特許 6970234 細胞分泌プロファイルの分析およびスクリーニング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6970234

(24)【登録日】2021年11月1日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】細胞分泌プロファイルの分析およびスクリーニング

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20211111BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20211111BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 Y

   G01N33/53 P

   G01N37/00 102

【請求項の数】26

【外国語出願】

【全頁数】57

(21)【出願番号】特願2020-70276(P2020-70276)

(22)【出願日】2020年4月9日

(62)【分割の表示】特願2017-530184(P2017-530184)の分割

【原出願日】2015年12月3日

(65)【公開番号】特開2020-148778(P2020-148778A)

(43)【公開日】2020年9月17日

【審査請求日】2020年5月8日

(31)【優先権主張番号】62/087,147

(32)【優先日】2014年12月3日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517193327

【氏名又は名称】アイソプレキシス コーポレイション

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】パトリック パズコフスキー

(72)【発明者】

【氏名】ショーン マッケイ

(72)【発明者】

【氏名】ショーン マッカスカー

【審査官】 大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／０３１９９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０５２９８９（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特開２０１０−０６６１４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１１１５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６１６５７３９（ＵＳ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２６９０７８６（ＣＮ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０３０７９３１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１０−５３３８６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 YAO LU，HIGH-THROUGHPUT SECRETOMIC ANALYSIS OF SINGLE CELLS TO ASSESS FUNCTIONAL CELLULAR HETEROGENEITY，ANALYTICAL CHEMISTRY，米国，2013年02月19日，VOL:85, NR:4，PAGE(S):2548 - 2556，http://dx.doi.org/10.1021/ac400082e

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − ３３／９８

Ｇ０１Ｎ ３７／００

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞集団に付随する分析物を個別に解像するシステムであって、
細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、前記少なくとも１つの細胞から放出された付随する複数の分析物を保持する、複数の試料保持領域と；
複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、前記試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が前記複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する、複数の分析物検出領域と；
前記複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカー、および前記複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーと；
画像化装置であって、選択された試料保持領域、および保持された少なくとも１つの細胞、さらには少なくとも１つの第１のアライメントマーカーの、複数の第１の画像、ならびに、前記第１の画像とは異なる光学パラメータを有する複数の第２の画像であって、前記選択された試料領域に対応する分析物検出領域、および付随する分析物パターン、さらには少なくとも１つの第２のアライメントマーカーの、前記複数の第２の画像、を生成する、画像化装置と；
選択された試料保持領域の付随する画像を前記少なくとも１つの第１のアライメントマーカーを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、前記少なくとも１つの第２のアライメントマーカーを使用して、選択された試料保持領域に対応する画像とアライメントする、画像プロセッサであって、さらに、それぞれの試料保持領域内に保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、前記分析物パターンで検出された前記分析物検出成分に基づいて、個別に解像する、画像プロセッサと
を含む、システム。

【請求項2】

前記画像プロセッサがさらに、前記試料保持領域の画像を評価して、付随する試料保持領域の画像特性を決定する、請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記画像プロセッサが、前記試料保持領域の前記画像特性に基づいて、分析物および細胞の会合の解像をゲーティングする、請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

前記画像プロセッサがさらに、前記試料保持領域の画像を評価して、前記保持された少なくとも１つの細胞の画像特性を決定する、請求項１に記載のシステム。

【請求項5】

前記システムがさらに、前記保持された少なくとも１つの細胞を、前記複数の第１の画像および第２の画像との画像特性の比較によって識別するために、前記画像プロセッサによってアクセスされる複数の細胞画像を含む細胞鋳型データベースを含む、請求項４に記載のシステム。

【請求項6】

前記画像プロセッサが、前記保持された少なくとも１つの細胞を、前記細胞鋳型データベース中の少なくとも１つの細胞画像との画像特性の類似性に基づいて識別する、請求項５に記載のシステム。

【請求項7】

前記少なくとも１つの細胞が、前記複数の第１の画像および第２の画像のうち少なくとも１つにおいて少なくとも１つの表面マーカーの存在を識別する、少なくとも１つの抗体、染料または色素で標識され、そして細胞識別のために前記画像プロセッサによって使用される、請求項１に記載のシステム。

【請求項8】

前記少なくとも１つの細胞が、細胞が生きているかまたは死んでいるのかを識別するか、または細胞の代謝過程を強調表示する前記複数の第１の画像および第２の画像のうちの少なくとも１つにおいて検出された前記少なくとも１つの染料または色素で標識される、請求項１に記載のシステム。

【請求項9】

前記複数の第１の画像および第２の画像のうちの少なくとも１つにおいて検出された前記少なくとも１つの標識された細胞が、異なるタイプの細胞を区別するために前記画像プロセッサによって使用される、請求項７または請求項８に記載のシステム。

【請求項10】

選択された少なくとも１つの細胞に付随する、前記分析物パターンの少なくとも２つまたはそれ超の個別領域が、前記画像プロセッサによって評価されて、前記選択された少なくとも１つの細胞の放出された分析物が解像される、請求項１に記載のシステム。

【請求項11】

前記画像プロセッサがさらに、対応する保持された細胞を欠いている少なくとも１つの選択された試料保持領域を有する画像のバックグラウンド強度決定を行う、請求項１に記載のシステム。

【請求項12】

前記画像プロセッサが前記決定されたバックグラウンド強度を、評価されるべき選択された少なくとも１つの細胞に付随する前記分析物パターンの領域に付随する強度と比較して、前記選択された少なくとも１つの細胞の放出された分析物を解像する、請求項１１に記載のシステム。

【請求項13】

前記画像プロセッサがさらに、単一細胞を保持する試料保持チャンバを識別し、前記単一細胞の前記個別に解像された放出された分析物を比較して、前記細胞の集団の検出された分析物の分布を反映する、請求項１に記載のシステム。

【請求項14】

前記細胞の集団の検出された分析物の前記分布が、前記細胞の集団からの単一細胞の、複数の分析物を放出する多機能性の能力を特徴付ける、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

選択された分析物に付随する、患者、治療、または疾患の応答についての分析物プロファイルを含む分析物応答データベースをさらに含み、前記画像プロセッサが、前記細胞の集団の検出された分析物の前記分布を前記分析物応答データベースと比較して、前記細胞の集団中で検出された放出された分析物を、前記分析物応答データベース中の前記分析物プロファイルと相関させる、請求項１３に記載のシステム。

【請求項16】

前記分析物が、無機分子、核酸、ペプチド、抗体、サイトカイン、ケモカイン、およびイオンからなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。

【請求項17】

前記分析物が、生体分子イオンである、請求項１に記載のシステム。

【請求項18】

前記分析物が、有機分子である、請求項１に記載のシステム。

【請求項19】

前記分析物が、タンパク質である、請求項１に記載のシステム。

【請求項20】

前記分析物が、前記細胞の集団からの前記少なくとも１つの細胞によって分泌されたサイトカインまたはタンパク質を含み、ＣＣｌ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、パーフォリン、ＲＡＮＴＥＳ、ｓＣＤ１３７、ｓＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦ−β１、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。

【請求項21】

前記細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、マクロファージ細胞、樹状細胞、上皮細胞および悪性細胞からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。

【請求項22】

前記細胞が、脳細胞である、請求項１に記載のシステム。

【請求項23】

前記細胞が、腫瘍細胞である、請求項１に記載のシステム。

【請求項24】

前記細胞が、疾患細胞である、請求項１に記載のシステム。

【請求項25】

細胞集団に付随する分析物を個別に解像するための方法であって、
細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、前記少なくとも１つの細胞から放出された付随する複数の分析物を保持する複数の試料保持領域の、複数の第１の画像を取得するステップと；
前記第１の画像とは異なる光学パラメータを有する複数の第２の画像を取得するステップであって、前記第２の画像が、複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、前記試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が前記複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する複数の分析物検出領域の画像である、取得するステップと；
前記複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカーを解像するステップと；
前記複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーを解像するステップと；
選択された試料保持領域の付随する画像を、前記複数の第１のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、前記複数の第２のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントするステップと；
それぞれの試料保持領域内に保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、前記保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、前記分析物パターンで検出された前記分析物検出成分に基づいて、個別に解像するステップと
を含む、方法。

【請求項26】

細胞集団に付随する分析物を個別に解像するためのコンピュータ実行可能なコードがメモリーされている、１つまたは複数の非一過性コンピュータ可読媒体であって、前記コードが、
細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、前記少なくとも１つの細胞から放出された付随する複数の分析物を保持する複数の試料保持領域の、複数の第１の画像を取得するための実行可能なルーチンと；
前記第１の画像とは異なる光学パラメータを有する複数の第２の画像を取得するための実行可能なルーチンであって、前記第２の画像が、複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、前記試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が前記複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する複数の分析物検出領域の画像である、取得するための実行可能なルーチンと；
前記複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカーを解像するための実行可能なルーチンと；
前記複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーを解像するための実行可能なルーチンと；
選択された試料保持領域の付随する画像を、前記複数の第１のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、前記複数の第２のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントするための実行可能なルーチンと；
それぞれの試料保持領域内に保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、前記保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、前記分析物パターンで検出された前記分析物検出成分に基づいて、個別に解像するための実行可能なルーチンと
を含む、１つまたは複数の非一過性コンピュータ可読媒体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１４年１２月３日に出願された「ＭＥＴＨＯＤ ＡＮＤ ＳＹＳＴＥＭ ＦＯＲ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＩＭＭＵＮＥ ＣＥＬＬＳ ＦＯＲ ＳＩＮＧＬＥ−ＣＥＬＬ ＦＵＮＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＰＯＬＹ−ＦＵＮＣＴＩＯＮ ＰＲＯＦＩＬＥ」と題する米国仮特許出願番号第６２／０８７，１４７号（代理人書類番号第ＩＰＸ−０２００ ＰＲＯ号）に基づく利益を主張しており、この仮特許出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。

【0002】

（開示の分野）
本発明は、一般に細胞分析に関し、より詳細には、細胞状態の生化学的アセスメントおよび機能的特徴付けのための装置、方法、およびソフトウェアに関する。

【背景技術】

【0003】

（背景）
細胞生物学および免疫学を含む諸分野では、細胞タンパク質発現および分泌プロファイルの評価および定量のための分析技法を開発することが、根底にある生化学的プロセスおよび細胞シグナル伝達機構を解明する上でかなり重要である。細胞が不均一な挙動を示すことが多いことを一因として、多数の個別の細胞集団をアッセイすることができ、また単一細胞レベルで生体分子を検出するのに適している、ツールおよび手順が必要とされている。細胞の表現型および機能性の感度が良く正確なアセスメント、ならびに個々の細胞間のドライバーおよび相互作用の識別が、生物学的系の能力および働きの重要な指標であることが示されている。

【0004】

一例として、免疫細胞応答は、ある範囲の細胞挙動および細胞間シグナル伝達プロセスを仲介する重要な機能的制御因子を代表するサイトカイン、ケモカインおよび増殖因子を含む、多数の分泌タンパク質によって方向付けられる。これらの複雑な免疫シグナル伝達経路および細胞相互作用を監視することは、その免疫系の状態を理解し、臨床結果を予測し、処置または治療を方向付けるために使用できる臨床的に関係する測定値を識別することに関し、かなりの困難性となる。疾患の相関物、様々な化学薬品および治療剤に対する細胞応答、および免疫学的介入に関与する他の細胞ベースのプロセスを識別し迅速に評価するために使用できる、細胞分析のための感度が良く高度に多重化された技術がますます求められている。このような技術はまた、免疫の根底にある機構をより良く理解するために使用することもできる。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

（開示の要旨）
本開示は、細胞プロセスおよび機能プロファイルを決定および調査するのに有用な装置、方法およびソフトウェアを提供する。様々な実施形態では、本教示は、免疫細胞の細胞分析の状況において有利に適用することができる。例えば、様々な治療、化学的相互作用および／または疾患状態に対するＴ細胞機能性および相関応答を単一細胞レベルでアセスメントすることができる。

【0006】

様々な実施形態では、多種多様な細胞ベースの、分泌物、発現タンパク質、および他の細胞成分を検出できる機器プラットフォームを使用して実施される、生物学的スクリーニングおよび分析を行うための装置、方法およびソフトウェアが開示される。プラットフォームは、多数の個別の試料が個々に隔離され評価されて、試料由来の成分を高度に並列化され、かつスケーラブルな様式で検出または識別できるように、複数の生物成分の同時多重化検出用に構成することができる。様々な実施形態では、プラットフォームは、自動化または半自動化処理用に構成されて、結果を得るまでの時間、試料スループット、検出精度、および感度が大幅に改善される。

【0007】

上記プラットフォームは、少数の細胞および単一細胞を分析する用途における使用のために有利に適合させることができる。本明細書に開示されるように、単一細胞、および単一細胞間の細胞相互作用（例えば細胞間相互作用）の分析は、Ｂ細胞、Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞）、および／またはマクロファージ細胞などの免疫細胞の機能プロファイルの決定を助ける、免疫学的用途で特に有用である。様々な例およびワークフローが、免疫細胞を含めて提供され論じられるが、本教示の装置、方法およびソフトウェアは、多種多様な異なる細胞型と一緒に使用することに適合させることができることを理解されたい。さらに、その試料分析技法は、細胞または生物学の分析用途の範囲を越えて拡張されて、多数の個別試料が望ましくは複数の異なる分析物について実質的に同時に評価される、他の化学的調査に使用することができる。加えて、細胞以外の試料成分を、例えば、化学物質、化合物、または目的の他の分析物を含むビーズまたは他の粒子を、並行して評価することもできる。様々な実施形態では、本明細書に開示の技術は、非常に少量で存在する液体または水の体積（例えば、ナノリットルおよびピコリットルの体積またはそれ未満）中の複数の分析物を検出、区別、および定量するのに、十分に感度が良い。

【0008】

様々な実施形態では、細胞集団に付随する分析物を個別に解像するシステムであって、（ａ）細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、少なくとも１つの細胞から放出された付随する複数の分析物を保持する、複数の試料保持領域と、（ｂ）複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する、複数の分析物検出領域と、（ｃ）複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカー、および複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーと、（ｄ）選択された試料保持領域、および保持された少なくとも１つの細胞、および追加の少なくとも１つの第１のアライメントマーカーの、複数の画像を生成する画像化装置であって、選択された試料領域に対応する分析物検出領域、および付随する分析物パターン、さらには少なくとも１つの第２のアライメントマーカーの、複数の画像をさらに生成する画像化装置と、選択された試料保持領域の付随する画像を少なくとも１つの第１のアライメントマーカーを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、少なくとも１つの第２のアライメントマーカーを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントする、画像プロセッサであって、さらに、それぞれの試料保持領域内の保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、分析物パターンで検出された分析物検出成分に基づいて、個別に解像する画像プロセッサとを含む、システムが記載される。

【0009】

他の実施形態では、細胞集団に付随する分析物を個別に解像するための方法であって、（ａ）細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、少なくとも１つの細胞によって放出された付随する複数の分析物を保持する複数の試料保持領域の、複数の画像を取得するステップと、（ｂ）複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する複数の分析物検出領域の、複数の画像を取得するステップと、（ｃ）複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカーを解像するステップと、（ｄ）複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーを解像するステップと、（ｅ）選択された試料保持領域の付随する画像を、複数の第１のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、複数の第２のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントするステップと、（ｆ）それぞれの試料保持領域内の保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、分析物パターンで検出された分析物検出成分に基づいて、個別に解像するステップとを含む、方法が記載される。

【0010】

さらなる実施形態では、細胞集団に付随する分析物を個別に解像するためのコンピュータ実行可能なコードがメモリーされている、非一過性コンピュータ可読媒体であって、このコードが、（ａ）細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、少なくとも１つの細胞によって放出された付随する複数の分析物を保持する複数の試料保持領域の、複数の画像を取得するための実行可能なルーチンと、（ｂ）複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する複数の分析物検出領域の、複数の画像を取得するための実行可能なルーチンと、（ｃ）複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカーを解像するための実行可能なルーチンと、（ｄ）複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーを解像するための実行可能なルーチンと、（ｅ）選択された試料保持領域の付随する画像を、複数の第１のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、複数の第２のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントするための実行可能なルーチンと、（ｆ）それぞれの試料保持領域内の保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、分析物パターンで検出された分析物検出成分に基づいて、個別に解像するための実行可能なルーチンとを含む、非一過性コンピュータ可読媒体が記載される。

