特許 6968467 豚流行性下痢ウイルス感染症の予防または治療のための医薬品の調製におけるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6968467

(24)【登録日】2021年10月29日

(45)【発行日】2021年11月17日

(54)【発明の名称】豚流行性下痢ウイルス感染症の予防または治療のための医薬品の調製におけるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/747 20150101AFI20211108BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20211108BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211108BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/747

   C12N1/20 E

   A61P31/14

   A61P43/00 171

【請求項の数】2

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2020-546913(P2020-546913)

(86)(22)【出願日】2018年7月4日

(65)【公表番号】特表2021-509118(P2021-509118A)

(43)【公表日】2021年3月18日

(86)【国際出願番号】CN2018094559

(87)【国際公開番号】WO2019242046

(87)【国際公開日】20191226

【審査請求日】2020年9月7日

(31)【優先権主張番号】201810628781.7

(32)【優先日】2018年6月19日

(33)【優先権主張国】CN

【微生物の受託番号】CCTC  CCTCC M 2017286

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】516071929

【氏名又は名称】華中農業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】金 梅林

(72)【発明者】

【氏名】楊 麗

(72)【発明者】

【氏名】滑 亜鋒

(72)【発明者】

【氏名】康 超

【審査官】 横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０７３１２７２６（ＣＮ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第２０１０−００５８８２３（ＫＲ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１７／２００１９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 韓国公開特許第２０１１−００００８５４（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Probiotics and Antimicro Prot., 2017, Vol.10, p.383-390

【文献】 Viruses, 2018 Mar, Vol.10, Article 106(p.1-14)

【文献】 Vaccine, 2018 Mar, Vol.36, p.2760-2763

【文献】 Virus Res., 2018 Mar, Vol.249, p.45-51

【文献】 Microbial Pthogenesis, 2018 Feb, Vol.117, p.247-254

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３１／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

豚流行性下痢ウイルスの細胞への侵入増殖を阻害するための豚流行性下痢ウイルス阻害剤の調製における、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１７２８６で寄託される、ラクトバチルスプランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＺＮ−３の使用であって、
前記ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３は、ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の発酵ブロスまたは発酵上清であり、
前記発酵上清のｐＨは７．０である、
使用。

【請求項2】

前記豚流行性下痢ウイルス阻害剤は、豚流行性下痢ウイルス感染症を予防または治療するための医薬品である、請求項１に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、家畜および家禽用の抗ウイルス微小生態製剤技術分野に属し、特に、豚流行性下痢ウイルス感染症の予防または治療するための医薬品の調製におけるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

腸疾患は、現代の養豚業に普遍的に存在している問題であり、細菌性下痢、ウイルス性下痢、栄養性下痢、寄生虫による下痢を含む下痢性疾患が子豚に起きやすく、その内、ウイルス性下痢の発生率が高く、急速に感染が広がり、死亡率が高く、治療効果も明らかでないため、特に、２０１０年から現在まで継続して発生している豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の予防に着眼した。流行性下痢は、下痢、嘔吐、脱水症などの臨床症状を主徴とする急性伝染病である。一部の大規模養豚場での死亡率は、８０％以上に達し、新生豚の腸炎と死亡を起こす重要な原因であり、養豚業に深刻な経済的損失を与えてきた。

【0003】

病気にとって、一般的に予防効果は、治療効果よりも優れ、特にウイルス性疾患であるＰＥＤＶも例外ではない。ＰＥＤＶには、厳密な細胞走性と宿主特異性がある。しかし、ウイルスの遺伝的変異により、有効なワクチンの保護が影響を受け；抗ウイルス薬にも通常重篤な副作用があり、その用量と効果が限られている。したがって、ウイルス性疾患を制御できる有効な方法を引き続き模索する必要があり、プロバイオティクスは、有害性がなく、非薬剤耐性、残留性もなく、抗菌、抗ウイルス性、成長促進、環境にやさしいという利点により、広く注目されている。

