特許 6971153 多重特異的ＮＫエンゲイジャータンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6971153

(24)【登録日】2021年11月4日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】多重特異的ＮＫエンゲイジャータンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20211111BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20211111BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20211111BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211111BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211111BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20211111BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/46ZNA

   C07K16/28

   C07K16/32

   A61P35/00

   A61K39/395 N

   A61K39/395 T

   !C12N15/13

【請求項の数】12

【全頁数】105

(21)【出願番号】特願2017-566332(P2017-566332)

(86)(22)【出願日】2016年6月23日

(65)【公表番号】特表2018-524326(P2018-524326A)

(43)【公表日】2018年8月30日

(86)【国際出願番号】EP2016064537

(87)【国際公開番号】WO2016207278

(87)【国際公開日】20161229

【審査請求日】2019年5月31日

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2015/064063

(32)【優先日】2015年6月23日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】62/271,459

(32)【優先日】2015年12月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】506000184

【氏名又は名称】イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＮＡＴＥ ＰＨＡＲＭＡ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ローラン・ゴーティエ

(72)【発明者】

【氏名】ナディア・アンセリズ

(72)【発明者】

【氏名】アリアーヌ・モレル

(72)【発明者】

【氏名】バンジャマン・ロッシ

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 BOLZHAUSER, Markus，Immunotherapy of childlike ALL: Influence of a bispecific CD19*NKp46 antibody on the cytotoxic activity of NK cells opposite CD19+ ALL blasts of pediatric patients，Inaugural-Dissertaion，2010年，p. 1-113

【文献】 BLOOD，2009年，Vol. 113, No. 16，p. 3735-3743

【文献】 BLOOD，2006年，Vol. 108, No. 8，p. 2648-2654

【文献】 Protein Eng. Des. Sel.，2013年，Vol. 26, No. 10，p. 645-654

【文献】 BMC Proceedings，2013年，Vol. 7, Suppl. 6，p. 1-3

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００ ー １６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／１３ ー １５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む第１の抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）と、免疫グロブリン重鎖可変ドメインおよび免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む第２のＡＢＤと、ヒトＣＤ１６Ａに結合することができるＦｃドメインとを含む多重特異的抗原結合タンパク質であって、前記第１又は第２のＡＢＤの一方がＮＫ細胞上のヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、且つ他方が腫瘍細胞によって発現される目的の抗原に結合し、前記Ｆｃドメインが、アミノ酸残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメインであり、前記多重特異的タンパク質が一価で前記ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、且つ前記多重特異的タンパク質が、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を誘導して、前記目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができ、前記標的細胞の前記溶解がＮＫｐ４６シグナル伝達によって媒介される、多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項2】

前記標的細胞の溶解が、ＮＫｐ４６シグナル伝達と、ＣＤ１６に媒介される抗体依存性細胞介在性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）との組み合わせによって媒介される、請求項１に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項3】

ＮＫ細胞上でのＣＤ１３７発現を上方制御する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項4】

ヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項5】

ポリペプチドが、表面プラズモン共鳴によって決定された場合に、１０^−７Ｍ未満のＮＫｐ４６に対するＫＤ（一価結合親和性）を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項6】

抗原結合部位の少なくとも１つが、従来のヒトＩｇＧ１抗体における抗原結合部位と比較してより大きい鎖内ドメイン運動を有するように構成されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項7】

少なくとも１つのポリペプチド鎖を含み、前記少なくとも１つのポリペプチド鎖が、可撓性リンカーによって、任意選択により可撓性ポリペプチドリンカーによって定常ドメイン又はＦｃドメインに結合された抗原結合ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項8】

表面上で固定されて、Ｂｉａｃｏｒｅを使用する表面プラズモン共鳴によって決定された場合に、２０００ｎＭ以下、任意選択により１３００ｎＭ以下、任意選択により１１００ｎＭ以下である一価結合に対するＫＤで可溶性ヒトＣＤ１６に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項9】

前記目的の抗原が癌抗原である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項10】

ＮＫｐ４６ポリペプチドへの結合に関してモノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６の任意の１つ又は任意の組み合わせと競合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項11】

多重特異的抗原結合タンパク質が、野生型ＮＫｐ４６への結合と比較して変異型ＮＫｐ４６ポリペプチドへの減少した結合を有し、変異型ＮＫｐ４６ポリペプチドが、
ａ．野生型ＮＫｐ４６への結合と比較して残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４及びＬ１０５での変異を有する変異型ＮＫｐ４６ポリペプチド、
ｂ．前記野生型ＮＫｐ４６への結合と比較して残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１及びＹ１９４の任意の１つ以上での変異を有する変異型ＮＫｐ４６ポリペプチド、及び
ｃ．前記野生型ＮＫｐ４６への結合と比較して残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５及びＳ１３６の任意の１つ以上での変異を有する変異型ＮＫｐ４６ポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質。

【請求項12】

請求項１〜１１のいずれか一項に記載の多重特異的抗原結合タンパク質を含む、癌の処置のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１２月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／２７１，４５９号明細書及び２０１５年６月２３日に出願されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１５／０６４０６３号明細書の利益を主張し、これらは両方とも、全ての図面及び配列表を含めてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表の参照
本出願は、電子形式の配列表と合わせて出願されている。この配列表は、２０１６年６月２２日に作成された３５５ＫＢサイズの「ＮＫｐ４６−６ ＰＣＴ＿ＳＴ２５ ｔｘｔ」という名称のファイルとして提供される。この配列表の電子形式の情報は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。

【0003】

エフェクターＮＫ細胞に結合し且つそれを特異的にリダイレクトして、複数の活性化受容体を介して目的の標的細胞を溶解する多重特異的タンパク質が提供される。このタンパク質は、疾患、特に癌又は感染病の処置に有用である。

【背景技術】

【0004】

２つの異なるエピトープに結合する二重特異的抗体は、特異性を高める機会、効力を拡張する機会、及び従来のモノクローナル抗体では達成できない作用の新規な機序を利用する機会を提供する。同時に２つの標的に結合する二重特異的抗体の様々な形態が報告されている。また、二重特異的抗体を用いて２つの異なる受容体を架橋してシグナル伝達経路を阻害することは、様々な適用例で有用性を示している（例えば、（非特許文献１）を参照されたい）。二重特異的抗体は、２つの異なる受容体を中和するために使用されてきた。他のアプローチでは、二重特異的抗体は、免疫エフェクター細胞を動員するために使用され、ここで、Ｔ細胞の活性化が、２つの異なる細胞型における受容体に同時に結合する二重特異的抗体によって腫瘍細胞の近傍で達成される（（非特許文献２）を参照されたい）。この抗体は「二重特異的Ｔ細胞エンゲイジャー（ｅｎｇａｇｅｒ）抗体」（又は「ＢｉＴＥ」抗体）と称されている。しかしながら、Ｔ細胞を完全に活性化させるには、このＴ細胞とＢｉＴＥのクラスターとが標的細胞の表面上で相互作用しなければならない。ＢｉＴＥ形態で機能する抗体可変領域を見出すことの困難さに起因して、これまで、ＣＤ１９×ＣＤ３特異的抗体ブリナツママブ（ｂｌｉｎａｔｕｍａｍａｂ）では単一の免疫細胞受容体（ＣＤ３）のみが標的とされている。これまでに開発された二重特異的抗体として、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体を腫瘍関連抗原に連結するものも挙げられる。また、一方のアームがＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）に結合し、且つ他方のアームが目的の抗原、例えば、ＣＤ１９に結合する二重特異的抗体が開発された（（非特許文献３）を参照されたい）。

【0005】

ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団である。ＮＫ細胞は、不所望の細胞、例えば、腫瘍又はウイルス感染細胞を排除することができる効率的な免疫学的監視機構を提供する。ＮＫ細胞の特徴及び生物学的特性は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、及び／又はＣＤ５７を含む表面抗原の発現、細胞表面上のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解酵素の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力を含む。

【0006】

ＮＫ細胞の活性は、シグナルの活性化及び阻害の両方を伴う複合機構によって調節される。ＮＫ細胞媒介認識及びＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の殺生において重要な役割を果たすいくつかの異なるＮＫ細胞受容体が同定されている。１つの受容体は、ＮＫ細胞に特異的ではないが、ＮＫ細胞媒介ＡＤＣＣに関与するＦｃγＲ３ａ（ＣＤ１６）である。ＮＫ細胞はまた、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）等の様々な他の活性化受容体及び共活性化受容体も発現する。抗４−１ＢＢに対するアゴニスト抗体は固形腫瘍（例えば、黒色腫、腎癌及び卵巣癌）の患者で臨床試験中であり、様々な癌モデル（例えば、乳癌、肉腫、神経膠腫、結腸癌、骨髄腫及びマスト細胞腫）で強い活性を示している。

【0007】

別のＮＫ細胞受容体は、ＩｇスーパーファミリーのメンバーであるＮＫｐ４６である。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞に特異的であり、特定のｍＡｂによって誘導されるその架橋は、細胞内Ｃａ^＋＋のレベルを上昇させる強いＮＫ細胞の活性化をもたらし、それにより細胞障害性が誘発され、リンホカインが放出される。（特許文献１）（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）は、Ｆｃγ陽性の血液悪性腫瘍の処置での、Ｆｃγ受容体に結合する単一特異的完全長ＩｇＧ抗ＮＫｐ４６抗体の使用を開示している。腫瘍細胞（例えば、Ｂ細胞悪性腫瘍）上で発現されたＦｃγ受容体は、ＮＫ細胞に結合する抗ＮＫｐ４６抗体のＦｃドメインと相互作用し、それにより、活性化ＮＫ細胞が、抗体の２つの反応部分（即ち、抗原認識ドメイン及びＦｃドメイン）によって標的細胞に接近するようになり、処置の効率を高めると考えられる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】国際公開第２００５／１０５８５８号パンフレット

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｊａｃｋｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：２０８５０−２０８５９

【非特許文献2】Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９（１２）：４９４１−４

【非特許文献3】Ｋｅｌｌｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．３０３（２）：１２８−１３９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

これまでＮＫ細胞特異的二重特異的抗体は報告されていない。むしろ、ＮＫ細胞障害性を漸増させる除去剤、例えば、抗腫瘍抗体は、典型的にはＣＤ１６によってＡＤＣＣを媒介する完全長ＩｇＧ１抗体である。様々な形態の二重特異的抗体の存在にもかかわらず、新規な十分に定義された作用機序を有する多重特異的タンパク質、具体的には、完全長抗体を上回る治療上の利点をもたらし得るものが当技術分野でなお要望されている。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及び標的細胞上の目的の抗原に結合し、且つＮＫ細胞をリダイレクトして、目的の抗原を発現する標的細胞、例えば、疾患の一因である細胞を溶解することができる機能的な多重特異的タンパク質（例えば、限定されるものではないが、抗体ベースのタンパク質形態を含む、ポリペプチド、一本鎖タンパク質、多鎖タンパク質）の発見に由来する。特に、第１の抗原結合ドメインと第２の抗原結合ドメインとを含む多重特異的タンパク質であって、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、且つ他方が目的の抗原に結合し、多重特異的タンパク質が一価でＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、多重特異的タンパク質が、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を誘導して、目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができる、多重特異的タンパク質が提供される。有利には、一実施形態において、ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下で、多重特異的タンパク質が（ｉ）標的細胞上の目的の抗原、及び（ｉｉ）ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６に結合することができ、標的細胞上の目的の抗原及びＮＫｐ４６に結合すると、ＮＫｐ４６を介してＮＫ細胞のシグナル伝達及び／又はＮＫ細胞の活性化を誘導することができ（このタンパク質はＮＫｐ４６作動薬として機能する）、それにより、特にＮＫｐ４６によって伝達される活性化シグナルによってＮＫ細胞の活性化及び／又は標的細胞の溶解が促進される。

【0012】

一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ヒトＦｃドメインの少なくとも一部（例えば、ＦｃＲｎが結合するＦｃドメイン）を含む。

【0013】

特定の実施形態では、本多重特異的抗体は、従来の完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較してＦｃγＲ結合が減少しているように又はＦｃγＲ結合が実質的に消失しているように設計されている。任意選択により、この多重特異的タンパク質は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較してヒトＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドへの結合が減少又は消失している。他の実施形態では、この多重特異的タンパク質は、例えば従来の完全長ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、実質的なＦｃγＲ結合を保持するように設計されている。任意選択により、この多重特異的タンパク質は、（例えば、この多重特異的タンパク質のＦｃドメインを介して）ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドに結合する。

【0014】

本発明は、目的の抗原に結合し、且つ一価でＮＫ細胞上のＮＫｐ４６に結合するように及びＣＤ１６又はＣＤ１６Ａに結合するようにさらに操作された多重特異的タンパク質が、（従来の抗体と比べて）ＮＫ細胞に媒介される標的細胞の溶解を促進する能力の増強を示すという観察に部分的に起因する。機能が異なる分子の比較を通して、そのような多重特異的タンパク質がこれらの受容体の個々の及び組み合わされた効果を誘発し、それにより、ＮＫ細胞による標的細胞の溶解がより良好に促進されることを観測した。本明細書に詳細に説明されているように、（ａ）ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ１６と、（ｂ）標的細胞上の目的の抗原とに結合する様々な機能性多重特異的タンパク質を構築しており、これらの機能性多重特異的タンパク質は、ＮＫ細胞を再誘導して目的の抗原を発現する標的細胞（例えば、癌又は感染等の疾患の一因となる細胞）を溶解させることができる。さらに、ＮＫ細胞上のＮｋｐ４６への結合にもかかわらず、有利には、これらの多重特異的タンパク質はＮＫ細胞自体の溶解を誘導しない。

【0015】

また、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６を活性化することができ、且つＮＫに媒介される所望の標的細胞の死滅を促進するために使用され得る多重特異的Ｆｃタンパク質の新規な形態も提供される。ＣＤ１６に結合し、且つＮＫｐ４６及び目的の抗原にさらに結合する主題の多重特異的タンパク質により実証した標的細胞の死滅での効力は、ＮＫ細胞の表面上で発現される共活性化受容体ＣＤ１３７の誘導及び上方制御に少なくも部分的に起因すると考えられる。具体的には、ＣＤ１３７の上方制御は、（標的細胞の存在下だけでなく）標的細胞の非存在下でも、且つＣＤ１６に媒介されるＮＫ細胞の溶解を誘導することなく、休止ＮＫ細胞上で起こる。ＣＤ１３７の発現が増加しているＮＫ細胞は、ＣＤ１３７Ｌ（ＣＤ１３７リガンド）を発現する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対して高度に活性であることが知られている。結果的に、一価で結合するＮＫｐ４６に加えてＣＤ１６に結合する本多重特異的タンパク質は、ＣＤ１３７を上方制御する手段を提供することができる。さらに有利には、この多重特異的タンパク質は、標的細胞によって発現される目的の抗原へのさらなる結合時、エフェクター細胞上で発現される複数の活性化受容体を含む標的細胞の多角的な認識を誘発することができる。また、（標的細胞の非存在下で）ヒトＩｇＧ１抗体に相当するＮＫ細胞上のＣＤ１３７の上方制御を引き起こす能力にもかかわらず、驚くべきことに、この多重特異的タンパク質は、ヒトＩｇＧ１抗体と比べて、ＮＫ細胞に媒介される腫瘍細胞の溶解の誘導においてはるかに強力である。これは、主題の多重特異的タンパク質が、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１３７に媒介される活性化の複合効果をもたらし、それにより、ＣＤ１６^＋ＮＫｐ４６^＋ＮＫ細胞によるＮＫ細胞の細胞傷害の誘導における相乗的な又は相加的な増強がもたらされることを示唆するであろう。加えて、ＣＤ１３７のいくらかの寄与とは無関係に、この多重特異的タンパク質は、有利には、ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞及びＣＤ１６⁻ＮＫ細胞の両方（全てのＮＫ細胞がＮＫｐ４６^＋である）を強力に動員することができる。

【0016】

さらに、主題の多重特異的タンパク質にＣＤ１６が結合するにもかかわらず、予想外にも、目的の抗原の標的化が、従来の抗体（例えば、完全長ヒトＩｇＧ１）が結合する場合に下方調節又はインターナリゼーションに対して敏感であることが知られている場合であっても、この多重特異的タンパク質は、目的の抗原の下方調節又はインターナリゼーションを誘導又は増加しない。これに基づき、主題の多重特異的タンパク質は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞又は感染細胞）によって発現される目的の抗原の標的化に十分適しているはずであり、例えば、従来の抗体（例えば、ＣＤ１６結合性を保持するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを有する抗体）が結合する場合に下方調節又はインターナリゼーションを受け得ることが知られている抗原の標的化に十分適しているはずである。これは治療上の巨大な利益であり、なぜなら、当技術分野では、抗原インターナリゼーションは、従来のヒトＩｇＧ１抗体の標的細胞に対してＡＤＣＣを媒介する能力を実質的に妨げる可能性があることが知られているからである。

【0017】

従って、一実施形態では、細胞の表面上で発現される目的の抗原に一価で結合する多重特異的タンパク質であって、目的の抗原の下方調節又は細胞内インターナリゼーションを増加させないか又は誘導しないタンパク質が提供される。

【0018】

別の実施形態では、本発明は、（例えば、単一の抗原結合ドメインを介して）一価でヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する抗原結合ドメインを含む多重特異的タンパク質であって、ヒトＣＤ１６に結合することができ、任意選択により標的細胞の非存在下で及び／又は存在下で、さらに任意選択により他の細胞の非存在下で、ＮＫｐ４６ポリペプチド及びＣＤ１６を発現するエフェクター細胞（例えば、ヒトＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）と共に可溶形態でインキュベートされた場合に、（例えば、ＮＫ細胞の検出可能な溶解を誘導することなく）このエフェクター細胞の表面上でのＣＤ１３７ポリペプチド発現の増加又は誘導を引き起こすことができる多重特異的タンパク質を提供する。任意選択により、この多重特異的タンパク質は目的の抗原にさらに結合する。

【0019】

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する第１の抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）と、（ｉｉ）ヒトＣＤ１６Ａに結合するＦｃドメインと、（ｉｉｉ）標的細胞によって発現される目的の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインとを含む多重特異的タンパク質を提供する。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を誘導して、目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができ、前記標的細胞の溶解はＮＫｐ４６シグナル伝達によって媒介され、任意選択により、前記標的細胞の溶解は、ＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達と、ＣＤ１６に媒介される抗体依存性細胞介在性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）との組み合わせによって媒介される。

【0020】

別の実施形態では、本発明は、（ｉ）ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合する一価の抗原結合ポリペプチド（「ＡＢＤ」）と、（ｉ）目的の抗原に結合するＡＢＤであって、前記目的の抗原が、腫瘍細胞又は感染因子によって発現される抗原を任意選択により含む、ＡＢＤと、（ｉｉｉ）ＣＤ１６Ａ結合ポリペプチド、任意選択により、対応する野生型Ｆｃポリペプチドと比べてＣＤ１６Ａ結合を増強するように任意選択により改変されているＦｃポリペプチドとを含む多重特異的抗原結合タンパク質であって、ＮＫｐ４６シグナル伝達により、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を誘導して、目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができる、多重特異的抗原結合タンパク質を提供する。

【0021】

別の実施形態では、本発明は、第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインと、Ｆｃドメイン又はその一部であって、ヒトＣＤ１６又はＣＤ１６Ａに結合することができるように任意選択により改変され得るＦｃドメイン又はその一部とを含む単離された多重特異的Ｆｃタンパク質であって、第１又は第２の抗原結合ドメインの一方がヒトＮＫｐ４６ポリペプチドに結合し、且つ他方が目的の抗原に結合し、この多重特異的タンパク質が、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を誘導して、目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させることができる、多重特異的タンパク質を提供する。一実施形態では、このタンパク質は、ＮＫｐ４６シグナル伝達を増強又は誘導することによって標的細胞の溶解を引き起こし、任意選択により、標的細胞の溶解は、Ｎｋｐ４６シグナル伝達と、ＣＤ１６に媒介される抗体依存性細胞介在性細胞傷害（「ＡＤＣＣ」）との組み合わせによって媒介される。任意選択により、この多重特異的タンパク質は、目的の抗原（例えば、ＮＫｐ４６ポリペプチド以外の抗原、即ち、腫瘍細胞又は感染因子等の標的細胞によって発現される目的の抗原）にそれぞれ結合する第３又は第４又はより高次の抗原結合ドメインをさらに含み、この目的の抗原は、第２の抗原結合ドメインによって結合される目的の抗原と同一であるか又は異なる。一実施形態では、第３の抗原結合ドメインは、第２の抗原結合ドメインと同一の目的の抗原に結合し、任意選択によりさらに、第３の抗原結合ドメインは、目的の抗原上において第２の抗原結合ドメインと同一のエピトープ又は異なるエピトープに結合する。一実施形態では、目的の抗原は癌抗原である。一実施形態では、目的の抗原は、悪性免疫細胞（例えば、血液系腫瘍に関与する細胞、白血病細胞、リンパ腫細胞）の表面上で発現される（任意選択により過剰発現される）タンパク質、ＣＤ１９タンパク質、ＣＤ２０タンパク質等である。一実施形態では、このタンパク質を使用して血液系腫瘍を処置し、例えば白血病又はリンパ腫細胞を処置する。別の実施形態では、目的の抗原は、感染細胞の表面上で発現される（任意選択により過剰発現される）タンパク質であるか、又はウイルス感染細胞、細菌感染細胞若しくは寄生虫感染細胞等の感染因子によって発現されるタンパク質である。

【0022】

任意選択により、主題の多重特異的ポリペプチドは、任意選択により他の細胞（例えば、標的細胞）の存在下で又は非存在下で、ＮＫｐ４６及びＣＤ１６を発現するエフェクター細胞（例えば、ヒトＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）と共に可溶形態でインキュベートされた場合に、（例えば、ＮＫ細胞の検出可能な溶解を誘導することなく）ＮＫ細胞の表面上でのＣＤ１３７ポリペプチド発現の増加又は誘導を誘発することができる。任意選択により、目的の抗原を発現する標的細胞及びＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞の存在下で、この多重特異的タンパク質は、具体的にはＮＫｐ４６、ＣＤ１６及び／又はＣＤ１３７の任意の組み合わせによって伝達される活性化シグナルにより、ＮＫ細胞の活性化及び／又は標的細胞の溶解を誘導することができる。

【0023】

一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は一価の様式でＮＫｐ４６に結合する。任意の実施形態の一態様では、この多重特異的タンパク質は、一価でＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するＮｋｐ４６結合ＡＢＤを含む。

【0024】

標的細胞及びＮＫ細胞の存在下における一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、例えばＮＫ４６及びＣＤ１６を発現するＮＫ細胞（ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）上で細胞表面ＣＤ１３７の増加を誘導することができる。

【0025】

標的細胞及びＮＫ細胞の存在下における一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６を介したＮＫ細胞によるシグナル伝達を誘導することができる。

【0026】

標的細胞及びＮＫ細胞の存在下における一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、標的細胞（目的の抗原を発現する細胞）の非存在下でＮＫ細胞と共にインキュベートされた場に合、（ＣＤ１６から独立して）ＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達又はＮＫ細胞の細胞活性化を誘導する能力を欠いており、例えば、この多重特異的タンパク質は、このタンパク質が、ＣＤ１６に結合しないＦｃドメイン（例えば、Ｎ２９７Ｓ置換を含むＦｃ領域）を含むように改変されているとき、標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達又はＮＫ細胞活性化を誘導する能力を欠いているか、又はこの多重特異的タンパク質は、標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６⁻ＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達又はＮＫ細胞活性化を誘導する能力を欠いている。

【0027】

本明細書で説明されている多重特異的タンパク質のいずれかでは、そのような多重特異的タンパク質は、以下の特徴を潜在的に有する：
（ａ）ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６を発現するヒトＮＫ細胞（ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）を誘導して、目的の抗原を発現する標的細胞を溶解させる能力、及び
（ｂ）任意選択により標的細胞の存在下において又は標的細胞の非存在下において、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞と共に（例えば、可溶形態で）インキュベートされた場合に、細胞表面ＣＤ１３７の増加を誘導する能力。

【0028】

別の実施形態では、本発明は、ＮＫｐ４６ベースのＮＫ細胞エンゲイジャーでの使用に適した多重特異的タンパク質形態を提供し、例えば、ヒトＣＤ１６結合する（且つ任意選択により、ＦｃＲｎ及び／又は他のヒトＦｃγ受容体にさらに結合する）二量体Ｆｃドメインを形成することができる免疫グロブリン由来の抗原結合ドメイン及び／又は定常領域ドメインを含む抗体ベースの形態を提供する。ＮＫｐ４６のＮＫ選択的発現と、多重特異的タンパク質がＦｃドメインを介したヒトＦｃγ受容体への結合の増加を維持し及び／又は有する多重特異的（例えば、二重特異的）抗体形態とを組み合わせることにより、本発明は、ＦｃＲｎ結合に起因して、ＮＫ細胞の細胞傷害を目的の標的に誘導することができ、且つ活性化受容体ＣＤ１６、ＮＫｐ４６及びさらに任意選択によりＣＤ１３７の複合作用によって標的細胞を溶解する能力の増加をさらに有するという好ましい薬理を有する多重特異的抗体形態を提供する。

【0029】

本明細書で説明されている任意の実施形態の別の態様では、本多重特異的タンパク質は、Ｆｃγ受容体陰性ＮＫ細胞（例えば、精製されたＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６⁻ＮＫ細胞）と共に、且つ標的細胞（例えば、目的の抗原を発現する細胞）の非存在下でインキュベートされた場合のＮＫｐ４６に対するアゴニスト活性の欠如によって特徴付けられ得る。

【0030】

別の実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ１６と、標的細胞によって発現される目的の抗原とに結合する多重特異的タンパク質を同定、試験及び／又は産生する方法であって、
（ａ）この多重特異的タンパク質が、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）と共にインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞上の細胞表面ＣＤ１３７の増加を誘導することができるかどうかを評価するステップ、及び
（ｂ）この多重特異的タンパク質が、ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞を誘導して標的細胞を溶解させる能力を有するかどうかを評価するステップ
を含む方法を提供する。

【0031】

任意選択により、上記のいずれかでは、ＮＫ細胞は精製されたＮＫ細胞である。

【0032】

別の実施形態では、本発明は、多重特異的タンパク質を同定、試験及び／又は産生する方法であって、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ１６と、標的細胞によって発現される目的の抗原とに結合する複数の多重特異的タンパク質を用意するステップ、
（ａ）各多重特異的タンパク質が、ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞を誘導して標的細胞を溶解させる能力を有するかどうかを評価するステップ、
（ｂ）任意選択により、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）と共にインキュベートされた場合に、細胞表面ＣＤ１３７の増加を誘導する能力に関して各多重特異的タンパク質をさらに評価するステップ、及び
（ｃ）多重特異的タンパク質が、
ａ．ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞を誘導して標的細胞を溶解させる能力を有し、且つ
ｂ．任意選択により、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合に、細胞表面ＣＤ１３７の増加を誘導する能力を有する
場合、（例えば、薬剤として使用するために、さらなる評価のために、さらなる産生のために）この多重特異的タンパク質を選択するステップ
を含む方法を提供する。

【0033】

別の実施形態では、本発明は、多重特異的タンパク質を同定、試験及び／又は産生する方法であって、ＮＫ細胞上のＮＫｐ４６及びＣＤ１６と、標的細胞によって発現される目的の抗原とに結合する複数の多重特異的タンパク質を用意するステップ、
（ａ）各多重特異的タンパク質を評価して、各多重特異的タンパク質が、標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合に、ＣＤ１６から独立してＮＫ細胞のＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達又はＮＫ細胞活性化を誘導することができるかどうかを決定するステップ、
（ｂ）各多重特異的タンパク質を評価して、各多重特異的タンパク質が、ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞を誘導して標的細胞を溶解させる能力を有するかどうかを決定するステップ、
（ｃ）任意選択により、各多重特異的タンパク質をさらに評価して、各多重特異的タンパク質が、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）と共にインキュベートされた場合に、細胞表面ＣＤ１３７の増加を誘導することができるかどうかを決定するステップ、及び
（ｄ）多重特異的タンパク質が、
ａ．標的細胞の非存在下でＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合に、ＣＤ１６から独立してＮＫ細胞でのＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達又はＮＫ細胞活性化を誘導する能力を欠いており、
ｂ．ＮＫ細胞及び標的細胞と共にインキュベートされた場合に、ＮＫ細胞を誘導して標的細胞を溶解させる能力を有し、且つ
ｃ．任意選択により、ＣＤ１６発現ＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合に、細胞表面ＣＤ１３７の増加を誘導する能力を有する
場合、（例えば、薬剤として使用するために、さらなる評価のために、さらなる産生のために）この多重特異的タンパク質を選択するステップ
を含む方法を提供する。

【0034】

別の実施形態では、本発明は、ヒトＣＤ１６に結合する多重特異的タンパク質（例えば、ポリペプチド、非抗体ポリペプチド又は抗体）であって、（ａ）第１の抗原結合ドメインと、（ｂ）第２の抗原結合ドメインとを含み、第１の抗原結合ドメインの内の一方がＮＫｐ４６に結合し、且つ他方が標的細胞上の目的の抗原（ＮＫｐ４６以外）に結合し、この多重特異的タンパク質がＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞を誘導して前記標的細胞を溶解させることができる、多重特異的タンパク質を提供する。一実施形態では、このタンパク質はヒトＦｃドメインの少なくとも一部を含み、任意選択により、このＦｃドメインは二量体であり、且つヒトＣＤ１６が結合し（及びさらに任意選択により、このＦｃドメインにはＦｃＲｎも結合し）、さらに任意選択により、この多重特異的抗体は、ＣＤ１６への結合を増加させる改変を（野生型Ｆｃドメインと比較して）含むＦｃドメインを含み、一実施形態では、このＦｃドメインは２つのＡＢＤ間に介在している（このＦｃドメインに対して、一方のＡＢＤはＮ末端に配置されており、且つ他方はＣ末端に配置されている）。

【0035】

一態様では、本多重特異的タンパク質は２つ以上のポリペプチド鎖を含み、即ち、この多重特異的タンパク質は複数鎖タンパク質を含む。例えば、この多重特異的タンパク質又は複数鎖タンパク質は、二量体、三量体若しくは四量体であり得るか、又は５つ以上のポリペプチド鎖を含む場合もある。

【0036】

ポリペプチド鎖上に位置する抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ若しくは単一抗原結合ドメイン）は、この抗原結合ドメインが、異なるポリペプチド鎖（これらのポリペプチド鎖は結合して多量体（例えば、二量体、三量体等）を形成する）上に位置する１つ以上の相補的タンパク質ドメイン（抗原結合ドメイン）と関連又は結合している場合、この抗原結合ドメイン自体がその標的（即ち、ＮＫｐ４６若しくは目的の抗原）に結合することができるか、又は任意選択によりその標的に結合することができる。

【0037】

一態様では、本多重特異的タンパク質は一価の様式でＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、ＮＫ細胞の表面上で発現される）に結合する。一態様では、この多重特異的タンパク質は一価の様式で目的の抗原に結合する。

【0038】

別の実施形態では、本発明は、１つ以上の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）の運動（鎖内ドメインの運動）の自由度又は柔軟性が例えば従来のヒトＩｇＧ抗体のＡＢＤと比較して増加している構造を有する多重特異的タンパク質を提供する。一実施形態では、多重特異的タンパク質であって、第１の抗原結合ドメインの抗原結合部位と第２の抗原結合ドメインの抗原結合部位とが、機能（例えば、この多重特異的タンパク質がＮＫｐ４６シグナル伝達及び標的細胞の溶解を誘導する能力）を向上させる距離（例えば、任意選択により８０オングストローム（Å）未満の距離）で分離されることを可能にする構造を含む多重特異的タンパク質が提供される。ＡＢＤがより大きい柔軟性を有し、及び／又は最適化された距離で分離されている多重特異的タンパク質は、溶解性ＮＫｐ４６標的シナプスの形成を増強することができ、それによりＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達が増強される。

【0039】

一実施形態では、本発明は、（例えば、従来のヒトＩｇＧ抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１抗体）のＡＢＤと比較して）抗原結合ドメインの運動の自由が増加している多重特異的タンパク質を提供する。そのようなタンパク質の一例は、抗原結合ドメイン（例えば、ＮＫｐ４６に結合するＡＢＤ又は目的の抗原に結合するＡＢＤ）が可撓性リンカーを介してＦｃドメインに連結又は融合された単量体又は多量体Ｆｃドメイン含有タンパク質（例えば、ヘテロ二量体又はヘテロ三量体）である。このリンカーは、このリンカーで曲げてＡＢＤとＦｃドメインとの間（又は２つのＡＢＤ間）の角度を潜在的に減少させる能力を付与することにより、１つ以上のＡＢＤの柔軟性又は運動の自由度を提供することができる。任意選択により、両方の抗原結合ドメイン（及び任意選択により、さらなるＡＢＤが多重特異的タンパク質中に存在する場合にはより多く）が、リンカー（概して可撓性ペプチドリンカー）を介してＦｃドメインに連結又は融合されている。任意選択により、１つ以上のエフェクター機能を変更（増強又は阻害）するために任意選択により改変され得る定常ドメイン等の他の配列又はドメインがＦｃドメインとＡＢＤとの間に配置されており、例えば、それにより、ＡＢＤは可撓性リンカー及び定常領域を介してＦｃドメインに融合されている。この抗原結合ドメインを、例えば可変領域、ｄＡｂ、ＶｈＨ又は非Ｉｇ足場で構成することができる。この抗原結合ドメインは、その全体が単一のポリペプチド鎖上に存在してもよく、又は別々のポリペプチド鎖上に存在するドメインとの結合に起因して形成されてもよい。任意選択により、運動の自由度が増加しているタンパク質は、このタンパク質が、ＮＫｐ４６結合部位と目的の抗原結合部位との間の距離が両方の結合ドメインがＦａｂであったタンパク質で観測した場合と比べて小さいか、又は完全長抗体で観測した場合と比べて小さい高次構造を採用することを可能にする。