【0011】

特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
細胞集団に付随する分析物を個別に解像するシステムであって、
細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、前記少なくとも１つの細胞から放出された付随する複数の分析物を保持する、複数の試料保持領域と、
複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、前記試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が前記複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する、複数の分析物検出領域と、
前記複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカー、および前記複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーと、
選択された試料保持領域、および保持された少なくとも１つの細胞、および追加の少なくとも１つの第１のアライメントマーカーの、複数の画像を生成する画像化装置であって、前記選択された試料領域に対応する分析物検出領域、および付随する分析物パターン、さらには少なくとも１つの第２のアライメントマーカーの、複数の画像をさらに生成する画像化装置と、
選択された試料保持領域の付随する画像を前記少なくとも１つの第１のアライメントマーカーを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、前記少なくとも１つの第２のアライメントマーカーを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントする、画像プロセッサであって、さらに、それぞれの試料保持領域内の保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、前記保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、前記分析物パターンで検出された分析物検出成分に基づいて、個別に解像する画像プロセッサと
を含む、システム。
（項目２）
前記画像プロセッサがさらに、前記試料保持領域の画像を評価して、付随する試料保持領域の画像特性を決定する、項目１に記載のシステム。
（項目３）
前記画像プロセッサが、前記試料保持領域の前記画像特性に基づいて、分析物および細胞の会合しの解像をゲーティングする、項目２に記載のシステム。
（項目４）
前記画像プロセッサがさらに、前記試料保持領域の画像を評価して、前記保持された少なくとも１つの細胞の画像特性を決定する、項目１に記載のシステム。
（項目５）
前記システムがさらに、前記保持された少なくとも１つの細胞を、複数の細胞画像との画像特性の比較によって識別するために前記画像プロセッサによってアクセスされた、前記複数の細胞画像を含む細胞鋳型データベースを含む、項目４に記載のシステム。
（項目６）
前記画像プロセッサが、前記保持された少なくとも１つの細胞を、前記細胞鋳型データベース中の少なくとも１つの細胞画像との画像特性の類似性に基づいて識別する、項目５に記載のシステム。
（項目７）
少なくとも１つの表面マーカーの存在を前記複数の画像のうちの少なくとも１つにおいて識別する、少なくとも１つの染料または色素で標識された少なくとも１つの細胞が、細胞識別のために前記画像プロセッサによって使用される、項目１に記載のシステム。
（項目８）
前記複数の画像のうちの少なくとも１つにおいて検出された前記少なくとも１つの染料または色素が、細胞が生きているかまたは死んでいるのかを識別するか、または細胞の代謝過程を強調表示する、項目７に記載のシステム。
（項目９）
前記複数の画像のうちの少なくとも１つにおいて検出された前記少なくとも１つの染料または色素が、異なるタイプの細胞を区別するために前記画像プロセッサによって使用される、項目７に記載のシステム。
（項目１０）
選択された少なくとも１つの細胞に付随する、前記分析物パターンの少なくとも２つまたはそれ超の個別領域が、前記画像プロセッサによって評価されて、前記選択された少なくとも１つの細胞の放出された分析物が解像される、項目１に記載のシステム。
（項目１１）
前記画像プロセッサがさらに、対応する保持された細胞を欠いている少なくとも１つの選択された試料保持領域を有する画像のバックグラウンド強度決定を行う、項目１に記載のシステム。
（項目１２）
前記画像プロセッサが前記決定されたバックグラウンド強度を、評価されるべき選択された少なくとも１つの細胞に付随する前記分析物パターンの領域に付随する強度と比較して、前記選択された少なくとも１つの細胞の放出された分析物を解像する、項目１１に記載のシステム。
（項目１３）
前記画像プロセッサがさらに、単一細胞を保持する試料保持チャンバを識別し、前記単一細胞の個別に解像された前記放出された分析物を比較して、前記細胞の集団の検出された分析物の分布を反映する、項目１に記載のシステム。
（項目１４）
前記細胞の集団の検出された分析物の前記分布が、前記細胞の集団からの単一細胞の、複数の分析物を放出する多機能性の能力を特徴付ける、項目１３に記載のシステム。
（項目１５）
選択された分析物に付随する、患者、治療、または疾患の応答についての分析物プロファイルを含む分析物応答データベースをさらに含み、前記画像プロセッサが、前記細胞の集団の検出された分析物の前記分布を前記分析物応答データベースと比較して、前記細胞の集団中で検出された放出された分析物を、前記分析物応答データベース中の前記分析物プロファイルと相関させる、項目１３に記載のシステム。
（項目１６）
前記分析物が、生体分子、有機分子、無機分子、核酸、ペプチド、タンパク質、抗体、サイトカイン、ケモカイン、およびイオンからなる群から選択される、項目１に記載のシステム。
（項目１７）
前記分析物が、前記細胞の集団からの前記少なくとも１つの細胞によって分泌されたサイトカインまたはタンパク質を含み、ＣＣｌ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、パーフォリン、ＲＡＮＴＥＳ、ｓＣＤ１３７、ｓＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦ−β１、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される、項目１に記載のシステム。
（項目１８）
前記細胞が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、マクロファージ細胞、樹状細胞、上皮細胞、脳細胞、腫瘍細胞、悪性細胞および疾患細胞からなる群から選択される、項目１に記載のシステム。
（項目１９）
細胞集団に付随する分析物を個別に解像するための方法であって、
細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、前記少なくとも１つの細胞から放出された付随する複数の分析物を保持する複数の試料保持領域の、複数の画像を取得するステップと、
複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、前記試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が前記複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する複数の分析物検出領域の、複数の画像を取得するステップと、
前記複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカーを解像するステップと、
前記複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーを解像するステップと、
選択された試料保持領域の付随する画像を、前記複数の第１のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、前記複数の第２のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントするステップと、
それぞれの試料保持領域内の保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、前記保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、前記分析物パターンで検出された前記分析物検出成分に基づいて、個別に解像するステップと
を含む、方法。
（項目２０）
細胞集団に付随する分析物を個別に解像するためのコンピュータ実行可能なコードがメモリーされている、１つまたは複数の非一過性コンピュータ可読媒体であって、前記コードが、
細胞の集団から分配された少なくとも１つの細胞を受け入れるとともに、前記少なくとも１つの細胞から放出された付随する複数の分析物を保持する複数の試料保持領域の、複数の画像を取得するための実行可能なルーチンと、
複数の個別に位置付けられた分析物検出成分がパターン化された複数の分析物検出領域であって、前記試料保持領域とアライメント可能な規則正しいパターンで配置され、それによって、カップリングすると、放出された分析物が前記複数の分析物検出成分と選択的に会合して、分析物検出領域ごとに分析物パターンを形成する複数の分析物検出領域の、複数の画像を取得するための実行可能なルーチンと、
前記複数の試料保持領域のまわりに配置された複数の第１のアライメントマーカーを解像するための実行可能なルーチンと、
前記複数の分析物検出領域のまわりに配置された複数の第２のアライメントマーカーを解像するための実行可能なルーチンと、
選択された試料保持領域の付随する画像を、前記複数の第１のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用してアライメントし、さらに、分析物検出領域の画像を、前記複数の第２のアライメントマーカーのうちの少なくとも１つを使用して、選択された試料保持領域の対応する画像とアライメントするための実行可能なルーチンと、
それぞれの試料保持領域内の保持された少なくとも１つの細胞、および対応する分析物パターンを識別して、前記保持された少なくとも１つの細胞に付随する放出された分析物を、前記分析物パターンで検出された前記分析物検出成分に基づいて、個別に解像するための実行可能なルーチンと
を含む、１つまたは複数の非一過性コンピュータ可読媒体。
開示された実施形態のさらなる目的および利点は、一部は以下の説明に呈示され、一部はその説明から明らかであり、あるいは、開示された実施形態の実践によって理解することができる。開示された実施形態の目的および利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘されている要素および組合せによって実現および達成される。上記の一般的な説明も以下の詳細な説明も、例示的および説明的なものにすぎず、特許請求の範囲で呈示されるような開示された実施形態の範囲を制限するものではないことを理解されたい。

【0012】

本開示のこれらおよび他の実施形態について、以下の例示的および非限定的な説明図を参照して論じ、図中において、同じ要素には同様に番号が付けられている。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1AB】図１Ａは、本開示による試料分析を行うための例示的な高レベルワークフローを示す。

【0014】

図１Ｂは、本開示による試料分析を行うための例示的な高レベルワークフローを図示する。

【0015】

【図1C】図１Ｃは、本開示による例示的な試料アレイおよび分析物検出基材を拡大サブ部分とともに示す。

【0016】

【図1D】図１Ｄは、本開示による試料アレイデータの画像化および解像のための例示的な詳細分析ワークフローを示す。

【0017】

【図1E】図１Ｅは、本開示による試料アレイのサブ領域の多重画像化に付随する処理の例示的な概要を示す。

【0018】

【図1F】図１Ｆは、本開示による試料アレイおよび細胞／粒子状物質の選択されたサブ領域の例示的な画像化を示す。

【0019】

【図1G】図１Ｇは、本開示による分析物パターンおよびアライメントマーカーに対する例示的なシグナルスキャンを示す。

【0020】

【図1H】図１Ｈは、本開示による、試料アレイの例示的な明視野画像パネルおよび蛍光画像パネルを、対応する分析物検出基材の付随する画像パネル、および画像パネルの組合せ（マージング）とともに示す。

【0021】

【図2】図２は、本開示による試料保持領域位置決定および解像の例示的なプロセスを示す。

【0022】

【図3】図３は、本開示によるアライメント特徴の位置特定のための例示的な方法を示す。

【0023】

【図4】図４は、本開示による試料保持領域識別プロセスの例示的な操作を図示する。

【0024】

【図5】図５は、本開示によるアライメント特徴位置特定および解像のための例示的なプロセスを示す。

【0025】

【図6A】図６Ａは、本開示による例示的な細胞／粒子状物質位置識別プロセスを示す。

【0026】

【図6B】図６Ｂは、本開示による試料領域境界の例示的な細胞検出および可視化方法を図示する。

【0027】

【図6CD】図６Ｃは、本開示による例示的な細胞鋳型整合プロセスを示す。

【0028】

図６Ｄは、本開示による例示的な細胞鋳型整合プロセスを示す。

【0029】

【図6E】図６Ｅは、本開示による細胞／粒子状物質鋳型ライブラリーを生成する例示的なプロセスを示す。

【0030】

【図7A】図７Ａは、本開示に従って、画像およびスキャンをアライメントするための例示的なワークフローを示す。

【0031】

【図7B】図７Ｂは、本開示に従って、アライメントマーカーを使用して例示的な画像およびスキャンに適用される例示的な作業について説明する。

【0032】

【図7C】図７Ｃは、本開示に従って、第１および第２の画像をアライメントするための例示的な方法を示す。

【0033】

【図7D】図７Ｄは、本開示に従って、第１および第２の画像をアライメントするための例示的なプロセスについて説明する。

【0034】

【図8A】図８Ａは、本開示に従って、特徴を関連付けおよびアライメントするための例示的なプロセス８００を示す。

【0035】

【図8B】図８Ｂは、本開示に従って、特徴を関連付けおよびアライメントするための例示的なプロセスについて説明する。

【0036】

【図9A】図９Ａは、本開示に従って、細胞／粒子状物質の位置を識別および区別するための例示的な方法を示す。

【0037】

【図9B】図９Ｂは、本開示に従って、例示的な、表面マーカーで標識された細胞を位置付け、および区別するプロセスについて説明する。

【0038】

【図10A】図１０Ａは、本開示に従って、試料保持領域の画像／分析物スキャンをマージするための例示的なプロセスを示す。

【0039】

【図10B】図１０ｂは、本開示に従って、例示的な画像化および画素比較プロセスについて説明する。

【0040】

【図10C】図１０Ｃは、本開示に従って、例示的な試料保持領域に対してマーカーパターンと関連付けられたペアワイズ読み出しを示す、画像化および画素比較プロセスの例について説明する。

【0041】

【図11】図１１は、本開示に従って、はずれ値データおよびシグナルをゲーティングするための例示的なプロセスを示す。

【0042】

【図12A】図１２Ａは、本開示に従って、交差する分析物検出領域を有する試料保持領域の一部分の例示的な画像を説明する。

【0043】

【図12B】図１２Ｂは、本開示に従って、複数の分析物を評価するための例示的な散布図を示す。

【0044】

【図12C】図１２Ｃは、本開示に従って、２つの細胞の細胞型と関連付けられた、検出された分析物に由来するマーカーパターン／読み出しに関する例示的な画像化結果について説明する。

【0045】

【図13】図１３は、本開示に従って、分析物のデータおよび結果を提示および解釈するための例示的な方法およびツールを示す。

【0046】

【図14A】図１４Ａは、本開示に従って、実験結果を評価するための例示的なデータベースインターフェースを示す。

【0047】

【図14B】図１４Ｂは、本開示に従って、実験からの情報を表示するための例示的な結果インターフェースを示す。

【0048】

【図14C】図１４Ｃは、本開示に従って、分析機能性およびデータベース照会のためのワークフローを示す。

【0049】

【図14D】図１４Ｄは、本開示に従って、画像取得のための構成要素、ならびに画像分析および後続する分析物評価のための計算処理構成要素を含む例示的なプラットフォームを示す。

【発明を実施するための形態】

【0050】

（詳細な説明）
生物学的な系または試料の状態もしくは能力を特徴付ける努力は、バルク分析法によって混乱することも不明瞭になることもある。このことは、通常の量または媒体で分析される多くの細胞を含む試料が分析物をマスクまたは希釈するように作用し得る、免疫学的調査などの細胞分析において明らかである。したがって、多くの事例において、非常に少量および単一の細胞試料分析能力を提供することが望ましい。単一または少数の細胞を含むような小試料量では、複数の試料を個別の反応領域または区域に隔離することがさらに望ましく、したがって、これらを並行分析にかけることができる。このような方法では、試料を均一かつ個別に処置する能力を提供しながら、試料間クロストークおよび汚染を回避する必要があり得る。正確で感度の良いデータをスケーラブルな、かつ多重化されたフォーマットで、最小限のユーザ介入によって収集することもまた重要である。

【0051】

個別細胞分析を特に適用できる生化学的分析の特定の例は、個々の細胞からの、または細胞間相互作用により生じる分泌タンパク質に基づく機能的状態の評価に関する。免疫細胞分析を含むモデルシステムでは、細胞タンパク質または化学的分泌プロファイルを単一細胞レベルで免疫応答の質と相関させ得る。例えば、複数のサイトカインにより、ＣＤ４およびＣＤ８の両方の細胞集団で、分化ステージを定義または区別することができる。さらに、中央メモリー細胞およびメモリー／エフェクター細胞は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン２（ＩＬ２）、および／またはインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）などの特定のサイトカインを分泌する増加する可能性と関連付けることができる。対照的に、主にＩＦＮ−γを産生および分泌する細胞は、プログラム細胞死（例えばアポトーシス）関連する末期分化型エフェクターをより示しやすい可能性がある。

【0052】

ＣＤ４細胞において実証されるものなどの、複数の潜在的な機能的表現型のスクリーニングを容易にするため、ならびに細胞免疫応答と関連付けられるものなどの多機能性の測定を可能にするために、複数の分析物を同時に分析することが望ましい。このような分析では、個々の、または少数の細胞から実質的に同時に複数の分析物を検出することを可能にすることがさらに望ましく、この場合、何百、何千、何百万の、またはそれ超の個別の細胞、試料、および／または個別の細胞相互作用が多数の分析物について評価される。さらに、細胞または試料集団ごとにスクリーニングされる分析物の数は、各試料について、比較的少ない（例えば、約１個から５個の間の分析物）またはより多い（例えば、約５個から１００個の間の分析物）数と、おそらくはさらに多い（例えば、１００個より多い分析物）数との間であり得る。

【0053】

多くの個別試料を多くの異なる分析物について望ましくは評価できる高度に多重化されたシステムでは、関連データを迅速かつ正確に取得すること、および高品質分析を行うことに関して、特別な困難性が生じる。このようなシステムによって同時に分析されるべき個別試料が小スケールおよび多数であることにより、これらの分析を高度の自動化および／またはユーザに依存しないコンピュータによる分析を用いずに適切に行うことを実施不能にし得る。このことは特に、何百、何千、またはそれ超の個別試料を評価することが意図された単一細胞技術および細胞分析システムを開発することでは明らかである。

【0054】

例示的な単一細胞分析技術は、最近、例えば、「High-Throughput Secretomic Analysis of Single Cells to Assess Functional Cellular Heterogeneity」、Analytical Chemistry、２０１３年、８５巻、２５４８〜２５５６頁、「Microfluidics-Based Single-Cell Functional Proteomics for Fundamental and Applied Biomedical Applications」、Annual Review of Analytical Chemistry、２０１４年、７巻、２７５〜９５頁、および「Single-cell technologies for monitoring immune systems」、Nature Immunology、２０１４年、１５巻、２号、１２８〜１３５頁に記載されており、分泌タンパク質を細胞ごとのベースで測定することができる。加えて、単一細胞分析および少数細胞分析のための例示的な装置およびプラットフォームが、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５６４５４号（ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０１４０３１９９７）、米国特許出願第１２／１７４，６０１号（米国特許出願公開第２００９／００３６３２４号）、米国特許出願第１２／１７４，５９８号（米国特許出願公開第２００９／００５３７３２号）、米国特許出願第１２／８５７５１０号（米国特許第８，８６５，４７９号）、および米国特許出願第１３／１３２８５８号（米国特許出願公開第２０１２／００１５８２４号）に開示されている。

【0055】

本明細書において以下でより詳細に記載するように、前述の単一細胞分析および少数細胞分析プラットフォームなどのシステムおよび技術は、スループット、精度、推論発見、および結果信頼度を改善する本教示の自動化および半自動化分析法から利益を得るように適合させることができる。さらに、本教示の装置、方法、およびソフトウェアは、複数の分析物が、各試料について検出、識別、および定量されるものを含む、多重化された化学的分析、生化学的分析、または細胞分泌物分析を行うときに、非常に多数の個別試料の分析を容易にすることができる。

【0056】

様々な実施形態によれば、開示された検出法は、例えば、生物学的な系（例えば、免疫細胞）に関連する生化学的物質、細胞分泌物、および／または発現タンパク質を含む、多種多様な化合物を多重化した手法で分析するのに使用することができる。加えて、（細胞間相互作用を含む）単一または少数の細胞と関連する複数の異なるタンパク質および／または化合物を検出および分析して、被験体または試料についての例示的な細胞集団、細胞サブ集団、または単一細胞の応答または状態を反映する細胞分泌物または発現プロファイルを生成することができる。

【0057】

免疫学的分析の状況において、免疫細胞の表現型および機能性の不均一性と、免疫細胞分化の柔軟性とにより、バルクで細胞を分析する従来の方法では、がんなどの疾患および病原体などの感染因子に対抗する免疫防御の相互関係を定義または識別することにおいて、困難が生じる。免疫防御に関連する分泌プロファイルおよび発現プロファイルは、個人の免疫を予知する潜在的に有用で測定可能なものである。このようなプロファイルは、病原体、疾患、または処置に対する反応を評価および定量するのに使用することができ、臨床的分析に役立つツールになる。

【0058】

防御免疫の相関物（例えばＴ細胞と会合している）は、防御の程度が既知の細胞表現型および／または細胞の表面マーカーと明確に一致しないか、または類似性がないかも知れないので、少なくとも部分的に識別することが免疫学者にとっては特に困難性であった。さらに、ＴＨ１細胞（Ｉ型ヘルパーＴ細胞）の機能プロファイルは、ネイティブなＣＤ４ Ｔ細胞から分化した主要な機能サブセットの１つであり、それらの多様なサイトカインプロファイルによって反映される顕著な不均一性を示した。フローサイトメトリーに基づく従来の方法を使用して、エフェクターＴ細胞の機能分析により細胞の機能的サブセットの区別を試みた。これらの細胞のグループ分け、またはクラスのそれぞれが、細菌感染によって誘発されるものなどの免疫応答の中で、サイトカインの異なる組合せを産生および放出できることが示された。

【0059】

様々な実施形態では、本開示のシステムおよび方法は、（免疫細胞または免疫応答に結び付いた関連するような）細胞分泌物および／または細胞シグナルを測定する新規の方法を提供する。分析は、（細胞間相互作用を含む）単一または少数の細胞レベルで行うことができ、複数のサイトカインのエフェクターレベルを細胞あたり比較的多数の細胞にわたって並行して評価することができる。

【0060】

本明細書で以下でより詳細に記載するように、開示された方法は、細胞保持領域または区域を区別すること、細胞／粒子状物質を識別および分類すること、系統的誤差に対処すること、および分析ワークフローを自動化することに関連した特定の問題に対処する分析プラットフォームの性能を強化および改善して、何百、何千、何百万の、またはそれ超の個別細胞または試料を並行して分析するのに必要な、スループット感度が高く、かつ正確なアセスメントを可能にする。このような方法は、既存の分析プラットフォームおよび技術を改善するように有利に使用して、免疫応答に含まれ、かつ相関するような、多くの異なるタイプの細胞多機能性を理解し調査するために使用できる、有用な発見ツールおよびスクリーニングツールを創製し得る。

【0061】

図１Ａ／１Ｂは、試料分析を行うための例示的な高レベルワークフロー１００を示す。この分析には、１つまたは複数の選択された試料供給源（例えば、疾患、病原体、または治療処置に化学的に応答する、選択された生物学的症状を表す個体または培養から得られた細胞）から回収または収集された細胞、ビーズ、または他の粒子１０６の集団もしくは分布を含む１つまたは複数の試料１０２、１０４の評価が含まれ得る。分析されるべき選択された、または所望の試料を含む細胞、ビーズもしくは粒子の１つまたは複数の集団が参照される本開示によれば、検出および評価されるべき分析物に関連した他のタイプの粒子状物質もまた、試料を含むことができる。さらに、試料は、集合して分析されるべき材料の１つまたは複数の混合集団を形成する細胞、ビーズ、または他の粒子の様々な別個の、または異なる集団を含むことができる。「細胞」または「ビーズ」への参照は、付随する分析物について分析できる粒子の例示的なクラスとして意図されていることを理解されたい。すなわち、本教示は、粒子状物質１０６の多種多様な異なるタイプおよび組成物に、本教示の範囲から逸脱することなく適用することができる。

【0062】

上記で言及されたように、試料１０２、１０４の細胞／粒子状物質１０６は、複数の分析物１０８と会合した、またはそれを含む成分について評価される。本開示による分析物１０８は多くの形態を取ることができる。例えば、分析物１０８は、細胞／粒子状物質１０６に会合するか、分泌されるか、または放出される、水性媒体（例えば、細胞培養培地）または流体／半流体キャリア中で壊れやすいか、分散するか、拡散するか、または溶解する化学物質、化合物または材料を含み得る。分析物１０８はさらに、核酸、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原、増殖因子、タンパク質、抗体、サイトカイン、ケモカイン、または他の分子などの生体分子もしくは有機分子を含み得る。分析物１０８はさらに、細胞／粒子状物質１０６と会合し、分泌され、または放出されるイオンまたは無機化学物質などの、他のタイプの材料または化合物を含み得る。

【0063】

様々な実施形態によれば、本開示の装置および方法は、試料１０２、１０４に含まれるか、またはそれを含む個別の単一または少数の細胞に会合した、低濃度の分析物１０８の分析に特によく適している。このような分析物１０８は、望ましくは高度に多重化した手法で並行して分析される細胞試料１０２、１０４によって分泌または放出される、例えば細胞膜に会合するタンパク質、サイトカイン、ケモカインまたは他の生化学的物質を含み得る。試料集団またはその細胞成分はさらに、第２の試験、異常／疾患の、または処理された細胞集団と比較された第１の対照、正常または未処理の細胞集団から生じ得るような、分析物存在、発現、または豊富さの類似性および／または相違について比較することができる。