【0004】

プロバイオティクス乳酸菌は、ヒトおよび動物の胃腸障害を予防および治療するために広く使用されている。乳酸菌は、体の胃腸管のｐＨ環境に耐えることができ、腸上皮細胞にコロニーを作ることができる嫌気性菌または通性嫌気性菌である。乳酸菌はまた、乳酸を産生し、腸内のｐＨを下げ、サルモネラ菌や大腸菌などの有害な細菌の侵入を阻害する。Ｇｉａｎｇら（２０１０）は、離乳子豚の食事にエンテロコッカス・フェカリス菌、ラクトバチルスアシドフィルス菌、ペディオコッカスペントサセウス、ラクトバチルスプランタラムの複合微小生態製剤を添加したものと、未添加のブランク対照群と比較したところ子豚下痢の発生率が減少した。乳酸菌ワクチンの経口投与による効果は、いくつかの研究結果から実証されており、既存のデータで乳酸菌が抗菌活性を持っただけでなく、抗ウイルス活性も持っていることを示した。粘膜は、多くの細菌やウイルスが体内に侵入して感染する最も主要な経路であるため、粘膜免疫が感染を防ぐ上で重要な役割を果たしている。粘膜経路を介した経口ワクチンは、体の潜在的な体液性免疫および粘膜免疫を効果的に誘導することができ、疾患に対処する効果的な戦略である。研究報告（Ｖａｎ Ｎｉｅｌら２００２；張ら２００８）によると、ラクトバチルスアシドフィルスは、ロタウイルスワクチンの経口アジュバントとして使用することで、ワクチンの免疫力を高めることもできる。ＫｒｉｔａｓおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ（２００７）も経口乳酸菌がＰＲＲＳＶウイルス感染に対するワクチンの防御効率を向上させ、ＰＲＲＳＶ感染豚の体重を毎日増加させる可能性があることも報告した。Ｗａｎｇ ＸＮら（２０１７）は、抗ＰＥＤＶの経口ワクチン担体としてラクトバチルスカゼイを使用した結果、ラクトバチルスカゼイが体の粘膜免疫、体液性免疫、Ｔｈ２タイプの細胞性免疫を効果的に誘導し、体に対するＰＥＤＶ感染および発症を防止できることを示した。また、経口ワクチンとしてのプロバイオティクスは、便利で安全かつ免疫ストレスがなく、経済的利益が高いという利点がある。これらのデータは、均しくプロバイオティクスが腸管粘膜免疫を促進し、腸管疾患を予防および治療する製剤として使用できることを証明している。しかし、プロバイオティクスの直接的な抗ウイルス活性に関する研究はまだ始まったばかりであり、特に非遺伝子組換え野生株の抗ウイルス活性に関する報告がほぼなく、現在ＰＥＤＶに対するラクトバチルスプランタラムの抗ウイルス活性に関する研究はない。本発明は、研究を通じて豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対する抗ウイルス活性を有するプロバイオティクスを得ることを目的とする。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、豚流行性下痢ウイルス感染症の予防または治療するための医薬品の調製におけるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用を提案することであり、ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３が消化管から腸に入り、エンテロウイルスＰＥＤＶの侵入増殖を阻害し、流行性下痢ウイルスによって起こる疾患を効果的に予防および治療できる。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明では、上記目的を達成するために、次の技術的手段を講じた。
豚流行性下痢ウイルス感染症の予防または治療するための医薬品の調製におけるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用は、ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３を利用して流行下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）の阻害剤として調製、あるいは流行下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）感染の治療薬または予防薬として調製することを含み、
上記ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３は、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１７２８６で寄託された。

【0007】

上記の使用において、ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３は、ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の発酵ブロスまたは発酵上清が挙げられる。

【発明の効果】

【0008】

本発明では、プロバイオティクスラクトバチルスプランタラムＺＮ−３を使用して豚流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）からの細胞感染を阻害し、ラクトバチルスプランタラムを潜在的な抗ウイルス微小生態製剤として、従来の抗ウイルス化学療法剤と比較すると次の利点を有する。

