特許 6970122 ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するためのアッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6970122

(24)【登録日】2021年11月1日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するためのアッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20211111BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/68

【請求項の数】18

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2018-560854(P2018-560854)

(86)(22)【出願日】2017年5月18日

(65)【公表番号】特表2019-521328(P2019-521328A)

(43)【公表日】2019年7月25日

(86)【国際出願番号】US2017033371

(87)【国際公開番号】WO2017201312

(87)【国際公開日】20171123

【審査請求日】2020年5月14日

(31)【優先権主張番号】62/338,605

(32)【優先日】2016年5月19日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(73)【特許権者】

【識別番号】508176441

【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・カンザス

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】マー， アンナ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン， イー

(72)【発明者】

【氏名】カオ， ティー

(72)【発明者】

【氏名】ジェンナーロ， リン エー．

(72)【発明者】

【氏名】ショーニッヒ， クリスティアン

【審査官】 草川 貴史

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２５４５８１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０１０５１０２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１７５５１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 MOREHEAD H W、外１名，Optimization of oxidation of glycoproteins: An assay for predicting coupling to hydrazide chromatographic supports，JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A，1991年12月20日，Vol.587, No.2，Page.171-176， doi:10.1016/0021-9673(91)85153-7

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法であって、
ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、
ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液中の、ポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度、及びポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度を判定するステップと、
ｄ）前記ポリペプチド・色素錯体において結合された前記ポリペプチドの濃度に対する前記ポリペプチド・色素錯体において結合された前記ヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、前記ポリペプチドの前記総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含み、
前記ヒドラジド色素が、ＬＹ−ＣＨであり、ステップａ）が、リチウムイオン、ナトリウムイオン、及びカリウムイオンからなる群から選択されるアルカリ金属イオンの存在下で実施される、方法。

【請求項2】

前記アルカリ金属イオンが、リチウムイオンである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ポリペプチドの前記アミノ酸残基が、アルギニン、リジン、プロリン、及びトレオニンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ポリペプチドが、抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、抗体断片、抗体薬物複合体、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物複合体である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ポリペプチド及び前記ヒドラジド色素を、ステップａ）において６，０００〜１０，０００の最終モル比で接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ステップａ）が、非イオン性界面活性剤の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記非イオン性界面活性剤が、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

ステップａ）が、３５℃〜３９℃の温度で実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ステップａ）が、１０〜２０時間にわたって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

ステップｂ）が、濾過、ゲル濾過、及び透析からなる群から選択される方法によって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

ステップｂ）が、濾過によって実施される、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

濾過が、１００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下、かつ２００〜３００ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ヒドラジド色素及び緩衝液を含む、請求項１に記載の方法を実行するためのキット。

【請求項15】

前記ヒドラジド色素が、ＬＹ−ＣＨである、請求項１４に記載のキット。

【請求項16】

前記緩衝液が、リチウムＭＥＳ緩衝液である、請求項１４に記載のキット。

【請求項17】

前記キットが、非イオン性界面活性剤、前記ポリペプチドの標準、及び前記ヒドラジド色素の標準を更に含む、請求項１４に記載のキット。

【請求項18】

前記非イオン性界面活性剤が、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である、請求項１７に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本出願は、２０１６年５月１９日に出願された米国仮出願第６２／３３８，６０５号に対する優先権の利益を主張するものであり、その全ての内容は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本記載は、ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

金属触媒酸化産物は、製造または貯蔵プロセス中のモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｍＡｂｓ）と金属または金属イオンとの接触に起因する、非常に関連性がある品質属性のモノクローナル抗体である。精製または貯蔵中、ステンレス鋼が、一般的な表面接触材料である。細胞培養培地中に存在するか、またはステンレス鋼から浸出した鉄イオンは、ｍＡｂのＦｃ領域内でメチオニン及びヒスチジン酸化を引き起こし得る。メチオニン及びヒスチジン酸化以外に、タンパク質中のアルデヒド／ケトン基の形成を指すタンパク質カルボニル化は、金属触媒酸化反応からの主要な分解経路であり、ｍＡｂに関しては広く研究されていない。酸化的カルボニル化の結果として、リジン及びアルギニン側鎖上の正電荷、ならびにプロリン残基からの立体障害が失われる。そのような変化は、増加したタンパク質凝集性向につながり得、したがってｍＡｂ産物の品質及び安定性プロファイルに影響を及ぼす可能性がある。加えて、金属触媒酸化によって誘導されたｍＡｂ凝集は、他のストレス条件によって誘導されたものよりもトランスジェニックマウスにおいて免疫原性があり得る。したがって、製造及び貯蔵中の金属触媒酸化からのｍＡｂのカルボニル化の程度を特定することが非常に重要である。

【0004】

総タンパク質カルボニル化レベルの定量的測定のために、異なるヒドラジドが、タンパク質上のカルボニル基と反応するための誘導体化試薬として採用されてきた（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。定量化は、通常、ヒドラジド及び誘導体化後の対応するヒドラゾンの固有の特性に基づいていた。例えば、広く使用される分光光度的カルボニル化アッセイは、誘導試料の吸光度を３７５ｎｍで測定し、誘導体化試薬、２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）、及び結果として生じるヒドラゾンは、強力に吸収する（Ｌｅｖｉｎｅ，ｅｔ ａｌ．，１９９０）。蛍光定量的カルボニル化アッセイは、フルオレセインチオセミカルバジドによる誘導体化後の誘導試料の、４８５ｎｍでの励起及び５３５ｎｍでの放射による蛍光を測定する（Ｍｏｈａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＥＬＩＳＡカルボニル化アッセイは、ＤＮＰＨによる試料の誘導体化後の定量化に抗ＤＮＰＨ抗体を使用する（Ｂｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。異なるヒドラジド試薬が、誘導体化及び定量化の目的のために用いられてきたが、タンパク質カルボニル化アッセイにおける一般的な手順は、カルボニル化レベルの過剰な定量化を防止するための、誘導体化ステップ後の未結合ヒドラジドの除去である（Ｒｏｇｏｗｓｋａ−Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。典型的に、未結合のヒドラジドは、タンパク質沈殿及び洗浄を通して除去されるが、これは労働集約的プロセスであり、実験的可変性の主な原因を構成する。実際に、分光光度的カルボニル化アッセイをＤＮＰＨと共に使用するときに、２つの追加の洗浄ステップが、カルボニル化結果を１５％低減したことが実証された（Ｍａｔｔｈｉｊｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，２００７）。洗浄ステップと関連付けられる大きなアッセイ可変性及び労働集約的性質は、これらのカルボニル化アッセイを広く適用して、製品開発中にｍＡｂカルボニル化を測定することを困難にし得る。修正されたＥＬＩＳＡ（Ｕｅｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びＤＮＰＨ（Ｍｅｓｑｕｉｔａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）アッセイが、簡略化された方法論を使用して、近年報告されている。しかしながら、これらの修正された方法は、依然として相対的に労働集約的であり、それらの頑強性は未だ評価されていない。ルシファーイエローカルボヒドラジド（ＬＹ−ＣＨ）は、以前に、抗体のＮ−グリカンオリゴ糖残基上の過ヨウ素酸酸化によって形成されたアルデヒド基を定量化するために、誘導体化試薬として使用されていた（Ｍｏｒｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。酸化抗体炭水化物残基の定量的標識をＬＹ−ＣＨによって調べるためのアッセイが説明された（Ｋｅｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。このアッセイにおいて、誘導体化反応におけるＬＹ−ＣＨ対ポリペプチドモル比は、従来の緩衝液系の使用に起因して制限され、未結合のＬＹ−ＣＨのより困難な除去をもたらす。更に、このアッセイは、カルボニル化含有量の過大評価につながる、カルボニル含有量を定量化するためのヒドラジド試薬のそれぞれの吸光度に対するタンパク質寄与を訂正しない。

【0005】

ＵＳ２００６／０２１６７５６Ａ１は、酸化タンパク質の性質の２次元評価のための方法を開示し、この方法は、皮膚から採取された角質層標本中の酸化タンパク質のカルボニル基を特異的に蛍光標識するステップを含む。ＵＳ２００７／０１１０６７０Ａ１は、毛髪損傷を評価するために、酸化タンパク質のカルボニル基を蛍光色素で標識することを含む方法を開示する。ＷＯ２０１２１７５５１９Ａ１は、少なくとも１つのタンパク質含有試料中のタンパク質カルボニル基を検出及び／または定量化するための方法であって、タンパク質カルボニル基をヒドラジドで標識するステップに続いて、１次元または２次元ゲル電気泳動を使用する試料の分析を含む、方法を説明する。

【0006】

本記載において、上記の先行技術の問題を克服する、ルシファーイエローカルボヒドラジド（ＣＡＬＹ）を使用する、簡略化された、より頑強かつより正確なタンパク質カルボニル化アッセイが説明される。

【発明の概要】

【0007】

本記載は、ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法及びキットに関する。

【0008】

一態様において、本記載は、ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法に関し、この方法は、ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液中の、ポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度、及びポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度を判定するステップと、ｄ）ポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度に対するポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、ポリペプチドの総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含む。

【0009】

一実施形態において、ヒドラジド色素は、ＬＹ−ＣＨである。一実施形態において、ステップａ）は、アルカリ金属イオンの存在下で実施される。一実施形態において、ポリペプチドのアミノ酸残基は、アルギニン、リジン、プロリン、及びトレオニンからなる群から選択される。一実施形態において、ポリペプチドは、抗体である。一実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、抗体断片、抗体薬物複合体、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物複合体である。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素を、ステップａ）において６，０００〜１０，０００の最終モル比で接触させる。一実施形態において、ステップａ）は、非イオン性界面活性剤の存在下で実施される。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。一実施形態において、ステップａ）は、３５℃〜３９℃の温度で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１０〜２０時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップｂ）は、濾過、ゲル濾過、及び透析からなる群から選択される方法によって実施される。一実施形態において、ステップｂ）は、濾過によって実施される。一実施形態において、濾過は、１００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下、かつ２００〜３００ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。

【0010】

別の態様において、本記載は、本明細書に記載される方法を実行するためのキットに関し、このキットは、ヒドラジド色素及び緩衝液を含む。一実施形態において、ヒドラジド色素は、ＬＹ−ＣＨである。一実施形態において、緩衝液は、リチウムＭＥＳ緩衝液である。一実施形態において、キットは、非イオン性界面活性剤、ポリペプチドの標準、及びヒドラジド色素の標準を更に含む。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】金属触媒酸化からの主要なカルボニル化産物を示す。

