特許 6971353 病理学的状態または生理学的状態に対するＩｎ ｖｉｔｒｏモデル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6971353

(24)【登録日】2021年11月4日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】病理学的状態または生理学的状態に対するＩｎ ｖｉｔｒｏモデル

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20211111BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20211111BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20211111BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20211111BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20211111BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20211111BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

   C12Q1/02ZNA

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 Z

   C12N5/077

   C12M1/42

【請求項の数】21

【全頁数】85

(21)【出願番号】特願2020-78194(P2020-78194)

(22)【出願日】2020年4月27日

(62)【分割の表示】特願2018-148672(P2018-148672)の分割

【原出願日】2013年4月18日

(65)【公開番号】特開2020-127412(P2020-127412A)

(43)【公開日】2020年8月27日

【審査請求日】2020年5月25日

(31)【優先権主張番号】61/635,118

(32)【優先日】2012年4月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】61/724,864

(32)【優先日】2012年11月9日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509195559

【氏名又は名称】ヘモシアー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー

【氏名又は名称原語表記】ＨｅｍｏＳｈｅａｒ， ＬＬＣ

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(72)【発明者】

【氏名】ブレット・アール・ブラックマン

(72)【発明者】

【氏名】ブライアン・アール・ワムホフ

(72)【発明者】

【氏名】アジット・ダッシュ

(72)【発明者】

【氏名】マイケル・ビー・シマーズ

(72)【発明者】

【氏名】ライアン・イー・フィーバー

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５１５４５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５０３１６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５０３５８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５１３６３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０２３４２０７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY，2010年，Vol.79, No.7，p.1036 - 1044

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｑ １／００−１／７０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで、肝臓の病理学的状態をモデル化する方法であって、前記方法が、
培養培地および少なくとも１つの因子を、細胞培養容器へと加えること、ここで、前記細胞培養容器は、前記細胞培養容器内に位置し、前記細胞培養容器を第一の層および第二の層に分離する多孔膜を含み、ここで、前記多孔膜は、前記多孔膜の表面に少なくとも一つの細胞外マトリクス成分を含み、ここで、前記表面は前記細胞培養容器の第一の層に面している；
前記病理学的状態を有する少なくとも１つの対象から単離された肝細胞を、前記細胞培養容器の第一の層に面した前記多孔膜の表面上の、前記少なくとも一つの細胞外マトリクス成分上にプレーティングすること、；および、
前記細胞培養容器の第二の層における培養培地の流れを導入することにより、プレーティングされた肝細胞に間接的にせん断力を適用すること、ここで、前記流れは、前記肝細胞が前記病理学的状態でｉｎ ｖｉｖｏにおいて曝される流れをモデル化する、
を含む、方法。

【請求項2】

前記肝細胞が、前記病理学的状態を有する少なくとも１つの対象から単離された初代肝細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記表面が前記多孔膜の第一の表面であり；
前記多孔膜が第二の表面を含み、前記第二の表面が前記細胞培養容器の第二の層に面しており；および
前記流れが前記多孔膜の前記第二の表面に前記せん断力を適用する、
請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞外マトリクス成分がコラーゲンを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記表面が前記多孔膜の第一の表面であり、前記方法が前記多孔膜の第二の表面に非実質性肝臓細胞をプレーティングすることをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記非実質性肝臓細胞が、類洞内皮細胞、肝臓星細胞、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記表面が前記多孔膜の第一の表面であり、前記方法が前記多孔膜の第二の表面にマクロファージをプレーティングすることをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記因子が、グルコースを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記因子が、インスリンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記因子が、脂肪酸を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記因子が、ＴＮＦαを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記培養培地内の前記因子の濃度が、前記病理学的状態で見られる、前記因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記培養培地内の前記因子の濃度が、薬物または化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与から得られる前記因子の濃度範囲内である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記培養培地内の前記因子の濃度が、前記せん断力の下、一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された病理学的状態を維持することができるが、同濃度の因子は、前記せん断力が無い場合には、前記一定期間、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された病理学的状態を維持することができないものである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記せん断力が約０．１ダイン／ｃｍ^２〜約３．０ダイン／ｃｍ^２のせん断率で適用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記せん断力が約０．２ダイン／ｃｍ^２〜約２．５ダイン／ｃｍ^２のせん断率で適用される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記肝臓の病理学的状態に対する効果について、薬物または化合物を検証することをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記表面は前記多孔膜の第一の表面であり、前記肝臓の病理学的状態に対する効果についての薬物または化合物の検証は：
前記培養培地に薬物または化合物を添加すること；および、
前記第二の層における前記培養培地の流れを介して、前記多孔膜の第二の表面に前記せん断力を適用すること、を含み；
ここで、前記薬物または前記化合物の存在下での、前記肝細胞における変化は、前記薬物または前記化合物が、前記肝臓の病理学的状態に対する効果を有していることを示す、方法。

【請求項18】

前記肝臓の病理学的状態に対する効果について、薬物または化合物を検証することをさらに含む、請求項５〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記肝臓の病理学的状態に対する効果についての薬物または化合物の検証は：
前記培養培地に薬物または化合物を添加すること；および、
前記第二の層における前記培養培地の流れを介して、前記膜の第二の表面にプレーティングされた前記非実質性肝臓細胞に前記せん断力を適用すること、を含み；
ここで、前記薬物または前記化合物の存在下での、前記非実質性肝臓細胞における変化は、前記薬物または前記化合物が、前記肝臓の病理学的状態に対する効果を有していることを示す、方法。

【請求項19】

前記非実質性肝臓細胞が、肝臓星細胞を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記培養培地中の前記薬物または前記化合物の濃度が、ｉｎ ｖｉｖｏで前記肝臓の前記病理学的状態に効果が得られる薬物または化合物の濃度範囲内である、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記培養培地中の前記薬物または前記化合物の濃度が、前記薬物または前記化合物に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療Ｃ_ｍａｘの濃度範囲内である、請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は概して、ｉｎ ｖｉｖｏの病理学的状態または生理学的状態を模倣するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する。本発明はまた、そのようなシステムにおいて薬物または化合物を検証するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

病理学的状態または生理学的状態の従来的なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルには通常、静的な状態（ｓｔａｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の下で１以上の細胞型を培養することが含まれる。しかしながら、そのようなモデルには多くの場合、当該病理学的状態または生理学的状態においてｉｎ ｖｉｖｏで見られるよりもずっと高い濃度で１以上の因子を添加することが必要とされる。たとえば、静的な組織培養において肝細胞を維持するためには、健常な個々において、ｉｎ ｖｉｖｏで見られる濃度よりも著しく高い濃度で、当該培養培地にインスリンおよびグルコース（グルコースに対してはおよそ２〜４倍高い濃度、インスリンに対しては、約１０，０００倍〜４０，０００倍高い濃度）を添加しなければならない。同様に、血栓症をモデル化するために用いられている内皮細胞の従来的な静的単一培養においては、ヒト循環血液において見られるものと比較して高いレベルのＴＮＦαが、フィブリン沈着の誘導に必要となる。

【0003】

さらに、従来的なシステムは多くの場合、ｉｎ ｖｉｖｏでは反応を誘導する濃度の薬物または化合物に対して反応を示さず、同じ反応を誘導するためには、かなり高い濃度の薬物または化合物が必要となる。

【発明の概要】

【0004】

本発明の１つの態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで病理学的状態を模倣する方法を目的とする。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、当該培養培地に少なくとも１つの因子を添加すること、当該細胞培養容器内の少なくとも１つの面に、少なくとも１つの細胞型をプレーティングすること、および、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該せん断力は、フローデバイスにより生じた当該培養培地の流れによって生じる。当該流れは、当該少なくとも１つの細胞型が、病理学的状態でｉｎ ｖｉｖｏにおいて曝される流れを模倣する。当該培養培地中の当該因子の濃度は、当該病理学的状態で見られる、当該因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内であっても良い。あるいは、当該培養培地中の当該因子の濃度は、薬物または化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与から得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。

【0005】

本発明の他の態様は、病理学的状態に対する効果について、薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。当該方法には、病理学的状態を模倣すること、当該培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、当該薬物または当該化合物に曝された、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用することを含む。当該薬物または当該化合物の存在下での、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型における変化は、当該病理学的状態に対する効果を、当該薬物または当該化合物を有しているということを示唆する。このｉｎ ｖｉｔｒｏの薬物または化合物の検証方法において、当該病理学的状態は、上述の、病理学的状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣する方法により、模倣されても良い。

【0006】

また、本発明により、効果について薬物または化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検証する方法が提示される。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、前記細胞培養容器内の少なくとも１つの面に少なくとも１つの細胞型をプレーティングすること、当該培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、前記薬物または化合物に曝された当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該培養培地中の当該薬物または当該化合物の濃度は、ｉｎ ｖｉｖｏでの効果が得られる当該薬物または当該化合物の濃度範囲内である。当該せん断力は、フローデバイスにより誘導される当該培養培地の流れから生じる。当該流れは、当該少なくとも１つの細胞型がｉｎ ｖｉｖｏで曝される流れを模倣する。当該薬物または当該化合物の存在下での、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型における変化は、当該薬物または当該化合物が効果を有していることを示唆する。たとえば、当該効果は、生理学的状態に対する効果、または病理学的状態に対する効果であっても良い。

【0007】

本発明の他の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生理学的状態を模倣する方法である。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、当該培養培地に少なくとも１つの因子を添加すること、当該細胞培養容器内の少なくとも１つの面に、少なくとも１つの細胞型をプレーティングすること、および、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該せん断力は、フローデバイスにより生じた当該培養培地の流れによって生じる。当該流れは、当該少なくとも１つの細胞型が、生理学的状態でｉｎ ｖｉｖｏにおいて曝される流れを模倣する。当該培養培地中の当該因子の濃度は、当該生理学的状態で見られる、当該因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内であっても良い。あるいは、当該培養培地中の当該因子の濃度は、薬物または化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与から得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。

【0008】

また、本発明は、生理学的状態に対する効果について、薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。当該方法には、病理学的状態を模倣すること、当該培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、当該薬物または当該化合物に曝された、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用することを含む。当該薬物または当該化合物の存在下での、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型における変化は、当該生理学的状態に対する効果を、当該薬物または当該化合物を有しているということを示唆する。このｉｎ ｖｉｔｒｏの薬物または化合物の検証方法において、当該生理学的状態は、上述の、生理学的状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣する方法により、模倣されても良い。

【0009】

本発明の他の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓の病理学的状態または生理学的状態を模倣する方法である。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、当該培養培地に少なくとも１つの因子を添加すること、当該細胞培養容器内の少なくとも１つの面に、少なくとも１つの肝臓細胞型をプレーティングすること、および、当該少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該せん断力は、フローデバイスにより誘導された当該培養培地の流れによって生じる。当該流れは、当該少なくとも１つの肝臓細胞型が、病理学的状態または生理学的状態でｉｎ ｖｉｖｏにおいて曝される流れを模倣する。当該病理学的状態を模倣するための当該培養培地中の当該因子の濃度は、当該病理学的状態で見られる、当該因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内であっても良い。あるいは、当該培養培地中の当該因子の濃度は、薬物または化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与から得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。さらに別の態様として、当該培養培地中の当該因子の濃度は、当該せん断力の下、一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された病理学的状態を維持することができるが、同濃度の因子は、当該せん断力が無い場合には、当該一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された当該病理学的状態を維持することができないものであっても良い。当該生理学的状態を模倣するための、当該培養培地中の当該因子の濃度は、当該生理学的状態で見られる、当該因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内であっても良い。あるいは、当該培養培地中の当該因子の濃度は、薬物または化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与から得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。さらに別の態様として、当該培養培地中の当該因子の濃度は、当該せん断力の下、一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された生理学的状態を維持することができるが、同濃度の因子は、当該せん断力が無い場合には、当該一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された当該生理学的状態を維持することができないものであっても良い。

【0010】

また、本発明により、病理学的状態または生理学的状態に対する効果について、薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法が提示される。当該方法には、病理学的状態または生理学的状態を模倣すること、当該培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、当該薬物または当該化合物に曝された、当該少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型にせん断力を適用することを含む。当該薬物または当該化合物の存在下での、当該少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型における変化は、当該病理学的状態または生理学的状態に対する効果を、当該薬物または当該化合物を有しているということを示唆する。このｉｎ ｖｉｔｒｏの薬物または化合物の検証方法において、当該病理学的状態は、すぐ上の項において記述される、病理学的状態または生理学的状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣する方法により、模倣されても良い。

【0011】

本発明の他の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、肝臓の病理学的状態または生理学的状態を模倣する方法を目的とする。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、当該細胞培養容器内の面に、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を配置させること、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞外マトリクス成分に肝細胞をプレーティングすること、および、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞外マトリクス成分および当該肝細胞にせん断力を間接的に適用すること、が含まれる。当該せん断力は、フローデバイスにより生じた当該培養培地の流れによって生じる。当該流れは、当該肝細胞が、病理学的状態または生理学的状態でｉｎ ｖｉｖｏにおいて曝される流れを模倣する。

【0012】

また、本発明により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、肝臓の病理学的状態または生理学的状態を模倣する他の方法が提示される。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、多孔膜の第一の面に肝細胞をプレーティングすること、が含まれる。当該多孔膜は、当該第一の面が、当該容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該容器内で、下層には当該肝細胞が含まれ、上層には当該多孔膜の第二の面が含まれるよう規定される。せん断力は、当該容器の当該上層の当該多孔膜の当該第二の面に適用され、当該せん断力は、フローデバイスにより生じた当該培養培地の流れから生じたものである。当該流れは、当該肝細胞が当該病理学的状態または生理学的状態においてｉｎ ｖｉｖｏで曝される流れを模倣する。当該フローデバイスは、当該容器の当該上層の当該培養培地中に位置づけられるために適合されたボディおよび、当該ボディを回転させるために適合されたモーターを含有する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】図１Ａは、静的な培養状態の下で行われた血栓形成アッセイに対する例示的なプロトコールを示す。

【図1B】図１Ｂおよび１Ｃは、静的な培養状態の下で行われた血栓形成アッセイから得られた例示的な蛍光顕微鏡の結果を示す。

【図1C】同上。

【図2A】図２Ａは、内皮細胞と平滑筋細胞を共培養するための、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）またはアテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）な、血流力学的な流れの適用に対する例示的なプロトコールを図示する。

【図2B】図２Ｂは、アテローム易発性またはアテローム保護的な血流力学的な流れの状態の下で増殖された、内皮細胞および平滑筋細胞における血栓形成に関する遺伝子の、例示的な遺伝子発現ヒートマップを示す。

【図3A】図３Ａは、血流力学的な培養条件の下で行われた、血栓形成アッセイに対する例示的なプロトコールを示す。

【図3B】図３Ｂは、血流力学的な培養条件の下で行われた、血栓形成アッセイから得られた例示的な蛍光顕微鏡の結果を示す。

【図4A】図４Ａは、血流力学的な培養条件の下で、血栓形成の間、継続的にせん断応力を適用させながら行われた、血栓形成アッセイに対する例示的なプロトコールを示す。

【図4B】図４Ｂは、血流力学的な培養条件の下で、血栓形成の間、継続的にせん断応力を適用させながら行われた、血栓形成アッセイから得られた例示的な蛍光顕微鏡の結果を示す。

【図5】図５は、内皮細胞と平滑筋細胞の共培養が、血流力学的な前処理に供され、次いで、１以上の因子で処理されるアッセイに対するプロトコールを示す。

【図6A】図６Ａ〜Ｆは、ｏｘＬＤＬを用いたアッセイに対する例示的な遺伝子発現データを図示する。

【図6B】同上。

【図6C】同上。

【図6D】同上。

【図6E】同上。

【図6F】同上。

【図7A】図７Ａ〜Ｅは、ｏｘＬＤＬに対する反応における、遺伝子発現の変化を図示する。

【図7B】同上。

【図7C】同上。

【図7D】同上。

【図7E】同上。

【図8】図８は、ｏｘＬＤＬに対する反応におけるＮＦκＢ活性を示す例示的なデータを図示する。

【図9】図９は、ｏｘＬＤＬで処理された細胞に対する、例示的な差次的遺伝子制御データを示す。

【図10】図１０は、ＴＮＦαに対する反応にける遺伝子発現を示す例示的なデータを示す。

【図11】図１１Ａ〜Ｂは、ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦαでの処理に対する反応における例示的な遺伝子発現データを示す。

【図12A】図１２Ａ〜Ｃは、グルコースおよびＴＮＦαでの処理に対する反応における炎症性シグナル伝達に関与する遺伝子発現の変化およびＮＦκＢ活性を示す例示的なデータを示す。

【図12B】同上。

【図12C】同上。

【図13A】図１３Ａ〜Ｂは、血流力学的な状態の下、アンギオテンシンＩＩで処理された、内皮細胞および平滑筋細胞に対する例示的な遺伝子アレイデータを示す。

【図13B】同上。

【図14A】図１４Ａ〜Ｂは、血流力学的な状態の下、アルドステロンで処理された、内皮細胞および平滑筋細胞に対する例示的な遺伝子アレイデータを示す。

【図14B】同上。

【図15A】図１５Ａは、肝洞様毛細血管の概略図である。

【図15B】図１５Ｂは、肝細胞への間接的なせん断力の適用およびコーンアンドプレートデバイス（ｃｏｎｅ−ａｎｄ−ｐｌａｔｅ ｄｅｖｉｃｅ）を図示する。

【図15C】図１５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ肝モデルにおける、肝細胞の配置構造を図示する。

【図16A】図１６Ａ〜Ｆは、静的な状態の下、または管理された血流力学的状態の存在下で培養された肝細胞の例示的な蛍光顕微鏡像である。

【図16B】同上。

【図16C】同上。

【図16D】同上。

【図16E】同上。

【図16F】同上。

【図17】図１７Ａは、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の例示的な蛍光顕微鏡像である。図１７Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏの肝臓の例示的な蛍光顕微鏡像である。図１７Ｃは、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の例示的な透過型電子顕微鏡像を示す。

【図18】図１８Ａ〜Ｂは、静的な状態の下、または管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞における、尿素およびアルブミン分泌の例示的なデータを示す。

【図19】図１９Ａ〜Ｄは、静的な状態の下、または管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の例示的な代謝遺伝子発現データを示す。

【図20】図２０Ａ〜Ｂは、静的な状態の下、または管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の例示的なチトクロームｐ４５０活性のデータを示す。図２０Ｃは、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の肝細胞におけるトランスポーター活性に対するアッセイから得られた例示的な蛍光顕微鏡像である。

【図21】図２１は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ脂肪性肝モデルに対する、例示的な遺伝子発現データを示す。

【図22】図２２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ脂肪性肝モデルに対する、例示的な遺伝子発現データを示す。

【図23】図２３は、細胞培養ディッシ上に取り付けられ、上層と下層を灌流させるための流入管および流出管を固定するクリップの透視図である。

【図24】図２４は、細胞培養容器内の内皮細胞および平滑筋細胞の代表的な配置構造を示す。

【図25】図２５Ａ〜Ｂは、脂肪性肝疾患を模倣する状態、または健常な状態の下で培養された肝細胞の代表的な蛍光顕微鏡像を示す。

【図26】図２６は、高グルコース／高インスリン状態の下で培養されたラット肝細胞の透過型電子顕微鏡像を示す。

【図27】図２７Ａ〜Ｂは、脂肪性肝疾患を模倣する状態、または健常な状態の下で培養された肝細胞における、総脂質および総トリグリセリドを測定したアッセイから得られた代表的な結果を示す。

【図28】図２８Ａ〜Ｂは、脂肪性肝疾患を模倣する状態、または健常な状態の下で培養された肝細胞の例示的な遺伝子発現データを示す。

【図29】図２９Ａ〜Ｂは、脂肪性肝疾患を模倣する状態、または健常な状態の下で培養された肝細胞の例示的な代謝遺伝子発現およびチトクロームｐ４５０活性のデータを提示する。

【図30】図３０Ａ〜Ｃは、ピオグリタゾンの存在下または非存在下で、脂肪性肝疾患を模倣する状態、または健常な状態の下で培養された肝細胞から得られた、例示的な蛍光顕微鏡像を示す。

【図31】図３１は、ピオグリタゾンの存在下または非存在下で、脂肪性肝疾患を模倣する状態、または健常な状態の下で培養された肝細胞における、総トリグリセリドの測定アッセイから得られた例示的な結果を提示する。

【図32】図３２は、ピオグリタゾンの存在下または非存在下で、脂肪性肝疾患を模倣する状態、または健常な状態の下で培養された肝細胞の例示的な代謝遺伝子発現データを提示する。

【図33】図３３は、フェノバルビタールまたはリファンピシンの存在下で、管理された血流力学的状態または静的状態の下で培養された肝細胞の例示的なチトクローム活性データを示す。

【図34】図３４Ａは、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏ血漿Ｃ_ｍａｘ濃度でのクロルプロマジンへの毒性反応を示す例示的な蛍光顕微鏡像を提示される。図３４Ｂは、管理された血流力学的状態または静的な状態の下で培養され、様々な濃度のクロルプロマジンに曝された肝細胞の、用量応答性毒性を示す例示的なデータを提示する。

【図35】図３５は、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞における、クロルプロマジンに対する反応における、酸化ストレス関連毒性遺伝子（図３５Ａ）および代謝遺伝子（図３５Ｂ）の上方制御を示す例示的なデータを提示する。

【図36】図３６は、クロルプロマジンに対する反応における、管理された血流力学的状態または静的な状態の下で培養された肝細胞の、ｍｉＲＮＡ１２２のリリースにより測定された、例示的な急性毒性データを示す。

【図37】図３７は、トログリタゾンでの処理に対する反応における、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の、亜致死的毒性および胆汁うっ滞変化を示す例示的な蛍光顕微鏡像を提示する。

【図38】図３８は、トログリタゾンでの処理に対する反応における、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞の、酸化ストレス関連遺伝子ならびにＭＲＰ３遺伝子およびＭＲＰ４遺伝子の上方制御を示す例示的なデータを示す。

【図39】図３９Ａは、管理された血流力学的状態の下で培養されたイヌ肝細胞における、分極形態の保持を示す、例示的な蛍光顕微鏡像を示す。図３９Ｂは、管理された血流力学的状態または静的な状態の下で培養されたイヌ肝細胞における、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ１の発現を示す、例示的な遺伝子発現データを示す。

【図40】図４０は、管理された血流力学的状態の下で培養された人工多分化能幹細胞（ｉＰＳＣ）から誘導された肝細胞における、分極形態の保持を示す、例示的な蛍光顕微鏡像を提示する。

【図41】図４１は、管理された血流力学状態の下で培養された、ｉＰＳＣ由来肝細胞における、代謝遺伝子および分化遺伝子の発現を示す例示的な遺伝子発現データを示す。

【0014】

対応する参照文字は、図面全体を通して、対応する部分を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明により、病理学的状態または生理学的状態を模倣するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ法が提示される。医薬品業界および生物医薬品業界により、標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして現在用いられている静的なモデルとは異なり、本発明の方法は、培養細胞にせん断力を適用し、様々な因子のｉｎ ｖｉｖｏでの病理学的な濃度または生理学的な濃度を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏの病理学的な状態または生理学的な状態を再現するものである。たとえば、ｉｎ ｖｉｔｒｏの肝モデルにおいて、肝細胞がインスリンおよびグルコースのｉｎ ｖｉｖｏの生理学的な濃度（標準的な静的モデルにおいて用いられていた濃度と比較して大幅に低い）で維持できることが判明している。さらに、より高いインスリン濃度およびグルコース濃度をそのようなモデルで用いた場合、肝細胞は、脂肪性肝疾患の多くの顕著な特徴を示すことも判明している。

【0016】

本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで病理学的な状態を模倣する方法を目的とする。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、当該培養培地に少なくとも１つの因子を添加すること、当該細胞培養容器内の少なくとも１つの面に少なくとも１つの細胞型をプレーティングすること、および、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該せん断力はフローデバイスにより生じた培養培地の流れから生じる。当該流れは、病理学的状態において、ｉｎ ｖｉｖｏで当該少なくとも１つの細胞型が曝される流れを模倣している。

【0017】

培養培地中の因子の濃度は、病理学的状態において見られる当該因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内であっても良い。あるいは、当該培養培地の当該因子の濃度は、薬物または化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与から得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。

【0018】

ｉｎ ｖｉｖｏ病理学的状態が模倣されていることを確認するために、病理学的状態のマーカーのレベルにおける変化を、本発明の方法と、せん断力を適用しない同方法との間で比較しても良い。せん断力の適用下での、当該培養培地中のマーカーのレベル、または当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型におけるマーカーのレベルを、せん断力を適用していない当該培養培地中のマーカーのレベル、または当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型のマーカーのレベルと比較する。たとえば、もしマーカーが病理学的状態と関連していることが知られており、および、当該状態がｉｎ ｖｉｖｏで存在する際にそのマーカー濃度が血清中で増加することが知られている場合、せん断力を適用した本発明の方法の培養培地における当該マーカーのレベルが、せん断力を適用しない場合の培養培地中のマーカーのレベルと比較して増加していれば、当該ｉｎ ｖｉｖｏの病理学的状態が、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ法により模倣されていることが裏付けられる。

【0019】

病理学的状態、当該病理学的状態に対する効果、生理学的状態、フローデバイス、血流力学的パターン、細胞型、および細胞培養培地（本発明の方法における使用のために当該細胞培養培地に添加される因子を含有する）が以下に詳述され、次いで、本発明の様々な方法が記述される。

【0020】

本発明はまた、病理学的状態に対する効果について、薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を目的とする。当該方法には、病理学的状態を模倣すること、当該培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、当該または当該化合物に曝された少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該薬物または化合物の存在下での、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型における変化は、当該薬物または化合物が、当該病理学的状態に対する効果を有することを示す。

【0021】

薬物または化合物を検証するこのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、病理学的状態は、上述の病理学的状態を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法により模倣されても良い。

【0022】

また、薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法の病理学的状態は、当該病理学的状態を有する対象（複数含む）由来の初代細胞または不死化細胞をプレーティングすること、および細胞培養培地中で当該細胞を培養すること、により模倣されても良い。

【0023】

本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生理学的状態を模倣する方法も目的とする。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、当該培養培地に少なくとも１つの因子を添加すること、当該細胞培養容器内の少なくとも１つの面に少なくとも１つの細胞型をプレーティングすること、および、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該せん断力は、フローデバイスにより生じた当該培養培地の流れから生じる。当該流れは、当該生理学的状態において当該少なくとも１つの細胞型が曝される流れを模倣する。

【0024】

培養培地中の因子の濃度は、生理学的状態において見られる当該因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内であっても良い。あるいは、当該培養培地の当該因子の濃度は、薬物または化合物のｉｎ ｖｉｖｏ投与から得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。

【0025】

ｉｎ ｖｉｖｏの生理学的状態が模倣されていることを確認するために、生理学的状態のマーカーのレベル変化を、本発明の方法と、せん断力を適用しない同方法との間で比較しても良い。せん断力の適用下での、当該培養培地中のマーカーのレベル、または当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型におけるマーカーのレベルを、せん断力を適用していない当該培養培地中のマーカーのレベル、または当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型のマーカーのレベルと比較する。たとえば、もしマーカーが生理学的状態と関連していることが知られており、および、当該状態がｉｎ ｖｉｖｏで存在する際にそのマーカー濃度が血清中で増加することが知られている場合、せん断力を適用した本発明の方法の培養培地における当該マーカーのレベルが、せん断力を適用しない場合の培養培地中のマーカーのレベルと比較して増加していれば、当該ｉｎ ｖｉｖｏの生理学的状態が、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ法により模倣されていることが裏付けられる。

【0026】

本発明はまた、生理学的状態に対する効果について、薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を目的とする。当該方法には、生理学的状態を模倣すること、当該培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、当該または当該化合物に曝された少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該薬物または化合物の存在下での、当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型における変化は、当該薬物または化合物が、当該生理学的状態に対する効果を有することを示す。

【0027】

薬物または化合物を検証するこのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、生理学的状態は、上述の生理学的状態を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法により模倣されても良い。

【0028】

また、薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの本方法の生理学的状態は、初代細胞または不死化細胞をプレーティングすること、当該細胞を細胞培養培地中で培養することにより模倣されても良い。当該初代細胞または不死化細胞は以下に詳述される。

【0029】

本発明はまた、効果について薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に関する。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、少なくとも１つの細胞型を当該細胞培養容器内の少なくとも１つの面にプレーティングすること、当該培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、当該薬物または当該化合物に曝された当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該培養培地当該薬物または化合物の濃度は、ｉｎ ｖｉｖｏで当該効果を得られる当該薬物または化合物の濃度範囲内である。当該せん断力は、フローデバイスにより生じた当該培養培地の流れから生じる。当該流れは、ｉｎ ｖｉｖｏで当該少なくとも１つの細胞型が曝される流れを模倣する。当該薬物または化合物の存在下での当該少なくとも１つのプレーティングされた細胞型における変化は、当該薬物または化合物が当該効果を有していることを示す。

【0030】

当該効果は、病理学的状態に対する効果であっても良い。あるいは、当該効果は生理学的状態に対する効果であっても良い。さらに、以下に効果について詳述する。

【0031】

本発明の任意の方法において、当該方法にはさらに、サイトカイン分泌、ケモカイン分泌、液性因子分泌、微粒子分泌、増殖因子分泌、細胞表面からのタンパク質の脱落、化合物の代謝物、免疫細胞、一酸化窒素分泌、血管拡張タンパク質、血管収縮タンパク質、ｍｉＲＮＡ、分泌タンパク質、または分泌された生物学的物質について、細胞培養培地を分析することが含まれる。当該細胞培養培地は、硝酸塩または亜硝酸塩濃度の測定により、一酸化窒素の分泌について分析されても良い。

【0032】

当該細胞培養培地が、細胞表面からのタンパク質の脱落について分析される場合、当該タンパク質には、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）、Ｅ−セレクチン、または細胞内接着分子（ＩＣＡＭ）が含まれうる。

【0033】

本発明の任意の方法において、当該細胞型（複数含む）を培養する工程が当該方法にさらに含まれても良い。

【0034】

薬物または化合物が培養培地に添加される場合の本発明の任意の方法において、当該方法は、当該細胞型の内の少なくとも１つに対する当該薬物または当該化合物の効果を測定するために、当該培地が当該薬物または当該化合物を含まない一定期間、当該せん断力を適用した後に、当該細胞型の内の少なくとも１つに対する当該薬物または当該化合物を当該培地が含む一定期間、当該せん断力を適用した後で、当該細胞型の内の少なくとも１つを比較する工程をさらに含んでも良い。