【0009】

１、有害な副作用がなく、残留性もなく、抗菌、抗ウイルスで、成長促進や環境に優しい。

【0010】

２、使用上において便利、安全、免疫ストレスがなく、経済的利益が高いという利点を有する。

【0011】

３、消化管から腸に入り、エンテロウイルスＰＥＤＶの細胞の侵入増殖を阻害し、流行性下痢ウイルスによって起こる疾患を効果的に予防および治療する。本発明において、ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の菌体懸濁液の３つの処理方法は、いずれもウイルスに対する直接的な阻害作用があり、阻害率がそれぞれ２８．３０％、２０．７５％および２２．６４％であり；ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３発酵上清については、先に発酵上清を添加してからＰＥＤＶ希釈液を添加することと、発酵ブロスとＰＥＤＶ希釈液を同時に添加する２つの方法も、ウイルスに対する直接的な阻害作用があり、阻害率がそれぞれ３２．０８％、１３．２１％であった。

【0012】

４、本発明におけるラクトバチルスプランタラムの菌体またはｐＨ７．０の発酵上清は、細胞に有害な副作用がなく、ｖｅｒｏ細胞に対するＰＥＤＶウイルスの感染活性を若干程度低下させ、ＰＥＤＶウイルスの細胞侵入と感染を阻害し、豚流行性下痢を予防および治療することができた。

【0013】

５、プロバイオティクスの応用は、すでに１０年以上あり、臨床上で消化管疾患への治療効果がある程度実証され、免疫機能の保護と増強作用および抗ウイルス作用も益々注目されているが、その作用機序はまだ明らかではない。本発明は、細胞レベルから流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に対するプロバイオティックラクトバチルスプランタラムの阻害作用を描写する。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＶＥＲＯ細胞におけるＰＥＤＶウイルスの増殖および病変の概略図（左図：ＰＥＤＶに感染していない細胞対照；右図：ＰＥＤＶ感染によって形成された病変）である。

【図2】ＰＥＤＶウイルス増幅液のＰＣＲ検出の概略図（レーン１：陽性対照；レーン２、３、４：異なるパンクレアチン濃度（０、５、１０μｇ／ｍｌ）によるＰＥＤＶウイルス増殖サンプル；レーン５：陰性対照；レーン６、７、８：レーン２、３、４サンプルの重複；レーン９：マーカー）である。

【図3】９６ウェルプレートのＴＣＩＤ５０測定におけるＰＥＤＶの病変細胞と対照細胞の概略図（左図：対照細胞；右図：病変細胞）である。

【図4】ＰＥＤＶウイルスに対するラクトバチルスプランタラムの阻害作用の概略図（左上図：正常対照細胞；右上図：先にＺＮ−３を添加してからＰＥＤＶ希釈液を添加した群；左下図：先にＰＥＤＶ希釈液を添加してからＺＮ−３を添加した群；右下図：ウイルス対照群）である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

特に明示的に述べられていない限り、本発明の実施例における試験方法および条件は、常法である。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の保護範囲はこれらの実施例によって限定されない。本発明の技術的手段は、特に明示的に述べられていない限り、当該分野における従来の解決的手段であり、特に明示的に述べられていない限り、試薬または材料はすべて、商業的に入手可能なものとする。

