6972017 ポリペプチドおよびヒアルロン酸コーティング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6972017

(24)【登録日】2021年11月5日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】ポリペプチドおよびヒアルロン酸コーティング

(51)【国際特許分類】

   A61L 29/08 20060101AFI20211111BHJP

   A61M 25/00 20060101ALI20211111BHJP

   A61F 2/12 20060101ALI20211111BHJP

   A61F 2/02 20060101ALI20211111BHJP

   A61K 6/20 20200101ALI20211111BHJP

   A61K 6/60 20200101ALI20211111BHJP

   A61L 17/00 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 29/16 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 31/16 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 17/14 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 27/34 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 27/40 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 29/12 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 31/10 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 31/12 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 27/50 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 17/10 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 17/08 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 27/18 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 29/06 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 31/06 20060101ALI20211111BHJP

   A61L 31/04 20060101ALI20211111BHJP

   G02C 7/04 20060101ALI20211111BHJP

   A61P 31/04 20060101ALN20211111BHJP

【ＦＩ】

   A61L29/08 100

   A61M25/00 500

   A61F2/12

   A61F2/02

   A61K6/20

   A61K6/60

   A61L17/00 100

   A61L27/54

   A61L29/16

   A61L31/16

   A61L17/14 100

   A61L27/34

   A61L27/40

   A61L29/12

   A61L31/10

   A61L31/12

   A61L27/50 300

   A61L17/10

   A61L17/08

   A61L27/18

   A61L27/20

   A61L29/06

   A61L31/06

   A61L31/04 120

   G02C7/04

   !A61P31/04

【請求項の数】19

【全頁数】60

(21)【出願番号】特願2018-558320(P2018-558320)

(86)(22)【出願日】2017年5月2日

(65)【公表番号】特表2019-515753(P2019-515753A)

(43)【公表日】2019年6月13日

(86)【国際出願番号】EP2017060378

(87)【国際公開番号】WO2017191110

(87)【国際公開日】20171109

【審査請求日】2020年4月2日

(31)【優先権主張番号】16305509.8

(32)【優先日】2016年5月2日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】507241492

【氏名又は名称】アンスティトゥート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシャルシュ・メディカル・（インセルム）

(73)【特許権者】

【識別番号】509228260

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ストラスブール

(73)【特許権者】

【識別番号】518388465

【氏名又は名称】プロティップ・メディカル

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ・ラヴァル

(72)【発明者】

【氏名】ピエール・シャーフ

(72)【発明者】

【氏名】ニハール・エンジン・ヴラナ

(72)【発明者】

【氏名】アンジュラ・ムートシュラー

【審査官】 吉田 知美

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０００２９７４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１２−５０１９７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−１１３３０５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Adv. Healthcare Mater. (2015), 4, p.2026-2036

【文献】 Appl. Mater. Interfaces (2016), 8, p.14958-14965

【文献】 Langmuir (2004), 20, p.7298-7302

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｌ １５／００−３３／１８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオンからなる１８以上６０以下のポリカチオン層

【化1】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
（ｂ）ヒアルロン酸からなる１８以上６０以下のポリアニオン層、を含む高分子電解質コーティング。

【請求項2】

前記少なくとも１つのポリカチオン層は、一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる

【化2】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒは−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、請求項１に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項3】

一般式（１）のＲは−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である、請求項１または請求項２に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項4】

ｎは１５以上９５以下である、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項5】

１以上５００以下のポリカチオン層を含む、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項6】

１以上５００以下のポリアニオン層を含む、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項7】

請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティングを含む装置。

【請求項8】

前記高分子電解質コーティングは、少なくとも前記装置の表面の一部を被覆する、請求項７に記載の装置。

【請求項9】

前記装置は埋め込み型装置である、請求項８に記載の装置。

【請求項10】

前記埋め込み型装置は、カテーテル、動静脈シャント、乳房植込み、心臓および他のモニター、人工内耳、除細動器、歯科インプラント、顎顔面インプラント、中耳インプラント、神経刺激装置、整形外科装置、ペースメーカーおよびリード、陰茎インプラント、人工装置、置換関節、脊椎インプラント、人工喉頭、人工心臓、コンタクトレンズ、骨折固定装置、輸液ポンプ、頭蓋内圧装置、眼内レンズ、子宮内装置、人工関節、機械弁、整形外科装置、縫合材料、泌尿ステント、血管補助装置、血管移植片、血管シャントと血管ステント、および永久または一過性の人工血管からなる群から選択される、請求項８から請求項９のいずれか一項に記載の埋め込み型装置。

【請求項11】

（ａ）装置を提供すること、
（ｂ１）前記装置の表面に、
（ｉ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオンからなる１８以上６０以下のポリカチオン層

【化3】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
ｉｉ）ヒアルロン酸からなる１８以上６０以下のポリアニオン層、を積層すること、または
（ｂ２）前記装置の表面に以上のように記述されるｉｉ）、およびｉ）を積層すること、および
ステップｂ１）および／またはｂ２）を任意に繰り返ることを含む、高分子電解質コーティングを含む装置を調製する方法。

【請求項12】

ｂ１）またはｂ２）のステップｉ）および／またはｉｉ）の後に、少なくとも１つの洗濯ステップをさらに含む、請求項１１に記載の装置を調製する方法。

【請求項13】

ｂ１）またはｂ２）のステップｉ）および／またはｉｉ）、および／または請求項１２の洗濯ステップの後に、少なくとも１つの乾燥ステップをさらに含む、請求項１０または請求項１１の装置を調製する方法。

【請求項14】

請求項７から請求項１０のいずれか一項に記述される装置を製造するための、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティングの使用。

【請求項15】

ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる１８以上６０以下のポリカチオン材料

【化4】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
ｂ）ヒアルロン酸からなる１８以上６０以下のポリアニオン材料、を含むキット。

【請求項16】

ｎが、２０以上８５以下の整数である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項17】

ｎが、２５以上７５以下の整数である、請求項１〜６及び１６のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項18】

一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位は、高分子電解質コーティング内で移動性である及び／又は拡散する、請求項１〜６、１６、及び１７のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティング。

【請求項19】

少なくとも１つのポリカチオン層と少なくとも１つのポリアニオン層は共有結合されていない、請求項１〜６及び１６〜１８のいずれか一項に記載の高分子電解質コーティング。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオンからなる少なくとも１つのポリカチオン層、およびヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン層を含む高分子電解質コーティングに関する。前記高分子電解質コーティングは殺菌活性があるので、本発明は、さらに、前記高分子電解質コーティングを含む装置、詳しくは静菌医療装置、より詳しくは埋め込み型装置を製造するための前記高分子電解質コーティングの使用、前記装置を調製する方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

先進国において第四の病因である院内感染（医療関連感染とも呼ばれる）は大きな健康問題である。年々、プロテーゼと医療装置の移植は増えていく。一方、文献に報告されるインプラントに関連する院内感染の流行はいつも上がっていく。世界中の半分の院内感染が医療装置に関係することが知られる。したがって、頻度および潜在的重症度に基づいて、最も重大な院内感染は、手術、例えば手術部位の感染および医療装置に関連するものであり、カテーテルを挿入した患者の尿路感染、人工呼吸器を挿入した患者の肺炎、および血管内カテーテルの使用に関連する菌血症等を含む。

【0003】

医療装置関連感染の増加のいくつかの要因としては、ｉ）人口の高齢化、ｉｉ）多剤耐性の細菌、ｉｉｉ）抗生物質の分子設計の新しい設計の開発不良である。インプラント等の医療装置の場合に、手術部位は病原体の格好の標的であり、早期合併症を引き起こす。このようなインプラントに関連する感染を防止するために、移植後の最初の６時間における局所治療には特に関心がある。

【0004】

この傾向を遅くするため、院内感染を低減する革新的で 生物活性があるスマートコーティングおよび材料は緊急に必要である。

【0005】

通常、基板上のポリカチオンとポリアニオンの交互積層は、高分子電解質コーティングと呼ばれるコーティングを形成する。それらの高分子電解質コーティングは多層構造を含み、それらの厚みが積層ステップの数とともに増加する。この種類のコーティングの潜在用途は、エネルギー貯蔵装置から防曇コーティングと生物活性の基板まで広まっている。後者の領域において、抗菌コーティングは、院内感染との闘いに関連する重要性のせいで広く注意を引いてきた。

【0006】

抗菌コーティングの１つの策略は、病原体の装置への付着および増殖を抑制する抗接着性のコーティングの設計にある。そこで、これらの抗接着性のコーティングは生物膜の形成を防止する。しかしながら、病原体の増殖がこの方法で抑制されていないので、特に虚弱な免疫不全者の場合に、周囲の他の部位への定着の可能性が高い。

【0007】

他の策略は、殺菌性のコーティングの設計にある。これらのコーティングは、通常、その積み重ね中にまたは積み重ね後のコーティングへの拡散によりコーティングの構造に組み込まれる抗生物質等の抗菌剤を放出する。活性化合物の放出は、例えば、コーティングの酵素分解またはｐＨ変化によりてトリガされることができる。また、その放出は、１つの膜成分の加水分解のせいで自然に起こり生ずる。

【0008】

これらはおもしろい手段であり、しかし、殺菌性のコーティングの原位置の放出プロフィルは、過剰の送達された薬物の悪影響を防止するために完全に制御されるべきである。なお、多くの場合にはその放出がパッシブであり、これは抗菌剤が細菌の有無にかかわらず送達されることを意味する。これらの欠点を回避するために、接触致死策略はより好ましく、材料の表面と接触する時のみに細菌を損傷するからである。

【0009】

本発明者らは、ポリカチオンとしてポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＡＲ）、ポリアニオンとしてヒアルロン酸（ＨＡ）を使用する高分子電解質コーティングを最近開発する。前記コーティングは抗菌性と免疫調節性を持つ強い表面コーティングとして用いられる（Oｚcｅｌｉｋ,Ｈ．ｅｔ ａｌ．,２０１５,Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｍａｔ,４:２０１２６−２０３６）。しかし、この策略において、抗菌性のペプチドがさらに添加されて同時に細菌、酵母および菌類を効率良く殺す。なお、用いられるポリ−Ｌ−アルギニンが単分散でないが、用いられるポリ−Ｌ−アルギニンの市販バッチは、異なる鎖長と７００００以上の分子量を有するポリマー鎖（４００以上のアルギニン残基を有するポリペプチド鎖に相当する）を含む。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0010】

【非特許文献1】Oｚcｅｌｉｋ,Ｈ．ｅｔ ａｌ．,２０１５,Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｍａｔ,４:２０１２６−２０３６

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0011】

これに対して、本発明において、本発明者らは、１０以上２００以下の残基を有する十分に記述されるポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｌ−オルニチン鎖を選択して、ＨＡをポリアニオンとして交互コーティングを積み重ねる。

【0012】

本発明者らは、驚いたことに、それらのコーティングが例えば、黄色ブドウ球菌（S．aureus）およびミクロコッカス・ルテウス（M．luteus）の細菌増殖を強く抑制することを示す。特に、いくつかのこれらのポリマーが溶液において殺菌活性を示すが、ポリアニオンＨＡのない時にコーティングとして用いられる場合に、前記殺菌活性が無くなったので、これらの結果は予期しなく驚くべきである。