【0040】

ＡＢＤを、可撓性リンカーを介して（任意選択により、定常領域ドメイン又はその一部等の介在配列、例えばＣＨ１又はＣ_Ｋを介して）Ｆｃドメイン（又はそのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン）に接続することができる。このリンカーはポリペプチドリンカーであり得、例えば、少なくとも５個の残基、少なくとも１０個の残基、少なくとも１５個の残基、少なくとも２０個の残基、少なくとも２５個の残基、少なくとも３０個の残基又はより多くの長さを含むペプチドリンカーであり得る。他の実施形態では、このリンカーは、２〜４個の残基、２〜４個の残基、２〜６個の残基、２〜８個の残基、２〜１０個の残基、２〜１２個の残基、２〜１４個の残基、２〜１６個の残基、２〜１８個の残基、２〜２０個の残基、２〜３０個の残基、１０〜２４個の残基、１０〜２６個の残基、１０〜３０個の残基又は１０〜５０個の残基の長さを含む。任意選択により、リンカーは抗体定常領域に由来するアミノ酸配列を含み、例えばＮ末端のＣＨ１又はヒンジ配列を含む。任意選択により、リンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含む。任意選択により、リンカーは、グリシン及び／又はセリン残基で主に又はそれのみで構成されている可撓性リンカーであり、例えば、アミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ_２Ｓ）_２ＧＧＡＤ又はアミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_３を含む。

【0041】

一実施形態では、Ｆｃドメインは２つのＡＢＤ間に介在している（Ｆｃドメインに対して、一方のＡＢＤはＮ末端に配置されており、且つ他方はＣ末端に配置されている）。主題の多重特異的タンパク質（例えば、二量体、三量体、四量体）は、一部の実施形態では以下のようなドメイン配置を含むことができ、このドメイン配置では、２つ、３つ又は４つのポリペプチド鎖のいずれかにドメインが配置され得、抗原結合ドメイン間にＦｃドメインが介在しており、且つＡＢＤの少なくとも１つとＦｃドメインとの間に可撓性リンカーが存在する：
（ＡＢＤ_１）（Ｆｃドメイン）（ＡＢＤ_２）。

【0042】

別の実施形態では、本多重特異的タンパク質（例えば、二量体、三量体、四量体）は以下のいずれかのドメイン配置を含むことができ、これらのドメイン配置では、２つ、３つ又は４つのポリペプチド鎖のいずれかにドメインが配置され得、ＡＢＤ間にはＦｃドメインが介在しておらず（例えば、このタンパク質は末端又は遠位のＦｃドメインを有する）、且つＡＢＤの少なくとも１つとＦｃドメインとの間に可撓性リンカーが存在する：
（Ｆｃドメイン）（ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２）、又は
（ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２）（Ｆｃドメイン）。

【0043】

上記で説明したドメイン配置では、ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２の一方はＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインであり、且つ他方は目的の抗原に結合する抗原結合ドメインであり、リンカーは可撓性ポリペプチドリンカーである。Ｆｃドメインは二量体Ｆｃドメイン（例えば、ヒトＦｃＲｎ及び／又はＦｃγ受容体に結合する）であり得る。一実施形態では、ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２のそれぞれは、直列型可変領域内に存在する２つの可変領域から形成されており、結合して特定のＡＢＤを形成するこれらの可変領域は、同一のポリペプチド鎖上にも異なるポリペプチド鎖上にもあり得る。別の実施形態では、ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２の一方は直列型可変領域を含み、且つ他方はＦａｂ構造を含む。

【0044】

本発明はまた、本明細書で開示されている多重特異的ポリペプチド等、ＮＫｐ４６結合部分による標的化に十分に適しているＮＫｐ４６上の特異的エピトープも同定する。例えば、これらのＮｋｐ４６エピトープの１つ以上に結合する二重特異的又は多重特異的タンパク質は有利な特性を有し、特に、（例えば、ＮＫｐ４６に媒介されるシグナル伝達を介した）ＮＫ細胞による標的細胞の溶解の発生又は誘導において高い有効性を有する。また、効率的な多重特異的タンパク質（例えば、二重特異的及び三重特異的タンパク質、特に、目的の標的細胞を強力に溶解するもの）の構築での使用に適した異なる抗ＮＫｐ４６抗体のＣＤＲと、例示的な多重特異的タンパク質のアミノ酸及び核酸配列と、これらのタンパク質をコードする核酸とも提供される。

【0045】

一態様では、本タンパク質（及び／又はＮＫｐ４６に結合するその抗原結合ドメイン）は、ＮＫｐ４６ポリペプチドへの結合に関して、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６若しくは−９又はそのようなＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６若しくは−９二重特異的抗体を含む抗ＣＤ１９−Ｆ５−抗ＮＫｐ４６抗体の任意の１つ又は任意の組み合わせと競合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ２（近位）ドメイン内（部分的に又は完全にＤ２ドメイン内）のエピトープに結合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、ＮＫｐ４６ポリペプチドのＤ１（遠位）ドメイン内（部分的に又は完全にＤ１ドメイン内）のエピトープに結合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６若しくは−９又はそのようなＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６若しくは−９二重特異的抗体を含む抗ＣＤ１９−Ｆ５−抗ＮＫｐ４６抗体の任意の１つ又は組み合わせが結合する残基から選択される１つ、２つ、３つ又はより多くの残基を含む配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチド上のエピトープに結合する。一実施形態では、この多重特異的タンパク質はヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合することができる。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は、例えば、完全長野生型ヒトＩｇＧ１抗体と比較して、ヒト及び／又は非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）Ｆｃγ受容体への結合が減少又は消失している。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は、ＮＫに媒介される溶解を（例えば、完全長ヒト野生型ＩｇＧ１抗体と同様に又はこの完全長ヒト野生型ＩｇＧ１抗体と比べて良好に）誘導することができる。

【0046】

本明細書で説明されている多重特異的タンパク質のいずれかの一実施形態では、目的の抗原に結合する抗原結合ドメインは、ＮＫ細胞により溶解されることが求められる標的細胞によって発現される抗原（例えば、ポリペプチド）に結合する。任意選択により、この抗原は、癌細胞により、又はウイルス感染細胞、細菌感染細胞若しくは寄生虫感染細胞、腫瘍の増殖若しくは回避に寄与する免疫細胞（例えば、腫瘍関連単球若しくはマクロファージ）により、又は自己免疫、アレルギー反応若しくは炎症性疾患に寄与する細胞により発現される。

【0047】

一実施形態では、本多重特異的タンパク質は一価の様式でＮＫｐ４６に結合する。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は一価の様式で目的の抗原に結合する。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は一価の様式でＮＫｐ４６及び目的の抗原の両方に結合する。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は二量体Ｆｃドメインを介してＣＤ１６に結合する。

【0048】

一実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む。任意選択により、前記重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの両方がＮＫｐ４６との結合相互作用に関与する。

【0049】

一実施形態では、第２のＡＢＤ（及び存在する場合には任意選択により第３又はより高次のＡＢＤ）は、抗体の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む。任意選択により、前記重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの両方が、第２の抗原結合ドメインによって結合される抗原との結合相互作用に関与する。一実施形態では、第２のＡＢＤ（及び存在する場合には任意選択により第３の又はより高次のＡＢＤ）は非免疫グロブリン足場を含む。

【0050】

任意選択により、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部とＣＨ３ドメインの少なくとも一部とを含み、多重特異的ポリペプチド中に存在する場合には二量体Ｆｃドメインの一部である。

【0051】

一実施形態では、ＣＨ２ドメインは、野生型ＣＨ２ドメインと比較してアミノ酸改変を含む。一実施形態では、このＣＨ２改変により、野生型ヒトＦｃ領域と比べて、この二重特異的ポリペプチドのヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合が増加する（例えば、結合親和性が増加する）。

【0052】

一実施形態では、このＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインは、天然に存在する（操作されていない）ヒトＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインである。一実施形態では、この多重特異的タンパク質は、Ｎ連結グリコシル化を含むＦｃドメインを含む。一実施形態では、（残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）での）このＮ連結グリコシル化は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞又は他の齧歯動物細胞、非ヒト霊長類細胞又はヒト細胞）中で産生されるＩｇＧクラス（例えば、ＩｇＧ１）免疫グロブリンで見られるものに特有のグリカン構造を含む。一実施形態では、このＦｃドメインは、ヒトＣＤ１６ポリペプチドに対する結合親和性を増加させる改変Ｎ連結グリコシル化（例えば、Ｎ２９７での低フコシル化（ｈｙｐｏｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）グリカン）を含む。

【0053】

一実施形態では、このＦｃ由来ポリペプチドは二量体であり、任意選択によりホモ二量体又はヘテロ二量体である。一実施形態では、このＦｃ由来ポリペプチドはヘテロ三量体である。一実施形態では、このＦｃ由来ポリペプチドはヘテロ四量体である。

【0054】

一実施形態では、それぞれが少なくとも１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含む３つの異なるポリペプチド鎖で構成されている２つの抗原結合ドメインを含むヘテロ三量体タンパク質であって、第１の（中心）鎖が、Ｆｃドメイン（又はこのＦｃドメインの任意選択によりＣＤ１６に結合する部分）によって分離された２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、且つ第２及び第３の鎖のそれぞれが１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方が、第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を優先的に受け、それにより第１の抗原結合ドメインが形成されており、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方が、第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を優先的に受け、それにより第２の抗原結合ドメインが形成されており、第２又は第３の鎖が、このポリペプチド鎖上に配置されたＦｃドメイン（又はその一部）をさらに含み、それにより、このＦｃドメインが中心ポリペプチドのＦｃドメインと一緒に、ＣＤ１６に結合する二量体Ｆｃドメインを形成することができる、ヘテロ三量体タンパク質が提供される。

【0055】

一実施形態では、それぞれが少なくとも１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含む３つの異なるポリペプチド鎖で構成されている３つの抗原結合ドメインを有するヘテロ三量体タンパク質であって、第１の（中心）鎖が２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、且つ第２及び第３の鎖のそれぞれが１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方が、第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を優先的に受け、それにより第１の抗原結合ドメインが形成されており、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方が、第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を優先的に受け、それにより第２の抗原結合ドメインが形成されており、ポリペプチド鎖の１つが、第３の抗原結合ドメインを形成する抗原結合ドメイン（例えば、直列型可変ドメイン、ｓｃＦｖ）をさらに含み、第１又は第２の鎖が、このポリペプチド鎖上に配置されたＦｃドメイン（又はその一部）をさらに含み、それにより、このＦｃドメインが中心ポリペプチドのＦｃドメインと一緒に、ＣＤ１６に結合する二量体Ｆｃドメインを形成することができる、ヘテロ三量体タンパク質が提供される。

【0056】

一実施形態では、本発明は、ヘテロ多量体（例えば、ヘテロ二量体）二重特異的タンパク質であって、（ａ）ＣＨ１又はＣκドメインに融合された第１の可変領域（Ｖ）を含む第１のポリペプチド鎖であって、Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位がヒトＦｃドメイン（完全Ｆｃドメイン又はその一部）の第１の末端（Ｎ末端又はＣ末端）に融合されている、第１のポリペプチド鎖と、（ｂ）第１の鎖のＣＨ１又はＣκと相補的であるＣＨ１又はＣκドメインに融合されてＣＨ１−Ｃκ二量体を形成する第１の可変領域（Ｖ）を含む第２のポリペプチド鎖であって、Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位が少なくともヒトＦｃドメイン（完全Ｆｃドメイン又はその一部）に融合されており、２つの第１の可変領域が、一価の様式で第１の目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成する、第２のポリペプチド鎖と、（ｃ）（任意選択により、相補的な抗原結合ドメインと共に）第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン、及び任意選択により、第１のポリペプチドのＦｃドメインの第２の末端（Ｎ末端又はＣ末端）に融合され、それにより、ＦｃドメインがＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位と第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインとの間に介在している、第２のＣＨ１又はＣκドメインであって、ヘテロ多量体タンパク質の第１及び第２の鎖のＦｃドメイン（又はその一部）が、ヒトＣＤ１６ポリペプチドが結合することができる二量体Ｆｃドメイン（例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメイン）を形成する、抗原結合ドメインとを含むヘテロ多量体二重特異的タンパク質を提供する。任意選択により、第１及び第２のポリペプチド鎖は、非共有結合によって、及び任意選択によりさらに、例えばそれぞれのＣＨ１及びＣκドメイン間及び／又はそれぞれのヒンジドメイン間に形成された鎖間ジスルフィド結合によって結合している。任意選択により、Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位は、ヒトＦｃドメインに直接的に又は介在配列（例えば、リンカー、他のタンパク質ドメイン等）を介して融合されている。任意選択により、抗原の１つはＮＫｐ４６であり、抗原のもう１つは、免疫細胞により溶解される細胞の表面上で発現されるもの（例えば、癌抗原又はウイルス抗原又は細菌抗原）であり、任意選択によりさらに、免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）により溶解される細胞の表面上に存在するそのような抗原は、特に抗体（例えば、ＣＤ１６が結合するヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ３等のアイソタイプの完全長抗体）が結合する場合に細胞内インターナリゼーションを受けることが知られているタンパク質である。

【0057】

一実施形態では、本多重特異的ポリペプチド又はタンパク質はモノクローナルである。一実施形態では、この多重特異的ポリペプチド又はタンパク質は精製されている。一実施形態では、この多重特異的ポリペプチド又はタンパク質は単離されている。別の実施形態では、この多重特異的ポリペプチド又はタンパク質は細胞（例えば、ヒトＮＫ細胞等のヒト免疫細胞）によって発現されている。

【0058】

上記のヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質の一実施形態では、ポリペプチド又はタンパク質は、ヘテロ二量体であり、第２の抗原の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、任意選択により、ＮＫｐ４６に結合するｓｃＦｖである。

【0059】

上記のヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質の一実施形態では、ヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、重鎖又は軽鎖可変領域を含むか又はそれからなる第２の抗原の抗原結合ドメインを含むヘテロ三量体であり、ヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、第１鎖のＣＨ１又はＣκと相補的なＣＨ１又はＣκドメインに融合されてＣＨ１−Ｃκ二量体を形成する可変領域（Ｖ）を含むか又はそれからなる第３のポリペプチド鎖をさらに含み、第１のポリペプチドの第２の抗原の抗原結合ドメインである可変領域と第３鎖の可変領域とが抗原結合ドメインを形成する。二重の二量体化は、三量体を形成する。第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣκ定常領域は、（第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１／Ｃκに相補的ではないが）第１のポリペプチド鎖の第２のＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的であるように選択される。

【0060】

一態様では、本発明に係るヘテロ二量体ポリペプチドは、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へと、第１の可変ドメイン（Ｖ）、Ｃκ定常領域のＣＨ１、Ｆｃドメイン又はこのＦｃドメインの任意選択によりＣＤ１６に結合する部分、第２の可変ドメイン、及び第３の可変領域を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へと、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣκ定常領域、Ｆｃドメイン又はその一部を含む第２のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣκ定常領域が、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第２のポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメイン及び第２のポリペプチドの第１の可変ドメインが第１の目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成するＣＨ１−Ｃκヘテロ二量体を形成し、第２の可変ドメイン及び第３の可変ドメインが、第２の目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、ヘテロ多量体タンパク質の第１及び第２の鎖のＦｃドメイン（又はその一部）が、ヒトＣＤ１６ポリペプチドが結合し得る二量体Ｆｃドメイン（例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメイン）を形成する、第２のポリペプチド鎖と
を含む。

【0061】

別の態様では、本発明は、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へと、第２の可変ドメイン及び第３の可変ドメイン、Ｆｃドメイン又はその一部、第１の可変ドメイン（Ｖ）、並びにＣκ定常領域のＣＨ１を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へと、第１の可変ドメイン（Ｖ）、ＣＨ１又はＣκ定常領域、及びＦｃドメイン又はその一部を含む第２のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣκ定常領域が、第１のポリペプチド鎖のＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第２のポリペプチドが、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメイン及び第２のポリペプチドの第１の可変ドメインが第１の目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成するＣＨ１−Ｃκヘテロ二量体を形成し、第２の可変ドメイン及び第３の可変ドメインが、第２の目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを形成し、ヘテロ多量体タンパク質の第１及び第２の鎖のＦｃドメイン（又はその一部）が、ヒトＣＤ１６ポリペプチドが結合し得る二量体Ｆｃドメイン（例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＩｇＧ型のＮ連結グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメイン）を形成する、第２のポリペプチド鎖と
を含むヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。

【0062】

別の態様では、本発明は、
（ａ）Ｎ末端からＣ末端へと、第１のＣＨ１又はＣκ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、Ｆｃドメイン又はその一部、及び第２のＣＨ１又はＣκ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｂ）Ｎ末端からＣ末端へと、第１のポリペプチド鎖の第１の（第２ではない）ＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的であるように選択されているＣＨ１又はＣκ定常領域に融合されており、それにより、第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−Ｃκヘテロ二量体を形成する可変ドメイン、並びにＦｃドメイン又はその一部を含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｃ）Ｎ末端からＣ末端へと、ＣＨ１又はＣκ定常領域に融合された可変ドメインを含む第３のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣκ定常領域が、第２の（第１ではない）可変ドメイン及び第１のポリペプチド鎖の第２のＣＨ１又はＣκ定常領域に相補的であるように選択され、ヘテロ多量体タンパク質の第１及び第２の鎖のＦｃドメイン（又はその一部）が、ヒトＣＤ１６ポリペプチドが結合し得る二量体Ｆｃドメイン（例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＩｇＧ型のＮ連結グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメイン）を形成する、第３のポリペプチド鎖と
を含むヘテロ二量体ポリペプチドを提供する。従って、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドとは、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣκ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣκ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣκ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣκ定常領域との間にＣＨ１−Ｃκヘテロ二量体を形成する。第１のポリペプチドと第２のポリペプチドと第３のポリペプチドとは、ＣＨ１−ＣＫヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとは、目的の第１の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖の可変ドメインとは、目的の第２の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。

【0063】

別の実施形態では、上記で説明したヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、１つ以上の追加のポリペプチド鎖を含むことができる。

【0064】

本明細書で説明されている任意のヘテロ多量体ポリペプチド又はタンパク質は、ヒトＣＤ１６ポリペプチドが結合し得る二量体Ｆｃドメイン（例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメイン）を含むことができる。

【0065】

任意選択により、ＣＨ１及び／又はＣκドメインは、ヒンジ領域を介してＦｃドメインに融合されている。任意選択により、ヒンジ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３は、ヒトＣＤ１６に対する結合親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸改変を含む。任意選択により、ヒンジ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３は、ヒトＦｃＲｎに対する結合親和性を増加させるアミノ酸改変を含む。任意選択により、ＣＤ１６に対する結合親和性を増加させるアミノ酸改変はまた、１つ以上の他のヒトＦｃγ受容体に対する親和性も増加させることができる。任意選択により、ヒンジ、ＣＨ２及び／又はＣＨ３は、阻害性ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ３２Ｂ）への結合並びに／又はＣＤ１６以外のＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ３２Ａ及び／若しくはＣＤ６４）への結合を減少させるか又は実質的に消失させるアミノ酸改変を含む。本明細書で説明されている任意の実施形態では、ＣＨ１及びＣκドメインは任意選択によりヒト起源であり得る。

【0066】

本明細書で説明されている実施形態のいずれかの一態様では、本二重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６に結合する場合と比べて目的の抗原（例えば、癌又はウイルス又は他の感染因子の抗原）に対して強力に又は貪欲に結合する（大きい結合親和性を有する）。そのような抗体は有利な薬理学的特性を有することができる。本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、このポリペプチドは、１０^−７Ｍ未満、好ましくは１０^−８Ｍ未満又は好ましくは１０^−９Ｍ未満の、ＮＫｐ４６に対するＫｄ（一価結合親和性）を有し、任意選択により、このポリペプチドは、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対するＫｄ（一価結合親和性）と比べて低い、癌、ウイルス、細菌又は他の抗原への結合に関するＫｄ（一価結合親和性）を有する（即ち、より良好な結合親和性を有する）。本明細書で説明されている実施形態のいずれかの一態様では、このポリペプチドは、ＮＫｐ４６ポリペプチドへの結合に関して、１０^−７Ｍ（１００ナノモル濃度）〜１０^−１０Ｍ（０．１ナノモル濃度）のＮＫｐ４６に対するＫｄ（一価結合親和性）を有する。本明細書で開示されている実施形態のいずれかの一態様では、このポリペプチドは、１０^−８Ｍ（１０ナノモル濃度）〜１０^−１０Ｍ（０．１ナノモル濃度）のＮＫｐ４６に対するＫｄ（一価結合親和性）を有する。本明細書の実施形態のいずれかの一態様では、この多重特異的ポリペプチドは、１０^−８Ｍ（１０ナノモル濃度）〜１０^−９Ｍ（１ナノモル濃度）のＮＫｐ４６に対するＫｄ（一価結合親和性）を有する。結合性を本明細書の実施例のように評価することができ、例えば表面プラズモン共鳴で評価することができる。

【0067】

本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つに結合されたアミノ酸残基のいずれかに一致するＮＫｐ４６の少なくとも１つの残基に結合する。一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つ又は組み合わせに結合されたエピトープ内のＮＫｐ４６の少なくとも１つ、２つ、３つ、又は４つ以上のアミノ酸に結合する。本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９のいずれか、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれかと同じＮＫｐ４６ポリペプチドのエピトープに結合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのエピトープに結合し、このエピトープは、抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、又は−９のいずれかに結合された残基の群から選択される１つ、２つ、又は３つ以上の残基を含む。

【0068】

一部の実施形態では、ＮＫｐ４６に結合するタンパク質は、配列番号１の野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドと比較して、抗体ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、又は−９のいずれかに結合された残基が異なるアミノ酸で置換された変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して著しく低い結合性を示す。

【0069】

本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合するタンパク質は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９のいずれか、又は抗ＣＤ１９−抗ＮＫｐ４６−１、−２、−３、−４、−６、若しくは−９二重特異的抗体のいずれか１つ又はいずれかの組み合わせと競合する。一実施形態では、ＮＫｐ４６に結合するタンパク質は、以下の群から選択される抗体と、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について競合する：
（ａ）配列番号３のＶＨ領域及び配列番号４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−１）、
（ｂ）配列番号５のＶＨ領域及び配列番号６のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−２）、
（ｃ）配列番号７のＶＨ領域及び配列番号８のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−３）、
（ｄ）配列番号９のＶＨ領域及び配列番号１０のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−４）、
（ｅ）配列番号１１のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−６）、及び
（ｆ）配列番号１３のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−９）。

【0070】

一実施形態では、本発明は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合について、以下の群から選択される抗体と競合する、Ｎｋｐ４６に特異的に結合する単離されたタンパク質（例えば、単一特異的モノクローナル抗体又は断片、多重特異的タンパク質又は断片、二重特異的抗体等）（又はそのようにコードする核酸）を提供する：
（ａ）配列番号３のＶＨ領域及び配列番号４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−１）、
（ｂ）配列番号５のＶＨ領域及び配列番号６のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−２）、
（ｃ）配列番号７のＶＨ領域及び配列番号８のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−３）、
（ｄ）配列番号９のＶＨ領域及び配列番号１０のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−４）、
（ｅ）配列番号１１のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−６）、及び
（ｆ）配列番号１３のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−９）。

【0071】

本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９、又は上記の任意の組み合わせのいずれか１つの超可変領域を含む。

【0072】

本発明の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９からなる群から選択される抗体の重鎖の１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを有する重鎖可変領域及び／又はこれらの抗体の軽鎖の１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを有する軽鎖可変領域を有する。

【0073】

一実施形態では、本発明によるＮＫｐ４６に結合する単離された多重特異的タンパク質は、以下の群から選択される任意の抗体の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３並びに軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３又はその抗原結合ドメインを含む：
（ａ）配列番号３のＶＨ領域及び配列番号４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−１）、
（ｂ）配列番号５のＶＨ領域及び配列番号６のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−２）、
（ｃ）配列番号７のＶＨ領域及び配列番号８のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−３）、
（ｄ）配列番号９のＶＨ領域及び配列番号１０のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−４）、
（ｅ）配列番号１１のＶＨ領域及び配列番号１２のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−６）、及び
（ｆ）配列番号１３のＶＨ領域及び配列番号１４のＶＬ領域を有する抗体（ＮＫｐ４６−９）。

【0074】

一実施形態では、本発明は、ＮＫｐ４６に結合し且つ以下を含む抗体（例えば、完全長の単一特異的抗体若しくは二重特異的抗体）又は抗原結合ドメイン（任意選択によりヒト化、キメラ化、若しくは親和性成熟化され（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｕｒｅｄ）得る）を提供する：
（ａ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−１の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、
（ｂ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−２の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、
（ｃ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−３の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、
（ｄ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−４の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、
（ｅ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−６の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−６の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、又は
（ｆ）（ｉ）表ＡのＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖、並びに（ｉｉ）表ＡのＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２、及び３を含むポリペプチド鎖。

【0075】

一態様では、本発明は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９からなる群から選択される抗体と同じ又は重複するＮＫｐ４６のエピトープに結合するＮＫｐ４６に特異的に結合するタンパク質（単量体又は多量体タンパク質）（例えば、単一特異的モノクローナル抗体、多重特異的タンパク質、二重特異的抗体）を提供する。単離されたポリペプチドは、例えば、単一特異的モノクローナル抗体、多重特異的ポリペプチド、又は二重特異的抗体であり得る。

【0076】

一態様では、本発明は、本明細書で開示されているＦ５、Ｆ１３又はＴ５タンパク質の第１のポリペプチド鎖の配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と、本明細書で開示されている各Ｆ５、Ｆ１３又はＴ５タンパク質の第２のポリペプチド鎖の配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖と、本明細書で開示されているＦ５、Ｆ１３又はＴ５タンパク質の第３のポリペプチド鎖の配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む第３のポリペプチド鎖とを含む単離された多重特異的ヘテロ三量体タンパク質を提供する。一態様では、このタンパク質は、ヒトＣＤ１６ポリペプチドが結合し得る二量体Ｆｃドメイン（例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む二量体Ｆｃドメイン）を含む。任意選択により、第１、第２及び／又は第３の鎖の可変領域又はＣＤＲのいずれか又は全てが別の可変領域で置換されており、任意選択により、第１、第２及び／又は第３の鎖のＶ−ＣＨ１／Ｃκ単位のいずれか又は全てが別のＶ−ＣＨ１／Ｃκ単位で置換されている。任意選択により、可変領域、ＣＤＲ又はＶ−ＣＨ１／Ｃκ単位は、同一性の計算に考慮される配列から除外されており、任意選択により、抗ＮＫｐ４６可変領域、ＣＤＲ又はＶ−ＣＨ１／Ｃκ単位は同一性の計算に含まれており、且つ他の抗原に結合する抗原結合ドメイン用の可変領域、ＣＤＲ又はＶ−ＣＨ１／Ｃκ単位が、同一性の計算に考慮される配列から除外されている。

【0077】

本明細書に記載の任意のポリペプチドの一実施形態では、多重特異的ポリペプチドは、ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞に目的の標的細胞（例えば、ＮＫｐ４６以外の抗原を発現する標的細胞）を溶解させることができる。

【0078】

本明細書に記載の任意の実施形態の一態様では、本発明は、第１のポリペプチド鎖、及び／又は第２のポリペプチド鎖、及び／又は第３のポリペプチド鎖、及び／又は第４のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸を提供する。本明細書に記載の任意の実施形態の一態様では、本発明は、第１のポリペプチド鎖、及び／又は第２のポリペプチド鎖、及び／又は第３のポリペプチド鎖をコードする核酸を含む組換え宿主細胞を提供し、任意選択により、この宿主細胞は、少なくとも１、２、３、又は４ｍｇ／Ｌの収量（精製前又は精製後の最終生産性又は濃度）で本発明による多量体又は他のタンパク質を産生する。また、本発明による第１のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、本発明による第２のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸、及び任意選択により、本発明による第３のポリペプチド鎖をコードする組換え核酸を含む核酸のキット又はセットも提供される。また、本発明による二量体、三量体、及び四量体タンパク質を作製する方法も提供される。

【0079】

いずれの方法も、特に「発明を実施するための形態」を含め、本出願に開示されるあらゆるステップを含むとしてさらに特徴付けることができる。本発明はさらに、本明細書に開示のタンパク質を同定、試験及び／又は産生する方法に関する。本発明はさらに、任意の本方法によって得ることができる多重特異的タンパク質に関する。本開示はさらに、本明細書に開示される多重特異的タンパク質の少なくとも１つを含む医薬剤又は診断剤に関する。本開示はさらに、治療又は診断の方法における主題の多重特異的タンパク質の使用方法に関する。

【0080】

本発明のこれらの及び追加の有利な態様及び特徴が本明細書の他の箇所でさらに説明され得る。

【図面の簡単な説明】

【0081】

【図1】抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、分離された場合にはＢ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下でＴ／Ｂ細胞の凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方を共にインキュベートされた場合に細胞の凝集を引き起こすことを示す。

【図2A-2F】産生された二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質の様々なドメイン配置を示す。

【図3A-3B】それぞれＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的Ｆ１及びＦ２形態タンパク質は、静止ＮＫ細胞をそれらのＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞に誘導することができ、アイソタイプ対照抗体は、Ｄａｕｄｉ細胞の除去をもたらさなかったことを示す。リツキシマブ（ＲＴＸ）はＡＤＣＣの陽性対照としての役割を果たし、ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌ）で得られた最大応答は２１．６％の特異的溶解であった。

【図4A-4C】図４Ａは、Ｆ２形態のタンパク質におけるＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する二重特異的抗体が標的細胞の非存在下で静止ＮＫ細胞を活性化せず、対照的に、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及び陽性対照アレムツズマブがＮＫ細胞を活性化したことを示す。図４Ｂは、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の結合ドメインのそれぞれを含む）がＤａｕｄｉ標的細胞の存在下で静止ＮＫ細胞を活性化したが、完全長抗ＣＤ１９が最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化を示し、完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツズマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を実質的に超える活性化の実質的な増大を誘発しなかったことを示す。図４Ｃは、ＣＤ１９陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の可変領域のそれぞれを含む）のいずれもＮＫ細胞を活性化しなかったことを示す。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツズマブは、即ちＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルで、ＮＫ細胞の検出可能な活性化をもたらした。アイソタイプ対照抗体は活性化を誘導しなかった。

【図5A-5B】１：１の低いエフェクター：標的比では、試験した二重特異的抗ＮＫｐ４６×抗ＣＤ１９抗体のそれぞれがＤａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化させたこと、及び二重特異的抗ＮＫｐ４６×抗ＣＤ１９抗体が対照抗ＣＤ１９抗体及び完全長ヒトＩｇＧ１ ＡＤＣＣ誘導抗体と比べてはるかに強力であった（標的細胞の溶解をより良好に誘発した）ことを示す。

【図6A-6C】図６Ａ及び図６Ｂは、各ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ３、Ｆ５及びＦ６）が、ヒトＫＨＹＧ−１ ＣＤ１６陰性ｈＮＫｐ４６陽性ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞（図６Ａ）又はＢ２２１細胞（図６Ｂ）の特異的溶解を誘導したが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１ アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体を誘導しなかったことを示す。図６Ｃは、ＮＫｐ４６×ＫＩＲ３ＤＬ２二重特異的タンパク質（形態Ｆ６）が、同一の抗ＫＩＲ３ＤＬ２可変領域を有する従来のＩｇＧ１抗体と同程度にＮＫｐ４６結合（ＣＤ１６結合なし）によりＨＵＴ７８腫瘍細胞の特異的溶解を誘導したことを示す。

【図7】ＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＦ５形態でのＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質が、Ｄａｕｄｉ標的細胞溶解の媒介において完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体又はＦ６形態の二重特異的タンパク質と比べてはるかに強力であることを示す。この図はまた、ＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＦ６形態での二重特異的抗ＣＤ１９が、Ｄａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同程度に強力であったことも示し、これは、対照ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体が二価でＣＤ１９に結合することを考慮すると予想外である。同等レベルの標的細胞溶解では、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３は、完全長抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１と比べて少なくとも１０００倍強力であった。

【図8】新鮮なＮＫ細胞を使用する細胞傷害アッセイの結果を示し（右側パネルにおけるＤａｕｄｉ細胞及び左側パネルにおけるＨＵＴ７８細胞）、Ｎ２９７置換に起因してＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、ＮＫ細胞が標的細胞と遭遇した場合にＮＫｐ４６誘発の作用様式を有するが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３二重特異的タンパク質は、Ｄａｕｄｉ細胞への細胞傷害性の媒介ではるかに高い効力を示した。Ｆ５タンパク質もＦ６タンパク質も、ＨＵＴ７８細胞へのいかなるＮＫ細胞の細胞傷害性も媒介しなかった。

【図9】Ｆ５タンパク質によるＮＫ細胞の表面上のＣＤ１３７の強力な上方制御を示したＮＫ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー染色の結果を示す（最も左側のパネル：ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ、中央のパネル：ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８、最も右側のパネル：ＮＫ細胞のみ）。ＣＤ１６に結合する完全長抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１抗体もＣＤ１３７上方制御を示したが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３タンパク質と比べてはるかに低かった。ＮＫｐ４６を介して機能するがＣＤ１６を介しては機能しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、いかなるＣＤ１３７上方制御も示さなかった。

【図10】ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１二重特異的タンパク質のＤａｕｄｉ細胞を溶解させる能力を同一の可変領域を含む比較抗体（ＧＡ１０１）と比較した細胞傷害アッセイの結果を示す。図１０の結果は、ＧＡ１０１−Ｆ５^＋−ＮＫｐ４６−１二重特異的タンパク質がＧＡ１０１と比べてＤａｕｄｉ細胞への細胞傷害の媒介ではるかに高い効力（ＥＣ_５０で約１０倍の増加）を有することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0082】

