特許 6971848 純粋なチオフラビンＴを精製する方法、純粋なチオフラビンＴの製造方法、チオフラビンＴを含有する組成物、及びアミロイドの検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6971848

(24)【登録日】2021年11月5日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】純粋なチオフラビンＴを精製する方法、純粋なチオフラビンＴの製造方法、チオフラビンＴを含有する組成物、及びアミロイドの検出方法

(51)【国際特許分類】

   C07D 277/66 20060101AFI20211111BHJP

   B01D 39/00 20060101ALI20211111BHJP

   G01N 33/52 20060101ALI20211111BHJP

【ＦＩ】

   C07D277/66

   B01D39/00 C

   G01N33/52 C

【請求項の数】6

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2017-543002(P2017-543002)

(86)(22)【出願日】2016年8月15日

(86)【国際出願番号】JP2016073846

(87)【国際公開番号】WO2017056758

(87)【国際公開日】20170406

【審査請求日】2019年8月8日

【審判番号】不服2020-8056(P2020-8056/J1)

【審判請求日】2020年6月10日

(31)【優先権主張番号】特願2015-191312(P2015-191312)

(32)【優先日】2015年9月29日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】000236436

【氏名又は名称】浜松ホトニクス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100113435

【弁理士】

【氏名又は名称】黒木 義樹

(74)【代理人】

【識別番号】100140442

【弁理士】

【氏名又は名称】柴山 健一

(74)【代理人】

【識別番号】100176773

【弁理士】

【氏名又は名称】坂西 俊明

(74)【代理人】

【識別番号】100189452

【弁理士】

【氏名又は名称】吉住 和之

(72)【発明者】

【氏名】小田 明典

(72)【発明者】

【氏名】里園 浩

(72)【発明者】

【氏名】新家 智美

(72)【発明者】

【氏名】高田 洋平

【合議体】

【審判長】 村上 騎見高

【審判官】 冨永 保

【審判官】 齊藤 真由美

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／００３９４３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００６／０８９２２１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特開２０００−１９８７８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第５４８６４６０（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開２０１７−６６０６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＹＳＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ Ｂ，（２０１３），１１７，ｐｐ．３４５９−３４６８

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，（２００３），Ｖｏｌ．７０，Ｎｏ．６，ｐｐ．８６８−８７４

【文献】 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９３），２，ｐｐ．４０４−４１０

【文献】 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ Ａ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（２００９），２０４，ｐｐ．１６１−１６７

【文献】 社団法人 日本化学会編，化学便覧 応用化学編 第６版，丸善株式会社，平成１５年１月３０日発行，Ｉのｐｐ．１８２−１８３，ＩＩのｐｐ．１１１３−１１１５

【文献】 社団法人 日本化学会編，第４版 実験化学講座１ 基本操作Ｉ，丸善株式会社，平成８年４月５日第２刷発行，ｐｐ．１９１−１９３

【文献】 社団法人 日本化学会編，第５版 実験化学講座２０−１ 分析化学，丸善株式会社，平成１９年５月１５日第２刷発行，ｐｐ．６１−６４

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C07D

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

粗チオフラビンＴが極性溶媒に溶解したチオフラビンＴ溶液を用意するステップと、
チオフラビンＴ溶液を無極性高分子多孔質体と接触させて、蛍光性不純物を除去するステップと、
蛍光性不純物が除去されたチオフラビンＴ溶液を前記無極性高分子多孔質体から分離するステップと、を備え、
前記無極性高分子多孔質体が、ポリスルホン、ナイロン、酢酸セルロース及びニトロセルロース並びにこれらの２種以上からなる群より選択される高分子で形成された多孔質構造体である、純粋なチオフラビンＴを得る方法。

【請求項2】

接触させるステップ、及び分離するステップが、波長４７５ｎｍ以下の光を遮光した状態で行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記極性溶媒が、水系溶媒、メタノール、エタノール、アセトニトリル及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記無極性高分子多孔質体が、無極性高分子膜であり、
接触させるステップ、及び分離するステップが、前記無極性高分子膜でチオフラビンＴ溶液をろ過することにより行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法を実施する精製工程を備える、純粋なチオフラビンＴの製造方法。

【請求項6】

粗チオフラビンＴから蛍光性不純物を除去するための不純物除去剤であって、
無極性高分子多孔質体からなり、
前記無極性高分子多孔質体が、ポリスルホン、ナイロン、酢酸セルロース及びニトロセルロース並びにこれらの２種以上からなる群より選択される高分子で形成された多孔質構造体である不純物除去剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、純粋なチオフラビンＴを精製する方法に関する。本発明はまた、純粋なチオフラビンＴの製造方法、チオフラビンＴを含有する組成物、及びアミロイドの検出方法にも関する。