【0064】

図１Ａ／１Ｂによれば、分析されるべき細胞／粒子状物質１０６を含む１つまたは複数の試料１０２、１０４は、ステップ１１０で回収または収集される。細胞／粒子状物質１０６は次に、ステップ１２０で個別の位置に分配および保持される。試料分配は、保持領域１２４を含む複数の個別のチャンバ、ウェル、窪み、チャネルまたは他の特徴／区域を有する試料アレイ１２２を含む、基材を使用して実現される。保持領域１２４はさらに、細胞／粒子状物質１０６の少なくとも一部分を含有、保持、または隔離するように適切に構成される。様々な実施形態では、細胞／粒子状物質１０６を分配するのに使用されるアレイ１２２は、細胞／粒子状物質１０６の寸法に基づいて適切なサイズにされている試料アレイ１２２の中に形成されたウェル、窪み、空洞、またはへこみなどの複数の保持領域１２４を含む。ステップ１２０で細胞／粒子状物質を分配することは、選択された流体量の試料を、所望の数の細胞／粒子状物質が１つまたは複数の保持領域に、その領域の容積と、そこに位置特定、配置または置かれるべき流体含有試料の量とに基づいて配置されることが予想されるように、分散することを含み得る。

【0065】

様々な実施形態では、試料アレイ１２２は、所望の数の細胞／粒子状物質を保持または位置付けするようにそれぞれ構成可能な、複数の個別の保持領域を含み得る。本教示による試料アレイ１２２は、多数の保持領域１２４を含み得る。例えば、何百、何千、または何百万の個別の保持領域１２４を試料アレイ１２２内に形成することができる。例示的な一実施形態では、試料アレイ１２２は、長さおよび／または幅が約１〜１０ｃｍの間の構造体を含むことができ、その中に約１，０００〜１００，０００個の間の個別の保持領域が形成される。

【0066】

様々な実施形態では、試料保持領域１２４は、長さが約０．０１〜５ミリメートル、深さが約０．５〜１００マイクロメートルの寸法を有するマイクロチャンバ／マイクロウェルを含む。他の実施形態では、マイクロチャンバ／マイクロウェルはおおむね長方形のプロファイルを有し、長さが約０．１〜２０００マイクロメートル、幅が約０．１〜１００マイクロメートル、および深さが約１〜１００マイクロメートルである。このサイズおよび形状のマイクロチャンバ／マイクロウェルは、様々な用途および細胞／粒子状物質型に対して構成することができる。例えば、大きい細胞／粒子状物質を収容するには、相応の大きいマイクロウェルが望ましくは使用され得る。加えて、各マイクロチャンバ／マイクロウェル内で評価されるべき、単一よりも多い細胞／粒子状物質を含む実験では、マイクロチャンバ／マイクロウェルのサイズおよび／または寸法は、それに応じて構成することができる。加えて、試料アレイ１２２の密度は、例えば、１ｃｍ^２当たり約１００〜５０，０００個の間のマイクロチャンバ／マイクロウェルで柔軟に構成することができる。

【0067】

ポアソン統計に基づくものなどの希釈法を使用すると、細胞／粒子状物質１０６の予想分配を得ることができ、少数の細胞／粒子状物質、または様々な実施形態では単一細胞／粒子状物質１０６、を受け入れる保持領域１２４の少なくとも一部分が結果として得られる。試料希釈／分配のこの手法によれば、いくつかの保持領域１２４は、細胞／粒子状物質１０６を何も受け入れることができない一方で、他のものは、所望の量よりも多い（例えば、１つまたはいくつかの細胞よりも多い）細胞／粒子状物質１０６を受け入れることができる。様々な実施形態では、少数の細胞／粒子状物質１０６、より詳細には単一細胞／粒子状物質１０６の試料集団に付随する分析物１０８の分析には、それぞれの保持領域１２４内に細胞／粒子状物質１０６が存在すること、およびその数が多いことを識別することが含まれる。以下で記載するように、本開示のシステムおよび方法では、様々な保持領域について所望の細胞／粒子状物質分配を効果的に画像化および区別して、所望の量または数の細胞／粒子状物質を含むものを識別することができる。

【0068】

試料分配に続いて、状態１３０で、細胞／粒子状物質１０６がそれぞれの保持領域内で、選択された期間または持続時間インキュベートされる。選択された基準またはプロトコルに従ってインキュベートすると、保持された細胞／粒子状物質１０６は、分析物１０８を個別の保持領域１２４内で取り囲む容積１３２（例えば、個別の単一またはいくつかの細胞／粒子状物質を含む培地が保持されている容積）の中に放出する。試料アレイ１２２の構成により、試料１０２、１０４の細胞／粒子状物質１０６が分析物１０８を容積１３２の中に分泌／放出することが可能になる。インキュベーション期間中、分析物濃度は、保持領域１２４の容積１３２の中で増加および／または拡散し得る。

【0069】

保持領域１２４の容積１３２の中に、例えば保持領域の少なくとも一部分全体にわたる分散または拡散によって放出された分析物１０８はさらに、ステップ１４０で、分析物検出基材１３４の選択された位置のまわりに配置または位置特定された、１つまたは複数の検出成分１３５と会合するか、または反応することができる。検出成分１３５は、１つまたは複数の選択された分析物１０８に対して選択的に反応、カップリング、認識、または別様に区別するか、そして／またはその存在を検出する、抗体、核酸、タンパク質、または他の化学／生化学構成物を含むことができる。一般に、保持領域１２４のサイズおよび構成は、分析物１０８が分析物検出基材１３４の選択された部分または領域（例えば、検出成分１３５が位置付けまたは配置される分析物検出領域１３６）と会合するか、またはそのまわりへの位置付けによって検出成分１３５で個別に検出され得るような様式で分析物が分散することを可能にするに十分な容積／面積を与える。

【0070】

様々な実施形態では、個別の保持領域１２４に保持された、分配された細胞／粒子状物質１０６に付随する分泌物、生化学的物質、サイトカイン、ケモカイン、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原、増殖因子、または発現タンパク質が、容積１３２の中で拡散および分配され、検出可能または識別可能なパターン、フィンガープリント、またはバーコード１４２を形成する分析物検出基材１３４に付随する分析物検出領域１３６に配置または位置付けされた、１つまたは複数の検出成分１３５と選択的に会合し、それによって捕捉され、または保持される。これらのパターン、フィンガープリント、またはバーコードは、状態１５０で検出されたときに、占有された保持領域１２４の中に含まれたそれぞれの細胞／粒子状物質１０６に付随する分析物１０８の存在および組成の表示を形成する。

【0071】

様々な実施形態では、分析物検出基材１３４は、多数の分析物１０８（例えば、約１０〜１０００個の間の異なるタイプの分析物）を検出および区別できる複数の分析物捕捉または検出成分１３５で構成される。分析物検出基材１３４上の分析物検出領域１３６における分析物検出成分１３５の位置付けまたは会合は、分析物１０８の存在および／または豊富さを同時に決定することが、パターン、フィンガープリント、またはバーコード１４２に基づいて、高度に多重化した様式で決定され得るようにして行われる。様々な実施形態では、分析物検出基材１３４上の分析物検出領域１３６に配置または位置付けされた分析物検出成分１３５の配置または位置付けにより、分泌および／または放出されたサイトカイン、ケモカイン、タンパク質、または他の細胞成分が、分析物１０８の種類および存在に基づいて容易に、かつ個々に分類されることが可能になる。

【0072】

分析物検出基材１３４は、目的の化合物、化学物質または生化学的物質を個別に、または特異的にそれぞれが認識する、複数の捕捉剤または検出成分１３５から構成することができる。分析物検出成分１３５はさらに、分析物検出基材１３４のまわりに別個の、または位置的に個別の特徴（例えば、分析物検出領域１３６）を配置して、様々な分析物検出成分１３５の間の空間分離を提供することができる。分析物検出成分１３５のこのような空間分離配置は、分析物検出領域１３６の中またはまわりにおいて、検出された分析物１０８を空間符号化またはパターニングすることを可能にし、これらは、分析物検出基材１３４に付随する分析物検出領域１３６の中またはまわりにおける、分析物検出成分１３５の既知の分配に基づいて解像することができる。様々な実施形態では、分析物検出基材１３４は、分析物検出領域１３６に複数の線、点もしくは他の個別の形状、または形状の組合せとして配置された分析物検出成分１３５を含むことができる。

【0073】

各分析物検出領域１３６はさらに、１つまたは複数のタイプの分析物検出成分１３５から構成することができ、これらは、異なるマーカー、標識、色素、または、例えば異なる光学特性または波長を画像化する間に使用する画像化際し識別できる別個のシグナル、もしくはスペクトルで分離可能な他の特性を生成する他の手段の使用によって、互いに区別されることが可能である。様々な実施形態では、分析物検出基材１３４は、１つまたは複数の重複した、冗長な、または繰り返しの分析物検出成分１３５または分析物検出領域１３６を含み、これらは例えば、分析物存在が、対応する分析物検出領域１３６について得られたシグナル、読み出し情報、またはパターンを使用して識別および比較されるための、多数の機会を提供するために使用することができる。

【0074】

複数の分析物１０８が望ましくは、それぞれの試料保持領域１２４に会合する細胞／粒子状物質１０６について、識別可能および／または定量可能である。様々な実施形態では、分析物検出基材１３４は、約５〜１０００個、またはそれ超の異なる分析物１０８を、対応する分析物検出成分１３５／分析物検出領域１３６を使用して検出および解像する能力を提供する。分析物検出基材１３４上に配置または位置特定された分析物検出成分１３５／分析物検出領域１３６は、代表的には、試料アレイ１２２の試料保持領域１２４に対応するか、また相補的である様式で、順序付けられるか、またはパターン化される。したがって、それぞれの分析物検出領域１３６の長さおよび幅、ならびに分析物検出領域１３６の全体のサイズおよび／またはグループ分けは、試料保持領域１２４によって決定される対応する、または利用可能な面積に基づいて、可変であるように構成することができる。

【0075】

本明細書において以下でより詳細に記載するように、分析物１０８と、分析物検出領域１３６に会合した対応する分析物検出成分１３５とのカップリングまたは会合から得られるシグナルは画像化されて、シグナルフィンガープリント、バーコード、または他の識別可能なパターンを形成することができ、これらは、試料アレイ１２２のそれぞれの試料保持領域１２４に存在する分析物１０８を決定するために分析および解像することができる。これらの分析物１０８はさらに、それぞれの試料保持領域１２４に存在すると決定された細胞／粒子状物質と相関させることができる。

【0076】

検出された分析物パターンは、分析物検出成分１３５／分析物検出領域１３６についての空間分離、スペクトル分離、または空間分離とスペクトル分離の両方の組合せに基づいて、個別の分析物の存在または量について解像することができる。本発明の装置および方法は、目的の分析物の２つまたはそれ超、３つまたはそれ超、４つまたはそれ超、５つまたはそれ超、１０個またはそれ超、２０個またはそれ超、４０個またはそれ超、５０個またはそれ超、１００個またはそれ超、１０００個またはそれ超の多重化検出によって複数の分析物１０８の存在を解像するのに使用することができる。したがって、本開示の画像分析装置および方法は、多数の個別の単一細胞／粒子状物質または個別の少数の細胞／粒子状物質（対応する試料保持領域１２４に同時位置付け、または同時位置付けされている）について、多数の異なる分析物を並行して検出する能力を提供する。

【0077】

ステップ１５０の分析物検出は、分析物検出基材１３４を画像化（直接、または試料アレイ１２２からの分離後に）することであって、分析物検出成分１３５にカップリングし、または会合した分析物１０８の存在を表すシグナルまたはマーカー（例えば、蛍光およびまたは放射活性）を識別することを含み得る。様々な実施形態では、分析物検出成分１３５は、発光マーカー、エネルギー発生マーカー、色素、または他の標識１３６を含み、分析物検出のための抗体捕捉およびＥＬＩＳＡ分析などの技法を利用することができる。

【0078】

細胞／粒子状物質１０６およびそれらの対応する分析物１０８は、ステップ１６０で、検出または識別されたパターン、フィンガープリント、シグナル読み出し情報、またはバーコード１４２をそれぞれの保持領域１２４と関連付けることによって特徴付けられる。この処理は、分析物検出基材１３４に対し、対応する区域に付随する個別の保持領域１２４を識別および区別することを含む。本明細書において以下でより詳細に記載するように、このプロセスは、対応する細胞／粒子状物質１０６、保持領域１２４、および検出または識別されたパターン、フィンガープリント、またはバーコード１４２の位置および／または配向を高度に多重化した様式で決定する、いくつかの操作を含み得る。この分析はさらに、個々の、または少数の細胞について、分泌物、生化学的物質、および／または発現タンパク質を高度に並行である様式で識別するための基礎を提供し、表現型の特徴付けなどの他の分析が、分析物の定量、発現パターンの決定、試料のクラスへのカテゴリー分類またはグループ分け、およびその他の分析機能を含む個々の試料を特徴付けるために、検出された分析物の得られたパターンから実施されることを可能にする。

【0079】

高スループット単一細胞分析における特別な困難性は、実質的に並行する様式で迅速かつ正確にアセスメントされなければならない多数の非常に小さい特徴から生じる。このような装置および方法は、個別の領域中に単一細胞を分離および保持できなければならないだけでなく、多数の個別の少ない存在量の分析物を高い信頼度で正確に識別するべきである。試料および基材特徴は、代表的には、サイズが小さく、必然的に高解像度かつ慎重な画像化が要求する（例えば、高解像度機器および／または顕微鏡を使用して）。様々な実施形態では、潜在的に複雑な分析物検出パターン、フィンガープリント、シグナル読み出し情報またはバーコードはまた、各試料からの複数の分析物を同時に検出および評価するための能力を提供するために、個々のウェル、または分析物１１３もしくは分析物１１５とともに識別されるか、または関連付けなければならない。ここで再び、分析物領域または区域のサイズと、検出されるべき分析物が近接した間隔で配置されることとが、正確な分析を行うことに関して特別な困難性を提示する。

【0080】

図１Ｃは、本開示による例示的な試料アレイ１２２の一部分の画像を拡大されたサブ部分１８０とともに示す。試料アレイ１２２は、拡大されたサブ部分１８２に示されるように、何百、何千またはそれ超の個別の試料保持区域１２４を含み得る。各試料保持区域１２４はさらに、単一または少数の細胞（または同様に粒子）１０６を保持し得る。個々の細胞／粒子状物質１０６は、信頼性良く識別可能であり、かつそれが存在するそれぞれの試料保持区域１２４と関連付けられなければならないだけでなく、様々な潜在的アーティファクト、ノイズおよび他のエラーの供給源から区別されなければならない。画像化品質に直接影響を及ぼし得る様々な要因には、例えば、可能性のある汚染物質に対する細胞のサイズ、混合集団の中で特定の細胞型を区別すること、画像取得の際の低品質／コントラスト、試料アレイの変形、気泡および他のアーティファクトが含まれる。当業者には理解されるように、このような混乱要因がある状態で細胞／粒子状物質を画像化および解像することは、特別な困難性を提示する。

【0081】

図１Ｃはさらに、本開示による例示的な分析物検出基材１３４の一部分の画像を拡大されたサブ部分２８０、２８２とともに示す。分析物検出基材１３４は、拡大されたサブ部分２８２に示されるように、何百、何千またはそれ超の個別の分析物検出領域１３６を含み得る。各分析物検出領域１３６は、細胞／粒子状物質１０６に会合する分析物１０８を検出するマーカー１３５に対応する、分析物パターン１４２を形成し得る。画像品質に直接影響を及ぼし得る様々な要因には、例えば、分析物マーカー１３５／パターン１４２が検出される領域のノイズおよびバックグラウンドが含まれる。当業者には理解されるように、このような混乱要因がある状態でマーカー１３５／分析物パターン１４２を画像化および解像することは、特別な困難性を提示する。

【0082】

図１Ｃはさらに、試料アレイ１２２および試料検出基材１３４の一部分の対応する画像の例示的なオーバーレイ、マージ、または会合２９１を示す。試料アレイ１２２および試料検出基材１３４の画像の対応する部分のアライメントおよび位置付けは、分析物パターン１４２を形成する分析物１０８を検出する様々なマーカー１３５からのシグナルを、分析物１０８がさらに関連けられる細胞／粒子状物質１０６と関連付ける手段を提供する。画像の対応する部分のアライメントおよび位置付けすること、および関連するデータを分析することのための機構については、以下でより詳細に記載する。

【0083】

前述のように、および様々な実施形態では、分析１００の間に望ましくは検出および関連付けられるべき特徴には、様々な細胞または粒子１０６、保持領域またはマイクロチャンバ１２４、およびパターン、フィンガープリント、シグナル読み出し情報またはバーコードが含まれる。小さいサイズ（例えば、代表的には、少なくとも１つの寸法が２０マイクロメートルまたはそれ未満の程度の大きさ）、および様々な特徴を画像化および解像することに関連する特徴的な特性が、望ましくは克服されるべき非常に多くの困難性を特に、許容可能なスループットおよび精度を達成するために必要な自動化または半自動化データ取得および処理機構を適用する場合に提示する。本発明の方法および装置は、単一または２つの細胞／粒子状物質の化学的および生化学的プロファイル読み出し情報についての必要な高品質データを特にアッセイチャンバまたは保持領域１２４ごとに得ることが、多数のこれらの特徴、例えば、何千という細胞／粒子状物質１０６、何千というマイクロチャンバまたは保持領域１２４、および何百万でないとしても何十万という読み出し情報を検出および分析が容易になるように画像化しながら、可能である。

【0084】

特徴サイズが非常に小さい試料アレイを含む細胞分析では、非常に高い解像度での画像化は実際的ではなく、かつ／または実行不可能であって、データ取得および分析のための代替方法が必要になる。この制約の１つの理由は、走査型顕微鏡および蛍光光度計などの画像化デバイスに解像度限界があるということである。このようなハードウェア構成要素のアップグレードは非常に費用がかかる可能性があり、またより新しい構成要素を組み込むことは、実施することが、臨床および研究設定で必要になり得る標準化された、または較正されたワークフローには実施することが困難である。加えて、特徴解像スキャンのために使用できる走査型顕微鏡などの画像化デバイスの視野の限界に、従来の捕捉およびタイル張りアフプローチで強化することにより対処することは、時間、費用、およびコンピュータを利用した制約条件により実際的ではないか、または実行不可能である。例えば、何千またはそれ超の保持領域１２４、細胞／粒子状物質１０６、および分析物シグナル読み出し情報を持つ全体の試料アレイ１２２を画像化および分析することは、何千という画像を捕捉し、タイル張りすることを容易に含む可能性があり、これはあまりに時間がかかり、またはコンピュータ的に法外なことになり得る。このようなタイル張り画像のサイズは数億またはそれ超の画素を容易に上回ることがあり、処理および分析することが非常に困難になる。あるいは、より低解像度で画像化を行うこともできるが、このようなアプローチは低い分析品質をもたらし、また定量化エラーが高くなる可能性があり、この場合、各特徴は画素の数が限定され、このことが細胞型の正確なアセスメント、ノイズ補正、および／またはシグナル解像を妨げ得る。

【0085】

いくつかのワークフローのさらなる制約は、細胞／粒子状物質試料アレイの光学／検出特性および要件が、分泌プロファイルまたは検出化合物を解像／画像化するために強化されたものとは別個であり、かつ異なり得ることである。したがって、単一デバイスでの同時画像化は実行するのが不可能／非実際的であり得る。したがって、必要条件ではないとしても、複数の画像化を異なるシグナル／データ取得デバイス（例えば、複数の顕微鏡／シグナル捕捉デバイス）を使用して行うことが望ましくあり得る。これらのデバイスは、同一のフォーマットの（例えば、同じ解像度または配向で）データを出力しない場合があり、したがってさらなる困難性が、検出された分泌パターンを特定の保持領域および細胞／粒子状物質とアライメントし、関連付けることに存在する。

【0086】

試料アレイと化学的シグナルフィンガープリントの両方を画像化するために使用される解像では、必要とされる細かな測定値が、不完全さの多くの供給源によって混乱する可能性がアル。例えば、基材表面のミクロンレベルの反りまたは歪み、ならびに非常に小さい汚染物質でさえも、十分な高品質および正確な結果を得るために対処されるべきである。加えて、細胞を含む生物学的データを画像化すると、細胞形態および観測される構造、ならびにシグナル（分泌）読み出し情報の強さおよび品質に関して不一致が生じることが多い。本開示のシステム、方法、およびソフトウェアは、ノイズ／バックグラウンドを高い信頼度で区別しながら、上記に例示されたものなどの潜在的に観察可能な変動に効果的に対処する。