【0035】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 肝モデル
薬物または化合物が、健常な肝臓に対する効果について検証される場合、因子にはインスリンおよびグルコースが含まれ、肝細胞は細胞培養容器内の面におかれ、およびせん断力は当該プレーティングされた肝細胞に間接的に適用される。

【0036】

たとえば、肝細胞は、多孔膜の第一の面にプレーティングされても良い。次いで、当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、上層および下層が規定される。下層には肝細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれる。せん断力は、容器の上層の多孔膜の第二の面に適用される。

【0037】

本発明の任意の方法において、細胞をプレーティングすることにおいては、細胞培養容器内に吊るされた多孔膜の使用が好ましい。せん断力が、プレーティングされた細胞または多孔膜の面に適用される場合（たとえば、せん断力が、プレーティングされた細胞の無い膜の面に適用される場合）、当該せん断力は、上層から下層へ細胞培養培地を灌流することができる。そのような灌流により、上層から下層への（逆もまた然り）因子の移転に好ましい影響を与える。

【0038】

本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓の生理学的状態または病理学的状態を模倣する方法を目的とする。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、少なくとも１つの因子を当該培養培地に添加すること、少なくとも１つの肝臓細胞型を当該細胞培養容器内の少なくとも１つの面にプレーティングすること、および、当該少なくとも１つのプレーティングされた肝細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。せん断力は、フローデバイスにより生じた当該培養培地の流れから生じる。当該流れは、病理学的状態または生理学的状態において、当該少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型がｉｎ ｖｉｖｏで曝される流れを模倣する。

【0039】

本方法において、病理学的状態を模倣するための培養培地中の因子の濃度は、当該病理学的状態において見られる因子のｉｎ ｖｉｖｏの濃度範囲内であっても良い。あるいは、本方法において、病理学的状態を模倣するための培養培地中の因子の濃度は、薬物または化合物の投与からｉｎ ｖｉｖｏで得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。さらに、本方法において、病理学的状態を模倣するための培養培地中の因子の濃度は、当該せん断力の下、一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された病理学的状態を維持することができるが、同濃度の因子は、当該せん断力が無い場合には、当該一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された当該病理学的状態を維持することができないものであっても良い。

【0040】

本方法において、生理学的状態を模倣するための培養培地中の因子の濃度は、当該生理学的状態において見られる因子のｉｎ ｖｉｖｏの濃度範囲内であっても良い。あるいは、本方法において、生理学的状態を模倣するための培養培地中の因子の濃度は、薬物または化合物の投与からｉｎ ｖｉｖｏで得られる当該因子の濃度範囲内であっても良い。さらに、本方法において、生理学的状態を模倣するための培養培地中の因子の濃度は、当該せん断力の下、一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された生理学的状態を維持することができるが、同濃度の因子は、当該せん断力が無い場合には、当該一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣された当該生理学的状態を維持することができないものであっても良い。

【0041】

本方法において、せん断力の適用が無い場合の少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型もしくは培養培地中のマーカーレベルと比較した、せん断力が適用された状態の当該少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型もしくは当該培養培地における病理学的状態または生理学的状態の当該マーカーレベルにおける変化により、当該病理学的状態または生理学的状態の模倣を裏付けられる。

【0042】

あるいは、本方法において、当該少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型には、肝細胞が含まれ、および、当該肝細胞におけるグルカゴン、インスリンまたはグルコース基質に対する反応性は、当該生理学的状態の模倣を裏付ける。グルコース基質はたとえば、グリセロール、乳酸塩、ピルビン酸塩、またはそれらの組み合わせ（たとえば、乳酸塩とピルビン酸塩の組み合わせ等）であっても良い。

【0043】

本発明はまた、病理学的状態または生理学的状態に対する効果について薬物または化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検証する方法も目的とする。当該方法には、病理学的状態または生理学的状態を模倣すること、培養培地に薬物または化合物を添加すること、および、当該薬物または化合物に曝された、少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型にせん断力を適用すること、が含まれる。当該薬物または化合物の存在下での、当該少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型における変化は、当該薬物または化合物が当該病理学的状態または生理学的状態に対する効果を有していることを示す。

【0044】

薬物または化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検証する本方法において、当該病理学的状態は、上述の病理学的状態または生理学的状態を模倣するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法により模倣されても良い。

【0045】

薬物または化合物を検証するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法の病理学的状態または生理学的状態はまた、当該病理学的状態を有する対象（複数含む）から得た初代細胞または不死化細胞をプレーティングすること、および細胞培養培地中で当該細胞を培養すること、により模倣されても良い。

【0046】

本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓の病理学的状態または生理学的状態を模倣する方法も目的とする。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、当該細胞培養容器内の面に少なくとも１つの細胞外マトリクス成分を配置させること、当該少なくとも１つの細胞外マトリクス成分に肝細胞をプレーティングすること、および、当該少なくとも１つの細胞外マトリクス成分および肝細胞にせん断力を適用すること、が含まれる。当該せん断力はフローデバイスにより生じた当該培養培地の流れから生じる。当該流れは、当該肝細胞が当該病理学的状態または生理学的状態においてｉｎ ｖｉｖｏで曝される流れを模倣する。

【0047】

肝臓細胞が多孔膜にプレーティングされる場合の本発明の方法において、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分が、当該多孔膜の第一の面にプレーティングされても良く、および、次いで、当該少なくとも１つの細胞外マトリクス成分に当該肝臓細胞がプレーティングされても良い。任意選択的に、非実質性肝臓細胞（たとえば、類洞内皮細胞等）が、当該多孔膜の第二の面にプレーティングされても良く、および、せん断力が、当該非実質性肝臓細胞に適用されても良い。

【0048】

細胞外マトリクスの配置を含む本発明の方法において、たとえば、少なくとも１つの細胞外マトリクス成分が、多孔膜の第一の面に配置されても良い。肝臓細胞型（たとえば、肝細胞）を、次いで、当該少なくとも１つの細胞外マトリクス成分にプレーティングする。当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、上層および下層が規定される。下層には少なくとも１つの細胞外マトリクス成分および当該肝臓細胞型（たとえば、肝細胞）が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれる。せん断力は、容器の上層の多孔膜の第二の面に適用される。任意選択的に、非実質性肝臓細胞（たとえば、類洞内皮細胞）を、多孔膜の第二の面に置いても良く、および、せん断応力を、当該非実質性肝臓細胞に適用しても良い。

【0049】

また、本発明により、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓の病理学的状態または生理学的状態を模倣する他の方法が提示される。当該方法には、細胞培養容器に培養培地を添加すること、および多孔膜の第一の面に肝細胞をプレーティングすること、が含まれる。当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には当該肝細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれる。せん断力は、容器の上層の多孔膜の第二の面に適用され、当該せん断力はフローデバイスにより生じた当該培養培地の流れから生じるものである。当該流れは、当該病理学的状態または生理学的状態において当該肝細胞がｉｎ ｖｉｖｏで曝される流れを模倣する。当該フローデバイスは、当該容器の当該上層の当該培養培地中に位置づけられるために適合されたボディおよび、当該ボディを回転させるために適合されたモーターを含有する。好ましくは、当該ボディは円錐面を有する。また、好ましくは、当該フローデバイスは、当該ボディの円錐面が当該容器内に位置づけられ、当該細胞培養培地と接触するように適合される。

【0050】

本方法にはさらに、多孔膜の第二の面に非実質性肝臓細胞をプレーティングすることが含まれ、ここで、せん断応力は、当該非実質性肝臓細胞に適用される。当該非実質性肝臓細胞には、類洞内皮細胞、肝臓星細胞、クッパー細胞またはそれらの組み合わせが含まれても良い。

【0051】

肝臓の病理学的状態または生理学的状態を模倣するためのｉｎ ｖｉｔｒｏの方法において、当該病理学的状態または生理学的状態のマーカーレベルの変化を、せん断力の適用が無い状態での、同発明方法と比較しても良い。せん断力の適用が無い状態での培養培地または肝臓細胞におけるマーカーレベルと比較した、当該せん断力が適用された状態での当該培養培地または任意の当該肝臓細胞におけるマーカーレベルの変化は、当該病理学的状態または生理学的状態の模倣を裏付ける。たとえば、せん断力の適用が無い状態での培養培地または肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞におけるマーカーレベルと比較した、当該せん断力が適用された状態での当該培養培地または当該肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞におけるマーカーレベルの変化は、当該病理学的状態または生理学的状態の模倣を裏付ける。

【0052】

あるいは、少なくとも１つのプレーティングされた肝臓細胞型に肝細胞が含まれる場合、グルカゴン、インスリンまたはグルコース基質に対する当該肝細胞における反応性は、当該生理学的状態の模倣を裏付ける。グルコース基質は、たとえば、グリセロール、乳酸塩、ピルビン酸塩、またはそれらの組み合わせ（たとえば、乳酸塩とピルビン酸塩の組み合わせ等）であっても良い。

【0053】

病理学的状態または関連因子
病理学的状態には、限定されないが、進行性炎症、アテローム性動脈硬化、糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症、高血圧、高血圧性脳障害、高血圧性網膜症、脂肪性肝疾患、高血圧、心不全、脳卒中、マルファン症候群、頸動脈内膜中膜肥厚、心房細動、腎疾患、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、アテローム性粥腫崩壊、アテローム性粥腫浸食、胸部大動脈瘤、脳動脈瘤、腹部大動脈瘤、脳動脈瘤、肺動脈疾患、肺高血圧症、末梢動脈疾患、動脈血栓症、静脈血栓症（たとえば、深部静脈血栓症）、血管再狭窄、血管石灰化、心筋梗塞、肥満、高中性脂肪血症、低αリポ蛋白血症、脂肪性肝疾患、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝線維症、細菌感染、ウイルス感染、肝硬変、肝線維症、およびアルコール誘導性肝疾患が含まれる。

【0054】

病理学的状態に、たとえば、萎縮、結石、分離腫、病理学的な収縮、病理学的な拡張、憩室、肥大、ポリープ、脱出、裂傷、動静脈瘻、または付属物（たとえば、左心耳等）等の解剖学的状態が含まれても良い。

【0055】

血管の病理学的状態に対し、内皮細胞、平滑筋細胞または心内膜細胞が、細胞培養容器内の面にプレーティングされても良く、および、せん断力は当該プレーティングされた内皮細胞、平滑筋細胞または心内膜細胞に適用されても良い。

【0056】

血管の病理学的状態に対し、因子には、酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、グルコース、組織増殖因子β（ＴＧＦβ）、エラスチン分解産物、エラスターゼ、ビタミンＤ、無機リン酸、レプチン、アディポネクチン、アペリン、アルドステロン、アンギオテンシンＩＩ、トリグリセリド、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、酸化高密度リポタンパク質（ｏｘＨＤＬ）、トリグリセリド富化リポタンパク質、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、インスリン、脂肪酸、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。

【0057】

トリグリセリド富化リポタンパク質には、極低密度リポタンパク質（ｖＬＤＬ）、ｖＬＤＬ残余物、カイロミクロン、またはカイロミクロン残余物が含まれても良い。

【0058】

多孔膜が用いられる場合の血管の病理学的状態に対し、心内膜細胞は、多孔膜の第一の面にプレーティングされても良い。当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には当該心内膜細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれる。せん断力は、上層の多孔膜の第二の面に適用される。任意選択的に、内膜細胞が多孔膜の第二の面にプレーティングされ、およびせん断力が当該プレーティングされた内膜細胞に適用されても良い。

【0059】

当該心内膜細胞は、平滑筋細胞を含んでも良い。

【0060】

血管の病理学的状態が心房細動、または心房細胞および関連高血圧である場合、当該細胞型は、内膜細胞、平滑筋細胞、心内膜細胞またはその組み合わせを含んでも良い。好ましくは、当該細胞型は、内膜；平滑筋；内膜および平滑筋；心内膜；または心内膜および内膜である。

【0061】

たとえば心房細動または、心房細動および関連高血圧等の血管の病理学的状態に対し、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、高血圧の対象、老齢の対象、または糖尿病、高血圧もしくは加齢をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0062】

血管の病理学的状態が心房細動、または心房細動および関連高血圧である場合、流れまたは血流力学的パターンは、心洞から誘導されてもよく、または心房細動リズムから誘導されてもよい。

【0063】

血管の病理学的状態が心房細動、または心房細動および関連高血圧である場合、因子は、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、アルドステロン、アンギオテンシンＩＩ、またはそれらの組み合わせを含んでも良い。たとえば、因子（複数含む）は、ｏｘＬＤＬ；ＴＮＦα；ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦα；アルドステロン；アンギオテンシンＩＩ；アルドステロンおよびアンギオテンシンＩＩ；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびアンギオテンシンＩＩ；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦαおよびアルドステロン；または、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、アルドステロンおよびアンギオテンシンＩＩを含んでも良い。

【0064】

多孔膜が用いられる場合の血管の病理学的状態に対し、平滑筋細胞が、多孔膜の第一の面にプレーティングされても良い。当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には当該平滑筋細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれる。せん断力は、上層の多孔膜の第二の面に適用される。任意選択的に、内膜細胞が多孔膜の第二の面にプレーティングされても良い。

【0065】

多孔膜が用いられる場合の血管の病理学的状態に対し、内膜細胞が、多孔膜の第二の面にプレーティングされても良い。当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には多孔膜の第一の面が含まれ、上層には当該内膜細胞が含まれる。せん断力は、上層の当該内膜細胞に適用される。任意選択的に、平滑筋細胞が多孔膜の第一の面にプレーティングされても良い。

【0066】

たとえばアテローム性動脈硬化症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、細胞型に、内膜細胞、平滑筋細胞またはそれらの組み合わせが含まれても良い。好ましくは、細胞型は、内膜；平滑筋；または内膜および平滑筋である。

【0067】

たとえばアテローム性動脈硬化症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、高血圧の対象、または糖尿病もしくは高血圧をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0068】

たとえばアテローム性動脈硬化症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、流れ、または血流力学パターンは、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ、すなわち、「健常な状態」としても本明細書に記述される）、大腿動脈由来、または、細動脈由来であっても良い。

【0069】

たとえばアテローム性動脈硬化症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、因子は、ＬＤＬ、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、ＨＤＬ、トリグリセリド富化リポタンパク質、またはそれらの組み合わせを含んでも良い。たとえば、因子（複数含む）は、ＬＤＬ；ＬＤＬおよびｏｘＬＤＬ；ｏｘＬＤＬ；ＨＤＬ；ＨＤＬおよびｏｘＬＤＬ；ＴＮＦα；ＴＮＦαおよびｏｘＬＤＬ；ＴＮＦα、ｏｘＬＤＬ、およびＨＤＬ；または、ＴＮＦα、ｏｘＬＤＬ、およびトリグリセリド富化リポタンパク質を含んでも良い。

【0070】

たとえば高トリグリセリド血症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、細胞型に、内膜細胞、平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。好ましくは、細胞型は、内膜；平滑筋；または内膜および平滑筋である。

【0071】

たとえば高トリグリセリド血症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、高血圧の対象、または糖尿病もしくは高血圧をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0072】

たとえば高トリグリセリド血症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、流れ、または血流力学パターンは、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）、大腿動脈由来、または、細動脈由来であっても良い。

【0073】

たとえば高トリグリセリド血症等の、血管の病理学的状態が進行性炎症である場合、因子は、トリグリセリド富化リポタンパク質を含んでも良い。

【0074】

血管の病理学的状態が腹部大動脈瘤である場合、細胞型に、内膜細胞、平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。好ましくは、細胞型は、内膜；平滑筋；または内膜および平滑筋である。

【0075】

血管の病理学的状態が腹部大動脈瘤である場合、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、高血圧の対象、喫煙者、腹部大動脈瘤を有する対象、または、糖尿病もしくは高血圧をモデリングするために遺伝子改変された、または腹部大動脈瘤をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0076】

血管の病理学的状態が腹部大動脈瘤である場合、流れ、または血流力学的パターンは、腹部大動脈から誘導されてもよく、または腹部大動脈内のリズムから誘導されてもよい。

【0077】

血管の病理学的状態が腹部大動脈瘤である場合、因子には、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、グルコース、エラスチン分解産物、エラスターゼ、アンギオテンシンＩＩ、アルドステロン、インスリン、ＴＧＦβ、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。たとえば、因子（複数含む）は、ｏｘＬＤＬ；ＴＮＦα；グルコース；エラスチン分解産物；エラスターゼ；アンギオテンシンＩＩ；アルドステロン；インスリン；ＴＧＦ−β；ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦα；ｏｘＬＤＬおよびグルコース；ｏｘＬＤＬおよびエラスチン分解産物；ｏｘＬＤＬおよびエラスターゼ；ｏｘＬＤＬおよびアンギオテンシンＩＩ；ｏｘＬＤＬおよびアルドステロン；ｏｘＬＤＬおよびインスリン；ｏｘＬＤＬおよびＴＧＦβ；ＴＮＦαおよびグルコース；ＴＮＦαおよびエラスチン分解産物；ＴＮＦαおよびエラスターゼ；ＴＮＦαおよびアンギオテンシンＩＩ；ＴＮＦαおよびアルドステロン；ＴＮＦαおよびインスリン；ＴＮＦαおよびＴＧＦβ；グルコースおよびエラスチン分解産物；グルコースおよびエラスターゼ；グルコースおよびアンギオテンシンＩＩ；グルコースおよびアルドステロン；グルコースおよびインスリン；グルコースおよびＴＧＦβ；エラスチン分解産物およびエラスターゼ；エラスチン分解産物およびアンギオテンシンＩＩ；エラスチン分解産物およびアルドステロン；エラスチン分解産物およびインスリン；エラスチン分解産物およびＴＧＦβ；エラスチン分解産物およびアンギオテンシンＩＩ；エラスターゼおよびアルドステロン；エラスターゼおよびインスリン；エラスターゼおよびＴＧＦβ；アンギオテンシンＩＩおよびアルドステロン；アンギオテンシンＩＩおよびインスリン；アンギオテンシンＩＩおよびＴＧＦβ；アルドステロンおよびインスリン；アルドステロンおよびＴＧＦβ；インスリンおよびＴＧＦβ；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびグルコース；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびエラスチン分解産物；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびエラスターゼ；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびアンギオテンシンＩＩ；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦαおよびアルドステロン；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびインスリン ；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびＴＧＦβ；ＴＮＦα、グルコース、およびエラスチン分解産物；ＴＮＦα、グルコースおよびエラスターゼ；ＴＮＦα、グルコースおよびアンギオテンシンＩＩ；ＴＮＦα、グルコースおよびアルドステロン；ＴＮＦα、グルコースおよびインスリン；ＴＮＦα、グルコースおよびＴＧＦ−β等であっても良い。

【0078】

血管の病理学的状態が腹部大動脈瘤である場合、タバコの抽出物が培養培地に添加されても良い。

【0079】

たとえば糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、または糖尿病性網膜症等の血管の病理学的状態が糖尿病性の血管の疾患である場合、細胞型に、内膜細胞、平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。好ましくは、細胞型は、内膜；平滑筋；または内膜および平滑筋である。

【0080】

たとえば糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、または糖尿病性網膜症等の血管の病理学的状態が糖尿病性の血管の疾患である場合、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、または、糖尿病をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0081】

たとえば糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、または糖尿病性網膜症等の血管の病理学的状態が糖尿病性の血管の疾患である場合、流れ、または血流力学パターンは、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）、大腿動脈由来、または、細動脈由来であっても良い。

【0082】

たとえば糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、または糖尿病性網膜症等の血管の病理学的状態が糖尿病性の血管の疾患である場合、因子は、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、グルコース、ＨＤＬ、ｏｘＨＤＬ、トリグリセリド富化リポタンパク質、インスリン、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。たとえば、因子（複数含む）は、グルコース；グルコースおよびインスリン；グルコース、ｏｘＬＤＬ、およびＴＮＦα；グルコース、インスリン、ｏｘＬＤＬ、およびＴＮＦα；グルコース、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびＨＤＬ；グルコース、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびｏｘＨＤＬ；グルコース、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、ＨＤＬ、およびｏｘＨＤＬ；グルコース、インスリン、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびＨＤＬ；グルコース、インスリン、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびｏｘＨＤＬ；グルコース、インスリン、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、ＨＤＬ、およびｏｘＨＤＬ；グルコース、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびトリグリセリド富化リポタンパク質；または、グルコース、インスリン、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびトリグリセリド富化リポタンパク質を含んでも良い。

【0083】

血管の病理学的状態が、高血圧である場合、細胞型に、内膜細胞、平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。好ましくは、細胞型は、内膜；平滑筋；または内膜および平滑筋である。

【0084】

血管の病理学的状態が、高血圧である場合、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、高血圧の対象、または、糖尿病もしくは高血圧をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0085】

血管の病理学的状態が、高血圧である場合、流れ、または血流力学パターンは、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）、大腿動脈由来、肺動脈由来、または、細動脈由来であっても良い。

【0086】

血管の病理学的状態が、高血圧である場合、因子には、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、アンギオテンシンＩＩ、アルドステロン、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。たとえば、因子（複数含む）には、アンギオテンシンＩＩ；アルドステロン；アンギオテンシンＩＩおよびアルドステロン；またはアンギオテンシンＩＩ、アルドステロン、ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦαを含んでも良い。

【0087】

血管の病理学的状態が、動脈石灰化である場合、細胞型に、内膜細胞、平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。好ましくは、細胞型は、内膜；平滑筋；または内膜および平滑筋である。

【0088】

血管の病理学的状態が、動脈石灰化である場合、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、高血圧の対象、または、糖尿病もしくは高血圧をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0089】

血管の病理学的状態が、動脈石灰化である場合、流れ、または血流力学パターンは、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）、大腿動脈由来、肺動脈由来、または、細動脈由来であっても良い。

【0090】

血管の病理学的状態が、動脈石灰化である場合、因子には、ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、ビタミンＤ、無機リン酸、レプチン、アディポネクチン、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。たとえば、因子（複数含む）には、ｏｘＬＤＬ；ＴＮＦα；ビタミンＤ；無機リン酸；レプチン；アディポネクチン；ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦα；ｏｘＬＤＬおよびビタミンＤ；ｏｘＬＤＬおよび無機リン酸；ｏｘＬＤＬおよびレプチン；ｏｘＬＤＬおよびアディポネクチン；ＴＮＦαおよびビタミンＤ；ＴＮＦαおよび無機リン酸；ＴＮＦαおよびレプチン；ＴＮＦαおよびアディポネクチン；ビタミンＤおよび無機リン酸；ビタミンＤおよびレプチン；ビタミンＤおよびアディポネクチン；無機リン酸およびレプチン；無機リン酸およびアディポネクチン；レプチンおよびアディポネクチン；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびビタミンＤ；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、および無機リン酸；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびレプチン；ｏｘＬＤＬ、ＴＮＦα、およびアディポネクチン；ＴＮＦα、ビタミンＤおよび無機リン酸；ＴＮＦα、ビタミンＤおよびレプチン；ＴＮＦα、ビタミンＤおよびアディポネクチン等が含まれても良い。

【0091】

血管の病理学的状態が、血栓症である場合、細胞型に、内膜細胞、平滑筋細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。好ましくは、細胞型は、内膜；平滑筋；または内膜および平滑筋である。

【0092】

血管の病理学的状態が、血栓症である場合、プレーティングされた細胞型は、正常な対象、糖尿病を有する対象、高血圧の対象、または、糖尿病もしくは高血圧をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0093】

血管の病理学的状態が、血栓症である場合、流れ、または血流力学パターンは、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）、アテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）、大腿動脈由来、肺動脈由来、または、細動脈由来であっても良い。

【0094】

血管の病理学的状態が、血栓症である場合、因子には、ＴＮＦα、ｏｘＬＤＬ、グルコース、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。たとえば、因子（複数含む）には、ＴＮＦα；ｏｘＬＤＬ；グルコース；または、ｏｘＬＤＬおよびグルコースが含まれても良い。

【0095】

病理学的状態が脂肪性肝疾患である場合、細胞型に、肝細胞、非実質性肝臓細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。非実質性肝臓細胞には、類洞内皮細胞、肝臓星細胞、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。

【0096】

病理学的状態が脂肪性肝疾患である場合、流れ、または血流力学パターンは、正常な対象、脂肪性肝疾患を有する対象、または、脂肪性肝疾患をモデリングするために遺伝子改変された動物由来であっても良い。

【0097】

病理学的状態が脂肪性肝疾患であり、多孔膜が用いられている場合、肝細胞が、多孔膜の第一の面にプレーティングされても良い。当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には当該肝細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれる。せん断力は、上層の多孔膜の第二の面に適用される。任意選択的に、非実質性肝臓細胞が多孔膜の第二の面にプレーティングされ、および、せん断力が上層の非実質性肝臓細胞に適用されても良い。任意選択的に、細胞外マトリクス成分が多孔膜の第一の面に配置されても良く、および、次いで、肝細胞が当該細胞外マトリクス上にプレーティングされても良い。

【0098】

病理学的状態が脂肪性肝疾患であり、多孔膜が用いられている場合、非実質性肝臓細胞が多孔膜の第二の面にプレーティングされても良い。当該多孔膜は、当該第一の面が細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には多孔膜の第一の面が含まれ、上層には当該非実質性肝臓細胞が含まれる。せん断力は、上層の当該非実質性肝臓細胞に適用される。任意選択的に、細胞外マトリクス成分が多孔膜の第一の面に配置されても良く、および、次いで、肝細胞が当該細胞外マトリクス上にプレーティングされても良い。

【0099】

血管の病理学的状態が脂肪性肝疾患である場合、因子に、インスリン、グルコースまたはそれらの組み合わせが含まれても良い。たとえば、因子（複数含む）には、インスリン；グルコース；またはインスリンおよびグルコースが含まれても良い。

【0100】

病理学的状態が糖尿病である場合、細胞型に、膵臓β細胞、膵臓α細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良く；および、因子に、インスリン、グルコース、またはインスリンおよびグルコースが含まれても良い。

【0101】

生理学的状態
本発明の方法で模倣することが出来る生理学的状態には、本明細書に記述される病理学的状態のような、対象の任意の病理学的状態に相当する生理学的状態が含まれる。たとえば、脂肪性肝疾患に相当する病理学的状態は、健常な肝臓の状態であっても良く、およびアテローム性動脈硬化症に相当する生理学的状態は、アテローム保護的な状態であっても良い。

【0102】

フローデバイス
せん断力を、培養培地に流れを誘導することができる適切なフローデバイスを用いて適用しても良く、ここで、当該流れは、病理学的状態または生理学的状態において、培養される細胞型（複数含む）がｉｎ ｖｉｖｏで曝される流れを模倣する。たとえば、フローデバイスは、コーンアンドプレートデバイスまたは、並行プレートフローデバイスであっても良い。

【0103】

フローデバイスは、米国特許第７，８１１，７８２号およびＡｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ−ｐｒｏｎｅ ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ａｎｄ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｉｍｉｎｇ， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２９３：１８２４-３３ （２００７）（Ｈａｓｔｉｎｇｓら）（それらの各内容は、参照により本明細書に援用される）に実質的に記述されるコーンアンドプレートデバイスであっても良い。そのようなデバイスの例を図１５Ｂに記述する。デバイス２００は、電子的指令のセットを受け取るための電子的コントローラーを含有し、モーター２２０は、当該電子的コントローラーにより操作され、および、せん断力アプリケーターは、当該モーターにより駆動されるために当該モーターに操作可能に連結される。せん断力アプリケーターは、当該モーターに付着されるコーン（円錐、ｃｏｎｅ）２３０を含有しても良く、当該コーンは、当該モーターにより直接駆動されても良い。当該モーターにより、各方向（時計回りまたは反時計回り）に当該コーンが回転させられる。

【0104】

コーンアンドプレートデバイスは、細胞培養容器（たとえば、ペトリディッシュ（たとえば、７５ｍｍ直径のペトリディッシュ）等）を収容する。コーンは、細胞培養容器の内部にフィットするように適合される。ゆえに、たとえば、７５ｍｍ直径のペトリディッシュの使用に適合されたデバイスでは、コーンは、約７１．４ｍｍの直径を有する。多くの場合、コーンは、浅い円錐角度を有する。たとえば、コーンの表面と、ペトリディッシュ内の面の間の角度は、およそ１°である。

【0105】

デバイスのコーンがペトリディッシュ内の培養培地に浸され、モーターにより回転されると、コーンにより、当該培養培地に回転力がかかり、次いで、当該細胞培養容器内にプレーティングされた細胞にせん断力がかかり、または、当該細胞培養容器内に吊るされた多孔膜の面にせん断力がかかる。

【0106】

コーンアンドプレートデバイスはまた、細胞培養容器をしっかりと保持するためのベースを含んでも良い。デバイスはまた、ペトリディッシュ上に取り付けられ、以下に詳述される上層と下層を灌流させるために用いられる流入管および流出管を固定するクリップを含んでも良い。

【0107】

流れは、前もって測定された血流力学的パターンから誘導されても良く、電子的指示のセットへとモデル化されても良い。フローデバイスは、電子的指示のセットを受け取るための電子的コントローラーを含有する。当該モーターは、当該電子的コントローラーにより操作される。せん断力アプリケーターは、当該モーターにより駆動されるモーターに操作可能に連結される。好ましくは、せん断力アプリケーターは、当該モーターに取り付けられるコーンを含有する。

【0108】

フローデバイスは、細胞培養容器と併せて用いられる。細胞培養容器は、細胞培養培地、因子、薬物、化合物および他の化合物の、細胞培養容器の内外への流れのための、入口および出口を含んでも良い。

【0109】

フローデバイスのための入口および出口は、クリップにより細胞培養容器に固定されても良い。そのようなクリップを図２３に示す。各クリップは、３つの部分から作られている：メインボディ１および２片の薄い金属管２および３（図２３に示す）。クリップは、ネジ４により、外側から細胞培養ディッシュの側面へ固定されても良い。たとえば、２つのクリップは、図２４ＡおよびＢに示されるように、ネジ４により、外側からディッシュの側面へ付着および締められても良い。メインボディ１は、処置されたステンレススチール金属で作られており、付着およびアクセスの目的のためにディッシュの端のあたりを曲げている。クリップ１つにつき、薄い金属管の２片（２および３）が曲げられることにより、コーンの回転を妨害することなく、効率的な培地の供給および排出のためのディッシュへのアクセスがもたらされる。メインボディ１の各側面の位置決めネジ５は、金属管２、３をメインボディに固定し、培養培地内の正しい深さまで伸長するように、所定の位置に金属管を保持する。次いで、フレキシブルな管を、培地を引き出す（たとえば、実施例のデバイスにある機械的な蠕動ポンプを介して、原料ボトルからディッシュへと）ために用いられる金属管の上にスライドさせる。