【0013】

ミクロコッカス・ルテウスがヒアルロニダーゼに不足なので、そのミクロコッカス・ルテウスに対する殺菌活性（図５参照）はさらに予期しなく驚くべきである。このため、本発明者らは、ＨＡ層の分解に必要がある従来技術のコーティングに反して、本発明の高分子電解質コーティングの殺菌活性がＨＡ層の分解に依存しないことを示す。

【0014】

さらに、別のコーティングに反して、本発明のコーティングの殺菌活性の原因となる機構は、細菌のコーティングとの表面接触に基づいたように見える。

【0015】

本発明者らは、ポリカチオン分子がコーティングにおいて拡散し、コーティングの架橋が殺菌機能を低減するので、殺菌活性がポリカチオン分子の自由な拡散に依存するように見えることを示す（図１０および１１参照）。

【0016】

そのため、本発明は、
（ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオンからなる少なくとも１つのポリカチオン層

【化1】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
（ｂ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン層、を含む高分子電解質コーティングに関する。

【0017】

本発明は特に、
（ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオン層

【化2】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒは、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
（ｂ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン層、を含む高分子電解質コーティングに関する。

【0018】

また、本発明は、本発明の高分子電解質コーティングを含む装置に関する。

【0019】

さらに、本発明は、本発明の装置、詳しくは医療装置、より詳しくは埋め込み型装置を製造するための本発明の高分子電解質コーティングの使用に関する。

【0020】

さらに、本発明は、本発明の高分子電解質コーティングを含む装置を調製する方法に関し、この方法は、
（ａ）装置を提供すること、
（ｂ１）前記装置の表面に、
（ｉ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位を含む少なくとも１つのポリカチオンからなる少なくとも１つのポリカチオン層

【化3】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、そして
ｉｉ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン層、を積層すること、または
（ｂ２）前記装置の表面に上記のように記述されるｉｉ）、そしてｉ）を積層すること、および
ステップｂ１）および／またはｂ２）を任意に繰り返すことを含む。

【0021】

さらに、本発明は、特に本発明の高分子電解質コーティングを含む装置を調製する方法に関し、この方法は、
（ａ）装置を提供すること、
（ｂ１）前記装置の表面に、
（ｉ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオン層

【化4】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒは、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、そして
ｉｉ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン層、を積層すること、または、
（ｂ２）前記装置の表面に上記のように記述されるｉｉ）、そしてｉ）を積層すること、および
ステップｂ１）および／またはｂ２）を任意に繰り返すことを含む。

【0022】

さらに、１つの態様において、本発明は、
（ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオン材料

【化5】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
（ｂ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン材料、を含むキットに関する。

【0023】

詳しい態様において、本発明は、
ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオン材料

【化6】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒは、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
ｂ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン材料、を含むキットに関する。

【0024】

さらに、１つの態様において、本発明は、埋め込み型装置の移植を受ける人の細菌感染を防止する方法に関し、以下のように記述される埋め込み型装置を提供するステップと、細菌感染を防止する前記埋め込み型装置を人に移植するステップを含む。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、ＱＣＭで追跡するＳｉ０_２被覆結晶への（ＰＡＲ／ＨＡ）多層コーティングの積み重ねを示す図である。様々な分子量のＰＡＲ（それぞれＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００という表記に対応する１０、３０、１００または２００個の残基）をＨＡとともに使用する。吸着される層数の関数と正規化頻度−Δｆｖ／ｖ（ｖ＝３）の進化である。ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００で積み重ねたコーティングについて、積層ステップ数での正規化頻度の指数増殖が観察される。より大きいＰＡＲ鎖について、最も重要な重大な増殖が監視される。ＰＡＲ１０の場合に、積層数での正規化頻度の増加がより弱く、しかし、指数増殖がすでに観察される。

【図2】図２は、ＰＡＲ／ＨＡコーティングのセクション（ｘ、ｚ）の共焦点顕微鏡法画像を示す画像である。ＱＣＭで追跡するＳｉ０_２被覆結晶上の（ＰＡＲ／ＨＡ）多層コーティングのＰＡＲ／ＨＡコーティングの積み重ねについての、ＰＡＲ／ＨＡコーティングのセクション（ｘ、ｚ）の共焦点顕微鏡法による観察である。様々な分子量のＰＡＲ、すなわち、ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００による（ＰＡＲ／ＨＡ）多層コーティングの積み重ねが比較されている。この画像は、得られたコーティングがすべての条件で表面に均一に積層されることを示す（１０〜２００個の残基のＰＡＲの場合）。

【図3】図３は、ＰＡＲ本発明のコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。様々な残基のポリ−Ｌ−アルギニンを含む（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各々の値は、３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４の場合に約８０％であり、（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４の場合に７５％であり、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４の場合に約９０％であり、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に５％以下であるので、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に、９５％以上の強い増殖抑制を示す。

【図4】図４は、本発明のＰＬＬコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間（Ｊ＋１）、２日間および３日間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各２４時間後に、コーティングを黄色ブドウ球菌の新鮮な懸濁液に接触する。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に１と２日間後５％以下であるので、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に、最初の４８時間に９５％以上の強い増殖抑制を示す。

【図5】図５は、コーティング（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４を使用してミクロコッカス・ルテウスの増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２０時間接触した後に上清に観察された正規化のミクロコッカス・ルテウス増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。ミクロコッカス・ルテウスの増殖について、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に２％以下であるので、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に９８％以上の強い増殖抑制を示す。

【図6】図６は、ポリアニオンＨＡがないＰＡＲ３０またはＰＬＬ３０コーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。ポリアニオン層ＨＡがないＰＬＬ３０またはＰＡＲ３０のポリカチオン層に２４時間接触した後に、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各２４時間後に、コーティングを黄色ブドウ球菌の新鮮な懸濁液に接触させる。。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、ＰＬＬ３０ の場合に約６５％であり、ＰＡＲ３０の場合に約１００％であるので、ＰＬＬ３０の場合に３５％のみの小さい増殖抑制を示し、ＰＡＲ３０の場合に増殖抑制を示さない。

【図7】図７は、本発明の（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０を使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。最後層のＰＡＲ３０を多層コーティング（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４に加えるので、多層コーティング（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０が生成される。（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０多層コーティングに２４時間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に１％以下であるので、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に９９％以上の強い増殖抑制を示す。

【図8】図８は、本発明の（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０を使用してミクロコッカス・ルテウスの増殖抑制を示す図である。最後層のＰＡＲ３０を多層コーティング（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４に加えるので、多層コーティング（ＰＡＲ_２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ_３０が生成される。ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０多層コーティングに２４時間接触した後、上清に観察された正規化のミクロコッカス・ルテウス増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。ミクロコッカス・ルテウスの増殖について、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に１％以下であるので、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に９９％以上の強い増殖抑制を示す。

【図9】図９は、本発明のＰＬＯコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。異なる残基数のポリ−Ｌ−オルニチンを含む（ＰＬＯ／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す、すなわち、（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ１００／ＨＡ）_２４。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４の場合に約８０％であり、（ＰＬＯ１００／ＨＡ）_２４の場合に５％以下のであり、（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４の場合に３％以下であるので、（ＰＬＯ１００／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４の場合に９５％以上の強い増殖抑制を示す。

【図10】図１０は、（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）２４または架橋（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４を使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。０．５ＭのＥＤＣと０．１ＭのＮＨＳを有するＥＤＣ／ＮＨＳにより、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４を４℃で１５時間架橋させる。エタノールアミンを使用して未反応のカルボキシル基を中和する。（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４または架橋（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清において正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を測定する。黄色ブドウ球菌の増殖について、架橋（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４の場合に約６５％であり、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に１８％以下であるので、架橋が著しくコーティングの殺菌活性を低減することを示す。

【図11】図１１は、（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４または架橋（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４を使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。０．５ＭのＥＤＣと０．１ＭのＮＨＳを有するＥＤＣ／ＮＨＳを使用して（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４を４℃で１５時間架橋する。エタノールアミンを使用して未反応のカルボキシル基を中和する。（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４または架橋（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清において正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を測定する。黄色ブドウ球菌の増殖について、架橋（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４の場合に約６５％であり、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に５％以下であるので、架橋がコーティングの殺菌活性を低減することを示す。

【図12】図１２は、１０、３０、１００または２００個のアルギニン残基を有する可溶性ＰＡＲの最小抑制濃度（ＭＩＣ_１００）を示す図である。黄色ブドウ球菌の１００％抑制を引き起こす最小抑制濃度（ＭＩＣ_１００）を溶液において測定する。１０、３０、１００または２００個のアルギニン残基を有するＰＡＲに検査を行う。０．０４ｍｇ．ｍＬ^−１までの濃度で、すべてのＰＡＲ（ＰＡＲ_１０、ＰＡＲ_３０、ＰＡＲ_１００またはＰＡＲ_２００）は、黄色ブドウ球菌増殖を完全に抑制する。

【図13】図１３は、放出実験の結果を示す図である。以上の「放出実験」というセクションに説明するように放出実験を行う。ＰＡＲ−ＦＩＴＣを有する 多層コーティング（ＰＡＲ３０ＦＩＴＣ／ＨＡ）_２４をＭＨＢ培地または黄色ブドウ球菌／ＭＨＢ溶液（Ａ_６２０＝０．００１）に接触させる。ＰＡＲ−ＦＩＴＣの放出を経時的に監視する。各条件で３つのサンプルを研究する。

【図14】図１４は、ＭＷによる（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４コーティングにおける運転ＰＡＲの比率（％）を示す図である。以上の「光退色（ＦＲＡＰ）実験後の蛍光回復」というセクションに説明する光退色実験（ＦＲＡＰ、光退色後の蛍光回復）により、ＰＡＲ−ＦＩＴＣを含有する（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４多層に対して拡散係数D、および運転分子の比率pを測定する。

【図15】図１５は、コーティングから溶液に拡散するＰＡＲ３０の濃度が黄色ブドウ球菌の増殖を効率的に抑制するのに不十分であることを示す図である。多層膜（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４で培養する培地に２４時間接触した後の正規化の黄色ブドウ球菌増殖を示す。培地Ａ）には３００μＬの黄色ブドウ球菌溶液Ａ６２０＝０．００１があり、Ｂ）には３００μＬのＭＨＢのみがある。細菌増殖抑制が観察されていない。

【図16】図１６は、（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４を使用して異なる細菌の増殖抑制を示す図である。コーティング（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４で被覆するガラスに２４時間接触した後の正規化の細菌増殖を示す。黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌および緑膿菌について細菌増殖が９０％以上抑制される。

【図17】図１７は、本発明のＰＬＬコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。異なる残基数のポリ−Ｌ−リジンを含む（ＰＬＬ／ＨＡ）_２４、すなわち、（ＰＬＬ１０／ＨＡ）_２４、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４、（ＰＬＬ１００／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清において観察された正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、ガラスと抗生物質の組み合わせの場合に３％以下であり、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に６％以下である。一方、細菌増殖について、（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４の場合に約７５％であり、（ＰＬＬ１００／ＨＡ）_２４の場合に約８５％であり、（ＰＬＬ１０／ＨＡ）_２４の場合に約９０％である。

【図18】図１８は、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４を使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに１日、２日と３日接触した後、上清において得られる正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各２４時間の後、コーティングを黄色ブドウ球菌の新鮮な懸濁液に接触させる。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、１日と２日後の（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に５％以下であるので、最初の４８時間に（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４に対して９５％以上の強い増殖抑制を示す。３日後に、抑制活性が低減する。

