なる厚さによる位相ずれによって、位相の様々な影響を生じさせることができる（例えば、段付きのガラス板）。この種の位相マスクは、振幅マスクと組み合わせることができる。

【0078】

個々の図面は次の通りである。
図９ 照射の２Ｄ強度分布による、瞳およびそれに属する断面における位相関数／振幅関数の例の図。

【0079】

図１０ａ） 照射の２Ｄ強度分布による、ランプが対向して配置された瞳およびそれに属する断面における半瞳位相ランプの例の図。
図１０ｂ） 焦点における２Ｄ強度分布の図。

【0080】

図１０ｃ） 焦点から２００ｎｍ外側の２Ｄ強度分布の図。
図１１ａ） 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、１つの経路および２つの経路のうちの少なくとも一方における補償されていない位相関数の図。

【0081】

図１１ｂ） 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、位相マスクを通って両方向に伝播する光についての補償された位相関数の図。
図１１ｃ） 照射および検出に対して異なる作用を有する位相マスクの図であって、位相マスクを通って両方向に伝播する光についての補償された位相関数の図。

【0082】

図１２ 図１１ａ）による位相マスクの上面図。
図１３ 超高速高感度空間分解検出装置６０と対物レンズ瞳内の振幅マスク／位相マスク４８．１とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【0083】

図１４ 超高速高感度空間分解検出装置６０と対物レンズ瞳内の検出放射線経路に振幅マスク／位相マスク５６．１とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。
図１５ 超高速高感度空間分解検出装置６０と、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイール４９内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスク４９．１とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【0084】

図１６ 超高速高感度空間分解検出装置６０と、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイール４９および調節可能な検出光学系５０内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスク４９．１とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【0085】

図１７ 超高速高感度空間分解検出装置６０と、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイール４９内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスク４９．１と、スペクトル空間分解２チャンネル検出とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【0086】

図１８ 超高速高感度空間分解検出装置６０と、対物レンズ瞳内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスク４８．１と、フィルタ／ビーム・スプリッタ・ホイール４９内の１つまたは複数の振幅マスク／位相マスク４９．１とを備えたレーザ走査顕微鏡の図。

【0087】

図９は、対物レンズの焦点での照射の２Ｄ強度分布による、瞳およびそれに属する断面における位相関数／振幅関数の例を示している。
左側には様々な位相マスクが、右側には照射時に対物レンズ瞳においてマスクを使用した際の光軸に対する横方向の位置に応じた物体平面内に生じる強度分布が図示されている。

【0088】

図９ａ）の左側には、右側および左側の間に生成されるパイの位相跳躍を有する位相マスクが図示されている（半瞳位相マスク）。
右側には、位相マスクを使用しない場合のエアリー輪郭を有する中央に位置するスポットＳの代わりに、空間的に分離した互いに近接して位置する２つのスポットＳ１およびＳ２が図示されている。

【0089】

図９ｂ）には、最大で２パイの位相遅れを有する、円形の方位角に位相変化が増加するスパイラル位相マスクと、右側には、それによって生じる強度分布が図示されている。図９ｃ）は、４パイまでの位相跳躍を有するスパイラル位相マスクの図である。

【0090】

これにより、右側に図示されたスポットは、図９ｂ）の図示よりもさらに互いから離れている。
図９ｄ）には、図９ａ）と同様に、例えば振幅マスクＡおよび位相マスクＰの組み合わせによる、追加の伝達変化のある半空間マスクの重畳が図示されている。

【0091】

これは、相応なコーティングおよびマスクによっても実現することができる。
図示の照射光分布が、前述の検出装置６０（検出カメラとして機能する）を使用した画像撮影において平行化を可能にすることが明らかである。というのも、マスクを使用すれば複数の照射スポットが生じるが、これらが互いに非常に近接して位置するので、厚い試料の場合にクロストークの問題が起こり得る。上述の平行化によって、画像撮影速度が高められる。なお、試料内への侵入深さの増加に伴って生じ得る収差が発生した場合、照射の変調が変化する。場合によっては、ここでは専門家らしく適合光学系によって撮像誤差を補正することができる。

【0092】

図１０ａ）は、半瞳位相ランプＨＰＲを使用した焦点での照射の強度プロファイルを示している。
それぞれの半瞳における両方の位相ランプは、上から下へ互いに逆向きに位相変化が推移している。