【図2A】ＬＹ−ＣＨとカルボニル基との間の誘導体化反応を示す。

【図2B】ＣＡＬＹのワークフローを示す。

【図3】図３Ａは、ＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ試料（ピーク積分の開始及び終了を示す矢印）及び緩衝液ブランク（より低いプロファイル）の２８０ｎｍでの吸光度による、サイズ排除クロマトグラムを示す。図３Ｂは、ＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ試料（ピーク積分の開始及び終了を示す矢印）及び緩衝液ブランク（より低いプロファイル）の４２８ｎｍでの吸光度による、サイズ排除クロマトグラムを示す。

【図4-1】図４Ａは、２８０ｎｍにおけるポリペプチド及びＬＹ−ＣＨの標準曲線を示す。標準曲線の線形回帰フィット後、ｍ１＝４８１３．９、ｂ１＝−１２５．９８、ｍ３＝３５．５０７、ｂ３＝１．４３２８。図４Ｂは、４２８ｎｍにおけるポリペプチド及びＬＹ−ＣＨの標準曲線を示す。標準曲線の線形回帰フィット後、ｍ２＝１０．０８５、ｂ２＝３．２４５８、ｍ４＝１８．７３５、ｂ４＝１．３９３７。

【図4-2】図４Ａは、２８０ｎｍにおけるポリペプチド及びＬＹ−ＣＨの標準曲線を示す。標準曲線の線形回帰フィット後、ｍ１＝４８１３．９、ｂ１＝−１２５．９８、ｍ３＝３５．５０７、ｂ３＝１．４３２８。図４Ｂは、４２８ｎｍにおけるポリペプチド及びＬＹ−ＣＨの標準曲線を示す。標準曲線の線形回帰フィット後、ｍ２＝１０．０８５、ｂ２＝３．２４５８、ｍ４＝１８．７３５、ｂ４＝１．３９３７。

【図5】１８時間の反応時間での、ＬＹ−ＣＨ対ｍＡｂモル比に関する誘導体化反応条件の最適化を示す。

【図6】８０００：１のＬＹ−ＣＨ対ｍＡｂモル比での、反応時間に関する誘導体化反応条件の最適化を示す。

【図7-1】図７Ａは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のｍＡｂ濃度を示す。図７Ｂは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のモル比を示す。図７Ｃは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のｐＨ値を示す。図７Ｄは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に（濾過による）緩衝液交換ステップの数を示す。図７Ｅは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に注入体積を示す。図７Ｆは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に冷凍／解凍サイクルの数に対する試料の安定性を示す。

【図7-2】図７Ａは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のｍＡｂ濃度を示す。図７Ｂは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のモル比を示す。図７Ｃは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のｐＨ値を示す。図７Ｄは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に（濾過による）緩衝液交換ステップの数を示す。図７Ｅは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に注入体積を示す。図７Ｆは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に冷凍／解凍サイクルの数に対する試料の安定性を示す。

【図7-3】図７Ａは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のｍＡｂ濃度を示す。図７Ｂは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のモル比を示す。図７Ｃは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に誘導体化反応のｐＨ値を示す。図７Ｄは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に（濾過による）緩衝液交換ステップの数を示す。図７Ｅは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に注入体積を示す。図７Ｆは、ＣＡＬＹアッセイの頑強性評価、特に冷凍／解凍サイクルの数に対する試料の安定性を示す。

【図8】オートサンプラー内で２〜８℃で１５時間まで貯蔵されたＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ試料の安定性に関する頑強性評価を示す。

【図9】３日間、２つの異なるＨＰＬＣ器具上での２名の分析者による共混合試料の分析による、アッセイ線形性及びアッセイ精度に関する方法の性能を示す。

【図10】共混合試料の分析による、アッセイ線形性及びアッセイ精度に関するＤＮＰＨ方法の性能を示す。

【図11】ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理を伴う場合と伴わない場合の、酸化ｍＡｂ試料の総タンパク質カルボニル化レベルを示す。

【図12A】結果として生じる総カルボニル化レベルとＦｅ（ＩＩ）との間の関係を示す。

【図12B】結果として生じる総カルボニル化レベルと、金属触媒酸化に使用された過酸化水素濃度との間の関係を示す。

【図12C】総カルボニル化レベルと、金属触媒酸化に使用されたＦｅ（ＩＩ）及び過酸化水素濃度との間の関係を示す。

【図13】様々な量のＦｅ（ＩＩ）（０．１μＭ及び０．８μＭ）ならびにＰＳ２０（０．０２％及び０．１６％、ｗ／ｖ）を含有し、暗所において室温で４、８、及び１６週間貯蔵されたｍＡｂ試料の総タンパク質カルボニル化レベルを示す。条件Ｂ５：０．８μＭ Ｆｅ（ＩＩ）及び０．１６％ ＰＳ２０、条件Ｂ３：０．１μＭ Ｆｅ（ＩＩ）及び０．１６％ ＰＳ２０、条件Ｂ４：０．８μＭ Ｆｅ（ＩＩ）及び０．０２％ ＰＳ２０、条件Ｂ２：０．１μＭ Ｆｅ（ＩＩ）及び０．０２％ ＰＳ２０、条件Ｂ１：Ｆｅ（ＩＩ）またはＰＳ２０なし（対照）。

【発明を実施するための形態】

【0012】

Ｉ．定義
本明細書を解釈する目的において、以下の定義が適用され、適当な場合はいつでも、単数形で使用される用語は複数形も含み、その逆も同様である。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合には、以下に記載される定義が優先する。

【0013】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ（１つの）」、「ｏｒ（または）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書に記載の本発明の態様及び変形は、態様及び変形「からなる」及び／または「本質的にからなる」を含むことが理解される。

【0014】

本明細書で使用される「約」という用語は、当業者に容易に知られているそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」の値またはパラメータに対する言及は、その値またはパラメータ自体に向けられる実施形態を含む（及び説明する）。

【0015】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、抗体薬物複合体、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、及びＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物複合体を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

【0016】

本明細書で使用される「カルボニル化」という用語は、例えば図１に示すように、ポリペプチド内のアミノ酸残基上のアルデヒド基またはケトン基の形成を指す。本明細書で使用される「総カルボニル化レベル」という用語は、ポリペプチドの単位量（ｎｍｏｌまたはｍｇ）当たりのカルボニル基の量（ｎｍｏｌ）を指す。

【0017】

本明細書で使用される「誘導体化」という用語は、アミノ酸またはポリペプチドの化学的性質を変化させるが、アミノ酸またはポリペプチド骨格構造を未変化のままにする化学反応を指す。具体的に、本明細書のＬＹ−ＣＨは、図２Ａに示す化学反応において使用され、アミノ酸またはポリペプチド上のカルボニル基を化学的に修飾し、それによりポリペプチド・色素錯体が形成される（図２Ａに示すシッフ塩基を形成する、ルシファーイエローカルボヒドラジド上のヒドラジド基と、ポリペプチド上のカルボニル基との間の反応によって）。

【0018】

本明細書で使用される「積分吸光度ピーク面積」という用語は、特定の波長において特定の検体について測定されたクロマトグラムにおける曲線下面積を指す。例えば、図３は、ＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ試料の２８０ｎｍ（図３Ａ）及び４２８ｎｍ（図３Ｂ）での吸光度による、サイズ排除クロマトグラムを示す。矢印は、ピーク積分の開始点及び終了点を示す。図３の積分吸光度ピーク面積は、開始点と終了点との間の曲線下面積である。

【0019】

「線形回帰フィッティング」という用語は、本明細書において、Ｙａｎ，Ｘ．，Ｇａｎｇ Ｓｕ，Ｘ．（２００９），Ｌｉｎｅａｒ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃに記載されるように使用される。

【0020】

本明細書で使用される「ルシファーイエロー」、「ルシファーイエローカルボヒドラジド」、「ルシファーイエローＣＨ」、「ＬＹ」、または「ＬＹ−ＣＨ」という用語は、未結合及び／または結合形態のルシファーイエローを指す。ルシファーイエローは、２８０ｎｍ及び４２８ｎｍで電磁気照射の強い吸光度を有する水溶性色素である。本明細書で使用される「ポリペプチド・色素錯体」という用語は、ヒドラジド色素と反応し、それによりポリペプチド・色素錯体を形成したポリペプチドを指す。具体的に、本明細書で使用される「ポリペプチド・色素錯体」という用語は、上記のようにＬＹ−ＣＨと反応したポリペプチドを指す。「未結合のヒドラジド色素」という用語は、具体的に、誘導体化試薬として本明細書で使用される、すなわち、ポリペプチド・色素錯体に結合されていないヒドラジド色素を指す。「未結合のＬＹ−ＣＨ」という用語は、具体的に、誘導体化試薬として本明細書で使用される、すなわち、ポリペプチド・色素錯体に結合されていないＬＹ−ＣＨを指す。「ルシファーイエロー」、「ルシファーイエローカルボヒドラジド」、「ルシファーイエローＣＨ」、「ＬＹ」、または「ＬＹ−ＣＨ」という用語は、同義に使用され得る。本明細書で使用されるＬＹ−ＣＨは、ＬＹ−ＣＨジリチウム塩として使用される。

【0021】

本明細書で使用される「ヒドラジド色素」という用語は、ヒドラジドを官能基として含む色素を指す。ヒドラジド色素の一般構造は、Ｅ−Ｎ（Ｒ）−Ｎ（Ｒ）_２であり、式中、Ｒは水素であり得、Ｅは色素である。「色素」という用語は、例えば、４２８ｎｍの波長で電磁気照射を吸収する分子または部分を指す。

【0022】

本明細書で使用される「モル比」という用語は、本明細書に記載される誘導体化反応においてポリペプチドの量（モル）を超えて使用されるＬＹ−ＣＨの量（モル）の比を指す。

【0023】

本明細書で使用されるフィルターユニットの「公称分画分子量」という用語は、特定の分子量の溶質の少なくとも９０％が維持されるフィルターユニットの孔径を指し、例えば、３０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットは、３０ｋＤａの分子量を有する溶質の少なくとも９０％を保持する。

【0024】

本明細書で使用される「非イオン性界面活性剤」という用語は、２種の液体間または液体と固体との間の表面張力を低下させる能力を有する非イオン性薬剤を指す。非イオン性界面活性剤の例は、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、及びＴｗｅｅｎ ８０である。本明細書で使用される「還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００」という用語は、ベンゼン環がシクロヘキサン環に還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００に関する。ベンゼン環に起因して、還元されていないＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、ポリペプチドの吸光度スペクトル（２６０ｎｍ〜２８０ｎｍ）と重複する吸光度スペクトルを有する。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００及びポリペプチドの吸光度スペクトルの重複が起こらないため、シクロヘキサン環の還元は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をポリペプチドの分析に好適にする。