【0087】

様々な実施形態によれば、本教示の望ましい特徴には、データ取得／抽出プロセスを自動化して、データを得るための、時間がかかりエラーを生じやすい手作業の方法を回避する能力が含まれる。アッセイデータの取得は、現存する既製品／従来の画像化処理ソフトウェアを強化しようとする場合でさえも、時間がかかり（アッセイ当たり数日程度）不正確でもある。本発明の方法のさらなる利点は、本明細書に開示された一体化および最適化された画像化解決策を開発することが、多数の非常に小さい特徴を高い精度で信頼性よく検出する能力を、経済的かつ時間的に効率的なままで、数ある困難性の中でも特徴の不一致、ノイズの存在、基材材料の歪みまたは変形に対処しながら、提供することである。様々な実施形態では、これらの方法は、自動化手順を開発するために適用することができ、これらの自動化手順は同時に非常に正確であるが、同様に、時間の見地からも（例えば、３０分未満の実践時間）、ハードウェアの見地からも（従来のコンピュータ上で実行できる）、分析するのに十分に実用的である。

【0088】

上記で論じたように、細胞分析のためのこれらの方法および装置は、従来の単一細胞画像分析解決策の多くの問題および欠点に対処する。図１Ｄは、本開示による試料アレイデータ（例えば、単一細胞分析アレイ）の画像化および解像のために使用できる詳細な分析ワークフロー１０００を示す。ワークフロー１０００は状態１１００で、試料アレイ１２２の試料保持領域１２４に付随する複数の画像と、試料保持領域１２４に配置された様々な細胞／粒子状物質１０６について検出分析物１０８からシグナル取得を代表する、付随するパターン、フィンガープリント、シグナル読み出し情報またはバーコード１４２とを収集することから開始する。

【0089】

様々な実施形態では、試料の画像化および分析は、試料アレイ１２２の選択された領域の付随する画像およびシグナル取得情報のグループ分け、またはコレクションの評価によって作動する。試料アレイ１２２の選択された画像化領域は、試料アレイ１２２からの試料保持領域１２４の一部分が画像に捕捉されているサブ領域１８０／１８２（図１Ｃ参照）を代表することができる。本開示によれば、全試料アレイを一緒に表すものを縫い合わせようとする（労力を要し、計算に費用がかかり、またエラーを生じやすいプロセス）よりもむしろ、各サブ領域１８０、１８２を独立に画像化および評価して高品質のデータおよび結果を、高価ではない日用品であるコンピュータシステムを使用して迅速に得ることができる。基準、標識、識別子または他の位置的特徴（集合的にアライメントマーカー）を試料アレイ１２２上に含むか、エッチングするか、またはプリントすることができる。アライメントマーカーはさらに、試料アレイ１２２の個別の試料保持領域１２４をその中に存在するか、または配置されている細胞／粒子状物質１０６と関連付けることができるように、複数の画像およびスキャンを通じて、またはそれ全体を横切って、試料保持領域１２４を配向または識別しやすくするために使用することができる。細胞／粒子状物質１０６はさらに、細胞／粒子状物質１０６の識別されたパターン、フィンガープリント、シグナル読み出し情報またはバーコード（集合的に分析物パターン）と関連付けられて、検出された放出分泌物および分析物１０８の高精度プロファイリングを促進し得る。

【0090】

本明細書中以下でより詳細に記載するように、第１の画像またはスキャン（例えば、高解像度明視野画像）が、試料アレイ１２２の選択されたサブ領域１８０、１８２について得られる。高解像度画像（１０×〜５０×対物レンズ付きの光学顕微鏡を用いて得ることができるものなど）が、最初の細胞／粒子状物質検出に使用することができる。この第１の画像を使用して、試料アレイ１２２のサブ領域１８０、１８２の様々な試料保持領域１２４中の細胞／粒子状物質１０６の場所、数、および分布を識別することができる。加えて、所望の数の細胞／粒子状物質１０６（例えば、単一細胞、または２つもしくはそれ超の相互作用する細胞）を含む試料保持領域１２２を、細胞／粒子状物質１０６を含まないか、または所望の数よりも多い細胞／粒子状物質１０６を含む試料保持領域１２２から識別および区別することができる。高解像度画像はまた、比較的小さいエフェクター細胞／粒子状物質１０６間で識別および区別する（例えば、免疫学アッセイにおいて、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞を試料中に存在し得る他の細胞から識別および区別する）助けにもなる。

【0091】

試料保持領域１２４および付随する分析物検出領域１３６に関連する画像および／またはアライメントマーカーの正確なアライメントをさらに助けるために、実質的に同一または同様のサブ領域１８０、１８２の第２の画像もまた得ることができる。この第２の画像は、第１の画像と比較して異なる光学パラメータを適用するより低解像度画像または他の画像タイプを含み得る。第１の画像および画像化サブ領域１８０、１８２の第２の画像はともに、様々な画像／スキャンのアライメントを助け、また単一の画像化の使用と比較して改善された細胞／粒子状物質検出および識別精度をもたらすことができる。様々な実施形態では、第２の画像は、コントラストまたは焦点面の配向を調整すること、デジタル解像度を変更すること、第１の画像と比較して倍率を指定の比または割合で低減すること（例えば、第１の画像またはスキャンの１０×〜５０×と比較して、より低い解像度画像の１×〜５×）などの異なる光学設定の使用を含め、様々な手法で得ることができ、また異なる照明／顕微鏡法（例えば、暗視野、位相差、蛍光）を用いて撮影することができる。様々な実施形態では、分析システムは、所望の光学設定で事前構成することができるか、あるいは、どんなタイプの光学設定が第１と第２の画像の両方に、それぞれの解像度設定で適用されるかについての決定を、データ品質および実験的な設計パラメータに基づいて急いで行うことができる。より高いおよび／またはより低い解像度および倍率が、画像化処理で使用することに容易に採用されることができることを理解されたい。様々な実施形態では、画像化のための倍率および他の光学パラメータは、少なくとも一部は、試料アレイ１２２／試料保持特徴１２４および試料検出基材１３４／分析物検出領域１３６の寸法、ならびに細胞／粒子状物質１０６および使用される分析物検出成分のタイプによって決定される。

【0092】

選択されたサブ領域１８０、１８２について得られた第１および第２の細胞／粒子状物質画像に加えて、追加のスキャンまたはシグナル取得が行われて、サブ領域１８０、１８２の試料保持領域１２２に存在する細胞／粒子状物質１０６に付随する検出、放出、または分泌された化合物もしくは分析物１０８を表す分析物パターン１４２が取得または識別される。様々な実施形態では、各サブ領域１８０、１８２について得られたスキャンまたはシグナル取得情報は、別の機器で、かつ／または異なる時間に取得することができて、より柔軟なデータ取得を提供する。加えて、第１および第２の画像化は、互いに、また分析物パターンスキャンと比較して、異なる光学的特性または特質に基づくことができる。例えば、第１および第２の画像化は、可視光による画像であり得るのに対し、分析物パターンスキャンは、蛍光シグナルから取得することができる。

【0093】

様々な実施形態では、選択されたサブ領域１８０、１８２の様々な第１と第２の画像は、選択された対応する画像セットにおいて検出および解像される基準またはアライメントマーカーを使用して関連付けられ、かつ正確にアライメントされる。さらに、アライメントマーカーの別のセット（または、異なるマーカー、色素もしくは標識を使用する、異なる波長におけるアライメントマーカーの第１のセットの追加の画像化）を、試料アレイ／粒子状物質画像化と分析物検出スキャンの両方で画像化することができる。したがって、試料アレイ画像と分析物検出スキャンの間のアライメントを行って、選択された試料保持領域１２４に付随する分析物パターン１４２から検出された分泌または放出された分析物１０８を、その中に位置特定されるか、または配置された対応する細胞／粒子状物質１０６と一致、または関連付けることができる。

【0094】

多くの要因が各画像の全体品質、およびそれぞれの画像中の特徴／細部の視認性に寄与することを理解されたい。照明状態、輝度、コントラスト、および焦点の相違などの要因が、画像化に有意に影響を及ぼし得る。上述の様式で複数の画像を取得することによって、これらの画像の組合せ結果が試料保持区域１２４と、その中に含まれる細胞／粒子状物質１０６との両方の識別信頼性の改善に寄与し得ることを理解されたい。さらに、特徴（画像中の試料保持区域輪郭／境界および細胞／粒子状物質プロファイルなど）のサイズが一般に小さいことにより、単一よりも多い画像を異なる解像度で有することは、試料アレイ１２２およびその中の成物を解像／画像化する上で非常に役立つことを実証することができる。本明細書中で以下でより詳細に記載するように、本開示の方法でなければ、サブ領域１８０、１８２内の一部分または全体の特徴を不明瞭にするように作用し得るか、あるいは細胞／粒子状物質１０６および／または分析物パターン１４２の位置合わせ誤りが結果として生じ得る、ノイズおよびエラーの様々な潜在的原因が、本開示の複数の画像化方法を使用して低減または除去することができる。これらの方法は、使用可能なデータを、試料アレイ１２２の向上した精度および改善した定量能力によって解像または区別する助けになり得る。

【0095】

図１Ｅは、図１Ｄのステップ１１００で記述された試料アレイ１２２のサブ領域１８０、１８２の複数の画像化に関連するプロセスの概要を示す。高解像度画像１１５０は、マイクロチャンバ／試料保持領域１２４の１つまたは複数の明視野／輝視野画像１１５５と、付随または近傍の第１のアライメントマーカー（例示的な「Ａ」で図中に指定）とを含み得る。第２の画像１１６０は同様に、試料保持区域１２４の類似視野と、高解像度画像１１５５としての付随する細胞／粒子状物質１０６とを有する１つまたは複数の明視野画像１１６５を含み得る。第１と第２の画像は、試料アレイ１２２上に存在するアライメントマーカーを使用してアライメントされ、対応する画像の中で識別されて、第１および第２の画像１１５５／１１６５を互いに対して配向する能力を提供することができる。

【0096】

例えば、蛍光画像化またはスキャン１１７０によって得られた対応する分析物パターン１４２は、分析物パターン１４２の１つまたは複数のスキャン１１７５を含む。分析物パターンはさらに、試料保持領域１２４に存在する細胞／粒子状物質１０６によって放出または分泌された個々の検出分析物１０８に解像することができる。スキャン１１７５はさらに、様々な選択波長で画像化することによって、または２つもしくはそれ超の検出モードを使用して、細胞／粒子状物質１０８に会合するか、そこから放出され、または分泌された検出分析物１０８を識別するために組み合わされ、かつ評価される分析物パターンのコレクションを形成することによって得られた、個別の識別可能なパターン、フィンガープリント、検出パターンまたはバーコード１４２を含み得る。

【0097】

様々な実施形態では、第１および／または第２の画像に対応する区域の第２の画像化１１６６が得られて、１つまたは複数の第２のアライメントマーカーが識別される。様々な実施形態では、第２の画像化は、第２のアライメントマーカーが１つまたは複数の第１のアライメントマーカーから容易に区別できるように、第２のアライメントマーカー用の異なる波長または放出スペクトルで取得される。例えば、第１および／または第２の画像の対応する領域の蛍光画像化またはスキャンを得て、図で「Ｂ」と指定された個別マーカーセットを区別することができる。その画像および付随するアライメントマーカーセットを使用して、マイクロアレイスキャン／分析物パターン（分析物１０８の識別可能なパターン、フィンガープリントまたはバーコード１４２に対応する）は、対応するアライメントマーカー「Ｂ」を含めて、第１および／または第２の画像を対応するマイクロアレイスキャン／分析物パターンとアライメントまたは配向するために使用することができる。まとめると、上述の処理を使用して、試料アレイ１２２上のそれぞれの部分に対する様々な画像およびスキャンが、望ましくは、細胞／粒子状物質１０６を、対応する分析物１０８と関連付けるように配向およびアライメントされて、高品質のプロファイリングおよび化合物分析が可能になり得る。

【0098】

特定の実施形態では、対応する第１および第２の画像中で画像化された選択されたサブ領域１８０、１８２に会合する、細胞／粒子状物質１０６の１つまたは複数の追加画像化１１６７を得ることができる。細胞画像化プロセス１１６７では、アライメントマーカー画像化または分析物検出スキャンとして、類似または異なる波長またはスキャン構成を利用することができる。様々な実施形態では、様々な細胞または粒子状物質１０６は、試料アレイ１２２の様々な試料保持領域１０９の細胞／粒子状物質１０６の場所または配置を解像するために、蛍光または発光色素、染色剤、または他の識別手段で標識することができる。この情報はさらに、選択された試料保持領域１０８中の細胞／粒子状物質１０６の存在および／または数を明確に識別するのに使用することができ、さらに、識別された細胞／粒子状物質１０６をその対応する識別可能なパターン１４２と、対応する放出または分泌された分析物１０８とを関連付けにおいて補助にするために使用することもできる。

【0099】

様々な実施形態では、分析されている細胞／粒子状物質１０６の寸法および他の特性により、後に続く検出および分析のために取得されるべき画像の数およびまたはタイプが決定し得る。例えば、相対的に大きい細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞）は、染色およびその後の蛍光画像化をせずに画像化することができる。相対的に小さい細胞（例えば、ＣＤ４細胞）では、蛍光染色が必要とされず、複数の明視野画像が様々な倍率で取得される場合がある。他の小さい細胞型では、染色および蛍光画像化、ならびに１つまたは複数の明視野画像が使用され得る。細胞の混合集団および非常に小さい細胞では、表面マーカーを、細胞型を区別するため、そして／または細胞の存在を検証するための適切な画像化パラメータとともに、使用および検出することができる。

【0100】

図１Ｆパネル（ａ）は、複数の試料保持領域１２４を含む試料アレイ１２２の、選択されたサブ領域１８０の例示的な高解像度画像化を示す。細胞／粒子状物質１０６はさらに、様々な試料保持領域１２４（拡大図にさらに示される）に位置付けられる。第１および第２の位置／アライメントマーカー１１６８、１１７１（例えば、「Ａ」および「Ｂ」を含むマーカーセット）がさらに、上記で論じた画像のアライメントのために試料保持領域１２２のまわりで位置特定される。図１Ｆパネル（ｂ）は、同じ複数の試料保持領域１２４を含む試料アレイ１２２の選択されたサブ領域１８０の、例示的な対応する第２の画像を示す。細胞／粒子状物質１０６は、試料保持領域１２４中に、第１の画像中に可視化したものと同様または同一の場所に位置付けられている。上記で論じられたような、アライメントのための位置決め可能なアライメントマーカー１１６８は、試料保持領域１２２のまわりに見える。図１Ｆパネル（ｃ）は、蛍光標識化および画像化（図１Ｅのステップ１１６６）の結果として得られた細胞／粒子状物質１０６の追加画像化を示す。他の細胞／粒子状物質に対する細胞／粒子状物質の位置付けおよび配向は保存することができるとともに、上のパネル（ａ）および（ｂ）の明視野画像について得られたものと比較可能である。細胞／粒子状物質位置は、必ずしも単一の位置に固定または維持される必要はないが、細胞／粒子状物質が存在する試料保持領域１２２は、細胞／粒子状物質１０６の全体の動きを制限し得る。

【0101】

図１Ｇパネル（ａ）は、細胞／粒子状物質１０６によって放出または分泌された検出分析物１０８に付随するマイクロアレイ／分析物パターンを示す、例示的なシグナルおよびアライメントスキャンを描写する。上述のように、分析物パターン１４２は、様々な保持領域１２２に配置または保持された細胞／粒子状物質１０６に付随する、個々の、または個別に検出された分析物１０８に解像することができる。分析物スキャンおよび根底にある検出された分析物パターン１４２を、細胞／粒子状物質１０６がある試料保持領域１２２についての第１および／または第２の画像と相関させることによって、個々の細胞／粒子状物質または細胞／粒子状物質のコレクションは、多数の分析物１０８を並行して、かつ多重化された様式で放出または分泌することに帰することができる。

【0102】

デバイス画像化プロセス（図１Ｅ、状態１１７５）に従って、分析物パターン１４２は、複数の波長または画像化／スキャンモードを使用して検出することができる。例えば、複数の個別に、かつ差別的にタグ付けまたは標識された分析物検出成分１３５は、分析物検出基材１３４のおおむね同じ分析物検出領域または区域１３６に配置されるか、または同時占領する。異なる分析物１０８は、差別的に標識された分析物検出成分１３５と選択的に結合または会合し、分析物検出成分１３５と会合するタグまたは標識１３５に基づいて、別個に解像または検出することができる。同じ分析物検出領域１３６中の同時位置決め可能な分析物１０８の個別の解像は、タグまたは標識に関連する異なる放射シグナル／波長に基づいて決定することができる。加えて、複数の画像が異なる波長で得られるか、あるいは、異なるフィルタまたは光学設定を使用して、これらの領域中の分析物１０８を別個に解像することができる。特定の実施形態では、別個の画像化を同一の分析物検出領域１３６について取得して、存在する分析物１０８と、分析物検出成分１３５と会合したタグ、マーカー、色素または標識に基づいて、異なる分析物パターン１４２を生成することができる。

【0103】

図１Ｇパネル（ｂ）は、分析物検出基材１３４と会合した、検出された第２のアライメントマーカー１１７１を描写する。第２のアライメントマーカー１１７１は、前述したように（図１Ｅ、状態１１６６）、デバイス画像化プロセスにおいて解像可能であり得る。図１Ｇパネル（ｃ）は、試料アレイ１２２と会合した検出された第２のアライメントマーカー１１７１を描写する。第２のアライメントマーカー１１７１は、前述したように（図１Ｅ、状態１１６６）、デバイス画像化プロセスにおいて解像可能であり得る。様々な実施形態によれば、分析物検出基材１３４および試料アレイ１２２について検出されたアライメントマーカーは、試料アレイ１２２の第１および／または第２の画像を関連付け、かつ廃校するために使用することもできる（図１Ｅ、状態１１６８）。したがって、これらの画像化およびスキャン間のアライメントが、本明細書中以下でより詳細に記載するように、それぞれの分析物パターン１４２を、分析物検出領域１３６の中で分析物１０６を放出または分泌する特定の細胞／粒子状物質１０６と関連付ける能力を提供する。

【0104】

図１Ｈは、単一細胞／粒子状物質１０６を保持する試料保持領域１２４がある、例示的な試料アレイ１２２の一部分の明視野画像（パネルａ）を示す。図１Ｈはさらに、細胞／粒子状物質１０６上の選択された表面マーカーの存在を表示する、例えば染料によって可視化された細胞１０６が示される、対応する蛍光画像（パネルｂ）を描写する。図１Ｈはさらに、細胞／粒子状物質１０６と会合する分析物１０８を検出するマーカー１３５に対応する分析物パターン１４２がある、例示的な分析物検出基材１３４の一部分の対応する画像（パネルｃ）を描写する。図１Ｈはさらに、それぞれの分析物パターン１４２を、分析物１０８が検出された関連細胞／粒子状物質１０６と関連付ける機構を提供するための、様々な画像（パネルｄ）のマージを描写する。

【0105】

図１Ｄを再び参照すると、試料アレイ１２２および分析物検出基材１３４の様々なサブ領域１８０、１８２の収集された画像が、詳細な分析ワークフロー１０００によるさらなる処理ステップで使用される。最初、状態１２００で、試料アレイ１２４のマイクロチャンバ／試料保持領域１２４が位置特定され、それぞれの画像について解像される。一部は試料保持領域１２４の特徴サイズが小さいことに起因して、ならびにそれら自体の構造に付随する潜在的なアーティファクトおよび歪みと、結果として得られる画像に起因して、様々な画像およびスキャンの詳細な評価を行うことが望ましい。これらのプロセスは、高品質分析に、そしてそれぞれの細胞／粒子状物質１０６に付随する様々な分析物の正確な決定に寄与する。