【背景技術】

【0002】

チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、タンパク質の特殊な凝集体であるアミロイドの蛍光染色色素として最も有名な物質であり、多くの研究で用いられている。

【0003】

市販されているＴｈＴ試薬には、２種類の蛍光が観察されることが知られている。この２種類の蛍光は、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、３５０ｎｍ）、及び４８０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、波長４３０ｎｍ）である。短波長側の蛍光（４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光）は、それがＴｈＴ由来であるか、又はＴｈＴ試薬中の不純物由来であるかについて、未だ明らかになっていない。

【0004】

例えば、初期の研究において、非特許文献１には、ＴｈＴ試薬中の不純物は波長３５０ｎｍに吸収があり、それがヘキサンやシクロヘキサンに溶解することが報告されている。これに対し、非特許文献２は、ＴｈＴの精製（再結晶）を繰り返しても、波長４４５ｎｍの蛍光が残ることから、これがＴｈＴ由来の蛍光であると結論し、ＴｈＴを構成する官能基の一部から発せられる蛍光（局所蛍光）に帰属している。非特許文献３は、この局所蛍光説を支持し、その物理化学的な起源について論じている。一方、非特許文献４は、ＴｈＴは光照射により光反応を起こし、波長３５０ｎｍ付近に吸収帯があり波長４５０ｎｍの蛍光を発する光反応物が生じることを報告し、ＴｈＴ試薬中の不純物は、ＴｈＴの光反応生成物に由来するとしている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．，２００３年，７０巻６号，ｐｐ．８６８−８７４

【非特許文献2】Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２０１０年，３巻，ｐｐ．１−１８

【非特許文献3】Ｄｙｅｓ Ｐｉｇｍｅｎｔｓ，２０１４年，１１０巻，ｐｐ．９７−１０５

【非特許文献4】Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，２０１３年，１１７巻，ｐｐ．３４５９−３４６８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

短波長側の蛍光（４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光）が、ＴｈＴ由来であるか、又はＴｈＴ試薬中の不純物由来であるか未だ明らかになっていない理由は、従来の技術では、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬（純粋なＴｈＴ）を得ることができないためである。

【0007】

本発明は、上述した技術背景に鑑み、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬を得る方法、すなわち、純粋なＴｈＴを得る方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明は、粗チオフラビンＴが極性溶媒に溶解したチオフラビンＴ溶液を用意するステップと、チオフラビンＴ溶液を無極性高分子多孔質体と接触させるステップと、接触後のチオフラビンＴ溶液を前記無極性高分子多孔質体から分離するステップと、を備える、純粋なチオフラビンＴを精製する方法を提供する。

【0009】

本発明に係る方法は、チオフラビンＴを極性溶媒の溶液としたうえで、無極性高分子多孔質体と接触させるものであるため、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬（純粋なＴｈＴ）を得ることができる。このことはまた、短波長側の蛍光は、ＴｈＴ由来の蛍光ではなく、蛍光性不純物に由来する蛍光であることを意味する。また、本発明者らの検討によれば、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴを光（特に、波長４７５ｎｍ以下の光）に曝すと、この蛍光性不純物が再度生じることも明らかになった。つまり、蛍光性不純物は、ＴｈＴの光反応物であると考えられる。

【0010】

本明細書において、「粗チオフラビンＴ（粗ＴｈＴ）」とは、上述の蛍光性不純物とＴｈＴとの混合物を意味する。従来“ＴｈＴ”と呼ばれていたものは、いずれも上述の蛍光性不純物を含むものであるため、本明細書における粗ＴｈＴに該当する。

【0011】

本明細書において、「純粋なチオフラビンＴ（純粋なＴｈＴ）」とは、短波長側の蛍光が存在しないＴｈＴ試薬を意味し、「ＴｈＴ試薬」とは、ＴｈＴを含む分子集合体（組成物）と同義である。したがって、「純粋なＴｈＴ」は、蛍光性不純物を実質的に含まないＴｈＴの分子集合体、又は実質的にＴｈＴからなる分子集合体ということもできる。「純粋なＴｈＴ」は、好ましくは蛍光性不純物を含まないＴｈＴの分子集合体、又はＴｈＴからなる分子集合体である。