【0025】

「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では同義に使用される。ポリマーは、直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの用語は、自然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作または修飾、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上の類似体を含有するポリペプチド、及び当該技術分野で既知の他の修飾もこの定義に含まれる。本明細書で使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、具体的に抗体を包含する。

【0026】

ＩＩ．方法
本記載において、ポリペプチドの総カルボニル化レベルを測定するための、簡略化された、より頑強かつより正確なタンパク質カルボニル化アッセイが提供される。前述のように、タンパク質沈殿及び洗浄による未結合のヒドラジドの除去は、労働集約的プロセスであり、例えば試料損失に起因する、実験的可変性の主な原因を構成する。ＬＹ−ＣＨは、比較的高い水溶性（約２００ｍＭ）を有し、ＤＮＰＨなどの多くのヒドラジド試薬よりも著しく親水性が高いため、誘導体化試薬として選択された。ＬＹ−ＣＨの可溶性かつ親水性の性質は、緩衝液交換濾過プロセスによる未結合のＬＹ−ＣＨの除去を可能にし、優れた試料回収につながる。本記載において、ＬＹ−ＣＨの可溶性は、緩衝液調製のために水酸化リチウムを使用することによって更に改善された。改善された緩衝液中のリチウムイオンの存在に基づくＬＹ−ＣＨの改善された可溶性は、従来の緩衝液系と比較して、誘導体化反応に対するより高いＬＹ−ＣＨ対ポリペプチドモル比の使用、及び誘導体化後の残留ＬＹ−ＣＨ試薬のより容易な除去を可能にする。誘導体化試薬として使用されるＬＹ−ＣＨの別の利点は、水溶液中のルシファーイエロー部分の化学安定性である。この特性は、複数の試料の分析が一度に実施される場合でも、分析の時間経過にわたって誘導体化試薬の発色団ならびに結果として生じるヒドラゾンの安定性を確保する。

【0027】

一態様において、本記載は、ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法に関し、この方法は、ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液中の、ポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度、及びポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度を判定するステップと、ｄ）ポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度に対するポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、ポリペプチドの総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含む。

【0028】

別の態様において、本記載は、ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法に関し、この方法は、ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液をクロマトグラフィーに適用して、ｉ）第１の積分ピーク面積をもたらす第１の波長でのクロマトグラム、及びｉｉ）第２の積分ピーク面積をもたらす第２の波長でのクロマトグラムを生成するステップと、ｄ）各々が第１の積分ピーク面積及び第２の積分ピーク面積に基づいて判定される、ポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度に対するポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、ポリペプチドの総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含む。

【0029】

更に別の態様において、本記載は、ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法に関し、この方法は、ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液をクロマトグラフィーに適用して、ｉ）第１の積分ピーク面積をもたらす第１の波長でのクロマトグラム、及びｉｉ）第２の積分ピーク面積をもたらす第２の波長でのクロマトグラムを生成するステップと、ｄ）４つの標準曲線、ｉ）第１の波長でのヒドラジド色素の標準曲線、ｉｉ）第２の波長でのヒドラジド色素の標準曲線、ｉｉｉ）第１の波長でのポリペプチドの標準曲線、及びｉｖ）第２の波長でのポリペプチドの標準曲線を生成するステップと、ｅ）４つの標準曲線、第１の積分ピーク面積、及び第２の積分ピーク面積に基づいて、ポリペプチド・色素錯体に結合されたヒドラジド色素の濃度、及びポリペプチド・色素錯体に結合されたポリペプチドの濃度を計算するステップと、ｆ）ポリペプチド・色素錯体に結合されたポリペプチドの濃度に対するポリペプチド・色素錯体に結合されたヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、ポリペプチドの総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含む。

【0030】

一実施形態において、ヒドラジド色素は、Ｃｙ３ヒドラジド、Ｃｙ５ヒドラジド、Ｃｙ５．５ヒドラジド、Ｃｙ７ヒドラジド、Ｃｙ７．５ヒドラジド、クマリンヒドラジド、ｉＦｌｕｏｒ（商標）色素ヒドラジド、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ ６４７ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３ヒドラジド、及びルシファーイエローヒドラジドからなる群から選択される。一実施形態において、ヒドラジド色素は、ＬＹ−ＣＨである。一実施形態において、ヒドラジド色素は、ＬＹ−ＣＨジリチウム塩である。

【0031】

一実施形態において、ステップａ）は、アルカリ金属イオンの存在下で実施される。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、１〜１００ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、１０〜９０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、２０〜８０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、３０〜７０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、４０〜６０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、４５〜５５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、４６〜５４ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、４７〜５３ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、４８〜５２ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、４９〜５１ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、約５０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、アルカリ金属イオンは、５０ｍＭの濃度で存在する。

【0032】

一実施形態において、ステップａ）に存在するアルカリ金属イオンは、リチウムイオン、ナトリウムイオン、及びカリウムイオンからなる群から選択される。一実施形態において、ステップａ）に存在するアルカリ金属イオンは、リチウムイオンである。一実施形態において、リチウムイオンは、１〜１００ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、１０〜９０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、２０〜８０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、３０〜７０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、４０〜６０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、４５〜５５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、４６〜５４ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、４７〜５３ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、４８〜５２ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、４９〜５１ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、約５０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態において、リチウムイオンは、５０ｍＭの濃度で存在する。

【0033】

本記載において、４２８ｎｍでの訂正吸光度を使用して、４２８ｎｍでのポリペプチド寄与を除算することによって、試料中のカルボニルのモル濃度を計算し、対応して、２８０ｎｍでの訂正吸光度を使用して、２８０ｎｍでのＬＹ−ＣＨ寄与を除算することによって、ポリペプチド濃度／量を計算する。比較して、他のアッセイは、カルボニル含有量を定量化するためのヒドラジド試薬のそれぞれの吸光度に対する４２８ｎｍでのポリペプチド寄与を訂正せず、カルボニル化含有量の過大評価につながる。換言すれば、ポリペプチド結合したルシファーイエロー部分及びポリペプチド構成要素の両方が、２８０ｎｍ及び４２８ｎｍでの測定された吸光度ピーク面積に寄与するため、ＬＹ−ＣＨのそれぞれの濃度及びポリペプチドのそれぞれの濃度は、ＬＹ−ＣＨ標準及び非誘導ｍＡｂを（ポリペプチド標準として）用いて生成された標準曲線を使用して計算した。したがって、一実施形態において、ルシファーイエローの吸光度の訂正及びポリペプチドの吸光度の訂正が実施される。

【0034】

一実施形態において、第１の波長は、４２０〜４４０ｎｍの範囲である。一実施形態において、第１の波長は、４２５〜４３５ｎｍの範囲である。一実施形態において、第１の波長は、４２６〜４３０ｎｍの範囲である。一実施形態において、第１の波長は、４２７〜４２８ｎｍの範囲である。一実施形態において、第１の波長は、約４２８ｎｍである。一実施形態において、第１の波長は、４２８ｎｍである。

【0035】

一実施形態において、第２の波長は、２７０〜２９０ｎｍの範囲である。一実施形態において、第２の波長は、２７５〜２８５ｎｍの範囲である。一実施形態において、第２の波長は、２７８〜２８２ｎｍの範囲である。一実施形態において、第２の波長は、２７９〜２８１ｎｍの範囲である。一実施形態において、第２の波長は、約２８０ｎｍである。一実施形態において、第２の波長は、２８０ｎｍである。

【0036】

本明細書に記載されるように、カルボニル化は、抗体などのポリペプチドのアミノ酸残基上で起こる。一実施形態において、カルボニル化が起こるアミノ酸残基は、アルギニン、リジン、プロリン、及びトレオニンからなる群から選択される。一実施形態において、カルボニル化は、ポリペプチドのアミノ酸残基のアルデヒド基上で起こる。一実施形態において、カルボニル化は、ポリペプチドのアミノ酸残基のケトン基上で起こる。

【0037】

一実施形態において、ポリペプチドは、ホモ多量体ポリペプチドである。一実施形態において、ポリペプチドは、ホモ二量体またはホモ三量体である。一実施形態において、ポリペプチドは、ヘテロ多量体ポリペプチドである。一実施形態において、ポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドである。一実施形態において、ポリペプチドは、抗体である。一実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、及びＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物複合体からなる群から選択される。一実施形態において、抗体は、クラスＧのサブクラスＩｇＧ１もしくはサブクラスＩｇＧ４またはそれらの変形である。一実施形態において、抗体は、抗体断片である。一実施形態において、抗体断片は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′−ＳＨ、二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体から選択される。

【0038】

一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、６，０００〜１０，０００の最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、７，０００〜９，０００の最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、７，５００〜８，５００の最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、７，８００〜８，２００の最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、７，９００〜８，１００の最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、７，９５０〜８，０５０の最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、及び１０，０００からなる群から選択される最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、約８，０００の最終モル比で接触される。一実施形態において、ポリペプチド及びヒドラジド色素は、８，０００の最終モル比で接触される。一実施形態において、ヒドラジド色素は、ＬＹ−ＣＨである。

【0039】

一実施形態において、ステップａ）は、非イオン性界面活性剤の存在下で実施される。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．０１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．２％（ｗ／ｖ）〜４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．３％（ｗ／ｖ）〜３％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．４％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．５％（ｗ／ｖ）〜１．５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．６％（ｗ／ｖ）〜１．４％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．７％（ｗ／ｖ）〜１．３％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．８％（ｗ／ｖ）〜１．２％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、０．９％（ｗ／ｖ）〜１．１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、約０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。

【0040】

一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、及びＴｗｅｅｎ ８０からなる群から選択される。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

【0041】

一実施形態において、ステップａ）は、暗所で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、一級アミンも二級アミンもいずれも含有しない緩衝液中で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、ｐＨ４〜７の能力を有する緩衝液中で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、一級アミンまたは二級アミンを含有しない、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液中で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、ＭＥＳ緩衝液中で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、リチウムＭＥＳ緩衝液中で実施される。

【0042】

一実施形態において、ステップａ）は、５〜７のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、５．５〜６．５のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、５．６〜６．４のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、５．７〜６．３のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、５．８〜６．２のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、５．９〜６．１のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、約５．９のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、約６．０のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、約６．１のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、５．９のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、６．０のｐＨ値で実行される。一実施形態において、ステップａ）は、６．１のｐＨ値で実行される。