【0016】

（実施例１）
（豚流行性下痢ウイルス感染症の予防または治療するための医薬品の調製におけるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用）
（１）細胞培養
ＶＥＲＯ細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで約４８時間継代培養し、
細胞の継代：継代時０．２５％のパンクレアチンで消化し、１０分ほど消化できる。具体的ステップは、次の通りである。
スポイトまたはピペットで接着細胞の培養容器から古い培養液を取り除き、残った古い培地をＰＢＳ溶液で洗い流し；
１〜２ｍｌの消化液（０．２５％パンクレアチン）をフラスコに加え、培養フラスコを静かに振って、消化液をすべての細胞表面に流し；
倒立顕微鏡で観察し、細胞から突起を取り除かれて丸みを帯びている場合、または細胞の隙間が広がっている場合は、消化を直ちに終了する（消化液を吸引して捨て、血清を含む少量の新鮮な培養液を加えて消化を終了させる）；
ピペットでフラスコ内の培養液を吸い取り、消化された細胞を繰り返しピペッティングして細胞壁を破壊させ、それらを分散させて細胞懸濁液を形成し；
カウントし、新しい培養フラスコに分注し、血清を含む一定量の新鮮な培地を追加で添加し；
フラスコにキャップをし、ＣＯ２ガスが入りやすいように適切に締めてから少し戻し、培養フラスコをＣＯ２培養器に戻す。

【0017】

（２）ＰＥＤＶウイルス増殖
消化されたＶｅｒｏ細胞をＴ７５細胞培養フラスコに接種し、３７℃、５％ＣＯ２恒温培養器に入れて細胞の単層を形成するまで培養し；
−８０℃で保存されたＰＥＤＶウイルス液（ＣＶ７７７）０．１ｍｌをＶｅｒｏ細胞の単層を形成した培養フラスコに接種し、３７℃、％ＣＯ２恒温培養器で１時間インキュベートし；
ウイルスインキュベーション液をピペットで少量吸引し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ細胞メンテナンス液１０ｍｌを加えると共に、最終濃度が０、５、１０ｕｇ／ｍｌとなる異なる量のパンクレアチンを添加し、３７℃、５％ＣＯ２恒温培養器で４８〜７２時間培養し；
細胞の状態を毎日観察し、細胞の８０％以上に病変がある場合は、ウイルス細胞増殖液を採取し；
ウイルス細胞増殖液を３回繰り返し凍結融解し、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液を収集して−８０℃で保存し、後日使用する。

【0018】

ウイルス増殖産物のＲＴ−ＰＣＲ検出：収集されたウイルス液は、ＰＥＤＶのＭ遺伝子フラグメントを増幅して、ウイルス増殖産物を検証する。ＰＥＤＶウイルスはＲＮＡウイルスに属し、逆転写ＰＣＲの実施を必要とする。

【0019】

逆転写システム（２０ｕｌ）は、次のとおりである。
システム体積（ｕｌ）
５×ＡＭＶ ｂｕｆｆｅｒ ５
ＡＭＶ酵素 １
ｄＮＴＰ ２
ランダムプライマー １．５
ＲＮａｓｅ阻害剤 ０．５
ＲＮＡテンプレート １０
逆転写反応手順：４２℃６０分、９４℃５分、４℃１０分。

【0020】

遺伝子増幅反応システム（２５ｕｌ）は、次のとおりである。
システム体積
Ｐ１ １
Ｐ２ １
１０×Ｂｕｆｆｅｒ ５
ｄＮＴＰ １
Ｔａｑ酵素 ０．５
ｄｄＨ_２０ １１．５
逆転写テンプレート ５
反応手順：９４℃３分；９４℃４５秒、５３℃４５秒、７２℃１分３０秒を３０サイクル；７２℃１０分；１６℃１０分。

【0021】

ＰＤＥＶウイルス力価の測定：ＴＣＩＤ５０を使用して、増殖したＰＥＤＶウイルス液中のウイルスタイター（ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌ）を測定する。具体的なステップは、次のとおりである。
消化されたＶｅｒｏ細胞を９６ウェルプレートに接種し、３７℃，５％ＣＯ２恒温培養器に入れて細胞の単層を形成するまで培養し；
２ｍｌの滅菌遠心チューブ内でＤＭＥＭを使用してＰＥＤＶウイルス液を１０^−６まで連続的に１０倍希釈し；
希釈したウイルス溶液をＶｅｒｏ細胞の単層が形成された９６ウェルプレートに接種し、各希釈段階を縦列に合計８穴に接種し、各穴に１００ｕｌのウイルスを接種し、７番目と８番目の縦列はコントロールとしてウイルスを含まないＤＭＥＭ培地を接種し、３７℃で、５％のＣＯ２恒温培養器で１時間インキュベートし；
ウイルスインキュベーション液とＤＭＥＭ培養基をピペットで少量吸引し、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ細胞メンテナンス液１００ｕｌを加え、３７℃、５％ＣＯ２恒温培養器で１２０時間培養し；
細胞変性効果（ＣＰＥ）の状況を毎日観察して記録し、Ｒｅｅｄ−Ｍｕｅｒｃｈ法に従ってＰＥＤＶウイルス液のＴＣＩＤ５０を計算した。