定義
本明細書で使用される「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は１つ以上を意味し得る。請求項において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語と共に使用される場合、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語は１つ又は２つ以上を意味し得る。

【0083】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、これは、任意選択により「本質的に〜からなる（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」で置き換えることができ、又は任意選択により「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」に置き換えることができる。

【0084】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」又は「ＡＢＤ」という語は、エピトープに免疫特異的に結合することができる３次元構造を含むドメインを指す。従って、一実施形態では、前記ドメインは、超可変領域、任意選択により抗体鎖のＶＨ及び／又はＶＬドメイン、任意選択により少なくとも１つのＶＨドメインを含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、抗体鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。別の実施形態では、結合ドメインは、非免疫グロブリン足場からのポリペプチドドメインを含み得る。

【0085】

本明細書の「抗体」という語は、広い意味で使用され、特に、完全長モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、並びに抗体断片及び誘導体（但し、所望の生物学的活性を示すものに限られる）を含む。抗体の作製に適切な様々な技術が、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８８）に示されている。「抗体断片」は、完全長抗体、例えば、その抗原結合領域又は可変領域の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆ（ａｂ）_３、Ｆｖ（典型的には、抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメイン）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓＦｖ、Ｆｄ断片（典型的には、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン）、及びｄＡｂ（典型的には、ＶＨドメイン）断片；ＶＨ、ＶＬ、ＶｈＨ、及びＶ−ＮＡＲドメイン；ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びカッパボディ（例えば、Ｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ １９９７；１０：９４９−５７を参照されたい）；ラクダＩｇＧ；ＩｇＮＡＲ；並びに抗体断片から形成された多重特異的抗体断片、及び１つ以上の単離されたＣＤＲ又は機能的パラトープが挙げられ、単離されたＣＤＲ又は抗原結合残基若しくはポリペプチドは、機能的抗体断片を形成するように１つに結合又は連結され得る。様々なタイプの抗体断片が、例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００５；２３，１１２６−１１３６；国際公開第２００５０４０２１９号パンフレット、及び米国特許出願公開第２００５０２３８６４６号明細書及び同第２００２０１６１２０１号明細書に記載され、再考察されている。

【0086】

本明細書で使用される「抗体誘導体」という語は、完全長抗体、又は例えばその少なくとも抗原結合領域又は可変領域を含む抗体の断片を含み、１つ以上のアミノ酸が、例えば、アルキル化、ＰＥＧ化、アシル化、エステル形成、又はアミド形成などによって化学修飾されている。これは、限定されるものではないが、ＰＥＧ化抗体、システイン−ＰＥＧ化抗体、及びこれらの変異体を含む。

【0087】

「超可変領域」という語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、及び８９−９７（Ｌ３）並びに重鎖可変ドメインの残基３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．１９９１）、及び／又は「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ １９８７；１９６：９０１−９１７）を含む。典型的には、この領域のアミノ酸残基の付番は、前出のＫａｂａｔらに記載の方法によって行われる。本明細書の「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔと同様の可変ドメイン残基の付番」、及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインについてのこの付番方式を指す。Ｋａｂａｔ付番方式を用いると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲの短縮又はＦＲ又はＣＤＲへの挿入に一致するより少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、抗体の配列の相同領域と「基準」Ｋａｂａｔ付番配列とのアラインメントによって所与の抗体について決定することができる。

【0088】

本明細書で使用される「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基とは、ＣＤＲとして定義される部分を除く抗体可変ドメインの領域のことである。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲによって分離された連続した領域にさらに細分することができる（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４）。

【0089】

本明細書で定義される「定常領域」とは、軽鎖又は重鎖免疫グロブリン定常領域遺伝子の１つによってコードされる抗体由来定常領域のことである。本明細書で使用される「定常軽鎖」又は「軽鎖定常領域」とは、κ（Ｃ_Ｋ）又はλ（Ｃλ）軽鎖によってコードされる抗体の領域のことである。定常軽鎖は、典型的には、単一ドメインを含み、且つ本明細書で定義されるように、Ｃ_Ｋの１０８〜２１４位、又はＣλを指し、付番は、ＥＵインデックスによる（（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。

【0090】

本明細書で使用される「定常重鎖」又は「重鎖定常領域」とは、μ、δ、γ、α、又はε遺伝子によってそれぞれコードされてＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＥとして抗体のアイソタイプを確定する抗体の領域のことである。完全長ＩｇＧ抗体では、本明細書で定義される定常重鎖は、ＣＨ１ドメインのＮ末端からＣＨ３ドメインのＣ末端までを指し、従って１１８〜４４７位を含み、付番は、ＥＵインデックスによる。

【0091】

本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドのことである。Ｆａｂは、分離されたこの領域、又はポリペプチド、多重特異的ポリペプチド、若しくはＡＢＤ、又は本明細書で概説されたその他の実施形態との関連でのこの領域を指し得る。

【0092】

本明細書で使用される「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片のことであり、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが、抗原結合のための所望の構造を形成できるようにする、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖを作製する方法は当技術分野で周知である。ｓｃＦｖを作製する方法の再考察については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。

【0093】

本明細書で使用される「Ｆｖ」、又は「Ｆｖ断片」、又は「Ｆｖ領域」とは、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドのことである。

【0094】

本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く、抗体の定常領域を含むポリペプチドのことである。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、並びに可撓性ヒンジＮ末端からこれらのドメインまでを指す。ＩｇＡ及びＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２（ＣＨ２）及びＣγ３（ＣＨ３）、並びにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６、Ｐ２３０、又はＡ２３１からそのカルボキシ末端までを含むように定義され、この付番はＥＵインデックスによる。Ｆｃは、以下に記載される、分離されたこの領域、又はＦｃポリペプチドとの関連でのこの領域を指し得る。本明細書で使用される「Ｆｃポリペプチド」又は「Ｆｃ由来ポリペプチド」とは、Ｆｃ領域の全て又は一部を含むポリペプチドのことである。本明細書のＦｃポリペプチドは、限定されるものではないが、抗体、Ｆｃ融合体、及びＦｃ断片を含む。また、本発明に係るＦｃ領域として、Ｆｃ関連エフェクター機能を変更（増強又は低減）する少なくとも１つの改変を含む変異体も挙げられる。また、本発明に係るＦｃ領域として、例えば異なるアイソタイプ又は種の抗体に由来する異なるＦｃ領域の異なる部分又はドメインを含むキメラＦｃ領域も挙げられる。

【0095】

本明細書で使用される「可変領域」とは、それぞれ軽鎖（_Ｋ及びλを含む）免疫グロブリン遺伝子座及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＬ（Ｖ_Ｋ（Ｖ_Ｋ）及びＶλを含む）遺伝子及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む抗体の領域のことである。軽鎖可変領域又は重鎖可変領域（ＶＬ又はＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲとの関連では、例えば、Ｋａｂａｔと同様に（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｅ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）を参照されたい）、及びＣｈｏｔｈｉａと同様に正確に定義されている。抗体のフレームワーク領域、即ち、構成軽鎖及び構成重鎖の組み合わせフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置して整列させる役割を果たし、ＣＤＲは抗原への結合に主に関与する。

【0096】

「特異的に結合する」という語は、抗体又はポリペプチドを、タンパク質の組換え形態、その中のエピトープ、又は単離された標的細胞の表面に存在するナイーブタンパク質のいずれかを用いて評価される、好ましくは競合的結合アッセイでの結合パートナー、例えば、ＮＫｐ４６に結合できることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的結合を決定する他の方法は、以下にさらに記載され、当技術分野で周知である。

【0097】

抗体又はポリペプチドが、特定のモノクローナル抗体（例えば、抗ＮＫｐ４６単一又は二重特異的抗体との関連でのＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９）と「競合する」と言われる場合、この「競合する」は、抗体又はポリペプチドが、組換え標的（例えば、ＮＫｐ４６）分子又は表面発現標的（例えば、ＮＫｐ４６）分子のいずれかを用いた結合アッセイでモノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が、結合アッセイにおいてＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９のＮＫｐ４６ポリペプチド又はＮＫｐ４６発現細胞に対する結合性を低下させる場合、抗体は、それぞれＮＫｐ４６−１、−２、−４、−６、又は−９と「競合する」と言われる。

【0098】

本明細書で使用される「親和性」という語は、抗体又はポリペプチドのエピトープへの結合の強さを指す。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数Ｋ_Ｄによって示され、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和定数Ｋ_Ａは１／Ｋ_Ｄによって定義される。ｍＡｂの親和性の決定に好ましい方法は、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８），Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に記載されている。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知の１つの好ましい標準的な方法では、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析によって）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングを使用する。

【0099】

本発明との関連では、「決定基」は、ポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指定する。

【0100】

「エピトープ」という語は、抗原決定基を指し、抗体又はポリペプチドが結合する抗原の範囲又は領域である。タンパク質エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基、並びに特定の抗原結合抗体又はペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基、即ち、抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。タンパク質エピトープは、例えば、抗体又は受容体と結合することができる複合抗原分子上の最も単純な形態又は最も小さい領域である。エピトープは、線形又は高次構造／構造であり得る。「線形エピトープ」という語は、アミノ酸の線形配列（一次構造）上の連続したアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「高次構造又は構造エピトープ」という語は、全てが連続しているわけではないアミノ酸残基から構成され、従って分子の折り畳み（二次、三次、及び／又は四次構造）によって互いに近接するアミノ酸の線形配列の分離した部分を表すエピトープとして定義される。高次構造エピトープは３次元構造によって決まる。従って、「高次構造の」という語は、「構造の」という語と頻繁に同義的に使用される。限定されるものではないが、アラニンスキャニング、ファージディスプレイ、Ｘ線結晶構造解析、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング又はペプスキャン分析（ｐｅｐｓｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、部位特異的突然変異誘発、ハイスループット変異誘発マッピング、Ｈ／Ｄ−Ｅｘ質量分析、ホモロジーモデリング、ドッキング、水素−重水素交換等が挙げられる当技術分野で既知の様々な方法により、エピトープを同定することができる（例えば、Ｔｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅｓ”，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ８（２）：９６−１０８；Ｇｅｒｓｈｏｎｉ，Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｍ；Ｒｏｉｔｂｕｒｄ−Ｂｅｒｍａｎ，Ａｎｎａ；Ｓｉｍａｎ−Ｔｏｖ，Ｄｒｏｒ Ｄ；Ｔａｒｎｏｖｉｔｓｋｉ Ｆｒｅｕｎｄ，Ｎａｔａｌｉａ；Ｗｅｉｓｓ，Ｙａｅｌ（２００７）．“Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ”．ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２１（３）：１４５−５６；及びＦｌａｎａｇａｎ，Ｎｉｎａ（Ｍａｙ １５，２０１１）；“Ｍａｐｐｉｎｇ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｗｉｔｈ Ｈ／Ｄ−Ｅｘ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ：ＥｘＳＡＲ Ｅｘｐａｎｄｓ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ Ｂｅｙｏｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ”，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｅｗｓ ３１（１０）を参照されたい）。

【0101】

本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書のアミノ酸改変の一例は置換である。本明細書の「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失のことである。本明細書の「アミノ酸置換」又は「置換」とは、タンパク質配列の所与の位置のアミノ酸の別のアミノ酸での置換のことである。例えば、置換Ｙ５０Ｗは、親ペプチドの変異体を指し、５０位のチロシンがトリプトファンで置換されている。ポリペプチドの「変異体」は、基準ポリペプチド、典型的にはナイーブ又は「親」ポリペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ポリペプチド変異体は、ナイーブアミノ酸配列内の特定の位置に１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入を有し得る。

【0102】

「保存的な」アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の物理化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当技術分野で公知であり、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。

【0103】

２つ以上のポリペプチドの配列間の関係で使用される「同一性」又は「同一の」という語は、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列関連性の程度を指す。「同一性」は、特定の計算モデル又はコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によって行われる、（存在する場合）ギャップアライメントを用いた同様の２つ以上の配列間の完全な一致のパーセントを示す。関連ポリペプチド間の同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法としては、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；ａｎｄ Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載の方法が挙げられる。

【0104】

同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最大の一致を得るように設計されている。同一性を決定する方法は、公表されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータープログラム方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））を含め、ＧＣＧプログラムパッケージを含む。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）及び他の情報源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）から公表されている。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。

【0105】

「単離された」分子は、組成物中の主な種である分子であり、この組成物中では、この分子は、この分子が属する分子のクラスに対して見出される（即ち、単離された分子は、組成物中の分子のタイプの少なくとも約５０％を構成し、典型的には、組成物中の分子、例えば、ペプチドの種の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％以上を構成する）。通常、ポリペプチドの組成は、組成物中に存在する全てのペプチド種との関連でのポリペプチドに対して、又は少なくとも提案される使用との関連での実質的に活性なペプチド種に対して９８％、９８％、又は９９％の均一性を示す。

【0106】

本明細書に関連して、「処置」又は「処置する」は、反対の旨の記載がない限り、疾患又は障害の１つ以上の症状又は臨床的に関連する兆候を予防すること、緩和すること、管理すること、治癒すること、又は軽減することを指す。例えば、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認されていない患者の「処置」は、防止又は予防療法であり、疾患又は障害の症状又は臨床的に関連する兆候が確認された患者の「処置」は、一般に、防止又は予防療法とはならない。

【0107】

本明細書で使用される「ＮＫ細胞」という句は、従来にない免疫に関与するリンパ球の亜集団を指す。ＮＫ細胞は、特定の特徴及び生物学的特性、例えば、ヒトＮＫ細胞のＣＤ５６及び／又はＮＫｐ４６を含む特定の表面抗原の発現、細胞表面のα／β又はγ／δＴＣＲ複合体の非存在、特定の細胞溶解装置の活性化によって「自己」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合してその細胞を殺す能力、ＮＫ活性化受容体のリガンドを発現する腫瘍細胞又は他の異常細胞を殺す能力、及び免疫応答を刺激又は抑制するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力によって特定することができる。これらの特徴及び活性のいずれかを用いて、当技術分野で周知の方法でＮＫ細胞を特定することができる。ＮＫ細胞のいかなる亜集団もＮＫ細胞という語に包含される。本明細書に関連して、「活性な」ＮＫ細胞は、標的細胞を溶解するか又は他の細胞の免疫機能を促進する能力を有するＮＫ細胞を含む生物学的に活性なＮＫ細胞を指す。ＮＫ細胞は、当技術分野で公知の様々な技術、例えば、血液サンプルからの単離、細胞吸着除去療法、組織又は細胞の収集などによって得ることができる。ＮＫ細胞を伴うアッセイの有用なプロトコルは、Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＫＳ ａｎｄ Ｃｏｌｏｎｎａ Ｍ）．Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ．ｐｐ．２１９−２３８（２０００）に記載されている。

【0108】

「細胞内インターナリゼーション」と互換的に使用される「インターナリゼーション」という語は、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面へと分子を移行させるプロセスと関連する分子事象、生化学的事象及び細胞事象を指す。分子の細胞内インターナリゼーションに関与するプロセスは公知であり、特に、細胞外分子（例えば、ホルモン、抗体及び有機小分子）、膜関連分子（例えば、細胞表面受容体）並びに細胞外分子に結合した膜関連分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜関連分子に結合した抗体）のインターナリゼーションを挙げることができる。そのため、「インターナリゼーションを誘導し及び／又は増加させる」は、細胞内インターナリゼーションが開始され、且つ／又は細胞内インターナリゼーションの割合及び／若しくは程度が増加する事象を指す。

【0109】

本明細書で使用される、ＮＫｐ４６で「アゴニスト」活性を有する作用物質は、「ＮＫｐ４６シグナル伝達」を引き起こす又は増加させることができる作用物質である。「ＮＫｐ４６シグナル伝達」は、細胞内シグナル伝達経路を活性化させるか又は伝達するＮＫｐ４６ポリペプチドの能力を指す。ＮＫｐ４６シグナル伝達活性の変化は、例えば、シグナル伝達要素のリン酸化の監視などによるＮＫｐ４６シグナル伝達経路の変化を測定するように設計されたアッセイ、特定のシグナル伝達要素と他のタンパク質若しくは細胞内構造の結合を測定するアッセイ、又はキナーゼなどの成分の生化学活性において、又はＮＫｐ４６感受性プロモーター又はエンハンサーの制御下でのレポーター遺伝子の発現を測定するように設計されたアッセイにより、又はＮＫｐ４６ポリペプチドによって媒介される下流の効果（例えば、ＮＫ細胞における特定の細胞溶解装置の活性化）により間接的に測定することができる。レポーター遺伝子は、天然に存在する遺伝子であり得る（例えば、サイトカインの産生を監視する）、又は細胞に人工的に導入される遺伝子であり得る。他の遺伝子は、このような調節要素の制御下に置くことができ、従って、ＮＫｐ４６シグナル伝達のレベルを報告する役割を果たす。

【0110】

「ＮＫｐ４６」は、Ｎｃｒ１遺伝子又はこのような遺伝子から調製されるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質又はポリペプチドを指す。あらゆる天然に存在するイソ型、対立遺伝子、オルソログ、又は変異体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドという語（例えば、配列番号１に９０％、９５％、９８％、若しくは９９％同一のＮＫｐ４６ポリペプチド、又はその少なくとも２０、３０、５０、１００、若しくは２００のアミノ酸残基の連続した配列）に包含される。ヒトＮＫｐ４６（イソ型ａ）の３０４のアミノ酸残基の配列は、以下のように示される。

【化1】

【0111】

配列番号１は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００４８２０に一致し、この開示は、参照により本明細書に組み入れられる。ヒトＮＫｐ４６ ｍＲＮＡ配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００４８２９に示されており、この開示は、参照により本明細書に組み入れられる。

【0112】

ポリペプチドの産生
本明細書に記載のタンパク質に使用される抗原結合ドメインは、様々な免疫グロブリン又は非免疫グロブリン足場、例えば、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメインをベースとしたアフィボディ、エンジニアリングされたＫｕｎｉｔｚドメイン、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの第１０細胞外ドメインをベースとしたモノボディ又はアドネクチン、リポカリンに由来するアンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ（設計アンキリン反復ドメイン、多量体化ＬＤＬＲ−Ａモジュール、アビマー、又はシステインリッチｋｎｏｔｔｉｎペプチド）の任意のものから容易に得ることができる。例えば、参照により開示内容が本明細書に組み入れられる、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：２４５−２５５を参照されたい。

【0113】

可変ドメインは、通常、抗体（免疫グロブリン鎖）に由来し、例えば、２つのポリペプチド鎖に存在する結合したＶ_Ｌ及びＶ_Ｈドメイン、又は一本鎖抗原結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、又はＶ_ＨＨドメインの形態である。対形成及び／又は折り畳みを実質的にさらに必要とすることなくＦａｂ又はｓｃＦｖ由来の広範囲の可変領域の使用を直接可能にする本明細書で開示されている特定の有利なタンパク質形態では、抗原結合ドメイン（例えば、ＡＢＤ_１及びＡＢＤ_２）はまた、Ｆａｂ又はｓｃＦｖとして抗体にも容易に由来し得る。

【0114】

典型的には、抗体は、最初は、抗体（例えば、ヒトポリペプチド）を得るのに望ましいポリペプチド、又は典型的には免疫原性断片であるその断片若しくは誘導体を含む免疫原を用いて、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、又はウサギの免疫によって得られる。非ヒト哺乳動物を抗原で免疫するステップは、マウスの抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知の任意の方式で行うことができる（例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＥ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）を参照されたい）。ヒト抗体は、ヒト抗体レパートリーを発現するようにエンジニアリングされたトランスジェニック動物（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ ｅｔ Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５）を免疫に用いることにより、又はファージ提示法を用いる抗体レパートリーの選択により産生することもできる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を免疫に使用することができる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、その免疫グロブリン遺伝子が機能的なヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられたマウス宿主である。従って、このマウスにより、又はこのマウスのＢ細胞から産生されたハイブリドーマで産生される抗体は既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、参照によりその内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，１６２，９６３号明細書に記載されている。抗体はまた、例えば、（参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられるＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３４１（１９８９）ｐ．５４４）に開示されているように、免疫グロブリンの組み合わせライブラリーの選択によって産生することもできる。ファージ提示法（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２−５５３）を用いて、非免疫ドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから抗体を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ ｅｔ ａｌ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５７３，９０５号明細書；同第５，５６７，６１０号明細書；及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい。組み合わせライブラリーが、ヒト起源の可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーを含む場合、組み合わせライブラリーからの選択により、ヒト抗体が得られる。

【0115】

加えて、広範囲の抗体が、ＤＮＡ及び／又はアミノ酸配列を含む化学文献及び特許文献で、又は民間供給業者から入手可能である。抗体は、典型的には、所定の抗原に対するものである。抗体の例としては、除去されるべき標的細胞、例えば、増殖細胞又は病理の原因となる細胞によって発現される抗原を認識する抗体が挙げられる。例としては、腫瘍抗原、微生物（例えば、細菌又は寄生虫）抗原、又はウイルス抗原を認識する抗体が挙げられる。

【0116】

ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載される（「ＣＤＲ配列」のセクションを参照されたい）抗ＮＫｐ４６抗体に由来し得る。可変領域は、直接使用することもできるし、又はＮＫｐ４６抗体の超可変又はＣＤＲ領域を選択して、これらを適切なＶＬ又はＶＨフレームワーク、例えば、ヒトフレームワークに入れることによって改変することもできる。ＮＫｐ４６に結合する抗原結合ドメインはまた、抗体を産生する方法を用いて新たに得ることもできる。抗体は、ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合性について試験することができる。本明細書の任意の実施形態の一態様では、ＮＫｐ４６に結合するポリペプチド（例えば、多重特異的ポリペプチド、二重特異的又は単一特異的抗体）は、細胞の表面で発現されるＮＫｐ４６、例えば、ＮＫ細胞によって発現されるナイーブＮＫｐ４６に結合することができる。

【0117】

目的の抗原に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、所望の目的の抗原（例えば、ＮＫｐ４６以外の抗原）に基づいて選択され得、例えば、癌抗原、例えば腫瘍細胞上に及び／又は腫瘍誘発効果（ｐｒｏ−ｔｕｍｏｒａｌ ｅｆｆｅｃｔ）を媒介し得る免疫細胞（例えば、単球若しくはマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、調節性Ｔ細胞若しくは骨髄由来のサプレッサー細胞）上に存在する抗原（癌の処置の場合）；細菌若しくはウイルス抗原（感染性疾患の処置の場合）；又は炎症誘発性免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、好中球、マクロファージ）上に存在する抗原等（炎症性及び／若しくは自己免疫性の障害の処置の場合）を挙げることができる。本明細書で使用される「細菌抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷細菌、弱毒細菌、若しくは死菌、あらゆる構造的若しくは機能的細菌タンパク質若しくは炭水化物、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）の細菌タンパク質の任意のペプチド部分を含む。例としては、グラム陽性細菌抗原及びグラム陰性細菌抗原が挙げられる。一部の実施形態では、細菌抗原は、ヘリコバクター（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）種、特にヘリコバクターピロリス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉｓ）；ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種、特にボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）種、特にレジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）；マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓ）種、特に結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、アビウム菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、イントラセルラ菌（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、Ｍ．ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）；ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、特に黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、特に淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、特にリステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、特にＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．アガラクティエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ファエカリス（Ｓ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；嫌気性連鎖球菌（ａｎａｅｒｏｂｉｃ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種；病原性カンピロバクター（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種；エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種；ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）種、特にヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特に炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にコリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）；エリジペロスリックス（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種、特にブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）；クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、特にウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃ．ｔｅｔａｎｉ）；エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、特にエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、特にクレブシエラ１Ｓニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ １Ｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パストレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、特にパストレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ）種、特にパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種；フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、特にフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）；ストレプトバチルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にストレプトバチルス・モリホルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）；トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種、特にトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ）；レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）；病原性エシェリキア種（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）；及びアクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、特にアクチノミセス・イスラエリ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉ）からなる群から選択される細菌に由来する。

【0118】

本明細書で使用される「ウイルス抗原」という語は、限定されるものではないが、無傷全ウイルス、弱毒全ウイルス、若しくは死滅全ウイルス、任意の構造的若しくは機能的ウイルスタンパク質、又は抗原性であるべき十分な長さ（典型的には、約８アミノ酸以上）のウイルスタンパク質の任意のペプチド部分を含む。ウイルス抗原の供給源としては、限定されるものではないが、レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；及び他の分離株、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス；ヒトコクサッキーウイルス；ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（例えば、胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブンヤウイルス科（例えば、ハンタウイルス、ブンヤウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス）；ボルナビリダエ科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１及び２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（バリオラウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；及びイリダウイルス科（例えば、アフリカブタ熱ウイルス）；及び未分類ウイルス（例えば、デルタ肝炎の作用物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライト（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ）と考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）の科からのウイルスが挙げられる。別法では、ウイルス抗原は、組換えにより作製することができる。

【0119】

本明細書で使用される「癌抗原」及び「腫瘍抗原」という語は互換的に使用され、癌細胞により差次的に発現され、又は腫瘍誘発効果（例えば、免疫抑制効果）を有する非腫瘍細胞（例えば、免疫細胞）によって発現され、それにより癌細胞を標的とするために利用され得る抗原（ＮＫｐ４６又はＣＤ１６以外）を指す。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。この抗原の一部は、正常細胞により、必ずしも発現されるものではないがコードされているか、又はより低いレベル若しくはより少ない頻度で発現される。これらの抗原は、正常細胞では通常サイレントである（即ち、発現されない）抗原、分化の特定の段階のみで発現される抗原、及び胚抗原及び胎児抗原のように一時的に発現される抗原として特徴付けることができる。他の癌抗原は、変異細胞遺伝子、例えば、癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異ｐ５３）、内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、ウイルス遺伝子、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルスに保持されたウイルス遺伝子によってコードすることができる。さらに他の癌抗原は、腫瘍誘発効果に寄与し得るか又はそれを媒介し得る免疫細胞（例えば、免疫回避に寄与する細胞、単球若しくはマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、調節性Ｔ細胞若しくは骨髄由来のサプレッサー細胞）上で発現され得る。

【0120】

癌抗原は、通常、過剰発現されるか若しくは異常な回数で発現される正常細胞の表面抗原であるか、又は標的とされる細胞の集団によって発現される。理想的には、標的抗原は増殖細胞（例えば、腫瘍細胞）上又は腫瘍誘発細胞（例えば、免疫抑制効果を有する免疫細胞）上でのみ発現されるが、実際にはこのようなことが観測されるのは稀である。結果として、標的抗原は、多くの場合、増殖／疾患組織と健康組織との間の差次的な発現に基づいて選択される。癌抗原の例として以下が挙げられる：受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、Ｃｒｙｐｔｏ、ＣＤ４、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ４７、糖タンパク質ＮＭＢ、ＣａｎＡｇ、Ｈｅｒ２（ＥｒｂＢ２／Ｎｅｕ）、Ｓｉｇｌｅｃファミリメンバー、例えばＣＤ２２（Ｓｉｇｌｅｃ２）又はＣＤ３３（Ｓｉｇｌｅｃ３）、ＣＤ７９、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＰＳＣＡ、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ７０、Ｅ−セレクチン、ＥｐｈＢ２、メラノトランスフェリン、Ｍｕｄ６及びＴＭＥＦＦ２。癌抗原の例として以下も挙げられる：免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）、例えばサイトカイン受容体、キラーＩｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリタンパク質、例えばキラーＩｇ様受容体３ＤＬ２（ＫＩＲ３ＤＬ２）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＰＤ−Ｌ１、ＩＬ−６受容体。例として以下も挙げられるが、これは包括的であることを意図されていない：ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、受容体タンパク質チロシンキナーゼ３（ＴＹＲＯ−３）、ネクチン（例えば、ネクチン−４）、主要組織適合複合体クラスＩ関連鎖Ａ及びＢポリペプチド（ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢ）、ＵＬ１６−結合タンパク質（ＵＬＢＰ）ファミリのタンパク質、レチノイン酸初期転写産物−１（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ ｅａｒｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ−１）（ＲＡＥＴ１）ファミリのタンパク質、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリ、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリ、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、ＤＲ５、ＲＯＲ１（受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１又はＮＴＲＫＲ１（ＥＣ２．７．１０．１）としても知られている、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、ＭＵＣファミリ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、アンジオポイエチン−２、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ヒトＥＧＦ様受容体ファミリのメンバー、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＥＲ−３、ＨＥＲ−４、又は少なくとも１つのＨＥＲサブユニットで構成されたヘテロ二量体受容体、ガストリン放出ペプチド受容体抗原、Ｍｕｃ−１、ＣＡ１２５、インテグリン受容体、αｖβ３インテグリン、α５β１インテグリン、αＩＩｂβ３インテグリン、ＰＤＧＦベータ受容体、ＳＶＥ−カドヘリン、ＩＬ−８受容体、ｈＣＧ、ＩＬ−６受容体、ＣＳＦ１Ｒ（腫瘍関連の単球及びマクロファージ）、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ウイルス産物、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質、ｉｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶコード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、並びにｃ−ｅｒｂＢ−２。一態様では、目的の抗原は、例えばＦｃγ受容体細胞の存在下で又は非存在下で従来のヒトＩｇＧ１抗体が結合した場合、細胞内インターナリゼーションを受けることができる抗原（例えば、上記で列挙した抗原の任意の１つ）である。一態様では、目的の抗原はＣＤ１９又はＣＤ２０ポリペプチドであり、一態様では、本多重特異的タンパク質はＶ_Ｈ及び／若しくはＶ_Ｌ又はｓｃＦｖ又は別のＡＢＤを含み、これらは、本明細書の実施例で説明されている抗ＣＤ１９若しくは抗ＣＤ２０それぞれのＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ若しくはｓｃＦｖの配列と少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％若しくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤ１９若しくはＣＤ２０に結合するか、又は本明細書で開示されている抗ＣＤ１９若しくは抗ＣＤ２０の重鎖及び軽鎖の可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。一態様では、本多重特異的タンパク質は、実施例で開示されている各抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ２０のＶ_Ｈ、Ｖ_Ｌ又はｓｃＦｖを含む抗体（即ちＦ５若しくはＴ６タンパク質）と、ヒトＣＤ１９又はＣＤ２０ポリペプチドへの結合に関して競合する。

【0121】

一実施形態では、目的の抗原に結合するＡＢＤは、抗原性標的（細胞上の目的の抗原）に結合した場合に目的の抗原の下方調節又は細胞内インターナリゼーションを増加させるか又は誘導する、目的の抗原に結合する親抗体（例えば、ネズミ抗体、ヒト抗体）に由来する（例えば、この親抗体の超可変領域を含むか、又はこの親抗体のＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つを含む）。一実施形態では、目的の抗原は癌抗原であり、例えば、インターナライズすることが分かっている上記で列挙した癌抗原の１つ（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリ（ＩｇＳＦ）メンバー、例えばサイトカイン受容体α又はβ鎖、キラーＩｇ様受容体、ＣＤ２８ファミリタンパク質、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＰＴＫ７、ＲＯＲ１、Ｌ１−ＣＡＭ、Ｓｉｇｌｅｃファミリメンバー、ＥＧＦ受容体及びＥＧＦ様受容体ファミリメンバー、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、インテグリン、抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体、ＣＳＦ−１Ｒ等）である。一実施形態では、抗原標的は、腫瘍誘発効果を媒介することができる免疫細胞（例えば、単球又はマクロファージ、任意選択によりサプレッサーＴ細胞、調節性Ｔ細胞又は骨髄由来のサプレッサー細胞）上に存在するポリペプチドである。

【0122】

一実施形態では、ＡＢＤは、癌抗原、ウイルス抗原、微生物抗原、又は感染（例えば、ウイルス感染）細胞上若しくは炎症性免疫細胞上に存在する抗原に結合する。一実施形態では、前記抗原は、腫瘍細胞、及び感染細胞又は炎症性細胞で選択的に発現又は過剰発現されるポリペプチドである。一実施形態では、前記抗原は、阻害されると、腫瘍細胞、感染細胞、又は炎症性細胞の増殖及び／又は生存率を低下させるポリペプチドである。

【0123】

ポリペプチドに含められるＡＢＤは、多重特異的ＮＫｐ４６結合タンパク質に含められる前に任意の所望の活性について試験することができ、例えば、ＡＢＤは、目的の抗原への結合性について試験することができる。

【0124】

抗体に由来するＡＢＤは、一般に、結合活性を付与するのに十分な超可変領域を少なくとも含む。ＡＢＤは、限定されるものではないが、リンカー要素（例えば、リンカーペプチド、ＣＨ１、Ｃ_Ｋ又はＣλドメイン、ヒンジ、又はそれらの断片）を含む他のアミノ酸又は機能的ドメインを場合により必要に応じて含み得ることを理解されたい。一例では、ＡＢＤは、ｓｃＦｖ、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメイン、又は単一ドメイン抗体（ナノボディ又はｄＡｂ）、例えば、Ｖ−ＮＡＲドメイン又はＶ_ＨＨドメインを含む。例示的な抗体形態は、本明細書にさらに説明され、ＡＢＤは、所望の形態に基づいて選択することができる。

【0125】

任意の実施形態では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗体から得ることができ、このヒト化抗体では、ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、元の抗体（親又はドナー抗体、例えば、マウス又はラット抗体）のＣＤＲからの残基によって置換されているが、所望の特異性、親和性、及び元の抗体の能力を維持している。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部又は全てがコードされた親抗体のＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに全て又は一部を移植して、その特異性が移植されるＣＤＲによって決まる抗体を作製する。このような抗体の作製は、例えば、国際公開第９２／１１０１８号パンフレット、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６に記載されている。従って、抗原結合ドメインは、非ヒト超可変領域又はＣＤＲ及びヒトフレームワーク領域の配列（任意選択により逆突然変異を含む）を有し得る。