【0110】

図２４Ａおよび２４Ｂにおいて、細胞培養容器に位置づけられたクリップを示す。図２４に示される構造において、吊るされる多孔膜は、細胞培養容器内（内皮細胞のみ（図２４Ｂ）、または内皮細胞および平滑筋細胞（図２４Ａ）が多孔膜の面にプレーティングされている）に吊るされている。

【0111】

血流力学的パターン
血流力学的パターンは、病理学的状態または疾患促進状態を有する対象（複数含む）から誘導されても良い。疾患促進状態には、萎縮、結石、分離腫、病理学的な収縮、病理学的な拡張、憩室、肥大、ポリープ、脱出、裂傷、動静脈瘻、または付属物（たとえば、左心耳）が含まれても良い。

【0112】

血流力学的パターンは、動脈、細動脈、静脈、細静脈、または器官の少なくとも１部から誘導されても良い。

【0113】

血流力学パターンが動脈または細動脈の少なくとも１部から誘導される場合、動脈または細動脈には、頸動脈、胸部動脈、腹部動脈、肺動脈、大腿動脈、腎輸出動脈、腎輸入動脈、冠状動脈、上腕動脈、内乳腺動脈、脳動脈、大動脈、前毛細血管細動脈、肝動脈、前大脳動脈、中大脳動脈、後大脳動脈、脳底動脈、外頸動脈、内頚動脈、脊椎動脈、鎖骨下動脈、大動脈弓、腋窩動脈、内胸動脈、鰓動脈、深部鰓動脈、橈側反回動脈、上腹壁動脈、下行大動脈、下腹壁動脈、骨間動脈、橈骨動脈、尺骨動脈、掌側手根動脈弓、背側手根動脈弓、浅掌動脈弓または深掌動脈弓、指動脈、大腿回旋動脈の下行枝、下行膝動脈、上行膝動脈、下膝動脈、前脛骨動脈、後脛骨動脈、腓骨動脈、深部足底動脈弓、弓状動脈、総頸動脈、肋間動脈、右胃動脈または左胃動脈、腹腔動脈、脾動脈、総肝動脈、上腸間膜動脈、腎動脈、下腸間膜動脈、精巣動脈、総腸骨動脈、内腸骨動脈、外腸骨動脈、大腿回旋動脈、貫通枝、深部大腿動脈、膝窩動脈、背側中足動脈、または背側指動脈が含まれてもよい。

【0114】

血流力学的パターンが静脈または細静脈の少なくとも１部から誘導される場合、静脈または細静脈には、後毛細血管細静脈、伏在静脈、肝門脈、上大静脈、下大静脈、冠状静脈、Ｔｈｅｓｂｉａｎ静脈、表在静脈、穿通枝静脈、系統的静脈、肺静脈、頚静脈、Ｓ状静脈洞、外頚静脈、内頚静脈、下甲状腺静脈、鎖骨下静脈、内胸静脈、腋窩静脈、橈側皮静脈、気管支静脈、肋間静脈、尺側皮静脈、肘正中皮静脈、胸腹壁静脈、尺骨静脈、前腕正中皮静脈、下腹壁静脈、深掌動脈弓、浅掌動脈弓、掌側指静脈、心静脈、下大静脈、肝静脈、腎静脈、腹部大静脈、精巣静脈、総腸骨静脈、貫通枝、外腸骨静脈、内腸骨静脈、外陰部静脈、深部大腿静脈、大伏在静脈、大腿静脈、副伏在静脈、上膝静脈、膝窩静脈、下膝静脈、大伏在静脈、小伏在静脈、前脛骨静脈または後脛骨静脈、深部足底静脈、足背静脈弓、または足指静脈が含まれても良い。

【0115】

血流力学的パターンが器官の少なくとも１部から誘導される場合、当該器官には、肝臓、腎臓、肺、脳、膵臓、脾臓、大腸、小腸、心臓、骨格筋、眼、舌、生殖器、または臍帯が含まれても良い。

【0116】

血流力学的パターンは、超音波データの分析から誘導されても良い。

【0117】

血流力学的パターンは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）データの分析から誘導されても良い。

【0118】

流れ、または血流力学的パターンは、時間変数（ｔｉｍｅ−ｖａｒｉａｎｔ）であっても良い。

【0119】

流れ、または血流力学パターンは、心臓の心房室、洞リズムの間の左心耳、心房細動、または心室細動から誘導されても良い。

【0120】

流れ、または血流力学的パターンが、心臓の心房室から誘導される場合、心臓の心房室には、左心房、右心房、左心室、または右心室が含まれても良い。

【0121】

流れ、または血流力学的パターンは、病理学的状態から生じた物理的変化からもたらされたものであっても良い。

【0122】

流れ、または血流力学的パターンは対象から誘導されても良く、ここで、血液の流れ、または血流力学的パターンは、薬物投与が為されていない対象に対する流れ、または血流力学的パターンと比較し、対象への薬物投与の直接的または間接的な効果として変化する。

【0123】

流れ、または血流力学的パターンは、たとえば遺伝子改変された動物またはヒト等の動物から誘導されても良い。好ましくは、当該パターンは、ヒトから誘導される。

【0124】

細胞型
本発明の方法において用いるための細胞型には、初代細胞および不死化細胞が含まれる。初代細胞または不死化細胞には、病理学的状態または生理学的状態を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に対するリスク因子を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に関連した一塩基多型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、薬物毒性に関連した特定の遺伝子型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、または、薬物毒性に関連した一塩基多型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、が含まれても良い。

【0125】

生理学的状態に関与する本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法において用いられる初代細胞または不死化細胞には、生理学的状態を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に対するリスク因子を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に関連した一塩基多型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、薬物毒性に関連した特定の遺伝子型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、または、薬物毒性に関連した一塩基多型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、が含まれる。

【0126】

病理学的状態に関与する本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法において用いられる初代細胞または不死化細胞には、病理学的状態を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に対するリスク因子を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に関連した一塩基多型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、薬物毒性に関連した特定の遺伝子型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、または、薬物毒性に関連した一塩基多型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、が含まれてもよい。

【0127】

病理学的状態に関与する本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法において用いられる初代細胞または不死化細胞には、病理学的状態を有していない少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に対するリスク因子を有していない少なくとも１つの対象から単離された細胞、病理学的状態に関連した一塩基多型を有していない少なくとも１つの対象から単離された細胞、薬物毒性に関連した特定の遺伝子型を有していない少なくとも１つの対象から単離された細胞、または、薬物毒性に関連した一塩基多型を有していない少なくとも１つの対象から単離された細胞が含まれてもよい。

【0128】

病理学的状態に関与する本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法において用いられる初代細胞または不死化細胞には、異なる病理学的状態を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、異なる病理学的状態に対するリスク因子を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、または異なる病理学的状態に関連した一塩基多型を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞、が含まれてもよい。

【0129】

細胞が病理学的状態に対するリスク因子を有する少なくとも１つの対象から単離された細胞である場合、当該リスク因子には、限定されないが、喫煙、年齢、性別、人種、エピジェネティックなインプリンティング、前記病理学的状態に関連した特定の遺伝子型、前記病理学的状態に関連した特定の一塩基多型、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化、アテローム性粥腫崩壊、アテローム性粥腫浸食、胸部大動脈瘤、脳動脈瘤、腹部大動脈瘤、脳動脈瘤、心不全、脳卒中、マルファン症候群、頸動脈内膜中膜肥厚、心房細動、腎疾患、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、肺動脈疾患、肺高血圧症、高脂血症、家族性高コレステロール血症、末梢動脈疾患、動脈血栓症、静脈血栓症（たとえば、深部静脈血栓症）、血管再狭窄、血管石灰化、心筋梗塞、肥満、高中性脂肪血症、低αリポ蛋白血症、脂肪性肝疾患、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝線維症、細菌感染、ウイルス感染、肝硬変、肝線維症、またはアルコール誘導性肝疾患が含まれても良い。

【0130】

初代細胞には、幹細胞（たとえば、成体幹細胞、胚幹細胞、人工多分化能性幹細胞、または骨髄由来幹細胞）または幹様細胞から誘導された細胞系統を含んでも良い。幹細胞または幹様細胞から誘導された細胞系統は、内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、肝細胞、神経細胞、内分泌細胞、膵臓β細胞、膵臓α細胞、または骨格筋細胞を含んでも良い。

【0131】

初代細胞は、病理学的状態を有する対象由来の人工多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の細胞を含んでも良い。たとえば、病理学的状態を有する対象由来のｉＰＳＣ由来細胞は、家族性高コレステロール血症、Ｉ型グリコーゲン蓄積症、ウィルソン症、Ａ１抗トリプシン欠損症、Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ症候群、進行性家族性遺伝性胆汁うっ滞、または遺伝性1型チロシン血症を有する対象由来のｉＰＳＣ由来肝細胞を含んでも良い。あるいは、病理学的状態を有する対象由来のｉＰＳＣ由来細胞は、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄ早老症、Ｗｉｌｌｉａｍｓ−Ｂｅｕｒｅｎ症候群、ファブリー病、スザック症候群、全身性毛細血管漏出症候群、Ｇｌｅｉｃｈ症候群、血管内乳頭内皮肥厚、鎌状赤血球症、または肝静脈閉塞症を有する対象由来のｉＰＳＣ由来血管細胞（たとえば、ｉＰＳＣ由来平滑筋細胞、ｉＰＳＣ由来内皮細胞、または、ｉＰＳＣ由来心内膜細胞）を含んでも良い。

【0132】

本発明の方法において用いるための細胞型には、腎細胞、気道の細胞、血液脳関門の細胞、血管細胞、肝細胞、すい臓細胞、心細胞、筋細胞、脾臓細胞、消化管細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、免疫細胞または造血細胞が含まれる。

【0133】

本方法に用いるための特定の細胞型には、星細胞、内皮細胞、糸球体有窓性内皮細胞、腎上皮有足細胞、α細胞、β細胞、Δ細胞、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）細胞、ε細胞、グリア細胞、肝細胞、神経細胞、非実質性肝臓細胞、有足細胞、平滑筋細胞、糸球体間質細胞、周皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、白血球、単球、筋細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、内皮前駆細胞、幹細胞、循環幹細胞または循環造血細胞を含む。非実質性肝臓細胞には、肝臓星細胞、類洞内皮細胞、またはクッパー細胞が含まれる。好ましくは、特定の細胞型には、内皮細胞、平滑筋細胞、肝細胞、類洞内皮細胞、またはそれらの組み合わせが含まれる。

【0134】

本発明の方法において用いるための細胞型は、たとえば遺伝子改変動物由来の細胞等の動物細胞型であっても良い。動物細胞型は好ましくはヒト細胞型である。ヒト細胞型は、年齢、性別、人種、エピジェネティクス、疾患、国籍、１以上の一塩基多型の有無、本明細書に記述されるリスク因子、または病理学的状態もしくは生理学的状態に関連する何か他の特徴に基づき選択されてもよい。

【0135】

本発明の方法において適用されるせん断力は、少なくとも１つのプレーティングされた細胞型に、間接的に適用されても良い。

【0136】

本発明の方法において適用されるせん断力は、少なくとも１つのプレーティングされた細胞型に、直接的に適用されても良い。

【0137】

細胞型、細胞外マトリクス成分等の付加的な静文、および多孔膜は、本発明の方法において、培養培地の内にある（すなわち、培養培地で覆われている）。

【0138】

本発明の方法はさらに、薬物または化合物からもたらされる、毒性、炎症、浸透性、適合性、細胞接着、細胞再構成、細胞移動、または表現型変化に対して、少なくとも１つの細胞型を分析することを含んでも良い。

【0139】

細胞培養培地
標準的な細胞培養培地を、本発明の方法において用いても良い。

【0140】

細胞培養培地に添加される因子
細胞培養培地に添加されうる因子を、関連病理学的状態または生理学的状態と併せて、明細書に記述する。

【0141】

Ｉｎ Ｖｉｖｏ因子濃度
因子の生理学的なｉｎ ｖｉｖｏ濃度は、これらｉｎ ｖｉｖｏ濃度の測定法が公知であるように、当分野に公知である。たとえば、健常な人およびアテローム性動脈硬化症を有するヒトにおけるＨＤＬの各ｉｎ ｖｉｖｏ濃度は、３０ｍｇ／ｄｌ超〜２００ｍｇ／ｄｌ、および３０ｍｇ／ｄｌ未満である（全血から測定）。因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度測定法は、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａおよび他の文献で入手可能である。

【0142】

報告されている因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲は、当該範囲の測定に用いられた方法、因子を得た源（たとえば、全血か血清か）、患者の医学的状態（すなわち、病理学的状態または生理学的状態を有しているかどうか）、および、正常な睡眠および摂食スケジュールに対する時刻によって変化しうる。しかしながら、当分野の当業者には、文献に報告されている、ｉｎ ｖｉｖｏ生理学的濃度範囲を外れた濃度は、当該濃度の測定を報告した当該方法を用いた、ｉｎ ｖｉｖｏの病理学的濃度であると理解されている。同様に、文献で報告されたｉｎ ｖｉｖｏ病理学的濃度範囲の下限値を下回る、または上限値を上回る濃度は、当該濃度の測定を報告した当該方法を用いたｉｎ ｖｉｖｏ病理学的濃度である（ｉｎ ｖｉｖｏ生理学的濃度が下限値を下回るか、または上限値を上回るかは、因子に依る）。たとえば、ＨＤＬ因子のｉｎ ｖｉｖｏ生理学的な濃度は、範囲の上限値を上回りうるが、ｏｘＬＤＬ因子のｉｎ ｖｉｖｏ生理学的濃度は、範囲の下限値を下回りうると、当業者に認識されている。

【0143】

他の成分
細胞外マトリクス成分
本発明の方法に用いるための細胞外マトリクス成分は、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラタン、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを含んでも良い。コラーゲンは好ましい細胞外マトリクス成分であり、特定の病理学的状態または生理学的状態に対してプレーティングされた細胞型（複数含む）のｉｎ ｖｉｖｏ環境において存在するコラーゲンの型が好ましい。

【0144】

細胞外マトリクス成分は、細胞培養容器内の面にプレーティングされた線維芽細胞、軟骨細胞、または骨芽細胞から分泌されても良い。

【0145】

細胞外マトリクス成分は、肝臓に関与する、本発明の方法での使用に特に適している。

【0146】

薬物または化合物
薬物または化合物は、抗炎症剤、抗新生物剤、抗糖尿病剤、タンパク質キナーゼ阻害物質、抗血栓剤、血栓溶解剤、抗血小板剤、抗凝固物質、カルシウムチャンネルブロッカー、キレート剤、ｒｈｏキナーゼ阻害物質、抗高脂血剤、ＨＤＬ上昇剤、抗再狭窄剤、抗生物質、免疫抑制物質、抗高血圧剤、利尿薬、食欲抑制物質、食欲抑制剤、抗うつ剤、抗精神病剤、避妊薬、カルシウム受容体刺激物質、生物学的医薬品、多発性硬化症治療、鎮痛剤、ホルモン補充療法、抗痙攣薬、またはそれらの組み合わせであっても良い。

【0147】

薬物が抗炎症剤である場合、当該抗炎症剤には、ステロイド（たとえば、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、またはデキサメタゾン）、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）（たとえばアセチルサリチル酸等のサリチル酸、イブプロフェン、アセトアミノフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、またはジクロフェナク）、選択性シクロオキシゲナーゼ阻害剤（たとえば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、またはバルデコキシブ）、非選択性シクロオキシゲナーゼ阻害剤、免疫選択性抗炎症剤（たとえば、フェニルアラニン−グルタミン−グリシントリペプチド）、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。

【0148】

薬物が抗新生物剤を含む場合、当該抗新生物剤には、アルキル化剤（たとえば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシド、またはイフォスファミド）、抗代謝物質（たとえば、アザチオプリンまたはメルカプトプリン）、植物アルカロイド（たとえば、パクリタキセルもしくはドセタキセル等のタキサン、たとえばビンクリスチン、ビンブラスチンもしくはビンデシン等のビンカアルカロイド、または、たとえばエトポシドもしくはテニポシド等のポドフィロトキシン）、トポイソメラーゼ阻害物質（たとえば、イリノテカン、トポテカン、またはアムサクリン）、細胞毒性抗生物質（たとえば、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、ミトマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、エピルビシン、またはリファンピシン）、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。

【0149】

薬物が抗糖尿病剤である場合、当該抗糖尿病剤には、ビグアニド（たとえば、メトフォルミン）、チアゾリジンジオン（たとえば、ロシグリタゾン、トログリタゾン、またはピオグリタゾン）、スルホニルウレア（たとえば、トルブタミン、アセトへキサミド、トルアザミド、クロロプロパミド、グリパジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジド、グリコピラミド、またはグリキドン）、インクレチン模倣物（たとえば、エクセナチド、リラグルチド、またはタスポグルチド）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害物質（たとえば、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチンまたはセプタグリプチン）、ナトリウム−グルコース共トランスポーター２阻害物質（たとえば、ダパグリフロジン、カナグリフロジン、エンパグリフロジン、イプラグリフロジン、レモグリフロジン、またはセルグリフロジン（ｓｅｒｇｌｉｆｌｏｚｉｎ））、グルコキナーゼ活性化物質（たとえば、ピラグリアチン（ｐｉｒａｇｌｉａｔｉｎ））、メグリチニド（たとえば、レパグリニド）、ＧＰＲ４０アゴニスト（たとえば、ＴＡＫ−８７５）、またはグルカゴン受容体アンタゴニストが含まれても良い。

【0150】

また、抗糖尿病剤には、２以上の薬物の組み合わせが含まれても良い。たとえば、抗糖尿病剤には、チアゾリジンジオン（たとえば、ピオグリタゾン）およびメトフォルミンの組み合わせ；チアゾリジンジオン（たとえば、ピオグリタゾン）およびグリメピリドの組み合わせ；ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害物質（たとえば、シタグリプチン）およびスタチン（たとえば、シンバスタチン）の組み合わせ；または、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ阻害物質（たとえば、シタグリプチン）およびメトフォルミンの組み合わせが含まれても良い。さらなる例として、抗糖尿病剤には、ダパグリフロジンおよびメトフォルミンの組み合わせ、または、ダパグリフロジンおよびサキサグリプチンの組み合わせが含まれても良い。

【0151】

薬物がタンパク質キナーゼ阻害物質を含む場合、当該タンパク質キナーゼ阻害物質には、セリン／スレオニン特異的キナーゼ阻害物質、チロシン特異的キナーゼ阻害物質（たとえば、イマチニブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、アキシチニブ、ラパチニブ、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、フォスチマチニブ、バリシチニブ、またはトファシチニブ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体阻害物質、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体阻害物質、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体阻害物質、または、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体阻害物質が含まれても良い。

【0152】

薬物に抗血栓剤が含まれる場合、当該抗血栓剤には、ジピリダモール、ウロキナーゼ、ｒ−ウロキナーゼ、ｒ−プロウロキナーゼ、レテプラーゼ、アルテプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ｒｔ−ＰＡ、ＴＮＫ−ｒｔ−ＰＡ、モンテプラーゼ、スタフィロキナーゼ、パミテプラーゼ、未分画ヘパリン、またはＡＰＳＡＣが含まれても良い。

【0153】

薬物に血栓溶解剤が含まれる場合、当該血栓溶解剤には、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、または組織プラスミノーゲン活性化物質が含まれても良い。

【0154】

薬物が抗血小板剤を含む場合、当該抗血小板剤には、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害物質、トロンボキサン阻害物質、アデノシン二リン酸塩受容体阻害物質、プロスタグランジンアナログ、またはホスホジエステラーゼ阻害物質が含まれても良い。たとえば、抗血小板剤には、クロピドグレル、アブシキシマブ、チロフィバン、オルボフィバン（ｏｒｂｏｆｉｂａｎ）、ゼミロフィバン、シブラフィバン、ロキシフィバン、またはチクロピニン（ｔｉｃｌｏｐｉｎｉｎ）が含まれても良い。

【0155】

薬物が抗凝固物質を含む場合、当該抗凝固物質には、ビタミンＫアンタゴニスト（たとえば、ワーファリン）、第Ｘａ因子阻害物質（たとえば、アピキサバン、ベトリキサバン、エドキサバン、オタミキサバン、リバロキサバン、フォンダパリヌクス、またはイドラパリヌクス）、または直接的トロンビン阻害物質（たとえば、ヒルジン、ビバリルジン、レピルジン、デシルジン、ダビガトラン、キシメラガトラン、メラガトラン、またはアルガトロバン）が含まれても良い。

【0156】

薬物にカルシウムチャンネルブロッカーが含まれる場合、当該カルシウムチャンネルブロッカーには、ベラパミル、ジルチアゼム、アムロジピン、アラニヂピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、またはプラニヂピンが含まれても良い。

【0157】

薬物にキレート剤が含まれる場合、当該キレート剤には、ペニシラミン、トリエチレンテトラミンジヒドロクロリド、ＥＤＴＡ、ＤＭＳＡ、デフェロキサミンメシレート、またはバチマスタットが含まれても良い。

【0158】

薬物にｒｈｏキナーゼ阻害物質が含まれる場合、当該ｒｈｏキナーゼ阻害物質には、Ｙ２７６３２が含まれても良い。

【0159】

薬物に抗高脂血剤が含まれる場合、当該抗高脂血剤には、スタチン（たとえば、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、またはシムバスタチン）、フィブレート（たとえば、ベザフィブレート、ベンザフィブリン酸、シプロフィブレート、シプロフィブリン酸、クロフィブレート、クロフィブリン酸、ゲムフィブロジル、フェノフィブレート、またはフェノフィブリン酸）、食事性コレステロール吸収の選択的阻害物質（たとえば、エゼチミベ）、コレステリルエステル転移タンパク質阻害物質（たとえば、アナセトラピブ、ダルセトラピブ、トルセトラピブ、またはエバセトラピブ）、プロスタグランジンＤ２受容体アンタゴニスト（たとえば、ラロピプラント）、オメガ−３−脂肪酸（たとえば、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）またはドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ））、またはコレステロール降下剤（たとえば、ナイアシン）が含まれても良い。

【0160】

抗高脂血剤にはまた、２以上の薬物の組み合わせが含まれても良い。たとえば、当該抗高脂血剤には、ナイアシンおよびラロピプラントの組み合わせ、またはエゼチミベおよびシムバスタチンの組み合わせが含まれても良い。

【0161】

薬物にＨＤＬ上昇剤が含まれる場合、当該ＨＤＬ上昇剤には、たとえばＡＭＧ１４５等のプロプロテインコンベルターゼサブチリジン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）の阻害物質が含まれても良い。

【0162】

薬物に抗再狭窄剤が含まれる場合、当該抗再狭窄剤には、デキサメタゾンチクロピジン、クロピドグレル、シロリムス、パクリタキセル、ゾタロリムス、エベロリムス、またはウミロリムスが含まれても良い。

【0163】

薬物が抗生物質を含む場合、当該抗生物質にはアクチノマイシンＤが含まれても良い。

【0164】

薬物が免疫抑制物質を含む場合、当該免疫抑制物質には、グルココルチコイド、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、ミトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、インフリキシマブ、エタネルセプト、またはアダリムマブが含まれても良い。

【0165】

薬物に抗高血圧剤が含まれる場合、当該抗高血圧剤には、βアドレナリン受容体アンタゴニスト（たとえば、アルプレノロール、ブシンドロール、カルテオロール、カルベジロール、ラベタロール、ナドロール、オキスプレノロール、ペンブタロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロール、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロールまたはネビボロール）、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト（たとえば、ロサルタン、オルメサルタン、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、またはアジルサルタン）、またはアンギオテンシン転換酵素阻害物質（たとえば、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、キナプリル、ゾフェノプリル、イミダプリル、ベナゼプリル、トランドラプリル、またはラミプリル）が含まれても良い。

【0166】

薬物に利尿剤が含まれる場合、当該利尿剤には、フロセアミド、アミロリド、スピロノラクトン、またはヒドロクロロチアジドが含まれても良い。

【0167】

薬物に食欲抑制物質が含まれる場合、当該食欲抑制物質には、フェンテルミン、フェンフルラミン、デクスフェンフルラミン、シブトラミン、ロルカセリン、トピラメートまたはそれらの組み合わせが含まれても良い。

【0168】

薬物に抗うつ剤が含まれる場合、当該抗うつ剤には、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン（ａｍｉｔｒｙｐｔｉｌｉｎｅ）、パロキセチン、シタロプラム、フルオキセチン、またはエスシタロプラムが含まれても良い。

【0169】

薬物に抗精神病薬が含まれる場合、当該抗精神病薬には、アリピプラゾール、リスペリドン、オランザピン、クエチアピン、カリプラジン、ルラシドン、またはアセナピンが含まれても良い。

【0170】

薬物に避妊薬が含まれる場合、当該避妊薬には、βエストラジオール、エチニルエストラジオール、プロゲステロン、レボノルゲストレル、またはドロスピレノンが含まれても良い。たとえば、当該避妊薬には、ドロスピレノンおよびエチニルエストラジオールの組み合わせが含まれても良い。

【0171】

薬物にカルシウムチャンネル刺激物質が含まれる場合、当該カルシウムチャンネル刺激物質には、シナカルセトが含まれても良い。

【0172】

薬物に生物学的医薬品が含まれる場合、当該生物学的医薬品には、合成多糖類、合成の、部分合成の、もしくはヒト化されたイムノグロブリン、または、組換え治療用タンパク質が含まれても良い。

【0173】

薬物に多発性硬化症治療が含まれる場合、当該多発性硬化症治療には、多発性硬化症に対する経口治療が含まれても良い。たとえば、当該多発性硬化症治療には、フマル酸のメチルエステル（たとえば、モノメチルフマル酸またはジメチルフマル酸）、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体アゴニスト（たとえば、フィンゴリモド）、または免疫調節物質（たとえば、テリフルノミドまたはラキニモド（ｌａｑｕｉｎｉｍｏｄ））が含まれても良い。

【0174】

薬物に鎮痛剤が含まれる場合、当該鎮痛剤には、麻薬性鎮痛剤（たとえば、プロポキシフェン、フェンタニル、モルヒネ、またはモルヒネ代謝物（たとえば、３−グルクロニドまたはモルヒネ６−グルクロニド））またはオピオイドペプチド（たとえば、ダイノルフィンＡ）が含まれても良い。

【0175】

薬物にホルモン補充療法が含まれる場合、当該ホルモン補充療法には、結合型エストロゲン、βエストラジオール、エチニルエストラジオール、プロゲステロン、レボノルゲストレル、ドロスピレノン、またはテストステロンが含まれても良い。

【0176】

薬物に抗痙攣薬が含まれる場合、当該抗痙攣薬には、フェノバルビタールが含まれても良い。

【0177】

薬物にはまた、２以上の薬物の組み合わせが含まれても良い。たとえば、薬物には、利尿剤およびカルシウムチャンネルブロッカー（たとえば、ヒドロクロロチアジドおよびアムロジピンの組み合わせ）の組み合わせ；利尿剤およびアンギオテンシン受容体ＩＩアンタゴニストの組み合わせ（たとえば、ヒドロクロロチアジドおよびロサルタンの組み合わせ）；利尿剤およびβアドレナリン受容体アンタゴニストの組み合わせ（たとえば、ヒドロクロロチアジドおよびプロプラノロールの組み合わせ）；または、利尿剤およびアンギオテンシン転換酵素阻害物質の組み合わせ（たとえば、ヒドロクロロチアジドおよびカプトプリルの組み合わせ）が含まれても良い。さらなる例として、薬物は、抗高脂血剤、抗高血圧剤、利尿剤、およびカルシウムチャンネルブロッカーの組み合わせ（たとえば、シムバスタチン、ロサルタン、ヒドロクロロチアジドおよびアムロジピンの組み合わせ）が含まれても良い。

【0178】

薬物または化合物には、造影剤、放射性同位体、プロドラッグ、抗体断片、抗体、生細胞、治療薬デリバリーミクロスフィア、マイクロビーズ、ナノ粒子、ゲルもしくは細胞含浸ゲル、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。

【0179】

化合物、少なくとも１つの細胞型でタンパク質または遺伝子の機能を阻害、活性化、または変化させることができるものであっても良い。

【0180】

薬物または化合物が、血管ステント物質からの溶出について評価されるものである場合、当該方法にはさらに、少なくとも１つの細胞型を、当該血管ステント物質との適合性、前記血管ステント物質への細胞接着、または前記血管ステント物質による表現型の変化に対して検証することが含まれても良い。

【0181】

薬物または化合物を検証することを含む任意の方法において、培養培地中の薬物または化合物の濃度は、適切に、ｉｎ ｖｉｖｏ効果が得られる薬物化合物の濃度範囲内にある。たとえば、培養培地中の薬物または化合物の濃度は、適切に、当該薬物または化合物に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療Ｃ_ｍａｘの濃度範囲内にある。

【0182】

血清
培養培地に因子を添加すること、または培養培地に薬物または化合物を添加することを含む、本明細書に記述される任意の方法において、当該培養培地に因子を添加する工程、または当該培養培地に薬物または化合物を添加する工程は、培養培地に対象由来の血清を添加する工程を含むことができ、ここで、当該血清は、因子、薬物、または化合物を含有する。