【0022】

【表1-1】

【表1-2】

【0023】

ＴＣＩＤ５０の測定結果から、パンクレアチンの濃度はＶＥＲＯ細胞でのＰＥＤＶの増殖に一定の影響を及ぼし、パンクレアチン濃度５ｕｇ／ｍｌ条件下で、ウイルスタイターの最高値が１０^{−４．４３}／０．１ｍｌであることが分かる。

【0024】

（３）プロバイオティクス（ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１７２８６）の菌液およびその代謝産物の調製
平板で賦活したラクトバチルスプランタラムＺＮ−３を１５０ｍｌのＭＲＳ液体培地に接種し、３７℃で２４時間培養し、２４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を取り、上清液のｐＨ値を検出し、後で使用するために４℃で保存した。遠心分離後の菌体ペレットを滅菌ＰＢＳに再懸濁し、細菌懸濁液の濃度を１０^９ＣＦＵ／ｍｌに調整し、後で使用するために４℃で保存した。

【0025】

（４）プロバイオティクスおよび代謝産物の細胞毒性試験
９６ウェルプレートに細胞懸濁液を接種し、細胞の単層が形成するまで培養し；
ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の菌懸濁液および代謝産物を取り、菌懸濁液を１０倍勾配で希釈し、１０^７ＣＦＵ／ｍｌ、１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^９ＣＦＵ／ｍｌの３つの勾配を選択し、代謝産物は発酵上清原液から取り、滅菌ＮａＯＨで発酵上清液をｐＨ７．０に調整し；
異なる処理の縦列を作成し、各穴に１００ｕｌの異なる処理液を加え、３７℃で５％のＣＯ_２培養器で９０分間インキュベートし；
インキュベーション後、２つの処理方法に分け、
１つは、インキュベーション液を廃棄した後、細胞メンテナンス液を直接加えて培養を続ける方法であり；
もう１つは、インキュベーション液を廃棄してＰＢＳで１回洗浄した後、細胞メンテナンス液を加えて培養を続けると共に、ブランク細胞対照とウイルス対象を設ける方法であり；
細胞変性の状態を毎日観察し、ウイルス対照群細胞のＣＰＥが８０％以上に達したら、ＭＴＴ法で細胞活性を測定する。
細胞毒性＝（対照群ＯＤ_４９０−処理群ＯＤ_４９０）／対照群ＯＤ_４９０×１００％

【0026】

プロバイオティクスＺＮ−３またはその代謝産物のＶＥＲＯ細胞に対する毒性効果をＭＴＴ法で間接的に測定した結果、１０^７ＣＦＵ／ｍｌ、１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^９ＣＦＵ／ｍｌの３つの勾配の菌懸濁液はＶＥＲＯ細胞に対し毒性効果がなく、９０分間インキュベートした後、インキュベーション液を廃棄してＰＢＳで洗浄せずに直接メンテナンス液を加えると、ある程度（１２％〜１４％）の細胞成長を促進でき、９０分間インキュベートした後、インキュベーション液を廃棄すると共にＰＢＳで洗浄した後、１０^７ＣＦＵ／ｍｌ、１０^８ＣＦＵ／ｍｌ、１０^９ＣＦＵ／ｍｌの３つの勾配にもある程度の成長促進効果（２％−４％）があり；発酵上清について、ｐＨを調整していない処理群は、洗浄の有無に関わらず、細胞の活性が極端に低下（９３％程度低下）し、ｐＨを７．０に調整した発酵上清の場合、未洗浄群の活性は影響を受けず、洗浄群の活性が４．３７％増加したことを示している。これに基づいて、後続の試験において、１０^８ＣＦＵ／ｍｌとｐＨが７．０に調整された発酵上清をそれぞれ選択してプロバイオティクスおよびその代謝産物のウイルス阻害作用を測定した。