【0012】

上記方法では、接触させるステップ、及び分離するステップが、波長４７５ｎｍ以下の光を遮光した状態で行われるのが好ましい。これにより、光反応物（蛍光性不純物）が新たに生成することをより抑制できるため、より一層効率よく純粋なＴｈＴを精製することができる。

【0013】

上記方法は、分離したチオフラビンＴ溶液の４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度を測定し、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達したか否かを判定するステップを更に備え、判定するステップにおいて、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達していないと判定された場合、当該チオフラビンＴ溶液に対して更に接触させるステップ、及び分離するステップを実行するものであってもよい。これにより、蛍光性不純物に由来する蛍光をモニターしながら精製を進めることができる。

【0014】

上記極性溶媒は、水系溶媒、メタノール、エタノール、アセトニトリル及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒からなる群から選択されるものであってもよい。

【0015】

上記無極性高分子多孔質体は、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ナイロン、酢酸セルロース及びニトロセルロース並びにこれらの２種以上からなる群より選択される高分子からなる多孔質構造体であることが好ましい。このような多孔質構造体を使用することにより、より一層効率よく純粋なＴｈＴを精製することができる。

【0016】

上記方法は、無極性高分子多孔質体が、無極性高分子膜であり、接触させるステップ、及び分離するステップが、前記無極性高分子膜でチオフラビンＴ溶液をろ過することにより行われることが好ましい。ろ過操作により精製を行うことで、簡便かつ迅速に純粋なＴｈＴを精製することができる。

【0017】

本発明はまた、上述した純粋なチオフラビンＴを精製する方法を実施する精製工程を備える、純粋なチオフラビンＴの製造方法を提供する。

【0018】

本発明はさらに、チオフラビンＴを含有する組成物であって、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度がバックグラウンドレベルである、組成物を提供する。

【0019】

本発明に係る組成物は、蛍光性不純物が含まれないＴｈＴ含有組成物であるため、例えば、アミロイドの蛍光染色に用いる際に、蛍光性不純物による影響を排除することができ、より精度の高い試験結果及び診断結果を得ることができる。したがって、本発明の組成物は、アミロイド検出用として好適に用いられる。

【0020】

本発明はさらにまた、アミロイドの検出方法であって、被験試料にチオフラビンＴを含む蛍光試薬を接触させる工程と、チオフラビンＴの蛍光を検出する工程と、を含み、上記蛍光試薬が、上記組成物である、検出方法を提供する。

【0021】

本発明に係るアミロイドの検出方法によれば、蛍光性不純物が含まれないＴｈＴ含有組成物を用いていることから、より精度よくアミロイドを検出することができる。

【0022】

上記アミロイドは、アミロイドβであってもよい。アミロイドβは、アルツハイマー病患者の脳内に蓄積することが知られている（老人斑）。アミロイドβを高精度で検出できれば、アルツハイマー病の病態の解明等に大きく貢献できる。

【0023】

本発明に係る精製方法は、チオフラビンＴ溶液と無極性高分子多孔質体との接触により蛍光性不純物が除去されるという新規知見に基づくものである。すなわち、無極性高分子多孔質体を、粗チオフラビンＴから蛍光性不純物を除去するという新規な用途に用いる発明と捉えることもできる。したがって、本発明は、粗チオフラビンＴから蛍光性不純物を除去するための不純物除去剤であって、無極性高分子多孔質体からなる不純物除去剤をも提供するものである。本発明はまた、粗チオフラビンＴからの蛍光性不純物の除去における無極性高分子多孔質体の使用又は応用と捉えることもできる。

【発明の効果】

【0024】

本発明によれば、従来の技術では得ることができなかった、純粋なＴｈＴを得ることができる。

【0025】

ＴｈＴは、アミロイドの染色において第１選択となる蛍光染色試薬であり、アミロイドの研究のみならず、アミロイドに関連する疾病の病理診断にも用いられる。アミロイドの染色に純粋なＴｈＴを使用することにより、蛍光性不純物による測定結果への影響を排除でき、より精度の高い試験結果及び診断結果を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】（Ａ）実施例１における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。（Ｂ）実施例１における精製前後の励起スペクトル（観測波長４４０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、ＰＶＤＦで形成されたろ過膜である。

【図2】（Ａ）実施例２における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。（Ｂ）実施例２における精製前後の励起スペクトル（観測波長４４０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、セルロース混合エステル（ＭＣＥ）で形成されたろ過膜である。

【図3】実施例３における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、酢酸セルロースで形成されたろ過膜である。

【図4】実施例４における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、ナイロンで形成されたろ過膜である。