【0106】

様々な実施形態によれば、試料アレイ１２２は、試料保持領域１２４の規則正しいパターンまたは位置付けによって構成することができる。例示的なパターンは、図１Ｃに示されるように、行および列を有する２次元の格子の形を取ることができる。試料保持領域１２４、およびその中に存在する細胞／粒子状物質１０６の配向および決定を助けるために、規則的なパターニングを使用することができ、この場合、試料保持領域１２４の寸法は、試料アレイ１２２の様々な部分またはセクションにわたって互いにおおむね類似しており、代表的にほぼ等しい。試料保持領域１２４間のオフセットは同様に、試料アレイ１２２の様々な部分またはセクションにわたって互いにおおむね類似しており、代表的にほぼ等しいように構成することができる。

【0107】

試料保持領域識別プロセスの間の主要な操作は、画像化された試料保持領域の相対的な位置または場所を決定することである。次いで、選択された試料保持領域１２４のグラフィカルまたは画素区域は、そこに局在している細胞／粒子状物質１０６のそれぞれの位置付け、および分析物パターン１４２とのアライメントを決定するために使用することができる。画像化システムの自動化分析能力を改善することは、分析全体のスループットを向上させるための重要な考慮事項である。したがって、検出できる試料保持領域１２２の数または比率を増大または最大化することが望ましい。

【0108】

様々な実施形態では、試料保持領域１２２を規則的に順序付け、またはパターニングすることは、自動化分析を強化する助けになるか、ほぼ一定の、または予想された、寸法および間隔付けを提供する。さらに、付随する検出手順は、試料アレイ１２２上の試料保持領域１２４のいくつかの異なる配向、寸法、間隔付け、および量に対して、拡張可能または構成可能であり得る。システムはまた、ユーザの特定のアッセイまたは好みに応じて、異なるアレイ構成の分析のために構成することもできる。

【0109】

画像化プロセスおよび識別プロセスはさらに、試料アレイ１２２および関連する試料保持領域１２４における、様々な不完全さおよび変形に対処することができる。特定の実施形態では、試料アレイ１２２は、様々な変形および／または不完全さが製造および／または処理の結果として存在し得るように製作される。いくつかの場合では、試料保持領域１２４は、互いにわずかにアラインメントからずれるか、または軸外れであるか、あるいはロット間またはアレイ間のばらつきがある可能性がある。また、試料保持領域寸法および間隔における小さいばらつきが、試料アレイ１２２全体にわたって存在し得る。さらに、試料保持領域輪郭またはプロファイルを不明瞭にする様々なアーティファクトおよび残渣が試料アレイ上に存在するか、または様々な試料保持領域１２４と会合する可能性がある。加えて、試料アレイおよび試料保持領域の結果として得られた画像が、ぼやけた区域または破損／歪んだ試料保持領域輪郭などの不完全さを含む可能性がある。

【0110】

ステップ１２００に関連するマイクロチャンバ／試料保持領域１２４の位置特定および解像のためのより詳細な処理４００が図２に示されている。加えて、図４は、試料保持領域識別の主要な操作５００を図で示す。図４に示されるように、例示的な試料保持領域１２４は、分析物を不明瞭にするか、または混乱させ、自動化画像分析中に望ましくは対処される、様々な不完全さ５１２およびアーティファクト５１４にさらされる可能性がある。

【0111】

プロセス４００は、選択された、望ましい、または実質的にすべての、試料アレイ１２２の画像化について、例えば、図１Ｆ（ａ）に表された高解像度明視野画像、および／または図１Ｆ（ｂ）に表された第２の明視野画像を使用して行うことができる。試料アレイ１２２の選択されたサブ領域１８０、１８２を表す入力画像（４１０）ごとに、ノイズ除去プロセス（４１５／５１５）を適用することができる。ノイズ除去プロセスでは、ガウス差分法を適用することを含む様々な方法を使用して、画像中のノイズおよびアーティファクトを識別することができる。ノイズ除去処理の結果により、低品質の試料保持領域の部分、または信頼性良く解像できない部分、または周囲のバックグラウンド、ノイズもしくはアーティファクトと区別できない部分を排除することができ、また、小さい不完全さ、および画像ぼやけに対抗または対処することもできる。加えて、画像化されたほこりおよび残渣を含むアーティファクトは、画像から除去すること、かつ／またはさらなる処理および画像分析から排除することもできる。アーティファクト除去は、画像から細胞／粒子状物質を排除する可能性が高くならないようにして行うことができる。

【0112】

ノイズ除去（４１５／５１５）に続いて、輪郭検出ルーチン（４２０／５２０）を実行して、画像４１０中の様々な試料保持領域１２４の周辺、境界またはエッジを検出することができる。エッジ、輪郭、および他の形状に基づく試料保持領域１２４の特性は、キャニーエッジ検出法の適用を含むいくつかの方法によって決定することができる。試料保持領域１２４の形態またはプロファイルは、このプロセスの一部として評価して、選択された試料保持領域１２４に影響を及ぼす膨張５３２および／または侵食５３４などの様々な歪みを識別することができる。対処されないと、これらの歪みにより後の操作に困難が生じ、結果として潜在的に不正確または誤った分析物分析になる。

【0113】

上述のプロセスを適用することは、画像の潜在的に問題となる特徴および画像の構成要素を識別および除去する助けになり、またフィルタリングプロセス（４２５／５２５）に関連して使用することができる。アーティファクトおよびノイズによる影響を受けている試料保持領域、ならびに著しい変形を被るか、または他の問題にさらされるものを排除することは、概して望ましく、そして／または耐容できる特性を有する、下流での操作で容易に分析できるフィルタリングされた試料保持領域５４２のサブセットを残す。特定のフィルタリングプロセスは、様々な基準を適用することによってチャンバをゲート除去すること、または排除することを含み得る。例えば、選択された試料保持領域は、輪郭の長さ、幅、高さの、または保持チャンバ内の観察された重なり合いの結果としての、不一致または偏差に基づいてゲーティングすることができる。

【0114】

ノイズ、アーティファクト、および他の問題による影響を受けた試料保持領域を排除することは、細胞／粒子状物質１０６および検出分析物１０８に付随するデータおよび情報の潜在的な損失になることを理解されたい。特定の場合において、分析に使用される試料が特に希少または貴重であることがあり、使用される分析物１０８または検出成分１３５は高価であることがあり、あるいは適時の結果が必要とされ、このことにより、実用的と同じほどの情報を所与の分析または操作から捕捉することが重要になる。

【0115】

本開示の注目すべき画像分析ルーチンの強化は、再捕捉または補充手順（４３０／５３０）の適用である。このアプローチによれば、試料保持領域１２４の予想または予測される場所は、試料保持領域１２４の中での規則的な規則正しいパターンを使用して決定することができる。例えば、位置特定されていない、または以前の操作で排除されている可能性がある、試料保持領域１２４について、隣接する試料保持領域１２４の相対的な場所を決定することができる。反復プロセスを使用すると、失った領域５４６のすぐ上および／または下の、既存の／識別された試料保持領域５４４を、失った領域５４６内の試料保持領域の予想される場所を識別する助けにするために使用することができる。失った試料保持領域５４６を、識別された隣接する試料保持領域１２４を分ける距離または間隔に基づいて、再創出または追加することをさらに試みることもできる。輪郭描写およびサイズ変更操作はまた、試料保持領域１２４のおおよその、または予想される位置を決定するために使用することもできる。まとめると、これらの操作がうまく適用される場合、失った試料保持領域を画像の中に再び追加するか、または構築することができる。したがって、これらの処理を適用すると、そうしなければ失われ得るか、または廃棄され得る画像からデータを復旧または回復する能力を提供することができる。

【0116】

上述の操作に続いて、様々な画像中の識別された／残っている試料保持領域をソートおよび編成することができる（４３５／５３５）。様々な実施形態では、選択された画像中の試料保持領域１２４は、隣接する試料保持領域に対して配向および／またはグループ分けすることができる。例えば、垂直に並べられた試料保持領域は、さらなる分析をしやすくするために、円柱状に標識し、ソート／分類整理することができる。次に、画像の中で検出、位置特定、および／または識別された試料保持領域１２４が出力されて（４４０）、プロセスを完了することができる（１２００／４００／５００）。

【0117】

上述のマイクロチャンバ／試料保持領域識別プロセス１２００に加えて、追加の操作１２２０、１２４０を行って、分析物スキャンおよび対応する細胞／粒子状物質画像化に関連する、付随するアライメント特徴またはマーカーを識別および位置特定することができる。このようなプロセスは、試料アレイ１２２および分析物検出基材１３６の、選択された、所望の、または実質的にすべての画像化／スキャンについて行うことができる。例えば、第１のアライメント特徴識別プロセス１２２０は、図１Ｇ（ｃ）に表された試料アレイ１２２と会合する、検出された第２のアライメントマーカー１１７１に対するスキャンを使用して行うことができる。対応する第２のアライメント特徴識別プロセス１２４０は、図１Ｇ（ｂ）に表された分析物検出基材１３４に会合する、検出された第２のアライメントマーカー１１７１に対するスキャンを使用して行うことができる。試料アレイ１２２の一部分と分析物検出基材１３４の対応する部分とを表す、スキャンのアライメント特徴の位置特定は、図３に概要が述べられているステップ４５０、および図５の図示された描画５５０に従って行うことができる。

【0118】

選択された入力画像／スキャン（４５５、５５５）を使用すると、アライメント特徴輪郭、エッジ、または周辺がまず、キャニーエッジ検出法を使用して、かつ／またはハフ変換などの線検出アプローチを適用して、検出され得る（４６０、５６０）。様々な実施形態では、アライメント特徴は、例えば角度、曲がり目、およびプロファイルを含む微細な細部、寸法、および／または幾何形状５５８を含み、これらは、アライメント特徴の位置の信頼性ある決定および解像を助けることができる。アライメント特徴はさらに、明確に識別可能であるアライメント特徴の部分と、あまり明確に解像できないことがある部分とを判定する助けにするために、１つまたは複数のセグメントのグループ分けとして解像することができる。

【0119】

様々な実施形態では、明確に解像されるアライメント部分またはセグメントは、フィルタリングおよびグループ分けされる（４６５、５６５）。フィルタリング操作は、あまり信頼性良く評価されなかったアライメント部分を除去または排除しながら、セグメントの一部分について選択、予想または画像化された角度、決定された配向および／または場所を識別すること、および同様の、または予想される部分／セグメントをマージすることを含み得る。残りのセグメント／アライメント部分はさらに、例えば角度および位置付けに従って、識別、標識、および／または順序付けることができる（４７０／５７０）。操作の一部分では、図５に示されるように、セグメント部分を配向または角度５７２に基づいて分類および／または標識することができる。アライメントマーカーの既知の、または予想される配向を使用して、失われたか、または画像／スキャンからうまく解像されていないことがある部分を補充または再構築することができる（４７５／５７５）。アライメントマーカーの間の予想間隔と実際の間隔との比較を使用して、失われた領域またはセグメントを再構築することができる。

【0120】

実際の、および再構築されたアライメントマーカーを使用すると、次に、追加の内挿操作（４８０／５８０）を例えば隣接セグメント間で行って、分析物検出領域、フローレーン、および細胞／粒子状物質保持領域の予想される配向および位置付けを得ることができる。これらの操作を分析物検出領域および分析物パターンのそれぞれの画像に適用すると、それによって、細胞／粒子状物質１０６および分析物検出成分１３４が存在する、予想の領域および実際の領域の決定が容易になる。

【0121】

図１Ｄを再び参照すると、ステップ１２００で決定された、位置特定された試料保持領域１２２を使用して、分析１０００の後に続く段階１３００で、試料保持領域１２２に存在し得る潜在的な細胞／粒子状物質１０６を決定する。細胞／粒子状物質局在化１３００の操作は、細胞／粒子状物質間で生じ得る相違に付随する問題に対処し、また、所望の細胞／粒子状物質１０６を、同じ試料保持領域１２２に存在し得る他の細胞／粒子状物質１０６両方から識別／区別することだけでなく、細胞／粒子状物質を、分析物放出または分泌と会合していない可能性があるほこりまたは粒子などの他の材料から区別することの両方を容易にする。

【0122】

様々な実施形態では、細胞は、予想された形態、形状またはサイズを、分析されたときに有し得る。例えば、細胞は、おおよそ円形で凸状であることが予想され得る。同様に、粒子状物質は、既知の寸法および均一性を有し得る。画像化の間、細胞の画像は、例えば、概して明るい内側部分と比較して輪郭または周辺部が概してより暗い、予想されるプロファイルを有し得る。同様に、粒子状物質は、均一に照明されること、または様々な他の光学特性を示すことなどの、他の予想される特性を有し得る。細胞は特に、個々の細胞の物理的特性間の相違により、高い信頼度で識別することが困難なことがある。例えば、細胞サイズは変化し得るが、選択された範囲内（例えば、およそ５〜２０ミクロンの範囲内）にあると仮定できるのに対し、細胞形態はかなり一定したままであり、サイズに依存しない。さらに、少数または単一細胞／粒子状物質を含むアッセイでは、試料保持領域１２４の中の空間の大部分は開放したままであり、細胞／粒子状物質１０６は、試料保持領域１２４の中の様々な異なる位置で位置特定され得る。

【0123】

位置識別ステップ１３００によれば、選択された、以前に識別されたマイクロチャンバ／試料保持領域１２４内の、１つまたは複数の細胞／粒子状物質１０６の占有および場所（例えば、対応する画像中の画素区域）は、決定することができる。これらのプロセスは、望ましくは細胞間の変動および変形、画像品質のバリエーションに対処し、精密で正確な検出を提供する助けになる。検出プロセス１３００はまた、望ましくは、異なる物理的特性および寸法を有する異なる細胞／粒子状物質型まで拡張可能に構成されると同時に、分析されるべき多数の試料保持領域１２４に関連スル多数の個別の識別を取り扱うことができる。

【0124】

図６Ａは、細胞／粒子状物質位置識別のための例示的で詳細なプロセス６００を図示する。状態６１０で開始して、様々な試料保持領域１２４の取得明視野画像が使用され得る。このような画像は、図１Ｆ（ａ）および図１Ｆ（ｂ）に示された第１または第２の明視野画像を含み得る。細胞局在化６００は、候補識別に基づいて細胞を含めるか排除するかの基準を決定するために使用される、上下限界または勾配閾値を確立すること（ステップ６１５）を含み得る。様々な実施形態では、閾値を、選択されたチャンバ／試料保持領域１２４の平均または中間の画像強度勾配を計算することによって、決定することができる。その後、上下限界閾値を、平均または中間の画像強度勾配からの標準偏差の選択された数値または百分率に基づいて限界を識別するなどの統計的パラメータ、または計算を使用して決定することができる。次に、画像強度勾配は、後に続く分析に使用して、簡単に自動化した様式で候補細胞／粒子状物質を含めるか、または排除することができる。

【0125】

候補細胞／粒子状物質が存在し得る潜在的な場所６６０を確立するために、１つまたは複数の試料領域マスクまたは境界が識別される（状態６２０）。図６Ｂの例示的な視覚化６５０で示されているが、試料領域境界マスク６５５は、細胞／粒子状物質１０６についてサーチまたは分析されるべき区域６５８を区別するための便利なツールを提供する。マスク６５５はさらに、考慮されるべきチャンバまたは粒子保持領域または区域を数えるのに役立つことができ、各区域６５８が別々に（順次に、または並行して）分析されてすべての区域６５８が処理されるまで続行する論理フローが適用され得る。状態６２５で、境界マスク６５５によって区別された区域６５８ごとに、推定上の細胞／粒子状物質識別６６２を行うことができる。識別６６２は、考慮中の区域６５８内に位置特定された特徴のサイズ／寸法などの、選択された基準に基づくことができる。これらの基準はさらに、区域６５８内に位置特定された細胞／粒子状物質１０６が合致することが予想され得る、予想される比例関係または基準に整合または一致し得る。細胞／粒子状物質識別は、１つまたは複数の潜在的な細胞／粒子状物質識別を区別するそれぞれの区域６５８の中に、１つまたは複数の特徴を含み得る。各推定上の細胞／粒子状物質識別６６２はさらに、上記の決定された、確立された勾配閾値に基づいて、本明細書中以下でより詳細に記載するように候補細胞／粒子状物質１０６が識別され得る、勾配強度分析を行うことを含み得る。

【0126】

細胞／粒子状物質決定の精度を改善するために、かつ／または所望の細胞／粒子状物質１０６間を選択または区別するために、特徴鋳型比較が行われる（状態６３０）。図６Ｃおよび図６Ｄは、特徴鋳型比較プロセスに対応する例示的な細胞鋳型整合プロセス６７０、６７２を示す。様々な実施形態では、複数の細胞／粒子状物質鋳型画像６７４のコレクションまたはカタログを得ることができる。カタログはさらに、推定上の細胞／粒子状物質を有する画像または領域と比較するために使用することができる。

【0127】

様々な実施形態では、データベースから回収された細胞鋳型６７４が、試料保持区域１２４ごとに、目的の推定上の細胞／粒子状物質に対応する指定領域／区域と比較される。細胞／粒子状物質鋳型６７４および／または考慮中の選択された領域６７６の両方の、多数の画像化／描画６７８が行われ得る。画像６７４、６７６、６７８はさらに、様々な操作によって正規化、スケール化、および／または平衡化され得る（例えば、およそ０〜１の範囲に強度を正規化する）。様々な実施形態では、複数の描画６７８は、様々な画像の様々な強度勾配および／または大きさを含み得る（例えば、原画像および／または鋳型画像の強度または大きさの変化を表す）。

【0128】

方向勾配画像化アプローチを適用して、画像の強度の選択された、または計算された変化を決定することができる。図示されるように、推定上の画像６７６および鋳型画像６７４に対し、３つの勾配画像が示されている。次に、画像の３つの対応する対のそれぞれを互いに比較して（例えば画素ごとに）、推定上の画像６７６と鋳型画像６７４の間の類似点および相違点を決定することができる。様々な実施形態では、様々な画像全体にわたる総合強度差が計算され、推定上の領域６７６と鋳型６７４の間の類似尺度が決定される。この情報は、指定された閾値と組み合わせて、推定上の細胞／粒子状物質識別を含めるためにも、または排除するためにも、ならびに潜在的／低精度／擬陽性の識別６８２または決定的／より高い精度／細胞整合識別６８４として識別をさらに分類するための両方に使用され得る。状態６３０は、決定的／より高い精度／細胞整合識別６６１の保持によって完了する。

【0129】

生産的な細胞／粒子状物質分析物分析の割合を増大させるために、潜在的／より低い精度／擬陽性の識別６８２を状態６３５で再検査することができる。例えば、決定的とは指定されなかったが、それでもなお高くランク付けされたか、または有望な細胞／粒子状物質候補であった推定上の識別は、前述の基準に対して考慮されることができ、この場合、追加の細胞／粒子状物質が、決定的／より高い精度／細胞整合識別６６１として含まれるか、または保持され得る。

【0130】

図６Ｂに示されるように、試料領域マスクまたは境界６５５、および対応する区域６５８はさらに、上記のプロセスで識別された細胞／粒子状物質に基づいて分類することができる。例えば、選択区域６５８に会合する細胞／粒子状物質の数から、その区域は、さらなる分析６６７から排除されるように指定すること、またはフラグを立てることができる（例えば、単一細胞実験または分析において複数の細胞／粒子状物質を含むとして）。所望の数または細胞／粒子状物質を含む他の領域６５８は、さらなる分析６６８に含まれるように指定すること、またはフラグを立てることができる（例えば、単一細胞実験または分析において単一細胞／粒子状物質を含むとして）。さらに、あいまいな結果が得られた領域またはチャンバには（例えば、細胞／粒子状物質の存在または不在の明解な識別を行うことができなかった場合）、フラグを立てることができる６６９。様々な実施形態では、あいまいなチャンバまたは領域６６９は、さらなる処理または検査６４５にかけることができる。いくつかの場合には、このような領域６６９は、図１Ｆ（ｃ）に示された蛍光細胞染料／マーカー画像などの、試料アレイ１２２について得られた追加の画像／スキャンと組み合わせて評価することができる。いくつかの場合では、前述の様式における追加の処理が、細胞／粒子状物質識別の信頼度を改善するとともに、さらなる分析のために保持され得る関連領域を「救出」することができる。