【0183】

当該対象は動物（たとえば、遺伝子改変した動物）またはヒトであっても良い。好ましくは、当該血清は、ヒト対象由来である。

【0184】

当該血清は、病理学的状態を有する対象、または生理学的状態を有する対象由来であっても良い。たとえば、血清が、病理学的状態を有する対象由来である場合、当該病理学的状態には、進行性炎症、アテローム性動脈硬化、糖尿病性腎症、糖尿病性神経症、糖尿病性網膜症、高血圧、高血圧性脳障害、高血圧性網膜症、脂肪性肝疾患、高血圧、心不全、脳卒中、マルファン症候群、頸動脈内膜中膜肥厚、心房細動、腎疾患、肺線維症、慢性閉塞性肺疾患、高脂血症、高コレステロール血症、糖尿病、アテローム性粥腫崩壊、アテローム性粥腫浸食、胸部大動脈瘤、脳動脈瘤、腹部大動脈瘤、脳動脈瘤、肺動脈疾患、肺高血圧症、末梢動脈疾患、動脈血栓症、静脈血栓症（たとえば、深部静脈血栓症）、血管再狭窄、血管石灰化、心筋梗塞、肥満、高中性脂肪血症、低αリポ蛋白血症、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、肝線維症、細菌感染、ウイルス感染、肝硬変、肝線維症、およびアルコール誘導性肝疾患が含まれても良い。

【0185】

生理学的状態に対する効果、または病理学的状態に対する効果
効果について薬物または化合物を検証する方法において、当該効果には、生理学的状態または病理学的状態に対する効果が含まれても良い。たとえば、生理学的状態または病理学的状態に対する効果は、毒性効果、防御的効果、病理的効果、疾患促進効果、炎症効果、酸化効果、小胞体ストレス効果、ミトコンドリアストレス効果、アポトーシス効果、ネクローシス効果、組織修復効果、増殖効果、タンパク質活性に対する効果（たとえば、タンパク質の阻害またはタンパク質の活性化等）、または遺伝子発現に対する効果（たとえば、遺伝子発現の増加または遺伝子発現の減少）であっても良い。

【0186】

フローデバイスに対する、複合的な細胞型構成
本発明の方法にはさらに、培養培地、因子、薬物または化合物を細胞容器の内外に灌流することが含まれても良い。

【0187】

細胞培養容器内の面に、当該細胞培養容器に吊るされた多孔膜が含まれる場合、当該方法にはさらに、当該細胞培養容器内の面に少なくとも１つの細胞型をプレーティングする工程（多孔膜の第一の面に第一の細胞型をプレーティングし、任意選択的に、多孔膜の第二の面に第二の細胞型をプレーティングすることを含む）を含んでも良く、ここで、当該多孔膜は、当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には第一の細胞型が含まれ、上層には任意の第二の細胞型が含まれるよう規定される。多孔膜は、細胞培養培地の液体連結、ならびに、当該第一の細胞型の細胞と当該任意の第二の細胞型の細胞の間の物理的相互作用およびコミュニケーションが可能となるように適合されてもよい。せん断力は、上層の多孔膜の第二の面、または第二の細胞型に適用される。当該方法にはさらに、上層の内外に培養培地が灌流し、および、下層の内外に培養培地が灌流することが含まれても良い。当該方法にはさらに、上層および下層のうちの少なくとも１つへ薬物または化合物を灌流することを含んでも良い。

【0188】

細胞培養容器内の面に、当該細胞培養容器に吊るされた多孔膜が含まれる場合、当該方法にはさらに、当該細胞培養容器内の面に少なくとも１つの細胞型をプレーティングする工程（任意選択的に多孔膜の第一の面に第一の細胞型をプレーティングし、および、多孔膜の第二の面に第二の細胞型をプレーティングすることを含む）を含んでも良く、ここで、当該多孔膜は、当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には任意の第一の細胞型が含まれ、上層には第二の細胞型が含まれるよう規定される。多孔膜は、細胞培養培地の液体連結、ならびに、当該任意の第一の細胞型の細胞と当該第二の細胞型の細胞の間の物理的相互作用およびコミュニケーションが可能となるように適合されてもよい。せん断力は、上層の第二の細胞型に適用される。当該方法にはさらに、上層の内外に培養培地が灌流し、および、下層の内外に培養培地が灌流することが含まれても良い。当該方法にはさらに、上層および下層のうちの少なくとも１つへ薬物または化合物を灌流することを含んでも良い。

【0189】

細胞培養容器の入口および出口は、当該細胞培養容器の一部の内にあっても良く、それにより、上層および下層が定義される。

【0190】

本項に記述される方法にはさらに、第一の細胞型および第二の細胞型の内の少なくとも１つを、薬物または化合物からもたらされる、毒性、炎症、浸透性、適合性、細胞接着、細胞再構成、細胞移動、または表現型変化に対して分析することを含んでも良い。

【0191】

これらの方法にはさらに、容器の面、または多孔膜の第一の面もしくは第二の面に、第三の細胞型をプレーティングすること、上層内の培地に第三の細胞型を懸濁すること、または、下層内の培地に第三の細胞型を懸濁すること、を含んでも良い。

【0192】

これらの方法にはさらに、容器の面、または多孔膜の第一の面もしくは第二の面に、第四の細胞型をプレーティングすること、上層内の培地に第四の細胞型を懸濁すること、または、下層内の培地に第四の細胞型を懸濁すること、を含んでも良い。

【0193】

これらの方法にはさらに、容器の面、または多孔膜の第一の面もしくは第二の面に、第五の細胞型をプレーティングすること、上層内の培地に第五の細胞型を懸濁すること、または、下層内の培地に第五の細胞型を懸濁すること、を含んでも良い。

【0194】

当該第一、第二、第三、第四、および第五の細胞型は、細胞型に関する上記の項で記述される様々な初代細胞型または不死化細胞型であっても良い。

【0195】

これらの組み合わせのそれぞれにおいて、第三の細胞型の細胞、第四の細胞型の細胞、または第五の細胞型の細胞は、容器の底面に接着することができる。

【0196】

定義
本明細書に記述される本発明の目的に対し、「疾患促進状態」という用語は、疾患状態に寄与しうる、異常な身体的状態（すなわち、医学的に受容できる正常な生体構造から明らかに外れている脈管系の構造）を意味する。

【0197】

「因子」という用語は、病理学的な状態または生理学的な状態の発現に寄与する生物学的な物質を意味する。好ましくは、因子は、せん断力の適用が無い状態での培養培地中の、または少なくとも１つのプレーティングされた細胞型のマーカーのレベルと比較して、せん断力の適用で、培養培地中の、もしくは、少なくとも１つのプレーティングされた細胞型の、病理学的または生理学的状態のマーカーのレベルにおける変化をもたらすものである。

【0198】

「血流力学」という用語は、対象の組織におけるｉｎ ｖｉｖｏの血液の流れを模倣する血液の流れを意味する。たとえば、動脈の血液の流れが対象である場合、加速率／減速率、逆流、前向き基礎流等が、動脈の血流力学流を特徴付ける一部のパラメーターである。他の組織において（たとえば、肝臓）、一定の血液の流れを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏ血流力学を特徴付けても良い。

【0199】

「病理学的状態」という用語は、異常な身体的または生理学的状態を意味し、疾患の客観的な症状または主観的な症状を含む。

【0200】

「生理学的状態」という用語は、病的ではない、正常な医学的状態を意味し、身体もしくは組織または器官の正常な機能または状態と一致する医学的な状態、または、身体もしくは組織または器官の正常な機能または状態の特徴である医学的な状態であっても良い。

【0201】

「対象」という用語は、動物（たとえば、遺伝子改変動物またはヒト）を意味する。当該動物には、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、霊長類、または医学研究で通常に用いられている任意の動物を含むことができる。

【0202】

特定のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルに対し本発明の方法を使用した例を以下に記述する。

【0203】

血栓症
本発明の方法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで血栓症をモデル化することができる。凝固カスケードにおいて、トロンビンはフィブリノーゲンをフィブリンへと転換し、それは血管の表面に沈着して、血栓形成が開始される（血栓症）。ＴＮＦαは、強力な炎症性サイトカインである。ＴＮＦαおよび他のサイトカインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞および平滑筋細胞由来組織因子の強力なメディエーターであることが示されており、それらは、血管壁へのフィブリンの沈着を調節する。心血管系疾患を有するヒトで検出される循環ＴＮＦαのレベルは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約０．１ｎｇ／ｍｌである。健常な個人では、循環ＴＮＦαのレベルはずっと低いか、検出限界以下である（たとえば、約０ｎｇ／ｍｌ〜約０．００１ｎｇ／ｍｌ）。

【0204】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで血栓症をモデル化する方法において、内皮細胞は、細胞培養容器内の面にプレーティングされる。細胞培養容器内の面は、多孔膜の面であっても良く、および、当該多孔膜は、当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養培地内で、下層には多孔膜の第一の面が含まれ、上層には多孔膜の第二の面および内皮細胞が含まれるよう規定される。あるいは、内皮細胞がプレーティングされる面は細胞培養容器の底である。

【0205】

１以上の追加の細胞型が、細胞培養容器内の面にプレーティングされても良く、または、細胞培養容器内の培地に吊るされても良い。たとえば、平滑筋細胞を、細胞培養容器内の多孔膜の第一の面にプレーティングし、内皮細胞を多孔膜の第二の面に置いても良い。多孔膜は、当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養培地内で、下層には多孔膜の第一の面および平滑筋細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面および内皮細胞が含まれるよう規定される。

【0206】

単球、マクロファージ、好中球、内皮前駆細胞、循環幹細胞、循環造血細胞、または白血球を、任意選択的に上層または下層内の細胞培養培地に懸濁しても良い。

【0207】

せん断力を、プレーティングされた内皮細胞に適用し、ここで、当該せん断力は血流力学フローデバイスにより生じた培養培地の流れから得られたものである。当該流れは、血栓症が発生する可能性がある脈管構造の領域で、ｉｎ ｖｉｖｏで内皮細胞が曝される流れを模倣する。たとえば、当該流れは、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）な血流力学的な流れである。

【0208】

培養培地に１以上の因子を添加する前に、せん断力を、一定期間、プレーティングされた内皮細胞に適用しても良い。たとえば、培養培地に１以上の因子を添加する前に、約１２〜約４８時間、約１２〜約３６時間、約１６〜約３２時間、または、約１８〜約２８時間、せん断力を内皮細胞に適用しても良い。たとえば、せん断力を、１以上の因子を添加する前に、約２４時間、プレーティングされた内皮細胞に適用しても良い。あるいは、培養培地に１以上の因子を添加するのと同時に、せん断力をプレーティングされた内皮細胞に適用しても良い。

【0209】

１以上の因子を培養培地に添加しても良い。たとえば、培養培地に添加された１以上の因子は、血栓症の発現または進行に関与する因子でであっても良い。因子（複数含む）は、血管系疾患を有する対象において見られる因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内である濃度で、培地に添加される。たとえば、ＴＮＦαは、血管系疾患を有する個人で見られるＴＮＦαのｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内である濃度で、培養培地に添加されても良い。たとえば、ＴＮＦαは、約０．００５ｎｇ／ｍｌ〜約０．２ｎｇ／ｍｌ、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約０．１ｎｇ／ｍｌ、約０．０３ｎｇ／ｍｌ〜約０．０７ｎｇ／ｍｌ、または、約０．０４ｎｇ／ｍｌ〜約０．０６ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加されても良い。ＴＮＦαは、約０．０５ｎｇ／ｍｌまたは約０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加されても良い。

【0210】

他の因子もまた、ＴＮＦαに加えて培養培地に添加されても良い。たとえば、酸化ＬＤＬ（ｏｘＬＤＬ）、グルコース、またはｏｘＬＤＬおよびグルコースの両方が、ＴＮＦαと組み合わせて、培養培地に添加されても良い。そのような因子は、血管系疾患を有する対象で見られる因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内である濃度で、培養培地に添加される。健常な個人においては、ｏｘＬＤＬの血漿濃度は、多くの場合、約２５μｇ／ｍｌ未満であり、一方、血管系疾患を有する患者においては、ｏｘＬＤＬの血漿濃度は、約２５μｇ〜約１００μｇ／ｍｌ超である。ゆえに、たとえば、ｏｘＬＤＬを，培養培地に約２５μｇ〜約１２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ〜約１００μｇ／ｍｌ、約４０μｇ〜約８０μｇ／ｍｌ、または、約２５μｇ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で添加しても良い。たとえば、ｏｘＬＤＬを、約２５μｇ／ｍｌ、または約５０μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加しても良い。

【0211】

グルコースもまた、培養培地に添加されても良い。糖尿病および関連グルコースレベルの増加は、血栓症のリスク因子である。健常な個人では、血中グルコース濃度は、約５ｍＭ〜約１０ｍＭである一方、糖尿病の個人では、血中グルコース濃度は、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ超の範囲にある。ゆえに、たとえば、グルコースを、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１２ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１４ｍＭ〜約１８ｍＭの濃度で培養培地に添加しても良い。たとえば、グルコースを、約１５ｍＭ、または約１７．５ｍＭの量で培養培地に添加しても良い。

【0212】

プレーティングされた内皮細胞へのせん断力の適用は、細胞培養培地への１以上の因子の添加の後に、一定期間、適切に継続される。

【0213】

せん断力の適用は継続されてもよく、たとえば、約１２時間〜約４８時間、約１８時間〜約３６時間、または約２０時間〜約３０時間、約１８時間〜約７２時間、または約２４時間〜約７２時間、継続されても良い。たとえば、細胞培養培地に１以上の因子を添加した後、せん断応力を、約２４時間、継続しても良い。

【0214】

次いで、内皮細胞を、血小板フリー血漿（ＰＬＰ）、カルシウムおよびフィブリノーゲンとインキュベートすることにより、血栓形成が誘導されても良い。このインキュベーションは、静的な状態で実施することができる。あるいは、このインキュベーションの間に、内皮細胞へのせん断力の適用を継続しても良い。細胞培養培地を上層から除去し、次いで、内皮細胞へのせん断力の継続適用の有無にかかわらず、内皮細胞を、ＰＬＰ、カルシウム、フィブリノーゲンと共にインキュベートしても良い。あるいは、せん断力の継続適用の有無にかかわらず、ＰＬＰ、カルシウムおよびフィブリノーゲンを、上層の細胞培養培地に添加しても良い。

【0215】

血栓症の模倣は、任意の多くの方法により評価することができる。一般的には、せん断力を適用していない内皮細胞もしくは平滑筋細胞または培養培地におけるマーカーレベルと比較した、せん断力を適用した内皮細胞もしくは平滑筋細胞または培養培地における血栓症マーカーレベルの変化により、血栓症の模倣が裏付けられる。たとえば、血栓症の模倣は、フィブリン沈着の分析、遺伝子もしくはタンパク質および／または分泌微粒子または血栓症に関連したタンパク質の発現の分析、または、血栓症に関連したタンパク質の活性を分析することにより、評価することができる。

【0216】

アテローム性動脈硬化症
また、本発明を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアテローム性動脈硬化症をモデル化することができる。アテローム性動脈硬化症は、低く、振動性のせん断応力（アテローム易発性のせん断応力）が内皮細胞に炎症性応答を「プライムする（ｐｒｉｍｅ）」、血管系領域内での炎症性シグナル伝達により特徴付けられる局所性の炎症性疾患である。炎症性応答の重要なメディエーターは、転写因子ＮＦκＢであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、アテローム易発性のせん断応力により活性化される。酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）は、進行性アテローム動脈硬化症の特徴であり、アテローム動脈硬化症の病変部位で見いだされ、心血管系の合併症を有する患者の循環血液中で増加する。ｏｘＬＤＬの主要成分である、酸化１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ｏｘＰＡＰＣ）は、標準的なＮＦκＢ経路を介して作用することは示されておらず、そして、ｏｘＬＤＬはｉｎ ｖｉｔｒｏの静的な単一培養においてＮＦκＢ依存性遺伝子の発現を増加させることができるが、多くの場合、これには、心血管系疾患を有する個人においてｉｎ ｖｉｖｏで観察されるよりも高い濃度のｏｘＬＤＬ（＞１００μｇ／ｍｌ）が必要となる。健常な患者においては、ｏｘＬＤＬの血漿濃度は、平均７μｇ／ｍｌである一方で、心筋梗塞を有する患者の平均血漿濃度は、約２８〜約３４μｇ／ｍｌであり、一部の患者は約６０μｇ／ｍｌのレベルである。ＴＮＦαもまた、進行性アテローム性動脈硬化症の病変部位で分泌されており、心筋梗塞を経験したことのある患者の循環血液中で上昇している。ＴＮＦαは強力な、炎症促進性サイトカインであり、高濃度（＞１ｎｇ／ｍｌ）でＮＦκＢのシグナル伝達を活性化することができる。

【0217】

従前のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、内皮細胞の静的な単一培養ですべて行われていた。本方法においては、対称的に、アテローム易発性の血流力学的せん断力が、ＮＦκＢシグナル伝達を活性化させることにより、内皮細胞の単一培養、または内皮細胞と平滑筋細胞の共培養を「プライム（ｐｒｉｍｅ）させ」、そして、ｏｘＬＤＬおよび／またはＴＮＦα、ならびに任意選択的に他のある因子を、脈管系疾患を有する患者において見られる当該因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で添加することによって、さらにＮＦκＢ活性および下流の炎症性シグナル伝達を増強させる。

【0218】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでアテローム性動脈硬化症をモデル化する本方法において、内皮細胞は細胞培養容器内の面にプレーティングされる。細胞培養容器内の面は、多孔膜の面であっても良く、当該多孔膜は、当該多孔膜の当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされてもよく、それにより、当該細胞培養培地内で、下層には多孔膜の第一の面が含まれ、上層には多孔膜の第二の面および内皮細胞が含まれるよう規定される。あるいは、内皮細胞がプレーティングされる面は、細胞培養容器の底である。

【0219】

１以上の追加の細胞型を、細胞培養容器内の面に置いても良く、または、細胞培養容器内の培地に懸濁しても良い。たとえば、平滑筋細胞を、細胞培養容器内の多孔膜の第一の面に置いても良く、および、内皮細胞を、当該多孔膜の第二の面に置いても良い。多孔膜は、当該多孔膜の当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養培地内で、下層には多孔膜の第一の面および平滑筋細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面および内皮細胞が含まれるよう規定される。

【0220】

単球、マクロファージ、好中球、内皮前駆細胞、循環幹細胞、循環造血細胞、または白血球を任意選択的に、上層または下層内の細胞培養培地内に懸濁しても良い。

【0221】

せん断力はプレーティングされた内皮細胞に適用され、ここで、当該せん断力は、血流力学的フローデバイスにより生じた培養培地の流れから生じるものである。当該流れは、アテローム性動脈硬化症が発生する可能性のある脈管系の領域で、ｉｎ ｖｉｖｏで内皮細胞が曝される流れを模倣する。たとえは、当該流れは、アテローム易発性の血流力学的な流れである。

【0222】

１以上の因子が培養培地に添加される前に、一定期間、せん断力をプレーティングされた内皮細胞に適用しても良い。たとえば、１以上の因子を培養培地に添加する前に、約１２時間〜約４８時間、約１２時間〜約３６時間、約１６時間〜約３２時間、または約１８時間〜約２８時間、せん断力を内皮細胞に適用しても良い。たとえば、１以上の因子の添加の前に、約２４時間、プレーティングされた内皮細胞にせん断力を適用しても良い。あるいは、１以上の因子を培養培地に添加すると同時に、プレーティングされた内皮細胞にせん断力を適用しても良い。

【0223】

１以上の因子を培養培地に添加しても良い。たとえば、培養培地に添加される１以上の因子は、アテローム性動脈硬化症の発現または進行に関与する因子であっても良い。そのような因子（複数含む）は、脈管系疾患を有する個人に置いて見られる因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で、培地に添加される。

【0224】

ｏｘＬＤＬを、脈管系疾患を有する個人に置いて見られるｏｘＬＤＬのｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で培養培地に添加しても良い。ゆえに、たとえば、ｏｘＬＤＬを，培養培地に、約２５μｇ〜約１２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ〜約１００μｇ／ｍｌ、約４０μｇ〜約８０μｇ／ｍｌ、または、約２５μｇ〜約５０μｇ／ｍｌの濃度で添加しても良い。たとえば、ｏｘＬＤＬを、約２５μｇ／ｍｌ、または約５０μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加しても良い。

【0225】

ｏｘＬＤＬの代わりに、またはｏｘＬＤＬと併せて、のいずれかで、他の因子をまた、培養培地に添加しても良い。限定されないが、因子としては、ＴＮＦα、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、トリグリセリド、トリグリセリド富化リポタンパク質（極低密度リポタンパク質（ｖＬＤＬ）、ｖＬＤＬ残余物、カイロミクロン、および／またはカイロミクロン残余物を含む）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、グルコース、インスリン、脂肪酸、ＴＧＦβ、または、それらの組み合わせが挙げられる。たとえば、ＴＮＦαを、ｏｘＬＤＬの代わりに培地に添加しても良い。あるいは、ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦαの両方を培地に添加しても良い。ＨＤＬをまた、任意選択的に培地に添加しても良い。たとえば、ＨＤＬを培地に単独で添加しても良く、または、たとえばＴＮＦαおよびｏｘＬＤＬ等の他の因子と併せて添加しても良い。トリグリセリド、またはトリグリセリド富化リポタンパク質（ｖＬＤＬ、ｖＬＤＬ残余物、カイロミクロン、および／またはカイロミクロン残余物を含む）をまた、単独、または、１以上の他の因子と併せてのいずれかで、任意選択的に培地に添加しても良い。グルコースをまた、培地に任意選択的に添加しても良い。たとえば、グルコースを、単独、または、たとえばＴＮＦα等の他の因子と併せて培地に添加しても良い。ＬＤＬまたはＴＧＦβをまた、単独、または他の因子と併せてのいずれかで、培地に添加しても良い。

【0226】

因子は、脈管系疾患を有する個人に置いて見られる因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で培地に添加される。ゆえに、たとえば、ＴＮＦαは、約０．００５ｎｇ／ｍｌ〜約０．２ｎｇ／ｍｌ、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約０．１ｎｇ／ｍｌ、約０．０３ｎｇ／ｍｌ〜約０．０７ｎｇ／ｍｌ、または、約０．０４ｎｇ／ｍｌ〜約０．０６ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加されても良い。たとえば、ＴＮＦαは、約０．０５ｎｇ／ｍｌまたは約０．１ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加されても良い。

【0227】

ｏｘＬＤＬを、約５０μｇ／ｍｌの濃度で培地に添加しても良い。

【0228】

ＴＮＦαを、約０．０５ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加しても良い。

【0229】

ＨＤＬを、脈管系疾患を有する個人、または脈管系疾患のリスクがある個人に置いて見られるＨＤＬのｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で、培養培地に添加しても良い。脈管系疾患のリスクがある個人におけるＨＤＬの濃度は、多くの場合、約３００μｇ／ｍｌ未満である一方、健常な個人におけるＨＤＬ濃度は、約３００μｇ／ｍｌ超〜約２，０００μｇ／ｍｌ（健常な、運動をしている患者）の範囲である。ゆえに、たとえば、ＨＤＬを、約１μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ〜２５０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ〜２００μｇ／ｍｌ、または、約９０μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加しても良い。たとえば、ＨＤＬを、約４５μｇ／ｍｌ、または約９０μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加しても良い。

【0230】

ＨＤＬは、ＴＮＦαおよびｏｘＬＤＬと併せて、培養培地に適切に添加されても良い。ＨＤＬ、ＴＮＦαおよびｏｘＬＤＬは、それぞれが、脈管系疾患を有する個人に置いて見られる、これら因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲（たとえば、これらの成分のそれぞれについて上記の濃度範囲）内の濃度で適切に存在する。たとえば、ＨＤＬは、約４５μｇ／ｍｌ、または約９０μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加され、ＴＮＦαは、約０．０５ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加され、および、ｏｘＬＤＬは、約５０μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加される。

【0231】

トリグリセリドまたはトリグリセリド富化リポタンパク質（極低密度リポタンパク質（ｖＬＤＬ）、ｖＬＤＬ残余物、カイロミクロン、および／またはカイロミクロン残余物を含む）を、脈管系疾患を有する個人に置いて見られる、これら因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で、培養培地に添加しても良い。健常な患者におけるトリグリセリドのレベルは、約４０ｍｇ／ｄＬ〜約１５０ｍｇ／ｄＬの範囲である。高トリグリセリド血症を有する患者においては、トリグリセリドのレベルは、約２００ｍｇ／ｄＬ〜約１５００ｍｇ／ｄＬ超の範囲である。ゆえに、たとえば、トリグリセリドは、約１７５ｍｇ／ｄＬ〜約１６００ｍｇ／ｄＬ、約２００ｍｇ／ｄＬ〜約１５００ｍｇ／ｄＬ、約４００ｍｇ／ｄＬ〜約１２００ｍｇ／ｄＬ、約６００ｍｇ／ｄＬ〜約１０００ｍｇ／ｄＬの濃度で培養培地に適切に添加される。

【0232】

糖尿病および関連血中グルコースレベルの増加は、アテローム性動脈硬化症のリスク因子である。それゆえ、グルコースもまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアテローム性動脈硬化症をモデル化する本方法において、培地に適切に添加されても良い。グルコースは、糖尿病を有する個人において見られるグルコースのｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で培養培地に添加される。健常な個人において、血中グルコース濃度は、約５〜約１０ｍＭである一方、糖尿病の個人においては、血中グルコース濃度は、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ超の範囲にある。ゆえに、たとえば、グルコースは、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭ、約１２ｍＭ〜約２０ｍＭ、または、約１４ｍＭ〜約１８ｍＭの濃度で培養培地に適切に添加される。たとえば、グルコースは、約１５ｍＭ、または約１７．５ｍＭの量で培養培地に添加されても良い。

【0233】

グルコースは、ＴＮＦαと共に培養培地に添加されても良い。グルコースおよびＴＮＦαは、糖尿病または脈管系疾患を有する個人に置いて見られるグルコースおよびＴＮＦαのｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲（たとえば、これらの成分のそれぞれに対する上記の濃度範囲）内の濃度で培養培地に添加される。たとえば、グルコースは、約１５ｍＭの濃度で培地に適切に添加され、ＴＮＦαは０．０５ｎｇ／ｍｌの濃度で培養培地に適切に添加される。

【0234】

グルコースおよびＴＮＦαの両方が培養培地に添加される場合、グルコースを培養培地に添加し、細胞を、せん断力の適用の前に、一定期間、グルコースの存在下で培養しても良い。たとえば、細胞は、せん断力の適用の前に、約１〜約７日間（たとえば、約３〜約５日、または約４日）グルコースの存在下で適切に培養される。次いで、ＴＮＦαを培養培地に添加する前に、一定期間、せん断力をプレーティングされた内皮細胞に適用しても良い。たとえば、ＴＮＦαを培養培地に添加する前に、せん断力を、約１２時間〜約４８時間、約１２時間〜約３６時間、約１６時間〜約３２時間、約１８時間〜約２８時間、または約２４時間、内皮細胞に適用しても良い。

【0235】

ＬＤＬおよび／またはＴＧＦβは、脈管系疾患を有する個人に置いて見られるＬＤＬまたはＴＧＦβのｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で培地に添加されても良い。健常な個人において、ＬＤＬのレベルは通常、約５０ｍｇ／ｄＬ〜約１００ｍｇ／ｄＬの範囲にある一方、アテローム性動脈硬化症の個人においては、ＬＤＬのレベルは通常、約１００ｍｇ／ｄＬ超である。ゆえに、たとえば、ＬＤＬは、約１００ｍｇ／ｄＬ〜約５００ｍｇ／ｄＬ、約１００ｍｇ／ｄＬ〜約３００ｍｇ／ｄＬ、または約１００ｍｇ／ｄＬの濃度で培養培地に適切に添加される。

【0236】

健常な個人におけるＴＧＦβのレベルは通常、約３０ｎｇ／ｍｌ未満である一方、脈管系疾患を有する個人のレベルは約３０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌである。ゆえに、ＴＧＦβは、約３０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、または約６０ｎｇ／ｍｌ〜約９０ｎｇ／ｍｌの範囲で培養培地に適切に添加される。

【0237】

１以上の因子が細胞培養培地に添加された後、プレーティングされた内皮細胞へのせん断応力の適用が、一定期間、適切に継続される。たとえば、約１２時間〜約４８時間、約１８時間〜約３６時間、約２０時間〜約３０時間、約１８時間〜約７２時間、または約２４時間〜訳７２時間、せん断応力の適用が継続されてもよい。たとえば、１以上の因子が細胞培養培地に添加された後、約２４時間、せん断応力が継続されてもよい。

【0238】

アテローム性動脈硬化症の模倣は、多くの方法により評価することができる。一般的には、せん断力を適用していない内皮細胞もしくは平滑筋細胞または培養培地におけるマーカーレベルと比較した、せん断力を適用した内皮細胞もしくは平滑筋細胞または培養培地におけるアテローム性動脈硬化症のマーカーレベルの変化により、アテローム性動脈硬化症の模倣が裏付けられる。たとえば、アテローム性動脈硬化症の模倣は、アテローム性動脈硬化症に関連したタンパク質または遺伝子の発現の分析、アテローム性動脈硬化症に関連したタンパク質の活性の分析、または分泌されたサイトカインレベルを分析することにより、評価することができる。

【0239】

高血圧
本発明の方法はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高血圧をモデル化するために用いることができる。アンギオテンシンＩＩ（ＡＮＧ２）のレベルは、心血管系の合併症（たとえば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病または高血圧）を有する患者において増加している。健常な患者において、標準的なＡＮＧ２の濃度は、約１ｎＭ〜約５ｎＭの範囲であり、高血圧の患者においては、約６ｎＭ〜約２０ｎＭ超の範囲である。さらに、アルドステロンは、レニン−アンギオテンシン系における下流の、ＡＮＧ２の重要なシグナル伝達ホルモンである。そのレベルは、多くの病態（アテローム性動脈硬化症、糖尿病および高血圧を含む）の下で変化しうる。健常な個人におけるアルドステロンの濃度は、約０．３ｍＭである。高アルドステロン症を有する個人におけるアルドステロンの濃度は、約０．８ｍＭ〜約１ｍＭの範囲である。

【0240】

ｉｎ ｖｉｔｒｏで高血圧をモデル化する方法においては、内皮細胞は細胞培養容器内の面にプレーティングされる。当該細胞培養容器内の面は、多孔膜の面であっても良く、当該多孔膜は、当該多孔膜の当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされても良く、それにより、当該細胞培養培地内で、下層には多孔膜の第一の面が含まれ、上層には多孔膜の第二の面および内皮細胞が含まれるよう規定される。あるいは、内皮細胞がプレーティングされる面は、細胞培養容器の底であっても良い。