【図19】図１９と２０は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行い、ａ）およびｂ）は２つの同様な独立した実験に対応する。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図20】図１９と２０は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ５０／ＨＡ）２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）２４および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行い、ａ）およびｂ）は２つの同様な独立した実験に対応する。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図21】図２０と２１は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_４８コーティングの上清のの抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_４８および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行い、ａ）およびｂ）は２つの同様な独立した実験に対応する。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図22】図２０と２１は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_４８コーティングの上清のの抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_４８および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行い、ａ）およびｂ）は２つの同様な独立した実験に対応する。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図23】図２３は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４（ＰＡＲ１５０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図24】図２４は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図25】図２５は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ７０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図26】図２６、２７と２８は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４（POR３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図27】図２６、２７と２８は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４（POR３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図28】図２６、２７と２８は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４（POR３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図29】図２９、３０と３１は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図30】図２９、３０と３１は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図31】図２９、３０と３１は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図32】図３２と３３は、本発明のＰＡＲコーティングを異なる貯蔵条件に暴露させた後の黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。予め乾燥され４℃で１日間（ａ）または７日間貯蔵される（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図33】図３２と３３は、本発明のＰＡＲコーティングを異なる貯蔵条件に暴露させた後の黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。予め乾燥され４℃で１日間（ａ）または７日間貯蔵される（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図34】図３４は、本発明のＰＡＲコーティングを異なる貯蔵条件に暴露させた後の黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。オートクレーブで予め滅菌される（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【発明を実施するための形態】

【0026】

高分子電解質コーティング
本発明者らは、ポリカチオンとしてポリアルギニン、ポリオルニチンまたはポリリジン、ポリアニオンとしてヒアルロン酸（ＨＡ）を有する高分子電解質コーティングが殺菌性を有する強い表面コーティングであることを示す。本発明者らは、ポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＡＲ）、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）またはポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、特にそれぞれ３０個のアルギニン、オルニチンまたはリジン残基があるもの、およびポリアニオンとしてヒアルロン酸（ＨＡ）を有する高分子電解質コーティングが強い殺菌活性を持つことを示す。

【0027】

さらに、本発明者らは、１００個のオルニチン残基があるポリオルニチンおよびポリアニオンとしてヒアルロン酸（ＨＡ）を有する高分子電解質コーティングが強い殺菌活性を持つことを示す。

【0028】

当業者に知られているように、用語「高分子電解質」とは、繰り返し単位が電解質基を持つポリマーのことを指す。ポリカチオンとポリアニオンの両方も高分子電解質である。したがって、本発明において、ポリアニオン層とポリカチオン層は高分子電解質層と呼ばれることがある。

【0029】

一般式（１）のポリカチオンはｎ個の繰り返し単位を含み、前記繰り返し単位が同じであってもよく異なってもよい。本発明によれば、ポリカチオンの繰り返し単位は、一般式−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｒ）−Ｃ（＝０）で表される。所定の繰り返し単位にとって、Ｒは以上のように定義され、それぞれの単位において異なってもよい。

【0030】

１つの好ましい実施形態によれば、一般式（１）のポリカチオンは、すべてのＲ基が同じであるｎ個の繰り返し単位を含む。

【0031】

また１つの実施形態によれば、一般式（１）のポリカチオンは、Ｒ基が異なってもよいｎ個の繰り返し単位を含む。

【0032】

ポリカチオンは、ｎ個の単位において、ｉ個の一般式−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２− ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）−Ｃ（＝０）の単位、ｊ個の一般式−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）−Ｃ（＝０）の単位、およびｋ個の一般式−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２）−Ｃ（＝０）の単位を含み、ｉ、ｊ、およびｋがそれぞれ０からｎまでの範囲にあり、ｉ＋ｊ＋ｋ＝ｎであり、単位がランダム分布またはブロック分布を有する。ここで、「少なくとも１つのポリカチオン」における用語「少なくとも」とは、一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位を含む少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のポリカチオン、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個のポリカチオン、好ましくは一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位を含む１つのポリカチオンのことを指す。

【0033】

ここで記述される「一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位を含むポリカチオン」または「一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位」は、正帯電ポリマーであり、「ポリカチオン材料」と呼ばれることもできる。したがって、１つの実施形態において、本発明に記述されるような一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位のポリカチオン材料は、本発明の高分子電解質コーティングの少なくとも１つのポリカチオン層を含む。

【0034】

１つの実施形態において、Ｒが−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合に、一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位における「ｎ」は、１１以上１００以下の整数である。

【0035】

もう１つの実施形態において、ｎは１１から９９までの整数であり、例えば、Ｒが−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、好ましくは、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、より好ましくは、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは１１以上９５以下、１５以上９５以下、１５以上９０以下、１５以上８５以下、 １５以上８０以下、１５以上７５以下、２０以上９５以下、２０以上９０以下、２０以上８５以下、２０ 以上８０以下、２０以上７５以下、２５以上９５以下、２５以上９０以下、２５以下８５以下、２５以上 ８０以下、２５以上７５以下、２８以上 ７４以下、２８以上７２以下、３０以上７０以下の整数、例えば３０、５０および７０である。

【0036】

もう１つの実施形態において、ｎは１１から４９までの整数であり、例えば、Ｒが−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、好ましくは、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、より好ましくは、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは１１以上４５以下、１５以上４５以下、２０以上４０以下、２１以上３９以下、 ２２以上３８以下、２３以上３７以下、２４以上３６以下、２５以上３５以下、２６以上３４以下、２７以上３３以下、２８以上３２以下、２９以上３１以下の整数である。

【0037】

１つの特定の実施形態において、Ｒが−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、好ましくは、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、より好ましくは、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは１１、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、４７、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８からなる群から選ばれる整数であり、好ましくは、ｎは３０、５０または７０である。

【0038】

１つの特定の実施形態において、Ｒが−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、好ましくは、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、より好ましくは、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは１１、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５および４９からなる群から選ばれる整数であり、好ましくは、ｎは３０である。

【0039】

１つの特定の実施形態において、Ｒが−ＮＨ_２である場合に、ｎは１１以上１５０以下の整数であり、例えば、１１以上１４０以下、１１以上１３０以下、１１以上１２０以下、１１以上１２０以下、１５以上１１０以下、１５以上１００以下、２０以上１００以下、２２以上９５以下、２４以上９０以下、２６以上８０以下、２６以上７５以下、２６以上７０以下、２６以上６５以下、２６以上５５以下、２６以上５０以下、２６以上４５以下、２６以上４０以下、２６以上３５以下、２６以上３４以下、２７以上３３以下、２８以上３２以下、２９以上３１の整数である。１つの実施形態において、Ｒが−ＮＨ_２である場合に、ｎは１１、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０からなる群から選ばれる整数であり、好ましくは、ｎは３０または１００である。

【0040】

１つの実施形態において、Ｒが−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、好ましくは、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、より好ましくは、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは、ｎが１１以上、またｎが４９以下であるという条件で以上のように記述される整数であり、好ましくは、Ｒが−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、好ましくはＲが−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される場合、より好ましくはＲが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは１５、２０、または２５以上であり、また、ｎは４５、４０、または３５以下である。

【0041】

１つの特定の実施形態において、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは、ｎが２０または２５以上、また、ｎが９５または１００以下であるという条件で以上のように記述される整数である。

【0042】

１つの特定の実施形態において、Ｒが−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に、ｎは、ｎが２０または２５以上、また、ｎが４５または４０以下であるという条件で以上のように記述される整数である。

【0043】

もう１つの特定の実施形態において、Ｒが−ＮＨ_２である場合に、ｎは、ｎが２０または２５以上、また、ｎが４５または４０以下であるという条件で以上のように記述される整数である。

【0044】

もう１つの特定の実施形態において、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２である場合に、ｎは、ｎが２０または２５以上、また、ｎが４５または４０以下であるという条件で以上のように記述される整数である。

【0045】

一般式（１）の「繰り返し単位」は、「構成単位」とも呼ばれ、ここでアミノ酸またはアミノ酸残基のことを指し、前記アミノ酸は、Ｒが−ＮＨ_２である場合にオルニチンであり、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２である場合にリジンであり、Ｒが−Ｈ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合にアルギニンである。したがって、「一般式（１）のｎ個の繰り返し単位」は、「一般式（１）のｎ個のアミノ酸残基」と呼ばれてもよく、より正確には、Ｒが−ＮＨ_２である場合にｎ個のオルニチン残基と呼ばれ、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２である場合にｎ個のリジン残基と呼ばれ、Ｒが−Ｈ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合にｎこのアルギニン残基と呼ばれてもよい。

【0046】

１つの実施形態において、一般式（１）のｎ個の繰り返し単位は、ペプチド結合の形成を介して重合する。したがって、一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位または一般式（１）のｎ個のアミノ酸残基は、ポリマーまたはポリペプチドと呼ばれてもよい。

【0047】

いくつかの実施形態において、以上に記述されるような上記ｉ、ｊ、およびｋ個の単位は、ペプチド結合の形成を介して重合する。したがって、ｉ個の一般式−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）−Ｃ（＝０）の単位、ｊ個の一般式−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ_２）−Ｃ（＝０）の単位、およびｋ個の一般式−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２）−Ｃ（＝０）の単位を含むポリカチオン材料は、コポリマーと呼ばれてもよく、ｉ、ｊ、およびｋがそれぞれ０からｎまでの範囲にあり、ｉ＋ｊ＋ｋ＝ｎであり、上記単位がランダム分布またはブロック分布を有する。

【0048】

アミド結合とも呼ばれる「ペプチド結合」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基（ＣＯＯＨ）と他のアミノ酸のアミノ基（ＮＨ_２）の間に形成される共有化学結合であり、一つの水分子がそこに生成される。

【0049】

以上により、いくつかの実施形態において、「一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位」は、Ｒが−ＮＨ_２である場合に「ｎ個のオルニチン残基を有するポリオルニチン」と呼ばれ、Ｒが−ＣＨ_２−ＮＨ_２である場合に「ｎ個のリジン残基を有するポリリジン」と呼ばれ、Ｒが−Ｈ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２である場合に「ｎ個のアルギニン残基を有するポリアルギニン」と呼ばれてもよい。

【0050】

「オルニチン」は、尿素サイクルに役割を果たす非タンパク質原性アミノ酸である。ポリオルニチンは、構成単位であるオルニチンのポリマーのことを指す。ポリオルニチンは、ポリ−Ｌ−、ポリ−Ｄ−またはポリ−ＬＤ−オルニチンのことを指す。本発明において、ポリオルニチンは、特にポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）を指す。

【0051】

「アルギニン」および「リジン」は、タンパク質の生合成に用いられるα−アミノ酸である。ポリアルギニンおよび−リジンはそれぞれ、構成単位であるアルギニンまたはリジンのポリマーのことを指す。ポリアルギニンまたは−リジンは、ポリ−Ｌ−、ポリ−Ｄ−またはポリ−ＬＤ−アルギニンまたは−リジンのことを指す。本発明において、ポリアルギニンまたはポリリジンはそれぞれ、特にポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＡＲ）およびポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）のことを指す。

【0052】

「ポリ−Ｌ−オルニチン」、「ポリ−Ｌ−リジン」および「ポリ−Ｌ−アルギニン」は、正帯電の合成ポリマー（ポリカチオンとも呼ばれる）であり、対イオンを持つ塩として生成される。その対イオンは、塩酸塩、臭化水素酸塩またはトリフルオロ酢酸塩から選択されてもよく、これに制限されていない。