【0027】

【表2】

【0028】

（５）ＰＥＤＶウイルスに対するプロバイオティクスの阻害率をＭＴＴ法で間接的に検出：試験は８グループに分けられる。
グループ１〜２は、プロバイオティクスまたはその代謝産物で前処理してからウイルスに接種：プロバイオティクスまたは代謝産物を先に細胞に接種して９０分間共培養し、洗浄した後、細胞に１００ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌ ＰＥＤＶを感染させ、培養器に入れて９０分間吸着させ、洗浄後、細胞メンテナンス液を添加して培養を続けた。

【0029】

グループ３〜４は、プロバイオティクスまたはその代謝産物を細胞に同時に接種：プロバイオティクスまたはその代謝産物を等量の１００ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌ ＰＥＤＶと混合し、単層を形成した９６ウェル培養プレートに加えて９０分間共培養し、混合液を廃棄してＰＢＳで洗浄し、細胞メンテナンス液を加えて培養を続けた。

【0030】

グループ５〜６は、それぞれ先にウイルス感染細胞を加えてから、プロバイオティクスまたはその代謝産物に接種：細胞に１００ＴＣＩＣ５０／０．１ｍｌ ＰＥＤＶを感染させ、培養器中で９０分間吸着した後で洗浄してから、プロバイオティクスまたはその代謝産物を加え、恒温培養器に入れて９０分培養した後ＰＢＳで洗浄し、細胞メンテナンス液を加えて培養を続けた。

【0031】

グループ７はウイルス対照である：ＶＥＲＯ細胞に１００ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌ ＰＥＤＶを感染させ、恒温培養器に入れて９０分吸着した後ＰＢＳで洗浄し、細胞メンテナンス液を加えて培養を続けた。

【0032】

グループ８は、正常細胞対照であった。

【0033】

ウイルス阻害率＝（プロバイオティクス処理群ＯＤ_４９０−ウイルス対照群ＯＤ_４９０）／（細胞対照群ＯＤ_４９０−ウイルス対照群ＯＤ_４９０）×１００％

【0034】

（細胞レベルでのＰＥＤＶウイルスに対するプロバイオティクスおよびその代謝産物阻害作用の結果。）
ＰＥＤＶウイルスに対するプロバイオティクスおよびその代謝産物の阻害作用を異なる処理方法でそれぞれ測定し、実験結果から、ＺＮ−３菌懸濁液の場合、３つの処理方法すべてがウイルスに対して阻害作用があることを示し、阻害率はそれぞれ２８．３０％、２０．７５％、２２．６４％であったことがわかる。発酵上清の場合、先に発酵上清を加えてからＰＥＤＶ希釈液を添加すること、発酵ブロスとＰＥＤＶ希釈液を同時に添加するという２つの方法はウイルスに対して阻害作用があり、阻害率がそれぞれ３２．０８％と１３．２１％であり；先にＰＥＤＶ希釈液を添加してから発酵上清を添加したものは、阻害作用がなかった。

【0035】

【表3】

【0036】

（付記）
（付記１）
豚流行性下痢ウイルス感染症の予防または治療するための医薬品の調製における、受託番号ＣＣＴＣＣ Ｍ ２０１７２８６で寄託されるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用。

【0037】

（付記２）
豚流行性下痢ウイルス阻害剤の調製におけるラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の使用。

【0038】

（付記３）
前記ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３は、ラクトバチルスプランタラムＺＮ−３の発酵ブロスまたは発酵上清である、付記１に記載の使用。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】