【0043】

一実施形態において、ステップａ）は、３５℃〜３９℃の温度で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、３６℃〜３８℃の温度で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、３６．５℃〜３７．５℃の温度で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、約３７℃の温度で実施される。一実施形態において、ステップａ）は、３７℃の温度で実施される。

【0044】

一実施形態において、ステップａ）は、１〜５０時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、５〜４０時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、８〜３０時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１１〜２５時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１２〜２０時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１３〜１９時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１４〜１８時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１５〜１７時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、約１６時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１６時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１７〜１９時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、約１８時間にわたって実施される。一実施形態において、ステップａ）は、１８時間にわたって実施される。

【0045】

一実施形態において、未結合のヒドラジド色素の除去は、濾過、ゲル濾過、及び透析からなる群から選択される方法によって実施される。一実施形態において、未結合のヒドラジド色素の除去は、濾過によって実施される。ヒドラジド色素をポリペプチドから分離することができる、任意のフィルターが使用され得る。一実施形態において、濾過は、５〜５０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、５ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、１０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、１５ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、２０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、２５ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、３０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、３５ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、４０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、４５ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、濾過は、５０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される。一実施形態において、未結合のヒドラジド色素の除去は、ゲル濾過によって実施される。一実施形態において、未結合のヒドラジド色素の除去は、透析によって実施される。

【0046】

一実施形態において、濾過は、１００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１１０〜２９０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１２０〜２８０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１３０〜２７０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１４０〜２６０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１５０〜２５０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１６０〜２４０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１７０〜２３０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１８０〜２２０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１９０〜２１０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、１９５〜２０５ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、約２００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。

【0047】

一実施形態において、濾過は、２００〜３００ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２１０〜２９０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２２０〜２８０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２３０〜２７０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２４０〜２６０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２４５〜２５５ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、約２５０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２５０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。

【0048】

一実施形態において、濾過は、１００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下、かつ２００〜３００ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、濾過は、２００ｍＭのリン酸カリウムの存在下、かつ２５０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。

【0049】

一実施形態において、濾過は、５．４〜７．０のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、５．５〜６．９のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、５．６〜６．８のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、５．７〜６．７のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、５．８〜６．６のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、５．９〜６．５のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、６．０〜６．４のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、６．１〜６．３のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、約６．２のｐＨ値で実行される。一実施形態において、濾過は、６．２のｐＨ値で実行される。

【0050】

一実施形態において、クロマトグラフィー中に、ポリペプチド・色素錯体は、未結合のヒドラジド色素から分離され、それにより図３Ａ及び３Ｂに示すように、ポリペプチド・色素錯体と未結合のヒドラジド色素との間の干渉が起こらないようにする。本明細書で使用される「干渉なし」という用語は、クロマトグラフィー中に、ポリペプチド・色素錯体のベースライン分解ピーク（１０〜２２分で溶出した）と未結合のヒドラジド色素のベースライン分解ピーク（およそ２４分で溶出した）との間の重複がないか、または関連重複がないことを意味する。

【0051】

更に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を上記のステップｃ）において用い、未結合のＬＹ−ＣＨをポリペプチド・色素錯体から分離する。ＳＥＣを使用する利点は、定量化が、下記の実施例に記載される頑強性実験によって実証されるように、試料中に存在する可変量の未結合のＬＹ−ＣＨによって影響を受けないことである。したがって、誘導体化にＬＹ−ＣＨ及び定量化にＳＥＣ分析を使用することの組み合わせは、最適な方法性能のために未結合のヒドラジド試薬を徹底的かつ再現性よく除去することに依存しない、改善された試料調製手順を提供する。

【0052】

したがって、一実施形態において、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーである。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、０．１〜０．９ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、０．２〜０．８ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、０．３〜０．７ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、０．４〜０．６ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、約０．５ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、０．５ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される。

【0053】

一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２０℃〜３０℃のカラム温度で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２１℃〜２９℃のカラム温度で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２２℃〜２８℃のカラム温度で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２３℃〜２７℃のカラム温度で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２４℃〜２６℃のカラム温度で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、約２５℃のカラム温度で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２５℃のカラム温度で実行される。

【0054】

一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１１０〜２９０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１２０〜２８０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１３０〜２７０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１４０〜２６０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１５０〜２５０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１６０〜２４０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１７０〜２３０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１８０〜２２０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１９０〜２１０ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、１９５〜２０５ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、約２００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される。

【0055】

一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２００〜３００ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２１０〜２９０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２２０〜２８０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２３０〜２７０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２４０〜２６０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２４５〜２５５ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、約２５０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、２５０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される。

【0056】

一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、５．４〜７．０のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、５．５〜６．９のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、５．６〜６．８のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、５．７〜６．７のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、５．８〜６．６のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、５．９〜６．５のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、６．０〜６．４のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、６．１〜６．３のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、約６．２のｐＨ値で実行される。一実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーは、６．２のｐＨ値で実行される。

【0057】

一実施形態において、４つの標準曲線は、サイズ排除クロマトグラフィーによって生成される。一実施形態において、４つの標準曲線は、以下の等式を使用して生成される。
等式１を使用する第４の標準曲線（２８０ｎｍでのポリペプチド）：ｙ_１＝ｍ_１ｘ＋ｂ_１
等式２を使用する第３の標準曲線（４２８ｎｍでのポリペプチド）：ｙ_２＝ｍ_２ｘ＋ｂ_２
等式３を使用する第２の標準曲線（２８０ｎｍでのルシファーイエロー）：ｙ_３＝ｍ_３ｚ＋ｂ_３
等式４を使用する第１の標準曲線（４２８ｎｍでのルシファーイエロー）：ｙ_４＝ｍ_４ｚ＋ｂ_４
式中、ｘは、ポリペプチドの濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、ｚは、ルシファーイエローのモル濃度（μＭ）であり、ｍ_１〜ｍ_４及びｂ_１〜ｂ_４は、線形回帰フィッティングから得られる定数である。

【0058】

一実施形態において、ポリペプチドのカルボニル化レベルは、２つの可変（ｘ及びｚ）線形等式を解くことによって、ｚ／ｘ（ｎｍｏｌ／ｍｇ）として計算される。
等式５：Ａ_２８０＝ｍ_１ｘ＋ｂ_１＋ｍ_３ｚ＋ｂ_３
等式６：Ａ_４２８＝ｍ_２ｘ＋ｂ_２＋ｍ_４ｚ＋ｂ_４
式中、ｚは、カルボニル基のモル濃度（μＭ）であり、ｘは、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、Ａ_２８０は、図３Ａに示すように、２８０ｎｍの吸光度からのＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ種の積分ピーク面積であり、Ａ_４２８は、図３Ｂに示すように、４２８ｎｍの吸光度からのＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ種の積分ピーク面積である。
ｚ及びｘは、以下に示す線形等式５及び６を解くことによって判定され得る。
ｘ＝［ｍ_４^＊Ａ_２８０−ｍ_３^＊Ａ_４２８−ｍ_４^＊（ｂ_１＋ｂ_３）＋ｍ_３^＊（ｂ_２＋ｂ_４）］／（ｍ_４^＊ｍ_１−ｍ_２^＊ｍ_３）
ｚ＝［ｍ_２^＊Ａ_２８０−ｍ_１^＊Ａ_４２８−ｍ_２^＊（ｂ_１＋ｂ_３）＋ｍ_１^＊（ｂ_２＋ｂ_４）］／（ｍ_２^＊ｍ_３−ｍ_１^＊ｍ_４）
次いで、総カルボニル化レベルをｚ／ｘとして計算する。

【0059】

ＩＩＩ．キット
本明細書において説明される用途で用いるために、製造者のキットまたは物品も提供される。このようなキットは、厳重な管理下で、バイアル、管等の１つ以上の容器手段を受容するように区分化された担体手段を備えてよく、容器手段のそれぞれは、この方法において用いられる別個の要素のうちの１つを含む。一実施形態において、容器手段のうちの１つは、ヒドラジド色素を含み得る。一実施形態において、ヒドラジド色素は、Ｃｙ３ヒドラジド、Ｃｙ５ヒドラジド、Ｃｙ５．５ヒドラジド、Ｃｙ７ヒドラジド、Ｃｙ７．５ヒドラジド、クマリンヒドラジド、ｉＦｌｕｏｒ（商標）色素ヒドラジド、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ ６４７ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３ヒドラジド、及びＬＹ−ＣＨからなる群から選択される。一実施形態において、ヒドラジド色素は、ＬＹ−ＣＨである。一実施形態において、ヒドラジド色素は、ＬＹ−ＣＨジリチウム塩である。一実施形態において、容器手段のうちの１つは、緩衝液を含む。一実施形態において、容器手段のうちの１つは、リチウムイオンを含む緩衝液を含む。一実施形態において、緩衝液は、一級アミンも二級アミンもいずれも含有しない。一実施形態において、緩衝液は、ｐＨ４〜７の能力を有する。一実施形態において、ＭＥＳ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、及びＰＩＰＥＳからなる群から選択される緩衝液は、一級アミンまたは二級アミンを含有しない。一実施形態において、緩衝液は、リチウムＭＥＳ緩衝液である。一実施形態において、緩衝液は、ｐＨ値６．０のリチウムＭＥＳ緩衝液である。一実施形態において、緩衝液は、ｐＨ値６．１のリチウムＭＥＳ緩衝液である。

【0060】

一実施形態において、容器手段のうちの１つは、非イオン性界面活性剤を含む。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、オクチル−ベータ−グルコシド、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、及びＴｗｅｅｎ ８０からなる群から選択される。一実施形態において、非イオン性界面活性剤は、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である。

【0061】

一実施形態において、容器手段のうちの１つは、ポリペプチドの標準を含み、容器手段のうちの１つは、ヒドラジド色素の標準を含む。一実施形態において、容器手段のうちの１つは、フィルターユニットを含む。一実施形態において、フィルターユニットは、３０ｋＤａフィルターユニットである。一実施形態において、容器手段のうちの１つは、リン酸カリウムを含む。一実施形態において、容器手段のうちの１つは、塩化カリウムを含む。

【0062】

キットは、典型的に、上記の容器と、緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を伴う添付文書を含む、商業的及びユーザーの視点から望ましい材料を含む１つ以上の他の容器と、を備える。標識は、組成物が非治療的用途に使用されることを示すために容器上に提示され得、上記のものなどのインビトロ使用に関する指示も示し得る。キットの他の任意の構成要素としては、１つ以上の緩衝液（例えば、誘導体化緩衝液、ブロック緩衝液、洗浄緩衝液、基質緩衝液等）、酵素標識により化学的に変化する基質（例えば、クロモゲン）などの他の試薬、エピトープ抽出溶液、対照試料（正及び／または負の対照）、対照スライド（複数可）等が挙げられる。