【0053】

１つの実施例において、ポリアルギニンは、ＣＡＳ＃２６９８２−２０−７のポリ−Ｌ−アルギニン塩酸塩である。

【0054】

１つの実施例において、ポリオルニチンは、ＣＡＳ＃２７３７８−４９−０のポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩、またはＣＡＳ＃２６９８２−２１−８のポリ−Ｌ−オルニチン塩酸塩である。

【0055】

１つの実施例において、ポリリジンは、ＣＡＳ＃２５９８８−６３−０のポリ−Ｌ−リジントリフルオロ酢酸塩、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩、またはＣＡＳ＃２６１２４−７８−７のポリ−Ｌ−リジン塩酸塩である。

【0056】

特定のアミノ酸残基を有するポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−リジンおよびポリ−Ｌ−アルギニンは、例えば、米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社を介して市販品として得られる。

【0057】

１つの実施例において、ポリ−Ｌ−アルギニン（ＰＡＲ）、例えば、ＰＡＲ１０（１０個のアルギニン（Ｒ）、Ｍｗ＝２．１ｋＤａ、ＰＤＩ＝１）、ＰＡＲ３０（３０個のＲ、Ｍｗ＝６．４ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０１）、ＰＡＲ５０（５０個のアルギニン（Ｒ）、Ｍｗ＝９．６ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０３）、ＰＡＲ７０（７０個のアルギニン（Ｒ）、Ｍｗ＝１３．４ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０１）、ＰＡＲ１００（１００個のＲ、Ｍｗ＝２０．６ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０５）、およびＰＡＲ２００（２００個のＲ、Ｍｗ＝４０．８ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０６）は、米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から購入される。

【0058】

もう１つの実施例において、ポリ−Ｌ−オルニチン（ＰＬＯ）、例えば、ＰＬＯ３０（３０個のＲ、Ｍｗ＝５．９ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０３）、ＰＬＯ１００（１００個のＲ、Ｍw=１８．５ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０３）、およびＰＬＯ２５０（２５０個のＲ、Ｍｗ＝４４．７ｋＤａ、ＰＤI=１．０２）は、米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から購入される。

【0059】

またもう１つの実施例において、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、例えば、ＰＬＬ１０（１０個のＲ、Ｍｗ＝１．６ｋＤａ）、ＰＬＬ３０（３０個のＲ、Ｍｗ＝５．４ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０２）、ＰＬＬ１００（１００個のＲ、Ｍｗ＝１７．３ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０７）、ＰＬＬ２５０（２５０個のＲ、Ｍｗ＝３９．５ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０８）は、米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から購入される。

【0060】

ｎが例えば３０であるｎ個の繰り返し単位、例えばポリアルギニン、ポリリジン、またはポリオルニチンを有するポリペプチドを得る方法は、当業者に知られて、α−アミノ酸であるＮ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）の開環重合と、その後の精製を含む。典型的に、ポリペプチドは、重合の後に、水あるいは例えば、有機非溶媒における沈降により、また、アミノ酸の側鎖脱保護の後に、透析により精製される。すべての水溶性ポリマーは最後に凍結乾燥される。

【0061】

ｎ個の単位を有するコポリマーを得る方法も当業者に知られている。

【0062】

１つの好ましい実施形態において、一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位は単分散であり、すなわち、ポリカチオン層が含むポリカチオン材料は単分散である。ポリカチオン層が含むポリカチオン材料は単分散であると、ポリカチオン層も単分散であることは、当業者にとっては理解できる。したがって、１つの実施形態において、本発明におけるポリカチオン層が単分散である。

【0063】

ここで、「単分散」とは、同じ質量の同じ分子を含むポリマーのことを指す。合成単分散のポリマー鎖は、例えば、アニオン性触媒を使用して鎖長が同様である鎖を生成する方法であるアニオン重合、例えば、α−アミノ酸Ｎ−カルボキシ無水物（ＮＣＡ）の開環重合のようなプロセスによって作成されることができる。多分散性指数（ＰＤＩ）に基づいてポリマーのサンプルが単分散であるかどうかを確定ことができる。したがって、１つの実施形態において、多分散性指数（ＰＤＩ）を使用して単分散性を表す。

【0064】

いくつかの実施形態において、上記少なくとも１つのポリカチオンが１つ以上のポリカチオンである場合に、上記少なくとも１つのポリカチオンは多分散であってもよく、すなわち、ポリカチオン層が含むポリカチオン材料は、異なるポリカチオンの混合物であり、多分散であってもよい。ポリカチオン層が含むポリカチオン材料は多分散であると、ポリカチオン層も多分散であることは、当業者にとっては理解できる。したがって、１つの実施形態において、本発明におけるポリカチオン層が多分散である。

【0065】

ここで、「多分散」とは、異なる質量の異なる分子のポリマーのことを指す。

【0066】

「多分散性指数（ＰＤＩ）」または「抗体異性度指数」、あるいあは単純の「分散性」は、所定のポリマーサンプルにおける分子質量の分布の指標である。多分散性指数（ＰＤＩ）は、重量平均分子量（Ｍ_ｗ）を数平均分子量（Ｍ_ｎ）で割れることにより計算される。ＰＤＩは１以上の値を有するが、ポリマー鎖が均一鎖長に近接することにつれて、ＰＤＩは１に近接する。

【0067】

したがって、１つの実施形態において、多分散性指数（ＰＤＩ）は、１．５以下、１．４以下、１．３以下、特に１以上１．２以下、好ましくは１以上１．１以下、例えば１以上１．０５以下である。

【0068】

１つの特定の実施形態において、一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位、ポリカチオン材料またはポリカチオン層の多分散性指数（ＰＤＩ）は、１．５以下、１．４以下、１．３以下、特に１以上１．２以下、好ましくは１以上１．１以下、例えば１以上１．０５以下である。

【0069】

当業者に知られているように、ＰＤＩは、サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）、動的光波散乱計測等の光波散乱計測、あるいはマトリックス支援レーザ脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレイイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）等の質量分析法により計測されてもよい。

【0070】

１つの実施例において、ＰＤＩは、典型的に６０℃で、例えば０．１Ｍ ＬｉＢｒのＤＭＦにおいて、典型的にゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により保護ポリアミノ酸に対して、または典型的に水性緩衝液において、例えばＧＰＣにより脱保護ポリペプチドに対して、両方の場合にも狭義の多分散性ＰＥＧ標準またはＴＡＬＬＳのユニバーサル較正から形成される検量線を使用することにより計測される。アミノ酸の繰り返し単位を使用するＴＡＬＬＳまたはプロトンＮＭＲ分光法により、平均分子量を組み込まれる開始剤ピックの統合比率に提供する。

【0071】

ヒアルロナンとしても知られる「ヒアルロン酸（ＨＡ）」は、Ｎ−アセチルグルコサミンとグルクロン酸塩の繰り返し二糖単位（β１−３およびβ１^_４グリコシド結合により架橋される）からなる直鎖（非分岐鎖）多糖または非硫酸化グリコサミノグリカンである。そのため、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、負帯電ポリマー（ポリアニオンとも呼ばれる）であるため、本発明において、ポリアニオン材料とも呼ばれる。したがって、前記負帯電ポリマーは、塩として対イオンとともに存在する。ヒアルロン酸ナトリウムについて、その対イオンはナトリウムである。それは一部の細胞外マトリックスとして結合、上皮と神経組織にわたって広く分布される。眼球の硝子体液、滑液、皮膚、および臍帯（ワルトン膠質）において高濃度で存在する。平均的に７０ｋｇの人はその体内に約１５グラムのヒアルロナンがあり、その三分の一が毎日代謝回転（分解および合成）されている。それはＡとＣ群連鎖球菌（Streptococci）およびパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）と、鳥類、哺乳類、および他の動物目に見られる進化的に保存された分子である。低濃度の中高分子量（５００，０００から＞３百万Ｄａ）の溶液において、水性溶液に相当な粘性を与える。ヒアルロン酸はヒアルロニダーゼから分解されることができる。ヒアルロナンの分子量（Ｍｗ）は、個体群におけるすべての分子の平均を表すので、平均分子質量（平均分子量）を表す。１つの実施例において、ヒアルロン酸は、１５０ｋＤａの分子量を有し、米国のＬｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄ社からのヒアルロン酸ナトリウムとして組み込まれる。

【0072】

「ヒアルロニダーゼ」とは、ヒアルロナンを分解する酵素科である。酵素は殆どの動物種と多くの微生物に見られる。異なる特異性と動態の異なるタイプのヒアルロニダーゼがたくさんある。

【0073】

１つの実施形態において、高分子電解質コーティングは、さらに「活性薬物」を含んでもよい。

【0074】

本明細書明において、用語「活性薬物」とは、生物学的事象を変更、抑制、活性化または作用する化合物または実体のことを指す。例えば、その薬物として、抗癌物質、抗炎症剤、免疫抑制剤、細胞増殖抑制剤を含む細胞−細胞外マトリックス相互作用の修飾物質、抗凝固薬、抗血栓剤、酵素抑制剤、鎮痛剤、抗増殖剤、抗真菌物質、細胞静止物質、増殖因子、ホルモン、ステロイド、非ステロイド物質、および抗ヒスタミン剤が挙げられ、これらに制限されていない。症状群の例は、鎮痛、抗増殖、抗血栓、抗炎症、抗真菌、抗生、細胞静止、免疫抑制物質と、増殖因子、ホルモン、グルココルチコイド、ステロイド、非ステロイド物質、サイレンシングとトランスフェクション用の遺伝的にまたは代謝的に活性な物質、抗体、ペプチド、受容体、配位子、およびそのいずれの薬剤として使用可能な誘導体が挙げられ、これらに制限されていない。上記群の詳しい例は、パクリタキセル、エストラジオール、シロリムス、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ドキソルビシン、イリノテカン、ゲンタマイシン、ジクロキサシリン、キニーネ、モルヒネ、ヘパリン、ナプロキセン、プレドニゾン、デキサメタゾンである。

【0075】

１つの実施形態において、上記「活性薬物」は、以上のように記述されるポリカチオン材料である。

【0076】

１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは生体適合性がある。

【0077】

本発明に使用されるような用語「生体適合性」は、生体内の実質的に有害な反応を引き起こすことがないコーティングを説明することを意図する。

【0078】

１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは免疫調節性がある。

【0079】

ここで、「免疫調節性」とは、炎症経路を抑制することを指す。

【0080】

換言すれば、もう１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは、炎症性サイトカインの生成に抑制作用がある。

【0081】

「炎症性サイトカイン」は、主に活性化されたマクロファージにより生成され、炎症反応の上向き調節に関わる。治癒を促進し炎症を低減する抗炎症サイトカインに対比して、炎症性サイトカインは、病気を悪化させる。

【0082】

したがって、本発明における炎症性サイトカインは、マクロファージ等の免疫細胞により、特にヒト初代マクロファージ下位個体群により放出される。炎症性サイトカインは、例えば、ＴＮＦ−α、ＣＣＬ１８およびＣＤ２０６であり、これらに制限されていない。

【0083】

マクロファージの活性化は二つに分ける。初期の炎症に活発で、その長期間の存在が慢性の炎症をもたらすＭ１マクロファージ、または典型的に活性化されたマクロファージと、組織改造と治癒に重要な役割を果たすＭ２マクロファージ、または選択的に活性化されたマクロファージである。マクロファージの不平衡活性化は、顕著で長期のタイプ１（Ｍ１）の成長をもたらす。ＴＮＦ−αはＭ１特有のサイトカイン、ＣＣＬ１８とＣＤ２０６はＭ２特有のサイトカイン。