【0131】

図６Ａに示された細胞／粒子状物質位置識別プロセス６００は、状態６４９で画像分類を出力することによって完了される。プロセス６００の出力には、識別された細胞／粒子状物質１０２に関連する情報が含まれ得る（例えば、それぞれの試料保持領域内の場所または位置付け、信頼度判定、細胞／粒子状物質の分類または識別など）。識別された試料保持領域１２２に関するさらなる情報は、それぞれの領域に含まれる細胞／粒子状物質１０６の数と、領域画像化の総合品質とに関する情報を含め、付加的に出力することができる。

【0132】

図６Ｅは、細胞／粒子状物質鋳型ライブラリー、データベースまたは集団６７４を生成するための例示的なプロセスを、図６Ｃおよび図６Ｄと関連して識別された、前述の方法と関連した比較のために示す。既知の細胞／粒子状物質の以前の画像化またはスキャン６９１を使用して、１つまたは複数の代表的な細胞／粒子状物質画像６９２を識別することができる。様々な実施形態では、多様な特性（例えば、異なる形態、サイズ、強度、または他の特性）を有する細胞／粒子状物質のサブセット６９２の識別は、細胞／粒子状物質１０６の選択された型またはクラスと関連付けることができる。サブセット６９２は、実験結果および分析から得られたデータおよび情報を使用して、さらに洗練し改善して代表的な細胞／粒子状物質サブセット６９３を形成することができる。様々な実施形態では、形態の類似点、実験品質、整合率の信頼度を考慮する基準、および他の基準を適用することによって、自動化された方法で代表的な細胞／粒子状物質鋳型を選択することができる。様々な代表的な細胞／粒子状物質サブセット６９３は、異なる実験、文献記述語および情報、ならびに他の情報供給源から収集して、データセットを経時的に改善することができる。加えて、いくつかの場合では、代表的な細胞／粒子状物質サブセットは、選択された細胞／粒子状物質画像が、他の細胞／粒子状物質画像に対して比較するための鋳型または基礎として使用される現在の実験からの画像およびデータを使用して、リアルタイムで決定することもできる。様々な実施形態では、試料保持領域１２４に存在し得る、他の擬陽性または望ましくない細胞もしくは粒子とは外見が似ていない代表的な細胞／粒子状物質画像が優先的に選択される。

【0133】

図１Ｄを再び参照すると、分析物検出基材１３４の画像化から得られた１つまたは複数のスキャンに付随する分析物パターン１４２が、試料アレイ１２２の選択された画像（例えば、より高い解像度およびより低い解像度の画像に対応する、例えば第１および第２の画像）とアライメントおよび配向される（ステップ１３１０、１３２０）。前述のように、試料保持領域１２４を分析物パターン１４２と関連付けることにより、分泌された、放出された、または選択された試料保持領域１２４に存在する細胞／粒子状物質１０８と会合する、分析物１０８を決定する能力が提供される。様々な実施形態では、分析物パターン１４２の複数の画像化を、例えば異なるスペクトルまたは光学特性を画像化プロセスの間に使用して、得ることができる。この様式における複数の画像化が、個別に識別可能および／またはスペクトルにより分離可能な標識または色素を有する同一の分析物検出領域１３６の中の、同時位置決め、または多重化された分析物検出成分１３５を解像するために使用されて、多数の分析物１０８を分析物検出基材１３４の特定の領域から区別する能力を提供する。

【0134】

図７Ａは、上記で議論した画像およびスキャンをアライメントするための詳細なワークフローを示す。図７Ｂは、基準／アライメントマーカー１１６８を使用して、例示的な画像およびスキャンに適用される作業についてさらに説明する。様々な実施形態によれば、例えばより高い解像度およびより低い解像度の画像に対応する試料保持領域１２４の第１および第２の画像は、異なる目的の領域を有し得る。画像化装置（例えば、走査型光学顕微鏡）は、異なる選択された目的の領域に基づき、複数のサブ画像（例えば、およそ数十または数百の大きさ）を取得することができる。これらの画像は、互いにタイリングまたはアライメントされ得るが、そのようなプロセスは不完全であり得、結果は、より高い解像度画像とより低い解像度画像間で有意に変化し得る。

【0135】

アライメントにおける潜在的問題を軽減し、全体的な正確性を改善するために、アライメントマーカー１１６８は、試料アレイ１２２の周りに位置する。様々な実施形態では、アライメントマーカー１１６８は、これまでに記載したように、選択された試料保持領域１２４に隣接してまたは近傍に見られ得る。アライメントマーカーは、試料保持領域１２４の各カラムに存在するか、または試料アレイ１２２の周りの様々な他の位置に配置され得る。様々な実施形態では、アライメントマーカー１１６８の数および／またはサイズは、反復する様式で、または画像およびスキャンの調整およびアライメントをさらに容易にする選択された順序で変化し得る。

【0136】

様々な実施形態では、目的の領域内の不整合またはばらつきに一部起因して、画像は、検出された分析物１０８に対応するスキャンが、細胞／粒子状物質１０６を識別する対応画像と正確にマッチングまたはアライメントすることが可能となるようにアライメントされ得るのが望ましい。いくつかの例では、例えば試料アレイ１２２および分析物検出基材１３４のタイリングの不整合ならびに特徴サイズ（例えば、試料保持領域１２４／分析物検出領域１３６）、ならびに特徴それ自体と関連した潜在的なばらつき、不整合、および問題をさらに含むことに起因して、一回のグローバルアライメント作業では、すべての画像／スキャン内のすべての領域を正確にアライメントするのに不十分である可能性がある。結果として、アライメントマーカーのサブセットを使用して、各画像／スキャンの領域を局所的にアライメントする機構を提供することが、多くの場合望ましい。

【0137】

図７Ａと関連して記載した方法によれば、第１（例えば、高解像度）の正常なまたは明視野画像は、第２（例えば、より低い解像度）の正常なまたは明視野画像と容易にアライメントすることができる。様々な実施形態では、画像およびスキャンのアライメントプロセスは、分析物スキャンと類似した視野およびタイリングを有し、アライメントの複雑性を低減するより低い解像度画像によって容易である。ステップ７１０では、１つまたは複数の第１（高）および第２（より低い）の解像度画像（例えば、図１Ｆ（ａ）および１Ｆ（ｂ）で描写したような画像に対応する）が、マーカー検出およびアライメントプロセス７００へのインプットとして選択され得る。ノイズ除去作業（ステップ７１５）は、画像品質を改善し、アーティファクトを除去する。そのようなプロセスは、例えばガウシアンアプローチの差、ならびに他のノイズ除去法を使用して実現可能であり得る。各画像が、ある範囲の選択されたまたは所望の数の試料保持領域１２４を含むように、インプット画像は細分化される（ステップ７２０）。例えば、画像の細分化は、各サブ画像が試料保持領域１２４についてほぼ単一カラムを含むように実施され得る（例えば、１０〜１００の間または他の選択された量）。

【0138】

サブ画像ごとに、アライメントマーカー１１６８が、マーカーアウトライン検出法を適用することにより識別され得る（ステップ７２５）。様々な実施形態では、キャニーエッジ検出アプローチが利用され得る。エッジ検出は、画像に含まれる特徴の他の品質アセスメント、例えばアライメントマーカー領域の拡張および侵食の形態アセスメント、ならびに特徴輪郭検出を実施することをさらに含み得る。図７Ｂは、複数のアライメントマーカー１１６８および関連する試料保持領域１２４を含むサブ画像領域７５５の例示的な処理について説明する。オリジナルの画像７５５は、様々なアライメントマーカー１１６８を個別に識別または配置するために、上記の輪郭検出およびサイズのゲーティング操作に従って変換され得る。マーカーアウトライン検出法（ステップ７２５）の後、偽性または誤ったマーカーの識別が実施され得る（ステップ７３０）。実際のまたは十分な解像度のアライメントマーカーが、後続するアライメント操作で使用されることを確実にすることを補助するために、検出されたマーカーが、様々な基準に基づき評価され得る。例えば、アライメントマーカーおよび試料分析物領域の寸法または位置付けが、様々なアライメントマーカーと関連した画素区域とともに評価され得る。解像度が不十分なアライメントマーカーを代表する重複した輪郭はさらに評価され得る。上記の様々なアライメントマーカーアセスメント操作において、品質が低い、および／または解像度が不十分なアライメントマーカーは、さらなる分析から除外される可能性があり、したがって潜在的な下流のアライメントの問題が望ましくも避けられる。様々な実施形態では、それぞれのサブ画像中に存在するアライメントマーカーの数は、画像／スキャンアライメントのために使用できる数よりも余分または過剰であるのが望ましい。そのような冗長性は、アライメントプロセスにより高い許容性および柔軟性を提供する。

【0139】

偽陽性、品質が低い、および／または解像度が不十分なマーカーの識別に加えて、方法７００は、失われたアライメントマーカーのために、予想される場所を識別するプロセス、あるいは品質が低い、および／または解像度が不十分なマーカーを補正する補充操作（ステップ７３５）を提供するプロセスを含み得る。これらのプロセスに続き、残りのアライメントマーカー１１６８は、マーカーがそれぞれのサブ画像内で明確に区別可能であることを確実にすることを補助するために、シェーディング、カラーリング、または他の方法により、より明確に識別され得る（ステップ７４０および図７Ｂ（ｃ）でさらに説明する）。得られた識別および処理されたアライメントマーカー１１６８ならびに関連するサブ画像７６５は、次にさらなる処理のためにアウトプットされ得る（ステップ７４５）。

【0140】

図１Ｄを参照すると、上で議論したように、類似した操作１３１０、１３２０が、高解像度およびより低い解像度の画像化（例えば、図１Ｆ（ａ）および１Ｆ（ｂ））で得られた様々な画像と関連したサブ画像７５５それぞれについて使用でき、各事例において識別される高品質アライメントマーカー１１６８を有する処理された画像が得られる。その後、対応する第１（例えば高解像度）および第２（例えばより低い解像度）の画像が、相互にアライメントされ得る。

【0141】

図７Ｄに示すアライメントプロセスのための対応する例示的な説明図７９２とともに、第１および第２の画像をアライメントするための例示的な方法７７０を図７Ｃに示す。最初に、対応する第１（例えば高解像度）および第２（例えば低解像度）の画像について、検出および妥当性を確認したアライメントマーカーを有するサブ画像が処理のために受け取られる（ステップ７７５）。これまでに記載したように、複数のサブ画像が、類似したまたは同一の目的の領域に対応してアライメントされ得るのが望ましい。サブ画像のアライメントは、アライメントプロセスに役立つように、１つまたは複数のオフセットを適用して、対応する第２のサブ画像に重ね合わされる／配向される第１のサブ画像を選択するステップに進む（ステップ７８０）。

【0142】

各オフセットは、例えばオフセット距離または位置を反映する画素の数により決定されるオフセット距離を用いて、それぞれの画像フレームを位置付けする際のシフトに該当し得る。オフセットごとに、各サブ画像内に存在する検出されたアライメントマーカーは、それぞれのサブ画像間で重複するアライメントマーカーの数を決定するために評価される。より詳細に記載するように、アライメントマーカー間の重複の数および程度は、サブ画像の重複の範囲または質を決定する際の因子として使用することができる。様々な選択または決定されたサブ画像オフセットについて、画素／アライメントマーカーの重複が最も大きい画像オフセットが識別され得る。

【0143】

図７Ｄは、ステップ７８０の複数のオフセットプロセスについて説明するが、その場合、それぞれ４５０画素、８００画素、１２００画素、および１８００画素であるおよそのアライメントマーカーの重複に対応する個別のオフセット間隔（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）について、選択されたサブ画像７９３が、別の関連するサブ画像７９４と重ね合わされる／配向される。最大の画素の重複（例えば、図７Ｄの（ｄ））に対応する画像オフセットを使用して、サブ画像内の試料保持領域１２４が割り当てられるか、または選択されたオフセットと関連付けられる（ステップ７８５）。このプロセスは、次に１つまたは複数の第１および第２の画像にまたがる実質的にすべての対応するサブ画像について完了するまで、追加の対応するサブ画像について繰り返され得る。プロセス７７０のアウトプットは、対応する第１および第２の画像ごとに、各サブ画像内の関連する試料保持領域１２４のアライメントについて、詳細および値を提供する。アライメント後の画像は、次に下流の処理で使用され本明細書において以後より詳細に記載するように、分析物パターンにさらに関連付けられ得る。

【0144】

図１Ｄを再び参照すると、試料アレイ１２２のそれぞれの試料保持領域１２４に配置された細胞／粒子状物質１０６が分泌または放出した個別の分析物１０８の検出および解像度は、分析物検出基材１３４上に形成された、またはそれと関連付けられた対応するフィンガープリント、バーコード、または分析物パターン１４２の関連付けおよびアライメントを必要とする。別途指摘するように、複数の画像およびスキャンにまたがり可視化された特徴のサイズが小さく、数が多いと、画像およびスキャンを相互に対して配向し、かつアライメントするために、高度に正確な手段を提供することが重要となる。ミスアラインメントは、失ったおよび誤った分析物の識別を含む、品質の低いデータ分析を導くおそれがある。本明細書に記載する方法論は、望ましくは、そのような問題を回避し、画像およびスキャンを関連付け、かつ評価するために、高度に正確な手段を提供する。

【0145】

様々な実施形態では、アドレス可能な基準またはアライメントマーカー１１６８が、関連する画像およびスキャンを相互に対して識別および位置付けする際に、有利に活用される。例えば、試料アレイ１２２（例えば、画像１Ｆ（ｂ）で検出された）の試料保持領域１２４と関連付けられたか、その付近に位置付けされたか、またはそれとともにアライメントされたアライメントマーカー１１６８が、分析物検出基材１３４（例えば、画像１Ｇ（ｂ）で検出された）の分析物検出領域１３６と関連付けられたか、またはその付近に位置付けされた、対応するアライメントマーカーまたは他のアライメントマーカー１１７１と組み合わせて使用することができる。

【0146】

試料アレイ１２２と分析物検出基材１３４の間では、正確および／または一義的なアライメントが望まれることが認識される。そのようなアライメントは、マイクロチャンバ／試料保持領域１２４が、対応するフローレーン／分析物検出領域１３６と適切にアライメントされることを確実にすることを補助する。これに関して、様々なタイプ、数および／または位置付けのアライメントマーカー１１６８、１１７１が、試料アレイ１２２および分析物検出基材１３４の様々な画像およびスキャンの間の最適なアライメントの識別を促進するのに役立つ可能性がある。

【0147】

アライメントマーカー１１６８、１１７１は、スキャンおよび／または画像の間の特徴を画像化する際に、スケールまたは差の変動を解像するのにさらに役立つ可能性がある。例えば、回転および／または並進の差が、アライメントを改善するために、対処および補正されるのが望ましい画像およびスキャンの間に存在する可能性がある。これら問題に対処するために、正確にアライメントマーカーを検出することが望ましく、またそのような検出は様々な画像化を正確にアライメントするのに使用することができる。いくつかの変数が、例えばｘとｙの並進またはオフセット、画像／スキャン回転角度の差、および画像／スキャンの倍率を含む、アライメントマーカーの識別および解像中に検討され得る。これらの要因を念頭に置いて、検出されたアライメントマーカーを、高レベルの正確性を伴い、試料保持領域１２４の配向を分析物検出領域１３６に合わせるのに使用することができる。図８Ａは、上記の特徴を関連付け、アライメントするための詳細なプロセス８００について説明する。図８Ｂは、対応する分析物検出領域１３６とともに、試料保持領域１２４の例示的なサブ画像部分について、図８Ａに記載されているプロセスの説明図８５０を提供する。

【0148】

ステップ８０５では、分析物検出基材１３４および試料アレイ１２２の対応するスキャンから検出されたアライメントマーカーが、収集および関連付けられ得る（例えば、図１Ｆ（２ｂ）および１Ｆ（３ｂ））。アライメントマーカーは、様々な方向、例えば水平方向、垂直方向、および／または対角線方向に配向するのに役立つように、分析物検出基材１３４および試料アレイ１２２の表面付近に様々な方式で位置付けされ得る。例として、アライメントマーカーの詳細およびアライメント情報、例えば分析物検出領域の場所および識別を分析中に生成される情報が、先行するステップから取得され得る（例えば、図５）。ステップ８１０では、選択された試料保持領域１２４のおよその位置および配向が、選択されたアライメントマーカー（例えば、対角線マーカー）を使用して決定され得る。ステップ８１５では、試料保持領域１２４の最初に決定された位置付けおよび配向を精緻化するために、さらなる操作が実施され得る。１つまたは複数の異なるセットのアライメントマーカー（例えば、水平マーカーおよび／または垂直マーカー）を使用して、試料保持領域１２４のより正確な位置付けおよびスケーリングが、１つまたは複数の操作に従って実施され得る。試料保持領域１２４のアップデートされた位置およびアライメントの詳細が、関連する分析物検出領域１３６の位置付けに対してアライメントするために、次に使用され得る。それぞれの画像およびスキャンに関するアライメントの結果が、次にステート８２０でアウトプットされる。

【0149】

図８Ｂは、試料保持領域１２４と分析物検出領域１３６の間のアライメント８５０の説明図を提供する。パネル８５５では、関連するアライメントマーカー８５６の位置付けから決定され得る分析物検出領域１３６に対応する検出されたフローレーンについて、サブ画像が描写される。パネル８６０では、対応する試料保持領域１２４とともにサブ画像を、アライメントマーカー８５７とともに描写する。２つの画像の相対的な位置付けは、互いに対して若干オフセットしてみえることが画像から指摘され得る。上記プロセスを使用して、２つのサブ画像８５５、８６０に由来するアライメントマーカー８５６、８５７が、２つのサブ画像の間で、より正確なアライメントを提供するのに役立つように活用され得る。したがって、サブ画像８６０では、アライメントマーカー８５６、８５７の２つのセットを使用する位置付けおよびアライメントにより、試料保持領域１２４と分析物検出領域１３６が交差するところで形成される分析物パターン１４２の可視化に対する正確なアプローチが提供される。これらの重複する領域は、その領域内に配置される分析物検出成分１３５のタイプ、ならびに試料保持チャンバ１２４と関連する１つまたは複数の細胞／粒子状物質から分泌または放出される検出された分析物１０８の存在に基づき、分析物１０８のシグナルが常在すると予想される位置とさらに対応する。

【0150】

図１Ｄを再び参照すると、ステップ１３４０では、分析物検出領域１３６の場所および位置付けが決定される。様々な実施形態では、分析物検出領域１３６の場所情報は、これまでの分析、計算、および評価から、一部支援され得る。例えば、画像分析操作、およびステップ１２２０、１２４０におけるアライメント特徴識別に関する情報が、関連するフローレーン／分析物検出領域１３６をさらに識別するために活用され得る（図３および５も参照）。図５（ｆ）に示すように、アライメント特徴／マーカーについて予想されるフローレーン／分析物検出領域の位置付けに基づき、検出後されたアライメント特徴／マーカーと関連付けられるフローレーン／分析物検出領域１３６をさらに識別するために、アライメント特徴／マーカーの配置された位置および配向が使用され得る。

【0151】

分析ワークフロー１０００に示すように、ステップ１４００、１４１０、および１４２０は、細胞／粒子状物質の識別について、さらなる操作を実施するのに使用することができる。例えば、細胞に基づくアッセイ（例えば、単一細胞アッセイおよび／または細胞間相互作用アッセイ）および関連する分析物１０８分析では、異なる種々の細胞型の間を区別するさらなる操作を実施するのが望ましい場合がある。さらに、選択された細胞１０６から分析物１０８が検出される場合、選択された細胞１０６の生理学的または生化学的な状態を評価または決定するのが望ましい場合がある。様々な実施形態によれば、１つもしくは複数の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８、および／またはＣＤ３に対応する表面マーカー）が検出され、かつ／または他の染色剤もしくは染料が評価され得る（例えば、バイタリティー染色剤または染料）。

【0152】

様々な実施形態によれば、選択された細胞集団および細胞の特徴が、１つもしくは複数の代表的な細胞表面マーカーの検出、または発現された膜会合／分泌タンパク質の指標により識別、分類、および／または区別され得る。したがって、選択された試料保持領域１２４に保持された単一の細胞ならびに複数の細胞１０６は、分泌または放出された化学物質、生化学的物質、または他の細胞関連の成分から生じる分析物パターン１４２に加えて、あるいはそれと組み合わせて評価される様々なマーカー、染料、染色剤、および／または試薬に曝露され得る。