【図5】実施例５における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、ポリスルホンで形成されたろ過膜である。

【図6】実施例６における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、ポリエーテルスルホンで形成されたろ過膜である。

【図7】実施例７における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、ポリテトラフルオロエチレンで形成されたろ過膜である。

【図8】実施例８における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、アクリル共重合体で形成されたろ過膜である。

【図9】実施例９における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、ポリプロピレンで形成されたろ過膜である。

【図10】実施例１０における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、再生セルロースで形成されたろ過膜である。

【図11】実施例１１における精製前後の蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）を比較した図である。無極性高分子多孔質体は、グラスファイバーで形成されたろ過膜である。

【発明を実施するための形態】

【0027】

以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

【0028】

〔チオフラビンＴ〕
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）は、下記式で表され、４−（３，６−ジメチル−１，３−ベンゾチアゾール−３−イウム−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリンクロリドとも称される公知の化合物である。

【化1】

【0029】

ＴｈＴは、４８０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、４３０ｎｍ）を発する。一方、ＴｈＴは、光照射により、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光（励起波長は、例えば、３５０ｎｍ）を発する光反応物（蛍光性不純物）を生じる。これまで、この蛍光性不純物とＴｈＴとの混合物（粗ＴｈＴ）からＴｈＴを単離することはできなかった。

【0030】

粗ＴｈＴの入手方法は、特に制限されるものではなく、例えば、市販されているＴｈＴ試薬を購入して入手してもよいし、公知の方法により合成して入手してもよい。

【0031】

〔チオフラビンＴの精製方法〕
本実施形態に係るチオフラビンＴの精製方法は、粗チオフラビンＴが極性溶媒に溶解したチオフラビンＴ溶液を用意するステップ（用意ステップ）と、チオフラビンＴ溶液を無極性高分子多孔質体と接触させるステップ（接触ステップ）と、接触後のチオフラビンＴ溶液を無極性高分子多孔質体から分離するステップ（分離ステップ）と、を備える。また、分離したチオフラビンＴ溶液の４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度を測定し、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達したか否かを判定するステップ（判定ステップ）を更に備えていてもよい。本実施形態に係る精製方法により、純粋なＴｈＴを得ることができる。

【0032】

用意ステップでは、粗ＴｈＴが極性溶媒に溶解したＴｈＴ溶液を用意する。ＴｈＴ溶液は、例えば、粗ＴｈＴを極性溶媒に溶解させて調製してもよく、またＴｈＴを合成等した際に極性溶媒に溶解した溶液となっている場合は、当該溶液をＴｈＴ溶液としてもよい。

【0033】

極性溶媒は、ＴｈＴが溶解する溶媒を特に制限なく使用することができる。極性溶媒としては、例えば、比誘電率が１０以上である溶媒を使用することができる。極性溶媒の具体例としては、例えば、水系溶媒、メタノール、エタノール、アセトニトリル及びジメチルスルホキシド、並びにこれらの２種以上を混合した混合溶媒が挙げられる。水系溶媒としては、例えば、水（医薬品に用いられる精製水、イオン交換、超ろ過等により調製したイオン交換水、超純水等を含む。）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及びトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）等の緩衝液、並びに生理食塩水等が挙げられる。使用する極性溶媒は、精製後のＴｈＴの用途に応じて適宜選択すればよい。例えば、精製後のＴｈＴをアミロイドの検出に使用する場合、極性溶媒としては水系溶媒が好ましい。

【0034】

ＴｈＴ溶液におけるＴｈＴ濃度に特に制限はないが、通常、０．００１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である。精製過程での光反応物（蛍光性不純物）の新たな生成をより一層抑制するという観点からは、ＴｈＴ濃度が低い方が好ましく、例えば、０．０１〜７．５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが好ましく、０．１〜５ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることがより好ましく、０．５〜２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であることが更に好ましい。また、ＴｈＴ溶液におけるＴｈＴ濃度は、精製後のＴｈＴの用途に応じて、改めて希釈又は濃縮を行う必要がないように設定してもよい。

【0035】

接触ステップでは、ＴｈＴ溶液を無極性高分子多孔質体と接触させる。分離ステップでは、無極性高分子多孔質体と接触した後のＴｈＴ溶液を無極性高分子多孔質体から分離する。