【0126】

所望の特異性及び／又は活性を有する適切な抗原結合ドメインが特定されると、ＡＢＤのそれぞれをコードするＤＮＡを、適切な宿主へのトランスフェクションのために、任意の要素、例えば、ＣＨ１、ＣＫ、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン又はその一部並びにその他の任意選択の要素をコードするＤＮＡ（例えば、誘導されるヒンジ又はリンカー要素をコードするＤＮＡ）と共に、適切な配置で適切な発現ベクターに別個に配置することができる。ＡＢＤは、互いに機能的に連結された所望のドメインを有するＦｃポリペプチドを作製するために、いずれのタイプのポリペプチドが作製されるべきかに応じて、１つの発現ベクター又は別個のベクターに配置することができる。次いで、宿主を多重特異的ポリペプチドの組換え産生に使用することができる。

【0127】

例えば、ポリペプチド融合産物をベクターから作製することができ、このベクターでは２つのＡＢＤのうちの第１のＡＢＤが、ＣＨ２ドメインのＮ末端に（例えば、直接、或いはＣＨ１、Ｃ_Ｋ、若しくはＣλ定常領域及び／又はヒンジ領域を介して）機能的に連結され、ＣＨ２ドメインが、そのＣ末端からＮ末端でＣＨ３ドメインに機能的に連結されている。２つのＡＢＤのうちの第２のＡＢＤは、第１のＡＢＤを含むポリペプチドと二量体、例えば、ヘテロ二量体を形成する第２のポリペプチド鎖上にあり得る。このポリペプチドは、完全長及び／又は二量体Ｆｃドメインを含み得る。

【0128】

次いで、多重特異的ポリペプチドを適切な宿主細胞で又は任意の適切な合成プロセスによって産生することができる。多重特異的ポリペプチドの発現用に選択された宿主細胞は、限定されるものではないが、免疫グロブリンＣＨ２ドメインのタンパク質を装飾するオリゴ糖部分の組成の変化を含め、最終組成物にとって重要な寄与因子である。従って、本発明の一態様は、多重特異的ポリペプチドが、ＦｃＲｎ及びＣＤ１６結合を維持するように、所望の治療用タンパク質を発現する産生細胞の使用及び／又は開発のための適切な宿主細胞の選択を含む。宿主細胞は、哺乳動物起源であってもよく、又はＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫若しくは植物細胞、又はそれらの任意の誘導体、不死化若しくは形質転換細胞から選択してもよい。宿主細胞は、Ｎ連結グリコシル化ポリペプチドを産生し得る任意の適切な種又は生物であり得、例えば、ヒト又は齧歯動物のＩｇＧ型Ｎ連結グリコシル化を生じさせ得る哺乳動物宿主細胞であり得る。

【0129】

ヘテロ二量体、ヘテロ三量体及び四量体（後者は、例えば２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する二重特異的抗体を含む）等の多量体二重特異的タンパク質を様々な形式に従って作製することができる。この多量体ポリペプチドは、概して、ヒトＣＤ１６又はＣＤ１６Ａ並びに任意選択により他のＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４）に結合することができる二量体Ｆｃドメインを含む。本明細書でさらに説明されているように、適切なＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインの使用により、実質的なＦｃＲｎ及びＣＤ１６（ＣＤ１６Ａ）結合を有するＦｃ部分を得ることができる。一実施形態では、Ｆｃ部分はヒトＩｇＧ１アイソタイプ定常領域に由来する。一実施形態では、宿主細胞中でのポリペプチドの産生により、又はＮ２９７連結グリコシル化を引き起こすプロセス（例えば、哺乳動物細胞）により、Ｆｃ部分を得ることができる。一実施形態では、Ｆｃ部分は、ＣＤ１６又はＣＤ１６Ａへの結合を増加させる（例えば、ＣＨ２ドメイン中での）１つ以上のアミノ酸改変を含む。

【0130】

一例では、本タンパク質は、ヒトＦｃドメインに融合された可変ドメイン（優先的なＣＨ３−ＣＨ３ヘテロ二量体化を受けることができるＣＨ３ドメインを含む）をそれぞれ含む第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、これらの第１及び第２の鎖はＣＨ３−ＣＨ３二量体化によって結合し、このタンパク質は二量体Ｆｃドメインを含む。各鎖の可変ドメインは、同一の又は異なる抗原結合ドメインの一部であり得る。

【0131】

多量体ポリペプチドを作製する有利な一方法は、ヒトＣＨ１又はＣκ定常ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）に融合された少なくとも１つの重鎖又は軽鎖の可変ドメインをそれぞれが含む異なるポリペプチド鎖の結合によるものであり、このタンパク質鎖は、ＣＨ１−Ｃκ二量体を受けて、非共有結合により並びに任意選択によりさらにそれぞれのＣＨ１及びＣκドメイン間に形成されたジスルフィド結合によって互いに結合している。一実施形態では、本発明は、第１及び第２の抗原に結合する単離又は精製されたヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質であって、Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位をそれぞれ含む少なくとも２つ又は３つのポリペプチド鎖であり、そのため、これらの鎖が、非供給結合により互いに結合しており、任意選択によりＣＨ１及びＣκドメイン間のジスルフィド結合によりさらに結合しており、さらに任意選択により、これらの鎖が、それぞれの可変領域間の非共有結合によって結合している、ポリペプチド鎖と、ＣＨ１及びＣκドメインと、Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインとを含むタンパク質を提供する。

【0132】

一実施形態では、本タンパク質は、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む第１及び第２のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣκドメインがそのＣ末端でヒトＦｃドメイン（ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を受けることができるＣＨ３ドメインを含む）に融合されている、第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１及び第２の鎖はＣＨ１−Ｃκ及びＣＨ３−ＣＨ３二量体化によって結合し、このタンパク質は二量体Ｆｃドメインを含む。それぞれの鎖の可変ドメインは同一の又は異なる抗原結合ドメインの一部であり得る。

【0133】

これらの可変及び定常領域は、各鎖がその所望の相補的パートナー鎖と優先的に結合するように選択及び構成され得る。従って、得られる多量体タンパク質は、組換え宿主細胞を使用する従来の作製方法を使用して作製することが簡単であろう。いずれのＶ_Ｈ又はＶ_Ｌが単位中のＣＨ１及びＣκと結合するかの選択は、所望の多量体の形成を駆動するように対形成する単位間の親和性に基づく。得られる多量体は、相補的なＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメイン間の非共有結合により、相補的なＣＨ１及びＣκドメイン間の非共有結合により、並びに任意選択により相補的なＣＨ１及びＣκドメイン間のさらなるジスルフィド結合（及び任意選択により相補的なヒンジドメイン間のさらなるジスルフィド結合）により結合する。Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌ結合はＶ_Ｈ−Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ−Ｖ_Ｌと比べて強力であり、その結果として、本明細書で示すように、Ｖ_Ｈ又はＶ_ＬをＣＨ１又はＣκのいずれかに隣接して配置することができ、得られるＶ−Ｃ単位は、好ましくは、そのＶ−Ｃカウンターパートとパートナーになる。例えば、Ｖ_Ｈ−Ｃκは、Ｖ_Ｈ−ＣＨ１よりも優先的にＶ_Ｌ−ＣＨ１と対形成する。加えて、Ｆｃドメインを含むことにより、２つのＦｃ含有鎖がＦｃドメインのＣＨ３ドメイン間の非共有結合によって結合することから、好ましい鎖の対形成がさらに改善される。従って、様々なＶ−Ｃの組み合わせは、任意選択によりＦｃの対形成とさらに組み合わされて、ヘテロ多量体タンパク質を作製するためのツールを提供する。

【0134】

一例では、本多重特異的タンパク質は、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む第１及び第２のポリペプチド鎖であって、ＣＨ１又はＣκドメインがそのＣ末端でヒトＦｃドメインに融合されている第１及び第２のポリペプチド鎖を含み、第１の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位が第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を受けており、それにより第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_１）と二量体Ｆｃドメインとが形成されており、これらのポリペプチド鎖の一方が、第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_２）を形成する抗原結合ドメインをさらに含み、ＦｃドメインがヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する。一実施形態では、このＦｃドメインは残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む。一例では、このタンパク質は、ドメイン配置：

【化2】

を有する。

【0135】

一例では、本タンパク質は、ＣＨ１又はＣκドメインに融合された可変ドメイン（Ｖ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位）をそれぞれ含む３つのポリペプチド鎖を含み、第１の（中心）鎖が、２つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位と、これらの単位間に介在しているヒトＦｃドメインとを含み、第２の鎖が１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とヒトＦｃドメインとを含み、第３の鎖が１つのＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位を含み、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の一方が、第２の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を受けており、それにより第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_１）と二量体Ｆｃドメインとが形成されており、中心鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位の他方が、第３の鎖のＶ−（ＣＨ１／Ｃκ）単位とのＣＨ１−Ｃκ二量体化を受けており、それにより第２の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ_２）が形成されており、ＦｃドメインがヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合する。一実施形態では、このＦｃドメインは残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）においてＮ連結グリコシル化を含む。一例では、このタンパク質は、ドメイン配置：

【化3】

を有する。

【0136】

特定の形態では、抗原結合ドメインを形成するためにＣＨ１又はＣκドメインに隣接した可変ドメインと第２の鎖との結合を必要としないヘテロ二量体が形成されている。例えば、単一可変ドメイン又はｓｃＦｖの使用により、各鎖は機能的ＡＢＤを含む。単一可変の例示的なヘテロ二量体分子によるＣＨ１−Ｃκ二量体化をベースとする例は、ドメイン配置：

【化4】

を有することができ、Ｖ_１及びＶ_２は単一可変ドメイン（例えば、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン又はＶ_ＨＨドメイン）であり、Ｖ_１及びＶ_２の一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。

【0137】

一実施形態では、例示的なヘテロ二量体分子は、ドメイン配置：

【化5】

を有することができ、Ｖ_ａ−１、Ｖ_ｂ−１、Ｖ_ａ−２、及びＶ_ｂ−２は、それぞれＶ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインであり、Ｖ_ａ−１及びＶ_ｂ−１の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖ_ａ−１とＶ_ｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖ_ａ−２とＶ_ｂ−２とが第２の抗原結合ドメインを形成し、ＡＢＤの一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。前述の一変異型では、Ｖ_ａ−１、Ｖ_ｂ−１、Ｖ_ａ−２、及びＶ_ｂ−２のいずれか又はそれぞれは、（２つの可変ドメインから形成された）ｓｃＦｖである。Ｖドメインの各対は、（例えば、ｓｃＦｖを形成するために）リンカーペプチドによって分離することができる。

【0138】

同様のアプローチでは、三量体を作製することができる。例示的なヘテロ三量体分子は、以下のドメイン配置：

【化6】

を有することができ、第１／中心鎖と第２鎖とは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化によって結合し、第１／中心鎖と第３鎖とは、ＣＨ１又はＣ_Ｋ二量体化によって結合し、第１／中心鎖及び第３鎖のドメインは、第１鎖と第３鎖とがＣＨ１−Ｃ_Ｋ二量体化によって結合できるように相補的となるように選択され、Ｖ_ａ−１、Ｖ_ｂ−１、Ｖ_ａ−２、及びＶ_ｂ−２は、それぞれＶ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインであり、Ｖ_ａ−１及びＶ_ｂ−１の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖ_ａ−１とＶ_ｂ−１とが第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２の一方はＶＨであり、且つ他方はＶＬであり、従って、Ｖ_ａ−２とＶ_ｂ−２とが第２の抗原結合ドメイン（例えば、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２がリンカーによって分離されているｓｃＦｖ）を形成し、ＡＢＤの一方はＮＫｐ４６に結合し、且つ他方は目的の抗原に結合する。

【0139】

一実施形態では、多量体タンパク質は、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化及び／又はヒンジ二量体化により二量体を生成するための２つＦｃ含有鎖（例えば、鎖１及び２）と、鎖１又は２の一方と二量体化する、Ｖ−Ｃ_Ｈ／Ｃ_Ｋ単位を含むさらなる鎖（例えば、鎖３）とに基づいて構築されている。例示的な分子は、ドメイン配置：

【化7】

を有することができ、Ｖ_ａ−１、Ｖ_ｂ−１、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２はそれぞれＶ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインであり、Ｖ_ａ−１及びＶ_ｂ−１の一方はＶ_Ｈであり、且つ他方はＶ_Ｌであり、それにより、Ｖ_ａ−１及びＶ_ｂ−１は第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２の一方はＶＨであり、且つ他方はＶ_Ｌであり、それにより、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２は第２の抗原結合ドメインを形成する。

【0140】

例示的な分子は、ドメイン配置：

【化8】

を有することができ、Ｖ_ａ−１、Ｖ_ｂ−１、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２はそれぞれＶ_Ｈドメイン又はＶ_Ｌドメインであり、Ｖ_ａ−１及びＶ_ｂ−１の一方はＶ_Ｈであり、且つ他方はＶ_Ｌであり、それにより、Ｖ_ａ−１及びＶ_ｂ−１は第１の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を形成し、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２の一方はＶ_Ｈであり、且つ他方はＶ_Ｌであり、それにより、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２は第２の抗原結合ドメインを形成する。ＣＨ１及びＣ_Ｋは、鎖１が鎖２と結合することができ、且つ鎖２が鎖３と結合することができるように選択される。このタンパク質を、鎖１及び２がＣＨ３−ＣＨ３二量体化によって結合し、且つ鎖２及び３がＣＨ１−Ｃ_Ｋ二量体化によって結合するように構成することができる。

【0141】

任意選択により、本発明の多重特異的タンパク質のいずれかは、アミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含むことができ、抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン界面は、Ｆｃ二量体界面にわたって変更された電荷極性が生じるように変異されており、それにより、静電気的に一致したＦｃ鎖の同時発現が有利な引力相互作用を支援し、それにより、所望のＦｃヘテロ二量体の形成が促進され、不利な反発電荷相互作用が望ましくないＦｃホモ二量体の形成を抑制する。

【0142】

それぞれが例えばＣＨ１−Ｃ_Ｋヘテロ二量体化により中心鎖と結合している１つ以上の鎖として、２つのＡＢＤ及び二量体Ｆｃドメインを有するヘテロ二量体又はヘテロ三量体ポリペプチドを任意選択により作製することができる。そのような多量体を、別々の抗原結合ドメイン（抗原特異性が異なる）の一部である２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む中心（第１の）ポリペプチド鎖と、追加の及び／又は相補的な可変ドメインを生じる１つ以上の他の鎖と、中心及び／又は１つ以上の他の鎖上に配置されたＦｃドメインとで構成することができる。一実施形態では、このＦｃドメインは多量体タンパク質中の２つのＡＢＤ間に介在している。

【0143】

一例では、第１（中心）のポリペプチド鎖は、第２のポリペプチド鎖上の相補的な可変ドメインと共に、目的の１つの（例えば、第１の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する１つの可変ドメインを提供する。第１（中心）のポリペプチド鎖はまた、相補的な可変ドメインと対を形成して目的の別の（例えば、第２の）抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する（例えば、間置Ｆｃドメインの反対側の端部に位置する）第２の可変ドメインを提供し、第２の可変ドメインに相補的な可変ドメインは、（例えば、直列型可変ドメイン構築物、例えば、ｓｃＦｖの第２の可変ドメインに隣接した）中心ポリペプチド上に配置することができるか、又は別個のポリペプチド鎖、特に第３のポリペプチド鎖上に配置することができる。第２（及び存在する場合には第３）のポリペプチド鎖は、ＣＨ１−Ｃ_Ｋヘテロ二量体化により中心ポリペプチド鎖と結合し、非共有結合並びに任意選択により相補的なＣＨ１及びＣ_Ｋドメイン間のさらなる鎖間ジスルフィド結合（及び任意選択によりヒンジ領域間の鎖間ジスルフィド結合）を形成し、ＣＨ／ＣＫ及びＶ_Ｈ／Ｖ_Ｋドメインが、優先的に所望のＶ_Ｈ−Ｖ_Ｌの対形成をもたらす好ましい二量体化構造を生じさせるように選択される限り、一次多量体ポリペプチドが形成される。残りの望ましくない対形成は、作製中に最小限に維持され得、及び／又は精製ステップ中に除去される。三量体では、又はポリペプチドが三量体の調製のために構築される場合、一般に、天然に存在しないＶＨ−ＣＫ又はＶＫ−ＣＨ１ドメイン配置を含む１つのポリペプチド鎖が存在するであろう。

【0144】

そのようなヘテロ二量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖のドメイン配置（ＮからＣ末端へ）の例として、以下：
Ｖ−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）−Ｆｃドメイン−Ｖ−Ｖ、及び
Ｖ−Ｖ−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）−Ｆｃドメイン、及び
Ｆｃドメイン−Ｖ−Ｖ、及び
Ｖ−Ｖ−Ｆｃドメイン、及び
Ｖ−Ｖ−Ｆｃドメイン−Ｖ−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）
のいずれかが挙げられる。

【0145】

例えば、そのようなヘテロ二量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖のドメイン配置（ＮからＣ末端へ）として、以下：
Ｖ_ａ−１−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ_ａ−２−Ｖ_ｂ−２、及び
Ｖ_ａ−２−Ｖ_ｂ−２−Ｆｃドメイン−Ｖ_ａ−１−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ａ
を挙げることができ、Ｖ_ａ−１は軽鎖又は重鎖の可変ドメインであり、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。

【0146】

さらなる例として、以下：
Ｖ_ａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）_ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ_ｂ、及び
Ｖ_ｂ−Ｆｃドメイン−Ｖ_ａ−１−（ＣＨ１又はＣＫ）_ａ
が挙げられ、Ｖ_ｂは単一可変ドメイン（例えば、ｄＡｂ、ＶｈＨ）である。

【0147】

中心鎖のＦｃドメインは、第２の鎖と二量体Ｆｃを形成する場合に所望の機能性（例えば、ＣＤ１６及び任意選択によりＦｃＲｎ又は別のＦｃ受容体の結合性）を付与するのに十分な完全Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）又はその一部であり得る。次いで、第２のポリペプチド鎖が作製され、この第２のポリペプチド鎖は、免疫グロブリン可変ドメイン、及びＣＨ１−Ｃ_Ｋの中心ポリペプチド鎖とのヘテロ二量体化を可能にするように選択されたＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域、例えば、（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｂ単位を含み、この免疫グロブリン可変ドメインは、ＣＨ１又はＣ_Ｋドメインに隣接した中心鎖の可変ドメインを補完し、それにより、相補的な可変ドメインが、目的の第１の抗原の抗原結合ドメインを形成するように選択される。

【0148】

例えば、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置：
Ｖ_ｂ−１−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｂ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_２が中心鎖の（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_１と二量体化し、Ｖ_ｂ−１が中心鎖のＶ_ａ−１と共に抗原結合ドメインを形成する。中心鎖のＶ_ａ−１が軽鎖可変ドメインである場合、Ｖ_ｂ−１は重鎖可変ドメインであり、中心鎖のＶ_ａ−１が重鎖可変ドメインである場合、Ｖ_ｂ−１は軽鎖可変ドメインである。

【0149】

次いで、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを、目的の第２の抗原の抗原結合ドメインを形成する中心鎖の直列型可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖（_Ｋ）可変ドメイン（Ｖ_Ｋ）であり、例えば、ｓｃＦｖ単位を形成する）として構成されたＶ_ａ−２及びＶ_ｂ−２から形成することができる。目的の第２の抗原の抗原結合ドメインは、別法では、中心鎖に存在する単一可変ドメインＶ_ｂから形成することもできる。

【0150】

得られるヘテロ二量体は、例えば以下の構成：

【化9】

を有することができ（図２Ｄ及２Ｅで示す形態１３及び１４として示すそのようなタンパク質のさらなる例を参照されたい）、この構成中、第１のポリペプチド鎖のＶ_ａ−１及び第２のポリペプチド鎖のＶ_ｂ−１の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインであり、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２の一方は軽鎖可変ドメインであり、且つ他方は重鎖可変ドメインである。

【0151】

一実施形態では、ヘテロ二量体二重特異的Ｆｃ由来ポリペプチドは、以下：

【化10】

の１つから選択されるドメイン配置を含み、任意選択により、ヒンジドメインの一方又は両方はペプチドリンカーで置き換えられており、任意選択により、Ｆｃドメインはペプチドリンカーを介して抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖに融合されている。

【0152】

本発明に係るヘテロ二量体ポリペプチドに関する潜在的なドメイン配置の他の例として、限定されるものではないが以下の表に示すものが挙げられる。

【0153】

【表1】

【0154】

例えば、第１のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、第２のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、並びに第１及び第２の可変ドメイン間に介在しているＦｃドメイン又はその一部（即ち、このＦｃドメインは、第１及び第２のＶ−（ＣＨ１／Ｃ_Ｋ）単位間に介在している）を含む中心（第１の）ポリペプチド鎖を使用することにより、ヘテロ三量体タンパク質を形成することができる。例えば、本発明に係るヘテロ三量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖は、以下のようなドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ_ａ−１−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ_ａ−２−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｂ
を有することができる。

【0155】

次いで、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ_ｂ−１−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｃ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｃは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ａと二量体化し、Ｖ_ａ−１及びＶ_ｂ−１は抗原結合ドメインを形成する。

【0156】

次いで、第３のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ_ｂ−２−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｄ
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｄは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｂ単位と二量体化し、Ｖ_ａ−２及びＶ_ｂ−２は抗原結合ドメインを形成する。

【0157】

二量体Ｆｃドメインを有する、得られるヘテロ三量体のドメイン構成の一例（図２Ｄ及び２Ｅ中での形態５、６、７及び１６としても示される）を以下に示す。

【化11】

【0158】

そのため、本発明に係る三量体ポリペプチドでは、第１のポリペプチドは、別個のポリペプチド鎖上の可変ドメイン（即ち、第２及び第３の鎖の可変ドメイン）と抗原結合ドメインをそれぞれが形成する２つの可変ドメインを有することができ、第２のポリペプチド鎖は１つの可変ドメインを有し、且つ第３のポリペプチドは１つの可変ドメインを有する。

【0159】

本発明に係る三量体ポリペプチドは以下：
（ａ）Ｃ_Ｋ定常領域の第１のＣＨ１に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）、Ｃ_Ｋ定常領域の第２のＣＨ１に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）、並びに第１及び第２の可変ドメイン間に介在しているＦｃドメイン又はその一部を含む第１のポリペプチド鎖と、
（ｂ）第２のポリペプチド鎖であって、第１のポリペプチド鎖の第１のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域に相補的であるように選択されているＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域にＣ末端で融合された可変ドメインであり、それにより、第１及び第２のポリペプチドがＣＨ１−Ｃ_Ｋヘテロ二量体を形成する、可変ドメイン、並びにＦｃドメインを含む第２のポリペプチド鎖と、
（ｃ）ＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域に（例えば、Ｃ末端で）融合された可変ドメインを含む第３のポリペプチド鎖であって、この可変ドメイン及び定常領域は、第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメイン及び第２のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域に相補的であるように選択され、それにより、第１及び第３のポリペプチドは、非共有結合により及び任意選択によりさらに第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域と第１のポリペプチドの第１のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域との間ではなく、第３のポリペプチドのＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域と第１のポリペプチドの第２のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域との間に形成されたジスルフィド結合によって結合したＣＨ１−Ｃ_Ｋヘテロ二量体を形成する、第３のポリペプチド鎖と
をさらに含むことができ、第１、第２及び第３のポリペプチドがＣＨ１−Ｃ_Ｋヘテロ三量体を形成し、第１のポリペプチド鎖の第１の可変ドメインと第２のポリペプチド鎖の可変ドメインとが、第１の目的の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成し、且つ第１のポリペプチド鎖の第２の可変ドメインと第３のポリペプチド鎖上の可変ドメインとが、第２の目的の抗原に特異的な抗原結合ドメインを形成する。

【0160】

そのような三量体二重特異的ポリペプチドに関する潜在的なドメイン配置の他の例として、限定されるものではないが以下に示すものが挙げられる。

【0161】

【表2】

【0162】

さらなる例では、３つのＡＢＤ及び二量体Ｆｃでヘテロ三量体を構築することができる。ＡＢＤの１つはＮＫｐ４６に結合し、他の２つのＡＢＤは目的の抗原に結合することができ、これらの２つのＡＢＤが結合する目的の抗原は、同一の抗原でも異なる抗原でもあり得る。そのため、そのような実施形態の一態様では、多重特異的ポリペプチドは、（２つのＡＢＤによる）二価の様式で目的の抗原に結合することができる。

【0163】

例えば、第１のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域に融合された第１の可変ドメイン（Ｖ）と、第２のＣＨ１又はＣ_Ｋ定常領域に融合された第２の可変ドメイン（Ｖ）と、第１及び第２の可変ドメイン間に介在するＦｃドメイン又はその一部（即ち、このＦｃドメインは第１及び第２の（Ｖ−ＣＨ１／Ｃ_Ｋ）単位間に介在する）とを含む中心（第１の）ポリペプチド鎖を使用することにより、ヘテロ三量体タンパク質を形成することができる。例えば、ヘテロ三量体タンパク質で使用する中心ポリペプチド鎖は、以下のようなドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ_１−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ａ−Ｆｃドメイン−Ｖ_２−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｂ
を有することができる。

【0164】

次いで、第２のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ_１−（ＣＨ１若しくはＣ_Ｋ）_ｃ、又は
Ｖ_１−（ＣＨ１若しくはＣ_Ｋ）_ｃ−Ｆｃドメイン
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１若しくはＣ_Ｋ）_ｃは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ａと二量体化し、Ｖ_ａ１及びＶ_ｂ１は抗原結合ドメインを形成する。

【0165】

次いで、第３のポリペプチド鎖は、ドメイン配置（Ｎ末端からＣ末端へ）：
Ｖ_２−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｄ−ｓｃＦｖ
を含むことができ、それにより、（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｄは中心鎖上の（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）_ｂ単位と二量体化し、Ｖ_ａ２及びＶ_ｂ２は抗原結合ドメインを形成する。

【0166】

二量体Ｆｃドメインを有する、得られるヘテロ三量体の構成の一例（図２Ｆ中で形態Ｔ５及びＴ６としても示される）は、ドメイン配置：

【化12】

を有する。

【0167】

本明細書のポリペプチド鎖のいずれかでは、ヒンジ領域は、概して、ＣＨ１ドメインとＦｃドメインのＣＨ２ドメインとの間のポリペプチ上に存在し、及び／又はＣ_ＫドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在することができる。任意選択により、ヒンジ領域を例えば適切なリンカーペプチドで置き換えることができる。

【0168】

任意のドメイン配置では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２−ＣＨ３単位（完全長ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン又はその断片）を含み得る。Ｆｃドメイン（二量体Ｆｃドメイン）を有する２つの鎖を含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体では、ＣＨ３ドメインは、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が可能である（例えば、それは野生型ＣＨ３ドメインを含む）。

【0169】

一部の例示的な構成では、本多重特異的タンパク質はヘテロ二量体、ヘテロ三量体又はヘテロ四量体であることでき、ポリペプチド鎖は、所望のタンパク質を作製するために互いの中でヘテロ二量体化するように操作されている。所望の鎖の対形成がＣＨ１−Ｃ_Ｋ二量体化により駆動されない実施形態では、鎖は、２つの同一の鎖のホモ二量体化よりも２つの異なる鎖の優先的なヘテロ二量体化を好むアミノ酸改変（例えば、置換）を有する定常又はＦｃドメインを含むことができる。一部の実施形態では、「ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」アプローチが使用され、このアプローチでは、抗体Ｆｃ領域のＣＨ３ドメイン界面が、抗体がヘテロ二量体（付着した軽鎖をさらに含む）を優先的に形成するように変異される。これらの変異は、Ｆｃ二量体界面にわたる電荷極性の変化を生じさせ、従って、静電気的に一致したＦｃ鎖の同時発現が有利な引力相互作用を支援し、それにより、所望のＦｃヘテロ二量体の形成が促進され、不利な反発電荷相互作用が不所望のＦｃホモ二量体の形成を抑制する。例えば、１つの重鎖がＴ３６６Ｗ置換を含み、且つ第２の重鎖がＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含み、例えば、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられるＲｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９，ｐｐ．６１７−６２１；Ａｔｗｅｌｌ（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７０，ｐｐ．２６−３５；及び国際公開第２００９／０８９００４号パンフレットを参照されたい。別のアプローチでは、１つの重鎖がＦ４０５Ｌ置換を含み、且つ第２の重鎖がＫ４０９Ｒ置換を含み、例えばＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１１０，ｐｐ．５１４５−５１５０を参照されたい。別のアプローチでは、１つの重鎖がＴ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ及びＹ４０７Ｖ置換を含み、且つ第２の重鎖がＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｓ、Ｋ３９２Ｌ及びＴ３９４Ｗ置換を含み、例えばＶｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ｍＡｂｓ ５：６４６−６５４を参照されたい。別のアプローチでは、１つの重鎖がＫ４０９Ｄ及びＫ３９２Ｄ置換の両方を含み、且つ第２の重鎖がＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ置換の両方を含み、例えばＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５：１９６３７−１９６４６を参照されたい。別のアプローチでは、１つの重鎖がＤ２２１Ｅ、Ｐ２２８Ｅ及びＬ３６８Ｅ置換を含み、且つ第２の重鎖がＤ２２１Ｒ、Ｐ２２８Ｒ及びＫ４０９Ｒ置換を含み、例えばＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９を参照されたい。別のアプローチでは、１つの重鎖がＳ３６４Ｈ及びＦ４０５Ａ置換を含み、且つ第２の重鎖がＹ３４９Ｔ及びＴ３９４Ｆ置換を含み、例えばＭｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）ｍＡｂｓ ３：５４６−５５７を参照されたい。別のアプローチでは、１つの重鎖がＨ４３５Ｒ置換を含み、且つ第２の重鎖が任意選択により置換を含んでもよく又は含まなくてもよく、例えば米国特許第８，５８６，７１３号明細書を参照されたい。そのようなヘテロ多量体抗体が、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来するＦｃ領域を有する場合、この抗体のＦｃ領域を、ＣＤ１６結合を可能にするアミノ酸改変を含むように操作することができる。一部の実施形態では、この抗体は、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）で哺乳類抗体型のＮ連結グリコシル化を含むことができる。

【0170】

一部の実施形態では、本発明は、ＮＫｐ４６結合ＡＢＤと目的の抗原結合ＡＢＤとを含むヘテロ二量体又はヘテロ三量体タンパク質も含み、これらのＡＢＤの一方又は両方（例えば、可変領域又は他の抗原結合ドメイン、例えば非免疫グロブリン足場）が、リンカー（例えば、可撓性ポリペプチドリンカー）を介して定常領域（例えば、Ｆｃドメイン又はその一部）に連結されている。任意選択により、このＡＢＤは単一ポリペプチド鎖（例えば、直列型可変ドメイン、Ｖ_ＨＨ又は単一Ｖドメイン、非免疫グロブリン足場）上に配置されている。

【0171】

一部の実施形態では、ＡＢＤの一方又は両方が、互いに結合してＡＢＤを形成するＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインに含まれる。一実施形態では、ＡＢＤを形成するＶ_Ｈ及びＶ_Ｌはそれぞれ直列型可変領域内である（Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは可撓性ポリペプチドリンカーによって分離されている）。

【0172】

一部の実施形態では、ＡＢＤの１つは、可変ドメインがＣＨ１ドメインに連結されており且つ相補的な可変ドメインが相補的Ｃ_Ｋ（又はＣλ）定常ドメインに連結されているＦａｂ又はＦａｂ様構造に含まれており、ＣＨ１及びＣ_Ｋ（又はＣλ）定常ドメインによって結合される（二量体化される）。一部の実施形態では、ＡＢＤの１つは、そのようなＦａｂ又はＦａｂ様構造に含まれており、他のＡＢＤは単一ポリペプチド鎖（例えば、直列型可変ドメイン）上に配置されており、且つリンカー（例えば、可撓性ポリペプチドリンカー）を介して定常領域（例えば、Ｆｃドメイン又はその一部）に連結されている。

【0173】

一部の実施形態では、ＡＢＤの１つは、可変ドメインがＣＨ１ドメインに連結されており且つ相補的な可変ドメインが相補的Ｃ_Ｋ（又はＣλ）定常ドメインに連結されているＦａｂ又はＦａｂ様構造を含み、ＣＨ１及びＣ_Ｋ（又はＣλ）定常ドメインによって結合されてヘテロ二量体タンパク質を形成する。例えば、第１及び第２のＡＢＤは、有利には、異なる抗原結合特異性（例えば、ＶｈＨ_１及びＶｈＨ_２）を有する単一可変ドメイン（例えば、ＶｈＨドメイン）を含み得るか又はそれからなり得る。また、ＶｈＨ_１は、ＣＨ１ドメインに融合することができ、ＶｈＨ_２は、Ｃ_Ｋ又はＣλドメインに融合することができる。Ｖ_１−Ｃ_Ｋ（又はＣλ）鎖は、Ｆａｂが形成されるようにＶ_２−ＣＨ１鎖と結合する。Ｆｃドメインを欠いたこのような抗体の例を開示する、参照によりそのＰＣＴ出願の開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第２００６／０６４１３６号パンフレット及び同第２０１２／０８９８１４号パンフレットを参照されたい。次いで、ＣＨ１及び／又はＣ_Ｋドメインを、任意選択によりヒンジ領域（又はリンカーペプチド、例えば同様の機能的特性、例えば二量体化を有するもの）を介して、ＣＨ２ドメインに連結することができる。次いで、ＣＨ２ドメインがＣＨ３ドメインに連結される。従って、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、任意選択により完全長Ｆｃドメインとして実施することができる。

【0174】

本発明に係る任意の多重特異的タンパク質では、ヒンジ領域は、概して、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間のポリペプチド鎖上に存在し、及び／又はＣ_ＫドメインとＣＨ２ドメインとの間に存在することができる。任意選択により、ヒンジ領域を例えば適切なリンカーペプチド（例えば、可撓性ポリペプチド）で置き換えることができる。