【0241】

１以上の追加の細胞型を、細胞培養容器内の面に置いても良く、または、細胞培養容器内の培地に懸濁しても良い。たとえば、平滑筋細胞を、細胞培養容器内の多孔膜の第一の面に置いても良く、および、内皮細胞を、当該多孔膜の第二の面に置いても良い。多孔膜は、当該多孔膜の当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養培地内で、下層には多孔膜の第一の面および平滑筋細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面および内皮細胞が含まれるよう規定される。

【0242】

単球、マクロファージ、好中球、内皮前駆細胞、循環幹細胞、循環造血細胞、または白血球を任意選択的に、上層または下層内の細胞培養培地内に懸濁しても良い。

【0243】

せん断力はプレーティングされた内皮細胞に適用され、ここで、当該せん断力は、血流力学的フローデバイスにより生じた培養培地の流れから生じるものである。当該流れは、高血圧において、ｉｎ ｖｉｖｏで内皮細胞が曝される流れを模倣する。

【0244】

１以上の因子が培養培地に添加される前に、一定期間、せん断力をプレーティングされた内皮細胞に適用しても良い。たとえば、１以上の因子を培養培地に添加する前に、約１２時間〜約４８時間、約１２時間〜約３６時間、約１６時間〜約３２時間、または約１８時間〜約２８時間、せん断力を内皮細胞に適用しても良い。たとえば、１以上の因子の添加の前に、約２４時間、プレーティングされた内皮細胞にせん断力を適用しても良い。あるいは、１以上の因子を培養培地に添加すると同時に、プレーティングされた内皮細胞にせん断力を適用しても良い。

【0245】

１以上の因子が培養培地に添加されても良い。たとえば、培養培地に添加される１以上の因子は、高血圧の発現または進行に関与する因子であっても良い。因子（複数含む）は、脈管系疾患を有する対象に置いて見られる因子のｉｎ ｖｉｖｏ濃度範囲内の濃度で培地に添加される。たとえば、アンギオテンシンは、約５．５ｎＭ〜約２５ｎＭ、約６ｎＭ〜約２０ｎＭ、約８ｎＭ〜約１５ｎＭ、または約９ｎＭ〜約１２ｎＭ（たとえば、１０ｎＭの濃度）の濃度で培養培地に適切に添加される。

【0246】

アンギオテンシンは、他の因子（たとえば、アルドステロン）と組み合わせて、または単独でのいずれかで、培養培地に添加されても良い。あるいは、アルドステロンは、アンギオテンシン以外の因子と組み合わせて、または単独で、培養培地に添加されても良い。アルドステロンが培養培地に添加される場合、約０．５ｍＭ〜約１．５ｍＭ、または約０．８ｍＭ〜約１ｍＭ（たとえば、約１ｍＭの濃度）の濃度で適切に存在する。

【0247】

１以上の因子が細胞培養培地に添加された後、プレーティングされた内皮細胞へのせん断応力の適用が、一定期間、適切に継続される。たとえば、約１２時間〜約４８時間、約１８時間〜約３６時間、約２０時間〜約３０時間、約１８時間〜約７２時間、または約２４時間〜訳７２時間、せん断応力の適用が継続されてもよい。たとえば、１以上の因子が細胞培養培地に添加された後、約２４時間、せん断応力が継続されてもよい。

【0248】

アテローム性動脈硬化症の模倣は、多くの方法により評価することができる。一般的には、せん断力を適用していない内皮細胞もしくは平滑筋細胞または培養培地におけるマーカーレベルと比較した、せん断力を適用した内皮細胞もしくは平滑筋細胞または培養培地におけるアテローム性動脈硬化症のマーカーレベルの変化により、アテローム性動脈硬化症の模倣が裏付けられる。たとえば、アテローム性動脈硬化症の模倣は、遺伝子またはタンパク質および／もしくは分泌微粒子、またはアテローム性動脈硬化症に関連したタンパク質の発現の分析、アテローム性動脈硬化症に関連したタンパク質の活性の分析、または分泌されたサイトカイン、ケモカイン、増殖因子のレベルを分析することにより、評価することができる。

【0249】

生理学的な肝臓モデル
本発明はまた、肝臓の生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを作製するために用いることができる。そのような方法において、幹細胞は細胞培養容器内の面にプレーティングされ、せん断力は、当該プレーティングされた肝細胞に間接的に適用される。たとえば、幹細胞は、多孔膜の第一の面に適切にプレーティングされ、ここで、当該多孔膜は、当該第一の面が、当該細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、当該細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養培地内で、下層には肝細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれるよう規定される。せん断力は、当該容器の上層の多孔膜の第二の面に適用される。ゆえに、デバイス内の細胞の構成（図１５Ｃ）は、肝小葉のｉｎ ｖｉｖｏ微細構造に基づいている（図１５Ａ）。

【0250】

図１５Ａに示されるように、ｉｎ ｖｉｖｏの肝小葉において、肝細胞索１００は、類洞内皮細胞の層１１０および細胞外マトリクスの層１４０をろ過することにより、類洞血流１５０から分離される。細胞外マトリクスの層１４０は、肝細胞の拠り所をもたらし、シグナル伝達に関与し、そして、サイトカインおよび増殖因子のレゼルボアとなる。肝細胞１１０は、分極形態を有し、毛細胆管１２０は、肝細胞層に存在する。類洞血流１５０および間質血流１３０により、酸素および栄養素の輸送がもたらされる。

【0251】

図１５Ｂおよび１５Ｃにおいて、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏ肝モデルに置いて用いられている例示的な構成を示す。図１５Ｂおよび１５Ｃの挿入図に示されるように、肝細胞２６０は、細胞培養容器２４０に吊るされた多孔膜２５０にプレーティングされ、せん断力アプリケーター（図１５Ｂおよび１５Ｃにおいてコーン２３０として示されている）を用いて、多孔膜の反対側にせん断力を適用する。せん断力は細胞培養容器の培養培地の流れから生じる。多孔膜は、肝臓に存在する類洞内皮細胞層のろ過に類似的な役割を果たす。肝細胞は、流れの直接的な影響から保護されている（ｉｎ ｖｉｖｏでそうであるように）。細胞培養容器内の上層および下層の入口ならびに出口２７０により、培養培地の継続的な灌流、および細胞培養培地の内外への薬物または化合物の灌流が可能となる。せん断力の適用により、多孔膜を通る間質の流れおよび溶質の移動を制御する、管理された血流力学的状態が生み出される。本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏのモデルにおいて、肝細胞は、その分極形態および毛細胆管を維持する。

【0252】

図１５Ｃに図示されるように、１以上の細胞外マトリクス成分２８０（たとえば、コラーゲンゲル）の少なくとも１つの層を、多孔膜の第一の面に適切に沈着させても良い。次いで、肝細胞２６０が、当該細胞外マトリクス成分（複数含む）にプレーティングされる。次いで、当該肝細胞が当該細胞外マトリクス成分（複数含む）に十分に囲まれるように、当該細胞外マトリクス成分（複数含む）の１以上の追加の層を、当該肝細胞の最上部に沈着させても良い。当該細胞外マトリクス成分は、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラタン、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを適切に含む。たとえば、当該細胞外マトリクス成分はコラーゲンを含んでも良い。

【0253】

１以上の追加の細胞型を、細胞培養容器内の面に置いても良く、または、培養培地に懸濁しても良い。たとえば、非実質性肝臓細胞を、多孔膜の第二の面に適切にプレーティングし、せん断力を、プレーティングされた非実質性細胞に適用する。非実質性細胞には、肝臓星細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞またはそれらの組み合わせが含まれても良い。肝細胞および非実質性肝臓細胞は、動物の肝臓（たとえば、ヒトの肝臓）から単離された適切な初代細胞である。あるいは、肝細胞および／または非実質性肝臓細胞は、不死化細胞である。

【0254】

培地は、多孔膜の両側に継続的に適切に灌流され、一方、生理学的な血流値の範囲から生じたせん断力は、多孔膜の第二の面、またはプレーティングされた非実質性肝臓細胞に継続的に適用される。多孔膜の第二の面に適用されるせん断力は、ｉｎ ｖｉｖｏで発生する肝類洞を通る流れを模倣する。せん断率は、適切に、約０．１ダイン／ｃｍ^２〜約３．０ダイン／ｃｍ^２、約０．２ダイン／ｃｍ^２〜約２．５ダイン／ｃｍ^２、約０．３ダイン／ｃｍ^２〜約１．０ダイン／ｃｍ^２、または、約０．４ダイン／ｃｍ^２〜約０．８ダイン／ｃｍ^２である。たとえば、せん断率は、約０．６ダイン／ｃｍ^２であっても良い。あるいは、せん断率は、約２．０ダイン／ｃｍ^２であっても良い。

【0255】

生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏ肝臓モデルにおいて、１以上の因子が培養培地に存在する。これらの１以上の因子は、せん断力の下で、一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓の生理学的状態の模倣を維持することができる濃度で培地に添加されても良い（これら因子の同濃度は、せん断力が無い場合には、当該期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓の生理学的状態の模倣を維持することができない）。たとえば、因子は、インスリン、グルコース、またはインスリンとグルコースの組み合わせを含んでも良い。グルコースおよびインスリンは、静的な培養において一般的に用いられている濃度（グルコースは約１７．５ｍＭ、インスリンは約２μＭ）と比較して、低い濃度で適切に存在する。たとえば、グルコースは、約５ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で、または約５．５〜約７ｍＭの濃度で（たとえば、約５．５ｍＭの濃度で）、培養培地に存在しても良い。インスリンは、約０．０５ｎＭ〜約５ｎＭ（たとえば、約０．１ｎＭ〜約３ｎＭ、または約０．５〜約２．５ｎＭ，たとえば、約２ｎＭの濃度）で、培養培地に存在しても良い。１以上の因子は、せん断力の適用の前に、またはせん断力の適用と同時に、培養培地に適切に添加される。

【0256】

１以上の因子の濃度は、少なくとも約７日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約３０日間またはそれ以上、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肝臓の生理学的状態の模倣を適切に維持することができるものである。

【0257】

肝臓の生理学的状態の模倣は、多くの方法により評価することができる。一般的には、せん断力を適用していない肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞または培養培地におけるマーカーレベルと比較した、せん断力を適用した肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞または培養培地における肝臓の生理学的状態のマーカーレベルの変化により、肝臓の生理学的状態の模倣が裏付けられる。たとえば、肝臓の生理学的状態の模倣は、肝臓の生理学的状態の維持に関与する遺伝子またはタンパク質の発現について、肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞を分析することにより（たとえば、肝細胞における、代謝およびインスリン／グルコース／脂質の経路遺伝子）；脂質の蓄積について肝細胞を分析することにより；分化機能における変化について肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞を分析することにより（たとえば、肝細胞において、尿素およびアルブミン分泌を測定）；代謝活性における変化について肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞を分析することにより（たとえば、肝細胞において、チトクロームｐ４５０アッセイを用いて）またはトランスポーター活性について肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞を分析することにより；または、形態変化について、肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞を分析することにより、評価することができる。肝臓の生理学的状態はまた、肝細胞または非実質性肝臓細胞の、生体異物、栄養素、増殖因子、またはサイトカインへの反応を、同じ生体異物、栄養素、増殖因子またはサイトカインへのｉｎ ｖｉｖｏの肝臓の反応と比較することにより、評価することができる。

【0258】

以下の実施例４にさらに記述されるように、静的状態の下で培養される肝細胞とは異なり、本発明の生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏ肝臓モデルにおいて培養された肝細胞は、グルカゴン、インスリンおよびグルコース基質への反応性を維持している。ゆえに、グルカゴン、インスリンまたは１以上のグルコース基質に対する反応性を用いて、生理学的な肝臓の状態の模倣を評価することもできる（たとえば、糖新生アッセイを用いて）。適切なグルコース基質としては、グリセロール、乳酸塩、ピルビン酸塩、またはそれらの組み合わせ（たとえば、乳酸塩とピルビン酸塩の組み合わせ）が挙げられる。さらに、肝細胞がグルカゴンに対する反応性を維持していることから、本発明の生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏ肝臓モデルは、グルカゴン受容体と相互作用する薬物（たとえば、グルカゴン受容体アンタゴニスト）のｉｎ ｖｉｔｒｏの検証に用いることができる。

【0259】

さらに、本発明の生理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏの肝臓モデルで培養された肝細胞は、静的な培養システムよりもずっとｉｎ ｖｉｖｏに近い濃度および臨床Ｃ_ｍａｘレベルで、薬物に対する誘導および毒性反応を示す。ゆえに、本モデルを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏで効果を得られる薬物または化合物の濃度範囲内の濃度で、薬物および化合物をｉｎ ｖｉｔｒｏで検証することができる。

【0260】

脂肪性肝
本明細書に記述される方法を用いて、脂肪性肝疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを作製することもできる。肝細胞内の脂質制御は、複雑で、ダイナミックなプロセスである。トリグリセリドの蓄積は、高脂肪食からの脂肪酸取込の増加、末梢での脂肪分解の増加、またはｄｅ ｎｏｖｏの脂質生成の増加の結果として発生しうる。インスリンおよびグルコースは、ｄｅ ｎｏｖｏの脂質生成の重要なレギュレーターであり、トリグリセリド合成の刺激ならびにβ酸化による脂肪酸代謝の阻害による、肝細胞内のトリグリセリド含量の増加に寄与する。

【0261】

非アルコール誘導性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、肥満、ＩＩ型糖尿病、およびインスリン抵抗性が存在する場合のメタボリックシンドロームに関連している。ＮＡＦＬＤは、肝臓の脂肪症（肝臓における過剰な脂質の蓄積）により特徴付けられ、もし治療しないままにすると、炎症性変化（脂肪性肝炎）および肝硬変へと進行する。多くの動物モデルが、高血糖性−高インスリン環境を介して脂肪症を誘導する（たとえば、脂質生成を刺激するための、低脂質／高炭水化物食の使用を介して）。しかしながら、おそらくは静的な状態下の培養で肝細胞を維持するのに必要とされる、超生理的レベルのインスリン／グルコースが理由で、現在のｉｎ ｖｉｔｒｏ肝細胞モデルには、同様のことを誘導するための適切なインスリン−グルコース応答が欠落している。おそらく、静的な培養下では肝細胞のインスリン応答性が損なわれていること、および、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの肝細胞の急速な脱分化のために、そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは、インスリンおよびグルコースを介した肝細胞の脂肪変化を誘導することができない。

【0262】

対称的に、生理学的肝臓モデルに関する上述のように、管理された肝誘導性血流力学および輸送の存在下で培養された肝細胞は、分化機能、形態、ならびに、グルコースおよびインスリンの生理学的レベルでの反応性を保持している。このシステムにおいて、高濃度のインスリンおよびグルコースの導入（病的な状態）により、肝細胞に脂肪変化を誘導する。ゆえに、管理された血流力学的状態および輸送により、肝細胞におけるインスリンおよびグルコースに対する生理学的な反応がより引き起こされ、それにより、高インスリン、高血糖性の環境における脂肪症と関連した脂肪変化（糖尿病のインスリン抵抗性状態において、通常、最初に見られる）を誘導することができる。さらに、管理された血流力学的状態および輸送の存在下で培養された肝細胞は、静的な培養システムよりもずっとｉｎ ｖｉｖｏに近い濃度および臨床Ｃ_ｍａｘレベルで、薬物に対する誘導および毒性反応を示す。ゆえに、本システムは、脂肪性肝疾患のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを提供する。

【0263】

本モデルにおいて、肝細胞は通常、上述の生理学的肝臓モデルに対するものと同様の様式でプレーティングされる。肝細胞は、細胞培養容器内の面にプレーティングされ、せん断力は、プレーティングされた肝細胞に間接的に適用される。たとえば、肝細胞は、多孔膜の第一の面に適切にプレーティングされ、多孔膜は、第一の面が、細胞培養容器の底面に対し近位および空間的な関係となるように、細胞培養容器内に吊るされ、それにより、当該細胞培養容器内で、下層には肝細胞が含まれ、上層には多孔膜の第二の面が含まれるよう規定される。せん断力は、容器の上層の多孔膜の第二の面に適用される。

【0264】

１以上の細胞外マトリクス成分の少なくとも１つの層を、多孔膜の第一の面に適切に沈着させても良い。次いで、肝細胞を、当該細胞外マトリクス成分（複数含む）にプレーティングする。次いで、細胞外マトリクス成分（複数含む）の１以上の追加の層を、肝細胞が細胞外マトリクス成分（複数含む）に十分に囲まれるように、肝細胞の最上部に沈着させても良い。細胞外マトリクス成分は、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチン、硫酸ケラタン、ヒアルロン酸、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、またはそれらの組み合わせを適切に含む。たとえば、当該細胞外マトリクス成分はコラーゲンを含んでも良い。

【0265】

１以上の追加の細胞型を細胞培養容器内の面に置いても良く、または、培養培地に懸濁しても良い。たとえば、非実質性肝臓細胞を、多孔膜の第二の面に適切にプレーティングし、せん断力を、当該プレーティングされた非実質性細胞に適用する。非実質性細胞には、肝臓星細胞、類洞内皮細胞、クッパー細胞、またはそれらの組み合わせが含まれても良い。肝細胞および非実質性肝臓細胞は、動物の肝臓（たとえば、ヒトの肝臓）から適切に単離された初代細胞である。あるいは、肝細胞および／または非実質性肝臓細胞は、不死化細胞である。

【0266】

培地は、多孔膜の両側に継続的に適切に灌流され、一方、生理学的な血流値の範囲から生じたせん断力は、多孔膜の第二の面、またはプレーティングされた非実質性肝臓細胞に継続的に適用される。多孔膜の第二の面に適用されるせん断力は、ｉｎ ｖｉｖｏで発生する肝類洞を通る流れを模倣する。せん断率は、適切に、約０．１ダイン／ｃｍ^２〜約３．０ダイン／ｃｍ^２、約０．２ダイン／ｃｍ^２〜約２．５ダイン／ｃｍ^２、約０．３ダイン／ｃｍ^２〜約１．０ダイン／ｃｍ^２、または、約０．４ダイン／ｃｍ^２〜約０．８ダイン／ｃｍ^２である。たとえば、せん断率は、約０．６ダイン／ｃｍ^２であっても良い。あるいは、せん断率は、約２．０ダイン／ｃｍ^２であっても良い。

【0267】

ｉｎ ｖｉｔｒｏの脂肪性肝モデルにおいて、１以上の因子が培養培地に存在する。これらの１以上の因子は、せん断力の下で、一定期間、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪性肝の模倣を維持することができる濃度で培地に添加されても良い（因子の同濃度は、せん断力が無い場合には、当該期間、脂肪性肝疾患の模倣を維持することができない）。たとえば、因子は、インスリン、グルコース、またはそれらの組み合わせを含んでも良い。グルコースは、約１０ｍＭ〜約２５ｍＭの濃度で、約１２ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で、または約１４ｍＭ〜約１８ｍＭの濃度で（たとえば、約１７．５ｍＭの濃度で）、培養培地に適切に存在する。インスリンは、約１μＭ〜約３μＭ、約１．５μＭ〜約２．５μＭ、または約１．８μＭ〜約２．２μＭ（たとえば、約２μＭ）で、培養培地に適切に存在する。１以上の因子は、せん断力の適用の前に、またはせん断力の適用と同時に、培養培地に適切に添加される。

【0268】

１以上の因子の濃度は、少なくとも約７日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約３０日間またはそれ以上、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂肪性肝疾患の状態の模倣を適切に維持することができるものである。

【0269】

脂肪性肝疾患の模倣は、多くの方法により評価することができる。一般的には、せん断力を適用していない肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞または培養培地におけるマーカーレベルと比較した、せん断力を適用した肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞または培養培地における脂肪性肝疾患マーカーレベルの変化により、脂肪性肝疾患の模倣が裏付けられる。たとえば、脂肪性肝疾患の模倣は、脂肪性肝疾患状態に関与する遺伝子またはタンパク質の発現について肝細胞または非実質性肝臓細胞を分析することにより（たとえば、肝細胞において、代謝およびインスリン／グルコース／脂質の経路遺伝子）；脂質の蓄積について肝細胞を分析することにより（たとえば、肝細胞において、トリグリセリドレベルを測定または脂質滴の可視化）；分化機能における変化について肝細胞または非実質性肝臓細胞を分析することにより（たとえば、肝細胞において、尿素およびアルブミン分泌を測定）；代謝活性における変化について肝細胞または非実質性肝臓細胞を分析することにより（たとえば、肝細胞において、チトクロームｐ４５０アッセイを用いて）またはトランスポーター活性について肝細胞または非実質性肝臓細胞を分析することにより；または、形態変化について、肝細胞もしくは非実質性肝臓細胞を分析することにより、評価することができる。脂肪性肝変化への続発症を、肝細胞の酸化状態における変化、および周囲の細胞外マトリクス組成および量における変化を測定することにより、評価しても良い。

【0270】

本発明の詳述により、添付のクレームに定義される本発明の範囲から逸脱することなく、改変および変更が可能であることが、明らかであろう。

【実施例】

【0271】

実施例１：動脈血栓症および静脈血栓症に対するＩｎ ｖｉｔｒｏモデル
凝固カスケードにおいて、トロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンへと転換し、血管の表面に沈着して、血栓の形成が開始される（血栓症）。ＴＮＦαは、強力な炎症性サイトカインである。ＴＮＦαおよび他のサイトカインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮および平滑筋誘導性組織因子の強力なメディエーター（血管壁におけるフィブリン沈着を調節する）であることが示されている。心血管系疾患を有するヒトで検出されるＴＮＦαの循環レベルは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約０．１ｎｇ／ｍｌである。健常な個人においては、ＴＮＦαの循環レベルはずっと低いか検出限界以下であり、たとえば、約０ｎｇ／ｍｌ〜約０．００１ｎｇ／ｍｌである。

【0272】

方法：
ヒト内皮細胞を、ヒト由来の、領域特異的な血流力学の存在下、または非存在下で、平滑筋細胞と共に、または平滑筋細胞は伴わずに、共培養した。内皮細胞を、様々な濃度のＴＮＦαに曝露させ、ヒト血小板フリーの血漿（ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８（Ａ４８８、蛍光色素）標識化フィブリノーゲンを補充）中でインキュベートした。Ａ４８８フィブリノーゲンの、Ａ４８８への転換、および内皮への沈着は、共焦点顕微鏡で定量化した。

【0273】

（ｉ）静的な単一培養の血小板アッセイ
内皮細胞の静的な単一培養のために、内皮細胞を、１００，０００細胞／ｃｍ^２でカバースリップにプレーティングし、２４時間、接着させた。２４時間後、培地を、０ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、または２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを含有する培地と交換した。細胞を、４時間、３７℃でインキュベートした。インキュベートの後、培地を除去し、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞をさらに１５分間、３７℃で、ヒト血小板フリー血漿（ＰＦＰ）（３７．５μｇ／ｍＬ ＡＬＥＸＡ−４８８ヒトフィブリノーゲン、２０μｇ／ｍＬコーン（ｃｏｒｎ）トリプシン阻害物質、および１０ｍＭカルシウムを補充）と共にインキュベートした。このプロトコールを、図１Ａに示す。１５分後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した０．５ｎＭ ＳＹＴＯ８３（蛍光核酸染色）で、４５分間、染色した。カバースリップを、ＦＬＵＯＲＯＭＯＵＮＴ−Ｇ（封入剤）を用いてカバーグラスに乗せ、画像撮影した。

【0274】

（ｉｉ）せん断力を伴う、単一培養の血栓症アッセイ
内皮細胞を、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ（ポリカーボネート、１０μｍの厚さ、および、０．４μｍの孔直径、ｎｏ．３４１９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の多孔膜に１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングし、コーンアンドプレート（ｃｏｎｅ−ａｎｄ−ｐｌａｔｅ）デバイスを用いて、アテローム易発性（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｎｅ）またはアテローム保護的（ａｔｈｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）な血流力学的パターンに供した。

【0275】

せん断力（アテローム易発性またはアテローム保護的）を適用して２４時間後、培地に、０．０５ｎｇ／ｍＬまたは０．１０ｎｇ／ｍＬの濃度でＴＮＦαを補充し、さらに２４時間、せん断力を継続させた（図３Ａに示す）。次いで、上のチャンバーおよび下のチャンバーの両方から培地を除去し、内皮細胞を、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、内皮細胞を３７℃で１５分間、ＰＦＰ（３７．５μｇ／ｍＬのＡＬＥＸＡ−４８８ヒトフィブリノーゲン、２０μｇ／ｍＬのコーントリプシン阻害物質、および１０ｍＭカルシウムを補充）でインキュベートした。１５分後、４％ＰＦＡで細胞を固定し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液に溶解した０．５ｎＭ ＳＹＴＯ８３で４５分間、染色した。多孔膜のごく一部を、ＦＬＵＯＲＯＭＯＵＮＴ−Ｇを用いてカバーグラスに乗せ、画像撮影した。

【0276】

（ｉｉｉ）せん断力を伴う、共培養の血栓症アッセイ（プロトコールＡ）
平滑筋細胞を、２０，０００細胞／ｃｍ^２の密度で、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜の第一の面にプレーティングし、２時間、膜に接着させた。次いで、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬを反転させ、細胞を、血清を減らした増殖培地（２％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭ１９９）中で４８時間、インキュベートした。次いで、内皮細胞を、同じ培地条件の下、１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ多孔膜の第二の面にプレーティングし、せん断力を適用する前に、さらに２４時間、インキュベートした。

【0277】

せん断力（アテローム易発性またはアテローム保護的）適用の２４時間後、培地に、０．０５ｎｇ／ｍＬまたは０．１０ｎｇ／ｍＬの濃度でＴＮＦαを補充し、さらに２４時間、せん断力を継続させた（図３Ａに示す）。次いで、上のチャンバーおよび下のチャンバーの両方から培地を除去し、内皮細胞および平滑筋細胞の両方を、ＰＢＳで２回洗浄した。次いで、内皮細胞を３７℃で１５分間、ＰＦＰ（３７．５μｇ／ｍＬのＡＬＥＸＡ−４８８ヒトフィブリノーゲン、２０μｇ／ｍＬのコーントリプシン阻害物質、および１０ｍＭカルシウムを補充）でインキュベートし、単一培養についての上述のように固定および画像撮影を行った。

【0278】

（ｉｖ）せん断力を伴う共培養の血栓症アッセイ−プロトコールＢ
平滑筋細胞および内皮細胞をプレーティングし、アテローム易発性またはアテローム保護的なせん断力に供し、プロトコールＡについての上述のようにＴＮＦαで処置した。ＰＦＰ（３７．５μｇ／ｍＬのＡＬＥＸＡ−４８８ヒトフィブリノーゲン、２０μｇ／ｍＬのコーントリプシン阻害物質を補充）を、上層に添加して、およそ２７％の最終濃度のＰＦＰを作製した。ＰＦＰ／培地の組み合わせ中、最終濃度が１０ｍＭのカルシウムとなるよう、ＰＦＰにカルシウムをさらに補充した。次いで、内皮細胞をさらに１５分間、３７℃でインキュベートし、上述のように固定および画像撮影した。

【0279】

（ｖ）せん断力を伴う共培養の血栓症アッセイ−プロトコールＣ
平滑筋細胞および内皮細胞をプレーティングし、アテローム易発性またはアテローム保護的なせん断力に供し、プロトコールＡについての上述のようにＴＮＦαで処置した。次いで、コーンアンドプレートデバイスのコーンを、約２ｍｍまで上げて、流入／流出クリップを除去した。次いで、コーンを元の操作する高さまで下げた。ＰＦＰ（３７．５μｇ／ｍＬのＡＬＥＸＡ−４８８ヒトフィブリノーゲン、２０μｇ／ｍＬのコーントリプシン阻害物質を補充）を、上層に添加し、およそ２７％の最終濃度のＰＦＰを作製した。ＰＦＰ／培地の組み合わせ中、最終濃度が１０ｍＭのカルシウムとなるよう、ＰＦＰにカルシウムをさらに補充した。次いで、アテローム易発性またはアテローム保護的なせん断力を適用させ、さらに３０分間、共培養物をインキュベートした（図４Ａに示す）。３０分後、細胞培養ディッシュをデバイスから取り除き、培地を低層から取り除いた。次いで、内皮細胞を上述のように固定し、画像撮影を行った。

【0280】

結果：
（ｉ）静的な内皮細胞の単一培養
静的な状態の下で２４時間培養し、４時間、ＴＮＦαで処理した内皮細胞の培養物において、１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処理された試料は、最小のフィブリン沈着を示した一方、１０ｎｇまたは２０ｎｇ／ｍｌで処理された試料は、濃いフィブリンネットワークを示した（１．１７ｅ５ 対 ２．６９ｅ７ 対 ３．６１ｅ７ 各々、平均蛍光強度）（図１Ｂ、流入口はカラー画像）。血栓の断面図（左から右に向かう「ｘ軸」および、上下に向かう「ｚ軸」）は、面の上にある血栓の高さ（ｚ軸）を測定するために、積み重ねた状態でイメージ化された（図１Ｂの下の真ん中のパネルに示される）。平均グレー値は、細胞表面の上の、指定された高さでの積み重ねの各画像の蛍光強度である（図１Ｂの下にある一番右のパネル）。

【0281】

フィブリン沈着は、組織因子依存性であり、抗ＣＤ１４２抗体によりブロックされた。図１Ｃの上のパネルは、組織因子に対する抗体の存在下でのフィブリン沈着（ＣＤ１４２、左）、または対照抗体の存在下でのフィブリン沈着（ＩｇＧ１Ｋ、右）を示す。下のパネルは、同じフィールド内での核の染色を示し、このことから、細胞の存在が確認される。

【0282】

ゆえに、静的な状態の下では、内皮細胞は、凝固カスケードの開始に、ＴＮＦαによる活性化を必要とする。この活性化は、組織因子の活性化、および生理学的なレベルよりもおよそ２００倍高い濃度のＴＮＦαに依存している。

【0283】

（ｉｉ）せん断に供される、内皮細胞／平滑筋細胞の共培養
図２Ｂにおいて、血栓症に関連したいくつかの遺伝子の、内皮細胞および平滑筋細胞（アテローム易発性またはアテローム保護的な状態で増殖された）における相対遺伝子発現のヒートマップを示す（図２Ａ）。組織因子（Ｆ３）およびトロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）の遺伝子発現における相対変化を、ヒートマップの下に示す。アテローム易発性の血流力学は、アテローム保護的なせん断力と比較して、組織因子（Ｆ３）をアップレギュレートする。さらに、トロンビンに結合し、凝固カスケードを阻害するトロンボモジュリンは、ダウンレギュレートされた。さらに、ＴＮＦα刺激により、内皮細胞および平滑筋細胞の両方における、組織因子経路阻害物質（ＴＦＰＩ）が減少する。