【0093】

各半瞳における位相ランプは、ここでは典型的には１分間であるくさび角度を有するガラスくさびに対応している。
ここでも、２つの互いに近接して位置する照射スポットが生じている。しかし、焦点の外側の照射の対称性が、図１０ｂ）および図１０ｃ）の撮影と比較すれば、変化している（図１０ｃ）では焦点から２００ｎｍ外側）。このことは、少ない断面画像で３Ｄ構造を撮影することが重要である場合に有利である。これが可能であるのは、異なるｚ平面からの光が空間的にやや違ったふうにカメラ（図１〜図８によるファイバー束の入口面）上で分布されるからである。

【0094】

この軸方向に構造化された照射を用いてデータがより高速かつより良好に分解され、相殺され、展開され得る前に、既知の方法で、ただし状況によってはより少ない画像を用いて、ＬＳＭによって画像のｚスタックが撮影される。

【0095】

３Ｄ試料体積（ｚスタック）の撮影の際の画像撮影速度を向上するために適した別の照射光分布が、パヴァーニら（Ｐａｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．）［８］による回転する二重ＰＳＦによって与えられる。

【0096】

図１１より、位相マスク／振幅マスクの位置に応じて、マスクが照射もしくは検出または照射および検出の両方に作用することが分かる。検出光が通過しない照射放射線経路内の位置にマスクが位置していれば、図１１ａ）のようにマスクが構成される。跳躍エッジＳもしくは跳躍点の上方および下方において断面の厚さｄ１およびｄ２が異なる光透過性の板４８．１が例示的に図示されている。

【0097】

図１２には、図１１ａ）のＡ方向から見たπステップ位相マスクが概略的に図示されている。この位相マスクにより、照射光ＢＬが瞳において図９ａ）と同様の位相跳躍を受けている。

【0098】

照射および検出の共通の放射線経路に同一の板が位置していれば、位相マスク／振幅マスクによって検出にも影響が与えられるであろう。
これはしかし、検出される画像を歪めないためには望ましくない。

【0099】

検出に対する作用の除外する図１１ｂ）および図１１ｃ）によるマスクは、検出光が逆の位相構造を、およびこれによってほぼ全体として平行平面板を通過することを支援することができる。

【0100】

図１１ｂ）のガラス・プレートは、光軸にほぼ直交するように向けられたある平面内に光軸に対して鏡面対称に位置する２つの位置について、伝達の光学的位相が同一となるように構造化されている。

【0101】

図１１ｂ）の構造化されたガラス・プレートは、主カラー・スプリッタとして機能し、追加的に二色性の層４９．２を備えており、照射（励起）光ＢＬと試料光ＤＥとの分離を行う。照射光ＢＬは二色性の層４９．２に当たって反射し、試料の方向に到達する（図１〜図８参照）。試料の検出光ＤＥは、ストーク・シフトを有しているので、対応するように形成された二色性の層に当たって検出方向に伝達される。

【0102】

照射光に対して４９．１によって形成される位相分布は、４９．１の通過の際に試料光ＤＥに対して同様に、ただし半分の大きさで形成し、試料光ＤＥが構造化されたガラス板から逆の表面構造を通って出射する際に再び持ち上げられることにより、位相差が形成されずにＤＥが検出方向に到達する。

【0103】

図９ｂ）〜図９ｄ）および図１０による位相マスクを使用する際も、検出光ＤＥ上の空間的に変化する位相分布を回避するために図９ｂ）あるいは図９ｃ）と同一の機構を使用することができる。

【0104】

図１３には、図１〜図８に基づいた、および照射放射線経路４５のみに振幅マスク／位相マスク４８．１を使用した超高速高感度空間分解検出装置６０を使用したレーザ走査顕微鏡の技術的に好ましい実施形態が示されている。照射光によって試料内に生成される試料光５３は、対物レンズによって集光され、検出素子６２を備えた本来の検出装置６１であるファイバー束６４から構成された検出装置６０に向かって、振幅マスク／位相マスク４８．１を通過せずに伝播する。照射および検出の統一あるいは分離は、カラー・スプリッタ・ホイール４９上のカラー・スプリッタ４９．１にて行われる。