【0175】

本開示で記載されるタンパク質ドメインは、任意選択により、Ｎ末端からＣ末端であると指定することができる。例示のための開示のタンパク質の配置は、Ｎ末端（左側）からＣ末端へと示されている。ドメインは、互いに融合されていると言える（例えば、ドメインは、その左側のドメインのＣ末端に融合されていると言え、且つ／又はドメインは、その右側のドメインのＮ末端に融合されていると言える）。

【0176】

本開示に記載されるタンパク質ドメインは、直接又は介在アミノ酸配列を介して互いに融合することができる。例えば、ＣＨ１又はＣ_Ｋドメインは、リンカーペプチド、任意選択によりヒンジ領域又はその断片を介してＦｃドメイン（又はそのＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン）に融合され得る。別の例では、Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｋドメインは、リンカーペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合され得る。直列型に互いに連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、リンカーペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）を介して融合され得、且つ一般的に融合される。Ｆｃドメインに連結されたＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは、リンカーペプチドを介して融合される。２つのポリペプチド鎖は、非共有結合によって互いに結合され（「｜」によって示される）、且つ任意選択により、相補的なＣＨ１及びＣ_Ｋドメイン内のシステイン残基間に形成される鎖間ジスルフィド結合を介してさらに結合され得る。

【0177】

リンカー
ＡＢＤ又はポリペプチド鎖が直列型可変領域（例えば、ｓｃＦｖ）を含む場合、２つのＶドメイン（例えば、Ｖ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメイン）は、概して、ＡＢＤが結合しようとする抗原への結合を可能にするようにＡＢＤが折り畳むのを可能にするのに十分な長さのリンカーにより互いに連結されている。同様に、ＡＢＤが定常ドメイン又はＦｃドメインに連結されている場合、この連結は、ＡＢＤがその標的抗原に結合して所望の機能を示すようにＡＢＤが配置されるのを可能にする可撓性リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）を介したものであり得、例えば、この連結は多重特異的タンパク質の残り（Ｆｃドメイン及び／又は他のＡＢＤ）と比べて十分な運動の範囲を有し、それによりＮＫｐ４６シグナル伝達を媒介する。リンカーの例として、例えば、抗体ヒンジ領域に由来するリンカー、アミノ配列ＲＴＶＡ、又はグリシン及びセリン残基を含むリンカー、例えばアミノ酸配列ＧＥＧＴＳＴＧＳ（Ｇ_２Ｓ）_２ＧＧＡＤが挙げられる。別の具体的な実施形態では、ｓｃＦｖのＶ_Ｈドメイン及びＶ_Ｌドメインは、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_３により互いに連結されている。

【0178】

主題の多重特異的タンパク質に含まれるペプチドリンカーのいずれかは、少なくとも４個の残基、少なくとも５個の残基、少なくとも１０個の残基、少なくとも１５個の残基、少なくとも２０個の残基、少なくとも２５個の残基、少なくとも３０個の残基又はより多くの長さを含むことができる。他の実施形態では、このリンカーは、２〜４個の残基、２〜４個の残基、２〜６個の残基、２〜８個の残基、２〜１０個の残基、２〜１２個の残基、２〜１４個の残基、２〜１６個の残基、２〜１８個の残基、２〜２０個の残基、２〜２２個の残基、２〜２４個の残基、２〜２６個の残基、２〜２８個の残基、２〜３０個の残基、２〜５０個の残基又は１０〜５０個の残基の長さを含む。

【0179】

ＡＢＤ（例えば、免疫グロブリン可変領域）は、従来の（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ）抗体と比較して（例えば、ＡＢＤとＦｃドメインとの間の又は中の）構造の剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）又は剛性（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を小さくする可撓性リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー）を介して定常ドメイン又はＦｃドメインに任意選択により連結され得る。例えば、多重特異的タンパク質は、従来の（例えば、野生型完全長ヒトＩｇＧ）抗体中のＡＢＤと比較してドメインの運動範囲の増加を可能にする、ＡＢＤと定常ドメイン又はＦｃドメインとの間の構造又は可撓性リンカーを有することができる。具体的には、この構造又は可撓性リンカーを、従来のヒトＩｇＧ１抗体中の抗原結合部位と比較してより大きい鎖内ドメイン運動を抗原結合部位に付与するように構成することができる。例えば、リンカー又はヒンジを含むタンパク質の旋回半径を測定するための又は比較するためのコンピュータモデリング、電子顕微鏡、核磁気共鳴（ＮＭＲ）等の分光法、Ｘ線結晶構造解析又は沈降速度分析超遠心分離（ＡＵＣ）により、剛性又はドメイン運動／鎖間ドメイン運動を決定することができる。試験タンパク質又はリンカーは、この試験タンパク質が比較器（例えば、ＩｇＧ１抗体又はヒンジ）の値と少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％異なる、先の文章で記載されている試験のいずれかから得られる値を有する場合、比較器タンパク質（ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）と比べて低い剛性を有することができる。当業者は、これらの試験の結果を解釈することにより、これらの試験から、試験タンパク質がそれぞれ別のタンパク質よりも低い剛性を有するどうかを決定することができるであろう。

【0180】

一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ＮＫｐ４６ ＡＢＤ及び目的の抗原に結合するＡＢＤが、約８０オングストローム未満、約６０オングストローム未満又は約４０〜６０オングストロームの範囲を含む前記ＡＢＤ間の間隔を有することを可能にする、ＡＢＤと定常ドメイン又はＦｃドメインとの間の構造又は可撓性リンカーを有することができる。

【0181】

一実施形態では、ヒンジ領域はヒンジ領域の断片（例えば、システイン残基を含まないトランケート型ヒンジ領域）であるか、又はヒンジ領域中のシステイン残基（任意選択により両方のシステイン残基）を除去する（例えば、別のアミノ酸で置換するか若しくは欠失させる）１つ以上のアミノ酸改変を含むことができる。システインの除去は、望ましくないジスルフィド結合形成（例えば、単量体ポリペプチド中でのジスルフィド架橋の形成）を予防するのに有用であり得る。

【0182】

一実施形態では、ＣＨ１又はＣＫドメインをＦｃドメインのＣＨ２又はＣＨ３ドメインに連結するために使用される（ポリ）ペプチドリンカーは、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域の断片を含む。例えば、ＣＨ１のＮ末端アミノ酸配列を可変ドメインに融合させて、野生型抗体の天然構造を可能な限り密接に模倣することができる。一実施形態では、このリンカーは、ヒンジドメイン又はＮ末端ＣＨ１アミノ酸由来のアミノ酸配列を含む。この配列は、例えば２〜４個の残基、２〜４個の残基、２〜６個の残基、２〜８個の残基、２〜１０個の残基、２〜１２個の残基、２〜１４個の残基、２〜１６個の残基、２〜１８個の残基、２〜２０個の残基、２〜２２個の残基、２〜２４個の残基、２〜２６個の残基、２〜２８個の残基又は２〜３０個の残基であり得る。一実施形態では、このリンカーはアミノ酸配列ＲＴＶＡを含むか、又はアミノ酸配列ＲＴＶＡからなる。

【0183】

一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジドメインに由来する。例えば、ヒンジドメインは、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、任意選択により、一方又は両方のシステインが欠失しているか、又は別のアミノ酸残基で置換されている。

【0184】

一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、ヒトＩｇＭ抗体のＣμ２−ＣＣμ３ヒンジドメインに由来する。例えば、ヒンジドメインは、アミノ酸配列：Ｎ−Ａ−Ｓ−Ｓ−Ｍ−Ｃ−Ｖ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％又は９０％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、任意選択により、一方又は両方のシステインが欠失しているか、又は別のアミノ酸残基で置換されている。

【0185】

非共有結合を介して互いに二量体化して結合するポリペプチド鎖は、これらの鎖上のそれぞれのＣＨ１及びＣκドメイン間並びに／又はそれぞれのヒンジドメイン間に形成された鎖間ジスルフィド結合によりさらに結合してもよく又は結合しなくてもよい。ＣＨ１、Ｃκ及び／若しくはヒンジドメイン（又は他の適切な連結アミノ酸配列）を、鎖の所望の対形成が好まれ且つ望ましくない又は不正確なジスルフィド結合形成が回避されるように鎖間ジスルフィド結合が鎖間で形成されるように、任意選択により構成することができる。例えば、対形成する２つのポリペプチド鎖がそれぞれヒンジドメインに隣接するＣＨ１又はＣκを有する場合、これらのポリペプチド鎖を、それぞれのＣＨ１／Ｃκ−ヒンジ断片間での鎖間ジスルフィド結合形成に利用可能なシステインの数が減少する（又は完全になくなる）ように構成することができる。例えば、それぞれのＣＨ１、Ｃκ及び／又はヒンジドメインのアミノ酸配列を改変して、ポリペプチドのＣＨ１／Ｃκ及びヒンジドメイン両方中のシステイン残基を除去することができ、それにより、二量体化する２つの鎖のＣＨ１及びＣκドメインは非共有的相互作用によって結合する。

【0186】

別の例では、ヒンジドメインに（例えば、Ｎ末端が）隣接するＣＨ１又はＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合形成が可能なシステインを含み、ＣＨ１又はＣκのＣ末端に配置されているヒンジドメインは、このヒンジの一方又は両方のシステイン（例えば、Ｋａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジに関して付番した場合にはＣｙｓ２３９及びＣｙｓ２４２）の欠失又は置換を含む。一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｓ−Ｐ−Ｐ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％若しくは９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0187】

別の例では、ヒンジドメインに（例えば、Ｎ末端が）隣接するＣＨ１又はＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合形成が可能なシステイン残基で欠失又は置換を含み、ＣＨ１又はＣκのＣ末端に配置されているヒンジドメインは、このヒンジの一方又は両方のシステイン（例えば、Ｋａｂａｔに従ってヒトＩｇＧ１ヒンジに関して付番した場合にはＣｙｓ２３９及びＣｙｓ２４２）を含む。一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％若しくは９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0188】

別の例では、ヒンジ領域はＩｇＭ抗体に由来する。そのような実施形態では、ＣＨ１／ＣＫの対形成は、ＩｇＭ抗体でのＣμ２ドメインホモ二量体化を模倣する。例えば、ヒンジドメインに（例えば、Ｎ末端が）隣接するＣＨ１又はＣκドメインは、鎖間ジスルフィド結合形成が可能なシステインで欠失又は置換を含み、ＣＨ１又はＣκのＣ末端に配置されているＩｇＭヒンジドメインは、このヒンジの一方又は両方のシステインを含む。一実施形態では、ヒンジ領域（又はその断片）は、アミノ酸配列：Ｔ−Ｈ−Ｔ−Ｃ−Ｓ−Ｓ−Ｃ−Ｐ−Ａ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｌ（一文字コード）又はこのアミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、８０％若しくは９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0189】

定常領域
定常領域ドメインは任意の適切なヒト抗体に由来することができ、定常重（ＣＨ１）及び軽（Ｃκ）ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインが挙げられる。重鎖定常ドメインに関して、「ＣＨ１」は、概して、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従うと１１８〜２２０位を指す。

【0190】

「ＣＨ２」は、概して、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従うと２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、概して、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従うと３４１〜４４７位を指す。

【0191】

「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」は本明細書において、抗体の第１及び第２の定常ドメイン間の可撓性ポリペプチド又はリンカーを指す。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵ２２０位で終端し、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインはＥＵ２３７位の残基で始まる。そのため、ＩｇＧの場合、ヒンジは、概して、２２１位（ＩｇＧ１中のＤ２２１）〜２３６位（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を含み、これらの付番は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う。ポリペプチド内で見られる定常領域ドメイン内の特定のアミノ酸残基への言及は、特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、ＩｇＧ抗体との関連で、Ｋａｂａｔに従って定義されるものとする。

【0192】

主題の抗体又は多重特異的タンパク質中に存在し得るＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、任意の適切な抗体に由来することができる。そのようなＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、野生型ドメインとして使用され得るか、又は改変されたＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインの基礎として機能する場合もある。任意選択により、ＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメインはヒト由来であるか、又は別の種（例えば、齧歯動物、ウサギ、非ヒト霊長類）のものを含むことができるか、又は改変された若しくはキメラのＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメイン（例えば、異なるＣＨ２若しくはＣＨ３ドメイン由来（例えば、異なる抗体アイソタイプ又は種抗体由来）の部分若しくは残基を含むもの）を含むことができる。

【0193】

多重特異的がヒトＣＤ１６ポリペプチドに結合することが意図されていない実施形態では、ＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメイン（又はそれらを含むＦｃドメイン）は、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６）への結合を減少又は消失させる改変を含むことができる。例えば、残基Ｎ２９７（Ｋａｂａｔ付番）での二量体Ｆｃドメインタンパク質中におけるＣＨ２変異は、ＣＤ１６結合を除去することができる。しかしながら、他の構成が実行され得ることを当業者は認識するであろう。例えば、２３３〜２３６位でのヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２残基への並びに３２７位、３３０位及び３３１位でのＩｇＧ４残基への置換は、Ｆｃγ受容体への結合の大きい減少を示し、その結果としてＡＤＣＣ及びＣＤＣの大きい減少を示した。さらに、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（８）：４１７８−８４は、Ｋ３２２等の様々な位置でのアラニン置換が補体活性化を著しく減少させることを実証した。

【0194】

ＣＤ１６Ａへの結合が所望されている本明細書の特定の実施形態では、ＣＨ２及び／若しくはＣＨ３ドメイン（又はそれらを含むＦｃドメイン）は、野生型ドメインであってもよく、又はヒトＣＤ１６及び任意選択によりＦｃＲｎ等の別の受容体への結合を増加させる１つ以上のアミノ酸改変（例えば、アミノ酸置換）を含んでもよい。任意選択により、この改変は、Ｆｃ由来ポリペプチドの新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）（例えば、ヒトＦｃＲｎ）に結合する能力を実質的に低下も消失もさせない。典型的な改変として、少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、置換、欠失、挿入）を含む改変ヒトＩｇＧ１由来定常領域及び／又は変更されたタイプのグリコシル化（例えば、低フコシル化）が挙げられる。そのような改変は、Ｆｃ受容体：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦＣγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）との相互作用に影響を及ぼすことができる。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２Ａ）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は活性化（即ち、免疫系増強）受容体であるが、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２Ｂ）は抑制（即ち、免疫系抑制）受容体である。改変は、例えば、エフェクター（例えば、ＮＫ）細胞上のＦｃγＩＩＩａへのＦｃドメインの結合を増加させることができ、及び／又はＦｃγＲＩＩＢへの結合を減少させることができる。改変の例は、参照によりその開示内容が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公報国際公開第２０１４／０４４６８６号パンフレットに記載されている。ＦｃγＲＩＩＩａ又はＦｃＲｎ結合性に影響を及ぼす（増強する）特定の変異（ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン中）も以下に記載する。

【0195】

【表3】

【0196】

一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は変異型Ｆｃ領域を含み、このＦｃ領域は、そのＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメイン中に少なくとも１つのアミノ酸改変を含み（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変を有し）、この改変はヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合を増強する。他の実施形態では、多重特異的タンパク質は、アミノ酸２３７〜３４１からのＦｃ領域のＣＨ２ドメイン中に又は残基２３１〜３４１を含む下位のヒンジ−ＣＨ２領域内で少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含む。一部の実施形態では、多重特異的タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸改変（例えば、２つ、３、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含み、そのよう改変の少なくとも１つはＣＨ３領域内であり、且つ少なくとも１つのそのような改変はＣＨ２領域内である。また、ヒンジ領域中のアミノ酸改変も包含される。一実施形態では、ＣＨ１ドメイン中の、任意選択により残基２１６〜２３０（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）を含む上位のヒンジ領域中のアミノ酸改変も包含される。Ｆｃ改変の適切に機能するあらゆる組み合わせを行うことができ、例えば、様々なＦｃ改変の任意の組み合わせが以下のいずれかで開示されている：米国特許第７，６３２，４９７号明細書；同第７，５２１，５４２号明細書；同第７，４２５，６１９号明細書；同第７，４１６，７２７号明細書；同第７，３７１，８２６号明細書；同第７，３５５，００８号明細書；同第７，３３５，７４２号明細書；同第７，３３２，５８１号明細書；同第７，１８３，３８７号明細書；同第７，１２２，６３７号明細書；同第６，８２１，５０５号明細書及び同第６，７３７，０５６号明細書；並びに／又はＰＣＴ公報国際公開第２０１１／１０９４００号パンフレット；同第２００８／１０５８８６号パンフレット；同第２００８／００２９３３号パンフレット；同第２００７／０２１８４１号パンフレット；同第２００７／１０６７０７号パンフレット；同第０６／０８８４９４号パンフレット；同第０５／１１５４５２号パンフレット；同第０５／１１０４７４号パンフレット；同第０４／１０３２２６９号パンフレット；同第００／４２０７２号パンフレット；同第０６／０８８４９４号パンフレット；同第０７／０２４２４９号パンフレット；同第０５／０４７３２７号パンフレット；同第０４／０９９２４９号パンフレット及び同第０４／０６３３５１号パンフレット；並びに／又はＬａｚａｒ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３（１１）：４０５−４１０；Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３０（４）：４８７−４９０；Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６；２７７（３０）：２６７３３−２６７４０及びＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６６０４）。

【0197】

一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、それにより、この分子は、野生型Ｆｃ領域を含む同一分子と比較してヒトＣＤ１６に対する結合親和性が増強されており、任意選択により、この変異型Ｆｃ領域は、２２１位、２３９位、２４３位、２４７位、２５５位、２５６位、２５８位、２６７位、２６８位、２６９位、２７０位、２７２位、２７６位、２７８位、２８０位、２８３位、２８５位、２８６位、２８９位、２９０位、２９２位、２９３位、２９４位、２９５位、２９６位、２９８位、３００位、３０１位、３０３位、３０５位、３０７位、３０８位、３０９位、３１０位、３１１位、３１２位、３１６位、３２０位、３２２位、３２６位、３２９位、３３０位、３３２位、３３１位、３３２位、３３３位、３３４位、３３５位、３３７位、３３８位、３３９位、３４０位、３５９位、３６０位、３７０位、３７３位、３７６位、３７８位、３９２位、３９６位、３９９位、４０２位、４０４位、４１６位、４１９位、４２１位、４３０位、４３４位、４３５位、４３７位、４３８位及び／又は４３９位（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）の任意の１つ以上において置換を含む。

【0198】

一実施形態では、本多重特異的タンパク質は、野生型Ｆｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ又はより多くのアミノ酸改変）を含むＦｃドメインを含み、それにより、この分子は、野生型Ｆｃ領域を含む分子と比較してヒトＣＤ１６に対する結合親和性が増強されており、任意選択により、変異型Ｆｃ領域は、２３９位、２９８位、３３０位、３３２位、３３３位及び／又は３３４位の任意の１つ以上で置換（例えば、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ及び／又はＫ３３４Ａ置換）を含み、任意選択により、変異型Ｆｃ領域は残基Ｓ２３９及びＩ３３２で置換を含み、例えばＳ２３９Ｄ及びＩ３３２Ｅ置換（Ｋａｂａｔ ＥＵ付番）を含む。

【0199】

一部の実施形態では、本多重特異的タンパク質は、ヒトＣＤ１６に対する結合親和性が増加している変更されたグリコシル化パターンを含むＦｃドメインを含む。そのような炭水化物改変を、例えば、変更されたグリコシル化装置を有する宿主細胞中において多重特異的タンパク質をコードする核酸を発現させることにより達成することができる。変更されたグリコシル化装置を有する細胞は当技術分野で既知であり、組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用され得る。例えば、それぞれ参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられるＳｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１、並びに欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；ＰＣＴ公報国際公開第０６／１３３１４８号パンフレット；同第０３／０３５８３５号パンフレット；同第９９／５４３４２号パンフレットを参照されたい。一態様では、多重特異的タンパク質は１つ以上の低フコシル化定常領域を含む。そのような多重特異的タンパク質は、アミノ酸変更を含んでもよく若しくはアミノ酸変更を含まなくてもよく、又は低フコシル化が得られる条件下で発現、合成若しくは処理されてよい。一態様では、多重特異的タンパク質組成物は本明細書で説明されている多重特異的タンパク質を含み、この組成物中の抗体種の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７５、８５、９０、９５％又は実質的に全てが、フコースを欠いているコア炭水化物構造（例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造）を含む定常領域を有する。一実施形態では、フコースを有するコア炭水化物構造を含むＮ連結グリカンを含まない多重特異的タンパク質組成物が提供される。このコア炭水化物は、好ましくはＡｓｎ２９７での糖鎖である。

【0200】

任意選択により、二量体Ｆｃドメインを含む多重特異的タンパク質は、例えば表面プラズモン共鳴によって評価された場合に、従来のヒトＩｇＧ１抗体のヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性の１−ｌｏｇ内であるヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性を有することによって特徴付けられ得る。

【0201】

一実施形態では、Ｆｃ受容体結合を増強するように操作された二量体Ｆｃドメインを含む多重特異的タンパク質は、例えば表面プラズモン共鳴によって評価された場合に、従来又は野生型のヒトＩｇＧ１抗体のヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性と比べて少なくとも１−ｌｏｇ大きいＣＤ１６ポリペプチドへの結合親和性を有することによって特徴付けられ得る。

【0202】

任意選択により、二量体Ｆｃドメインを含む二重特異的タンパク質は、（例えば、実施例１６、Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上に固定された二重特異的抗体、及びこの固定された二重特異的抗体全体に注入された可溶性ＣＤ１６ポリペプチドの連続希釈物によりＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施したＳＰＲ測定のように）表面プラズモン共鳴によって評価された場合に、ヒトＣＤ１６ポリペプチドへの結合（一価）に関するＫｄが１０^−５Ｍ（１０μモル濃度）未満、任意選択により１０^−６Ｍ（１μモル濃度）未満であることによって特徴付けられ得る。

【0203】

ＣＤＲ配列及びエピトープ
一部の実施形態では、本明細書のタンパク質及び抗体は、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのＮＫｐ４６のＤ１ドメイン、ＮＫｐ４６のＤ２ドメイン、又は（Ｄ１とＤ２ドメインの境界、Ｄ１／Ｄ２接合部において）Ｄ１及びＤ２ドメインに跨る領域に結合する。一部の実施形態では、本発明による多重特異的タンパク質又は抗体は、１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、又は１０^−１０Ｍ未満のＫ_Ｄによって特徴付けられるヒトＮＫｐ４６に対する親和性を有する。

【0204】

別の実施形態では、本発明の抗体又は多重特異的タンパク質は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９と実質的に同じＮＫｐ４６上のエピトープでＮＫｐ４６に結合する。別の実施形態では、この抗体は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９によって結合されたセグメント又はエピトープの少なくとも１つの残基と少なくとも部分的に重複するか、又はこの少なくとも１つの残基を含む。一実施形態では、エピトープの全ての重要な残基は、ドメインＤ１又はＤ２に対応するセグメント内にある。一実施形態では、この抗体又は多重特異的タンパク質は、Ｄ１ドメイン内に存在する残基及びＤ２ドメイン内に存在する残基に結合する。一実施形態では、抗体は、配列番号１のＮＫｐ４６ポリペプチドのドメインＤ１又はＤ２に対応するセグメント内の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、又は７つ以上の残基を含むエピトープに結合する。一実施形態では、抗体は、ドメインＤ１に結合し、且つ残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５の１つ、２つ、３つ、又は４つを含むエピトープにさらに結合する。

【0205】

別の実施形態では、抗体又は多重特異的タンパク質は、Ｄ１／Ｄ２ドメイン接合部においてＮｋｐ４６に結合し、且つ残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１、及び／又はＹ１９４の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つを含むか又はそれからなるエピトープに結合する。

【0206】

別の実施形態では、抗体又は多重特異的タンパク質は、ドメインＤ２に結合し、且つ残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５、及び／又はＳ１３６の１つ、２つ、３つ、又は４つを含むエピトープに結合する。

【0207】

以下に提供される実施例のセクションに、一連の変異ヒトＮＫｐ４６ポリペプチドの構築が記載される。実施例では、ＮＫｐ４６変異体でトランスフェクトされた細胞への抗ＮＫｐ４６抗体又は多重特異的タンパク質の結合を測定し、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（配列番号１）に結合する抗ＮＫｐ４６抗体の能力と比較した。本明細書で記載される抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合の低下は、抗ＮＫｐ４６抗体の結合親和性の低下（例えば、公知の方法、例えば、特定の変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験により、又は変異ポリペプチドへの結合性のＢｉａｃｏｒｅ試験により測定される）、及び／又は抗ＮＫｐ４６抗体の総結合能の低下（例えば、抗ＮＫｐ４６抗体濃度のポリペプチド濃度に対するプロットにおけるＢｍａｘの減少によって裏付けられる）が存在することを意味する。結合性の著しい低下は、変異残基がＮＫｐ４６への抗ＮＫｐ４６抗体に対する結合性に直接関与しているか、又は抗ＮＫｐ４６抗体若しくはＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質がＮＫｐ４６に結合するときに結合タンパク質に非常に近接していることを示唆する。従って、抗体エピトープは、好ましくはこのような残基を含み、且つこのような残基に隣接した追加の残基を含み得る。

【0208】

一部の実施形態では、結合性の著しい低下は、抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質と変異ＮＫｐ４６ポリペプチドとの間の結合親和性及び／又は結合能が、この抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１に示されているポリペプチド）との間の結合性に対して、４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超低下していることを意味する。特定の実施形態では、結合性は、検出限界未満に低下する。一部の実施形態では、結合性の著しい低下は、抗ＮＫｐ４６抗体の変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する結合性が、抗ＮＫｐ４６抗体と野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１に示されているポリペプチド（又はその細胞外ドメイン））との間で観察される結合性の５０％未満（例えば、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、又は１０％未満）であるときに立証される。このような結合性の測定は、当技術分野で公知の様々な結合アッセイを用いて行うことができる。１つのこのようなアッセイの特定の例が、実施例のセクションに記載される。

【0209】

一部の実施形態では、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチド（例えば、配列番号１）の残基が置換されている変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対する著しい結合性の低下を示す抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質が提供される。本明細書で使用される略語では、その形式は、配列番号１に示されている残基の番号が付された野生型残基：ポリペプチドの位置：変異残基である。

【0210】

一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体は、野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６に対する結合性と比較して、（配列番号１における）残基Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４、及び／又はＬ１０５のいずれか１つ以上に変異（例えば、アラニン置換）を有する変異ＮＫｐ４６ポリペプチドに対して低い結合性を有する。

【0211】

一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質は野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６への結合と比較して（配列番号１に関して）残基Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１及び／又はＹ１９４の１つ以上において変異（例えば、アラニン置換）を有する変異型ＮＫｐ４６ポリペプチドへの結合が減少している）。

【0212】

一部の実施形態では、抗ＮＫｐ４６抗体又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質は野生型ＮＫｐ４６ポリペプチドに結合するが、野生型ＮＫｐ４６への結合と比較して（配列番号１に関して）残基Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５及び／又はＳ１３６の１つ以上において変異（例えば、アラニン置換）を有する変異型ＮＫｐ４６ポリペプチドへの結合が減少している）。

【0213】

抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ本明細書の表Ｂに列記され（配列番号：３、５、７、９、１１、及び１３）、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域のアミノ酸配列もそれぞれ本明細書の表Ｂに列記されている（配列番号：４、６、８、１０、１２、及び１４）。

【0214】

特定の一実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９と本質的に同じエピトープ又は決定基に結合する、二重特異的単量体ポリペプチドを含む抗体、例えば、完全長単一特異的抗体、多重特異的又は二重特異的抗体、又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質を提供し、任意選択により、この抗体は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の超可変領域を含む。本明細書の任意の実施形態では、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９は、そのアミノ酸配列及び／又はそれをコードする核酸配列によって特徴付けることができる。一実施形態では、この抗体は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９のＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２部分を含む。また、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域を含む抗体も提供される。一実施形態によると、抗体は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む。また、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域のＣＤＲの１つ、２つ、又は３つをさらに含むポリペプチドも提供される。任意選択により、前記軽鎖又は重鎖ＣＤＲのいずれか１つ以上は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ以上のアミノ酸改変（例えば、置換、挿入、若しくは欠失）を含み得る。任意選択により、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、若しくはＮＫｐ４６−９の抗原結合領域の一部若しくは全てを含む軽鎖及び／又は重鎖可変領域のいずれかがヒトＩｇＧ型の免疫グロブリン定常領域に融合された多重特異的タンパク質又は抗体ポリペプチドが提供される。

【0215】

別の態様では、本発明は、タンパク質、例えば、抗体、完全長単一特異的抗体、多重特異的若しくは二重特異的タンパク質、又はポリペプチド鎖若しくはその断片、又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質、並びにこれらのいずれかをコードする核酸を提供し、このタンパク質は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖ＣＤＲを含み、それぞれの抗体が、表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＨＣＤＲ１領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＨＣＤＲ２領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＨＣＤＲ３領域を含む。

【0216】

別の態様では、本発明は、タンパク質、例えば、抗体、完全長単一特異的抗体、多重特異的若しくは二重特異的タンパク質、又はポリペプチド鎖若しくはその断片、又はＮＫｐ４６結合多重特異的タンパク質、並びにこれらのいずれかをコードする核酸を提供し、このタンパク質は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の軽鎖ＣＤＲを含み、それぞれの抗体が、表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＬＣＤＲ１領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって置換することができる、ＬＣＤＲ２領域；表Ａに示されているアミノ酸配列、又は少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ３領域であって、これらのアミノ酸の１つ以上を異なるアミノ酸によって欠失させるか又は置換することができる、ＬＣＤＲ３領域を含む。

【0217】

別の態様では、本発明は、ヒトＮＫｐ４６に結合する多重特異的タンパク質又は抗体を提供し、このタンパク質は、
（ａ）任意選択により１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域、
（ｂ）任意選択により１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の軽鎖可変領域、
（ｃ）任意選択により１つ以上のこれらのアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖可変領域、及び任意選択により１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ｂに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９のそれぞれの軽鎖可変領域、
（ｄ）任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２）アミノ酸配列、
（ｅ）任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列、又は
（ｆ）任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９の重鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）アミノ酸配列、並びに任意選択によりＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸によって置換することができる、表Ａに示されているそれぞれのＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、又はＮＫｐ４６−９抗体の軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）アミノ酸配列
を含む。

【0218】

一実施形態では、上述のＣＤＲは、例えば、表１に示されているようにＫａｂａｔに従っている。一実施形態では、上述のＣＤＲは、例えば、表Ａに示されているようにＣｈｏｔｈｉａ付番に従っている。一実施形態では、上述のＣＤＲは、例えば、表Ａに示されているようにＩＭＧＴ付番に従っている。

【0219】

本明細書の任意の実施形態の別の態様では、重鎖及び軽鎖の任意のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、少なくとも４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、若しくは１０の連続したそのアミノ酸配列により、並びに／又は対応する配列番号若しくは表Ａに列記されている特定のＣＤＲ若しくは一連のＣＤＲと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を有することにより特徴付けることができる。

【0220】

別の態様では、本発明は、ＮＫｐ４６の結合について、上述の（ａ）〜（ｆ）によるモノクローナル抗体と競合する抗体を提供する。

【0221】

別の態様では、本発明は、上述の（ａ）〜（ｆ）によるヒトＮＫｐ４６に結合する抗体、又はこのような抗体のいずれかとＮＫｐ４６の結合について競合する、単量体Ｆｃドメインに（任意選択により、介在アミノ酸配列によって）融合され、任意選択により第２の抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、Ｖ_Ｈドメイン、Ｖ_Ｌドメイン、ｄＡｂ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、若しくはＶ_ＨＨドメイン）にさらに（任意選択により、介在アミノ酸配列によって）融合された抗体を含む二重特異的抗体を提供する。任意選択により、第２の抗原結合ドメインは、癌抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、又は細菌抗原に結合する。

【0222】

ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、及びＣｈｏｔｈｉａ定義方式に従ったＣＤＲの配列が以下の表Ａに要約される。本発明による抗体の可変鎖の配列は、以下の表Ｂに列記されている。本明細書の任意の実施形態では、ＶＬ又はＶＨ配列は、シグナルペプチド若しくはその任意の部分を含むか又は含まないように指定又は付番することができる。

【0223】

【表4】

【0224】

【表5】

【0225】

【表6】

【0226】

【表7】

【0227】

また、本明細書の実施例に記載されるように、単量体二重特異的ポリペプチドのアミノ酸配列を含む多重特異的タンパク質又は抗体が提供され、このタンパク質又は抗体は、抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−６、及びＮＫｐ４６−９の配列番号３〜１４として列記されているそれぞれに重鎖及び軽鎖可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３を含むｓｃＦｖ、単量体Ｆｃドメイン、並びに抗ＣＤ１９抗体、例えば、本明細書の実施例のセクションに記載される抗ＣＤ１９の任意のものの重鎖及び軽鎖可変領域の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ１、２、及び３を含むｓｃＦｖをそれぞれ含む。

【0228】

多重特異的タンパク質を作製すると、このタンパク質を生物学的活性に関して評価することができ、例えば、抗原結合、標的細胞溶解を誘発する能力及び／又はそれにより誘発される特異的シグナル伝達活性に関して評価することができる。

【0229】

本明細書で説明されている任意の実施形態の一態様では、本発明の多重特異的タンパク質は、このタンパク質をＮＫｐ４６発現細胞（例えば、精製されたＮＫ細胞）及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）の活性化を誘導することができる）。

【0230】

本明細書で説明されている任意の実施形態の一態様では、本発明の多重特異的タンパク質は、このタンパク質を、任意選択により標的細胞の非存在下において、ＮＫｐ４６及び／又はＣＤ１６発現細胞（例えば、精製されたＮＫ細胞）の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６及び／又はＣＤ１６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）の細胞表面上に存在するＣＤ１３７の増加を誘導することができる。

【0231】

本明細書で説明されている任意の実施形態の一態様では、本発明の多重特異的タンパク質は、このタンパク質をＮＫｐ４６発現細胞（例えば、精製されたＮＫ細胞）及び目的の抗原を発現する標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＮＫｐ４６発現細胞（例えば、ＮＫ細胞、レポーター細胞）中でＮＫｐ４６シグナル伝達を誘導することができる）。