【0284】

内頸動脈洞から誘導された炎症易発性血流力学的状態でプライムされ、０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処置された内皮／平滑筋細胞の共培養は、濃いフィブリンネットワークを沈着させた（１．９ｅ７ 平均蛍光強度）（図３Ｂ；上述のプロトコールＡを用いて作成されたデータ）。ゆえに、アテローム易発性の血流力学的状態は、サイトカイン活性化に対して内皮層をさらに応答性とするようにプライムし、静的な培養と比較して、１００〜２００倍低いレベルのＴＮＦαで、フィブリン沈着を誘導することができるようになる。

【0285】

内皮細胞のみを培養した同一の実験でも類似の結果が得られたことから（データは示さず）、この結果は血流力学的状態に特異的であり、平滑筋細胞の存在の結果ではないことが示された。

【0286】

図４Ｂにおいて、上述のプロトコールＣ（血栓形成の間、せん断力が維持され、生理学的状態により近く模倣されている）に従い実施された実験から得られた結果を示す。図４Ｂの上の２つのパネルにおいて、各状態に対する、積みかさねられた画像を示す（血栓のトポグラフィーを示すために、やや角度をつけている）。図４Ｂの棒グラフは、指定された細胞表面の上への距離での、これら各画像の蛍光強度を示す。細胞表面の上、６μｍおよび２１μｍでの代表的な画像を、図４Ｂの下の右側のパネルに示す。

【0287】

結論：
内皮細胞の静的な単一細胞には、フィブリン沈着を誘導するために、ヒト循環血液濃度とは関連しない、著しく高いレベルのＴＮＦαが必要とされる。アテローム易発性の血流力学的状態は、アテローム保護的な血流力学的状態と比較して、凝固因子をアップレギュレートし、凝固阻害物質をダウンレギュレートする。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける内皮細胞の血流力学的状態によるプライミングによって、ＴＮＦαに応答する用量依存性のフィブリン沈着を、心血管系疾患を有するヒトにおいて見られるＴＮＦαの循環レベルに類似した範囲の濃度へと変換する（静的な内皮細胞培養でフィブリン沈着を誘導するために必要とされるものよりも２桁分低い）。

【0288】

実施例２：アテローム性動脈硬化に対する、Ｉｎ ｖｉｔｒｏモデル
（ｉ）血流力学環境における、ｏｘＬＤＬの効果
（ａ）方法
ＬＤＬを酸化するために、天然型ＬＤＬ（ｎＬＤＬ）を、２４時間、ＰＢＳで透析して、ＥＤＴＡを取り除いた。次いで、ＬＤＬを、１３．８μＭのＣｕＳＯ_４を含有数ＰＢＳ中で、３日間、透析した。次いで、ＬＤＬを、５０μＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで、さらに２４時間、透析した。相対電気泳動数を用いて、各バッチの酸化レベルを確認した。酸化が完了した時点で、ｏｘＬＤＬを、使用するときまで、４℃、窒素雰囲気下で保存した。

【0289】

平滑筋細胞を、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜（ポリカーボネート、１０μｍの厚さ、０．４μｍの孔直径、ｎｏ．３４１９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の第一の面に、２０，０００細胞／ｃｍ^２の密度でプレーティングし、２時間、膜に接着させた。次いで、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬを反転させ、細胞を、血清を減らした増殖培地（２％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＭ１９９）中で４８時間、インキュベートした。次いで、内皮細胞を、同じ培地条件の下、１００，０００細胞／ｃｍ^２の密度で、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ多孔膜の第二の面にプレーティングし、せん断応力を適用する前に、さらに２４時間、インキュベートした。

【0290】

アテローム保護的、またはアテローム易発性の血流力でのせん断応力で、１６〜２４時間、前調整した後、ｏｘＬＤＬを１０〜５０μｇ／ｍｌの濃度で上層（内皮細胞を含有）に加えた（図５）。ｏｘＬＤＬを加えなかったデバイスには、同じ濃度でｎＬＤＬを上層に加え、ビヒクル対照として用いた。ｏｘＬＤＬのこの濃度は、心血管系疾患を有する患者に見られるｏｘＬＤＬの血漿濃度に類似している。せん断応力の適用は、ｏｘＬＤＬの存在下、さらに２４時間継続された。

【0291】

５つの異なるドナーのペアを用いて、内皮細胞および平滑筋細胞における、アテローム易発性の血流力学環境内での、ｏｘＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）応答を、ｎＬＤＬ（５０μｇ／ｍｌ）と比較して分析した。実験が完了した時点で、遺伝子アレイ分析のためにＲＮＡを採取した。０．０１のＦＤＲを用いて、重要な遺伝子とみなされた。遺伝子発現の結果は、β−２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現と比較した、相対遺伝子発現として表す。タンパク質発現の結果は、アクチンの発現と比較した、相対タンパク質発現として表す。ＮＦκＢの活性は、ＥＣおよびＳＭＣに感染させた、アデノウイルスＮＦκＢ−ルシフェラーゼ（Ａｄ−ＮＦκＢ−ｌｕｃ）レポーターを用いて分析された。

【0292】

（ｂ）結果
図６に示されるように、遺伝子発現に対する異なる濃度のｏｘＬＤＬの効果を、アテローム易発性の血流環境と、従来的な静的培養の間で比較した。これらのデータをさらに、ｏｘＬＤＬを伴わない「健常な」血流力学状態と比較した。（図６において、「健常な」とは、アテローム保護的な血流力学の適用を示し、「アテローム易発性」とは、アテローム易発性の血流力学の適用を示す；「従来的な」とは、静的な培養条件の適用を示す。平均±ＳＥ，ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５、ｔ検定）。血流力学的環境は明らかに多くの炎症促進性遺伝子および抗炎症性遺伝子（ＩＬ８、Ｅ−セレクチン（ＳＥＬＥ）、ＫＬＦ２、ｅＮＯＳ）を制御していた。ｎＬＤＬと比較して、ｏｘＬＤＬの添加に対する反応によって、血流力学的な環境に依存した、遺伝子発現における用量依存性の変化が生じた。

【0293】

特に、従来的な静的培養での、従前に公表された研究において、ＨＯ−１およびＡＴＦ３が、「古典的な」ｏｘＬＤＬ感受性遺伝子であることが示されてきた。図６Ａおよび６Ｂに示されるように、ｏｘＬＤＬは、従来的な静的条件と比較し、アテローム易発性の状態の下、より高いレベルでこれらの遺伝子を活性化している。

【0294】

アテローム易発性の状態に特有のこととして、ｏｘＬＤＬは、たとえばＩＬ８およびＥ−セレクチン（ＳＥＬＥ）等の炎症性遺伝子を活性化することも判明した（従来的な静的培養では、これら遺伝子は影響を受けない）（図６Ｃおよび６Ｄ）。驚くべきことに、ｏｘＬＤＬは、アテローム保護的なシグナル伝達（ｅＮＯＳおよびＫＬＦ２）を減少させていた（図６Ｅおよび６Ｆ）。

【0295】

図７において、アテローム易発性の血流力学環境でのｏｘＬＤＬ処置に反応したタンパク質発現における変化を示す。遺伝子発現と一致して、ｏｘＬＤＬ処置により、ＶＣＡＭ−１タンパク質発現の上昇（炎症促進性；図７Ａ）、およびアテローム保護的なｅＮＯＳシグナル伝達のリン酸化の減少（図７Ｂ）がもたらされた。さらに、ｏｘＬＤＬ処置により、分泌サイトカイン（たとえば、ＩＬ６、ＩＬ８およびＭＣＰ−１、図７Ｃ〜７Ｅ）のレベル増加がもたらされた。図７において、平均±ＳＥ、ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５、ｔ検定。

【0296】

ｏｘＬＤＬにより影響を受けた遺伝子およびタンパク質の多くがＮＦκＢ依存性であるため、ＮＦκＢの活性を、内皮細胞および平滑筋細胞において、ルシフェラーゼレポーターを用いて分析した。図８に、内皮細胞（図８Ａ）において、健常な状態と比較して、アテローム易発性の血流力学的状態が、ＮＦκＢの活性を増加させるように細胞を「プライムする（ｐｒｉｍｅ）」ことを示す。この反応は、ｏｘＬＤＬの処置でさらに高まる。同様に、平滑筋細胞（図８Ｂ）において、ｏｘＬＤＬの処置で、ＮＦκＢシグナル伝達が上昇したことが示された（ｏｘＬＤＬは、内皮細胞のみを含有する上層に添加されたのではあるが）。図８において、平均±ＳＥ、ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５、ｔ検定。

【0297】

フルゲノムアレイを用いて、５０μｇ／ｍｌ ｎＬＤＬと５０μｇ／ｍｌ ｏｘＬＤＬの間の、アテローム易発性の状態の下、ＥＣおよびＳＭＣにおける遺伝子発現の差異を調査した。図９において、５人のドナー（内皮細胞）または４人のドナー（平滑筋細胞）に対する、２つの異なる状態からの、遺伝子発現に対するヒートマップを示す。ストリンジェントな統計的カットオフ基準を用いたところ（ＳＡＭおよびｗＬＰＥ法）、ｎＬＤＬで処置された細胞と比較し、６８８の遺伝子が内皮細胞において制御され、３０４の遺伝子が平滑筋細胞において制御されていた。これらの遺伝子パネルは、せん断応力で制御された、炎症促進性遺伝子（ＶＣＡＭ、Ｅセレクチン）および抗炎症性遺伝子（ＫＬＦ２、ｅＮＯＳ）で富化されていた。

【0298】

要約すると、ｏｘＬＤＬは、従来的な静的培養においては、一部の経路（ＨＯ−１、ＡＴＦ３）を活性化することが知られているが、他（Ｅ−セレクチン、ＩＬ６）は知られていない。本明細書において、アテローム易発性の血流力学環境下においてｏｘＬＤＬを添加することにより、内皮の「アテローム保護的な」シグナル伝達（ＫＬＦ２、ｅＮＯＳ発現およびリン酸化）を優先的に減少させ、さらに、炎症促進性シグナル伝達（接着分子発現およびサイトカイン分泌を含む）を活性化させることが判明した。アテローム易発性のせん断応力またはＬＤＬのいずれかに直接的に曝されたわけではないが、本共培養システムの下層のＳＭＣのこれらの状態により多くの遺伝子（炎症性遺伝子を含む）が制御された。生理学的なせん断応力との関連におけるｏｘＬＤＬの役割を調査することにより、さらに炎症促進性の表現型へと向かう、アテローム易発性に制御された遺伝子プロファイルの増強が判明した。これらの状態は、ヒト動脈における血管壁の炎症を模倣し、進行性アテローム性動脈硬化症の治療を目的とする薬物の検証に理想的な環境を提供する。

【0299】

（ｉｉ）血流力学的環境におけるＴＮＦαの効果
（ａ）方法
ＴＮＦαは強力な炎症性サイトカインである。ＴＮＦαの濃度は、慢性心疾患を有する患者の重篤度により、約０．０２ｎｇ／ｍｌのレベルまで調節される一方、健常な個人においては、ＴＮＦαは通常、もっと低いか、または検出限界以下である。上記のように、心血管系疾患を有するヒトにおいて検出される循環ＴＮＦαレベルは、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約０．１ｎｇ／ｍｌである。健常な個人において、循環ＴＮＦαのレベルはもっと低いか、または検出限界以下であり、たとえば、約０ｎｇ／ｍｌ〜約０．００１ｎｇ／ｍｌである。比較すると、静的なｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では通常、１〜１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＴＮＦαを用いる。

【0300】

平滑筋細胞および内皮細胞を、ｏｘＬＤＬ実験に対する上述と同じ様式で、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜の第一の面および第二の面においた。

【0301】

アテローム易発性またはアテローム保護的な血流力での、せん断応力の前調整の２４時間後、ＴＮＦαを、上層（内皮細胞を含有）に、０．０５〜１ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した（図５を参照のこと）このＴＮＦαの濃度は、心血管系疾患を有する患者に置いて見られるＴＮＦαの血漿濃度と類似している。せん断応力適用は、ＴＮＦαの存在下でさらに２４時間、継続させた。

【0302】

（ｂ）結果
図１０に示すように、１８〜２４時間の血流力学的プライミングにより、従来の静的培養と比較して、内皮細胞および平滑筋細胞がより低いレベルのＴＮＦαに対し感受性となることが判明した。内皮細胞を０．１〜１ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで処置することにより、アテローム易発性の血流力学的応力を適用した培養において、Ｅ−セレクチン、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ、およびＩＬ８の発現が増加したことにより示されるように、炎症反応を誘導した。（静的培養では同レベルで炎症反応は見られない）。図１０において、「従来法」とは、細胞が静的培養の下で培養されたことを示し、「病的」とは、細胞に、アテローム易発性の血流力学的応力を適用したことを示す。図１０において、データは、平均±ＳＥ、ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５、ｔ検定として示されている。

【0303】

（ｉｉｉ）血流力学的環境における、ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦαの効果
（ａ）方法
アテローム性動脈硬化症の炎症ステージをより模倣するためには、複数の循環因子を組み合わせ、ヒト血管内に存在する複雑性をより良く模倣することが望ましい。これらの実験のために、内皮細胞および平滑筋細胞を、上述と同じ様式でプレーティングし、１８〜２４時間、アテローム易発性のせん断応力の前調整を行った。次いで、上層の培地を、０．０５ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦαおよび、５０μｇ／ｍｌのｏｘＬＤＬを含有する培地と交換した。５０μｇ／ｍｌのｎＬＤＬのみを含有する培地を、対照として使用した。

【0304】

アテローム防御性またはアテローム易発性の血流力でのせん断応力の前調整を２４時間行った後、５０μｇ／ｍｌのｏｘＬＤＬおよび０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを上層（内皮細胞を含有）に添加した。このＴＮＦαの濃度は、心血管系疾患を有する患者に見られる血漿ＴＮＦα濃度に類似している。ｏｘＬＤＬを加えなかったデバイスには、同じ濃度でｎＬＤＬを上層に加え、ビヒクル対照として用いた。せん断応力の適用は、ＴＮＦαおよびｏｘＬＤＬの存在下、さらに２４時間継続された（図５を参照のこと）。遺伝子発現分析を、ＲＴ−ＰＣＲを用いて行った。

【0305】

（ｂ）結果
これらの因子（ｏｘＬＤＬおよびＴＮＦα）の組み合わせは、遺伝子およびタンパク質発現の両方の相乗的増加を示し、また、ｏｘＬＤＬまたはＴＮＦα単独のいずれかよりも、広くシグナル伝達の活性化をもたらした。図１１Ａにおいて、炎症促進性接着分子であるＥ−セレクチン（ＳＥＬＥ）が、ｏｘＬＤＬ単独と比較して、遺伝子発現が増加したことを示す。ゆえに、図６に示す結果と同様、ｏｘＬＤＬは、ｎＬＤＬで処置した対照よりも、高いレベルのＥ−セレクチン遺伝子発現をもたらした。ｏｘＬＤＬとＴＮＦαの添加により、さらに高いレベルの炎症性遺伝子発現がもたらされた。

【0306】

さらに、ｅＮＯＳ転写（ＮＯＳ３）を介したアテローム防御性シグナル伝達は、炎症状態においては強く抑制されている。この反応は、アテローム易発性せん断応力＋ｏｘＬＤＬ＋ＴＮＦαの組み合わせで増幅された（図１１Ｂ）。ゆえに、ｅＮＯＳ遺伝子発現（ＮＯＳ３）は、ｏｘＬＤＬにより抑制されるが、ＴＮＦαおよびｏｘＬＤＬの組み合わせでは、アテローム易発性シグナル伝達はさらに抑制される。最終産物は、アテローム易発性状態の単独と比較して、より高い基礎レベルの炎症性シグナル伝達を有するシステムとなる。

【0307】

（ｉｖ）血流力学的環境における、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の効果
（ａ）方法
ｎＬＤＬまたはｏｘＬＤＬとは明確に異なる血漿コレステロールの追加成分は、ＨＤＬである。血流力学的環境における、ＨＤＬの効果を分析するために、内皮細胞および平滑筋細胞を上述のようにプレーティングし、２４時間、アテローム易発性のせん断応力の前調整を行った。次いで、上層に４５〜１，０００μｇ／ｍｌの濃度でＨＤＬを添加した。この広範な範囲は、ヒト患者内に存在しうるＨＤＬ濃度の広範な範囲を反映している。血管系疾患に対するリスクがある個人におけるＨＤＬの濃度は、通常、約３００μｇ／ｍｌ未満である一方、健常な個人におけるＨＤＬ濃度は、約３００μｇ／ｍｌ〜約２，０００μｇ／ｍｌ超（健常な運動をしている患者）の範囲にある。

【0308】

上述のようにプレーティングされた追加の実験において、内皮細胞／平滑筋細胞の共培養を、血流力学的せん断応力で１６時間、前調整した。１６時〜２４時に、細胞をさらに、上層において、０．０５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαおよび５０μｇ／ｍｌのｏｘＬＤＬでプライムした（５０μｇ／ｍｌのｎＬＤＬを含有するビヒクル対照と比較）。２４時間で、４５μｇ／ｍｌまたは９０μｇ／ｍｌのＨＤＬを上層の培地に添加し、さらに２４時間（２４時〜４８時）、血流力学的せん断応力を継続した。

【0309】

（ｂ）結果
４５μｇ／ｍｌまたは９０μｇ／ｍｌでＨＤＬを添加することにより、多くのアテローム防御性の遺伝子が活性化される一方、炎症促進性遺伝子およびタンパク質の活性化が阻害される。

【0310】

（ｖ）血流力学的環境における、トリグリセリド含有リポタンパク質の効果
トリグリセリド（ＴＧ）は、心血管系疾患の重要なバイオマーカーである。極低密度リポタンパク質（ｖＬＤＬ）およびｖＬＤＬ残余物、ならびにカイロミクロン（ＣＭ）残余物を含有する、いくつかの種のトリグリセリド富化リポタンパク質（ＴＲＬ）は、ＬＤＬとは無関係にアテローム発生を促進するようである。健常な患者におけるＴＧレベルは、約４０〜約１５０ｍｇ／ｄＬの範囲である。高トリグリセリド血症を有する患者においては、ＴＧレベルは、約２００ｍｇ／ｄＬ〜約１，５００ｍｇ／ｄＬ超の範囲にある。

【0311】

内皮細胞／平滑筋細胞の共培養を、上述のようにプレーティングし、アテローム易発性のせん断応力で、２４時間、前調整しても良い。極低密度リポタンパク質（ｖＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）、ならびにｖＬＤＬおよびＣＭの残余物粒子を含有するＴＧ含有リポタンパク質を、５００ｍｇ／ｄＬ（高トリグリセリド血漿を有する患者において見られる代表的なレベルの濃度）で当該システムに添加しても良い。各成分の処置濃度はＴＧの割合に基づいており、これら成分の各々は以下に相当する：ｖＬＤＬは、ＴＧの約５３％を構成し、ゆえに、０．５３ｘ５００ｍｇ／ｄＬ＝２６５ｍｇ／ｄＬ；ＣＭは、ＴＧの約３８％を構成し、ゆえに、０．３８ｘ５００ｍｇ／ｄＬ＝１９０ｍｇ／ｄＬである（高トリグリセリド血症の状態）。これを、８０ｍｇ／ｄＬのｖＬＤＬ、および５７ｍｇ／ｄＬのＣＭの、１５０ｍｇ／ｄＬの循環トリグリセリドのレベル（健常な患者に置いて見られる代表的なレベル）に基づく、対照条件と比較しても良い。血流力学的な前調整の２４時間後、ｖＬＤＬ、ＣＭ、またはｖＬＤＬ＋ＣＭを、実験の残りの２４時間に、加えても良い。ｖＬＤＬおよびＣＭ残余物様タンパク質（ＲＬＰ）は、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）で、上述の同濃度物を処理することにより作製することができる。ＲＬＰを、個々に、またはｖＬＤＬおよび／またはＣＭと組み合わせて添加しても良い。

【0312】

（ｖｉ）血流力学的な環境における、ＴＮＦαと組み合わせたグルコースの効果
（ａ）方法
糖尿病は、インスリンおよびグルコースのホメオスタシスが変化した特徴を有する疾患である。健常人においては、血中グルコース濃度は約５〜１０ｍＭである一方、糖尿病の場合には、血中グルコース濃度は、約１０ｍＭ〜約２０ｍＭ超の範囲にある。糖尿病および関連グルコースレベルの上昇は、アテローム性動脈硬化症のリスク因子である。

【0313】

内皮細胞および平滑筋を上述のように置いた。せん断応力の適用の前に、４日間、内皮細胞および平滑筋細胞を、増加グルコース条件（１５ｍＭ）または基準グルコース条件（５ｍＭ、ほとんどの培地組成において見られる濃度）の存在下で培養した（浸透圧における変化の可能性を証明するための、グルコースに対するビヒクル対照として、マンノースを補充）。次いで、培養物を２４時間、アテローム易発性の血流力学下で前調整し、次いで、０．０５ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦα（心血管系疾患を有する患者に見られる循環レベルに類似の濃度）にさらに２４時間、曝した。実験の終了時に、ＲＴ−ＰＣＲを用いた遺伝子発現分析のためにＲＮＡを回収した。一部の実験において、ルシフェラーゼアッセイを用いたＮＦκＢの測定を行うために、ＮＦκＢ−ルシフェラーゼ構築物を有するアデノウイルスに内皮細胞を感染させた。ＮＦκＢ活性、ならびに炎症促進性遺伝子（Ｅ−セレクチンおよびＩＣＡＭ）および抗炎症性遺伝子（ＫＬＦ２およびｅＮＯＳ）を分析した。

【0314】

（ｂ）結果
血流力学実験に供する前に、細胞を、増加したレベルのグルコースに慢性的に曝した。図１２に示される実験について、内皮細胞は、残りの実験に対し、増加グルコースの存在下で、アテローム易発性の血流力を用いて前調整した。実験の最後で、遺伝子発現およびＮＦκＢ活性を、ＴＮＦαと組み合わせたグルコース処置の作用として分析した。

【0315】

基準レベルの遺伝子（未処置）に対し、増加グルコースは何も効果が無かった一方で、アテローム易発性せん断応力およびＴＮＦαで処置した試料は、増加グルコースで前処置した際、炎症性シグナル伝達が、マンノース対照と比較し、高レベルであった。図１２Ａおよび１２Ｂにおいて、増加グルコースが、炎症性シグナル伝達の活性化（ＮＦκＢ活性を含む、図１２Ａ）、ならびに、接着分子Ｅ−セレクチンおよびＩＣＡＭの下流遺伝子活性化（図１２Ｂ）を上昇させたことを示す。増加グルコースはまた、マンノース処置対照と比較して、アテローム保護的なシグナル伝達（ｅＮＯＳ、ＫＬＦ２）を大幅に減少させた（図１２Ｃ）。図１２の結果は、平均±ＳＥ、ｎ＝４、^＊ｐ＜０．０５、ｔ検定として表されている。

【0316】

実施例３：高血圧に対するＩｎ ｖｉｔｒｏモデル
（ｉ）アンギオテンシンＩＩ（ＡＮＧ２）
アンギオテンシンＩＩ（ＡＮＧ２）レベルは、心血管系合併症（たとえば、アテローム性動脈硬化症、糖尿病または高血圧）を有する患者において増加している。典型的なＡＮＧ２の濃度は、健常な患者において約１ｎＭ〜約５ｎＭの範囲であり、高血圧患者においては、約６ｎＭ〜約２０ｎＭ超である。

【0317】

血流力学的環境下でのＡＮＧ２の効果を分析するために、内皮細胞および平滑筋細胞を上述のようにプレーティングし、健常な、およびアテローム易発性の血流力でのせん断応力前調整を２４時間行った。１０ｎＭ（１０．４６ｎｇ／ｍｌ）の濃度のＡＮＧ２、またはＤＭＳＯビヒクル対照（ＶＥＨ）を、上層に添加し、遺伝子アレイ分析のためにＲＮＡを回収した。

【0318】

ＤＭＳＯビヒクル対照と比較した、この条件での遺伝子アレイ分析により、ＡＮＧ２によりアップレギュレートされた多くの重要な炎症性遺伝子が明らかとなった。図１３において、健常およびアテローム易発性（病的）状態の両方で、ＡＮＧ２処理した内皮細胞（図１３Ａ）および平滑筋細胞（図１３Ｂ）の両方に対する遺伝子発現ヒートマップを示す。図１３に示されるように、多くの遺伝子がＡＮＧ２によって明らかに制御されており、不偏的な方法でＡＮＧ２条件は共に分類された。

【0319】

（ｉｉ）アルドステロン
アルドステロンはレニン−アンギオテンシン型において、ＡＮＧ２の下流にある重要なシグナル伝達ホルモンである。そのレベルは多くの病状（アテローム性動脈硬化症、糖尿病および高血圧を含む）の存在の下で変化しうる。健常な個人におけるアルドステロンの濃度は約０．３ｍＭである。高アルドステロン症を有する個人におけるアルドステロンの濃度は、約０．８ｍＭ〜約１ｍＭの範囲である。

【0320】

血流力学的環境におけるアルドステロンの効果を分析するために、内皮細胞および平滑筋細胞を上述のようにプレーティングし、健常およびアテローム易発性の血流力でせん断応力前調整を２４時間行った。１ｍＭの濃度のアルドステロンまたはビヒクル対照（ＶＥＨ）を上層に添加し、遺伝子アレイ分析のためにＲＮＡを回収した。

【0321】

ＤＭＳＯビヒクル対照と比較した、この条件での遺伝子アレイ分析により、アルドステロンによりアップレギュレートされた多くの重要な炎症性遺伝子が明らかとなった。図１４において、健常およびアテローム易発性（病的）状態の両方で、アルドステロン（Ａｌｄｏ）処理した内皮細胞および平滑筋細胞に対する遺伝子発現ヒートマップを示す。多くの重要な遺伝子がこれら条件により制御されており、制御された遺伝子の多くは、アテローム易発性の血流力学的環境内において見出された。

【0322】

実施例４：生理学的なＩｎ Ｖｉｔｒｏ肝臓モデル
一つには、長い間、ｉｎ ｖｉｖｏで代謝表現型を維持する生理学的なパラメーターが無いために、静的肝細胞培養法では、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの間にはほとんど相関関係が無い。発明者らは、生理学的な血流力学的状態および輸送を復活させることにより、標準的な静的肝細胞コラーゲンゲル構造と比較して、肝細胞の表現型および機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで維持できることを発見した。

【0323】

ｉｎ ｖｉｖｏの肝臓血液循環と類似した流体力学および輸送を有する細胞性の肝細胞システムを再現するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、血管内皮細胞のヒト由来血流力学的血流力への暴露を再現することによる、ｉｎ ｖｉｖｏ血管細胞表現型の再構築に広く用いられている、コーンアンドプレートデバイスを元にした技術を用いた。この技術は米国特許第７，８１１，７８２号に記述されている（参照により、その内容は本明細書に援用される）。当該技術（図１５Ｂ）を、ｉｎ ｖｉｖｏの肝臓循環値を反映する、血流力学的流れ、および輸送条件を適用するラット肝臓単一培養システムに適合させ、改変した。当該デバイスの細胞構造（図１５Ｃ）は、肝細胞索が、内皮細胞層のろ過により類洞血流から分離される、肝小葉のｉｎ ｖｉｖｏ微細構造（図１５Ａを参照のこと）に基づいている。このデザインは、細胞培養容器に吊るされている多孔ポリカーボネートと、当該多孔膜の片側がコラーゲンゲルでサンドイッチされている初代ラット肝細胞を使用する。多孔膜は、肝臓に存在する類洞内皮細胞の濾過層に似た作用を有する。培地は、多孔膜の両側で継続的に灌流され、生理学的血流値の範囲由来の血流力は多孔膜の非細胞側に継続的に適用される。セットアップ全体は、５％ＣＯ_２および３７℃に制御された環境中に収納される。流れをベースにした培養システムにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏでそうであるように、肝細胞は直接的な流れの効果から保護される場所が実用的に作られた。血行状態を再現することで、肝類洞の微細構造と類似するよう設計されたシステムにおいて、ｉｎ ｖｉｖｏの肝臓に似た分化した肝臓の表現型および代謝表現型の安定した保持がもたらされる。

【0324】

方法
（ｉ）動物の外科的手術および肝細胞単離
本実験に用いられた全ての動物は、ＨｅｍｏＳｈｅａｒ’ｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ＆ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されたプロトコールに従って処置された。肝細胞は、２０ｍＬ／分の流速を用いたＳｅｇｌｅｎの２ステップコラゲナーゼ灌流法（Ｓｅｇｌｅｎ， Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｓ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｇｎｅｓｉｓ， Ｊ． Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｈｅａｌｔｈ， ５（２-３）： ５５１-５６０ （１９７９）（参照によりその内容は本明細書に援用される）の改変法により、オスのＦｉｓｃｈｅｒラット（２５０〜３５０ｇ）から単離された。簡潔に述べると、ラットをイソフルランで麻酔し、その後、腹腔を切開し、流出肝門脈を切除しながら、下大静脈にカニューレ挿管した。肝臓を２ステップで潅流した（最初は血液をフラッシュアウトし細胞間結合を破壊するためのＣａ^＋＋フリー緩衝液、次いで、細胞外コラーゲンマトリクスを消化するためのＣａ^＋＋含有緩衝液に溶解したコラゲナーゼ）。肝臓を適切に灌流した後、摘出し、滅菌フード下で、ペトリディッシュのカプセルから解放させた。富化された肝細胞群（約９５％の純度）を、２つの連続的な６５ｇの遠心および１０分間の洗浄サイクル（各々は、その後、９０％ＰＥＲＣＯＬＬ（ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）でコートされた直径１５〜３０ｎｍのコロイドシリカ粒子（水中２３重量％）。細胞単離に用いられる密度勾配を作製するために用いられた）での１０分のスピンが続く）により得た。肝細胞の活性は、トリパンブルー排出テストにより測定され、８５％を超える活性を有する細胞を用いた。