【0036】

無極性高分子多孔質体は、無極性高分子で形成された多孔質構造体である。

【0037】

無極性高分子としては、例えば、比誘電率が１０未満である高分子（例えば、有機高分子、無機高分子）を使用することができる。無極性高分子の具体例としては、例えば、再生セルロース（比誘電率３．２〜７．５）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ，比誘電率８．４）、ポリテトラフルオロエチレン（比誘電率２．１）、酢酸セルロース（比誘電率３．２〜７．０）、ニトロセルロース（比誘電率６．２〜７．５）、ポリエチレン（比誘電率２．２〜２．４）、ポリプロピレン（比誘電率１．５〜１．８）、ポリスルホン（比誘電率３．０〜３．１）、ポリエーテルスルホン（比誘電率３．８）、ポリカーボネート（比誘電率２．９〜３．０）、ナイロン（比誘電率４．０〜５．０）、アクリル重合体（アクリル酸、メタクリル酸、及びそれらの誘導体（例えば、アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル等のエステル体）の重合体又は共重合体，比誘電率２．７〜４．５）、グラスファイバー（比誘電率３．７〜７．０）及びこれら２種以上の混合物が挙げられる。無極性高分子としては、ポリフッ化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ナイロン及びこれら２種以上の混合物が好ましく、ポリフッ化ビニリデン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ナイロン、並びに酢酸セルロース及びニトロセルロースの混合物がより好ましい。

【0038】

多孔質構造体は、細孔が形成された構造体であり、具体的には、例えば、膜（フィルム）、シート、粒状体、発泡体が挙げられる。

【0039】

無極性高分子多孔質体は、相分離法、抽出法、延伸法、トラックエッチング法、焼結法等の常法により製造することができる。

【0040】

無極性高分子多孔質体としては、例えば、無極性高分子膜（ろ過膜）、無極性高分子粒状体を挙げることができる。無極性高分子多孔質体は市販されているものを用いてもよく、例えば、ポリフッ化ビニリデンろ過膜（例えば、メンブレンフィルターＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（メルクミリポア社製））、酢酸セルロース及びニトロセルロース混合物のろ過膜（例えば、メンブレンフィルターＶｅｎｔｅｄ−Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ（メルクミリポア社製））、酢酸セルロースろ過膜（例えば、シリンジフィルターアズフィル（アズワン社製））、ナイロンろ過膜（例えば、シリンジフィルターアズフィル（アズワン社製））、ポリスルホンろ過膜（例えば、フィルターエキクロディスク２５（島津社製））、ポリエーテルスルホンろ過膜（例えば、シリンジフィルターアズフィル（アズワン社製））、ポリテトラフルオロエチレンろ過膜（例えば、シリンジフィルターアズフィル（アズワン社製））、アクリル共重合体ろ過膜（例えば、フィルターエキクロディスク１３（島津社製））、ポリプロピレンろ過膜（例えば、シリンジフィルタープラディスク２５（ＧＥヘルスケア社製））、再生セルロースろ過膜（例えば、フィルターミニザルトＲＣ１５（ミニザルト社製））、グラスファイバーろ過膜（例えば、シリンジフィルターＧＦ（アズワン社製））が挙げられる。

【0041】

ＴｈＴ溶液と無極性高分子多孔質体との接触方法に特に制限はない。接触方法の具体例としては、例えば、ろ過操作によりＴｈＴ溶液を無極性高分子膜を通して接触させる方法（膜ろ過法）、無極性高分子粒状体を充填したカラムにＴｈＴ溶液を通液して接触させる方法（カラムろ過法）、ＴｈＴ溶液に任意形状の無極性高分子多孔質体を添加して攪拌する方法が挙げられる。接触ステップと分離ステップを簡便かつ迅速に行えることから、膜ろ過法及びカラムろ過法が好ましく、膜ろ過法がより好ましい。

【0042】

ＴｈＴ溶液と無極性高分子多孔質体との分離方法に特に制限はなく、固液分離に常用される任意の方法を用いることができる。

【0043】

判定ステップでは、分離したＴｈＴ溶液の４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度を測定し、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達したか否かを判定する。

【0044】

判定ステップでは、例えば、無極性高分子多孔質体から分離したＴｈＴ溶液の一部を採取して測定サンプルとし、蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定には、例えば、蛍光分光光度計、蛍光プレートリーダーを使用することができる。より具体的には、測定サンプルに波長３００〜４３０ｎｍの光を照射し、これに応じた波長４４０〜４６０ｎｍの発光（蛍光）を測定する。照射光の波長は上記範囲内から適宜設定することができるが、波長３５０ｎｍが好ましい。測定する蛍光の波長は上記範囲内から適宜設定することができるが、波長４４０ｎｍが好ましい。