【0232】

任意選択により、ＮＫ細胞の活性化又はシグナル伝達は、活性化の細胞表面マーカー、例えば、ＣＤ１０７、ＣＤ６９、Ｓｃａ−１又はＬｙ−６Ａ／Ｅ、ＫＬＲＧ１などの発現の増加によって特徴付けられる。

【0233】

活性は、例えば、多重特異的ポリペプチドの存在下で、標的細胞とＮＫｐ４６発現細胞とを互いに接触させることによって測定することができる。一例では、標的細胞とＮＫ細胞との凝集が測定される。別の例では、多重特異的タンパク質は、例えば、ＮＫ細胞の活性に関連した当技術分野で公知の任意の特性又は活性、例えば、細胞毒性のマーカー（ＣＤ１０７）又はサイトカインの産生（例えば、ＩＦＮ−γ若しくはＴＮＦ−α）の測定可能な増加をもたらす能力、細胞内遊離カルシウムレベルの増加、リダイレクト殺傷アッセイ（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ａｓｓａｙ）において標的細胞を溶解する能力などについて評価することができる。

【0234】

標的細胞（目的の抗原を発現する標的細胞）及びＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞の存在下で、多重特異的タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＮＫ細胞の活性に関連した特性又は活性（例えば、ＮＫ細胞の細胞毒性の活性化、ＣＤ１０７の発現、ＩＦＮγの産生）の増加を引き起こすことができる。例えば、本発明による多重特異的タンパク質は、多重特異的タンパク質に接触されない同じＮＫ細胞と標的細胞を用いて同じエフェクター：標的細胞比で達成されるＮＫ細胞の活性と比較して、約２０％超、好ましくは少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又はそれを超えるＮＫ細胞の活性を増加させるその能力に基づいて選択することができ、このＮＫ細胞の活性は、ＮＫ細胞の活性を検出するアッセイ、例えば、ＮＫ活性化マーカーの発現を検出するか、又はＮＫ細胞傷害性を検出するアッセイ、例えば、ＣＤ１０７又はＣＤ６９の発現を検出するアッセイ、ＩＦＮγの産生、又は従来のｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性のクロム放出試験によって測定される。ＮＫ細胞活性化を検出するためのプロトコル及び細胞毒性アッセイの例は、本明細書の実施例のセクション、及び例えばＰｅｓｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９８，１８８（５）：９５３−９６０；Ｓｉｖｏｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６５６−１６６６；Ｂｒａｎｄｏ ｅｔ ａｌ，（２００５）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７８：３５９−３７１；Ｅｌ−Ｓｈｅｒｂｉｎｙ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（１８）：８４４４−９；ａｎｄ Ｎｏｌｔｅ−’ｔ Ｈｏｅｎ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｂｌｏｏｄ １０９：６７０−６７３）に記載されている。任意選択により、本発明に係る多重特異的タンパク質は、ＮＫ細胞活性のアッセイ（例えば、目的の抗原を発現する標的細胞のＮＫ細胞に媒介される溶解を検出するアッセイ）によって測定された場合に、同一の目的の抗原に結合する従来のヒトＩｇＧ１抗体と比較して標的細胞へと（即ち標的細胞の溶解へと）ＮＫ細胞活性を誘導する能力が高いというその能力のために選択され得るか、又はその能力によって特徴付けられ得る。

【0235】

本明細書で示すように、ＣＤ１６に結合しないＦｃドメインを有する本発明に係る多重特異的タンパク質は、（例えば、目的の抗原及び／又は標的抗原の非存在下で）このタンパク質が標的細胞上の目的の抗原に結合しない場合、ＮＫ細胞のＮＫｐ４６シグナル伝達（及び／又はこのシグナル伝達により生じるＮＫ活性化）を実質的に誘導しない。そのため、多重特異的タンパク質の一価ＮＫｐ４６結合成分はそれ自体、ＮＫｐ４６シグナル伝達を引き起こさない。従って、ＣＤ１６に結合するＦｃドメインを有する多重特異的タンパク質の場合、ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞により、この多重特異的タンパク質のＮＫｐ４６発現への効果を試験することにより、そのような多重特異的タンパク質を、ＮＫｐ４６シグナル伝達又はＮＫｐ４６に媒介されるＮＫ細胞活性化を誘発する能力に関して評価することができる。任意選択により、多重特異的タンパク質を、この多重特異的タンパク質を標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６発現ＣＤ１６陰性細胞（例えば、精製されたＮＫ細胞又は精製されたレポーター細胞）と共にインキュベートされた場合に、そのようなＮＫｐ４６発現ＣＤ１６陰性細胞（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６⁻ＮＫ細胞、レポーター細胞）によるＮＫｐ４６シグナル伝達を実質的に引き起こさない（又は増加しない）と特徴付けることができる。

【0236】

本明細書の任意の実施形態の一態様では、ＣＤ１６に結合する本明細書で説明されている多重特異的タンパク質は、例えば以下によって特徴付けられ得る：
（ａ）ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合に、ＣＤ１６及びＮＫｐ４６を発現するＮＫ細胞を誘導して標的細胞を溶解させることができ、及び
（ｂ）標的細胞の非存在下でＣＤ１６陰性ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ１６を発現しないＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞）と共にインキュベートされた場合のＮＫｐ４６でのアゴニスト活性の欠如。任意選択により、このＮＫ細胞は精製されたＮＫ細胞である。

【0237】

本明細書の任意の実施形態の一態様では、本明細書で説明されている多重特異的タンパク質は、例えば以下によって特徴付けられ得る：
（ａ）ＮＫｐ４６発現ＮＫ細胞及び標的細胞の存在下でインキュベートされた場合のＮＫｐ４６でのアゴニスト活性、及び
（ｂ）標的細胞の非存在下での、（例えば、ＣＤ１６陰性ＮＫ細胞（例えば、ＣＤ１６−ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞）と共にインキュベートされた場合又はＮＫ細胞と共にインキュベートされた場合の、及びこのタンパク質中に（例えば、改変により）ＣＤ１６への結合を欠くＦｃドメインを含む場合の）ＮＫｐ４６でのアゴニスト活性の欠如。任意選択により、このＮＫ細胞は精製されたＮＫ細胞である。

【0238】

化合物の使用
一態様では、疾患の処置、予防又は診断を、それを必要とする哺乳動物において行うための医薬製剤の製造のための、本明細書で定義されている化合物（具体的には、本発明の多重特異的タンパク質若しくは抗体及び／又はそれらを発現する細胞）のいずれかの使用が提供される。また、薬剤としての又は薬剤中の活性成分若しくは活性物質としての、上記で定義されている化合物のいずれかの使用も提供される。さらなる態様では、本発明は、経口投与、局所投与、又は注射による投与のための固体又は液体製剤を生成するために本明細書で定義されている化合物を含む医薬組成物を調製する方法を提供する。そのような方法又はプロセスは、この化合物と薬学的に許容され得る担体とを混合するステップを少なくとも含む。

【0239】

一態様では、本明細書で説明されている多重特異的タンパク質若しくは抗体又はそれを含む（医薬）組成物を使用することにより、又は投与することにより、個体における所定の状態を処置する方法、予防する方法若しくはより一般的にはこの状態に影響を及ぼす方法、又は特定の状態を検出する方法が提供される。

【0240】

例えば、一態様では、本発明は、ＮＫｐ４６^＋ＮＫ細胞（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）の活性の回復又は増強を、それを必要とする患者（例えば、癌又はウイルス若しくは細菌の感染を有する患者）において行う方法であって、前記患者に本明細書で説明されている多重特異的タンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、この方法は、リンパ球（例えば、ＮＫ細胞）活性の増加が有益である疾患又は不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるか、若しくはこの活性によって特徴付けられる疾患を有する患者において、例えば、癌又はウイルス若しくは微生物／細菌の感染を有する患者において、ＮＫｐ４６^＋リンパ球（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）の活性を増加させることに向けられる。

【0241】

別の態様では、本発明は、ＮＫｐ４６^＋ＮＫ細胞（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）の活性の回復又は増強を、それを必要とする患者（例えば、癌又はウイルス、寄生虫若しくは細菌の感染を有する患者）において行う方法であって、患者由来の細胞（例えば、免疫細胞、及び任意選択により目的の抗原を発現する標的細胞）を本発明に係る多重特異的タンパク質と接触させるステップ、及びこの多重特異的タンパク質で処置した細胞を患者に再注入するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、この方法は、リンパ球（例えば、ＮＫ細胞）活性の増加が有益である疾患又は不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるか、若しくはこの活性によって特徴付けられる疾患を有する患者において、例えば、癌又はウイルス若しくは微生物（例えば、細菌）若しくは寄生虫の感染を有する患者において、ＮＫｐ４６^＋リンパ球（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）の活性を増加させることに向けられる。

【0242】

別の実施形態では、主題の多重特異的タンパク質を、処置する患者由来の又は別のドナー由来の免疫細胞（特にＮＫ細胞）、及びそれを必要とする患者（例えば、リンパ球（例えば、ＮＫ細胞）活性の増加が有益である疾患又は不十分なＮＫ細胞活性により引き起こされるか、若しくはこの活性によって特徴付けられる疾患を有する患者、例えば、癌又はウイルス若しくは微生物（例えば、細菌）若しくは寄生虫の感染を有する患者）に投与されるこのＮＫ細胞と組み合わせて使用又は投与してよい。ＮＫ細胞は（ＣＡＲ−Ｔ細胞と異なり）ＴＣＲを発現しないことから、このＮＫ細胞は、たとえ別のドナー由来のものであってもＧＶＨＤ反応を誘導しない（例えば、Ｇｌｉｅｎｋｅ ｅｔ ａｌ．，“Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＡＲ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ”，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６，Ａｒｔ．２１：１−６（２０１５）；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，Ａｒｔ．１９５：１−６（２０１５）を参照されたい）。

【0243】

一実施形態では、エフェクター細胞（ＮＫｐ４６、ＣＤ１６及びＣＤ１３７等）の複数の活性化受容体を介してＮＫ細胞活性化及び／又は標的細胞溶解を媒介する本明細書で開示されている多重特異的タンパク質を、エフェクター細胞（例えば、ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６^＋ＮＫ細胞）が低活性であるか、消尽されているか、又は抑制されている個体（例えば、１つ又は複数の抑制受容体（例えば、ＴＩＭ−３、ＰＤ１、ＣＤ９６、ＴＩＧＩＴ等）の発現及び／又は上方制御によって特徴付けられるエフェクター細胞の顕著な集団を有する患者）の処置に有利に使用することができる。

【0244】

本明細書に記載の多重特異的ポリペプチドを使用して、抗体で処置することができる障害、例えば、癌、固形及び非固形腫瘍、血液悪性腫瘍、感染、例えば、ウイルス感染、及び免疫又は自己免疫疾患を予防又は処置することができる。

【0245】

一実施形態では、目的の抗原（非ＮＫｐ４６抗原）は、以下からなる群から選択される癌のタイプの悪性細胞の表面で発現される抗原である：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）。

【0246】

一実施形態では、本明細書に記載の本発明の多重特異的ポリペプチドを使用して、以下からなる群から選択される癌を予防又は処置することができる：膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、頸癌、甲状腺癌、及び扁平上皮癌を含む皮膚癌を含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、及びバーケッツリンパ腫を含むリンパ系統の造血腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉系起源の腫瘍；神経芽腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を含む横紋筋起源の腫瘍；並びに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、濾胞性甲状腺癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍。本発明によって処置することができる他の例示的な障害としては、リンパ系統の造血腫瘍、例えば、限定されるものではないが、小細胞及び大脳細胞型を含むＴ細胞障害、例えば、Ｔ前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）を含むＴ細胞及びＢ細胞腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒性リンパ球性白血病（ＬＧＬ）；セザリー症候群（ＳＳ）；成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）；ａ／ｄ Ｔ−ＮＨＬ肝脾臓リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫（多形性及び免疫芽球性亜型）；血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫；血管中心（鼻）Ｔ細胞リンパ腫；未分化（Ｋｉ １＋）大細胞リンパ腫；腸管Ｔ細胞リンパ腫；Ｔリンパ芽球；並びにリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）が挙げられる。

【0247】

一例では、腫瘍抗原は、リンパ腫細胞又は白血病細胞の表面で発現される抗原であり、多重特異的タンパク質は、リンパ腫又は白血病を有する個人に投与され、且つ／又はこの個人の処置に使用される。任意選択により、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、又はＣＤ３３から選択される。

【0248】

一態様では、処置の方法は、例えば本明細書で開示されている疾患（例えば、上記で同定されている癌のいずれか）の処置のために、治療有効量において本明細書で説明されている多重特異的タンパク質を個体に投与するステップを含む。治療有効量は、疾患又は障害を有する患者に治療効果を有する（又は疾患若しくは障害を有する患者及び患者と実質的に同様の特徴を有する患者の少なくとも相当数でこのような効果を促進、増強及び／又は誘導する）任意の量であり得る。

【0249】

一実施形態では、本発明に係る多重特異的タンパク質を使用して、ＣＤ１３７活性化に応答する癌（例えば、固形腫瘍又は血液癌、例えば、限定されるものではないが乳癌、肉腫、神経膠腫、結腸癌、骨髄腫、マスト細胞腫、黒色腫、腎癌及び卵巣癌）を処置する。一実施形態では、本発明に係る多重特異的タンパク質を使用してＣＤ１３７Ｌ発現癌を処置する。本明細書で示すように、多重特異的タンパク質の腫瘍細胞溶解を誘導する強い効果は、ＮＫ細胞の表面上のＣＤ１３７（４−１ＢＢ）の上方制御により部分的に媒介されると仮定される。共活性化ＣＤ１３７タンパク質は、腫瘍細胞上のＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ、４−１ＢＢＬ）に結合して認識することができ、その結果としてＮＫ細胞活性化及びＣＤ１３７Ｌ発現細胞の細胞傷害性が増強される。ＣＤ１３７Ｌは様々な腫瘍上で発現されることが分かっており、特に中程度の又は低い分化腫瘍において、悪性腫瘍によってより一般的に発現される（例えば、Ｖｉｎａｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１１（５）：１０６２−１０７０を参照されたい）。ＣＤ１３７Ｌ発現癌として、例えば肺扁平上皮癌、鼻腔扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、結腸腺癌、直腸腺癌、胆嚢腺癌、膵臓腺癌及び乳腺癌が挙げられる。

【0250】

本発明に係る多重特異的タンパク質を、個体から得られる生物学的サンプル（例えば、癌細胞、癌組織又は癌隣接組織を含む生物学的サンプル）中における標的細胞上での目的の抗原の発現を検出する事前のステップの有無にかかわらず使用することができる。別の実施形態では、本開示は、癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行う方法であって、
ａ）目的の抗原を発現する、個体由来のサンプル中において細胞（例えば、腫瘍細胞）を検出するステップ、及び
ｂ）任意選択により参照レベル（例えば、健康な個体又は本明細書で説明されているタンパク質から実質的な利益を得ていない個体に対応する）と比べて高いレベルで、目的の抗原を発現する細胞がサンプルに含まれることの検出時に、目的の抗原、ＮＫｐ４６（例えば、一価で）及びＣＤ１６（例えば、Ｆｃドメインを介して）結合する多重特異的タンパク質（例えば、本発明に係る多重特異的タンパク質）をこの個体に投与するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、目的の抗原は癌抗原（例えば、本明細書で開示されている癌抗原）であり、任意選択により、特異的に結合する完全長ヒトＩｇＧ１抗体と接触した場合に細胞内インターナリゼーションを受け得ることが分かっている癌抗原である。

【0251】

一実施形態では、本発明は、癌の処置又は予防を、それを必要とする個体において行う方法であって、
ａ）ＣＤ１３７Ｌ（ＣＤ１３７リガンド）を発現する個体由来のサンプル中（又は腫瘍内及び／若しくは隣接組織内）において細胞（例えば、腫瘍細胞）を検出するステップ、及び
ｂ）任意選択により参照レベル（例えば、健康な個体又は本明細書で説明されているタンパク質から実質的な利益を得ていない個体に対応する）と比べて高いレベルで、ＣＤ１３７Ｌを発現する細胞がサンプル（又は腫瘍内及び／若しくは隣接組織内）に含まれることの検出時に、癌抗原、ＮＫｐ４６（例えば、一価で）及びＣＤ１６に結合する多重特異的タンパク質（例えば、本開示のタンパク質）をこの個体に投与するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、癌抗原は本明細書で開示されている癌抗原であり）、任意選択により、特異的に結合する完全長ヒトＩｇＧ１抗体と接触した場合に細胞内インターナリゼーションを受け得ることが分かっている癌抗原である。

【0252】

一実施形態では、本開示は、疾患（例えば、癌）の処置又は予防を、それを必要とする個体において行う方法であって、
ａ）個体由来のサンプル中において（例えば、循環中において又は腫瘍環境中において）免疫エフェクター細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞）上の１つ又は複数の抑制受容体の細胞表面発現を検出するステップ、及び
ｂ）任意選択により参照レベル（例えば、健康な個体、免疫疲労若しくは免疫抑制に罹患していない個体、又は本明細書で説明されているタンパク質から実質的な利益を得ていない個体に対応する）と比べて高いレベルでの、免疫エフェクター細胞上の１つ又は複数の抑制受容体の細胞表面発現の検出時に、目的の抗原（例えば、癌抗原）、ＮＫｐ４６（例えば、一価で）及びＣＤ１６に結合する多重特異的タンパク質（例えば、本発明に係る多重特異的タンパク質）をこの個体に投与するステップ
を含む方法を提供する。任意選択により、癌抗原は本明細書で開示されている癌抗原であり）、任意選択により、特異的に結合する完全長ヒトＩｇＧ１抗体と接触した場合に細胞内インターナリゼーションを受け得ることが分かっている癌抗原である。

【0253】

一実施形態では、本発明に係る多重特異的タンパク質を単一治療（他の治療薬なし）として使用してもよく、又は１つ以上の他の治療薬による処置と組み合わせて使用してもよく、この他の治療薬として、抗体が投与される特定の治療目的に通常利用される薬剤が挙げられる。追加の治療薬を通常、処置される特定の疾患又は状態のための単一治療においてその薬剤に概して使用される量及び処置計画で投与する。そのような治療薬は、癌の処置で使用する場合、限定されるものではないが抗癌剤及び化学療法剤が挙げられ、感染性疾患の処置では、限定されるものではないが抗ウイルス剤及び抗生物質が挙げられる。そのような他の治療薬として、例えばＩｇ融合タンパク質、抗体、サイトカイン等の他の免疫調節性ポリペプチドをさらに挙げることができる。一部の実施形態では、本発明に係る多重特異的タンパク質及び他の治療薬の投与により、免疫及び／又は治療効果への相加又は相乗効果を引き出すことができる。

【0254】

本多重特異的タンパク質をキットに含めることもできる。このキットは、任意選択により、任意の数のポリペプチド及び／又は他の化合物をさらに含むことができ、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はあらゆる他の数の本発明に係る多重特異的タンパク質及び／又は他の化合物をさらに含むことができる。キットの内容物に関するこの説明は決して限定するものではないことが認識されるであろう。例えば、このキットは、他のタイプの治療化合物を含むことができる。任意選択により、このキットはまた、ポリペプチドの使用に関する取扱説明書も含み、例えば、特定の疾患状態の検出又は処置等での本明細書で説明されている方法を詳述する取扱説明書も含む。

【0255】

本発明はまた、主題の多重特異的タンパク質と、任意選択により、上記定義された他の化合物とを含む医薬組成物も提供する。多重特異的タンパク質及び任意選択により別の化合物は、医薬組成物として医薬担体と共に精製された形態で投与することができる。形態は、意図する投与方式及び治療又は診断用途によって決まる。医薬担体は、化合物を患者に送達するのに適した任意の適合性の非毒性物質とすることができる。薬学的に許容され得る担体は、当技術分野で公知であり、例えば、水溶液、例えば、（滅菌）水若しくは生理緩衝食塩水、又は他の溶媒若しくはビヒクル、例えば、グリコール、グリセロール、油、例えば、オリーブ油、又は注射可能な有機エステル、アルコール、脂肪、ワックス、及び不活性固体を含む。薬学的に許容され得る担体は、例えば化合物の吸収を安定させるか又は高めるように作用する、生理的に許容され得る化合物をさらに含み得る。このような生理的に許容され得る化合物は、例えば、炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、又はデキストラン、抗酸化物、例えば、アスコルビン酸又はグルタチオン、キレート剤、低分子量タンパク質、又は他の安定剤若しくは賦形剤を含む。当業者であれば、生理的に許容され得る化合物を含む薬学的に許容され得る担体の選択が、例えば、組成物の投与経路によって決まることを理解されよう。薬学的に許容され得るアジュバント、緩衝剤、及び分散剤なども医薬組成物に含まれ得る。そのようなアジュバントの非限定的な例として、無機及び有機アジュバント、例えばミョウバン、リン酸アルミニウム及び水酸化アルミニウム、スクアレン、リポソーム、リポ多糖、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ、一本鎖（ｓ−ｓ）ＤＮＡ、並びに非メチル化ＣｐＧ等のＴＬＲアゴニストが挙げられる。

【0256】

本発明による多重特異的タンパク質は、非経口投与することができる。非経口投与用の化合物の調製は、滅菌でなければならない。滅菌は、任意選択により凍結乾燥及び再生の前又は後での、滅菌濾過膜に通す濾過によって容易に達成される。化合物の投与の非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内経路、腹腔内経路、筋肉内経路、動脈内経路、若しくは病巣内経路による注射又は注入に従う。化合物は、注入又はボーラス注射によって連続的に投与することができる。静脈注射用の典型的な組成物は、特定のタイプの化合物及びその必要な投与計画に合わせて、任意選択により２０％アルブミン溶液が添加された１００〜５００ｍｌの滅菌０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコース及び１ｍｇ〜１０ｇの化合物を含むように構成することができる。非経口投与可能な組成物を調製する方法は、当技術分野で公知である。

【実施例】

【0257】

実施例１：
抗ｈｕＮＫｐ４６抗体の作製
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、配列番号１のタンパク質の細胞外ドメインを含む組換えヒトＮＫｐ４６細胞外ドメイン組換えＦｃタンパク質で免疫化した。マウスは、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により最初の免疫を行い、５０μｇのＮＫｐ４６タンパク質と不完全フロイントアジュバントのエマルションの腹腔内投与により２回目の免疫を行い、最後に、１０μｇのＮＫｐ４６タンパク質の静脈投与により追加免疫した。免疫脾細胞を追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞に融合し、これを放射線照射脾細胞の存在下で培養した。

【0258】

一次スクリーニング：増殖しているクローンの上清（Ｓ／Ｎ）を、細胞表面でヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いるフローサイトメトリーによって一次スクリーニングで試験した。簡単に述べると、ＦＡＣＳスクリーニングでは、上清中の反応性抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）によって明らかにした。

【0259】

ＮＫｐ４６に結合する抗体のパネルを選択し、産生し、及びそれらの可変領域を配列決定し、且つこれらの抗体及びその誘導体を二重特異的分子との関連でのそれらの活性についてさらに評価した。

【0260】

実施例２ エフェクター細胞受容体を標的とする、ＦｃＲｎには結合するがＦｃγＲには結合しない二重特異的抗体形態の同定
実験は、Ｆｃドメインを、抗ＮＫｐ４６結合ドメイン及び抗標的抗原結合ドメインと共にポリペプチドに配置する新規な二重特異的タンパク質形態を開発することを目的として行われた。そのような二重特異的タンパク質は、その抗ＮＫｐ４６結合ドメインを介してＮＫｐ４６に一価で結合するはずである。単量体Ｆｃドメインは、ヒト新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する少なくとも部分的な結合を維持するが、ヒトＣＤ１６及び／又は他のヒトＦｃγ受容体には実質的に結合しないはずである。結果として、そのような二重特異的タンパク質は、Ｆｃγ媒介（例えば、ＣＤ１６媒介）標的細胞溶解を誘導しないはずである。

【0261】

実施例２−１ 抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ抗ＣＤ３の作製及び結合分析
このようなタンパク質が機能的であり得るか否かを示すことができる抗ＮＫｐ４６二重特異的抗体が作製されていないため、ＮＫｐ４６を介したＮＫ細胞の標的化前に新規な一価二重特異的タンパク質形態の可能な機能を調べるために、ＮＫｐ４６の代わりにＣＤ３をモデル抗原として使用した。

【0262】

腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）をベースとした二重特異的Ｆｃを使用して、新規な単量体二重特異的ポリペプチド形態のＦｃＲｎ結合及びＣＤ１９結合機能を評価した。最終ポリペプチドのドメイン配置は、「Ｆ１」形態と呼ばれる（ＣＨ２ドメインの星は、本明細書で試験されたポリペプチドには含まれていない任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）（図２を参照されたい）。

【0263】

二重特異的単量体Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）及びＴ細胞の活性化受容体ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ）をベースに構築した。ＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ及びＫ４０９Ｙを含んでいた。このポリペプチドは、以下のように配置されたドメインを有する：抗ＣＤ１９−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＣＤ３。ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列も設計した。

【0264】

このＣＨ３ドメインは、変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ及びＫ４０９Ｙを含んでいた。選択したＣＨ２ドメインは野生型ＣＨ２であった。単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分及び抗ＣＤ１９のＤＮＡ及びアミノ酸配列を以下に示す。

【0265】

抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖに対応する軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列は次の通りであった。

【0266】

【表8】

【0267】

単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分及び最終二重特異的ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏポリペプチド（その構築物では最後のＫが除去された）のＤＮＡ配列が配列番号１１７に示されている。それによってコードされたアミノ酸配列が配列番号２に示されている。抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３完全配列（成熟タンパク質）が配列番号１１８に示されている。

【0268】

組換えタンパク質のクローニング及び産生
コード配列を直接合成及び／又はＰＣＲによって構築した。ＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＭＡＸ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，＃Ｒ０４５Ａ）を用いて行い、ＰＣＲ産物を、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル及びＰＣＲ ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６０９．２５０）を用いて１％アガロースゲルから精製した。精製した後、ＰＣＲ産物を定量してから、製造者のプロトコル（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，＃ＳＴ０３４５）に記載されているようにＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ連結反応を行った。プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ ９６プラスミドキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，＃７４０６２５．４）を用いてＥＶＯ２００（Ｔｅｃａｎ）で行われたミニプレップ調製後に得た。次いで、ＣＨＯ細胞株のトランスフェクションの前に、プラスミドを配列の確認のために配列決定した。

【0269】

ＣＨＯ細胞を、フェノールレッド及び６ｍＭ ＧｌｕｔａＭａｘが添加されたＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖した。トランスフェクションの前日に、細胞をカウントし、１７５，０００細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクションのために、細胞（２００，０００細胞／トランスフェクション）をＡＭＡＸＡ ＳＦ細胞株キット（ＡＭＡＸＡ，＃Ｖ４ＸＣ−２０３２）に記載されているように調製し、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ４Ｄ装置でＤＳ１３７プロトコルを用いてヌクレオフェクトした。全てのトランスフェクションは、３００ｎｇの検証済みプラスミドを用いて行った。トランスフェクション後、細胞を２４ウェルプレートの予熱された培養培地に播種した。２４時間後、ハイグロマイシンＢを培養培地に添加した（２００μｇ／ｍｌ）。タンパク質の発現を１週間後に培地で監視した。次いで、タンパク質を発現している細胞をサブクローニングして最高の産生株を得た。９６平底ウェルプレートを用いて、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢが添加された２００μｌの培養培地に１細胞／ウェルで細胞を播種して、サブクローニングを行った。クローンの生産性を試験する前に、細胞を３週間放置した。

【0270】

ＩｇＧ１−Ｆｃ断片を含む組換えタンパク質を、プロテインＡビーズ（ｒＰｒｏｔｅｉｎＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。簡単に述べると、細胞培養上清を濃縮し、遠心分離によって清澄化し、プロテインＡカラムに注入し、組換えＦｃ含有タンパク質を捕捉した。タンパク質を酸性ｐＨ（クエン酸０．１Ｍ ｐＨ３）で溶出し、及びＴＲＩＳ−ＨＣＬ ｐＨ８．５を用いて溶出物を即座に中和し、１×ＰＢＳで透析した。「ｓｉｘ ｈｉｓ」タグを含む組換えｓｃＦｖを、コバルト樹脂を用いてアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。他の組換えｓｃＦｖをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。

【0271】

実施例２−２：抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＣＤ３〜Ｂ２２１、ＪＵＲＫＡＴ、ＨＵＴ７８、及びＣＨＯ細胞株の結合分析
細胞を回収して、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３産生細胞の細胞上清で、４℃で１時間染色した。染色緩衝液（ＰＢＳ １Ｘ／ＢＳＡ ０．２％／ＥＤＴＡ ２ｍＭ）で２回洗浄した後、細胞をヤギ抗ヒト（Ｆｃ）−ＰＥ抗体（ＩＭ０５５０ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ−１／２００）で４℃において３０分間染色した。２回の洗浄後、染色をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。

【0272】

ＣＤ３及びＣＤ１９の発現もフローサイトメトリーによって制御した。細胞を回収して、５μｌの抗ＣＤ３−ＡＰＣ及び５μｌの抗ＣＤ１９−ＦＩＴＣ抗体を用いて、ＰＢＳ １Ｘ／ＢＳＡ ０．２％／ＥＤＴＡ ２ｍＭ緩衝液で、４℃で３０分間染色した。２回の洗浄後、染色をＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。

【0273】

これらの実験の結果は、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３タンパク質が、ＣＤ３細胞株（ＨＵＴ７８及びＪＵＲＫＡＴ細胞株）及びＣＤ１９細胞株（Ｂ２２１細胞株）に結合するが、陰性対照として使用されたＣＨＯ細胞株には結合しないことを明らかにした。

【0274】

実施例２−３：
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３によるＴ細胞及びＢ細胞の凝集
精製抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３をＴ／Ｂ細胞凝集アッセイで試験して、抗体が、ＣＤ１９及びＣＤ３発現細胞の凝集を促進するか否かを評価した。

【0275】

このアッセイの結果が図１に示されている。上のパネルは、抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３は、Ｂ２２１（ＣＤ１９）又はＪＵＲＫＡＴ（ＣＤ３）細胞株の存在下で凝集を引き起こさないが、Ｂ２２１及びＪＵＲＫＡＴ細胞の両方が同時にインキュベートされるときに細胞を凝集させることを示し、二重特異的抗体が機能的であることを例示する。下のパネルは、抗体なしで実施された対照実験の結果を示す。

【0276】

実施例２−４：
二重特異的単量体ＦｃポリペプチドのＦｃＲｎに対する結合性
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性試験
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃において行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、酢酸緩衝液（５０ｍＭ酢酸 ｐＨ５．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％界面活性剤ｐ２０）及びＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液として使用された。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えマウスＦｃＲｎをＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。

【0277】

ＦｃＲｎの固定化
組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。ＦｃＲｎタンパク質を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。

【0278】

親和性試験
一価親和性試験をＳｉｎｇｌｅ Ｃｙｃｌｅ Ｋｉｎｅｔｉｃ（ＳＣＫ）プロトコルに従って行った。５段階希釈の４１．５〜６６０ｎＭの可溶性分析物（抗体及び二重特異的分子）を（再生なしで）ＦｃＲｎに添加し、再生の１０分前に解離させた。各分析物について、全てのセンサーグラムを、１：１ＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。

【0279】

結果
ＣＨ２−ＣＨ３ドメインが２つの抗原結合ドメイン（具体的には２つのｓｃＦｖ）間に配置された抗ＣＤ１９−Ｆ１−抗ＣＤ３を評価して、そのような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質が、ＦｃＲｎへの結合を維持することができ、且つ従来の二重特異的抗体と比較して改善されたｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有するか否かを決定した。これらの実験の結果はＦｃＲｎ結合性が維持されることを示しており、このモデルは、正常なＩｇＧ又は野生型ＩｇＧに対して、２：１の比（各抗体に対して２つのＦｃＲｎ）ではなく１：１の比（各単量体Ｆｃに対して１つのＦｃＲｎ）を示唆している。

【0280】

この多重特異的タンパク質の結合親和性を、ＳＰＲを使用して評価し、完全なヒトＩｇＧ１定常領域を含むキメラ完全長抗体と比較した。単量体Ｆｃは、ＦｃＲｎに対して著しい単量体結合性を維持した（単量体Ｆｃ：ＫＤ＝１９４ｎＭの親和性；二価結合を有する完全長抗体：ＫＤ＝１５．４ｎＭの親和性）。

【0281】

実施例３：
抗ＣＤ１９ｘ抗ＮＫｐ４６二重特異的単量体Ｆｃドメインポリペプチドの作製
ＮＫ細上の活性化受容体が標的細胞の溶解に寄与し得るかは不明であり、また、抗ＮＫｐ４６抗体がＮＫｐ４６をブロックし得るため、細胞毒性がＮＫｐ４６によって媒介することができたか否かはさらに不明であった。本発明者らは、二重特異的タンパク質形態が、ＮＫｐ４６のトリガーを引き起こすことができたか否か、それが、標的から離れた不適切なＮＫ活性化及び／又は標的細胞に対する全活性の低下をもたらし得る、標的細胞の非存在下でＮＫｐ４６アゴニズムを誘導するか否かを調べた。