【0105】

照射パターンの構造、例えば２つもしくは３つの照射スポットが、ファイバー束６４上にも再び現れている。つまり、例えば、ほぼ２つもしくは３つの検出スポットがここでは生じているが、これらのスポットは照射の試料との相互作用によって、および検出点像関数を用いた畳み込みによって、拡張あるいは変更されている。

【0106】

ファイバー束内のファイバー数が固定されている場合、状況によっては分解能が低下するものの、走査速度が例えば２倍に速まる。
図１３に示された技術的に好ましい実施形態とは異なり、図１４では、振幅マスク／位相マスク５６．１が検出放射線経路のみに位置している。本発明によれば、３Ｄスタックの撮影速度の向上もしくは軸方向の分解／コントラストの改善のために、この実施形態を用いることができる。その際、マスク５６．１は、光ファイバー入口面６４の分布上の平行な検出スポットを生成することによって、図１０による構造を有していてもよい。

【0107】

図１５は、本発明による技術的に好ましいＬＳＭの実施形態を示しており、この実施形態では、振幅マスク／位相マスク４９．１が、照射光４５と検出光５３との共通の放射線経路に位置している。これに関して、フィルタ・ホイール４９上の振幅マスク／位相マスク４９．１は、色分割の機能も担わなければならない。つまり、振幅マスク／位相マスク４９．１は、照射光用の二色性の層構造をも有している。図１１ｂ）および図１１ｃ）に従って、この層構造の基本形状は、その作用が照射光４５のみに限られるように構成されている（検出方向における位相差の取り消し）。

【0108】

基本的に、フィルタ・ホイール４９は、選択的に位相マスクもしくは簡素な二色性のビーム・スプリッタを放射線経路内に挿入するために役立つ。
同様に、照射放射線経路および検出放射線経路のうちの少なくとも一方内に挿入される位相マスクは、矢印で概略的に図示されているように、放射線経路から押出可能に形成されていてもよく、それにより、調節可能な照射モードおよび検出モードのうちの少なくとも一方に関する最大の柔軟性が確保される。

【0109】

図１６は、調節可能な焦点光学系２０が検出装置６０の上流に位置しているという点で図１５と異なっている。この焦点光学系は、適切なサンプリングのために、検出装置６０に対して検出光分布５３のサイズを適合させる役割を担っている。サイズの適合は、検出光５３の波長領域および使用される瞳適合のための対物レンズのうちの少なくとも一方と、およびマスク４９．１または図１３によるマスクによって照射放射線経路のみに生成される照射光分布４５（例えば、２つのスポットもしくは４つのスポット）とのうちの少なくとも一方に応じて、必要となることがある。

【0110】

図１７には、検出光５３を検出するための少なくとも２つの検出装置６０および６０．１を備えた技術的に好ましい実施形態が示されており、検出光５３はカラー・スプリッタ５５を用いた分離の後にスペクトルが異なっている。少なくとも２つの検出装置６０および６０．１によって検出される検出光５３の波長領域が重複することもあり得る。

【0111】

位相マスクを、例えば４９に配置することができる。
図１８に提示されている実施形態では、振幅マスク／位相マスク４８．１が、瞳あるいは瞳付近において対物レンズの直近に位置している。しかし、サンプリング方向が走査光学系の瞳（焦点）内をちょうど通っていなければ、光分布あるいは４８．１の振幅マスク領域／位相マスク領域に関して全く非対称性が生じ得ないことが、本実施形態の小さいサンプリング角度についての利点である。しかし、サンプリング角度を変更した際に、振幅マスク／位相マスク４８．１の作用が変化しないことを確認しなければならない。この配置の欠点は、検出光５３が同様にマスク４８．１を通過することによって変更されてしまう点である。これを防ぐには、特に４８．１が位相マスクである場合は、検出光５３にのみ作用する位相マスク４９．１として、逆の位相マスク構造をカラー・スプリッタ・ホイール４９に挿入すればよい。

【0112】

これは例えば、検出方向においてビーム・スプリッタの二色性の層に対して向けられた面に、（図１１に図示されたように）伝達される検出光のみに作用し、４８．１の作用を取り消す逆向きの位相マスクを形成またはコーティングすることによって行うことができる。

【0113】

代替的に、４９．１の検出光５３に対して向けられた平らな面に二色性の層構造を配置し、照射光４４がマスク４９．１の影響を受けないようにすることによってもこれを実現することができる（図１１ｂ）、図１１ｃ）参照）。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】