【0084】

以上に説明されたように、本発明者らは、意外と本発明の高分子電解質コーティングが殺菌活性を持つことを示す。

【0085】

したがって、１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは殺菌活性を持つ。

【0086】

ここで、「殺菌活性」とは、いずれの有害生物を殺す、抑止、無害化する、あるいはそれに防除効果を及ぼすことを指す。ここでの 殺菌活性は、例えば抗菌活性のことを指す。

【0087】

ここで、「抗菌活性」とは、消毒活性、抗生活性、抗細菌活性、抗ウイルス性、抗真菌性、抗原虫活性および／または抗寄生虫活性、好ましくは抗細菌活性のことを指す。

【0088】

したがって、１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは、抗細菌活性および／または静菌活性を持つ。

【0089】

１つの実施形態において、抗細菌活性および／または静菌活性は、少なくとも１つの細菌にに向けられる。

【0090】

ここで、「静菌活性」とは、必ずしも細菌を殺さない条件でその生殖を抑えることを指し、換言すれば、ここで、静菌活性は、細菌の増殖を抑制することを指す。したがって、静菌活性は、例えば、少なくとも１つの細菌の増殖抑制の百分率で示すことがある。

【0091】

本発明における「少なくとも１つの細菌の増殖抑制」は、７０％以上、例えば、７５％以上、８０％以上、典型的に、８２、８４、８６、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８％以上であってもよく。

【0092】

したがって、１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングでは、少なくとも１つの細菌の増殖抑制が７０％以上、より詳しくは、７５％以上、８０％以上であり、典型的に、少なくとも１つの細菌の増殖抑制が８２、８４、８６、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８％以上である。

【0093】

ここで、「少なくとも１つの 細菌」とは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の種の細菌を指す。

【0094】

１つの実施形態において、上記少なくとも１つの細菌はＥＳＫＡＰＥ病原体である。

【0095】

「ＥＳＫＡＰＥ病原体」は、世界にわたって院内感染の主な原因になり、例えば、Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１６；２０１６：２４７５０６７に説明されている。１つの実施形態において、用語「ＥＳＫＡＰＥ病原体」とは、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、バクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、およびエンテロバクター（Enterobacter）種からなる群から選ばれる細菌のことを指す。

【0096】

１つの実施形態において、上記少なくとも１つの細菌は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌であり、好ましくはグラム陽性細菌である。

【0097】

１つの実施形態において、グラム陰性菌は、緑膿菌、バクター・バウマニ、ステノトロフォモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、大腸菌（Escherichia coli）、肺炎桿菌、エンテロバクター種またはレジオネラ菌（Legionella）であり、好ましくは、大腸菌または緑膿菌である。

【0098】

１つの実施形態において、グラム陽性菌は、ブドウ球菌、ミクロコッカス（Micrococcus）またはエンテロコッカス菌である。

【0099】

「ブドウ球菌」属の細菌は、フドウ状の群れを成す固定で芽胞形成がない、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性、グラム陽性の球菌である。１８７９にＰａｓｔｅｕｒによりフルンケル膿において観察されたブドウ球菌は、急性慢性の膿瘍においてそれらを分離したＯｇｓｔｅｎ（１８８１）から名前を得る。「ブドウ球菌」属の細菌、例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌（S．epidermidis）、スタフィロコッカス・カピティス（S．capitis）、スタフィロコッカス・カプラエ（S.caprae）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（S.haemolyticus）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（S.lugdunensis）、スタフィロコッカス・シュライフェリ（S.schleiferi）、スタフィロコッカス・シミュランス（S.simulans）およびスタフィロコッカス・ワルネリ（S.warneri）は、例えば人工関節感染における異物感染の主な病原体である。

【0100】

したがって、１つの実施形態において、ブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・カピティス、スタフィロコッカス・カプラエ、スタフィロコッカス・ヘモリチカス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、スタフィロコッカス・シュライフェリ、スタフィロコッカス・シミュランスおよびスタフィロコッカス・ワルネリから選ばれ、好ましくは黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌、より好ましくは黄色ブドウ球菌である。

【0101】

「ミクロコッカス」属の細菌は、特に免疫システムに欠陥がある宿主、例えば、ＨＩＶ患者における日和見性の病原体であってもよいが、一般、腐生性または共生の生物であると考えられている。小球菌は皮膚の微生物相に正常に存在し、その属は殆ど病気と関連がない。しかし、めずらしい場合には、免疫不全の患者の死亡は、ミクロコッカス由来肺の感染から起こる。小球菌は、特に免疫抑制患者における再発性菌血症、敗血症性ショック、敗血症性関節炎、心内膜炎、髄膜炎、および空洞化肺炎を含む他の感染に関わることがある。

【0102】

１つの実施形態において、ミクロコッカスは、ミクロコッカス・ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）菌である。

【0103】

「エンテロコッカス」属の細菌は、尿路感染、菌血症、細菌性心内膜炎、憩室炎、および髄膜炎等の重大な臨床感染の原因になる。

【0104】

１つの実施形態において、エンテロコッカスは、バンコマイシン耐性のエンテロコッカス、例えば、エンテロコッカス・フェカリス(E．faecalis)またはエンテロコッカス・フェシウム(E．faecium)である。

【0105】

静菌活性または増殖抑制の百分率は、例えば、以下の「方法」というセクションにおいて説明されるような抗細菌分析に示す。このような抗細菌分析に用いられる菌株は、例えば、ミクロコッカス・ルテウスまたは黄色ブドウ球菌であってもよい。

【0106】

以上に説明されるように、１つの典型的な適用において、本発明の高分子電解質コーティングは、特にインプラントおよび医療装置に関連する院内感染を防止することを目的とする。以上の説明において、移植後の６時間において感染のリスクが特に高い。

【0107】

これにより、１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは、移植後の最初の２４時間において、例えば移植後の最初の１２時間、最初の９時間、最初の６時間において静菌活性を持つ。

【0108】

さらに紹介に説明されるように、抗細菌コーティングは適用分野が広い。したがって、１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは防汚活性を持つ。

【0109】

ここで、「汚損」または「生物汚損」は、湿潤表面上の微生物の蓄積のことを指す。

【0110】

このため、ここで、「防汚」は湿潤表面上の微生物の蓄積を抑制することを指す。

【0111】

本発明の高分子電解質コーティングは、典型的に、以下の「装置を調製する方法」というセクションにさらに説明される交互（ＬｂＬ）積層技術を使用して形成される。交互構成に基づいて、上記高分子電解質コーティングは、「多層高分子電解質（ＰＥＭ）」、「高分子電解質膜」または「高分子電解質マトリックス」とも呼ばれてもよい。

【0112】

各高分子電解質層は所定の電荷を持つ。ポリカチオン層とポリアニオン層も高分子電解質ネットワークまたは高分子電解質骨格を形成する。高分子電解質層が静電相互作用により互いに引き合う。他の引力は疎水性、ファンデルワールス、および水素結合の相互作用に基づく。

【0113】

一般に、ＬｂＬ積層において、例えば、医療装置または埋め込み型装置等の装置は、正帯電と負帯電高分子電解質の希浴溶液の間に往復して浸漬される。各回の浸漬において、少量の高分子電解質が吸着され、表面電荷が反転され、静電架橋されたポリカチオン・ポリアニオン層の漸進的な制御された積み重ねを可能にする。このようなコーティングの厚みをシングルナノメートルスケールまで制御することが可能である。

【0114】

したがって、本発明の高分子電解質コーティングは、典型的に、交互に帯電した高分子電解質層の実質的に規則の高分子電解質層を含む。

【0115】

１つの実施形態において、単一の高分子電解質層、例えば１つのポリカチオン層またはポリアニオン層は、厚みが１ｎｍ以上１０ｎｍ以下である。ポリカチオン層および／またはポリアニオン層の厚みは、コーティング条件および用いられる高分子電解質に依存する。

【0116】

１つの実施形態において、高分子電解質コーティングは、その厚みが典型的に高分子電解質コーティングの単一の高分子電解質層の厚みより実質的に大きい。１つの実施形態において、高分子電解質コーティングは、厚みが約１０以上約１０００００ｎｍ以下である。高分子電解質コーティングの厚みは、コーティング条件、高分子電解質層の数、および高分子電解質層に用いられる高分子電解質材に依存する。

【0117】

得られた高分子電解質コーティングの厚みは、例えば、共焦点顕微鏡法を使用して評価される。このため、例えば、１００μＬのＰＬＬ−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネートで標識されるポリ−Ｌ−リジン、緑色蛍光プローブ）（典型的にトリス−ＮａＣｌ緩衝液において０．５ｍｇ．ｍＬ^−１である）は、高分子電解質コーティング、例えば（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の高分子電解質コーティングのトップに堆積される。５分間およびＰＬＬ−ＦＩＴＣの全高分子電解質コーティングへの拡散の後、典型的に、トリス−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄ステップを行う。共焦点顕微鏡、例えば、２０倍の対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ社、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）を使用するＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０顕微鏡（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）でコーティングの観察を行ってもよい。

【0118】

以上に説明するように、高分子電解質コーティングは、自己組織化方式で形成されて交互（ＬｂＬ）構成を作り出す。

【0119】

ここで、「ポリカチオン層」または「ポリアニオン層」における用語「層」とは、例えば装置の表面に、例えば堆積される多くの以上に説明されるようなポリカチオンまたはポリアニオンのことを指し、前記装置が以下の「装置」というセクションに説明されるようなものであり、好ましくは医療装置または埋め込み型装置である。当業者にとっては理解できるように、本発明において、１つのポリカチオン層は同じポリカチオン材料のいくつかの層を含んでもよく、１つのポリアニオン層は同じポリアニオン材料のいくつかの層を含んでもよい。

【0120】

いくつかの実施形態において、本発明における「少なくとも１つのポリカチオン層」および／または「少なくとも１つのポリアニオン層」とは、少なくとも１、５、１０、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００層のポリカチオン層および／またはポリアニオン層のことを指す。

【0121】

いくつかの実施形態において、本発明における「少なくとも１つのポリカチオン層」および／または「少なくとも１つのポリアニオン層」とは、少なくとも１、５、１０、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０層のポリカチオン層および／またはポリアニオン層のことを指す。

【0122】

いくつかの実施形態において、「少なくとも１つのポリカチオン層」および／または「少なくとも１つのポリアニオン層」とは、１以上５００以下のポリカチオン層および／またはポリアニオン層、例えば、１以上４００以下、１以上３００以下、１以上２００以下、１以上１００以下、１以上９０以下、１以上８０以下、１以上７０以下、１以上６０以下、５以上６０以下、１０以上６０以下、２０以上６０以下、好ましくは２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０層のものを指す。

【0123】

いくつかの実施形態において、「少なくとも１つのポリカチオン層」および／または「少なくとも１つのポリアニオン層」とは、１以上１００以下のポリカチオン層および／またはポリアニオン層、例えば、１以上９０以下、１以上８０以下、１以上７０以下、１以上６０以下、１以上５０以下、１以上４０以下、１以上３５以下、１以上３０以下、例えば５以上４０以下、１０以上４０以下、１５以上４０以下、２０以上４０以下の層、好ましくは２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０層のものを指す。