【0325】

（ｉｉ）細胞培養およびデバイス操作条件
肝細胞培養培地：図１６〜２０に示されるデータについて、高グルコース（１７．５ｍＭ）を含有し、ウシ胎児血清（細胞をプレーティングする際には１０％、２４時間後の維持の際には２％まで減少）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２の基準培地が、ラット肝細胞培養培地に含まれた。また、当該培地には、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度 ２μＭｏｌ）、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＧＬＵＴＡＭＡＸ、およびデキサメタゾン（細胞をプレーティングする際には１μＭ、２４時間後の維持の際には２５０ｎＭ）が含有された。

【0326】

表４および図３６、３７のデータについては、低グルコース（５．５ｍＭ）を含有し、ＨＥＰＥＳ（３％ ｖｏｌ／ｖｏｌ）およびウシ胎児血清（細胞をプレーティングする際には１０％ ｖｏｌ／ｖｏｌ、２４時間後の維持の際には２％まで減少）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２の基準培地がラット肝細胞培養培地に含まれた。また、当該培地には、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度 ２ｎＭｏｌ）、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＧＬＵＴＡＭＡＸ、およびデキサメタゾン（細胞をプレーティングする際には１μＭ、２４時間後の維持の際には１００ｎＭ）が含有された。

【0327】

ヒトまたはイヌの幹細胞の培養については、低グルコース（５．５ｍＭ）を含有し、ＨＥＰＥＳ（３％ ｖｏｌ／ｖｏｌ）およびウシ胎児血清（細胞をプレーティングする際には１０％ ｖｏｌ／ｖｏｌ、２４時間後の維持の際には２％まで減少）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２の基準培地が、培養培地に含まれた。また、当該培地には、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度 ２ｎＭｏｌ）、およびデキサメタゾン（細胞をプレーティングする際には１μＭ、２４時間後の維持の際には１００ｎＭ）が含有された。

【0328】

コラーゲンコーティングおよび配置：コラーゲン溶液は、滅菌蒸留水に溶解したＩ型ラット尾コラーゲン、１０Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）および０．２Ｎの水酸化ナトリウムを規定の比率（１ｍｌの作成に対し、各成分それぞれ、４４０μｌ、３７５μｌ、１００μｌおよび、８５μｌ）で混合することにより作製した。

【0329】

静的状態での培養については、１００ｍｍ組織培養滅菌処置細胞培養ディッシュを、コラーゲン溶液を７μｌ／ｃｍ^２でコートした。管理された血流力学状態での培養については、７５ｍｍＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳ（ポリカーボネート、１０μｍの厚さ、および０．４μｍの孔直径、ｎｏ．３４１９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の多孔膜の底面を、コラーゲン溶液を７μｌ／ｃｍ^２でコートした。溶液を１時間、ゲル化させた後、表面をＤＰＢＳで洗浄し、肝細胞を、１２５，０００生細胞／ｃｍ^２の播種密度でプレーティングし、４時間後、コラーゲンゲルの第二層を加えた。１時間後、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳを反転させ、細胞培養ディッシュへとプレーティングし、培地を加えた（下層には９ｍｌ、および上層には６ｍｌ）。７ｍｌの培地を組織培養ディッシュに加え、静的培養に用いた。２４時間後、培地を維持培地（２％ＦＢＳ含有）へと変え、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳを含有する細胞培養ディッシュをコーンアンドプレートデバイス内へと置いた。管理された血流力学を、上層のＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜の面に適用した。

【0330】

凍結保存したヒト肝細胞を業者（Ｋａｌｙ−Ｃｅｌｌ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手し、業者の指示したプロトコールに従って溶解させた。ヒト肝細胞の播種について、我々はラット肝細胞についての上述の類似手順に従ったが、限局された領域に細胞を播種した。コラーゲンの第二層は、上述のように適用した。

【0331】

ビーグル犬から単離されたばかりのイヌ肝細胞を、業者（Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ）から入手し、業者の指示したプロトコールに従って処理した。イヌ肝細胞の播種について、我々はラット肝細胞についての上述の類似手順に従ったが、限局された領域に細胞を播種した。コラーゲンの第二層は上述のように適用した。

【0332】

操作条件：文献から、類洞（ΔＰ）、類洞の半径（ｒ）および類洞の長さ（ｌ）を横切る圧力勾配に対する基準値を用いて、せん断応力（ダイン／ｃｍ^２（τ））は、シリンダーを通るニュートン流体の圧力駆動流に対する式に基づいた、典型的な肝類洞に対して算出された。

【数1】

【0333】

最初の最適化プロセスの一部として、文献から予測される値の桁内の比率をもたらす、培地粘度およびコーンスピードを改変することにより得られた、適用されたせん断応力条件の範囲は、膜全体にわたるセイヨウワサビペルオキシダーゼ色素の異なる輸送プロファイルと関連しているように思われた。これらを、培養への７日間、培養肝細胞の遺伝子発現プロファイルに対して検証した（データは示さず）。静的培養と、せん断力を適用せずに単純に灌流を行ったものの間に差異は見られず、遺伝子発現プロファイルに基づき、本実施例に記述される全ての実験に対し、０．６ダイン／ｃｍ^２の操作せん断率を選択した。

【0334】

（ｉｉｉ）表現型、機能、代謝および毒性のパラメーターの評価
ＲＴ−ＰＣＲ：代謝、毒性およびインスリン／グルコース／脂質経路の遺伝子における変化を、培養期間（７または１４日）の最後で、健常状態および脂質浸潤状態下で稼働されたデバイス由来の肝細胞からＲＮＡを抽出し、このＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを実施することにより評価した。ＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳをデバイスから取り出し、細胞を多孔膜からはがし取る前に、ＰＢＳで洗浄した。総ＲＮＡをＰＵＲＥＬＩＮＫ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（細胞からの総ＲＮＡ精製のためのキット）を用いて単離し、ＩＳＣＲＩＰＴ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ｃＤＮＡ合成キット）を用いてｃＤＮＡへ逆転写した。プライマーは、代謝遺伝子ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ２、ＭＤＲおよびＧＳＴ、ならびに、インスリン／グルコース／脂質経路遺伝子ＧＰＡＴ、ＡＣＣ１、ＩＲＳ−２、ＰＰＡＲ−γ、ＳＲＥＢＰ、ＣｈＲＥＢＰ、ＬＸＲ、ＣＤ１、ＣＰＴ１に対して設計した。プライマー配列を以下の表１に示す。
表１：ラットプライマー配列

【表1】

【0335】

ＲＮＡ発現を、ＩＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＲＴ−ＰＣＲのためのＰＣＲ試薬混合物）およびＣ１０００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒを備えたＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴ−ＰＣＲ検出システムおよびサーマルサイクラ―）を用いて、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。ＲＮＡデータはβ２−マイクログロブリンの内因性発現に対して正規化され、健常培養物と比較した相対量として報告された。

【0336】

代謝および毒性実験のために分析されたヒト遺伝子には、ＣＹＰ１Ａ１、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＧＳＴＡ１、ＵＧＴ１Ａ１、ＧＳＲ、ＳＯＲＤ、ＴＸＮＲＤ１、およびＡＰＥＸ１が含まれた。これらに対するプライマー配列を、表２に示す。代謝に対して分析されたイヌ遺伝子には、ＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ１２が含まれた（プライマー配列は表３に示す）。
表２：ヒトプライマー配列

【表2】

【0337】

表３：イヌプライマー配列

【表3】

【0338】

尿素およびアルブミンアッセイ：様々な時点での静的培養およびデバイスから採取された培地を、ラット特異的ＥＬＩＳＡベースのキット（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、メーカーのプロトコールに従い、アルブミンに対して分析した。尿素は、標準比色アッセイ（ＱＵＡＮＴＩＣＨＲＯＭ Ｕｒｅａ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、ＤＩＵＲ−５００、Ｇｅｎｔａｕｒ）を用いて培地試料から推定した。システム間の全ての計測は、灌流された培地の体積および、最初にプレーティングされた細胞数に基づく比較のために、百万個の細胞／日の比率ごとに対して正規化された。

【0339】

ウェスタンブロット：管理された血流力学の適用の後、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜の配置面の１／３（約１８０万個の細胞）は、新鮮な１５０ｍＭ ＤＴＴおよびプロテアーゼ阻害物質（ＨＡＬＴ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｐｉｅｒｃｅ）＋１ｍＭ ＰＭＳＦ＋２００ｍＭ ＤＴＴ）を含有する１Ｘ ＲＩＰＡ緩衝液１５０μｌのタンパク質のために採取された。試料を氷上で、５ｘ１秒パルスでソニケートし、氷上に３０分置き、冷却された微小遠心管で１０分間、１７，０００ｘｇで遠心した。タンパク質測定は、Ａ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行った。試料を１０分間、７０℃で煮て、次いで、７．５％ ＴＧＸゲル（プレキャストポリアクリルアミドゲル、ＢｉｏＲａｄ）で泳動させ、０．２μｍのＰＶＤＦ膜にウェットトランスファーを行い、室温で１０分間、５％の脱脂粉乳中でブロッキングした。膜をウサギ抗ＵＧＴ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：５００希釈）中で、４℃、一晩、インキュベートした。二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ヤギ抗ウサギＨＲＰ、１：５０００希釈）インキュベーションは、室温で１時間行った。化学発光シグナルは、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ ＷＥＳＴ ＰＩＣＯ（セイヨウワサビペルオキシダーゼの化学発光基質、Ｐｉｅｒｃｅ）試薬を用いて発色させ、Ｉｎｎｏｔｅｃｈ ＡＬＰＨＡＥＡＳＥイメージングシステムを用いて捕捉した。正規化については、ゲルを、マウス抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ Ａ１９７８、１：２０００希釈）でプローブし、次いで、ヤギ抗マウスＨＲＰ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−２００５、１：１０，０００希釈）を用いた。

【0340】

免疫染色および胆管活性染色：使用抗体：Ｈｎｆ４ａ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−８９８７）、Ｅ−カドヘリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｓｃ−７１００９）および、抗ＭＲＰ２（Ａｂｃａｍ ａｂ３３７３）。実験設計において選択された時点で、静的な培養物および管理された血流力学状態に供された培養物は、１ｘＰＢＳで穏やかに洗浄され、その後、４％パラホルムアルデヒドで３０分間、固定された。試料は、免疫染色されるまで、４℃、ＰＢＳ中で保存された。免疫染色については、最初に０．１％のＴＲＩＴＯＮ Ｘ（非イオン界面活性剤）で２０分間、試料を透過処理し、次いで、ＰＢＳで洗浄し、５％ヤギ血清でブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションは、１：１００希釈で１時間、行われた。１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体を１：５００希釈でさらに１時間添加した。次いで、試料を１％ＢＳＡ添加ＰＢＳで洗浄し、次いで、共焦点イメージングのために標本化した。

【0341】

毛細胆管ジャンクションでの胆管活性のイメージングについては、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜切片をＰＢＳで洗浄し、１０μＭのカルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＣＤＦＤＡ）を含有する培地で１０分間、インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで洗浄し、共焦点イメージングのためにガラススライド上に置いた。

【0342】

透過電子顕微鏡：透過電子顕微鏡を、以下の実施例５に記述するように実施した。

【0343】

チトクローム活性アッセイ：肝細胞を、静的状態または管理された血流力学的状態の下、コーンアンドプレートデバイス中で５日間、培養し、次いで、０．１％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または公知のチトクローム酵素誘導物質（３−メチルコラントレンおよびデキサメタゾン）で４８時間処置した。およそ２ｃｍ^２の面積の多孔膜断片を切除し、標準的な２４ウェルプレートへ、対応する静的培養物と同時に移送した。細胞を、メーカー推奨の濃度で市販のｐ４５０−ＧＬＯキット（発光性チトクロームｐ４５０アッセイのためのキット）基質を含有する肝細胞培地５００μｌとインキュベートした。４時間後、培地を９６ウェルプレートに移し、メーカーのプロトコールに従い、チトクロームｐ４５０活性を反映する発光代謝物を分析した。次いで、同じ多孔膜断片または静的培養のウェルの細胞のＡＴＰ含量を、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイ（発光性細胞活性アッセイ）によりメーカーのプロトコールを用いて推定し、チトクロームの値をＡＴＰ含量に対して正規化した。

【0344】

ＣＹＰ活性およびヒト肝細胞の誘導応答を分析するために、細胞をプレーティングし、コーンアンドプレートデバイス内で培養し、上述の操作条件の下、管理された血流力学的状態に供し、または、静的状態（対照）の下で、７日間培養し、０．１％ＤＭＳＯ、または公知のＣＹＰ誘導剤であるフェノバルビタール（静的状態に対しては５００μＭ、デバイスに対しては５０μＭ）、またはリファンピシン（静的状態に対しては２５μＭ、デバイスに対しては２．５μＭ）のいずれかに７２時間、曝した。次いで、肝細胞を、ＣＹＰ基質のカクテル［（エトキシ レゾルフィン（１０μＭ）、ミダゾラム（３μＭ）、塩酸ブフラロール（１０μＭ）、（Ｓ）−メフェニトイン（５０μＭ）、塩酸ブプロピオン（１００μＭ）、およびジクロフェナクナトリウム（１０μＭ）］を含有する培地で４時間インキュベートした。次いで、培養上清を回収し、特定のＣＹＰ酵素の特異的活性を評価するために、代謝物の形成についてＨＰＬＣにより分析した。

【0345】

糖新生アッセイ：上述のように単離され、プレーティングされた初代ラット肝細胞を、管理された血流力学的状態の下、７日間、コーンアンドプレートデバイス中で培養した。肝細胞をＰＢＳで洗浄し、基質グリセロール（２ｍＭ）または乳酸塩（２０ｍＭ）およびピルビン酸塩（２ｍＭ）を添加したグルコースフリー培地で、制御ホルモンであるインスリン（２ｎＭ）またはグルカゴン（１００ｎＭ）の存在下、または非存在下で、インキュベートした。４時間後、上清を回収し、比色ＡＭＰＬＥＸ ＲＥＤキット（グルコース／グルコース オキシダーゼアッセイキット、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、メーカーの説明書に従い、グルコース含量について分析した。グルコース値は、細胞溶解物のタンパク質含量に対して正規化された。

【0346】

ＭＴＴアッセイ：ヒト肝細胞の毒性応答を分析するために、細胞をプレーティングし、管理された血流力学的状態の下、上述の操作条件を用いて、コーンアンドプレートデバイス中で、または、静的条件の下（対照）で、７日間培養し、０．１％ＤＭＳＯ、または公知の毒物クロルプロマジン（０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ）のいずれかに、７２時間、曝した。次いで、肝細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（チアゾリルブルー テトラゾリウムブロミド）を含有する培地で１時間インキュベートし、その後、細胞をＤＭＳＯで溶解させて、形成されたホルマザンブルー色素を放出させた。溶液を９６ウェルプレートに移し、吸光度を５９５ｎｍで読み取った。

【0347】

生−死染色：ヒト肝細胞における毒性応答を分析するために、細胞をプレーティングし、血流力学的状態の下、上述の操作条件の下、コーンアンドプレートデバイス中で７日間培養し、または、静的条件の下（対照）で培養し、０．１％ＤＭＳＯ、または公知の毒物クロルプロマジン（０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ）のいずれかに、７２時間、曝した。処置の最後に、肝細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ活性／細胞毒性試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、２μＭカルセインＡＭおよび４μＭのエチジウム ホモ二量体−１（ＥｔｈＤ−１）の濃度で、３０分間、インキュベートした。次いで、細胞をガラスカバースリップの間で標本化し、共焦点顕微鏡を用いて画像撮影した。

【0348】

ｍｉＲＮＡ１２２アッセイ：ラット肝細胞をプレーティングし、上述の操作条件を用いて、７日間、コーンアンドプレートデバイスにおいて管理された血流力学的状態の下、または静的状態の下（対照）、培養した。次いで、肝細胞をＰＢＳで洗浄し、公知の毒物であるクロルプロマジン（ＣＰＺ）（２つの異なる濃度（１μＭおよび１０μＭ））を添加し、または添加せずに、血清フリー肝細胞培地で４時間、インキュベートした。細胞由来の上清を回収し、マイクロＲＮＡ抽出は、ＭＩＲＮＥＡＳＹ血清／血漿キット（マイクロＲＮＡ抽出のためのキット、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行った。ｃＤＮＡは、メーカーの説明書に従い、ＭＩＳＣＲＩＰＴＩＩ ＲＴキット（ｃＤＮＡ調整のためのキット、Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより調整し、試料は、ＭＩＳＣＲＩＰＴ ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ ＰＣＲキット（ｃＤＮＡ定量のためのキット、Ｑｉａｇｅｎ）を用いることにより定量した。

【0349】

結果
（ｉ）管理された血流力学的状態により、従来の静的単一培養の状態と比較して、肝細胞の表現型、分極形態、および輸送局在性が維持される。
単離されたばかりのラット初代肝細胞を得て、多孔膜上のコラーゲンゲルサンドイッチ内に置いた。１日後、ＣＯ_２インキュベーター、３７℃で標準的な静的状態の下で培養が継続されるか、または血流力学的な流れ技術を導入して、あらかじめ決められた間接的なせん断率（０．６ダイン／ｃｍ^２）で管理された血流力学的な状態の下のいずれかで培養が維持された。静的な培養状態においては、培地は４８時間毎に変え、デバイスにおいては、継続的に灌流した。７日後、培養物を取り出し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、肝細胞分化マーカー（Ｅ−カドヘリンおよびＨＮＦ−４α）に対する抗体で免疫染色し、共焦点顕微鏡で可視化した。コラーゲンゲルサンドイッチ静的培養におけるＥ−カドヘリン染色パターン（図１６Ａ）は、形態学的分析により、高レベルの細胞質Ｅ−カドヘリンが確認および定量され（隣接したグラフ）、および、周辺膜分布を妨害した。管理された血流力学的状態の下では（図１６Ｂ）、肝細胞は、Ｅ−カドヘリンのはっきりとした周辺膜局在およびより低レベルの細胞質Ｅ−カドヘリンにより特徴付けられる、より分化した形態を示した。ＨＮＦ４αの染色パターンは、局在性のパターンにおいて明白な差を示し、静的培養状態におかれた細胞は７日目まで散漫な染色パターン（図１６Ｃ）であった一方、管理された血流力学的状態におかれた細胞は、核に限定された染色を維持していた（図１６Ｄ）（ｉｎ ｖｉｖｏにおいて見られるものと類似）。分極形態および、コラーゲンゲルサンドイッチ培養の５〜７日後に現れるｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｍｕｌｔｉ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−２（ＭＲＰ−２）の毛細胆管局在は、静的培養では１４日までに消失した（図１６Ｅ）が、管理された血流力学的状態の下では毛細胆管ネットワークパターンは安定し、広範囲にわたっている（図１６Ｆ）。管理された血流力学的状態の下で維持された１４日目の培養を、ＭＲＰ−２およびＨＮＦ−４αで共染色（図１７Ａ）し、それと同時に、ラットのｉｎ ｖｉｖｏ肝臓由来の切片も共染色した（図１７Ｂ）ところ、非常に類似した染色パターンを示した。管理された血流力学的状態の下での７日目の培養物の透過型電子顕微鏡画像（図１７Ｃ）では、たとえば滑面小胞体および粗面小胞体、並びにミトコンドリア等の細胞内成分の保持が示され、加えて、毛細胆管およびタイトジャンクションの存在も確認された。

【0350】

（ｉｉ）１４日間にわたり、静的な培養と比較し、管理された血流力学的状態によって、コラーゲンゲル構造中のラット肝細胞の肝細胞特異的機能が維持された。
肝細胞を静的または管理された血流力学的状態（０．６ダイン／ｃｍ^２）の下で２週間培養し、４、７、１１、および１４日目で培地から試料採取した。尿素およびアルブミンに対するアッセイを培地に対して行い、値は、最初にプレーティングされた細胞数に基づき、１００万細胞毎に、２４時間の産生率に対して正規化された。肝細胞機能は、１４日間の様々な時点での培地試料から推定される分泌アルブミンにより示され、μｇ／プレーティングされた肝細胞数１０^６／日として表されている（図１８Ａ）。静的な培養（点線）と比較して、管理された血流力学的状態の下（実線）では、有意に高いレベル（３〜４倍）が示された（７日目：９７．９６±１１．３４対２５．８４±８．２２、ｐ＝０．００００１；１４日目：８７．８０±８．６２対３３．９３±４．３９、ｐ＝０．０００１）。肝細胞による尿素分泌（図１８Ｂ）は、μｇ／プレーティングされた肝細胞数１０^６／日として表され、管理された血流力学的状態の下（実線）では、静的な培養（点線）よりも４〜５倍高いレベルであり、２週間にわたる培養において一定していたことが判明した（７日目：６２２．７８±３３．９６対１３９．７６±１３．３７、ｐ＝２．７ｘ１０^−９；１４日目：６６７．７１±８４．３７対１７８．６８±６．１３、ｐ＝１ｘ１０^−６）。

【0351】

（ｉｉｉ）管理された血流力学的状態において、フェーズＩおよびフェーズＩＩの代謝遺伝子およびタンパク質の発現は、静的培養と比較し、特異的に制御された。
肝細胞を、静的または管理された血流力学的状態（０．６ダイン／ｃｍ^２）の下で７日間培養した。これらの条件からの７日目のＲＮＡ試料に対して、ＱＲＴ−ＰＣＲを選択された代謝遺伝子（表１）に対して行った。全ての値は、７日目の静的培養に対して正規化された。管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞は、静的培養よりも一定して高い遺伝子発現レベルであり（ｎ＝１１、静的培養と比較した倍数変化：Ｃｙｐ１Ａ１〜５４、ｐ＝０．０００３；Ｃｙｐ１Ａ２〜６４、ｐ＝０．００５、Ｃｙｐ２Ｂ１〜１５、ｐ＝０．００１：図１９Ａ、Ｃｙｐ２Ｂ２〜２．７、ｐ＝０．０９およびＣｙｐ３Ａ２〜４、ｐ＝０．０７５：図１９Ｂ）、ｉｎ ｖｉｖｏレベルに近いものであった。興味深いことに、フェーズＩＩ酵素ＧＳＴのＰｉサブユニットの遺伝子（静的培養において時間と共に増加することが知られている）の発現レベルは、ｉｎ ｖｉｖｏの肝臓（−４．９倍、ｐ＝０．１５２）および管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞（−２．３倍、ｐ＝０．０２５）の両方において、静的培養と比較し、低かった（図１９Ｃ）。

【0352】

肝細胞を、静的または管理された血流力学的状態（０．６ダイン／ｃｍ^２）の下で培養した。細胞培養物を４、７、１１および１４日で取り出し、細胞溶解物を方法の項で記述したように得て、総タンパク質に対して正規化し、等量の試料をＳＤＳページゲル上にロードして泳動し、フェーズＩＩ酵素ＵＧＴ１ Ａ１ およびβアクチン（正規化のため）に対する抗体でプローブした。ウェスタンブロット（図１９Ｄ）により、ＵＧＴ１ Ａ１は、２週にわたる培養の全ての時点で、静的な培養状態と比較し、管理された血流力学的状態の下でアップレギュレートされていた。同様の実験において、管理された血流力学的状態の下での１４日の培養から採取したＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜の一部を、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＨＮＦ−４ａ、および毛細胆管輸送タンパク質ＭＲＰ−２に対して染色したところ、肝細胞の間の毛細胆管ジャンクションに沿ったＭＲＰ−２の維持および局在が示された（図１７Ａ）。残りの膜は、デバイスから取り出した後にとりだし、ただちに基質カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン ジアセテート（ＣＤＦＤＡ）とインキュベートした。細胞を共焦点顕微鏡により、２０分のタイムウィンドウで撮影し、基質がカルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦ）へと分解され、毛細胆管構造へと能動分泌されていることが観察された（図１７Ｃに示す）。そのパターンは、ＭＲＰ−２抗体およびＨＮＦ−４ａ抗体で免疫染色したｉｎ ｖｉｖｏの肝臓の切片試料と非常に類似していた（図１７Ｂ）。

【0353】

（ｉｖ）管理された血流力学的状態の下で培養されたラット肝細胞は、静的な培養よりも、よりｉｎ ｖｉｖｏ様の濃度で、高いレベルの基準チトクロームｐ４５０、および誘導可能なチトクロームｐ４５０を示す。
代謝活性における変化に対して翻訳される代謝遺伝子およびタンパク質の増加を立証するために、初代ラット肝細胞を、管理された血流力学的状態の下（０．６ダイン／ｃｍ^２）でのコーンアンドプレートデバイスにおいて、または静的なコラーゲンゲル培養でのいずれかで、上述のように培養した。５日後、０．１％ＤＭＳＯ、１Ａ／１Ｂ誘導物質３−メチルコラントレン（３−ＭＣ、静的状態では１μＭ、管理された血流力学的状態の下では０．１μＭ）、または３Ａ誘導物質デキサメタゾン（静的状態では５０μＭ、管理された血流力学的状態の下では０２．５μＭ）でそれらを処置し、または処置せずにおいた。４８時間後、７日目に、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞を含むデバイス由来の多孔膜（およそ２．０ｃｍ^２の面積）の断片を摘出し、標準的な２４ウェルのプレートに移し、対応する静的培養（異なる剤で処置）と並行して、Ｃｙｐ ｐ４５０酵素に対する基質で処置した。チトクロームｐ４５０アッセイを、市販のｐ４５０−ＧＬＯキットを用いて７日目に行った。４時間後、培地を９６ウェルプレートに移し、チトクロームｐ４５０活性を反映する発光性代謝物を分析した。値は、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯにより分析された細胞のＡＴＰ含量に対して正規化され、生細胞の正確な提示を得て、総タンパク質計測に対するコラーゲンゲルの交絡効果を回避した。

【0354】

未処置培養における、チトクロームｐ４５０酵素の基準活性レベル（図２０Ａ）は、静的状態と比較し、管理された血流力学的状態によりアップレギュレートされていた（１Ａは約１５倍、１Ｂは約９倍、および３Ａは約５倍）。高レベルの基準活性にもかかわらず、管理された血流力学的状態の下での、古典的誘導剤への応答（図２０Ｂ）は、良く維持されていた（ＤＭＳＯに対する１Ａ／１Ｂ 対 ３−ＭＣ、−４．８７対１３３．０６；ＤＭＳＯに対する３Ａ応答 対 デキサメタゾン、−１１．６４対５７．５３））。

【0355】

管理された流れの下で着目した高い遺伝子発現を確認するための、Ｃｙｐ活性の測定を最初に行ったものの、静的培養を誘導するための推奨濃度である５０μＭのデキサメタゾンは、このシステムにおいては毒性であった。結果として、デキサメタゾンの濃度を１μｇ／ｍｌにまで下げ、ラットでｉｎ ｖｉｖｏにおいて見られる血漿濃度と良く相関するレベルの、誘導可能な応答を得た。同様に、３−ＭＣに対する誘導応答は、管理された血流力学的状態の下では、１０倍低いレベルで見られた。

【0356】

管理された血流力学的状態の下でのトランスポーター活性の存在を確認するために、デバイス由来のＴＲＡＮＳＷＥＬＬフィルター断片を、基質カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン ジアセテート（ＣＤＦＤＡ）とインキュベートした。化合物は、蛍光形態のＣＤＦカルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセインへと分解され、毛細胆管へと能動的に分泌され、能動毛細胆管輸送を実証する（図２０Ｃ）。

【0357】

上述のデータは、管理された血流力学的状態に曝された肝細胞の影響を評価するために行われた実験の結果であり、ｉｎ ｖｉｖｏで観察される表現型により似せて再現するためである。これらの実験においては、静的培養において日常的に用いられている標準的な培地組成を使用して、静的なコラーゲンゲル培養と並行して比較することを可能にし、管理された血流力学的状態の選択的利点を特定した。これらの実験の過程において、これら管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ様の表現型および機能の増強を示し、たとえばデキサメタゾンおよび３−ＭＣ等の誘導剤に対してより反応性を示した。しかしながら、静的システムにおけるアッセイで日常的に用いられているグルコース（１７．５ｍＭ）およびインスリン（２μＭｏｌ）の濃度で培養された肝細胞において、いくらかの脂質の蓄積もまた観察された。本明細書に記述される管理された血流力学的状態の下で肝細胞が培養される場合、ずっと低い濃度のグルコースおよびインスリン（健康な個人に置いて見られる濃度と類似）を用いることができることが明らかとなった。本データから、これら低い濃度のグルコース（５．５ｍＭ）およびインスリン（２ｎＭ）は、肝細胞の機能および代謝活性をさらに強化することが示される。さらに、以下の実施例にさらに説明されるように、脂肪性肝疾患のモデルを作製するために、より高い濃度のグルコースおよびインスリンを含有する培地中で、管理された血流力学的状態の下、肝細胞を培養することもできる。

【0358】

（ｖ）管理された血流力学的状態の下で培養された初代ラット肝細胞は、インスリンおよびグルコースに対し反応性を示す。
上述のように単離され、プレーティングされた初代ラット肝細胞を、管理された血流力学的状態の下、コーンアンドプレートデバイスで７日間、培養し、その後、ＰＢＳで洗浄し、制御ホルモンであるインスリン（２ｎＭ）またはグルカゴン（１００ｎＭ）の存在下、または非存在下で、基質のグリセロール（２ｍＭ）または乳酸塩（２０ｍＭ）およびピルビン酸塩（２ｍＭ）と共にインキュベートした。ＡＭＰＬＥＸ ＲＥＤアッセイにより測定された、４時間後の上清中のグルコースレベルから、基質の非存在下では、インスリンはグルコースレベルを２７％まで減少させた一方、グルカゴンは５１％まで上昇させたことが示された。基質のグリセロールの存在下では、肝細胞により産生されたグルコースは、６７％まで増加した。グルカゴンの添加により、グルコースレベルはさらに１５％まで上昇した一方、インスリンはグルコースレベルを３８％まで減少させた。乳酸塩およびピルビン酸塩を基質として使用した場合には、肝細胞から産生されたグルコースは、グルカゴンの存在下で８０％まで増加した一方、インスリンは２５％までグルコースレベルを減少させた。これらのデータを表４にまとめる。