【0063】

ＩＶ．具体的な実施形態
１．ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法であって、
ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、
ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液中の、ポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度、及びポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度を判定するステップと、
ｄ）ポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度に対するポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、ポリペプチドの前記総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含む、方法。

【0064】

２．ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法であって、
ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、
ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液をクロマトグラフィーに適用して、ｉ）第１の積分ピーク面積をもたらす第１の波長でのクロマトグラム、及びｉｉ）第２の積分ピーク面積をもたらす第２の波長でのクロマトグラムを生成するステップと、
ｄ）各々が第１の積分ピーク面積及び第２の積分ピーク面積に基づいて判定される、ポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度に対するポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、ポリペプチドの総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含む、方法。

【0065】

３．ポリペプチド上の総カルボニル化レベルを判定するための方法であって、
ａ）溶液中のポリペプチドを、ヒドラジド色素がポリペプチドのアミノ酸残基上に存在するカルボニル基と反応してポリペプチド・色素錯体を形成し得るような条件下で、ヒドラジド色素と接触させるステップと、
ｂ）ステップａ）からの結果として生じる溶液から未結合のヒドラジド色素を除去するステップと、
ｃ）ステップｂ）からの結果として生じる溶液をクロマトグラフィーに適用して、ｉ）第１の積分ピーク面積をもたらす第１の波長でのクロマトグラム、及びｉｉ）第２の積分ピーク面積をもたらす第２の波長でのクロマトグラムを生成するステップと、
ｄ）４つの標準曲線、ｉ）第１の波長でのヒドラジド色素の標準曲線、ｉｉ）第２の波長でのヒドラジド色素の標準曲線、ｉｉｉ）第１の波長でのポリペプチドの標準曲線、及びｉｖ）第２の波長でのポリペプチドの標準曲線を生成するステップと、
ｅ）４つの標準曲線、第１の積分ピーク面積、及び第２の積分ピーク面積に基づいて、ポリペプチド・色素錯体に結合されたヒドラジド色素の濃度、及びポリペプチド・色素錯体に結合されたポリペプチドの濃度を計算するステップと、
ｆ）ポリペプチド・色素錯体において結合されたポリペプチドの濃度に対するポリペプチド・色素錯体において結合されたヒドラジド色素の濃度の比に基づいて、ポリペプチドの総カルボニル化レベルを判定するステップと、を含む、方法。

【0066】

４．ヒドラジド色素が、Ｃｙ３ヒドラジド、Ｃｙ５ヒドラジド、Ｃｙ５．５ヒドラジド、Ｃｙ７ヒドラジド、Ｃｙ７．５ヒドラジド、クマリンヒドラジド、ｉＦｌｕｏｒ（商標）色素ヒドラジド、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ ６４７ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３ヒドラジド、及びＬＹ−ＣＨからなる群から選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0067】

５．ヒドラジド色素が、ＬＹ−ＣＨである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0068】

６．ステップａ）が、アルカリ金属イオンの存在下で実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0069】

７．アルカリ金属イオンが、１〜１００ｍＭの濃度で存在する、実施形態６に記載の方法。

【0070】

８．アルカリ金属イオンが、５０ｍＭの濃度で存在する、実施形態６に記載の方法。

【0071】

９．アルカリ金属イオンが、リチウムイオン、ナトリウムイオン、及びカリウムイオンからなる群から選択される、実施形態６〜８のいずれか１つに記載の方法。

【0072】

１０．アルカリ金属イオンが、リチウムイオンである、実施形態６〜８のいずれか１つに記載の方法。

【0073】

１１．ステップａ）が、リチウムＭＥＳ緩衝液中で実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0074】

１２．ステップａ）における反応が、誘導体化である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0075】

１３．第１の波長が、４２６ｎｍ〜４３０ｎｍの範囲である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0076】

１４．第１の波長が、４２８ｎｍである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0077】

１５．第２の波長が、２７８ｎｍ〜２８２ｎｍの範囲である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0078】

１６．第２の波長が、２８０ｎｍである、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0079】

１７．アミノ酸残基が、アルギニン、リジン、プロリン、及びトレオニンからなる群から選択される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0080】

１８．ポリペプチドが、抗体である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0081】

１９．抗体が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、抗体断片、抗体薬物複合体、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）、またはＴＨＩＯＭＡＢ（商標）薬物複合体である、実施形態１８に記載の方法。

【0082】

２０．ポリペプチド及びヒドラジド色素が、ステップａ）において６，０００〜１０，０００の最終モル比で接触される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0083】

２１．ポリペプチド及びヒドラジド色素が、ステップａ）において８，０００の最終モル比で接触される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0084】

２２．ステップａ）が、非イオン性界面活性剤の存在下で実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0085】

２３．非イオン性界面活性剤が、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、及びＴｗｅｅｎ ８０からなる群から選択される、実施形態２２に記載の方法。

【0086】

２４．非イオン性界面活性剤が、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である、実施形態２２に記載の方法。

【0087】

２５．非イオン性界面活性剤が、０．０１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、実施形態２２〜２４のいずれか１つに記載の方法。

【0088】

２６．非イオン性界面活性剤が、０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、実施形態２２〜２４のいずれか１つに記載の方法。

【0089】

２７．非イオン性界面活性剤が、１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する、実施形態２２〜２４のいずれか１つに記載の方法。

【0090】

２８．ステップａ）が、暗所で実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0091】

２９．ステップａ）が、５〜７のｐＨ値で実行される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0092】

３０．ステップａ）が、６．０のｐＨ値で実行される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0093】

３１．ステップａ）が、６．１のｐＨ値で実行される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0094】

３２．ステップａ）が、３５℃〜３９℃の温度で実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0095】

３３．ステップａ）が、３７℃の温度で実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0096】

３４．ステップａ）が、１０〜２０時間にわたって実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0097】

３５．ステップａ）が、１６時間にわたって実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0098】

３６．ステップａ）が、１８時間にわたって実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0099】

３７．ステップｂ）における未結合のヒドラジド色素の除去が、濾過、ゲル濾過、及び透析からなる群から選択される方法によって実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0100】

３８．未結合のヒドラジド色素の除去が、濾過によって実施される、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

【0101】

３９．濾過が、５〜５０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される、実施形態３５に記載の方法。

【0102】

４０．濾過が、３０ｋＤａの公称分画分子量を有するフィルターユニットで実行される、実施形態３５に記載の方法。

【0103】

４１．濾過が、１００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される、実施形態３５〜３７のいずれか１つに記載の方法。

【0104】

４２．濾過が、２００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される、実施形態３５〜３８のいずれか１つに記載の方法。

【0105】

４３．濾過が、２００〜３００ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される、実施形態３５〜３９のいずれか１つに記載の方法。

【0106】

４４．濾過が、２５０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される、実施形態３５〜４０のいずれか１つに記載の方法。

【0107】

４５．濾過が、６〜７のｐＨ値で実行される、実施形態３５〜４１のいずれか１つに記載の方法。

【0108】

４６．濾過が、６．２のｐＨ値で実行される、実施形態３５〜４２のいずれか１つに記載の方法。

【0109】

４７．クロマトグラフィー中に、ポリペプチド・色素錯体が、未結合のヒドラジド色素から分離され、それによりポリペプチド・色素錯体と未結合のヒドラジド色素との間の干渉が起こらないようにする、実施形態２〜４３のいずれか１つに記載の方法。

【0110】

４８．クロマトグラフィーが、サイズ排除クロマトグラフィーである、実施形態２〜４４のいずれか１つに記載の方法。

【0111】

４９．サイズ排除クロマトグラフィーが、０．２〜０．８ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される、実施形態４５に記載の方法。

【0112】

５０．サイズ排除クロマトグラフィーが、０．５ｍＬ／分のイソクラティック流で実行される、実施形態４５のいずれか１つに記載の方法。

【0113】

５１．サイズ排除クロマトグラフィーが、２０℃〜３０℃のカラム温度で実行される、実施形態４５〜４７のいずれか１つに記載の方法。

【0114】

５２．サイズ排除クロマトグラフィーが、２５℃のカラム温度で実行される、実施形態４５〜４８のいずれか１つに記載の方法。

【0115】

５３．サイズ排除クロマトグラフィーが、１００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される、実施形態４５〜４９のいずれか１つに記載の方法。

【0116】

５４．サイズ排除クロマトグラフィーが、２００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される、実施形態４５〜５０のいずれか１つに記載の方法。

【0117】

５５．サイズ排除クロマトグラフィーが、２００〜３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で実行される、実施形態４５〜５１のいずれか１つに記載の方法。

【0118】

５６．サイズ排除クロマトグラフィーが、２５０ｍＭの塩化カリウムの存在下で実行される、実施形態４５〜５２のいずれか１つに記載の方法。

【0119】

５７．サイズ排除クロマトグラフィーが、６〜７のｐＨで実行される、実施形態４５〜５３のいずれか１つに記載の方法。

【0120】

５８．サイズ排除クロマトグラフィーが、６．２のｐＨで実行される、実施形態４５〜５４のいずれか１つに記載の方法。

【0121】

５９．４つの標準曲線が、サイズ排除クロマトグラフィーによって生成される、実施形態３〜５５のいずれか１つに記載の方法。

【0122】

６０．４つの標準曲線が、以下の等式を使用して生成される、実施形態３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
等式１を使用する第４の標準曲線（２８０ｎｍでのポリペプチド）：ｙ_１＝ｍ_１ｘ＋ｂ_１
等式２を使用する第３の標準曲線（４２８ｎｍでのポリペプチド）：ｙ_２＝ｍ_２ｘ＋ｂ_２
等式３を使用する第２の標準曲線（２８０ｎｍでのルシファーイエロー）：ｙ_３＝ｍ_３ｚ＋ｂ_３
等式４を使用する第１の標準曲線（４２８ｎｍでのルシファーイエロー）：ｙ_４＝ｍ_４ｚ＋ｂ_４
式中、ｘは、ポリペプチドの濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、ｚは、ルシファーイエローのモル濃度（μＭ）であり、ｍ_１〜ｍ_４及びｂ_１〜ｂ_４は、線形回帰フィッティングから得られる定数である。