【0282】

新規な二重特異的タンパク質形態を、ＦｃＲｎには結合するがＦＣγＲには結合しない一本鎖タンパク質として開発した。加えて、２つ又は３つのポリペプチド鎖を含み、Ｆｃドメインが単量体を維持している多量体タンパク質を開発し、この多量体タンパク質は、ｓｃＦｖ形態に変換されたときにそれらの標的に対する結合性を維持しない抗体可変領域での使用に適合している。ｓｃＦｖ形態は、抗体のスクリーニングに便利に使用することができ、少なくとも１つの結合領域をＦ（ａｂ）構造として含めることにより、任意の抗標的（例えば、抗腫瘍）抗体可変領域を、抗体がｓｃＦｖとして結合性を維持するか否かにかかわらず、二重特異的タンパク質内のＦ（ａｂ）形態として二重特異的構築物で直接発現させて試験することができ、それにより、利用可能な抗体を単純にスクリーニングしてその数を増加させることができる。Ｆｃドメインが単量体を維持するこれらの形態は、最大の配座柔軟性を維持するという利点を有し、且つ以下に示すように、ＮＫｐ４６又は標的抗原に対する最適な結合性を可能にし得る。

【0283】

異なる構築物を、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖからの可変ドメイン、及び実施例１に示されたＮＫｐ４６受容体に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて、二重特異的抗体の調製に使用するために作製した。また、ＮＫｐ４６受容体に特異的である、商業的に入手可能な抗体Ｂａｂ２８１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）が市販するｍＩｇＧ１（Ｐｅｓｓｉｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ，１９９８，１８８（５）：９５３−９６０ ａｎｄ Ｓｉｖｏｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９９．２９：１６５６−１６６６も参照されたい））からの可変領域を抗ＮＫｐ４６として用いて作製した。

【0284】

Ｆｃドメインが、一本鎖ポリペプチドで、又は１つの鎖のみがＦｃドメインを有する多量体で単量体を維持するために、ＣＨ３−ＣＨ３二量体化が、２つの異なる戦略：（１）特定の変異（ＥＵ付番）、即ちＬ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙを含むＣＨ３ドメインの使用により、又は（２）直列型ＣＨ３ドメインが互いに結合された可撓性リンカーにより分離され、鎖間ＣＨ３−ＣＨ３二量体化を防止する直列型ＣＨ３ドメインの使用によって防止された。上記で特定された点変異を含む単量体ＣＨ２−ＣＨ３Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同じであった。直列型ＣＨ３ドメインを有する単量体ＣＨ２−ＣＨ３−リンカーＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、図２Ａ〜図２Ｄに示されている。

【0285】

抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列も実施例２−１と同じであった。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。以下に、異なる抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖ＤＮＡ及びアミノ酸配列が示される。

【0286】

【表9】

【0287】

【表10】

【0288】

形態１（Ｆ１）（抗ＣＤ１９−ＩｇＧ１−Ｆｃｍｏｎｏ−抗ＮＫｐ４６（ｓｃＦｖ））
形態１（Ｆ１）のドメイン構造が図２Ａに示されている。二重特異的Ｆｃ含有ポリペプチドを、腫瘍抗原ＣＤ１９（抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ）に特異的なｓｃＦｖ及びＮＫｐ４６受容体に特異的なｓｃＦｖをベースに構築した。このポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する一本鎖ポリペプチドである。
（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｋ）^{抗ＮＫｐ４６}

【0289】

アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。図２に示されている最終ポリペプチドのドメイン配置（ＣＨ２ドメインの星は、任意選択のＮ２９７Ｓ変異を示す）では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖが抗ＮＫｐ４６ ｓｃＦｖによって置換されている。（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）単位は、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｋドメインとの間にリンカーを含む。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的ポリペプチドのアミノ酸配列（完全な配列（成熟タンパク質））が、以下の表２Ｂに列記された対応する配列番号に示されている。

【0290】

【表11】

【0291】

形態２（Ｆ２）：ＣＤ１９−Ｆ２−ＮＫｐ４６−３
Ｆ２ポリペプチドのドメイン構造が図２Ａに示されている。単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、実施例２−１と同様であり、それは、同様にＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ、及びＫ４０９Ｙ）を含む。ヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｖ_Ｈ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＫ。

【0292】

（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）単位は、Ｖ_Ｈドメイン、リンカー、及びＶ_Ｋ単位（即ち、ｓｃＦｖ）から構成されていた。本発明の二重特異的ポリペプチドの他の形態と同様に、アミノ酸配列ＳＴＧＳを有するＣＨ３／ＶＨリンカーペプチドをコードするＤＮＡ配列を、ＣＨ３−ＶＨ接合部に特定のＳａｌｌ制限部位を挿入するために設計した。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。Ｆ２タンパク質の第１鎖及び第２鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４０及び１４１に示されている。

【0293】

形態３（Ｆ３）：ＣＤ１９−Ｆ３−ＮＫｐ４６−３
Ｆ３ポリペプチドのドメイン構造が図２Ａに示されている。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、同じポリペプチド鎖上の２つのＣＨ３ドメインが互いに結合し、それにより、異なる二重特異的タンパク質間の二量体化が防止される直列型ＣＨ３ドメインを含んでいた。

【0294】

一本鎖ポリペプチドは、以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する。
（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｋ）^{抗ＮＫｐ４６}

【0295】

（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）単位は、Ｖ_Ｈドメイン、リンカー、及びＶ_Ｋ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。Ｆ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４２に示されている。

【0296】

形態４（Ｆ４）：ＣＤ１９−Ｆ４−ＮＫｐ４６−３
Ｆ４ポリペプチドのドメイン構造が図２Ａに示されている。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ３と同様に直列型ＣＨ３ドメインを含み、さらに、Ｎ連結グリコシル化を防止してＦｃγＲ結合性を消失させるＮ２９７Ｓ変異を含んでいた。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。ＮＫｐ４６−３可変ドメインを有するＦ４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４３に示されている。

【0297】

形態８（Ｆ８）
Ｆ８ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｂに示す。単量体ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は形態Ｆ２と同様であり、ＣＨ３ドメイン変異（変異（ＥＵ付番）Ｌ３５１Ｋ、Ｔ３６６Ｓ、Ｐ３９５Ｖ、Ｆ４０５Ｒ、Ｔ４０７Ａ及びＫ４０９Ｙ、並びにＮ連結グリコシル化を防止してＦｃγＲ結合性をさらに消失させるＮ２９７Ｓ変異）を同様に含む。Ｆ８タンパク質の以下の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである１（野生型、Ｆ８Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第２（Ｆ８Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ８Ｃ）。変異型Ｆ８Ｂ及びＦ８Ｃは中心鎖のホモ二量体の形成を回避することから、これらの変異体は作製上の利点を提供した。このヘテロ三量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｖ_Ｈ^{抗ＮＫｐ４６}−Ｃ_Ｋ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
ＶＫ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＣＤ１９}−Ｃ_Ｋ。

【0298】

タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は３．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ８Ｃ）の高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は単純なＳＥＣプロフィールを再び示した。ＮＫｐ４６−３可変領域を有するＦ８タンパク質（Ｃ変異体）の３つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１４４、１４５及び１４６に示す。

【0299】

形態９（Ｆ９）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ９ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖及びそれぞれＣＨ１−Ｃ_Ｋの二量体化によって中心鎖に結合している２つのポリペプチド鎖を有する三量体ポリペプチドである。この三量体Ｆ９タンパク質のドメイン構造を図２Ｂに示し、ＣＨ１及びＣ_Ｋドメイン間の結合は鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインは、抗体がｓｃＦｖ形態で機能を維持するか否かにかかわらず、この抗体の使用を可能にするＦ（ａｂ）構造を有する。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４と同様の直列型ＣＨ３ドメインを含み、且つＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含む。Ｆ９タンパク質の以下の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第１（野生型、Ｆ９Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第２（Ｆ９Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ９Ｃ）。変異型Ｆ９Ｂ及びＦ９Ｃは、中心鎖のホモ二量体の形成を回避することにより作製で利点を提供した。このヘテロ三量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−Ｖ_Ｈ^{抗ＮＫｐ４６}−Ｃ_Ｋ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＣＤ１９}−Ｃ_Ｋ。

【0300】

タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、８．７ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ａ）及び３．０ｍｇ／Ｌ（Ｆ９Ｂ）の高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。

【0301】

Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ａの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４７、１４８、及び１４９に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｂの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５０、１５１、及び１５２に示されている。Ｆ９タンパク質変異型Ｆ９Ｃの３つの鎖のアミノ酸配列は、配列番号１５３、１５４、及び１５５に示されている。

【0302】

形態１０（Ｆ１０）：ＣＤ１９−Ｆ９−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１０ポリペプチドは、中心ポリペプチド鎖及びＣＨ１−Ｃ_Ｋ二量体化により中心鎖に結合している第２のポリペプチド鎖を有する二量体タンパク質である。この二量体Ｆ１０タンパク質のドメイン構造を図２Ｂに示し、ＣＨ１及びＣ_Ｋドメイン間の結合は鎖間ジスルフィド結合である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。ＣＨ２−ＣＨ３ Ｆｃ部分のＤＮＡ及びアミノ酸配列は、形態Ｆ４で示すような直列型ＣＨ３ドメインを含み、且つＮ２９７Ｓ置換を含むＣＨ２ドメインを含む。Ｆ１０タンパク質の以下の３つの変異体も作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第１（野生型、Ｆ１０Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基により置換された第２（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ１０Ｃ）。変異型Ｆ１０Ｂ及びＦ１０Ｃは中心鎖のホモ二量体の形成を回避することから、これらの変異体は作製で利点を提供した。（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）単位は、Ｖ_Ｈドメイン、リンカー、及びＶ_Ｋ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。このヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｋ）^{抗ＮＫｐ４６}、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＣＤ１９}−Ｃ_Ｋ。

【0303】

これらのタンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は２ｍｇ／Ｌ（Ｆ１０Ａ）の良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は単純なＳＥＣプロフィールを再び示した。Ｆ１０Ａタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１５６（第２鎖）及び１５７（第１鎖）に示す。Ｆ１０Ｂタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１５８（第２鎖）及び１５９（第１鎖）に示す。Ｆ１０Ｃタンパク質変異体の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１６０（第２鎖）及び１６１（第１鎖）に示す。

【0304】

形態１１（Ｆ１１）：ＣＤ１９−Ｆ１１−ＮＫｐ４６−３
Ｆ１１ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｃに示す。このヘテロ二量体タンパク質はＦ１０に類似しているが、抗原結合ドメインの構造が逆である。２つの抗原結合ドメインの一方はＦａｂ様構造を有し、且つ他方はｓｃＦｖである。このヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−Ｖ_Ｈ^{抗ＮＫｐ４６}−Ｃ_Ｋ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１。

【0305】

タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は２ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は単純なＳＥＣプロフィールを同様に示した。Ｆ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１６２（第１鎖）及び配列番号１６３（第２鎖）に示す。

【0306】

形態１２（Ｆ１２）：ＣＤ１９−Ｆ１２−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１２ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｃに示し、ＣＨ１及びＣ_Ｋドメイン間の結合はジスルフィド結合である。このヘテロ二量体タンパク質はＦ１１に類似しているが、Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣ_Ｋドメインが逆である。このヘテロ二量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
（Ｖ_Ｋ−Ｖ_Ｈ）^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−Ｖ_Ｈ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＮＫｐ４６}−Ｃ_Ｋ。

【0307】

タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製し、分析し、ＳＥＣにより精製した。このタンパク質は２．８ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は単純なＳＥＣプロフィールを同様に示した。Ｆ１２タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１６４（第１鎖）及び配列番号１６５（第２鎖）に示す。

【0308】

形態１７（Ｆ１７）：ＣＤ１９−Ｆ１７−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１７ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｃに示し、ＣＨ１及びＣ_Ｋドメイン間の結合はジスルフィド結合である。ヘテロ二量体タンパク質はＦ９と同様であるが、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｋドメイン、並びにＣ末端Ｆ（ａｂ）構造内のＣＨ１及びＣ_Ｋドメインは、それぞれそれらのパートナーと逆である。このヘテロ三量体は以下から構成される：
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１の（中心）ポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ３−Ｖ_Ｋ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ^{抗ＮＫｐ４６}−Ｃ_Ｋ、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＣＤ１９}−Ｃ_Ｋ。

【0309】

加えて、Ｆ１７タンパク質の以下の３つの変異体を作製した：（ａ）ヒンジ領域のシステイン残基が完全なままである第１（野生型、Ｆ１７Ａと呼ばれる）、（ｂ）ヒンジ領域のシステイン残基がセリン残基で置換された第２（Ｆ１０Ｂ）、及び（ｃ）ヒンジの残基ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰを置換するリンカー配列ＧＧＧＳＳを含む第３（Ｆ１７Ｃ）。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生して精製した。Ｆ１７Ｂタンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１６６、１６７、及び１６８に示す。

【0310】

実施例４：
二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的ＮＫｐ４６抗体形態
二量体Ｆｃドメインを有する新規なタンパク質構築物を開発しており、このタンパク質構築物は、実施例３の単量体Ｆｃドメインタンパク質の利点の多くを共有するが、より高い親和性でＦｃＲｎに結合する。ＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）への結合が低かった若しくは実質的に欠如していた又はＦｃγＲ（ＣＤ１６を含む）への結合を有していた様々なタンパク質形態を作製し、例えば、ヒトＣＤ１６への結合親和性は、ＳＰＲ（例えば、実施例１６の方法を参照されたい）によって評価された場合に、野生型ヒトＩｇＧ１抗体の結合親和性の１−ｌｏｇ内であった。この異なるポリペプチド形態を、（ＶＨ−（ＣＨ１／Ｃ_Ｋ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位又は（Ｖ_Ｋ−（ＣＨ１又はＣ_Ｋ）−ＣＨ２−ＣＨ３−）単位を有する中心鎖を含むヘテロ二量体タンパク質の機能を調べるために試験及び比較した。次いで、ＣＨ３ドメインの一方又は両方は、任意選択により介在アミノ酸配列若しくはドメインを介して、可変ドメイン（分離されたポリペプチド鎖上の可変ドメインに結合する単一可変ドメイン）、直列型可変ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）、又は単一可変ドメインとして抗原に結合することができる単一可変ドメインに融合される。２つの鎖が、ＣＨ１−Ｃ_Ｋ二量体化によって結合してジスルフィド結合二量体を形成するか、又は第３鎖と結合して三量体を形成する。

【0311】

様々な構築物を、二重特異的抗体の調製に使用するために、実施例２−１に記載の腫瘍抗原ＣＤ１９に特異的なｓｃＦｖに由来する可変ドメインＤＮＡ及びアミノ酸配列及び実施例１で明らかにされたＮＫｐ４６に特異的な抗体からの異なる可変領域を用いて作製した。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。ドメイン構造は、図２Ａ〜図６Ｄに示されている。

【0312】

形態５（Ｆ５）：ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ５ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／Ｃ_ＫとＣＨ２ドメイン間に図形で示されている）及びＣＨ１とＣ_Ｋドメインとの間の鎖間結合は鎖間ジスルフィド結合である。ヘテロ三量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−Ｖ_Ｈ^{抗ＮＫｐ４６}−Ｃ_Ｋ、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＣＤ１９}−ＣＫ−ＣＨ２−ＣＨ３、及び
（３）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第３のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１

【0313】

タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、３７ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１６９（第２鎖）、１７０（第１鎖）、及び１７１（第３鎖）に示されている。

【0314】

形態６（Ｆ６）：ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ６ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されている。Ｆ６タンパク質は、Ｆ５と同じであるが、Ｎ連結グリコシル化を防止するためのＮ２９７Ｓ置換を含む。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１２ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７２（第２鎖）、１７３（第１鎖）、及び１７４（第３鎖）に示されている。

【0315】

形態７（Ｆ７）：ＣＤ１９−Ｆ７−ＮＫｐ４６−３
ヘテロ三量体Ｆ７ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されている。Ｆ７タンパク質は、Ｆ６と同じであるが、但し、中心鎖とＶ_Ｋ^{抗ＮＫｐ４６}−ＣＨ１鎖との二量体種の少数集団の形成を防止するために、それらのＣ末端でＦｃドメインに連結されたＣＨ１及びＣ_Ｋドメインにシステインのセリンでの置換を有する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、１１ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７５（第２鎖）、１７６（第１鎖）、及び１７７（第３鎖）に示されている。

【0316】

形態１３（Ｆ１３）：ＣＤ１９−Ｆ１３−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１３ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｄに示されており、ヒンジドメイン間の鎖間結合（鎖上のＣＨ１／Ｃ_ＫとＣＨ２ドメイン間に示されている）及びＣＨ１とＣ_Ｋドメイン間の鎖間結合は、鎖間ジスルフィド結合である。このヘテロ二量体は、以下から構成される。
（１）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第１（中心）のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｈ^{抗ＣＤ１９}−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｋ）^{抗ＮＫｐ４６}、及び
（２）以下のように（Ｎ末端からＣ末端に）配置されたドメインを有する第２のポリペプチド鎖：
Ｖ_Ｋ^{抗ＣＤ１９}−Ｃ_Ｋ−ＣＨ２−ＣＨ３。

【0317】

（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｋ）単位は、Ｖ_Ｈドメイン、リンカー、及びＶ_Ｋ単位（ｓｃＦｖ）から構成されていた。

【0318】

タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、６．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。２つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１７８（第２鎖）及び１７９（第１鎖）に示されている。

【0319】

形態１４（Ｆ１４）：ＣＤ１９−Ｆ１４−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｆ１４ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１４ポリペプチドは、Ｆ１３形態の構造を共有する二量体ポリペプチドであるが、野生型Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）の代わりに、Ｆ１４二重特異的形態は、Ｎ連結グリコシル化をなくすためにＣＨ２ドメイン変異Ｎ２９７Ｓを有する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、２．４ｍｇ／Ｌの高い産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを示した。２つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８０（第２鎖）及び１８１（第１鎖）に示されている。

【0320】

形態１５（Ｆ１５）：ＣＤ１９−Ｆ１５−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１５ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１５ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＮ末端ＶＨ−ＣＨ１とＶ_Ｋ−Ｃ_Ｋ単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。二重特異的タンパク質を、ｐｒｏｔ−Ａビーズを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製し、分析し、且つＳＥＣによって精製した。このタンパク質は、０．９ｍｇ／Ｌの良好な産生収率を示し、精製されたタンパク質は、単純なＳＥＣプロフィールを有していた。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８２（第２鎖）、１８３（第１鎖）、及び１８４（第３鎖）に示されている。

【0321】

形態１６（Ｆ１６）：ＣＤ１９−Ｆ１６−ＮＫｐ４６−３
三量体Ｆ１６ポリペプチドのドメイン構造が図２Ｅに示されている。Ｆ１６ポリペプチドは、Ｆ６形態の構造を共有するが、中心鎖と第２鎖との間のＣ末端Ｖ_Ｈ−ＣＫとＶ_Ｋ−ＣＨ１単位とが逆であるため異なっている三量体ポリペプチドである。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生し、且つ精製した。３つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号１８５（第２鎖）、１８６（第１鎖）、及び１８７（第３鎖）に示されている。

【0322】

形態Ｔ５（Ｔ５）
三量体Ｔ５ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ５ポリペプチドはＦ５形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第３の鎖（Ｆｃドメインを欠いている鎖）のＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。従って、このタンパク質は、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを有し、このタンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合する。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。このＴ５タンパク質は、異なる抗体に由来する（及びＣＤ２０上の異なるエピトープに結合する）、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを有した。第１の抗ＣＤ２０ ＡＢＤは、親抗体ＧＡ１０１（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、Ｇａｚｙｖａｒｏ（登録商標）、オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含んだ。第２の抗ＣＤ２０ ＡＢＤは、親抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｍａｂｔｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含んだ。第３の抗原結合ドメインはヒトＮＫｐ４６に結合する。このＴ５タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す（リツキシマブ配列を太字及び下線で示し、抗ＧＡ１０１配列を下線で示し、抗ＮＫｐ４６配列をイタリック体で示す）。

【0323】

ＧＡ１０１−Ｔ５−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド１（配列番号１８８）

【化13】

【0324】

ポリペプチド２（配列番号１８９）

【化14】

【0325】

ポリペプチド３：（配列番号１９０）

【化15】

【0326】

形態Ｔ６（Ｔ６）
三量体Ｔ６ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ６ポリペプチドはＦ６形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、第３の鎖（Ｆｃドメインを欠いている鎖）のＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。この三量体タンパク質は、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを含み、Ｎ２９７置換に起因して、この三量体タンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。このＴ６タンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。第１の抗ＣＤ２０ ＡＢＤは親抗体ＧＡ１０１のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含み、第２の抗ＣＤ２０ ＡＢＤはリツキシマブのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む。このＴ６タンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を配列番号１９１、１９２及び１９３に示す。

【0327】

形態Ｔ９Ｂ（Ｔ９Ｂ）
三量体Ｔ９Ｂポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ９ＢポリペプチドはＦ９形態（Ｆ９Ｂ変異体）の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、（第３の鎖上の）遊離ＣＨ１ドメインのＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。このタンパク質は、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを含むが、単量体Ｆｃドメイン及び／又はＮ２９７置換に起因して、このタンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。上記で説明した三量体タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。このＴ９Ｂタンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを有した。第１の抗ＣＤ２０ ＡＢＤは親抗体ＧＡ１０１のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含み、第２の抗ＣＤ２０ ＡＢＤは親抗体リツキシマブのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含んだ。このＴ９Ｂタンパク質の３つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。

【0328】

ＧＡ１０１−Ｔ９Ｂ−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド２：（配列番号１９５）

【化16】

【0329】

ポリペプチド１：（配列番号１９４）

【化17】

【0330】

ポリペプチド３（配列番号１９６）：

【化18】

【0331】

形態Ｔ１１（Ｔ１）：ＣＤ１９−Ｔ１１−ＮＫｐ４６−３
二量体Ｔ１１ポリペプチドのドメイン構造を図２Ｆに示す。このＴ１１ポリペプチドはＦ１１形態の構造を共有する三量体ポリペプチドであるが、遊離ＣＨ１ドメインのＣ末端でのｓｃＦｖ単位の融合が異なる。この二量体タンパク質は、目的の抗原用の２つの抗原結合ドメインとＮＫｐ４６用の１つとを含み、単量体Ｆｃドメイン及び／又はＮ２９７置換に起因して、この二量体タンパク質のＦｃドメインを介してＣＤ１６に結合しない。タンパク質を実施例２−１と同様にクローニングし、産生させて精製した。このＴ１１タンパク質は、ヒトＣＤ２０に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。第１の抗ＣＤ２０ ＡＢＤは親抗体ＧＡ１０１のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含み、第２の抗ＣＤ２０ ＡＢＤはリツキシマブのＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含んだ。このＴ１１タンパク質の２つの鎖のアミノ酸配列を以下に示す。

【0332】

ＧＡ１０１−Ｔ１１−Ｒｉｔｕｘ−ＮＫｐ４６
ポリペプチド１（配列番号１９７）：

【化19】

【0333】

ポリペプチド２（配列番号１９８）：

【化20】

【0334】

実施例５：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出される二重特異的タンパク質によるＮＫｐ４６結合親和性
Ｂａｃｏｒｅ Ｔ１００の一般的な手順及び試薬
ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、２５℃で行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ １０ｍＭは、それぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。プロテインＡを（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から購入した。ヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。

【0335】

プロテインＡの固定化
プロテインＡタンパク質をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡを結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。

【0336】

結合試験
まず、二重特異的タンパク質を、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の抗体からの異なる抗ＮＫｐ４６可変領域を有する実施例２に記載のように形態Ｆ１で試験した。次に、抗体を、ＮＫｐ４６−３抗体からの抗ＮＫｐ４６可変領域を有する異なる形態Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、Ｆ１４として試験し、完全長ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３抗体と比較した。

【0337】

二重特異的タンパク質を１μｇ／ｍＬで、プロテインＡチップ上で捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質を、５μｇ／ｍＬで、捕捉した二重特異的抗体に注入した。ブランク差し引きのために、サイクルを再び行って、ＮＫｐ４６タンパク質を泳動用緩衝液に替えた。

【0338】

Ｂａｂ２８１抗体を、ＳＰＲによってＮＫｐ４６に対する結合性について別個に試験し、さらに細胞表面にヒトＮＫｐ４６構築物を発現する細胞株を用いてフローサイトメトリーによって試験した。ＦＡＣＳスクリーニングのために、上清中の反応性抗体の存在を、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）を使用して検出した。ＳＰＣ及びＦＡＣＳの結果は、Ｂａｂ２８１ベースの抗体が、ＮＫｐ４６細胞株にもＮＫｐ４６ Ｆｃタンパク質にも結合しないことを示した。Ｂａｂ２８１は、二重特異的形態で存在する場合、その標的に結合する能力を失った。

【0339】

親和性試験
一価親和性試験を、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ）が推奨する正規のＣａｐｔｕｒｅ−Ｋｉｎｅｔｉｃプロトコルに従って行った。６２．５〜４００ｎＭの範囲のヒトＮＫｐ４６組換えタンパク質の７段階希釈物を、捕捉した二重特異的抗体に連続的に注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、１：１動態結合モデルを用いてフィッティングした。

【0340】

結果
ＳＰＲは、ＮＫｐ４６−１、２、３、及び４ ｓｃＦｖ結合ドメインを有する形態Ｆ１の二重特異的ポリペプチドが、ＮＫｐ４６に結合したが、異なる抗ＮＫｐ４６抗体のｓｃＦｖを有する他の二重特異的ポリペプチドが、ＮＫｐ４６結合性を維持しなかったことを示した。単量体二重特異的形態で結合性を維持しなかった結合ドメインは、当初はＮＫｐ４６に結合したが、二重特異的形態への変換時にＮＫｐ４６に結合する能力を失った。形態Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、及びＦ１４の二重特異的ポリペプチドの全ては、ＮＫｐ４６−３可変領域を用いる場合にＮＫｐ４６に対する結合性を維持した。一価親和性並びに動力学的結合及び解離速度定数が以下の表３に示されている。

【0341】

【表12】

【0342】

実施例６：
Ｄａｕｄｉ腫瘍標的に対するＮＫ細胞とＦｃ含有ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質との結合
単量体Ｆｃドメイン及び実施例３に記載の一本鎖Ｆ１又は二量体Ｆ２形態に従って配置されたドメイン、及びＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体を、ＮＫ細胞にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｂリンパ芽球細胞株によって十分に特徴付けられるＤａｕｄｉ）を溶解させる機能的能力について試験した。Ｆ２タンパク質は、ｓｃＦｖ形態ではＮＫｐ４６に結合する能力を失うが、Ｆ２のＦ（ａｂ）様形態ではＮＫｐ４６に結合する能力を維持するＮＫｐ４６−９の可変領域をさらに含んでいた。

【0343】

簡単に述べると、（ａ）静止ヒトＮＫ細胞、及び（ｂ）ヒトＮＫｐ４６でトランスフェクトされたヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１のそれぞれの細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレートにおいて典型的な４時間の^５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞を^５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０^６細胞）で標識し、次いで、異なる濃度の単量体二重特異的抗体の存在下で、ＫＨＹＧ−１では５０、静止ＮＫ細胞では（Ｆ１タンパク質に対して）１０又は（Ｆ２タンパク質に対して）８．８に等しいエフェクター／標的比で、ｈＮＫ４６でトランスフェクトされたＫＨＹＧ−１と混合した。短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、上清のサンプルを取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、^５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴ ベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。

【0344】

結果
ＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ実験モデルでは、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）及びＣＤ１９／ＣＤ３二重特異的抗体）と比較して、ヒトＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。

【0345】

静止ＮＫ細胞をエフェクターとして使用したときに、各二重特異的抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９が同様に、陰性対照（ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体）と比較して、ヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞の特異的溶解を誘導し、それにより、これらの抗体が、ＣＤ１９／ＮＫｐ４６架橋によってヒトＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ標的細胞の溶解を誘導することが示された。リツキシマブ（ＲＴＸ、キメラＩｇＧ１）を、静止ヒトＮＫ細胞によるＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）の陽性対照として使用した。ＲＴＸ（このアッセイでは１０μｇ／ｍｌで）で得られた最大応答は、２１．６％の特異的溶解であり、本発明の二重特異的抗体が高い標的細胞溶解活性を有することを例証した。静止ＮＫ細胞での実験の結果は、一本鎖Ｆ１タンパク質については図３Ａに示され、二量体Ｆｃタンパク質については図３Ｂに示されている。

【0346】

実施例７：
完全長抗ＮＫｐ４６ ｍＡｂと枯渇抗腫瘍ｍＡｂとの比較：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質が非特異的ＮＫ活性化を防止する
これらの実験では、特有の二重特異的形態を有する二重特異的抗体が、非特異的ＮＫ細胞の活性化を引き起こすことなく、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ活性化を媒介することができるか否かを評価することを目的として、そのような二重特異的抗体を作製した。

【0347】

具体的には、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較（ＡＤＣＣ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃｏｍｐａｒａｔｏｒ）としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。

【0348】

実験は、対照として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ、高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体対照；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ、標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１；並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。

【0349】

様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８ Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＮＫ細胞の活性化に対するその相対的な機能的影響について評価するために試験した。

【0350】

簡単に述べると、ＮＫ活性化を、フローサイトメトリーにより、ＮＫ細胞でのＣＤ６９及びＣＤ１０７の発現を評価することによって試験した。アッセイは、完全ＲＰＭＩ、１５０μＬ最終／ウェルで、９６Ｕウェルプレートで行った。エフェクター細胞は、ドナーから精製した新鮮なＮＫ細胞とした。標的細胞は、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９−陽性）、ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−陰性）、又はＫ５６２（ＮＫ活性化対照細胞株）とした。Ｋ５６２陽性対照に加えて、以下の３つの条件を試験した。
＞ＮＫ細胞のみ
＞ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（Ｃ１９＋）
＞ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９−）

【0351】

エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は、２．５：１（５０，０００Ｅ：２０，０００Ｔ）とし、抗体の希釈範囲は、１／４希釈で１０μｇ／ｍＬから始めた（ｎ＝８の濃度）。抗体、標的細胞、及びエフェクター細胞を混合し、３００ｇで１分間回転させ、３７℃で４時間インキュベートし、５００ｇで３分間回転させ、染色緩衝液（ＳＢ）で２回洗浄し、５０μＬの染色Ａｂミックスを加え、３００ｇで３０分間インキュベートし、ＣｅｌｌＦｉｘを含むＳＢ再懸濁ペレットで２回洗浄し、４℃で一晩保存し、Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＨＴＳ）で蛍光を検出した。

【0352】

結果
１．ＮＫ細胞のみ
これらの実験の結果は図４Ａに示されている。標的抗原発現細胞の非存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）はいずれも、ＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現による評価によるとＮＫ細胞を活性化しなかった。完全長抗ＣＤ１９もＮＫ細胞を活性化しなかった。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体は、ＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アレムツヅマブも非常に高いレベルでＮＫ細胞の活性化を誘導した。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。

【0353】

２．ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）
これらの実験の結果は図４Ｂに示されている。標的抗原発現細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の結合ドメインのそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。完全長抗ＣＤ１９抗体は、最良でも非常に低いＮＫ細胞の活性化のみを示した。完全長抗ＮＫｐ４６抗体もアレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性化を超えた活性化の実質的な増加を示さなかった。図４のデータは、完全長抗ＮＫｐ４６抗体が、ＮＫ細胞のみの存在下で観察されたものと同様のレベルのベースライン活性化を誘発することを示す。アレムツヅマブも、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された活性と同様のレベルのＮＫ細胞の活性化を誘導し、この設定のより高い抗体濃度（ＥＴ ２．５：１）では、活性化は、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体を用いたときよりも高かった。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。

【0354】

３．ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８（ＣＤ１９⁻）
これらの実験の結果は図４Ｃに示されている。標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下で、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、及びＮＫｐ４６−９の可変領域のそれぞれを含む）は全て、ＮＫ細胞を活性化した。しかしながら、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、ＮＫ細胞のみの存在下で観察された同様のレベルでＮＫ細胞の検出可能な活性化を引き起こした。アイソタイプ対照抗体は、活性化を誘導しなかった。

【0355】

上述の結果は、本発明の二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質が、完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体と異なり、さらには標的細胞の非存在下で同様にＮＫ細胞を活性化する枯渇ＩｇＧアイソタイプの完全長抗体とも異なり、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化し得ることを示す。抗ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質により達成されるＮＫ細胞の活性化は、完全長抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１抗体で観察される活性化と比べて顕著に高かった。従って、この二重特異的抗体は、誘発する非特異的細胞傷害性がより低いはずであり、治療で使用される場合により強力であり得る。

【0356】

実施例８：
低いＥＴ比での枯渇抗腫瘍ｍＡｂ：ＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質の効果の比較
これらの試験は、二重特異的抗体が、低いエフェクター：標的比で、癌標的細胞に対するＮＫｐ４６媒介ＮＫ細胞活性化を媒介できるか否かを調べることを目的とした。この実施例に使用されるＥＴ比は、実施例７で使用された２．５：１のＥＴ比又は実施例６の１０：１のＥＴ比よりもｉｎ ｖｉｖｏで遭遇するであろう設定に近いと考えられる１：１とした。

【0357】

ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３に記載のＦ２形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質を以下と比較した：
（ａ）完全長単一特異的抗ＮＫｐ４６抗体（ヒトＩｇＧ１のようなＮＫｐ４６−３）、及び
（ｂ）ＡＤＣＣ誘導抗体対照比較としての完全長ヒトＩｇＧ１のような抗ＣＤ１９抗体。

【0358】

実験は、対象として以下をさらに含んでいた：リツキシマブ（高い発現レベルを有する標的抗原の抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体対照）；抗ＣＤ５２抗体アレムツヅマブ（標的細胞及びＮＫ細胞の両方に存在するＣＤ５２標的に結合するヒトＩｇＧ１）、並びに陰性対照アイソタイプ対照治療抗体（標的細胞（ＨＵＧ１−ＩＣ）に存在する標的に結合しないヒトＩｇＧ１）。様々なタンパク質を、ＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞（Ｄａｕｄｉ細胞）の存在下、ＣＤ１９陰性ＣＤ１６陽性標的細胞（ＨＵＴ７８ Ｔリンパ腫細胞）の存在下、且つ標的細胞の非存在下でのＣＤ６９又はＣＤ１０７の発現により評価される、ＮＫ細胞活性化に対する機能的な影響について試験した。これらの実験は、ＥＴ比を１：１としたことを除いて実施例７と同様に行った。