【表4】

【0359】

（ｖｉ）管理された血流力学的状態の下で培養された凍結保存ヒト肝細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏレベルの濃度で、フェノバルビタールおよびリファンピシンに対し誘導反応を示す。
ヒト肝細胞を、７日間、上述の操作条件の下、管理された血流力学的状態の下で、コーンアンドプレートデバイス中で培養し、または、静的な状態（対照）の下で培養し、公知のＣＹＰ誘導剤であるフェノバルビタール（静的状態に対しては５００μＭ、管理された血流力学的状態に対しては５０μＭ）またはリファンピシン（静的状態に対しては２５μＭ、管理された血流力学的状態に対しては２．５μＭ）に７２時間、曝した。次いで、肝細胞をＰＢＳで洗浄し、ＣＹＰ基質（上述）のカクテルを含有する培地で４時間、インキュベートした。次いで、培養上清を回収し、代謝物形成を分析して、特定のＣＹＰ酵素の特異的活性を評価した。結果は、細胞のタンパク質含量に対して正規化され、ｐｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇとして表した。ＤＭＳＯ０．１％でビヒクル処理された対照は、静的な状態と比較し、管理された血流力学的状態の下で、高レベルのＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４を示した（それぞれ、７．７対４．６、４．６対０．５、および７．６対０．７ｐｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。また、管理された血流力学的状態の下での低い濃度（５０ｕＭ）でのフェノバルビタール処理は、静的な状態での高い濃度（５００μＭ）と比較して、同等な、または高いレベルのＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９およびＣＹＰ３Ａ４の酵素活性をもたらした（それぞれ、４５．９対３４．３、１６．３対０．９および、１６．３対３．８ｐｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。同様に、管理された血流力学的状態の下での低い濃度（２．５μＭ）でのリファンピシン処理は、静的な状態での高い濃度（２５μＭ）と比較して、同等の、または高いレベルのＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９および、ＣＹＰ３Ａ４の酵素活性をもたらした（それぞれ、８７．３対１３１．１、１．４対１６．０、および１１．５対２３．１ｐｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。これらの結果を図３３に図示する。

【0360】

（ｖｉｉ）管理された血流力学的状態の下で培養された凍結保存ヒト肝細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏレベルの濃度でクロルプロマジンに対して毒性応答を示す。
凍結保存された初代ヒト肝細胞を溶解し、上述のようにプレーティングし、そして管理された血流力学的状態の下、コーンアンドプレートデバイス中で、または、静的な状態の下（対照）で、７日間培養し、異なる濃度のクロルプロマジン（０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭ）、またはビヒクル対照に、７２時間曝した。生死染色は、肝細胞に対しエチジウム−カルセイン染色で実施した。また肝細胞を、ＭＴＴ試薬と１時間インキュベートし、活性を分析した。ＲＮＡを追加断片から抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行って、選択毒性および代謝遺伝子を分析した。静的状態の下での肝細胞培養は、検証された全ての濃度で何の毒性も示さなかった。しかし、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞は用量依存性の毒性を示した（１μＭで３０．３％の毒性、１０μＭで４６．４％の毒性）（図３４の右パネル）。１μＭでは、管理された血流力学的状態のデバイスで培養された肝細胞に対する毒性は、生死染色でも検出された（図３４の左パネル）。

【0361】

ＲＴ−ＰＣＲは、静的対照と比較し、管理された血流力学的状態の下では、１μＭのクロルプロマジンで、様々な酸化ストレス関連毒性遺伝子のアップレギュレーションが示された。（グルタチオン還元酵素（ＧＳＲ）に対しては８．３倍。チオレドキシン還元酵素（ＴＸＮＲＤ１）に対しては５．５倍、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＯＲＤ）に対しては６．９倍および、ＡＰＥＸヌクレアーゼ（多機能性ＤＮＡ修復酵素）に対しては２．８倍）。同時に、ある代謝遺伝子もまた、静的対照と比較して、管理された血流力学的状態の下はアップレギュレートされていた（チトクロームｐ４５０ファミリー１のメンバーであるＡ２（ＣＹＰ１Ａ２）に対しては１７．８倍、チトクロームｐ４５０ファミリー１のメンバーであるＡ１（ＣＹＰ１Ａ１）に対しては８．４倍、チトクロームｐ４５０ファミリー２のメンバーであるＢ６（ＣＹＰ２Ｂ６）に対しては５．６倍）。これらの結果は図３５に示す。図３５に示される結果において、ＫａｌｙＣｅｌｌドナー＃Ｂ０４０３ＶＴ由来の初代ヒト肝細胞を用いた。

【0362】

これらのデータから、初代ヒト肝細胞は、管理された血流力学的状態の下、臨床的な血漿Ｃ_ｍａｘ濃度でクロルプロマジンに対する毒性応答を示すことが示された。これらの毒性応答は、酸化ストレス関連遺伝子およびある代謝遺伝子のアップレギュレーションと関連している。

【0363】

（ｖｉｉｉ）管理された血流力学的状態の下で培養された初代ラット肝細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏレベルの濃度でのクロルプロマジン曝露に応答し、急性毒性およびｍｉＲＮＡ１２２の放出を示す。
上述のように単離およびプレーティングされた初代ラット肝細胞を、管理された血流力学的状態の下、コーンアンドプレートデバイス中で、または静的状態（対照）の下、７日間、培養した。肝細胞をＰＢＳで洗浄し、ただちにビヒクル（蒸留水）またはクロルプロマジン（１μＭ）のいずれかと４時間、インキュベートした。上清を回収し、ｍｉＲＮＡ１２２のレベルを上述のように測定した。静的状態の下では、１μＭのクロルプロマジンは、ビヒクル対照と比較し、上清におけるｍｉＲＮＡ１２２のレベルには何の変化も起こらなかった。対照的に、管理された血流力学的状態の下で培養され、クロルプロマジン（１μＭ）と４時間インキュベートされた肝細胞は、有意に高いレベルでｍｉＲＮＡを放出した（ビヒクル対照と比較して６倍）。これらの結果を図３６に示す。

【0364】

（ｉｘ）管理された血流力学的状態の下で培養された初代ラット肝細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ濃度でのトログリタゾン曝露に反応して、亜致死的な毒性を示し、胆汁鬱滞の変化を表す。
上述のように単離およびプレーティングされた初代ラット肝細胞を、管理された血流力学的状態の下、コーンアンドプレートデバイス中で５日間、培養し、４μＭ〜４０μＭのトログリタゾンに４８時間、曝露した。肝細胞をＰＢＳで洗浄し、ただちに基質の１０ｕＭ カルボキシ−２，７−ジクロロフルオロセリン ジアセテート（ＣＤＦＤＡ）とインキュベートした。細胞を、非蛍光性の基質ＣＤＦＤＡに曝露させ、基質が高度に蛍光性のＭｒｐ−２基質カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン（ＣＤＦ）へと加水分解され、毛細胆管構造内へと能動分泌される２０分間の間、共焦点顕微鏡により画像撮影した。４ｕＭでは、トリグリタゾンは、毛細胆管パターンに、明白な毛細胆管構造の拡張を伴う変化を引き起こすことが判明した。これらの変化は、４０ｕＭのトログリタゾンで、より顕著で広範囲にわたっていた（図３７）。管理された血流力学的状態の下で培養された際の、ｉｎ ｖｉｖｏ／臨床血漿Ｃ_ｍａｘ濃度での、ラット肝細胞のトログリタゾンへの毒性応答は、酸化ストレス関連遺伝子のアップレギュレーション、およびＭＲＰ３およびＭＲＰ４遺伝子の代償性アップレギュレーションと関連していた（図３８）。

【0365】

（ｘ）管理された血流力学的状態の下で培養された初代イヌ肝細胞は、静的状態での培養と比較し、分極形態の保持を示し、重要な代謝遺伝子の高い発現を示す。
単離されたばかりのイヌ肝細胞を、ヒト肝細胞に対する上述の方法と類似の操作条件で、管理された血流力学的状態の下、コーンアンドプレートデバイス中で培養し、または、静的状態（対照）の下で培養した。７日後、培養物を固定し、ファロイジンおよびＤｒａｑ５（それぞれ、アクチン細胞骨格および核に対する）で染色した。ＲＮＡを細胞から採取し、ＲＴ−ＰＣＲを、特定の代謝遺伝子に対して実施した。イヌ肝細胞は、７日目で、多角形の分極形態を保持し、そして、静的状態の対照よりも有意に高くＣＹＰ１Ａ１およびＣＹＰ３Ａ１２を発現していることが確認された（それぞれ６．７倍および７．４倍）。これらの結果を図３９に示す。

【0366】

実施例５：脂肪性肝疾患に対するＩｎ ｖｉｔｒｏモデル
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、肝機能障害のもっとも多い原因であり、肥満、インスリン抵抗性および２型糖尿病と関連している。脂肪性肝における変化は、肝細胞内の脂肪小胞の早期の蓄積（肝脂質浸潤（ｓｔｅａｔｏｓｉｓ））から、それに引き続き肝臓の代謝機能の消失、炎症性変化、最終的には線維症および肝硬変へと進行する。脂肪性肝疾患の動物ｉｎ ｖｉｖｏモデルは、トリグリセリドの集積を誘導する糖尿病性環境の反映である、高血糖症および高インスリン血症を誘導する、高脂肪食または低脂肪・高炭水化物食のいずれかをうまく用いている。しかしながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏモデルは多くの場合、脂質変化を誘導するために遊離脂肪酸（オレイン酸、パルミチン酸またはリノール酸）の過負荷のみを用いており、おそらく疾患の発症機序において重要な役割を果たしうる高レベルのグルコースおよびインスリンに対するｄｅ ｎｏｖｏの肝細胞応答を捉えていない。静的な肝細胞培養もまた、インスリン応答が著しく減少することが知られており、通常、必要最小限の肝細胞の生存および機能のために、生理学的なレベルではない高レベルのホルモンが、標準的な培養培地に必要となる。対照的に、本明細書に記述されるモデルは、薬物およびホルモンに対する生理学的な肝細胞応答をより保持しており、ｉｎ ｖｉｖｏレベルにより近いグルコースおよびインスリンの濃度で、基本的な肝臓の機能を維持することができ（実施例４に上述）、さらに、高グルコースおよびインスリンレベルにより特徴付けられる糖尿病様環境を作り出すことにより、脂肪性肝において見られる病的な応答を引き起こすこともできる。

【0367】

方法：
（ｉ）動物の外科手術および肝細胞の単離
動物の外科手術および肝細胞の単離は実施例４に上述のように行った。

【0368】

（ｉｉ）細胞培養およびデバイス操作条件
健常な肝細胞培養培地：健常な肝細胞培養培地は、ウシ胎児血清（プレーティングする際には１０％、２４時間後の維持に対しては２％まで減少）を補充した、低グルコース（５．５ｍＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地を含有した。さらに培地にはゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、およびセレニウム；インスリン濃度は２ｎＭ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸ（Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン含有培地補充剤）、およびデキサメタゾン（図２１および２２に示すデータに対しては、プレーティングする際には１μＭ、２４時間後の維持の際には２５０ｎＭ；図２５〜３２に示すデータに対しては、実験を通して１００ｎＭ）を含有した。

【0369】

脂肪性肝変化を誘導するための培地（脂肪性肝培地）：脂肪性肝変化を誘導するために用いられた培養培地には、ウシ胎児血清（プレーティングする際には１０％、２４時間後の維持の際には２％まで減少）を補充した、高グルコース（１７．５ｍＭ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地を含有した。また、培地には、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度は２μＭｏｌ）、１％ＮＥＡＡ、１％ＧＬＵＴＡＭＡＸ、およびデキサメタゾン（図２１および２２に示すデータに対しては、プレーティングする際には１μＭ、２４時間後の維持の際には２５０ｎＭ；図２５〜３２に示すデータに対しては、実験を通して１００ｎＭ）を含有した。

【0370】

コラーゲンコーティングおよび配置：コラーゲン溶液は実施例４に記述されるように作製した。７５ｍｍのＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳの多孔膜（ポリカーボネート、１０μｍの厚さ、０．４μｍの孔直径、ｎｏ．３４１９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の低面を、３００μｌのコラーゲン溶液でコートした。１時間、ゲルに溶液を接触させた後、表面をＤＰＢＳで洗浄し、肝細胞を１２５，０００生細胞／ｃｍ^２の播種密度でプレーティングし、４時間後にコラーゲンゲルの第二層を加えた。１時間後、ＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳを反転させ、細胞培養ディッシュ内にプレーティングし、培地を加えた（下層に９ｍｌ、上層に６ｍｌ）。２４時間後（すなわち、実験の２日目）、培地を維持培地（上述の脂肪性肝培地または健常培地）に変え、ペトリディッシュをコーンアンドプレートの血流力学的フローデバイスに置き、管理された血流力学的状態を上層のＴＲＡＮＳＷＥＬＬの多孔膜の面に適用した。一部の例において、維持培地には０．１％ＤＭＳＯビヒクルに溶解した１．５μＭピオグリタゾンを含有し、または、０．１％ＤＭＳＯビヒクルのみを含有した。管理された血流力学的状態の下、７日まで細胞を培養し、以下に記述されるアッセイを用いて肝細胞を検証した。

【0371】

操作条件：せん断応力は、上述の実施例４のように算出した。培地粘度およびコーンスピードを変え、文献から予測される値の桁内の比率とすることにより作製された適用されたせん断応力条件の範囲（０．１〜６ダイン／ｃｍ^２）を用いた。これらは、膜を横切る基準色素であるセイヨウワサビペルオキシダーゼ色素の異なる輸送プロファイルと相関していた。培養は７日間行われ、脂肪性肝の変化に対して分析された。

【0372】

（ｉｉｉ）脂肪性肝変化の測定：
健常な対照と比較し、脂肪性肝モデルにおいて発生する変化を検証するために、以下を評価した：
（ａ）代謝遺伝子およびインスリン／グルコース脂質経路遺伝子における変化（ＲＴ−ＰＣＲ）
（ｂ）オイルレッドＯアッセイ、ナイルレッド染色、および総トリグリセリド測定による、肝細胞内の細胞内脂質の蓄積、
（ｃ）肝細胞の分化した機能における変化（尿素およびアルブミン分泌）
（ｄ）代謝活性における変化（チトクロームｐ４５０アッセイ）；および、
（ｅ）透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による肝細胞内の形態変化

【0373】

ＲＴ−ＰＣＲならびに、尿素およびアルブミンアッセイは、上述の実施例４のように実施した。

【0374】

染色方法：肝細胞ＴＲＡＮＳＷＥＬＬ膜断片は、ＰＢＳに希釈した０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ中で２０分間、透過処理し、ＰＢＳで３度、洗浄した（各５分）。次いで、試料を、ＰＢＳに溶解した５％ヤギ血清、０．２％ブロッティンググレードの脱脂粉乳ブロッカー、および１％ＢＳＡで４５分間、ブロッキングした。次いで、試料をＰＢＳに溶解した０．１％ＢＳＡで３度洗浄し、１：５０００希釈のナイルレッド（１ｍＭストック）、１：１０００希釈のＤＲＡＱ５（蛍光ＤＮＡ色素；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、１：５００希釈のファロイジン接合ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＰＢＳに溶解した１％ＢＳＡと３０分間、インキュベートし、遮光した。試料を、ＰＢＳに溶解した０．１％ＢＳＡで３度、各５分間洗浄し、ＰＲＯＬＯＮＧ ＧＯＬＤ抗減色封入培地（抗減色試薬；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてガラスカバースリップに乗せた。試料をＮｉｋｏｎ Ｃ１＋共焦点システム顕微鏡で画像撮影した。

【0375】

透過イメージング顕微鏡（ＴＥＭ）：健常、または脂質浸潤状態の下で７日間培養された肝細胞を含有するＴＲＡＮＳＷＥＬＬＳ由来の多孔膜断片を、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドおよび２％グルタルアルデヒドを含有する溶液中で１時間固定した。次いで、試料を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ ｉｍａｇｉｎｇ ｃｅｎｔｅｒでのＴＥＭ処理のために送付した。ＴＥＭ画像は肝細胞内の脂質の蓄積、細胞内器官（たとえばミトコンドリアならびに滑面小胞体および粗面小胞体等）の出現、分極形態の維持、および毛細胆管に対して評価された。

【0376】

オイルレッドＯアッセイ：肝細胞内の細胞内脂質の蓄積を、市販のＳｔｅａｔｏｓｉｓ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を改変および適合させることにより分析した。培養期間の最後に、健常および脂質浸潤状態の下でのデバイスからの肝細胞を含有する２ｃｍ^２の大きさの多孔膜断片を、ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。次いで、これら多孔膜断片をＰＢＳで洗浄し、完全に乾燥させ、３００μｌのオイルレッドＯの希釈標準液と２０分間、２４ウェルプレート中でインキュベートした。次いで、多孔膜断片を蒸留水で７〜８回繰り返し洗浄し、その後、Ｓｔｅａｔｏｓｉｓ Ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに入っていた洗浄溶液で２回、５分間洗浄した。色素抽出溶液（３００μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを、軌道攪拌機上で１５〜３０分間、一定の攪拌でインキュベートした。次いで、溶液を正常な９６ウェルプレートに移し、分光光度計で吸光度を４９０〜５２０ｎｍで読み取った。

【0377】

総トリグリセリドの測定：トリグリセリド含量は、市販の比色アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、Ｃａｔ ＃ １００１０３０３）を用いて分析した。処置期間の最後で、ラバーポリスマンとＰＢＳでかき集めることにより、多孔膜から細胞を回収し、その後、遠心した（２，０００ｘ ｇ、１０分間、４℃）。細胞ペレットは、トリグリセリドアッセイキットに含まれていた、冷却、希釈された標準希釈剤中（１００μｌ）に再懸濁し、１秒バーストで２０回、ソニケートした。次いで、細胞懸濁液を４℃で１０分間、１０，０００ｘ ｇで遠心した。上清を取り出し、メーカーのプロトコールに従いアッセイに用いて、同試料のタンパク質含量に対して正規化した。

【0378】

チトクローム化アッセイの分析：肝細胞を、健常および脂質浸潤状態の下、コーンアンドプレートデバイス中で７日間培養した。およそ２ｃｍ^２の面積の多孔膜断片を取り出し、対応する静的培養物と並行して標準的な２４ウェルのプレートに移した。市販のＰ４５０−ＧＬＯキットに入っていた基質を含有する健常肝細胞培地５００μｌ（メーカーの推奨濃度）と細胞をインキュベートした。４時間後、培地を９６ウェルプレートに移し、メーカーのプロトコールに従い、チトクロームｐ４５０の活性を反映する発光性代謝物を分析した。次いで、同多孔膜断片の細胞のＡＴＰ含量、または静的培養ウェル中の細胞のＡＴＰ含量を、メーカーのプロトコールを用いて、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯアッセイにより推定し、チトクローム値をＡＴＰ含量に対して正規化した。

【0379】

結果：
ナイルレッド染色：図２５ＡおよびＢにおいて、健常培地（図２５Ａ）または脂質性肝培地（図２５Ｂ）中でナイルレッド、ファロイジンおよびＤＲＡＱ５と共に培養した肝細胞の染色を示す。図２５Ｂに見られるように、脂肪性肝培地（高濃度のグルコースおよびインスリンを含有）中で培養した肝細胞は多量の脂質滴を蓄積している。

【0380】

透過型電子顕微鏡：脂質性肝培地中で培養した肝細胞を透過型電子顕微鏡でも検証した。図２６に示すように、これらの条件下で培養した肝細胞は脂質を蓄積している。大きな脂質滴は、画像の左側の肝細胞中に示されている。２つの肝細胞の間のギャップジャンクションもまた示され、このことから、分極形態が示唆される。

【0381】

総脂質および総トリグリセリド：図２７に示されるように、総脂質（図２７Ａ）および総トリグリセリド（図２７Ｂ）は、両方とも、高グルコース／抗インスリンの脂質性肝状態の下、肝臓由来血流力学的状態の存在下で培養された肝細胞中で有意に増加していた。オイルレッドＯの定量から、総脂質は、健常状態の培養と比較し、病的状態の培養で約３倍まで上昇したことが示された。

【0382】

遺伝子発現：グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ）は、トリグリセリド合成に関与する重要な酵素であり、脂質浸潤および脂肪性肝でアップレギュレートされ、一因となることが知られている。図２１に示されるように、管理された血流力学的状態の下、デバイス中で培養された初代ラット肝細胞は、病的な高インスリン（２μＭｏｌ）状態および高グルコース（１７．５ｍＭｏｌ）な状態に曝された場合（ｎ＝９）、培地中に健常な生理学的レベルのインスリン（２ｎＭｏｌ）およびグルコース（５．５ｍＭｏｌ）を含有する状態で培養された場合（ｎ＝６）と比較して、有意に高いＧＰＡＴ遺伝子の発現（ｐ＝０．０４）を示す。結果は、標準的な静的培養と比較した、コラーゲンゲルサンドイッチ（２μＭｏｌインスリンおよび１７．５ｍＭｏｌグルコース）における、倍数増加として表されている。

【0383】

低濃度のデキサメタゾンを含有する脂肪性肝培地または健常培地中での、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞に対する、類似の結果を図２８Ｂに示す。抗インスリン／高グルコース（脂肪性肝）培地中で培養された肝細胞は、低レベルのインスリンおよびグルコースを含有する健常培地中で培養された肝細胞と比較して、有意に高いレベルのＧＰＡＴ発現を示した。また、図２８Ａに示されるように、高インスリン／高グルコース培地中で、管理された血流力学的状態の下で培養された肝細胞において、健常培地中で培養された肝細胞と比較し、脂質生成に関与する他の重要な遺伝子である、ステロール制御エレメント結合タンパク質（ｓｔｅｒｏｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＲＥＢＰ））は、有意に高いレベルの発現を示した。

【0384】

これらの脂質浸潤変化は、付随する代謝変化と同時に発生した。すべての重要な代謝酵素のうち、チトクロームｐ４５０ ３Ａファミリーは、薬物の大部分の代謝に関与する。図２２に示されるように、健常な生理学的レベルのインスリン（２ｎＭｏｌ）およびグルコース（５．５ｍＭｏｌ）を培地中に含むデバイス中で、管理された血流力学的状態の下で培養された初代ラット肝細胞（ｎ＝６）は、高レベルのインスリン（２μＭｏｌ）および高レベルのグルコース（１７．５ｍＭｏｌ）と共に、病的な状態の下で培養されたもの（ｎ＝９）と比較して、重要な代謝酵素であるチトクロームｐ４５０ ３ａ２が有意に高いレベルの発現を示している（Ｃｙｐ３Ａ２；ｐ＝０．０３）。管理された流れの下での、健常および病的な脂肪性肝レベルの両方が、コラーゲンゲルサンドイッチ（２μＭインスリンおよび１７．５ｍＭｏｌグルコース）における静的培養よりも、高い倍数である。

【0385】

同様に、図２９Ａに示されるように、薬物代謝に関与する多くのフェーズＩ酵素の発現は、低および高グルコース／インスリン状態の下で差次的に制御されている。血流力学的流れの下では、健常培地条件の肝細胞は、Ｃｙｐ１ａ１、Ｃｙｐ ２ｂ１、２ｂ２、Ｃｙｐ３ａ２のｍＲＮＡ発現は高いレベルを維持していた一方（それぞれ、従来的な静的培養よりも２０、９０、３０および４０倍高い）、脂肪性肝培地中で培養された肝細胞におけるＣｙｐ ２ｂ２およびＣｙｐ ３ａ２のレベルは、健常なものと比較して、９倍および１２倍、低かった。

【0386】

Ｃｙｐ活性：図２９Ｂに示されるように、ＣＹＰ３Ａ２およびＣＹＰ１Ａ１の活性もまた、健常と比較し、高インスリン／グルコースの脂肪性肝状態の下で３〜６倍減少していた（ｐ４５ｇｌｏアッセイにより測定）。

【0387】

ピオグリタゾン処置：脂質浸潤処置のために用いられる薬物であるピオグリタゾンを、脂肪性肝モデルで検証し、高インスリン／グルコース脂肪性肝培地により誘導された脂質蓄積および代謝変化を変えることが出来るかどうかを測定した。ピオグリタゾンを、１．５μＭの濃度（ｉｎ ｖｉｖｏで見られたピオグリタゾンの治療Ｃ_ｍａｘに基づき選択された濃度）で培地に添加した。ピオグリタゾンは、疾患状態の下で代謝遺伝子発現を回復させると同時に、脂質蓄積およびトリグリセリド含量の減少に有効であった。図３０に示されるように、ナイルレッド染色から、ｉｎ ｖｉｖｏ治療濃度でのピオグリタゾン処置は、脂質浸潤状態の下での脂質滴形成を減少させることが示唆される。ピオグリタゾンはまた、高インスリン／グルコース培地中で培養された肝細胞の総トリグリセリド含量を、健常状態で培養された肝細胞に見られるレベルと似たレベルまで、減少させた（図３１）。さらに図３２に示されるように、ピオグリタゾンは、高インスリン／グルコース疾患状態により低下させられるＣｙｐ３Ａ２等の代謝遺伝子の発現を回復させた。

【0388】

結論：
要約すると、高グルコース／インスリン環境の存在下で、病的な脂質浸潤変化を誘導することにより、肝脂質浸潤のモデルを作製するための、ｉｎ ｖｉｖｏ様の肝臓の表現型および応答を保存するシステムが開発された。管理された血流力学的状態の下でのラット肝細胞は、インスリンおよびグルコースに対する応答を保持しており、管理された流れの下で培養された肝細胞は、高グルコースおよびインスリン（病的）状態で培養された際に脂質浸潤変化を発現する。脂質浸潤は、２つの重要な遺伝子（ＳＲＥＢＰおよびＧＰＡＴ）のアップレギュレーションを伴うｄｅ ｎｏｖｏ脂質生成を介して介在され、脂質蓄積およびトリグリセリド含量の増加は、代謝遺伝子の発現および活性の減少が付随して同時に発生する。ＰＰＡＲ−γアゴニストのピオグリタゾンの処置により、高グルコースおよびインスリン状態下での脂質蓄積の阻害および代謝活性消失の阻害が促進される。これらのデータにより、現時点では存在していない、新規で、食事誘導性非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の重要な新しいｉｎ ｖｉｔｒｏモデルが示される。

【0389】

実施例６：人工多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来ヒト肝細胞システム
人工多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の肝細胞は、変動を排除し、薬物応答における遺伝子変異を研究するための有望な解決策を提示するが、標準的な、静的培養システムにおいてそれらが示す、胎児性の表現型および不十分な代謝プロファイルのために、広く受け入れられてはいない。上述の実施例４に記述されるデータから、静的培養状態の下では急速に脱分化することが知られている初代ラット肝細胞および初代ヒト肝細胞が、管理された血流力学的状態の下で培養された場合には、成熟した分化表現型を安定的に維持し、より生理学的な薬物応答およびホルモン応答を生じさせることが示される。本発明者らは、たとえば流れ、血流力学的状態および輸送等の生理学的特性が維持される場合、ｉＰＳＣは同様に応答し、分化した肝臓の表現型、および、ｉｎ ｖｉｖｏで示す薬物応答を示すことを見出した。

【0390】

方法
（ｉ）ｉＰＳＣ由来肝細胞
ｉＰＳＣ由来肝細胞を、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した。

【0391】

（ｉｉ）ｉＰＳＣ由来肝細胞培養培地
静的培養に対しては、ｉＰＳＣ由来肝細胞培地は、ベンダーの推奨に従った。コーンアンドプレートデバイス中で管理された血流力学的状態の下で培養された細胞に対しては、ウシ胎児血清（１０％）およびデキサメタゾン（１μＭ）を細胞をプレーティングする際に補充したＷｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培地の基礎培地を使用した。維持培地は２４時間後から使用し、ＦＢＳを含まないが、ウシ血清アルブミン（０．１２５％）を補充した。また培地は、ゲンタマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、ＩＴＳ（インスリン濃度２ｎＭｏｌ）、１％ ＮＥＡＡ、１％ ＧＬＵＴＡＭＡＸ、ＨＥＰＥＳ（３０ｍＭ）およびデキサメタゾン（１００ｎＭ）を含有した。

【0392】

（ｉｉｉ）コラーゲンコーティングおよび配置
コラーゲンコーティングおよび配置条件は、初代ヒト肝細胞に対する実施例４に記述されたものと同一であった。ｉＰＳＣ由来肝細胞を解離させ、ベンダーのプロトコールに従い、推奨培地を用いて置いた。ｉＰＳＣ由来肝細胞を静的状態の下で培養し、または２４時間後に、管理された血流力学的状態の下でさらに培養するためにコーンアンドプレートデバイスに移した。

【0393】

結果
（ｉ）管理された血流力学的状態の下で培養された人工多分化能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来肝細胞は、分極形態を維持し、静的培養と比較し、重要な代謝遺伝子は高いレベルの発現を示した。
管理された血流力学的状態の下、コーンアンドプレートデバイス中で１０日間培養されたｉＰＳＣ由来肝細胞は、分極形態を維持し（図４０）、静的培養と比較し、重要な代謝遺伝子は高いレベルの発現を示す（ＣＹＰ１Ａ１に対しては１０４倍、ＣＹＰ１Ａ２に対しては９１倍、ＣＹＰ３Ａ４に対しては８．８倍、ＣＹＰ２Ｂ６に対しては８．２倍、ＣＹＰ２Ｃ９に対しては２．３倍、ＣＹＰ２Ｄ６に対しては２．３倍）。構成的アンドロスタン受容体ＣＡＲの発現は、静的状態の下で培養された細胞よりも６．０倍高く、肝臓特異的タンパク質であるアルブミンは、静的状態の下で培養された細胞よりも２．２倍高いレベルであった。これらの結果を図４１に示す。

【0394】

本発明の構成要素またはその好ましい実施態様（複数含む）を提示する場合、「一つの」（ａ、ａｎ）、「当該」（ｔｈｅ）、および「前記」（ｓａｉｄ）という冠詞は、１以上の要素があることを意味することが意図される。「含有する」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、「含む」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）および「有する」（ｈａｖｉｎｇ）という用語は、包括的であることが意図され、リストアップされた要素以外の付加的な要素がありうることを意味する。

【0395】

上述の点を考慮し、本発明のいくつかの目的が達せられ、他の有益な結果も成し得ることが理解されるであろう。

【0396】

本発明の範囲から逸脱することなく、上述の方法に様々な変更が可能であり、上述に含有され、添付の図面（複数含む）に示される全ての内容は、示されるように解釈されるべきであり、限定の意図は無い。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図6F】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図16D】

【図16E】

【図16F】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]