【0045】

次いで、測定された発光強度がバックグラウンドレベルに達したか否かを判定する。バックグラウンドレベルに達していないと判定された場合は、接触ステップ及び分離ステップを更に繰り返し、バックグラウンドレベルに達していると判定された場合は、精製を終了する。

【0046】

「バックグラウンドレベル」とは、精製されたＴｈＴ溶液の蛍光強度が、純粋なＴｈＴ溶液の蛍光強度と同程度であることを意味する。「バックグラウンドレベル」の判定は、例えば、以下のようにして実施することができる。すなわち、精製されたＴｈＴ溶液の波長４４０ｎｍの蛍光強度に加えて、波長４８０ｎｍの蛍光強度も測定し、波長４４０ｎｍの蛍光強度を波長４８０ｎｍの蛍光強度で除した蛍光比を求める。この蛍光比が、０．４〜１．０の範囲内にある場合に「バックグラウンドレベル」と判定することができる。ここで、蛍光比が０．５〜０．９の範囲内にある場合に「バックグラウンドレベル」と判定することが好ましく、０．６〜０．８の範囲内にある場合に「バックグラウンドレベル」と判定することがより好ましい。また、より簡易的には、判定ステップで測定された蛍光強度の測定値がそれ以上低下しない場合に「バックグラウンドレベル」と判定してもよい。

【0047】

精製終了後のＴｈＴ溶液は、そのまま次の用途に用いてもよいし、必要に応じて極性溶媒を除去し、ＴｈＴ粉末として次の用途に用いてもよいし、ＴｈＴ粉末を任意の溶媒に再溶解させたものを次の用途に用いてもよい。

【0048】

上述した精製方法は、波長４７５ｎｍ以下の光を遮光した状態で行われることが好ましい。これにより、蛍光性不純物が新たに生成することを抑制できるため、精製方法全体の効率をより一層向上させることができる。精製方法の全工程に亘って遮光した状態としてもよいが、接触ステップ以降を遮光した状態としても問題はない。波長４７５ｎｍ以下の光を遮光する方法は、適宜選択することができる。具体的には、例えば、赤色光下で精製操作を行う、又は（完全に）遮光した状態で精製操作を行うことができる。

【0049】

〔チオフラビンＴの製造方法〕
本実施形態に係るチオフラビンＴの製造方法は、上述したチオフラビンＴの精製方法を実施する精製工程を備える。本実施形態に係る製造方法により、純粋なＴｈＴを得ることができる。

【0050】

本実施形態に係る製造方法は、精製工程の前に、ＴｈＴを合成する合成工程、粗ＴｈＴを極性溶媒に溶解させる溶解工程等を備えていてもよい。また、精製工程の後に、得られた純粋なＴｈＴを包装する包装工程を備えていてもよい。包装工程は、例えば、遮光瓶（褐色瓶等）等の容器にＴｈＴ溶液を充填する工程であってもよい。

【0051】

〔チオフラビンＴを含有する組成物〕
本実施形態に係るチオフラビンＴを含有する組成物は、４４０ｎｍ付近にピーク波長を有する蛍光の発光強度がバックグラウンドレベルである組成物である。すなわち、蛍光性不純物を実質的に含まない組成物、又は実質的にＴｈＴからなる組成物（分子集合体）である。一実施形態に係る組成物は、チオフラビンＴを含有し、波長３５０ｎｍの光を照射したときの波長４４０ｎｍの蛍光の発光強度がバックグラウンドレベルである組成物である。

【0052】

本実施形態に係る組成物は、液状、固体状のいずれであってもよい。本実施形態に係る組成物は、蛍光性不純物の生成を抑制するとの観点から、遮光された容器（褐色瓶等）に充填されていることが好ましい。

【0053】

本実施形態に係る組成物は、上述したＴｈＴの精製方法又は製造方法により得ることができる。

【0054】

本実施形態に係る組成物は、蛍光性不純物を実質的に含まないため、アミロイドの染色に用いた場合に、蛍光性不純物による測定結果への影響を排除でき、より精度の高い試験結果及び診断結果を得ることができる。したがって、本実施形態に係る組成物は、アミロイド検出用組成物（アミロイド検出用蛍光試薬）として好適に使用できる。

【0055】

〔アミロイドの検出方法〕
アミロイドとは、βシート構造が特徴的なタンパク質の特殊な凝集体を示す。アミロイドを形成するタンパク質は、インスリン、β２ミクログロブリン及びアミロイドβ等の様々な種類が存在する。体内での特定のアミロイドの蓄積は病気の原因にもなる。例えば、β２ミクログロブリンは、透析アミロイド―シス、アミロイドβはアルツハイマー病に関連がある。