【0123】

６１．ポリペプチドのカルボニル化レベルが、２変数（ｘ及びｚ）線形等式を解くことによって、ｚ／ｘ（ｎｍｏｌ／ｍｇ）として計算される、実施形態３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
等式５：Ａ_２８０＝ｍ_１ｘ＋ｂ_１＋ｍ_３ｚ＋ｂ_３
等式６：Ａ_４２８＝ｍ_２ｘ＋ｂ_２＋ｍ_４ｚ＋ｂ_４
式中、ｚは、カルボニル基のモル濃度（μＭ）であり、ｘは、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、Ａ_２８０は、図３Ａに示すように、２８０ｎｍの吸光度からのＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ種の積分ピーク面積であり、Ａ_４２８は、図３Ｂに示すように、４２８ｎｍの吸光度からのＬＹ−ＣＨ由来のｍＡｂ種の積分ピーク面積である。
ｚ及びｘは、以下に示す線形等式５及び６を解くことによって判定され得る。
ｘ＝［ｍ_４^＊Ａ_２８０−ｍ_３^＊Ａ_４２８−ｍ_４^＊（ｂ_１＋ｂ_３）＋ｍ_３^＊（ｂ_２＋ｂ_４）］／（ｍ_４^＊ｍ_１−ｍ_２^＊ｍ_３）
ｚ＝［ｍ_２^＊Ａ_２８０−ｍ_１^＊Ａ_４２８−ｍ_２^＊（ｂ_１＋ｂ_３）＋ｍ_１^＊（ｂ_２＋ｂ_４）］／（ｍ_２^＊ｍ_３−ｍ_１^＊ｍ_４）
次いで、総カルボニル化レベルをｚ／ｘとして計算する。

【0124】

６２．ヒドラジド色素及び緩衝液を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法を実行するためのキット。

【0125】

６３．ヒドラジド色素が、Ｃｙ３ヒドラジド、Ｃｙ５ヒドラジド、Ｃｙ５．５ヒドラジド、Ｃｙ７ヒドラジド、Ｃｙ７．５ヒドラジド、クマリンヒドラジド、ｉＦｌｕｏｒ（商標）色素ヒドラジド、ＨｉＬｙｔｅ（商標）Ｆｌｕｏｒ ６４７ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ヒドラジド、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３ヒドラジド、及びＬＹ−ＣＨからなる群から選択される、実施形態５９に記載のキット。

【0126】

６４．ヒドラジド色素が、ＬＹ−ＣＨである、実施形態５９に記載のキット。

【0127】

６５．緩衝液が、リチウムＭＥＳ緩衝液である、実施形態５９〜６１に記載のキット。

【0128】

６６．非イオン性界面活性剤を更に含む、実施形態５９〜６２に記載のキット。

【0129】

６７．非イオン性界面活性剤が、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ １８８、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、及びＴｗｅｅｎ ８０からなる群から選択される、実施形態６３に記載のキット。

【0130】

６８．非イオン性界面活性剤が、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００である、実施形態６３に記載のキット。

【0131】

６９．キットが、ポリペプチドの標準及びヒドラジド色素の標準を更に含む、実施形態５９〜６５に記載のキット。

【実施例】

【0132】

Ｖ．実施例
以下は、本発明に記載の方法の実施例である。上述の概要を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。

【0133】

前述の発明が明確な理解のために例証及び例により多少詳しく記載されているが、これらの記述及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。

【0134】

材料
本記載において使用される全てのｍＡｂは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）において製造された。ＬＹ−ＣＨジリチウム塩、硫酸鉄、過酸化水素溶液（Ｈ_２Ｏ中３０％、ｗ／ｗ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、コハク酸ナトリウム、コハク酸、リン酸カリウム（二塩基性及び一塩基性）、塩化カリウム、酢酸ナトリウム、酢酸、水酸化ナトリウム溶液（Ｈ_２Ｏ中１Ｍ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、水酸化リチウム、還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及びＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）サイズ排除カラムは、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）タンパク質カルボニルアッセイキットは、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ（グリセロール不含）は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。

【0135】

実施例１：酸化ｍＡｂ試料の調製及びＬＹ−ＣＨによるｍＡｂ試料の誘導体化
オキシ標準ｍＡｂまたはオキシ標準ｍＡｂ（ＩＩ）と称される酸化ｍＡｂ試料は、フェントン反応を使用して本明細書に記載される方法のために生成した。したがって、抗体試料を、ＦｅＳＯ_４及び過酸化水素と５ｍｇ／ｍＬ、２ｍＭ、及び１０ｍＭそれぞれの最終濃度まで、５０ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で混合した。反応混合物を室温で２時間インキュベートし、その後に過剰量のメチオニン及びＥＤＴＡを添加することによって停止させた。

【0136】

誘導体化は、ＭＥＳ溶液を１Ｍの水酸化リチウム溶液でｐＨ６．０まで滴定することによって調製された誘導体化緩衝液（５０ｍＭのリチウムＭＥＳ緩衝液、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ６．０）中で実行した。最初に、ｍＡｂ試料を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０ＫＤａフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、誘導体化緩衝液に緩衝液交換した。その後に、ｍＡｂ試料（０．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、ＬＹ−ＣＨ（８，０００の最終ＬＹ−ＣＨ対ｍＡｂモル比）及び還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（１％重量／体積の最終濃度）と誘導体化緩衝液中で混合した。誘導体化は、暗所において３７℃で１６時間実行した。誘導体化後に、５００μＬ分量の誘導体化試料を、１５ｍＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０ｋＤａフィルターユニットを使用して、２００ｍＭのリン酸カリウム、２５０ｍＭの塩化カリウム、ｐＨ６．２に３回緩衝液交換した。

【0137】

誘導体化は、ＭＥＳ溶液を１Ｍの水酸化リチウム溶液でｐＨ６．０まで滴定することによって調製された誘導体化緩衝液（５０ｍＭのリチウムＭＥＳ緩衝液、０．０５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ６．０）中で実行した。最初に、ｍＡｂ試料を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０ＫＤａフィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、誘導体化緩衝液に緩衝液交換した。その後に、ｍＡｂ試料（０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、ＬＹ−ＣＨ（８，０００の最終ＬＹ−ＣＨ対ｍＡｂモル比）及び還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（０．０５％重量／体積の最終濃度）と誘導体化緩衝液中で混合した。誘導体化は、暗所において３７℃で１８時間実行した。誘導体化後に、５００μＬ分量の誘導体化試料を、１５ｍＬのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５ ３０ｋＤａフィルターユニットを使用して、２００ｍＭのリン酸カリウム、２５０ｍＭの塩化カリウム、ｐＨ６．２に３回緩衝液交換した。

【0138】

実施例２：ｍＡｂのタンパク質カルボニルレベルの判定
ＣＡＬＹの全体ワークフローを図２Ｂに示す。ｍＡｂ試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣシステムによって生成された０．５ｍＬ／分のイソクラティック流でＴＳＫ Ｇ３０００ ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ）サイズ排除カラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。移動相は、２００ｍＭのリン酸カリウム、２５０ｍＭの塩化カリウムをｐＨ６．２で含有していた。カラム温度は、２５℃で制御し、オートサンプラー温度は、８℃で制御した。各試料について、分析のために２５μＬのｍＡｂ材料（およそ２５μｇ）を注入した。溶出液を、２８０ｎｍ及び４２８ｎｍ両方でのＵＶ吸光度によってモニタリングした。

【0139】

誘導体化及び緩衝液交換後に、ｍＡｂ試料をサイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、試料中の残留ＬＹ−ＣＨを誘導ｍＡｂから分離した。カルボニル化レベルの定量化は、サイズ排除クロマトグラムの誘導ｍＡｂ（およそ１０〜２２分で溶出した）のＵＶ２８０ｎｍ及び４２８ｎｍ吸光度ピーク面積に基づいていた。タンパク質結合したルシファーイエロー部分及びタンパク質構成要素の両方が、測定されたＵＶ２８０及び４２８ｎｍ吸光度ピーク面積に寄与するため、ルシファーイエロー部分及びタンパク質のそれぞれの濃度を、ＬＹ−ＣＨ標準及び非誘導ｍＡｂ（タンパク質標準として）の標準曲線を使用して計算した。

【0140】

ｍＡｂ標準曲線は、様々なタンパク質濃度（０．２５、０．５、１、２、及び３ｍｇ／ｍＬ）での２５μＬ注入を伴う、対応する非誘導ｍＡｂ試料のサイズ排除クロマトグラフィー分析によって調製した。ＬＹ−ＣＨ標準曲線は、２５μＬのＬＹ−ＣＨ標準を様々なモル濃度（１、５、１０、１５、及び２０μＭ）で注入することによって同様に調製した。ｍＡｂ及びＬＹ−ＣＨ標準それぞれの濃度に対する結果として生じるＵＶ吸光度ピーク面積の線形回帰フィットによって、４つの線形等式を生成した。これらの等式において、ｘは、ｍＡｂタンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）であり、ｚは、ＬＹ−ＣＨモル濃度（μＭ）であり、ｍ_１〜ｍ_４及びｂ_１〜ｂ_４は、線形回帰フィッティングから得られた定数である。
等式１（ｍＡｂのＵＶ２８０ｎｍ応答）：ｙ_１＝ｍ_１ｘ＋ｂ_１
等式２（ｍＡｂのＵＶ４２８ｎｍ応答）：ｙ_２＝ｍ_２ｘ＋ｂ_２
等式３（ＬＹ−ＣＨのＵＶ２８０ｎｍ応答）：ｙ_３＝ｍ_３ｚ＋ｂ_３
等式４（ＬＹ−ＣＨのＵＶ４２８ｎｍ応答）：ｙ_４＝ｍ_４ｚ＋ｂ_４

【0141】

図４Ａ及び４Ｂに示すように、標準曲線の線形回帰フィット後、ｍ１＝４８１３．９、ｂ１＝−１２５．９８、ｍ２＝１０．０８５、ｂ２＝３．２４５８、ｍ３＝３５．５０７、ｂ３＝１．４３２８、ｍ４＝１８．７３５、ｂ４＝１．３９３７である。

【0142】

次いで、ｍＡｂ試料のカルボニル化レベルを、２つの変数（ｘ及びｚ）線形等式５及び６を解くことによってｚ／ｘ（ｎｍｏｌ／ｍｇ）として計算し、式中、ｘは、カルボニル基のモル濃度（μＭ）であり、ｚは、タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）である。
等式５：Ａ_２８０＝ｍ_１ｘ＋ｂ_１＋ｍ_３ｚ＋ｂ_３
等式６：Ａ_４２８＝ｍ_２ｘ＋ｂ_２＋ｍ_４ｚ＋ｂ_４