【0124】

ある実施形態において、ポリカチオン層の数とポリアニオン層の数が同じである。

【0125】

ある実施形態において、ポリカチオン層とポリアニオン層は、交互層、特に交互に帯電した高分子電解質層である。

【0126】

したがって、１つの実施形態において、高分子電解質コーティングは、１以上６０以下のポリカチオン層および／または１以上６０以下のポリアニオンを含む。

【0127】

特定の実施形態において、高分子電解質コーティングは、１８以上６０以下のポリカチオン層および／または１８以上６０以下のポリアニオン層を含み、より好ましくは、高分子電解質コーティングは、１８以上５０以下のポリカチオン層および／または１８以上５０以下のポリアニオン層を含む。

【0128】

特定の実施形態において、高分子電解質コーティングは、１８以上６０以下のポリカチオン層および／または１８以上６０以下のポリアニオン層を含み、より好ましくは、高分子電解質コーティングは、１８以上４０以下のポリカチオン層および／または１８以上４０以下のポリアニオン層を含む。

【0129】

１つの実施例において、以下にさらに説明されるように、１つのポリカチオン層で物体の表面を被覆して、物体を洗濯し１つのポリカチオン層で再び被覆することが可能になる。いくつかのポリカチオン層を含む所定の厚みの１つのポリカチオン層を得るために、これらのステップを数回繰り返すことができる。当業者にとって理解できるように、この方法を使用していくかつのポリアニオン層を含むある厚みの１つのポリアニオン層を得ることもできる。

【0130】

１つの実施例において、高分子電解質コーティング は、２４層の３０個のアルギニン残基（ＰＡＲ３０）を有するポリアルギニンと２４層のＨＡを含み、よって、ここで、前記コーティングが（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４と呼ばれる。同じ実施例において、第一層がＰＡＲ３０を含むポリカチオン層であり、続いて第一層のポリアニオンＨＡがあり、続いてＰＡＲ３０を含む第二のポリカチオン層があり、続いてＨＡを含む第二のポリアニオン層がある。２４層目のＰＡＲ３０を含むポリカチオン層と２４層目のＨＡを含むポリアニオン層までそれらの層を交互積層する。

【0131】

他の実施例において、高分子電解質コーティングは、４８層の３０個のアルギニン残基（ＰＡＲ３０）を有するポリアルギニンと２４層のＨＡを含み、よって、ここで、前記コーティングが（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_４８と呼ばれる。同じ実施例において、第一層がＰＡＲ３０を含むポリカチオン層であり、続いて第一層のポリアニオンＨＡがあり、続いてＰＡＲ３０を含む第二のポリカチオン層があり、続いてＨＡを含む第二のポリアニオン層がある。４８層目のＰＡＲ３０を含むポリカチオン層と４８層目のＨＡを含むポリアニオン層までそれらの層を交互積層する。

【0132】

本発明のもう１つの態様において、高分子電解質コーティングは、例えば、物体の表面でポリアニオン層から始め、ポリアニオン層で終えてもよく、この場合に、ポリカチオン層とポリアニオン層の数が異なる。好ましくは、高分子電解質コーティングは、物体の表面が正帯電である場合に、ポリアニオン層から始める。

【0133】

本発明の他の様態において、高分子電解質コーティングは、例えば、物体の表面でポリカチオン層から始め、ポリカチオン層で終えてもよく、この場合に、ポリカチオン層とポリアニオン層の数も異なる。したがって、ある実施形態において、ポリカチオン層の数とポリアニオン層の数が異なる。好ましくは、高分子電解質コーティングは、物体の表面が負帯電である場合に、ポリカチオン層から始める。

【0134】

１つの実施例において、高分子電解質コーティングは、２５層の３０個のアルギニン残基を有するポリアルギニンと２４層のＨＡを含み、よって、前記コーティングが（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０と呼ばれる。

【0135】

ある実施形態において、ここに記述されるように、異なる高分子電解質層は、同じポリカチオン材料または異なるポリカチオン材料を含む。例えば、高分子電解質コーティングは、１２層の３０個のアルギニン残基を有するポリアルギニンを含む層、１２層の３０個のオルニチン残基を有するポリオルニチンを含む層、および２４層のＨＡを含む層を含んでもよい。

【0136】

本発明者らは、さらに実施例と図１において説明されるように、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を使用して、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００とＨＡを有する高分子電解質コーティングの積み重ねの積層ステップ数での正規化頻度の指数増殖を観察する。さらに、本発明者らは、積層ステップ数での厚みの指数増加が多層からなる少なくとも１つの高分子電解質の全コーティングの内外への拡散に関連することを示す。さらに、本発明者らは、図１４に示すように、退色実験を使用して、コーティングに含まれるポリカチオンポリマーが運動可能であるので全コーティング内に拡散することを示す。

【0137】

したがって、１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングは、積層ステップ数で正規化頻度のいわゆる「指数増殖」を向上する。

【0138】

もう１つの実施形態において、以上のように記述される一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位は、運動可能であり、また／あるいは高分子電解質コーティングにおいて拡散する。

【0139】

本発明者らは、少なくとも２つの逆帯電した高分子電解質層の共有結合がコーティングの静菌活性を低減することを示す。

【0140】

したがって、１つの実施形態において、少なくとも１つのポリカチオン層と少なくとも１つのポリアニオン層は共有結合されていない。

【0141】

装置
異物によるブドウ球菌性感染は、生物膜としての細菌の配列により通常の感染と異なる。

【0142】

「生物膜」は、異物に接続され、細菌細胞が粘液またはグリコカリックスと呼ばれる多糖細胞外マトリックスに埋め込まれる複雑な三次元構造である。この特定の構造は、同じ種または異なる種の細菌によって形成されてもよい。それらの自由（または「浮遊性」）形式の生きている同属種に対比して、これらの細菌は、低レベルの代謝活性で示す休止状態にある。低減された代謝のせいで、生物膜としての活性細菌は、例えば、いずれの抗細菌治療に対してより耐性がある。

【0143】

生物膜の問題は医療分野に制限されていない。生物膜は、水生と工業用水システムだけでなく数多くの環境に遍在し起こる。生物膜は、台所と浴室における便器、流し台、玩具、まな板、および調理台等の様々な家事用品の表面を広くコロニーを作ることができる。生物膜は、食品製造産業、例えば生産ラインに沿って用いられる缶または機器に起こることがある。水と汚水処理施設について、生物膜（生物汚損）も問題となる。生物膜は、金属腐食を引き起こし、製品汚染のリスクを増加させ、水質を低下させ、例えば台所と浴室における板、および調理台のための熱交換の効能を低下させる。

【0144】

したがって、抗細菌コーティングは、多くの異なる適用の装置に対して有利である。

【0145】

以上に説明されるように、本発明者らは、特に細菌を含有する溶液に接触する時最初の７２時間に、特に細菌を含有する溶液に接触する時最初の４８時間に、より好ましくは細菌を含有する溶液に接触する時最初の２４時間、最初の１２時間、最初の６時間に殺菌活性を持つ高分子電解質コーティングを開発する。そのため、本発明の高分子電解質コーティングは、細菌増殖を抑制して、細菌が本発明の高分子電解質コーティングを含む装置の表面に生物膜を形成することを防止する。

【0146】

本発明者らは、例えば、２４／４８または７２時間の培養後の、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ５０、ＰＡＲ１００およびＰＡＲ３０で構築された（ＰＡＲ／ＨＡ）２４のコーティングが細菌を完全に抑制し、３日および３つの連続汚染にわたって効率を示すことを示す。さらに、本発明者らは、本発明のコーティングの殺菌活性の期間が層数につれて増加することを発見する。したがって、本発明のコーティングの殺菌活性の期間は、用いられる層の数につれて増加する。

【0147】

さらに、本発明者らは、本発明のコーティングに対する乾燥も滅菌もコーティングの抗菌活性を変更しないことを示す。これにより、滅菌の後においても、総殺菌活性に完全に変化が計測されていない。

【0148】

したがって、当業者にとって、本発明の高分子電解質コーティングの静菌活性により、前記高分子電解質コーティングは、前記高分子電解質コーティングを含む装置を製造することに特に適していることが理解できる。

【0149】

したがって、本発明は、さらに、高分子電解質本発明のコーティングを含む装置のことを指す。

【0150】

ここで、「装置」とは、少なくとも１つの表面を含む物体である。

【0151】

１つの実施形態において、上記高分子電解質コーティングは、前記装置の少なくとも一部の表面を被覆する。

【0152】

１つの実施形態において、本発明の装置の表面は、チタン等の金属、シリコーン等のプラスチック、セラミックまたは木等の他の材料を含むか、あるいは少なくとも部分的に含む。

【0153】

もう１つの実施形態において、本発明の装置の表面は、用いられる材料によってはあらゆる構造に存在する。したがって、表面が平らな表面であってもよく、平らでない表面であってもよく、このような平らでない表面が例えば、典型的に発泡体またはファイバー等の多孔質材料の表面に存在することは、当業者にとって理解できる。いくつかの実施例において、表面は微粒子またはナノ粒子を含むか、あるいは微粒子またはナノ粒子のみからなる。

【0154】

上記装置が本発明の高分子電解質コーティングを含むので、「高分子電解質コーティング」というセクションにより詳しく記述される前記高分子電解質コーティングに関連する特性が上記装置にも見つけられることは当業者にとって理解できる。

【0155】

したがって、１つの実施形態において、本発明の装置は殺菌活性を持ち、その殺菌活性は以上の「高分子電解質コーティング」というセクションに記述されるようになる。

【0156】

本発明の１つの態様において、本発明の装置は、少なくとも１つの細菌の７０％以上の増殖抑制ができ、より詳しくは、少なくとも１つの 細菌の７５％以上、８０％以上、典型的に８２、８４、８６、８８、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８％以上の増殖抑制ができる。少なくとも１つの 細菌の増殖抑制百分率は、以上の「高分子電解質コーティング」というセクションに記述されるようになる。

【0157】

もう１つの実施形態において、本発明の装置は、移植後の最初の７２時間に、例えば、移植後の最初の４８時間、２４時間、１２時間、最初の９時間、および最初の６時間において静菌活性を持つ。

【0158】

好ましい実施形態において、本発明の装置は、移植後の最初の２４時間に、例えば、移植後の最初の１２時間、最初の９時間、および最初の６時間において静菌活性を持つ。

【0159】

さらに、１つの実施形態において、本発明の装置は防汚活性を持つ。もう１つの実施形態において、本発明の装置は抗細菌活性および／または静菌活性を持つ。

【0160】

したがって、１つの実施形態において、本発明の高分子電解質コーティングを含む装置は静菌装置および／または防汚装置である。静菌は以上の「高分子電解質コーティング」というセクションに記述されるようになる。

【0161】

本発明の高分子電解質コーティングおよび本発明の装置は、コーティングおよびその特性への有害な影響がなくて簡単に滅菌され貯蔵されることができる。

【0162】

さらに、本発明の高分子電解質コーティングの静菌活性により、前記高分子電解質コーティングが、１つの実施形態において、特に医療装置、好ましくは埋め込み型装置を製造するのに適していることは、当業者にとって理解できる。