【0056】

本実施形態に係るアミロイドの検出方法は、蛍光試薬として本発明に係る組成物を使用すること以外は、常法に従って実施することができる。

【0057】

〔不純物除去剤〕
上述した無極性高分子多孔質体は、粗ＴｈＴを極性溶媒に溶解させたＴｈＴ溶液と接触したときに蛍光性不純物を捕捉する。この特性を利用して、無極性高分子多孔質体を、粗ＴｈＴから蛍光性不純物を除去する用途に好適に用いることができる。

【0058】

本実施形態に係る不純物除去剤は、無極性高分子多孔質体からなる。本実施形態に係る不純物除去剤は、例えば、無極性高分子多孔質体がカラムに充填された不純物除去カラム、膜形状の多孔質構造体に成形された無極性高分子多孔質体を備える不純物除去フィルターとして提供されてもよい。

【実施例】

【0059】

以下、本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0060】

〔実施例１〕
実施例１は、無極性高分子多孔質体として、ＰＶＤＦで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。

【0061】

（ＴｈＴ溶液の調製）
ＴｈＴ（ウルトラピュアグレード，ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ Ｉｎｃ．社製。本明細書における粗ＴｈＴに該当する。）を蒸留水に溶解し、１ｍＭ ＴｈＴ溶液を得た。

【0062】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１ｍＭ ＴｈＴ溶液２ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びメンブレンフィルターＭｉｌｌｅｘ−ＧＶ（材質：親水性ＰＶＤＦ，ポアサイズ：０．２２μｍ，フィルター径：３３ｍｍ，メルクミリポア社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0063】

（蛍光の測定）
得られたろ液１０μＬに蒸留水９９０μＬを添加して希釈し、マイクロセル（光路長：５ｍｍ）に充填した。試料を充填したマイクロセルを蛍光分光光度計ＲＦ−５０００（株式会社島津製作所製）に設置し、励起波長３５０ｎｍにて蛍光スペクトルを測定した。また、観測波長４４０ｎｍにて励起スペクトルを測定した。

【0064】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図１（Ａ）に示す。図１（Ａ）に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。また、励起スペクトル（観測波長４４０ｎｍ）の測定結果を図１（Ｂ）に示す。図１（Ｂ）に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長３５０ｎｍ付近をピークとする蛍光の消失が認められる。すなわち、ＰＶＤＦで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0065】

〔実施例２〕
実施例２は、無極性高分子多孔質体として、セルロース混合エステル（酢酸セルロースとニトロセルロースの混合物：ＭＣＥ）で形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例１と同様に実施した。

【0066】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１ｍＭ ＴｈＴ溶液２ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びメンブレンフィルターＶｅｎｔｅｄ−Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＳ（材質：ＭＣＥ，ポアサイズ：０．２２μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，メルクミリポア社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0067】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図２（Ａ）に示す。図２（Ａ）に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。また、励起スペクトル（観測波長４４０ｎｍ）の測定結果を図２（Ｂ）に示す。図２（Ｂ）に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長３５０ｎｍ付近をピークとする蛍光の消失が認められる。すなわち、ＭＣＥで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0068】

〔実施例３〕
実施例３は、無極性高分子多孔質体として、酢酸セルロースで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。

【0069】

（ＴｈＴ溶液の調製）
ＴｈＴ（ウルトラピュアグレード，ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ Ｉｎｃ．社製。本明細書における粗ＴｈＴに該当する。）を蒸留水に溶解し、１０ｍＭ ＴｈＴ溶液を得た。

【0070】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１０ｍＭ ＴｈＴ溶液１ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びシリンジフィルターアズフィル（材質：酢酸セルロース，ポアサイズ：０．４５μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，アズワン社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0071】

（蛍光の測定）
得られたろ液２μＬに蒸留水１９９８μＬを添加して希釈し、希釈液１０００μＬをマイクロセル（光路長：５ｍｍ）に充填した。試料を充填したマイクロセルを蛍光分光光度計ＲＦ−５０００（株式会社島津製作所製）に設置し、励起波長３５０ｎｍにて蛍光スペクトルを測定した。

【0072】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図３に示す。図３に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、酢酸セルロースで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0073】

〔実施例４〕
実施例４は、無極性高分子多孔質体として、ナイロンで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例３と同様に実施した。