【0143】

定量化プロセスを例示するために、誘導オキシ標準ｍＡｂの典型的なサイズ排除クロマトグラムを図３Ａ及び３Ｂに示す。非誘導オキシ標準ｍＡｂ及びＬＹ−ＣＨからの４つの標準曲線を図４Ａ及び４Ｂに示し、吸光度ピーク面積とｍＡｂ及びＬＹ−ＣＨ濃度それぞれとの間の線形応答を実証した。データの線形回帰フィッティングからの判定係数（Ｒ^２）は、０．９９超であった。次いで、各誘導体化条件の総カルボニル化レベルを、誘導オキシ標準ｍＡｂからの積分ピーク面積及び標準曲線からの４つの等式に基づいて計算した。例として、Ａ_２８０及びＡ_４２８値を以下のように判定した。ピーク面積４３４７．７、Ａ_２８０は、２８０ｎｍでのｍＡｂ及びＬＹ−ＣＨの吸光度寄与の結果であり、ＳＥＣプロファイルにおいて、およそ１０．１分から２２．２分までの曲線下面積を積分することによって判定した。したがって、ピーク面積２２４．０、Ａ_４２８は、４２８ｎｍでの吸光度を有するＳＥＣプロファイルにおいて、およそ１０．１分から２２．２分までの曲線下面積を積分することによって判定した。上記等式５及び６と関連して、これは以下の２つの等式をもたらした。
ｉ）４３４７．７＝４８１３．９^＊×−１２５．９８＋３５．５０７^＊ｚ＋１．４３２８
ｉｉ）２２４．０＝１０．０８５^＊×＋３．２４５８＋１８．７３５^＊ｚ＋１．３９３７

【0144】

次いで、２つの変数ｘ及びｚを、２つの線形等式ｉ）及びｉｉ）（ｘ＝０．８４６ｍｇ／ｍＬ ｍＡｂ、ｚ＝１１．２５３μＭ ＬＹ−ＣＨ）を解くことによって判定し、１３．３ｎｍｏｌ／ｍｇ）のカルボニル化レベルをもたらした。

【0145】

実施例３：誘導体化条件の最適化
最適な緩衝液系及びｐＨ値の特定
ＣＡＬＹの最適な誘導体化条件を確立するために、上記実施例１に記載されるオキシ標準ｍＡｂ試料を試験試料として使用して、誘導体化緩衝液、ＬＹ−ＣＨ対ｍＡｂモル比、及び誘導体化時間を最適化した。誘導体化試薬としてＬＹ−ＣＨの使用を可能にする最適化緩衝液を特定するために、最初に、誘導体化反応の異なる緩衝液ｐＨ値を考慮した。ｐＨ５．０以下で、誘導体化反応中にある程度の試料沈殿が観察された。試料沈殿を回避するために、ｐＨ５．０より上で沈殿が観察されなかったこと、及びｐＨ７．０以上で誘導体化反応が著しく低速になるという考慮に基づいて、誘導体化ｐＨとしてｐＨ６．０を選択した。対応して、ｐＫａ６．１３のＭＥＳを緩衝液系として選択した。緩衝液は、水酸化リチウムを使用して、５０ｍＭ ＭＥＳ溶液をｐＨ６．０まで滴定することによって調製した。緩衝液調製のための水酸化リチウムの使用は、ＬＹ−ＣＨのリチウム塩がナトリウム塩及びカリウム塩よりも高い可溶性を有するという考慮に基づいていた。緩衝液中にリチウムイオンを有する、結果として生じる可溶性の高いＬＹ−ＣＨは、誘導体化反応に対するより高いＬＹ−ＣＨ対ｍＡｂモル比の使用を可能にし、かつ誘導体化後の残留ＬＹ−ＣＨ試薬のより容易な除去を可能にする。最後に、考慮される別の因子は、酸化タンパク質試料が、より高い凝集性向を有する傾向があることであり、これが潜在的に誘導体化反応中の試料沈殿を引き起こし得る。その懸念に対処するために、界面活性剤としての還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を、最終濃度０．０５％または１％（重量対体積）まで誘導体化緩衝液中に添加した。還元されたＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００は、２８０ｎｍ及び４２８ｎｍでいかなる著しい吸光度も有しない。最終最適化緩衝液系を用いた場合、全ての後次分析において試料沈殿が観察されなかった。

【0146】

ＬＹ−ＣＨ対試料モル比及び誘導体化時間の最適化
ＬＹ−ＣＨ対試料モル比及び誘導体化時間は、様々な誘導体化条件におけるオキシ標準ｍＡｂの総カルボニル化レベルを定量化することによって最適化した。最初に、ＬＹ−ＣＨ対試料モル比を、５０、５００、１０００、１５００、２０００、４０００、６０００、８０００、及び１０，０００における様々なモル比での誘導体化の程度を評価することによって最適化した。反応混合物中の最終オキシ標準ｍＡｂ濃度（０．２ｍｇ／ｍＬ）、反応温度（３７℃）、及び反応時間（１８時間）などの全ての他の誘導体化条件は、標的条件において未変化であった。様々なモル比からの対応するカルボニル化レベル（図５）は、誘導体化反応が８０００のモル比で平坦域に至ることを示し、これを超えてカルボニル化レベルの著しい増加は観察されない。したがって、８０００のＬＹ−ＣＨ対試料モル比を、誘導体化反応の最終条件として選択した。同様に、反応時間を、８０００のモル比及び全ての他の誘導体化条件を標的条件で変更せず保持しながら、インキュベーション時間を変えることによって最適化した。結果として生じる総カルボニル化レベル（図６）は、誘導体化反応が１８時間で平坦域に達したことを示した。したがって、誘導体化反応の最終反応時間として１８時間を選択した。

【0147】

実施例４：ＣＡＬＹの評価
頑強性評価
ＣＡＬＹの頑強性を、他の方法条件は変更しないで１つの方法条件／パラメータにわずかな変更を適用すること、及びその後にオキシ標準ｍＡｂの総カルボニル化結果に対するこれらのわずかな変更の効果を評価することによって評価した。具体的には、誘導体化反応条件の効果、誘導体化後の試料の取り扱い及び分析プロセス、ならびに評価のためのＳＥＣ分析中の誘導体化試料の安定性を調査した。誘導体化反応条件について、異なるｍＡｂタンパク質濃度（０．４５、０．５０、及び０．５５ｍｇ／ｍＬ）、異なるＬＹ対ｍＡｂモル比（７０００：１、８０００：１、及び９０００：１）、ならびに誘導体化緩衝液の異なるｐＨ値（５．９、６．０、及び６．１）からのオキシ標準ｍＡｂの総カルボニル化レベルを比較した。図７Ａ〜７Ｂに示すように、カルボニル化レベルのごくわずかな変動が、反応タンパク質濃度またはＬＹ−ＣＨ対ｍＡｂモル比について観察された。緩衝液ｐＨ頑強性データから、ｐＨ６．１からの総カルボニル化レベルは、ｐＨ５．９及び６．０からのものよりわずかに低く（図７Ｃ）、これはｐＨ６．１でのわずかに遅い反応速度に起因する可能性があり、誘導体化緩衝液ｐＨの厳格な制御が、最適な方法頑強性に必須であり得ることを示唆する。

【0148】

試料の取り扱いプロセスについて、誘導体化後に、濾過による各緩衝液交換が、試料中に存在する残留ＬＹ−ＣＨの量をおよそ５０倍低減することに等しいことは述べるに値する。２回、３回、及び４回の緩衝液交換を使用する効果を調査して、様々な量の試料中の残留ＬＹ−ＣＨが、カルボニル化結果に影響を及ぼすか否かを理解する。図７Ｄに示すように、２回、３回、または４回の緩衝液交換による結果に有意差は観察されず、様々な量の誘導体化試料中の残留ＬＹ−ＣＨの存在が、結果にほとんど影響を及ぼさないことを実証する。サイズ排除分析について、誘導体化及び緩衝液交換したオキシ標準ｍＡｂの様々な注入体積（２０μＬ〜３０μＬ）を試験した。対応するカルボニル化レベルを図７Ｅに示し、この方法が、注入体積／量のわずかな変化に対して頑強であることを実証した。

【0149】

１回、２回、及び３回の冷凍（−８０℃）／解凍サイクルに供された誘導体化／緩衝液交換したオキシ標準ｍＡｂ試料の結果を、新たに調製した試料の結果と比較することによって、複数の冷凍／解凍サイクルでの試料の安定性を評価した。データ（図７Ｆ）は、誘導体化試料が、複数の冷凍／解凍サイクルに対して安定していたことを示した。ＨＰＬＣ分析の誘導体化試料の安定性を、ＨＰＬＣオートサンプラー（８℃で制御された温度）内で１、３、５、７、９、１１、１３、及び１５時間貯蔵された誘導体化及び緩衝液交換したオキシ標準ｍＡｂのカルボニル化レベルを測定することによって評価した。加えて、図８に示すように、測定したカルボニル化レベルに有意差は観察されず、誘導体化試料が、２〜８℃で少なくとも１５時間にわたって安定であることを支持する。

【0150】

全体として、オキシ標準ｍＡｂを試験試料として使用して、頑強性評価研究から合計３１のデータ点が生成され、１３．０ｎｍｏｌ／ｍｇの平均総カルボニル化レベルを示し、変化係数（ＲＳＤ）は２．４％である。これらのデータは、ＣＡＬＹが非常に頑強であることを支持する。

【0151】

特異性評価
特異性は、ｍＡｂ種以外の全ての試料緩衝液構成要素を有する試料ブランクを、誘導体化、緩衝液交換、及びＳＥＣ分析ステップに供することによって調査した。図３Ａ及び３Ｂに示すように、関心対象のピーク領域内（１０〜２２分）でピークが観察されず、緩衝液賦形剤が定量化プロセスを干渉しないこと、及びＣＡＬＹ方法がｍＡｂ試料の総タンパク質カルボニル化を測定するために特異的であることを実証した。

【0152】

検出限界及び定量化限界
検出限界（ＬＯＤ）及び定量化限界（ＬＯＱ）を、負の対照のカルボニル化レベルの標準偏差の３倍及び１０倍としてそれぞれ計算した。標準偏差は、様々なタンパク質濃度で繰り返し注入することで（合計２７データ点）、負の対照としてストレス無負荷かつ非誘導のｍＡｂを分析することによって、表１に示すように０．０５８ｎｍｏｌ／ｍｇであると判定された。次いで、ＣＡＬＹのＬＯＤ及びＬＯＱは、それぞれ０．２及び０．６ｎｍｏｌ／ｍｇであると判定された。