【0163】

ここで、「医療装置」とは、例えば、以下に記述されるような人における、疾患の診断または他の条件、あるいは疾患の治療、軽減、または防止での使用に向け、あるいは人体の構成またはいずれの機能に作用するようと意図する部品、または付属品を含めて器具、器械、用具、機械、仕組み、インプラント、体外試薬、あるいは他の同様なまたは関連する品物のことを指し、その医療装置は、人間または他の動物の体への化学作用を介して意図される主な目的のいずれかを達成することがなく、代謝されることに依存して意図される主な目的のいずれかを達成することもない。１つの実施例において、医療装置は、創傷治癒に用いられる装置、例えば、粘着性帯またはドレッシング等の包帯のことを指す。もう１つの実施例において、医療装置は衛生品物のことを指す。

【0164】

ここで、医療装置は、人への使用に向かうことになってもよい。

【0165】

用語「人」、「患者」または「対象」とは、雄、雌、成体および幼体を含めて人間または人間でない哺乳動物、好ましくはマウス、ネコ、イヌ、サル、ウマ、ウシ（すなわち、雌牛、ヒツジ、ヤギ、水牛）のことを指す。

【0166】

したがって、１つの実施形態において、本発明における医療装置は医療器具であってもよい。

【0167】

１つの実施形態において、医療器具は、打診槌、打診板、温度計、異物検出器、聴診器、耳鏡、鉗子、オトスコープ、またはそれらのいずれの付属品、探針、開創器、スカルポル、外科用ハサミ、骨用器具、鋭匙、縫合針および創傷クリップからなる群から選択すればよい。

【0168】

１つの実施形態において、上記医療装置は埋め込み型装置である。

【0169】

本発明の「埋め込み型装置」とは、人体に設置されて特別な目的または特別な機能を果たす設備または機構のことを指す。

【0170】

本発明において、埋め込み型装置は、例えば、人工装置であってもよいし、例えば、埋め込まれて薬物、栄養素または酸素を送達し、体の機能を監視し、また、臓器および組織を支持する装置であってもよい。埋め込み型装置は、永久に設置されてもよいし、必要がない場合に除去されてもよい。例えば、ステントまたは股関節インプラントは永久になるつもりである。しかし、骨折を治療する化学療法のポートまたはスクリューは、必要がない場合に除去されることができる。

【0171】

１つの実施形態において、埋め込み型装置は、カテーテル、動静脈シャント、乳房植込み、心臓および他のモニター、人工内耳、除細動器、歯科インプラント、顎顔面インプラント、中耳インプラント、神経刺激装置、整形外科装置、ペースメーカーおよびリード、陰茎インプラント、人工装置、置換関節、脊椎インプラント、人工喉頭、人工心臓、コンタクトレンズ、骨折固定装置、輸液ポンプ、頭蓋内圧装置、眼内レンズ、子宮内装置、人工関節、人工弁、整形外科装置、縫合材料、泌尿ステント、血管補助装置、血管移植片、血管シャントと血管ステント、および永久または一過性の人工血管からなる群から選択される。

【0172】

好ましい実施形態において、埋め込み型装置は、カテーテル、除細動器、人工装置、人工弁、置換関節、整形外科装置、ペースメーカー、血管移植片、血管 シャント、血管ステントおよび子宮内装置からなる群、好ましくはカテーテル、整形外科装置、ペースメーカーおよび人工装置からなる群から選択される。

【0173】

ここで、「カテーテル」とは、診断または治療の目的、液体および薬物のために管、血管、通路、または体腔に挿入する管状医療装置のことを指し、このカテーテルは、尿または腹水等の体液の排出、血管形成、血管造影、およびカテーテル切除、酸素、揮発性麻酔剤等の気体の投与と、血液透析にも用いられる。

【0174】

「シャント」は、典型的には、血液の流れをある部分から別の部分へ変える狭い金属またはプラスチック管である。

【0175】

「ステント」は、典型的には、動脈または胆管としての解剖学的血管の内腔に挿入されて、特に閉塞された通路を開いたままにする網としての短く狭い金属またはプラスチック管のことを指す。

【0176】

「人工弁」は、例えば人工心臓弁である。

【0177】

本発明の装置を調製する方法
本発明は、さらに、本発明の方法として、ここに言及される本発明の装置を調製する方法に関する。

【0178】

本発明の装置は、以上に説明されるように異なる材料を含んでもよく、よって、高分子電解質コーティングで被覆される装置の少なくとも１つの表面は、以上に説明されるように異なる材料を含んでもよい。前記材料の表面電荷が異なることは、当業者にとって理解できる。正帯電の表面は、例えば、アミン基系ポリマーからなる表面である。負帯電の表面は、例えば、カルボキシル基系ポリマーからなる表面である。さらに、正帯電の表面は、まずポリアニオン層で、そして、ポリカチオン層で被覆されるが、負帯電表面は、まずポリカチオン層で、そして、ポリアニオン層で被覆されることは、当業者にとって理解できる。この２つの連続的な積層ステップは、必要な限りに繰り返されてもよい。

【0179】

１つの実施例において、本発明の装置は、例えば、ドイツのベルリンにあるＲｉｅｇｌｅｒ＆Ｋｉｒｓｔｅｉｎ ＧｍｂＨ社の自動浸漬ロボット等の自動浸漬ロボットを使用して、２４層のＰＡＲ／ＨＡ（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の二重層を例えばＳｉ０_２表面に積層することにより調製される。したがって、典型的には、装置の表面は、まず、例えば、２％のＨｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）ＩＩ 溶液、Ｈ_２０、およびエタノールにより洗濯され、そして、気流により乾燥される。ＰＡＲとＨＡ等の高分子電解質の溶液は、例えば、典型的に０．５ｍｇ．ｍＬ^−１のＰＡＲとＨＡを、典型的に１５０ｍＭのＮａＣｌと、例えば、典型的にｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）・アミノメタン（ＴＲＩＳ、ドイツのＭｅｒｃｋ社製）を含有する滅菌された緩衝液に溶解することにより調製される。装置の表面は、各ステップの間に、選択的にポリカチオン溶液とポリアニオン溶液に浸漬され、十分にＮａＣｌ・Ｔｒｉｓ 緩衝液に洗われる。調製の後に、典型的には、気流によりコーティングを乾燥し、ＮａＣｌ・Ｔｒｉｓ緩衝液に沈み、使用するまで４℃で貯蔵する。

【0180】

ここで、ステップｂ１）ｉ）およびｉｉ）またはｂ２）ｉｉ）およびｉ）における「前記装置の表面に少なくとも１つのポリカチオン層を積層する」および「前記装置の表面になくとも１つのポリアニオン層を積層する」という表現は、ステップｂ１）ｉ）またはｂ２ ｉ）の場合に前記装置の表面にポリカチオン溶液を接触させること、あるいはステップｂ１）ｉｉ）またはｂ２ ｉｉ）の場合に前記装置の表面にポリアニオン溶液を接触させることを指す。

【0181】

ここで、「前記装置の表面」とは、少なくとも１つの表面のことを指し、前記少なくとも１つの表面が部分的に本発明の高分子電解質コーティングにより被覆されてもよい。好ましくは、前記少なくとも１つの表面は１つの表面である。

【0182】

ここで、「ポリカチオン溶液」または「ポリアニオン溶液」とは、以上に「高分子電解質コーティング」とういセクションに記述されるような、ポリカチオン材料またはポリアニオン材料を含む溶液である。本発明において、典型的には、「ポリカチオン溶液」および「ポリアニオン溶液」は、高分子電解質溶液とも呼ばれることがある。

【0183】

ここに使用される「接触」とは、典型的には、噴霧する、浸す、浸漬するまたは注ぐことを指す。

【0184】

したがって、１つの実施形態において、「ステップ（ｂ１）および／または（ｂ２）に応じて高分子電解質層を積層する」ために、高分子電解質溶液は、例えば、高分子電解質コーティングが形成される装置の表面に噴霧されてもよい。

【0185】

その代わりに、いるいはそれとともに、前記装置の表面を高分子電解質溶液に浸すか浸漬してもよいし、高分子電解質溶液を基板の表面に注いでもよい。

【0186】

したがって、１つの実施形態において、少なくとも１つのポリカチオン層は、前記装置の表面に以上のように記述される一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位を含むポリカチオン溶液を接触させることにより、ステップｂ１）ｉ）において装置の表面に積層される。

【0187】

したがって、１つの実施形態において、少なくとも１つのポリアニオン層は、前記装置の表面にＨＡを含むポリアニオン溶液を接触させることにより、ステップｂ１）ｉｉ）において装置の表面に積層される。

【0188】

必要に応じて、ステップｂ１）および／またはｂ２）を繰り返して、以上に「高分子電解質コーティング」というセクションに記述されるような数の高分子電解質層、特に交互のポリカチオン層とポリアニオン層を有する高分子電解質コーティングを含む装置を得ることは、当業者にとっては理解できる。高分子電解質の積層がｐＨから影響を受けることは、当業者にとっては明らかである。

【0189】

したがって、１つの実施形態において、本発明における前記「ポリカチオン溶液」および／または「ポリアニオン溶液」は、さらに緩衝液を含んでもよい。

【0190】

「緩衝液」は、弱酸とその共役塩基または弱塩基とその共役酸の混合物からなる水性溶液である。緩衝液は、少量の強酸または塩基が添加される場合に、そのｐＨが殆ど変化しないので、溶液のｐＨの変化を防止するのに用いられる。緩衝液溶液は、広い化学的応用においてｐＨをほぼ一定の値に保持する手段として用いられる。本発明に用いられる緩衝液は、例えば、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）またはＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）であってもよい。

【0191】

１つの実施形態において、本発明における前記「ポリカチオン溶液」および／または「ポリアニオン溶液」は、４以上９以下、好ましくは４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９のｐＨを有し、典型的に、５以上８以下、５．５以上８以下、６以上８以下、６．５以上８以下、７以上８以下、好ましくは７以上８以下、特に７、７．２、７．４、７．６、７．８、８、例えば７．４のｐＨを有する。

【0192】

高分子電解質の積層は、帯電した高分子電解質と高分子電解質が積層される帯電した表面との間の相互作用、および帯電した高分子電解質同士の相互作用から影響を受けることは、当業者にとってさらに明らかである。それらの相互作用は、少なくとも部分的に溶液のイオン強度により制御される。

【0193】

このため、いくつかの実施形態において、本発明の方法のステップ（ｂ１）または（ｂ２）に用いられる高分子電解質溶液のイオン強度は、ある実施形態において調整されて積層される高分子電解質の量を増加する。

【0194】

したがって、１つの実施形態において、本発明における前記「ポリカチオン溶液」および／または「ポリアニオン溶液」はさらにイオンを含んでもよい。

【0195】

「イオン」は、電子の総数とプロトンの総数とは等しくなく、正味の正（カチオン）電荷または負（アニオン）電荷を持つことになる原子または分子のことである。単一の原子からなるイオンは、原子イオンまたは単原子イオンであり、２つ以上の原子からなるイオンは、分子イオンまたは多原子イオンである。持つ電荷に基づいてさらにイオンを分ける。このため、イオンは、一価、二価または多価イオンであってもよい。イオンは、Ｆ⁻、Ｃｌ⁻、Ｉ⁻、ＮＨ_４^＋、Ｓ０_４^２＋、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｎａ^＋であってもよく、これに制限されていない。