【0074】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１０ｍＭ ＴｈＴ溶液１ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びシリンジフィルターアズフィル（材質：ナイロン，ポアサイズ：０．４５μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，アズワン社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0075】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図４に示す。図４に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、ナイロンで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0076】

〔実施例５〕
実施例５は、無極性高分子多孔質体として、ポリスルホンで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例３と同様に実施した。

【0077】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１０ｍＭ ＴｈＴ溶液１ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びフィルターエキクロディスク２５（材質：ポリスルホン，ポアサイズ：０．２μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，島津社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0078】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図５に示す。図５に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、ポリスルホンで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0079】

〔実施例６〕
実施例６は、無極性高分子多孔質体として、ポリエーテルスルホンで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例３と同様に実施した。

【0080】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１０ｍＭ ＴｈＴ溶液１ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びシリンジフィルターアズフィル（材質：ポリエーテルスルホン，ポアサイズ：０．４５μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，アズワン社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0081】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図６に示す。図６に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、ポリエーテルスルホンで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0082】

〔実施例７〕
実施例７は、無極性高分子多孔質体として、ポリテトラフルオロエチレンで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。

【0083】

（ＴｈＴ溶液の調製）
ＴｈＴ（ウルトラピュアグレード，ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ Ｉｎｃ．社製。本明細書における粗ＴｈＴに該当する。）を蒸留水に溶解し、１００μＭ ＴｈＴ溶液を得た。

【0084】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１００μＭ ＴｈＴ溶液２ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びシリンジフィルターアズフィル（材質：親水性ポリテトラフルオロエチレン，ポアサイズ：０．４５μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，アズワン社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0085】

（蛍光の測定）
得られたろ液１００μＬに蒸留水９００μＬを添加して希釈し、マイクロセル（光路長：５ｍｍ）に充填した。試料を充填したマイクロセルを蛍光分光光度計ＲＦ−５０００（株式会社島津製作所製）に設置し、励起波長３５０ｎｍにて蛍光スペクトルを測定した。

【0086】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図７に示す。図７に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、ポリテトラフルオロエチレンで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0087】

〔実施例８〕
実施例８は、無極性高分子多孔質体として、アクリル共重合体で形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例３と同様に実施した。

【0088】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１０ｍＭ ＴｈＴ溶液０．２５ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びフィルターエキクロディスク１３（材質：アクリル共重合体，ポアサイズ：０．２μｍ，フィルター径：１３ｍｍ，島津社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0089】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図８に示す。図８に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、アクリル共重合体で形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0090】

〔実施例９〕
実施例９は、無極性高分子多孔質体として、ポリプロピレンで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例７と同様に実施した。

【0091】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１００μＭ ＴｈＴ溶液１ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びシリンジフィルタープラディスク２５（材質：ポリプロピレン，ポアサイズ：０．４５μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，ＧＥヘルスケア社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0092】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図９に示す。図９に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、ポリプロピレンで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0093】

〔実施例１０〕
実施例１０は、無極性高分子多孔質体として、再生セルロースで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例７と同様に実施した。

【0094】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１００μＭ ＴｈＴ溶液１ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びフィルターミニザルトＲＣ１５（材質：再生セルロース，ポアサイズ：０．２μｍ，フィルター径：１５ｍｍ，ミニザルト社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0095】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図１０に示す。図１０に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、再生セルロースで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【0096】

〔実施例１１〕
実施例１１は、無極性高分子多孔質体として、グラスファイバーで形成された膜形状の多孔質構造体（ろ過膜）を適用して、純粋なＴｈＴを精製した例である。ＴｈＴ溶液の調製、及び蛍光の測定は、実施例７と同様に実施した。

【0097】

（ＴｈＴ溶液のろ過精製）
１００μＭ ＴｈＴ溶液１ｍＬを、シリンジ（テルモ製）及びシリンジフィルターＧＦ（材質：グラスファイバー，ポアサイズ：１．０μｍ，フィルター径：２５ｍｍ，アズワン社製）を用いてろ過してろ液を回収した。

【0098】

（評価）
蛍光スペクトル（励起波長３５０ｎｍ）の測定結果を図１１に示す。図１１に示されるように、ろ過により蛍光性不純物由来の波長４４０ｎｍ付近をピークとする蛍光が消失し、ＴｈＴ本来の蛍光である波長４８０ｎｍ付近をピークとする蛍光のみが残っていることが分かる。すなわち、グラスファイバーで形成されたろ過膜を用いたろ過操作により、粗ＴｈＴに含まれる蛍光性不純物の除去が可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】