【0153】

単一細胞または少数細胞の分析中、上記識別および特徴付け操作は、選択されたマイクロチャンバまたは試料保持領域１２４内の細胞の場所および位置付けを精緻化および／または確認するのにさらに使用することができる（ステップ１４００）。そのようなプロセスは、取得された様々な画像およびスキャンを使用して、特徴的な光学特性、または画像およびスキャンにおいて視認される細胞に付随する細胞の特徴を評価するステップに進むことができる。例えば、細胞が、適切な染料および／または抗体により標識されるか、印を付けられるか、または染色される場合、細胞の位置は、一般的に高い蛍光またはシグナル強度により決定され得ることが観察され得る。そのようなシグナルは、例えば細胞と会合した１つもしくは複数の対応する識別可能な表面マーカー（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ８、および／またはＣＤ３）、またはバイタル染色剤もしくは他の染料の場合には、いくつかの他の識別可能な特徴（例えば、生存細胞と死亡細胞）の存在をさらに示し得る。

【0154】

細胞表面マーカーに対して検出された蛍光または高シグナル強度は、観察された蛍光もしくは観察されたシグナルに接近して、またはまさに同一の区域内に位置すると予想される細胞の位置付けについて、良好な表示を提供する。しかし、いくつかの事例では、表面マーカーである抗体、染料、染色剤、または他のマーカーは、比較的ノイズが多いか、または拡散性のシグナルを生成するおそれがあり、その結果、細胞１０６を含む試料保持領域１２４内に、バックグラウンドが比較的高い区域を生じさせる可能性がある。バックグラウンドまたはノイズが高いと、試料保持領域１２４と関連した細胞／粒子状物質１０６の可視化または検出を不明確にするおそれがある。これらの高バックグラウンド試料保持領域１２４は、識別され、フラグ付けされ、および／またはさらなる分析から除外されるのが望ましい場合がある（ステップ１４１０）。

【0155】

さらに、シグナル強度または蛍光は、異なる試料保持領域１２４内の細胞／粒子状物質１０６の間でばらつきを示す場合もあり、実験間でばらつき、および／または使用した染色剤、マーカー、もしくは染料の品質もしくは特徴によってばらつく可能性がある。一部の例では、対応する表面マーカーを有するか、または選択された染色剤、マーカー、もしくは染料で標識されているにもかかわらず、検出可能なシグナルを示さないか、または脆弱なシグナルしか有さない細胞／粒子状物質１０６の集合が存在する場合もある。さらに、同じタイプ、または一般的特徴を有する２つまたはそれ超の細胞／粒子状物質１０６が、近接してまたは相互に隣り合って常在する場合には、蛍光またはシグナルの起源を区別する際に、困難が認められる場合がある。細胞分泌、タンパク質発現、および他のタイプの生体分析では、検出された各細胞に付随する細胞型および表面マーカーまたは他の特徴を正確に決定することが重要であり得る。したがって、細胞に付随する細胞表面マーカーまたは他のシグナル特性に基づき、潜在的または候補細胞の識別を、真正細胞または偽陽性細胞として標識することが望ましい場合がある（ステップ１４２０）。

【0156】

図９Ａは、細胞／粒子状物質の位置を識別および区別するための詳細な方法９００を示す。図９Ｂは、細胞を特徴付けおよび区別するための表面マーカー９８５（ＣＤ８およびＣＤ３）で標識された細胞とともに、試料保持領域１２４の例示的サブセットを表す位置付けおよび区別プロセス９７０についてさらに説明する。プロセス９００は、例えば蛍光検出により可視化され得る染料、マーカー、または標識で識別可能な細胞／粒子状物質１０６に対応するインプット画像を受け取るステップより開始する（図１Ｆ（ｃ））。上で議論したように、マーカーは、同時にまたは異なる時点で画像化／スキャンされる１つまたは複数の細胞／粒子状物質表面マーカーを含み得、そのデータは、本明細書に記載するアライメントおよび位置付け機構を通じて集約される。アライメントプロセス９００において、さらなる情報も利用することができ、そのような情報は、識別されたマイクロチャンバ／試料保持領域、真正および潜在的な細胞候補、ならびにアライメントされたマイクロチャンバ／試料保持領域の情報に対応する（例えば、図４、６、および７と関連してそれぞれ記載されるプロセス４００、６００、７００から得られる）。

【0157】

最初に、ステップ９１０において、平均バックグラウンドシグナルまたはノイズ比が、決定され得る（例えば、分析で使用される染料、マーカー、または標識に起因するバックグラウンド蛍光を識別するために）。平均バックグラウンドシグナルは、その中に常在する細胞／粒子状物質１０６を欠く１つまたは複数の試料保持領域１２４を評価することにより、さらに決定され得る。様々な実施形態では、細胞／粒子状物質１０６を欠く試料保持領域１２４は、低バックグラウンドを示すか、またはそれぞれの試料保持領域１２４の全体を通じて存在する平均公称バックグラウンドを反映するものと予想され得る。

【0158】

ステップ９１５では、試料保持領域または区域１２４は、インプット画像（例えば図１Ｆ（ｃ））と相関する。このプロセス９１５では、アライメントされた第１および第２の画像（例えば、図１Ｆ（ａ）、１Ｆ（ｂ））について、これまでに決定されたオフセット情報がさらに利用され得る。ステップ９２０では、評価されるそれぞれの区域を単離またはローカライズするために、マイクロチャンバまたは試料保持領域マスクが決定される。このプロセス９２０の一部分は、細胞／粒子状物質１０６が検出されるか、または予測される場所の外側にある領域内の平均画素強度または密度を識別するステップであって、それぞれの試料保持領域１２４内のバックグラウンドを決定するステップを含み得る。例えば、検出されるか、または可能な細胞区域、シグナル、または強度を除外することにより、平均画素強度が、選択された試料保持領域１２４の部分について決定され得る。その後、選択されたマイクロチャンバ／試料保持領域１２４に関するバックグラウンドシグナル（例えば、蛍光）が決定され得る。

【0159】

ステップ９２５では、識別または予測された細胞／粒子状物質の場所に隣接する区域内の高シグナル強度がさらに識別されるように、試料保持領域１２４が評価され得る。例えば、細胞／粒子状物質１０６の周辺または近傍に常在する最高蛍光シグナルが、１つもしくは複数の表面マーカーまたは画像について決定され得る。上記識別されたバックグラウンドシグナル／強度の情報および細胞／粒子状物質関連の最高シグナルの存在を考慮しながら、試料保持領域１２４のそれぞれの画像内の細胞／粒子状物質１０６の相対的位置が、高度の正確性を伴い決定され得る。この情報は、対応する試料保持領域１２４内の細胞（単数または複数）／粒子状物質（単数または複数）１０６と関連した分析物パターン１４２の１つまたは複数のスキャンとさらに関連付けられ得る。

【0160】

ステップ９３０では、細胞／粒子状物質表面マーカー強度が、検出されたマーカーを決定し、定量するために評価され得る。様々な実施形態では、分析される細胞ごとに、検出または細胞に付随する１つまたは複数の表面マーカーの存在が、細胞の特徴および／または状態を決定するのに使用され得る。さらに、例えば、上記の決定および計算に基づき、高バックグラウンドシグナルが存在する場合、関連する試料保持領域１２４は、フラグ付けされ、および／またはステップ９３５においてさらなる分析から除外され得る。このように、試料保持領域をフラグ付けし、または除外すれば、高品質の結果の生成に役立ち、および／または試料データの異常なもしくは誤った解釈を防止し得る。最終的に、ステップ９４０では、許容されるバックグラウンドを有する試料保持領域が、関連する細胞／粒子状物質の位置、および表面マーカーパターンまたは識別子（存在する場合には）を含む識別特性とともに、さらなる処理のためにアウトプットされる。

【0161】

図９Ｂは、図９Ａに記載するプロセスの図形表示９７０を提供し、その場合、例示的な単一細胞アッセイにおいて、ＣＤ３およびＣＤ８に関する表面マーカーが個別に画像化され、アライメントされる。画像化９７２は、ＣＤ８表面マーカー検出について検出されたシグナルを反映する。画像化９７２内の細胞１０６の一部分は、ＣＤ８マーカーの存在を識別するのに十分なシグナルを示す。画像化９７４では、同一の試料保持領域１２４の例示的な明視野画像が、画像化９７２に存在する細胞および他の細胞１０６の存在を示す。複合画像化９７８により表されるように、２つの画像化９７２、９７４と関連したシグナルの比較、重ね合わせ、またはマージは、アライメントマーカーおよびこれまでに記載したプロセスと類似したプロセスを使用して実現し得る。

【0162】

同様に、画像化９７６は、ＣＤ３表面マーカー検出について検出されたシグナルを反映する。画像化９７６内の細胞１０６の一部分は、ＣＤ８マーカーの存在を識別するのに十分なシグナルを示す。複合画像化９８０により表されるように、２つの画像化９７２、９７６と関連したシグナルの比較、重ね合わせ、またはマージは、アライメントマーカーおよびこれまでに記載したプロセスと類似したプロセスを使用して実現し得る。複合画像化９７８および９８０は、これまでのパネルのそれぞれからのデータおよびシグナル情報を合わせる最終画像化を提供するために、さらに比較または重ね合わせがされ得る。まとめると、細胞の位置ならびに検出された細胞表面マーカー９８５が決定され得る。差次的に検出されたマーカー（ＣＤ８、ＣＤ３）の存在により細胞の異なる特徴および／または発現パターンが示される。この情報は、細胞を分類またはグループ分けし、異なる細胞型および／または状態の間で区別するのにさらに使用することができる。そのような分類およびグループ分けは、以下で議論される検出された分析物パターン１４２それぞれと関連してさらに検討され得る。

【0163】

図１Ｄを再び参照すると、試料アレイ１２２の試料保持領域１２４、および分析物検出基材１３４の分析物検出領域１３６と関連した様々な画像およびスキャンについて位置付けおよびアライメント操作の後、分析ワークフロー１０００は、選択された細胞／粒子状物質１０６に付随するか、またはそれに帰属可能な分析物パターン１４２を配置および識別するステップに進むことができる（ステップ１４３０）。図１０Ａは、分泌読み出し決定に関するワークフロー１５１０の詳細を提供する。さらなる分泌読み出しの説明図を、図１０Ｂに提供する。

【0164】

様々な実施形態では、細胞／粒子状物質１０６により発現、分泌、または放出された１つまたは複数の検出された分析物１０８に対応する選択された分析物パターン１４２は、１つまたは複数の個別のシグナルを含み、そのそれぞれは、分析物検出基材１３４に対して既知のまたは予想される様々な場所の付近に位置するそれぞれの分析物と関連する。分析物検出基材１３４の付近において、様々な分析物検出成分１３５／分析物検出領域１３６を組み立て、位置付けし、および／または配置する方式は、得られた検出された分析物１０８の配向および位置を決定する。

【0165】

様々な実施形態では、異なるスキャンにおいて観察された位置または領域であっても、それとほぼ同一の位置または領域において、２つまたはそれ超の分析物が検出され得る。位置的に多重化した分析物検出成分１３５は、したがって、発せられたシグナルのタイプ、および／またはそれらが現れるスキャンもしくは画像化により相互に解像され得る。（例えば、同時に配置されたか、または位置的に多重化した分析物検出成分は、別々に検出および／または区別され得る個別の標識またはフルオロフォアを含み得る）。

【0166】

選択された細胞／粒子状物質１０６に関する分析物パターン１４２は、分析物検出成分１３５が位置する分析物検出基材１３４上で、選択された試料保持領域１２４を対応する一連の１つもしくは複数の位置または領域１３６と関連付けることにより識別され、または「読み取られ」得る。検出された分析物１０８をもたらすそれぞれの細胞／粒子状物質１０６の配置は、したがって、下でより詳細に記載されるように、重複が生ずる細胞画像および分析物検出スキャンの１つもしくは複数の選択された画素区域（単数または複数）または領域を評価することにより決定され得る。代表的なシグナル／スキャン画像において識別されたシグナル強度値は、識別および処理を容易にするために、別個の画素および／または画像化区域内の画素を代表する割り当てられた数値に対してマッピングされ得る。様々な実施形態では、選択された閾値の識別されたシグナル強度は、検出された分析物１０８と関連し得る値を取得するために平均化され得る。様々な実施形態では、分析物１０８のより正確な定量および／または選択された分析物１０８が存在することの確認は、分析物検出／画素分析の２つまたはそれ超の領域を使用して決定され得る。これらの領域のスキャン／画像化は、試料保持領域１２４と分析物検出領域１３６の間の２つもしくはそれ超の区域または場所に、個別の重複を提供する。様々な実施形態では、対応する重複領域ごとに観察された強度値が比較され、かつ／またはそれぞれの検出された分析物１０８の識別について、より高い信頼性をもたらすために平均化され得る。

【0167】

図１０Ａに示す通り、分析プロセス１５１０は、検出されたフローレーン、または対応するマイクロチャンバもしくは試料保持領域１２４とアライメントされた分析物検出領域１３６を取得するステップから開始し得る。様々な実施形態では、検出された分析物１０８に対応するサブ画像が、１つまたは複数の分析物が検出される強度領域を識別するのに利用され得る（例えば、図１Ｇ（ａ）および（ｂ）を参照）。対応するフローレーンまたは試料保持領域１２４は、次に、分析物スキャンを重ね合わせるか、またはマージして、重複領域の位置を特定するのに使用され得る。上で議論したように、重複は、様々な画像およびスキャン内の画素に従って決定され得る。重複領域または区域は、次に、ペアワイズ方式で対応する試料保持領域１２４／分析物検出領域１３６に割り当てられ得る。

【0168】

識別された重複について区域または領域が割り当てられると、関連する強度データまたはシグナル情報が、各位置から抽出され得る（ステップ１５２５）。選択された区域からの関連または対応するシグナルは、さらに平均化されて、検出された分析物１０８に対応するアウトプットシグナルまたは読み出しを提供し得る。ある特定の例では、信頼性が低いか、または外れたデータもしくはシグナルは、下記の図１１においてより詳細に記載するように、除去またはフラグ付けされ得る。同一の細胞／粒子状物質１０６、および分析物１０８のペアリングと関連した重複性または冗長性のシグナル強度が、検出された分析物１０８の最終的な分析物読み出しを生成する前に、妥当性および／または信頼性についてさらに比較および／または平均化され得る。その後、有効な検出された分析物１０８、関連する強度、および他の特徴が、アウトプットされ得る（ステップ１５３０）。

【0169】

図１０Ｂは、図１０Ａに記載する画像化および画素比較プロセスの例１５５０について説明する。サブ画像１５５５に示すように、複数の分析物検出領域１３６（「タンパク質レーン」として識別される）が、複数の試料保持領域１２４（「チャンバ」として識別される）と重複し得る。例示的なサブ画像１５５５によれば、分析物検出領域１３６は、一般的に水平方向に配置された試料保持領域１２４をともなって、概して垂直方向に配置されて重ね合わされるか、または配向される。観測可能なシグナル強度を有する重複領域１５５７がさらに識別される。サブ画像１５６０は、分析物「レーン」１５と試料「チャンバ」２３の間の選択された重複領域の拡大図を提供する。重複領域１５５８により表されるように、分析物読み出し区域は、検出された分析物１０８の存在を示すように指定され得る。サブ画像１５７０は、同一の細胞／粒子状物質１０６および検出された分析物１０８領域に対応する２つの別個の重複領域１５７２、１５７４に関するペアワイズ読み出しについてさらに説明する。これらの領域は、独立して評価され、結果は上記のように比較および／または平均化され得る。

【0170】

図１０Ｃは、上記図１０Ｂに記載した画像化および画素比較プロセスのさらなる例１５５１について説明し、例示的な試料保持領域１２４についてのマーカーパターン１４２と関連したペアワイズ読み出し１５５２を示す。複数の分析物（例えば、サイトカイン）１０８は、個別に同時に検出され、マーカーパターン１４２から解像され得る。画像パネル（ａ）および（ｂ）に示すように、複数の画像が、同一の分析物検出領域１３５付近において同時に位置特定または位置決めされ得るマーカー１３５を個別に識別するために、例えば異なる波長を使用して、または異なる画像取得上の特徴を用いて取得され得る。パネル（ｃ）に示す通り、異なる画像取得上の特徴を用いて取得される画像は、さらに重ね合わされるか、またはマージされ得る。

【0171】

図１Ｄを再び参照すると、分析物／分泌の場所を識別および分析した後、バックグラウンドシグナル評価および外れ値検出分析が実施され得る（ステップ１４４０）。図１１は、信頼性が低い、間違いを起こしやすい、または外れ値である可能性のあるデータおよびシグナルをゲーティング、除外、および／またはフラグ付けするプロセス１６１０を表す。図１０と関連して上で議論したように、様々なスキャンまたは画像（またはその一部分）が、バックグラウンドおよびノイズが高い領域、ならびに他の潜在的なアーティファクトに該当する可能性があり、分析方法１０００によりアウトプットされたシグナルデータおよび結果の品質を台無しにするおそれがある。分析から誤った結果や低品質の結果をアウトプットするのを避けるために役立つように、様々な品質チェックまたはゲーティング手順１６２０が、アウトプット分析物の識別、読み出し、およびステップ１５３０から得られた関連画像／スキャンデータに適用され得る。このデータは、１つまたは複数の品質チェック１６２０が適用される品質レビュー（ステップ１６２５）用として最初に受け取られ得る。

【0172】

１つの例示的な品質検定１６３０は、画素情報に基づく画像／スキャン品質のアセスメントを含み得る。グラブス検定は、潜在的な外れ値として識別される画像／スキャン内の画素を除外する、またはフラグ付けするために実施され得る。様々な実施形態では、分析物検出領域１３６と重複する試料保持領域１２４の部分に関する画像／スキャン（図１０Ｂに例示する）に対応する画素データが、画素データの他の領域とともに検討され得る。グラブス検定で棄却された画素データは、これらの領域内の関連する画像／スキャンデータは疑わしく、結果／読み出しは、除外されまたはさらなるレビューのためにフラグ付けされ得る指標として役に立つ可能性がある。

【0173】

別の例示的な品質検定１６３５は、強度情報が抽出および評価される領域の画素区域またはサイズを評価するステップを含み得る。サイズ閾値が画像／スキャンデータに適用でき、選択された閾値に満たない、または適合しない画素区域と関連した分析物の結果／読み出しが除外されまたはさらなるレビューのためにフラグ付けされ得る。一例として、分析物検出領域１３６と関連する試料保持領域１２４の間の重複が不十分であると、データを正確に決定またはアセスメントするための画素情報が不十分となる可能性がある。事前に選択された基準により重複が不十分と決定された領域では、結果／読み出しは、除外されるか、またはさらなるレビューのためにフラグ付けされ得る。

【0174】

さらなる例示的な品質検定１６４０は、高い間質性のバックグラウンドが領域を識別するために、画像／スキャンデータを評価するステップを含み得る。様々な実施形態では、識別された分析物検出領域１３６および／または試料保持領域１２４と実質的に隣接するまたはその近傍の（例えば、上部、下部、右側、または左側）区域内の画像／スキャンを評価すると、間質性領域の１つまたは複数が、分析物シグナルと関連した閾値を上回ることが示される場合がある。そのような結果は、関連するデータ／読み出し結果が偽陽性結果を示すことを示唆し得る。したがって、そのような結果／読み出しは除外されるか、またはさらなるレビューのためにフラグ付けされ得る。

【0175】

別の例示的な品質検定１６４５は、選択された試料検出チャンバ１２４に付随する観察された分析物結果について検討し得る。様々な実施形態では、選択された分析物について、少なくとも１つの信頼性のある分析物の識別／読み出しと関連しない試料保持チャンバは除外されるか、またはさらなるレビューのためにフラグ付けされ得る。一部の例では、少なくとも１つの信頼性のある読み出しが、２つまたはそれ超の関連する分析物画像化区域から取得されるべきである。