【0359】

結果
上記の実験の結果は図５に示されている（図５Ａ：ＣＤ１０７及び図５Ｂ：ＣＤ６９）。標的抗原発現細胞の存在下では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体（ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、ＮＫｐ４６−４、又はＮＫｐ４６−９の可変領域をそれぞれ含む）は全て、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化した。

【0360】

Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、完全長ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体によって誘発されるものよりも遥かに強力であった。このＡＤＣＣ誘導抗体は、この設定で低い活性を有していた。さらに、この低いＥ：Ｔ比の設定では、二重特異的抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体によって誘導される活性化は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブと同程度に強力であり、差異は、差異が２．５：１のＥＴ比で観察された濃度よりも１０倍高い最高濃度でのみ観察された。

【0361】

標的細胞の非存在下又は標的抗原陰性ＨＵＴ７８細胞の存在下では、完全長抗ＮＫｐ４６抗体及びアレムツヅマブは、Ｄａｕｄｉ細胞の存在下で観察されたものと同様のレベルのベースライン活性化を示した。抗ＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９抗体は、ＨＵＴ７８細胞の存在下でＮＫ細胞を活性化しなかった。

【0362】

上記の結果は、本発明の二重特異的抗ＮＫｐ４６タンパク質が、標的細胞特異的にＮＫ細胞を活性化することができ、より低いエフェクター：標的比が、ＮＫ細胞の活性化の媒介において従来のヒトＩｇＧ１抗体よりも有効であることを示す。

【0363】

実施例９：
ＮＫｐ４６動作機序
ＮＫｐ４６−３からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ２、Ｆ３、Ｆ５、又はＦ６形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘ抗ＣＤ１９二重特異的抗体を、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ＮＫ細胞株にＣＤ１９陽性腫瘍標的細胞を溶解させるその機能的能力について、リツキシマブ（抗ＣＤ２０ ＡＤＣＣ誘導抗体）、及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。

【0364】

簡単に述べると、ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６^＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中において典型的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を^５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０^６個の細胞）で標識し、次いで１／５希釈で１０^−７ｍｏｌ／Ｌから始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した（ｎ＝８濃度）。

【0365】

短時間の遠心分離及び３７℃での４時間にわたるインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、^５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）による標的細胞の溶解により得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。

【0366】

結果
上記実験の結果を図６Ａ（ＫＨＹＧ−１対Ｄａｕｄｉ）及び図６Ｂ（ＫＨＹＧ−１対Ｂ２２１）に示す。ＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ実験モデルでは、各ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質（形態Ｆ２、Ｆ３、Ｆ５及びＦ６）は、ヒトＫＨＹＧ−１ ｈＮＫｐ４６ ＮＫ細胞株によるＤａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞の特異的溶解を誘導するが、リツキシマブ及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（ＩＣ）抗体を誘導しなかった。

【0367】

実施例１０
抗ＫＩＲ３ＤＬ２二重特異的タンパク質
ヒトＫＩＲ３ＤＬ２を標的とする二重特異的タンパク質（ＫＩＲ３ＤＬ２×ＮＫｐ４６二重特異的）をＦ６形態として構築し、活性に関して試験した。ＫＩＲ３ＤＬ２（ＣＤ１５８ｋ；キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン及び長い細胞質尾部２）は、Ｐｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：５０５−５１８（この開示は参照により本明細書に組み入れられる）で説明されている約１４０ｋＤの３つのＩｇドメイン分子のジスルフィド連結ホモ二量体である。ＫＩＲ３ＤＬ２ポリペプチドに関していくつかの対立遺伝子変異体が報告されており、これらはそれぞれ用語ＫＩＲ３ＤＬ２に包含される。成熟ヒトＫＩＲ３ＤＬ２（対立遺伝子^＊００２）のアミノ酸配列をＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ５２５２０に示す。簡潔に述べると、ドナーからのＢｕｆｆｙコート由来のＮＫ細胞の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中での典型的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。ＫＩＲ３ＤＬ２を発現するＨＵＴ７８腫瘍細胞（ＣＴＣＬ）を^５１Ｃｒで標識し、次いで、１／１０希釈で１０μｇ／ｍＬ（又は１００μｇ／ｍＬ）から始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、１０：１（２５０００：２５００）に等しいエフェクター／標的比でＮＫ細胞と混合した（ｎ＝８）。アッセイは、３連においてｃＲＰＭＩ（１５０μＬ最終／ウェル）中であった。

【0368】

結果を図６Ｃに示す。この形態中のＣＤ１６に結合しないＦｃドメインにもかかわらず、ＮＫｐ４６×ＫＩＲ３ＤＬ２二重特異的タンパク質として作製したＦ６タンパク質構造は、驚くべきことに、同一の可変領域を含んでおり且つ二価でＫＩＲ３ＤＬ２に結合する既知の抗ＫＩＲ３ＤＬ２ヒトＩｇＧ１抗体と同等の標的細胞溶解能力を示した。

【0369】

実施例１１
多量体タンパク質内の鎖内ドメイン運動の効果
本発明者らは、ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質の、標的細胞のＮＫｐ４６媒介溶解を促進する能力が、ＮＫｐ４６抗原結合ドメイン及び目的の抗原と相互作用する抗原結合ドメインの一方又は両方の能力に影響を及ぼしてそれぞれの標的と相互作用することができる二重特異性タンパク質中の２つの抗原結合ドメイン間の距離に影響され得ることを理論化した。また、標的細胞のＮｋｐ４６媒介溶解が、２つの抗原結合ドメインの構造及び／又はそれぞれの高次構造、２つの抗原結合ドメインの構造の影響を受け得る運動の自由度又は柔軟性、並びに２つの抗原結合ドメインが互いに結合する方法、例えばリンカーペプチド及びこのリンカーペプチドの特定の長さ及び化学組成の影響を受け得ることもさらに理論化した。具体的には、溶解性ＮＫｐ４６標的細胞シナプスが二重特異的タンパク質のサイズ及び構造の関数として変化し得ることを理論化した。従って、本発明者らは、抗原結合ドメインが、この抗原結合ドメインがその高次構造、間隔及び柔軟性をより密接に模倣又は近似する形態である二重特異的タンパク質を仮定した。

【0370】

これは理論化されており、なぜなら、高次構造の柔軟性、特に鎖内ドメインの運動又は移動が、例えばＮＫｐ４６と目的の抗原結合部位との間の有効距離に影響を及ぼす場合があり、この有効距離は、ＮＫｐ４６標的細胞シナプス並びに多量体二重特異的タンパク質のＮＫｐ４６媒介シグナル伝達及び溶解を媒介する能力への影響を有する可能性があるからである。これらの仮定に基づいて、本発明者らは、抗原結合部位及びこれらの抗原結合部位を分離する具体的なリンカーの構造に基づいて、抗原結合ドメインのより大きい又はより小さい運動の自由度を含む様々な二重特異的タンパク質形態の多量体タンパク質の溶解機能を評価した。

【0371】

具体的には、様々な腫瘍抗原に結合する様々な形態（例えば、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０及びＦ１１形態）の様々なＮＫｐ４６×腫瘍抗原二重特異的タンパク質を、それぞれのＫＨＹＧ−１ＮＫ細胞（ＮＫｐ４６^＋ＣＤ１６⁻）による腫瘍標的細胞のＮＫｐ４６媒介溶解を誘導する能力に関して評価した。Ｆ５及びＦ６二重特異的タンパク質形態は、ＮＫｐ４６結合部位と目的の抗原結合部位との間の距離が完全長抗体の場合と比べて小さい。これに対して、Ｆ９形態でヒトＣＤ１９を標的とする二重特異的タンパク質（ＣＤ１９×ＮＫｐ４６二重特異的）は、従来の完全長抗体における２つの結合部位の距離と同様に、さらに離れている結合部位を有する。従って、二重特異的タンパク質をＦ９形態として構築し、Ｆ１０及びＦ１１形態と比較した。構造的には形態Ｆ９、Ｆ１０及びＦ１１は互いに非常に近いが、形態Ｆ１０及びＦ１１は、Ｆａｂ構造を有する１つの抗原結合ドメインと、直列型可変ドメイン構造（可撓性リンカーによって分離されている２つの可変ドメイン）を有する他の抗原結合ドメインとによって特徴付けられる。従って、Ｆ１０及びＦ１１は、Ｆ９タンパク質におけるよりも結合部位間の距離が場合により小さいだけなく、より大きい鎖内ドメインの運動及び／又はより小さい局所的立体障害を有する。

【0372】

ＣＤ１６−／ＮＫｐ４６＋ヒトＮＫ細胞株ＫＨＹＧ−１の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中における典型的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＢ２２１細胞を^５１Ｃｒ（５０μＣｉ（１．８５ＭＢｑ）／１×１０^６個の細胞）で標識し、次いで、１／５希釈で１０^−７ｍｏｌ／Ｌから始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、５０：１に等しいエフェクター／標的比でＫＨＹＧ−１と混合した（ｎ＝８濃度）。結果は、ＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞溶解の誘導において、形態Ｆ１０及びＦ１１が両方とも形態Ｆ９と比べて強力であることを示した。上述したように、Ｆ９形態タンパク質は、ＮＫｐ４６結合部位と目的の抗原結合部位との間の距離が完全長抗体と類似し、又は約８０Åであり、Ｆ１０及びＦ１１タンパク質は、可撓性リンカーによりＦｃに連結された単鎖ドメインを含み、抗原結合部位間が実質的に８０Å未満である（Ｆ１０の場合には約５５Å）。

【0373】

これに基づき、他のＣＤ１９×ＮＫｐ４６二重特異的タンパク質を使用して、ＮＫｐ４６結合ドメインと目的の抗原結合ドメインとの間のさらに短い距離の効果を試験した。この実験では、タンパク質形態Ｆ１０及びＦ１１との比較のためにＦ３、Ｆ４タンパク質形態を選択した。これらのタンパク質のそれぞれは抗原結合部位間の距離が８０Å未満であるが、Ｆ３及びＦ４はＦ１０及びＦ１１と比べて短く、Ｆ３及びＦ４は抗原結合部位間の距離がＦ１１と等しいがＦ１０の場合と比べて２５Å小さい。この実験の結果は、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ１０及びＦ１１形態がそれらのＮＫ細胞によるＤａｕｄｉ細胞溶解を誘導する能力において有意に異ならないことを示した。この結果は、効力を改善する抗原結合ドメイン間の最適な最小間隔が存在し得ること、並びに／又は効力が、抗原結合ドメイン間の間隔と抗原結合ドメインの柔軟性及び／若しくは高次構造との組み合わせの影響を受けることを示唆するであろう。

【0374】

実施例１２：
ＮＫｐ４６誘発及びＣＤ１６誘発の組み合わせ
ＮＫｐ４６−３由来の抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有するＦ５形態に係る配置を有する、ヒトＣＤ１６に結合するＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的タンパク質を、精製されたＮＫ細胞を誘導してＣＤ１９陽性Ｄａｕｄｉ腫瘍標的細胞を溶解させる機能的能力に関して、Ｆ６形態（ＣＤ１６結合を欠く）での同一の二重特異的抗体及びヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ１９抗体並びにヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較した。

【0375】

簡単に述べると、ＥＦＳ Ｂｕｆｆｙ Ｃｏａｔからの新鮮なヒト精製済ＮＫ細胞の細胞溶解活性をＵ底９６ウェルプレート中における典型的な４時間^５１Ｃｒ放出アッセイで評価した。Ｄａｕｄｉ細胞又はＨＵＴ７８細胞（ＣＤ１９を発現しない陰性対照細胞）を^５１Ｃｒで標識し、次いで、１／１０希釈で１０μｇ／ｍＬから始まる希釈範囲での試験抗体の存在下において、１０：１に等しいエフェクター／標的比でＮＫ細胞と混合した（ｎ＝８濃度）。

【0376】

短時間の遠心分離及び３７℃で４時間のインキュベーション後、５０μＬの上清を取り出して、ＬｕｍａＰｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）に移し、^５１Ｃｒの放出をＴｏｐＣｏｕｎｔ ＮＸＴベータ検出器（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で測定した。全ての実験条件を３連で分析し、特異的溶解のパーセンテージを以下のように決定した：１００×（平均ｃｐｍ実験放出−平均ｃｐｍ自然放出）／（平均ｃｐｍ総放出−平均ｃｐｍ自然放出）。総放出のパーセンテージは、２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）での標的細胞の溶解によって得られ、自然放出は、培地（エフェクターもＡｂｓも含まない）中の標的細胞に一致する。

【0377】

この実験の結果を図７に示す。Ｎ２９７置換に起因してＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６（Ｆ６形態での二重特異的タンパク質）は、完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体と同様にＤａｕｄｉ標的細胞のＮＫ細胞溶解の媒介において強力であった。この結果は、対照ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体が二価でＣＤ１９に結合することを考慮すると、さらにＣＤ１６が抗ＣＤ１９抗体に結合することから、特に注目すべきである。Ｆ６タンパク質を、Ｋａｂａｔ残基２９７でのアスパラギンを除いてＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６タンパク質と同一であるタンパク質ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６とも比較した。驚くべきことに、ＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６（Ｆ５形態タンパク質）によるＣＤ１６誘発によって媒介される強力なＮＫ活性化にもかかわらず、Ｆ５形態は、Ｄａｕｄｉ標的細胞溶解の媒介において、完全長ＩｇＧ１抗ＣＤ１９抗体又はＦ６形態二重特異的タンパク質と比べてはるかに強力であった。これは、ＣＤ１６が誘発される場合であってもＮＫｐ４６が標的細胞溶解を増強し得ることを示唆するであろう。実際に、同程度の標的細胞溶解では、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６は、完全長抗ＣＤ１９ ＩＧｇ１と比べて少なくとも１０００倍強力であった。これらの効力の結果は、本発明の多重特異的ＮＫｐ４６抗体が、例えば癌又は感染性疾患の処置において、ヒト治療での使用に十分に適しているはずであることを示唆するであろう。

【0378】

実施例１３：
ＣＤ１６結合ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的の作用機序
ＮＫｐ４６×ＣＤ１９二重特異的Ｆ５及びＦ６によるＤａｕｄｉ細胞の溶解を従来のヒトＩｇＧ１抗体と比較した。対照として、ＣＤ１９を欠くＨＵＴ７８細胞についても溶解を試験し、ＨＵＴ７８細胞溶解の陽性対照は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ＫＩＲ３ＤＬ２であった（ＨＵＴ７８はＫＩＲ３ＤＬ２陽性である）。細胞傷害アッセイを実施例１０と同様に行った。ＮＫ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー染色を実施例７と同様に行った。

【0379】

細胞傷害アッセイに関する結果を図８に示す（右側パネルにおけるＤａｕｄｉ細胞及び左側パネルにおけるＨＵＴ７８細胞）。Ｎ２９７置換に起因してＦｃドメインがＣＤ１６に結合しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、ＮＫ細胞が標的細胞と遭遇した場合にＮＫｐ４６が誘発する作用様式を有するが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３二重特異的タンパク質は、Ｄａｕｄｉ細胞への細胞傷害性の媒介ではるかに高い効力を示した。Ｆ５タンパク質もＦ６タンパク質も、ＨＵＴ７８細胞へのいかなるＮＫ細胞の細胞傷害性も媒介しなかった。

【0380】

ＮＫ細胞表面マーカーのフローサイトメトリー染色の結果は、Ｆ５タンパク質によるＮＫ細胞の表面上のＣＤ１３７の強力な上方制御を示した。この結果を図９に示す（最も左側のパネル：ＮＫ細胞対Ｄａｕｄｉ、中央のパネル：ＮＫ細胞対ＨＵＴ７８、最も右側のパネル：ＮＫ細胞のみ）。ＦｃドメインがＣＤ１６に結合するＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３が最高のＣＤ１３７上方制御を示した。ＣＤ１６に結合する完全長抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１抗体はＣＤ１３７上方制御も誘発したが、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３と比べてはるかに低かった。ＮＫｐ４６を介して機能するがＣＤ１６を介しては機能しないＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３は、いかなる検出可能なＣＤ１３７上方制御も誘発しなかった。Ｆ５形態の顕著な効力は、ＮＫｐ４６及びＣＤ１６の二重標的化によって媒介され得るＮＫ細胞上の特に強力なＣＤ１３７上方制御から生じ得ると仮定する。

【0381】

実施例１４：
Ｆｃが操作されたＣＤ１６結合ＮＫｐ４６×ＣＤ２０二重特異的
最も強力な新世代のＦｃ増強抗体を改善することができる薬剤を生成するために、新規の二重特異的タンパク質をさらに構築した。この実験では、比較抗体として市販の抗体ＧＡ１０１（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標）、Ｇａｚｙｖａｒｏ（登録商標）、オビヌツズマブ、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を選択し、これらは、低フコシル化されたＮ連結グリコシル化の結果としてＣＤ１６Ａ結合性が増強されているＦｃ改変ヒトＩｇＧ１抗体である。

【0382】

ＮＫｐ４６×ＣＤ２０二重特異的タンパク質を、ＣＤ１６結合なしのタンパク質（Ｆ６形態）として、ＣＤ１６結合ありのタンパク質（Ｆ５形態）として、又はＦ５をベースとするが重鎖のＣＨ２ドメイン中にヒトＣＤ１６Ａに対する結合親和性を増加させる２つのアミノ酸置換を含むＦｃ操作形態（「Ｆ５＋」と称する）として作製した。これらの構築物では、抗ＣＤ２０ ＡＢＤはＧＡ１０１のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌを含む。

【0383】

ＮＫｐ４６×ＣＤ２０二重特異的Ｆ５、Ｆ５＋及びＦ６抗体によるＤａｕｄｉ細胞の溶解を市販の抗体ＧＡ１０１（ＧＡＺＹＶＡ（登録商標））と比較した。細胞傷害アッセイを実施例１０と同様に行った。

【0384】

この細胞傷害アッセイの結果を図１０に示す。図１０に示すように、ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＮＫｐ４６−１二重特異的タンパク質は、ＧＡ１０１と比べてＤａｕｄｉ細胞への細胞傷害性の媒介ではるかに高い効力（ＥＣ_５０で約１０倍の増加）を示した。

【0385】

さらに、ＡＤＣＣ最適化Ｆｃを二重特異的形態（Ｆ５^＋）に使用する場合、ＧＡ１０１−Ｆ５^＋−ＮＫｐ４６−１活性におけるＮＫｐ４６の寄与を確認する、ＮＫｐ４６アームを欠くＦ５＋−ＢＳ（ＧＡ１０１−Ｆ５＋−ＩＣ；黒色の菱形）とＣＤ１６＋ＮＫｐ４６に同時に結合するＦ５＋−ＢＳ（ＧＡ１０１−Ｆ５^＋−ＮＫｐ４６−１；黒色の四角）との間での有意な差異を観測した。驚くべきことに、ＣＤ１６に対するＧＡ１０１−Ｆ５^＋−ＮＫｐ４６−１の高い親和性及び推定される最大ＮＫ細胞媒介溶解にもかかわらず、ＮＫｐ４６はそれでも細胞傷害活性の実質的なさらなる増加を誘発した。この結果は、ＣＤ１６を介してＡＤＣＣを誘導することができる薬剤を、ＮＫｐ４６に媒介される溶解を誘導する能力をこの薬剤にさらに付与することにより改善し得ること、及び二重特異的抗ＮＫｐ４６薬剤の効力を、Ｆｃ操作によりＣＤ１６への親和性を増強させることによって改善することもできることを示唆するであろう。

【0386】

様々な二重特異的形態のＦｃＲｎに対する結合性
様々な抗体形態のヒトＦｃＲＮに対する親和性を、実施例２〜６に記載されているように、組換えＦｃＲｎタンパク質をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定化することにより、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって試験した。

【0387】

完全なヒトＩｇＧ１定常領域を有するキメラ完全長抗ＣＤ１９抗体、及びＮＫｐ４６−３（Ｆ２ではＮＫｐ４６−２）からの抗ＮＫｐ４６可変ドメインを有する実施例３又は４に記載のＦ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１３、又はＦ１４形態に従った配置を有するＮＫｐ４６ｘＣＤ１９二重特異的タンパク質をそれぞれの分析物について試験し、全てのセンサーグラムを、定常状態又は１：１のＳＣＫ結合モデルを用いてフィッティングした。

【0388】

これらの実験の結果は以下の表４に示されている。二量体Ｆｃドメイン（形態Ｆ５、Ｆ６、Ｆ１３、Ｆ１４）を有する二重特異的タンパク質は、完全長ＩｇＧ１抗体の親和性と同様の親和性でＦｃＲｎに結合した。単量体Ｆｃドメイン（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ９、Ｆ１０、Ｆ１１）を有する二重特異的タンパク質もＦｃＲｎに対する結合親和性を示したが、二量体Ｆｃドメインを有する二重特異的タンパク質よりも低い結合性であった。

【0389】

【表13】

【0390】

実施例１６
Ｆｃγに対する結合性
そのような二重特異的単量体Ｆｃタンパク質がＦｃγ受容体への結合を保持し得るかどうかを評価するために、様々な二重特異的Ｆｃタンパク質を評価した。

【0391】

ＳＰＲ測定を２５℃においてＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び１０ｍＭ ＮａＯＨ、５００ｍＭ ＮａＣｌがそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。組換えヒトＦｃＲ（ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ及びＣＤ１６ｂ）をクローニングし、産生させて精製した。

【0392】

Ｆ５及びＦ６二重特異的抗体ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３又はＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層中のカルボキシル基に共有結合的に固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。二重特異的抗体を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸塩、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、８００〜９００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。

【0393】

一価親和性試験を古典的なｋｉｎｅｔｉｃ ｗｉｚａｒｄ（製造業者により推奨されている）に従って評価した。ＣＤ６４の場合には０．７〜６０ｎＭの及び他の全てのＦｃＲの場合には６０〜５０００ｎＭの範囲の可溶性分析物（ＦｃＲ）の連続希釈物を固定した二重特異的抗体全体にわたり注入し、再生の１０分前に解離させた。全てのセンサーグラムのセットを、ＣＤ６４の場合には１：１動態結合モデルを使用してフィッティングし、他の全てのＦｃＲの場合にはＳｔｅａｄｙ Ｓｔａｔｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙモデルでフィッティングした。

【0394】

この結果は、完全長野生型ヒトＩｇＧ１が全てのカニクイザル及びヒトＦｃγ受容体に結合するが、ＣＤ１９−Ｆ６−ＮＫｐ４６−３二重特異的抗体はいずれの受容体にも結合しないことを示した。一方、ＣＤ１９−Ｆ５−ＮＫｐ４６−３は、ヒト受容体ＣＤ６４（ＫＤ＝０．７ｎＭ）、ＣＤ３２ａ（ＫＤ＝８４６ｎＭ）、ＣＤ３２ｂ（ＫＤ＝１８５０ｎＭ）、ＣＤ１６ａ（ＫＤ＝１０９８ｎＭ）及びＣＤ１６ｂ（ＫＤ＝２４２６ｎＭ）のそれぞれに結合した。従来のヒト抗ＩｇＧ１抗体は、これらのＦｃ受容体への同等の結合性を有する（ＫＤを以下の表に示す）。

【0395】

【表14】

【0396】

実施例１７：
抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープマッピング
Ａ．競合アッセイ
競合アッセイを以下に記載の方法に従って表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって行った。

【0397】

ＳＰＲ測定をＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で２５℃において行った。全てのＢｉａｃｏｒｅ実験では、ＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＮａＯＨ １０ｍＭ ＮａＣｌ ５００ｍＭがそれぞれ泳動用緩衝液及び再生緩衝液としての役割を果たした。センサーグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアで分析した。抗６ｘＨｉｓ標識抗体をＱＩＡＧＥＮから購入した。ヒト６ｘＨｉｓ標識ＮＫｐ４６組換えタンパク質（ＮＫｐ４６−Ｈｉｓ）をクローニングし、産生し、且つＩｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａで精製した。

【0398】

抗Ｈｉｓ抗体をＳｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５上のデキストラン層のカルボキシル基に共有結合により固定した。チップ表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））で活性化した。プロテインＡ及び抗Ｈｉｓ抗体を結合緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、適切な固定化レベル（即ち、２０００〜２５００ＲＵ）に達するまで注入した。残りの活性化基の不活性化を、１００ｍＭエタノールアミン ｐＨ８（Ｂｉａｃｏｒｅ ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。

【0399】

ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４に一致するＮＫｐ４６結合領域を有する正常なヒトＩｇＧ１キメラ親抗体を、抗６ｘＨｉｓ標識抗体チップを用いて行われた競合試験に使用した。１μｇ／ｍＬの、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４をベースとするＮＫｐ４６結合領域を有する二重特異的抗体をプロテインＡチップで捕捉し、組換えヒトＮＫｐ４６タンパク質をＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４の群の第２の試験二重特異的抗体と共に５μｇ／ｍＬで注入した。

【0400】

結果は、ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−２、ＮＫｐ４６−３、又はＮＫｐ４６−４のいずれも、ＮＫｐ４６に対する結合について互いに競合しないことを示した。従って、これらの抗体は、それぞれ異なるＮＫｐ４６エピトープに結合するか又はそれと相互作用する。

【0401】

Ｂ．ＮＫｐ４６変異体に対する結合性
これらの抗ＮＫｐ４６抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、ＮＫｐ４６の２つのドメイン上の分子表面に露出された１つ、２つ、又は３つのアミノ酸置換によって定義されるＮＫｐ４６変異体を設計した。このアプローチにより、以下の表に示されている、Ｈｅｋ−２９３Ｔ細胞でトランスフェクトされた４２の変異体が作製された。以下の表５の標的アミノ酸変異は共に、配列番号１の付番に従って示されている（Ｊａｒｏｎ−Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８８（１２）：６１６５−７４で使用された付番にも一致している）。

【0402】

【表15】

【0403】

Ｃ．変異体の生成
ＮＫｐ４６変異体をＰＣＲによって生成した。増幅された配列をアガロースゲルにかけて、Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを用いて精製した。次いで、それぞれの変異体について生成された２つ又は３つの精製ＰＣＲ産物をＣｌｏｎＴｅｃｈ ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムで発現ベクターに連結した。変異配列を含むベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐで調製し、配列決定した。配列決定後、変異配列を含むベクターを、Ｐｒｏｍｅｇａ ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＭｉｎｉｐｒｅｐで調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いてベクターでトランスフェクトし、導入遺伝子発現の試験前にＣＯ２インキュベーターで、３７℃で２４時間インキュベートした。

【0404】

Ｄ．抗ＮＫｐ４６のＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクト細胞に対する結合性のフローサイトメトリー分析
全ての抗ＮＫｐ４６抗体を、それらのそれぞれの変異体に対する結合性についてフローサイトメトリーによって試験した。１つ又はいくつかの変異体に対する結合性を特定の濃度（１０μｇ／ｍｌ）で失う抗体を同定するために最初の実験を行った。結合性の消失を確認するために、抗体の滴定を、結合性がＮＫｐ４６変異体（１〜０，１〜０．０１〜０．００１μｇ／ｍｌ）によって影響を受けると思われる抗体を使用して行った。

【0405】

Ｅ．結果
抗体ＮＫｐ４６−１は、野生型ＮＫ４６と比較して変異体２（残基Ｋ４１、Ｅ４２及びＥ１１９で変異を有する）（ＮＫｐ４６野生型での付番）への結合が減少していた。同様に、ＮＫｐ４６−１も追加変異体Ｓｕｐｐ７（残基Ｙ１２１及びＹ１９４で変異を有する）への結合が減少していた。

【0406】

抗体ＮＫｐ４６−３は変異体１９（残基Ｉ１３５及びＳ１３６で変異を有する）への結合が減少していた。同様に、ＮＫｐ４６−１も追加変異体Ｓｕｐｐ８（残基Ｐ１３２及びＥ１３３で変異を有する）への結合が減少していた。

【0407】

抗体ＮＫｐ４６−４は変異体６（残基Ｒ１０１及びＶ１０２で変異を有する）への結合が減少していた。同様に、ＮＫｐ４６−１も、残基Ｉ１０４及びＬ１０５で変異を有する追加変異体Ｓｕｐｐ６への結合が減少していた。

【0408】

これらの方法を使用して、抗ＮＫｐ４６抗体ＮＫｐ４６−１、ＮＫｐ４６−３及びＮＫｐ４６−４のエピトープを同定した。ＮＫｐ４６−４、ＮＫｐ４６−３及びＮＫｐ４６−１のエピトープは、それぞれＮＫｐ４６ Ｄ１ドメイン、Ｄ２ドメイン及びＤ１／Ｄ２接合部上にあると決定した。Ｒ１０１、Ｖ１０２、Ｅ１０４及びＬ１０５は、ＮＫｐ４６−４結合性に必須の残基であり、ＮＫｐ４６−４エピトープの一部と定義される。ＮＫｐ４６−１エピトープのエピトープとして、Ｋ４１、Ｅ４２、Ｅ１１９、Ｙ１２１及びＹ１９４残基が挙げられる。ＮＫｐ４６−３のエピトープとして、Ｐ１３２、Ｅ１３３、Ｉ１３５及びＳ１３６残基が挙げられる。

【0409】

実施例１８：
様々な二重特異的形態の、既存の形態と比較して改善された産生プロフィール及び収率
ブリナツモマブ、並びにＦ１〜Ｆ１７形態及びＮＫｐ４６−３をベースとするＮＫｐ４６及びＣＤ１９結合領域を有する２つの二重特異的抗体、並びにブリナツモマブをそれぞれ同じプロトコルに従って且つ同じ発現系を使用して、形態６（Ｆ６）、ＤＡＲＴ（商標）形態及びＢｉＴＥ（商標）形態の下でクローニングして産生させた。Ｆ６、ＤＡＲＴ（商標）及びＢｉＴＥ（商標）二重特異的タンパク質を、Ｆ６の場合にはｐｒｏｔ−Ａビーズを使用し、ＤＡＲＴ（商標）及びＢｉＴＥ（商標）の場合にはＮｉ−ＮＴＡビーズを使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製した。精製したタンパク質をさらに分析し、ＳＥＣにより精製した。ＤＡＲＴ（商標）及びＢｉＴＥ（商標）は、Ｆ６と比較して非常に低い産生収率を示しており、精製したタンパク質は非常に複雑なＳＥＣプロフィールを有する。ＤＡＲＴ（商標）及びＢｉＴＥ（商標）は、予想されるＳＥＣ画分（ＢｉＴＥ（商標）の場合には３及び４、並びにＤＡＲＴ（商標）の場合には４及び５）でのクマーシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによってわずかに検出可能であり、Ｆ６形態は、多量体二重特異的タンパク質を含む主ピーク（画分３）を有する、明確で単純なＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを示した。Ｆ６形態の主ピークは全タンパク質の約３０％に一致する。これらの結果は、Ｆ１〜Ｆ１７タンパク質で見られるものと一致し（データは示さない）、これは、これらの形態中に存在するＦｃドメイン（又はＦｃ由来ドメイン）が産生を促進し、二重特異的タンパク質の品質及び溶解性を改善することを示す。

【0410】

さらに、タンパク質Ｆ１〜Ｆ１７中に存在するＦｃドメインは、ペプチドタグの取込みを必要とすることなくアフィニティークロマトグラフィーでの使用に適しているという利点を有する。これは、そのようなタグは望ましくない免疫原性を潜在的に誘発し得ることから治療用製品では望ましくないことから望ましい。対照的に、ＤＡＲＴ（商標）及びＢｉＴＥ（商標）抗体を、プロテインＡを使用して精製することができないが、Ｆ１〜Ｆ１７抗体全てにプロテインＡが結合する。以下の表６は、様々な形態の生産性を示す。

【0411】

【表16】

【0412】

表題及び副題は、本明細書では便宜のためにのみ使用され、本発明を限定すると決して一切解釈するべきではない。上述の要素の全ての可能なバリエーションでのあらゆる組み合わせが、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、本発明に包含される。本明細書で述べられた値の範囲は、本明細書に特段の記載がない限り、範囲内に含まれるそれぞれの別個の値について個々に述べられる省略方法の役割を単に果たすものであり、それぞれの別個の値は、本明細書で個々に述べられたかのように本明細書に包含される。特段の記載がない限り、本明細書に記載される全ての正確な値は、対応するおおよその値を代表する（例えば、特定の因子又は測定値に関して記載される全ての正確な例示的な値は、適切な場合に「約」によって変更される、対応するおおよその測定値を示すものと見なすことができる）。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に特段の記載がない限り、又は文脈から他の旨である場合を除き、任意の適切な順序で行うことができる。

【0413】

本明細書に記載されるあらゆる例又は例示的な語（例えば、「〜など」）の使用は、単に本発明をより明確にするためのものであり、特段の記載がない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明確な記載がない限り、いずれの要素も本発明の実施に不可欠であることを示すと解釈される語は本明細書には存在しない。

【0414】

語、例えば、１つ又は複数の要素を指す語を用いた、本発明の任意の態様又は実施形態の本明細書の説明は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その１つ又は複数の特定の要素「からなる」、「から実質的になる」、又は「を実質的に含む」本発明の同様の態様又は実施形態を支援するためである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書に記載される組成物は、特段の記載がない限り、又は文脈から明確に他の旨である場合を除き、その要素からなる組成物の記載でもあることを理解されたい）。

【0415】

本発明は、適用される法律によって許容される最大程度まで、本明細書に記載される態様又は請求項で述べられる主題の全ての変更形態及び均等物を含む。

【0416】

本明細書で述べられる全ての刊行物及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物又は特許出願が、参照により含められると具体的且つ個別に示されたかのように、参照によりそれらの全内容が本明細書に組み入れられる。

【0417】

前述の本発明は、理解を明確にするために例示及び例によってある程度詳細に説明されたが、当業者であれば、添付の特許請求の趣旨又は範囲から逸脱することなく、特定の変形形態及び変更形態をなし得ることが本発明の教示から明白であろう。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A-3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A-5B】

【図6A-6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]