【0153】

表１．様々な濃度で繰り返し注入することによって、負の対照としてＬＹ−ＣＨによって誘導されないストレス無負荷のｍＡｂ試料からのカルボニル化レベル。これらのデータからの標準偏差、０．０５８１ｎｍｏｌ／ｍｇを、ＬＯＤ及びＬＯＱの判定に使用した。

【0154】

線形性及び精度
方法最適化及び頑強性研究後に、後次評価のためのオキシ標準ｍＡｂ試料の別のバッチを調製した。第２のバッチの総タンパク質カルボニル化レベルは、ＣＡＬＹによって、第１のバッチのレベルよりもわずかに低い、１１．５ｎｍｏｌ／ｍｇであると判定された。しかしながら、これは、線形性及び精度に関する後次の方法性能評価に影響を及ぼさない。簡潔性のために、第２のバッチのオキシ標準ｍＡｂは、以下でオキシ標準ｍＡｂ（ＩＩ）試料と称した。

【0155】

ＣＡＬＹの線形性を評価するために、オキシ標準ｍＡｂ（ＩＩ）をストレス無負荷のｍＡｂと、０対１００、２５対７５、５０対５０、７５対２５、及び１００対０（質量対質量）の比で混合することによって、一連の共混合試料を調製した。その後、共混合試料を、２つの検体によって、２つのＨＰＬＣ器具上で分析し、各分析者は、２つのサイズ排除カラム及び３つの独立した調製物を異なる３日に用いた。各共混合試料について、合計６回の独立した測定を実施した。図９に示すように、それぞれの共混合試料中のストレス負荷のｍＡｂのパーセンテージに対する比率で、測定した総タンパク質カルボニル化に対する線形応答を観察し、線形回帰率は０．９９７であった。このデータは、ＣＡＬＹが優れた線形性を有することを実証した。加えて、共混合試料の各々について、２名の分析者からの日内及び日間分析からの測定値からの変化係数（ＣＶ）は１５％を下回り、ＣＡＬＹの精度を実証する。

【0156】

実施例５：ＤＮＰＨ比色定量アッセイによるｍＡｂのタンパク質カルボニルレベルの判定
いくつかのｍＡｂ試料の総タンパク質カルボニル化レベルもまた、ＯｘｉＳｅｌｅｃｔ（商標）タンパク質カルボニル分光光度アッセイキット（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用することによって定量化した。３つの独立した調製を実施して、各試料の平均タンパク質カルボニル化レベルを報告した。

【0157】

ＤＮＰＨ分光光度アッセイとの比較
ＤＮＰＨ分光光度アッセイは、従来のタンパク質カルボニル化アッセイである。総タンパク質カルボニル化レベルを、オキシ標準ｍＡｂ（ＩＩ）、５０：５０共混合、及びストレス無負荷のｍＡｂについて、ＤＮＰＨ方法及びＣＡＬＹ方法によって測定し、２つの方法による結果がどれほど近いかを判定し、２つの方法の性能を比較した。全体として、図９及び１０に示すように、２つの方法から判定されたそれぞれのカルボニル化レベルは同様であるが、ＣＡＬＹ方法は、明らかに、ＤＮＰＨ方法からのものよりも良いアッセイ精度を明確に実証した。

【0158】

実施例６：ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理したｍＡｂのＣＡＬＹ分析
ＬＹ−ＣＨは、以前に、抗体のＮ−グリカンオリゴ糖残基上の過ヨウ素酸酸化によって形成されたアルデヒド基を定量化するために、誘導体化試薬として使用されていた。アミノ酸残基上のアルデヒド及びケトンとのＬＹ−ＣＨの反応性は、Ｎ−グリカンアルデヒドと同じでない場合があるため、ＬＹ−ＣＨが、ｍＡｂのアミノ酸残基上の金属触媒酸化的カルボニル化を定量化するために好適であるかどうかを評価した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理を伴う場合と伴わない場合の、ストレス無負荷及びフェントンストレス負荷したｍＡｂ試料の総タンパク質カルボニル化レベルを、ＣＡＬＹによって測定した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理は、Ｎ−グリカンをｍＡｂ試料から除去するため、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理後に測定したｍＡｂ試料の総タンパク質カルボニル化レベルは、ｍＡｂ上のアミノ酸残基上のカルボニル化に寄与する。図１１に示すように、ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理を伴う場合と伴わない場合の、オキシ標準ｍＡｂ（ＩＩ）試料の総タンパク質カルボニル化レベルは、それぞれ９．９ｎｍｏｌ／ｍｇ及び１１．９ｎｍｏｌ／ｍｇであった。これらのデータは、アミノ酸残基上の金属触媒カルボニル化を定量化することに関する、ＣＡＬＹの特定の好適性を確認する。加えて、これらのデータは、本研究において試験したフェントンの酸化条件下で、相当量のＮ−グリカンアルデヒドがｍＡｂ試料上で形成されなかったことを示す。

【0159】

ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理による脱グリコシル化
脱グリコシル化反応は、２５０μｇのｍＡｂ試料を、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中の１２５００単位のＰＮＧａｓｅ Ｆと、最終量１ｍＬまで混合することによって行った。混合物を、３７℃で１６時間インキュベートした。

【0160】

実施例７：様々な量のＦｅ（ＩＩ）及び過酸化水素を使用して酸化したｍＡｂのタンパク質カルボニルレベルの判定
表２に示す様々な最終濃度のＦｅ（ＩＩ）（４μＭ、２０μＭ、１００μＭ、及び５００μＭ）ならびに過酸化水素（８μＭ、４０μＭ、２００μＭ、及び１０００μＭ）の組み合わせを用いて、合計１６の条件を使用してｍＡｂ試料を調製した。最終ｍＡｂ濃度は、５ｍｇ／ｍＬであった。混合物を、室温で５０ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で２時間インキュベートした。その後、過剰量のメチオニン及びＥＤＴＡを添加することによって反応を停止させた。

【0161】

図１２Ａ、１２Ｂ、及び１２Ｃに示すように、総タンパク質カルボニル化レベルに対する様々な量のＦｅ（ＩＩ）及び過酸化水素の効果は、非常に複雑である。より低いＦｅ（ＩＩ）濃度（４μＭ及び２０μＭ）において、ストレス負荷したｍＡｂの総カルボニル化レベルは、広範囲の過酸化水素量（８μＭ〜１０００μＭ）を用いても、わずかに変化するだけであることが観察された。対照的に、試験した各過酸化水素濃度について、４μＭ〜５００μＭの範囲のより高いＦｅ（ＩＩ）濃度で、より高い総カルボニル化を示す一貫した傾向があった。これらのデータは、これらの指定したストレス条件下で、酸化的カルボニル化の程度が、過酸化水素の場合よりも、金属イオン濃度の変化に対して比較的より敏感であることを示唆すると思われる。したがって、Ｆｅ（ＩＩ）は、これらの条件下でｍＡｂ上のタンパク質カルボニル化を生じさせるために、過酸化水素よりも重要な因子であり得る。
表２．様々なＦｅ（ＩＩ）及びＨ２Ｏ２濃度（最終）での合計１６条件、最終ｍＡｂ濃度は５ｍｇ／ｍＬであり、酸化を室温で２時間実行した後、過剰量のＥＤＴＡ及びメチオニンを添加することによって反応停止させた。

【0162】

実施例８：貯蔵中のＰＳ２０製剤及び低レベルのＦｅ（ＩＩ）を用いたｍＡｂのタンパク質カルボニルレベルの判定
Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０（ＰＳ２０）は、抗体凝集に対処するために抗体製剤中で一般的に使用される界面活性剤であるが、ペルオキシドを含有することも知られている（Ｊａｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。ｍＡｂの貯蔵中に、ＰＳ２０からのペルオキシドは、鉄イオンと反応して、抗体カルボニル化を誘導することができる。貯蔵中のｍＡｂカルボニル化に対するＰＳ２０及び鉄の効果を調査するために、表３に示すように、様々な最終Ｆｅ（ＩＩ）（０．１μＭ及び０．８μＭ）及びＰＳ２０（０．０２％及び０．１６％、ｗ／ｖ）濃度で、５０ｍＭのコハク酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中でｍＡｂ試料を調製した。ＰＳ２０濃度は、ｍＡｂ製剤中の報告されたＰＳ２０濃度範囲に基づいている（Ｈａｗｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。Ｆｅ（ＩＩ）濃度は、報告された浸出鉄イオンの濃度範囲に基づいている（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。次いで、これらの試料を、暗所において室温で４、８、及び１６週間貯蔵した。各時点において、過剰なメチオニン及びＥＤＴＡを試料に添加して、カルボニル化反応を停止させた。その後、これらの試料を、ＣＡＬＹによる更なる分析まで−８０℃で貯蔵した。
表３．貯蔵実験のための様々なＦｅ（ＩＩ）及びＰＳ２０濃度（最終）での合計５条件Ｂ１は、対照として含めた。

【0163】

図１３に示すように、ＰＳ２０及びＦｅ（ＩＩ）を含有する４つの試料（Ｂ２〜Ｂ５）全てについて、貯蔵中にカルボニル化レベルの明らかな増加が観察された。比較すると、対照試料（Ｂ１）について、カルボニル化レベルの著しい変化は観察されなかった。これらのデータは、低レベルの鉄イオンが貯蔵中に存在する場合、ＰＳ２０製剤を含むｍＡｂが、カルボニル化の影響を受けやすいことを示した。興味深いことに、０．１６％のＰＳ２０（Ｂ５及びＢ３）を含む試料は、鉄濃度にかかわらず、一貫して、４、８、及び１６週目に、０．０２％のＰＳ２０（Ｂ４及びＢ２）を含む試料よりも高いレベルのカルボニル化を有していた。この観察は、ＰＳ２０が、これらの場合にｍＡｂカルボニル化に対して主要な効果を有していたことを示す。したがって、フリーラジカル源である可能性があるＰＳ２０からの過酸化水素は、貯蔵条件下でｍＡｂカルボニル化の程度を制限したより重要な因子になった。したがって、より多くの過酸化水素を含有する０．１６％のＰＳ２０製剤は、一貫してより高いレベルのタンパク質カルボニル化を有していた。これは更に、低レベルの鉄イオンの存在下で、界面活性剤の過酸化水素含有量が、貯蔵中にｍＡｂカルボニル化に対して著しい影響を有し得ることを示す。別の興味深い観察は、試料Ｂ３及びＢ５のカルボニル化レベルが、８週目〜１６週目まで著しく減少したことである。これらの試料のカルボニル化含有量の減少は、脱カルボニル化プロセスが存在し得ることを示す。

【0164】

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【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】