【0176】

上記の様々なゲーティングおよび品質アセスメントチェックのうちの１つまたは複数を適用した後に、得られた分析物データ／読み出しは、有効とみなされ、そしてアウトプットされ得る（ステップ１６５０）。様々な品質アセスメントを適用することにより、データ分析の全体的な信頼性および品質が改善するのが望ましいと認識される。したがって、分析物のアウトプットデータ／読み出し品質をさらに高めるために、さらなる品質アセスメントが適用され得る。

【0177】

図１Ｄを再び参照すると、高バックグラウンドシグナルおよび関連する分析物データを除外した後、データ分析１０００は、１つまたは複数の分析物検出領域１３６において検出された分析物１０８について、シグナルの定量に進むことができる（ステップ１４５０）。図１２Ａは、例示的な画像化１６１０、１６２０について説明し、分析物検出領域１３６と交差する選択された試料保持領域１２４の一部分を図示する。画像パネル１６１０に示すように、その中に含まれるか、または常在する細胞／粒子状物質１０６を欠くことがこれまでに決定されている試料保持領域１２４（「ゼロ−細胞−チャンバ」として識別されるチャンバ３、５、２２）が識別される。様々な交差する分析物検出領域１３６（例えば、レーン１５）と関連した領域内のシグナル強度が、バックグラウンドシグナル強度を決定するまたは特徴付けるために活用され得る。

【0178】

例えば、細胞／粒子状物質１０６を欠く試料分析物領域のうちの１つまたは複数と関連したシグナル強度が、関連するバックグラウンドシグナルを決定するために、選択された交差領域１６３０内で評価され得る。様々な実施形態では、バックグラウンドシグナルは、１つもしくは複数の分析物検出領域１３６および／または１つもしくは複数の試料保持領域１２４について決定され得る。バックグラウンド結果は、全体的なバックグラウンドシグナル値を決定するために、組み合わされ、平均化され、または他の方法によりさらに処理することができ、そのようなシグナル値は、他のシグナル強度データに適用されるか、またはバックグラウンドシグナルが決定された領域１６３０の近傍に位置する試料保持領域１２４について、選択されたか、もしくは対応するシグナル強度データに個々に適用される。

【0179】

画像パネル１６２０に示すように、バックグラウンドシグナル強度は、次に、少なくとも１つの細胞／粒子状物質１０６を含むものとしてこれまでに識別されている試料保持領域１２４について、シグナル強度データ関連の検出された分析物１０８に適用され得る（例えば、チャンバ１９、２３）。様々な実施形態では、バックグラウンドシグナル強度は、選択された分析物検出領域１３６と関連する分析物シグナル／読み出しを評価するのに使用することができ、得られた検出された分析物シグナルをさらに特徴付ける。例えば、画像パネル１６２０に示すように、選択された分析物検出領域１３６（例えば、レーン１５）のシグナル強度は、それぞれの試料保持領域１２４（例えば、チャンバ１９、２３）について評価され、バックグラウンドに対して特徴付けられ得る。例えば、関連するシグナル強度からのバックグラウンドシグナルの減算を行い、対応する領域が、バックグラウンドを上回る（例えば、１６４０）、またはバックグラウンドを下回る（例えば、１６４５）ものとして特徴付けられ得る。このようなバックグラウンド分析は、バックグラウンドが減算された領域に対応する分析物１０８の有無について判定を下すのにさらに使用され得る。

【0180】

図１２Ｂは、複数の試料（例えば、細胞１０６）が複数の分析物（例えば、サイトカイン１０８）について評価される実験に関する例示的な散布図１７００を表す。分析結果は、バックグラウンドシグナルまたはバックグラウンド閾値１７２０に対して、分析物シグナル／読み出しを示す細胞の数またはその割合１７１０として示される。縦軸１７３０は、横軸１７４０に表示する選択されたサイトカインの相対的強度の値または単位を提示する。バックグラウンド閾値１７２０は、サイトカインごとに独立に決定され、そして細胞は、閾値を上回る１７５０、または閾値を下回る１７６０分析物の存在を検出することにより特徴付けられる。

【0181】

分析物の分泌、または上に示した方式で表される検出結果は、多数の可能性のある細胞について、選択された分析物の全体的な発現、分泌、または存在を同時に評価するのに好都合な方法を提供する。この情報を使用することにより、集合的にプロファイリングされるべき細胞の可能な大集団が、細胞の挙動、応答、または特徴に関する見識を示すことを可能にしながら、単一細胞ベースの分析物の存在および／または応答について、細胞を評価することができる。したがって、開示の分析法を適用することにより、実用的な手段がもたらされ、そのような手段によりかなりの数の細胞にわたって、単一細胞の分析物分泌または細胞間相互作用を検出するための感度および正確性を維持しつつ、同一の細胞から分泌される生化学的物質、サイトカイン、およびケモカインを含め、複数の分析物が同時にアセスメントされる。

【0182】

図１２Ｃは、試料保持領域１２４の選択されたサブセットのマージされた画像に関する例示的な画像化結果１７０１を、試料保持領域１２４内に含まれる１つまたは複数の細胞１０６と関連する検出された分析物１０８から得られた関連するマーカーパターン／読み出しとともに説明する。ペアワイズ分析物分析結果を、これまで記載したように示し、細胞数１７０２および細胞型１７０３とさらに関連付ける。単一の細胞型１７０３（例えば、Ｋ−５６２およびＮＫ細胞）を含むそれぞれの試料保持領域１２４からの検出された分析物の結果を、型が異なる２つまたはそれ超の細胞を含む試料保持領域１２４に関する分析物結果に対して評価することにより、例えば細胞間相互作用に関する情報および見識、ならびに細胞の分析物応答または細胞分泌における関連する変化を提供することができる。さらに、型が同一の２つまたはそれ超の細胞を含む試料保持領域１２４について、分析物の結果を評価することにより、例えば細胞間相互作用に関する情報および見識を提供し、かつチャンバ内に存在する細胞数と相関する定量的分析物分析でさらに使用することができる。

【0183】

図１Ｄを再び参照すると、データ分析１０００は、個別の細胞の集団を評価して、相関性のある分析物（例えば、サイトカイン／ケモカイン）応答および試料の機能的プロファイリングを決定するためのさらなる操作およびツールを含み得る（ステップ１４６０）。様々な実施形態では、開示の方法に従って得られる実験データおよび結果は、さらに分析、比較、かつ関連付けられ、例えば免疫応答と関係し、関連付けられる、多くの異なる型の細胞の特徴、応答、および機能性を発見、スクリーニング、調査するための強力なツールを提供し得る。図１３に示すように、分析物データおよび結果を提示および解釈するための様々な方法およびツール１８００が利用可能である。例えば、単一細胞の実験では、細胞集団全体にわたる多機能性の評価は、データ分析からのアウトプットとして提供され得る。１つまたは複数の実験から得られた単一細胞発現データおよび情報は、多機能発現（例えば、同一細胞から複数のエフェクタータンパク質／サイトカインを分泌する能力）におけるパターンおよび傾向の識別と関連し得る。選択されたサイトカインに関する例示的な多機能アッセイに対応する分泌プロファイルは、例示的な円グラフ１８０５、棒グラフ１８１０、およびヒートマップ１８１５で表される。さらなる相関関係が、例えば複数の試料からの細胞型を比較し、分析物の発現もしくは分泌プロファイル、生理学的相関関係、疾患状態、および／または治療応答を決定するために、検出された分析物を既知のまたは確立されたパラメータと比較してなされ得る。

【0184】

図１Ｄを再び参照すると、データ分析１０００は、例えば既存の文献／公開資料／データセットからなるデータベースと比較することにより、分析物応答に関する実験結果と他情報との比較および／または相関関係を促進するさらなる操作およびツールを含み得る（ステップ１４７０）。図１４Ａは、単一細胞の実験結果を評価して推論決定および発見するためのツールを提供するのに使用することができる情報を含むデータベースインターフェース１８５０を表す。

【0185】

例えば、データベース１８５０は、これまでの実験ならびに文献／公表されたデータに由来する単一細胞の分泌／分析物発現情報を含み得る。例示的な実験フィルタ１８５５、公開資料フィルタ１８６０、およびデータフィルタ１８６５により、ユーザは、所望の情報、または保存された実験データおよび公開資料情報を照会するのに使用することができる関連情報に集中する能力を提供する。実験的フィルタ１８５５は、例えば、特定のまたは選択された情報源、疾患／状態、被験体の種類、細胞型および／または技術（試料分析で使用される、例えばフローサイトメトリー、酵素連結ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（ＥＬＩＳＰＯＴ）、本明細書に記載の技術等）に基づき、データ／情報の選択または検索を可能にし得る。公開資料フィルタ１８６０は、例えば特定のまたは選択された目的の区域、科学分類、著者、公開年、および／またはキーワードに基づき、関連する文献／情報の選択または検索を可能にし得る。データフィルタ１８６５は、例えば特定のまたは選択されたサイトカインまたは他の目的の分析物に基づき、データ／情報／文献の選択を可能にし得る。データフィルタ１８６５は、サイトカイン／分析物分泌プロファイルまたは値の間のデータ検索に基づく比較、ならびに多機能性サイトカイン／分析物応答に基づく選択に対して機能性をさらに提供し得る。様々なメトリクスが、全体的なサイトカイン／分析物分泌および／または多機能プロファイルの類似性を自動的に比較するために選択され得る。データベースツールとのユーザインタラクションをさらに促進するために、様々なフィルタが、サーチおよびデータ選択基準を用いて自動的に追加され得る。カタログ分類されたデータセットとユーザの現在のデータセットにおいて関連性または類似性が存在する限り、任意のユーザ選択型フィルタと連携して、全体的な決定がなされ得る。様々な実施形態では、最終的な相関関係が決定できない場合、小さいセットの関連する過去の実験／データセットを提供することが、どのような後続試験を行えば参考になるか、他の治療と比較して処置をどのように実施可能であるか等について決定する際に、ユーザをガイドまたは支援するのに役立つ可能性がある。

【0186】

図１４Ｂは、選択された単一細胞実験に由来する情報を表示する例示的な結果インターフェース１８７５を表す。結果および関係する関連データセット１８８０は、公開資料および関連データと好都合にリンクしてより詳細に選択および検討され得る。スコアまたはランク１８８５は、例えば実験的または所望の細胞プロファイルとのそれらの類似性に基づく結果１８８０にさらに帰属させて、文献／公開資料と、得られた／実験的細胞応答データとの間の詳細および相関関係を提供することができる。

【0187】

図１４Ｃは、上記のデータ分析機能、および免疫学的プロファイリング分析の文脈において単一細胞プロファイリング能力を提供するためのデータベースに関する全体的なワークフロー１９００を表す。本明細書に開示のシステムおよび方法のスループット、感度、および正確性を活用することにより、単一細胞、細胞集団、および細胞のクラスまたはタイプについて機能的特徴付けが可能となり、さらなるデータ収集、エビデンス評価、および実験結果を評価するための推論決定機能が提供される。

【0188】

様々な実施形態では、また図１４Ｄに示すように、上に記載され、関連する図に示された方法およびプロセスが、画像取得のためのコンポーネントを含むプラットフォーム１９５０を使用して実施することができ、画像分析および後続する分析物評価のためのコンピュータコンポーネントをさらに含む。プラットフォーム１９５０は、組み込み型システム、例えば所望の分析物結果および関連するデータをアウトプットする機能をそれぞれ実施する能力を有する単一のデバイスまたは機器をさらに含み得る。また、プラットフォーム１９５０は、所望の様々な機能性を実施するための様々な機器および計算コンポーネントを含む個別または分離したコンポーネントを含み得る。

【0189】

様々な実施形態では、試料アレイ１２２および関連する分析物検出基材１３４は、複数の画像／スキャンを取得する画像化装置１９５２により処理される。画像化装置１９５２は、例として顕微鏡、蛍光検出器、マイクロアレイスキャナー、および／または他の光学的およびシグナル検出装置を含む、１つまたは複数の画像化デバイスを含み得る。例えば適切な画像処理およびデータ分析ソフトウェアを備える計算デバイスを含む画像プロセッサ１９５３は、シグナル情報、画像、スキャン、および画像化プロセスと関連した他のデータを受け取るように構成され得る。画像プロセッサ１９５３は、検出された分析物と関連した対応する細胞（単数または複数）／粒子状物質（単数または複数）を決定するとともに、示されたシグナルに関与する分析物を決定または関連付けるために、情報をさらに評価および分析することができる。

【0190】

画像プロセッサ１９５３は、例えばサイトカインシグナルと、画像化装置１９５２により検出された単一細胞チャンバ／マイクロウェルとの間の対応を決定し、サイトカインシグナルを１つまたは複数の特異的細胞とさらに関連付けて、個々の細胞について、分泌タンパク質の細胞別プロファイルを生成することができる。画像プロセッサ１９５３は、検出された分析物をさらに定量化し、この情報を、検出された細胞／粒子状物質と関連付けることができる。画像プロセッサ１９５３は、細胞／粒子状物質当たり、１つまたは複数の分析物にわたって、検出された様々な細胞（単数または複数）／粒子状物質（単数または複数）に関する検出された分析物を関連付ける追加の解析をさらに実施することができる。画像プロセッサは、上記のように、細胞／粒子状物質の機能的応答および特徴をさらに決定し、１つまたは複数のデータリポジトリ１９５４に含まれる情報を活用してさらなる関連付けを実施し、成果データを決定し、既存の情報／文献と比較することができる。

【0191】

この画像化および分析法は、標準プログラミング技法を使用するコンピュータプログラムを含むソフトウェアを使用して実施され得る。そのようなプログラムは、プログラム可能なコンピュータ上で実行され得るが、コンピュータはそれぞれ、電子プロセッサ、データ保存システム（メモリーおよび／または保存エレメントを含む）、少なくとも１つのインプットデバイス、および少なくとも１つのアウトプットデバイス、例えばディスプレーまたはプリンターを含む。

【0192】

一部の実施形態では、本明細書に記載する機能を実施するため、およびアウトプット情報（例えば、分析物のアセスメント／定量、多機能性の決定、および関連する相関関係／推論）を生成するために、画像およびスキャンデータ（例えば、試料保持領域１２４、分析物検出領域１３６、および関連する細胞（単数または複数）／粒子状物質（単数または複数）１０６、および分析物パターン（単数または複数）１４２に関する画像およびスキャン）を取得および分析するためにコードが適用されるが、コードは１つまたは複数のアウトプットデバイスに適用され得る。そのようなコンピュータプログラムは、それぞれハイレベル手順のまたはオブジェクト指向のプログラミング言語、またはアセンブリ、または機械語で実施され得る。さらに、言語は、コンパイル型または翻訳型言語であり得る。そのようなコンピュータプログラムはそれぞれ、コンピュータにより読み取られると、コンピュータ内のプロセッサに本明細書に記載する分析を実施させることができるコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭまたは磁気ディスケット）に保管され得る。

【0193】

本開示のシステムおよび方法のスピード、正確性、およびスループット能力は、単一細胞アッセイレベルの細胞集団分析、および単一の細胞間の細胞シグナル伝達アッセイにおいて有用である。特に、本教示は、免疫学的細胞（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、および他の免疫細胞型）等の細胞の高度に多機能性のクラス間を区別するために、細胞集団分析に有利に適用され得る。免疫細胞は、細胞当たり多くのサイトカインの分泌をともない、多くの場合、個々の細胞についてサイトカイン分泌プロファイルの間で有意な差異を示す。本明細書に開示する教示を適用することにより、臨床医および研究者は、高感度で再現性のある方式で細胞およびタンパク質分泌プロファイルを分析することができる。単一細胞のサイトカイン分泌プロファイル（例えば、分析物読み出し）は、１もしくは複数の患者または試料について同時に分析し、免疫の機能性、制御、および毒性を評価するために、免疫細胞サイトカイン応答のデータベースに対して評価され得る。これまで記載したように、システムは、様々な細胞画像、分析物検出スキャンの処理、および単一細胞の機能分析を自動化する情報のデータベース照会について高度の自動化を実現する。

【0194】

Ｔ細胞亜集団の構成（例えば、ＣＤ４／ＣＤ８比に基づく）ならびにそれらの関連するエフェクター／サイトカイン分泌プロファイルは、臨床転帰および／または治療応答と相関性を有し得る。そのような分析が有用であり得る例として、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、ならびに病原体感染に対して適応免疫防御応答を有する患者の免疫細胞応答が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。

【0195】

様々な例では、同一のまたは類似した細胞型（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８細胞）は、動的および発展的な機能表現型を有する高度に不均質な集団を含み得る。そのような細胞は、その免疫エフェクター機能（例えば、サイトカイン分泌プロファイル）により、単一細胞レベルで分類されるのが望ましい場合がある。免疫応答の効力および非一過性は、多機能性とさらに関連付けることができ、したがって同一の細胞に由来する複数の免疫エフェクタータンパク質を分析することが望ましい。サイトカイン分泌の性質を考慮する際には、免疫保護の程度は、別個のサイトカインを同時に分泌する多機能性免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の頻度、ならびにサイトカイン分泌の質および／または量の両方と相関し得る。

【0196】

免疫細胞は、特徴的で異種の免疫学的分泌プロファイルを示すだけでなく、免疫細胞が常在する微環境における活性にも影響を及ぼす。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカインは、免疫細胞により産生され、Ｔ細胞のプライミング効果を改善し、がん環境に導入されたら、適応性抗腫瘍免疫性を誘発することができる。反対に、他のサイトカインは、患者転帰の不良と関連しており、腫瘍の増殖を促進し、抗腫瘍免疫応答を阻害することが報告されている。例えば、インターロイキン６（ＩＬ−６）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、またはマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）が不均衡に産生されると、樹状細胞の成熟を抑制し、腫瘍細胞が免疫監視機構を逃れるのを支援する調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を活性化させることにより、適応性抗腫瘍免疫性が阻害される。形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）は、多くの病理学的な状態において豊富に発現されるが、このサイトカインは、腫瘍微環境の形成、および血管形成の促進において重要な役割を有するので、腫瘍の増殖および維持に多大な影響を及ぼす。本開示の教示を適用することにより、上記免疫学的サイトカイン因子について、複数の細胞および細胞集団／試料にわたって、単一細胞レベルで正確な測定を実施することができる。個々の細胞または細胞のコレクションに関するサイトカイン分泌プロファイルは、実行可能な患者の免疫学的プロファイルを創出するために、ならびに／またはがんに対する免疫応答および機能的活性化の指標もしくは相関を提供するためにさらに評価され、既存の情報および文献値と比較され得る。

【0197】

他の用途では、罹患細胞、例えば悪性の血液学的細胞または固形腫瘍細胞の多機能性が、サイトカイン分泌に基づき、病因と相関する様々な分泌プロファイルを用いて評価され得る。分析され得るサイトカインの例として、ＣＣｌ−１１、ＧＭ−ＣＳＦ、グランザイムＢ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、パーフォリン、ＲＡＮＴＥＳ、ｓＣＤ１３７、ｓＣＤ４０Ｌ、ＴＧＦ−β１、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βを挙げることができる。さらに、例えば細胞免疫および腫瘍学ツールの区域において、単一細胞の幅広いスペクトルまたは集団にわたって、エフェクター機能について特徴付けが、正確な診断または治療評価にとって有益である場合、本開示のシステムおよび方法が、様々な臨床用途に適用されるのが望ましい場合がある。

【0198】

本開示の原理について、本明細書に示す例示的な実施形態と関連して説明してきたが、本開示の原理はそれに限定されず、そのあらゆる修正形態、変形形態、または置換形態も含む。さらに、上記の例は、当業者に対して完全な開示を与え、本開示のデバイス、システム、および方法に関する実施形態を作製および使用する方法について説明するために提供され、発明者らがその開示とみなすものの範囲を制限することは意図されない。当業者にとって明白である、本開示を実施するための上記モードの修正は、下記の特許請求の範囲内であるように意図される。本明細書に挙げたすべての特許および公開資料は、本開示が関係する当業者の技能レベルを示す。

【0199】

本明細書で使用する用語法は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、制限することは意図されない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、内容により別途明確に規定されない限り、複数形の指示物も含まれる。用語「複数」には、内容により別途明確に規定されない限り、２つまたはそれ超の指示物が含まれる。本開示のいくつかの実施形態が記載されている。それにもかかわらず、本開示の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変更をなすことができるものと理解される。したがって、他の実施形態も、下記の特許請求の範囲に含まれる。

【図1AB】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6CD】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】