【0196】

典型的に、イオンは、以上に記述されるような緩衝液として添加されてもよいし、例えばＮａＣｌ等の塩として添加されてもよい。

【0197】

例えば、ＰＡＲとＨＡ等の高分子電解質の溶液は、例えば、典型的に０．５ｍｇ．ｍＬ^−１のＰＡＲとＨＡを、典型的に１５０ｍＭのＮａＣｌと、例えば、典型的にｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）・アミノメタン（ＴＲＩＳ、ドイツのＭｅｒｃｋ社製）を含有する滅菌された緩衝液に溶解することにより調製される。

【0198】

高分子電解質層の積層の間に、高分子電解質のない溶液において少なくとも１つの洗濯または洗浄ステップを行って組み立てられていない高分子電解質材料を除去することができる。

【0199】

したがって、１つの実施形態において、本発明の方法は、さらに、ｂ１）またはｂ２）のステップｉ）および／またはｉｉ）の後に、少なくとも１つの洗濯ステップを含む。

【0200】

１つの実施形態において、洗濯のために、高分子電解質がない溶液を使用してもよい。前記溶液は、水または当業者にとって適切ないずれの別の溶液であってもよい。１つの実施形態において、例えばＮａＣｌ・Ｔｒｉｓ緩衝液等の緩衝液を使用して洗濯を行う。１つの実施例において、前記ＮａＣｌ・Ｔｒｉｓ緩衝液は、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭのＴｒｉｓを含み、ｐＨ７．４である。

【0201】

その代わりに、あるいはそれに加えて、１つの実施形態において、１つ以上の乾燥ステップを行ってもよい。

【0202】

したがって、１つの実施形態において、本発明の方法は、請求項のｂ１）またはｂ２）のステップｉ）および／またはｉｉ）、および／または洗濯ステップの後に、さらに少なくとも１つの乾燥ステップを含む。

【0203】

「乾燥」は当業者に知られるいかなる方法で行われてもよく、例えば、空気加熱、自然空気乾燥、誘電乾燥、気流、好ましくは気流のことである。１つの実施例において、気流は、窒素ガスによるパージのことを指す。

【0204】

１つの実施形態において、乾燥が結合側または下層の高分子電解質層の電荷の部分的な露出を引き起こすことがあるので、乾燥ステップの後に、乾燥ステップの直前に用いられる同じ高分子電解質溶液を再び表面に積層してもよい。このため、前記乾燥ステップは中間乾燥ステップとも呼ばれる。このような順序を利用することにより、特定の高分子電解質のロードをさらに増加することができる。

【0205】

したがって、１つの実施形態において、本発明の方法はさらに少なくとも１つの乾燥ステップを含む場合に、先のｂ１）またはｂ２）のステップｉ）またはｉｉ）および／または洗濯ステップを繰り返してもよい。

【0206】

典型的に、高分子電解質溶液を表面に接触させ、そして、例えば、窒素ガスによるパージによって所定の時間、例えば、１０から６０秒でその表面を乾燥することを可能にする。この結果、同じ高分子電解質溶液を再び表面に接触させる。

【0207】

ある実施形態において、２つの連続する積層ステップの間に少なくとも１つの洗濯および／または乾燥ステップを行う。

【0208】

本発明者らは、少なくとも２つの逆帯電した高分子電解質層の共有結合がコーティングの静菌活性を低減することを示す。

【0209】

したがって、１つの実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つのポリカチオン層と少なくとも１つのポリアニオン層を共有結合するステップを含まない。

【0210】

１つの実施形態において、本発明の方法は、以上に記述されるような方法のステップ（ａ）および（ｂ１）または（ｂ２）で得られた高分子電解質コーティングをさらに活性薬物で浸すステップ（c）をさらに含む。薬物は以上の「高分子電解質コーティング」というセクションに記述されるようになる。

【0211】

１つの特定の実施形態において、装置を調製する方法は、埋め込み型装置を調製する方法である。

【0212】

したがって、１つの実施形態において、本発明は、高分子電解質コーティングを含む埋め込み型装置を調製する方法であって、この方法は、
（ａ）埋め込み型装置を提供すること、
（ｂ１）前記埋め込み型装置の表面に、
（ｉ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位を含む少なくとも１つのポリカチオンからなる少なくとも１つのポリカチオン層

【化7】

（式中、
ｎは１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、そして
ｉｉ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン層、を積層すること、または
（ｂ２）前記埋め込み型装置の表面に以上のように記述されるｉｉ）、そしてｉ）を積層すること、および
ステップｂ１）および／またはｂ２）を任意に繰り返すことを含む。

【0213】

したがって、特定の実施形態において、本発明は、高分子電解質コーティングを含む埋め込み型装置を調製する方法であって、この方法は、
（ａ）埋め込み型装置を提供すること、
（ｂ１）前記埋め込み型装置の表面に、
（ｉ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオン層

【化8】

（式中、
ｎは１１以上１００以下の整数であり、
Ｒは、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、そして
ｉｉ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン層、を積層すること、または
（ｂ２）前記埋め込み型装置の表面に以上のように記述されるｉｉ）、そしてｉ）を積層すること、および
任意にステップｂ１）および／またはｂ２）を繰り返すことを含む。

【0214】

「装置」というセクションに説明されるように、本発明の装置の表面は、チタン等の金属、シリコーン等のプラスチック、セラミックまたは木等の他の材料を含むか、あるいは少なくとも部分的に含む。これらの表面は帯電してもよく、例えば、正帯電または負帯電する。この結果、例えば負帯電した表面を含む装置をまずカチオン層で被覆しればよいことは、当業者にとって理解すべきである

【0215】

いくつかの実施形態において、装置は埋め込み型装置を調製する方法に先立って表面処理を受けて帯電する表面を得ることがある。

【0216】

したがって、ステップａ）に提供される装置の表面は、帯電、例えば正帯電または負帯電することがあり、上記表面が以上の「装置」というセクションに記述されるようになる。

【0217】

選択的に、いつくかの実施形態において、埋め込み型装置を調製する方法は、前記埋め込み型装置の表面に帯電させるステップ（ａ２）を含んでもよい。

【0218】

装置の表面に帯電させる方法は当業者に知られている。このような方法は、イオン吸着、プロトン化／脱プロトン、および外部電場を加えることを含む。なお、例えば、装置が液体に設置される場合に、表面電荷が実際にいつも装置の表面に存在することは当業者に知られている。多くの液体は、正イオン（カチオン）および負イオン（アニオン）というイオンを含有する。これらのイオンは、装置表面と相互に作用する。この相互作用は、表面へのいくつかのイオンの吸着を引き起こすことがある。吸着されるカチオンの数が吸着されるアニオンの数より大きい時、表面が正味の正電荷を持つが、吸着されるアニオンの数が吸着されるカチオンの数より大きい時、表面が正味の負電荷を持つ。

【0219】

使用
１つの実施形態において、本発明は、本発明の装置、特に防汚装置および／または静菌装置を製造するための本発明の高分子電解質コーティングの使用に関する。

【0220】

もう１つの実施形態において、本発明は、医療装置または埋め込み型装置を製造するための本発明の高分子電解質コーティングの使用に関する。

【0221】

キット
さらに、本発明は、
ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオン材料

【化9】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒ基はそれぞれ、同じでも異なっていてもよく、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
ｂ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン材料、を含むキットを提供する。

【0222】

特に、本発明は、
ａ）一般式（１）を有するｎ個の繰り返し単位からなる少なくとも１つのポリカチオン材料

【化10】

（式中、
ｎは、１１以上１００以下の整数であり、
Ｒは、−ＮＨ_２、−ＣＨ_２−ＮＨ_２および−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ）−ＮＨ_２から選択される）、および
ｂ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン材料、を含むキットをさらに提供する。

【0223】

１つの実施形態において、キットは、さらに、ポリカチオンとポリアニオン材料の使用に関連する指示を含む。これらの指示は、例えば、以上に記述されるように埋め込み型装置を調製する方法を説明してもよい。

【0224】

「ｎ」、「Ｒ」および「一般式（１）を有する繰り返し単位」は、以上に「高分子電解質コーティング」というセクションに記述されるようになる。

【0225】

ここで、「少なくとも１つのポリカチオン材料」または「少なくとも１つのポリアニオン材料」における「少なくとも」の表現とは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８つのポリカチオン材料のことを指す。

【0226】

１つの実施形態において、キットは、
ａ）１１以上９５以下、１５以上９５以下、１５以上９０以下、１５以上８５以下、１５以上８０以下、１５以上７５以下、２０以上９５以下、２０以上９０以下、２０以上８５以下、２０以上８０以下、２０以上７５以下、２５以上９５以下、２５以上９０以下、２５以上８５以下、２５以上８０以下、２５以上７５以下、２８以上７４以下、２８以上７２以下、３０以上７０以下のアルギニン残基を有するポリアルギニン、好ましくはポリ−Ｌ−アルギニン、より好ましくは、３０個のＬ−アルギニン残基、５０個のＬ−アルギニン残基、または７０個のＬ−アルギニン残基を有するポリ−Ｌ−アルギニンからなる少なくとも１つのポリカチオン材料、および／または
ｂ）１１以上９９以下、好ましくは１１以上９５以下、１５以上９０以下、２０以上８５以下、２０以上８０以下、２５以上７５以下、２５以上７０以下、２５以上６５以下、２５以上６０以下、２５以上５５以下、２５以上５０以下、２５以上４０以下、２５以上３５以下のアルギニン残基を有するポリリジン、好ましくはポリ−Ｌ−リジン、より好ましくは３０個のＬ−リジン残基を有するポリ−Ｌ−リジンからなる少なくとも１つのポリカチオン材料、および／または
ｃ）１１以上１５０以下のオルニチン残基、好ましくは１１以上１４０以下、１１以上１３０以下、１１以上１２０以下、１１以上１２０以下、１５以上１１０以下、１５以上１００以下、１５以上９５以下、１５以上９０以下、１５以上８０以下、１５以上７５以下、２０以上７０以下、１０以上６５以下、２０以上５５以下、２０以上５０以下、２０以上４５以下のオルニチン残基を有するポリオルニチン、好ましくはポリ−Ｌ−オルニチン、より好ましくは３０個の−リジン残基を有するポリ−Ｌ−オルニチンからなる少なくとも１つのポリカチオン材料、および
ｄ）ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン材料、を含む。

【0227】

１つの実施形態において、キットは、
ａ）１５以上４５以下のアルギニン残基を有するポリアルギニン、好ましくはポリ−Ｌ−アルギニン、より好ましくは３０個のＬ−アルギニン残基を有するポリ−Ｌ−アルギニンからなるポリカチオン材料、および／または
ｂ）１５以上４５以下のリジン残基を有するポリリジン、好ましくはポリ−Ｌ−リジン、より好ましくは３０個のＬ−リジン残基を有するポリ−Ｌ−リジンからなるポリカチオン材料、および／または
ｃ）１５以上１２０以下のオルニチン残基を有するポリオルニチン、好ましくはポリ−Ｌ−オルニチン、より好ましくは３０個のＬ−リジン残基を有するポリ−Ｌ−オルニチンからなるポリカチオン材料、および
ヒアルロン酸からなる少なくとも１つのポリアニオン材料、を含む。

【0228】

治療方法および使用
生物膜の形成と関連する異物へのブドウ球菌性感染等の感染は、それらを通常の組織感染と完全に区別する多くの特徴を有する。これらの感染は、少菌型（少ない細菌を有する）で 容易に多菌性のものになることが多い。それらの細菌は、細菌を休眠に近い状態に保持する遅い代謝を有し、それらの細菌が発現する遺伝子は浮遊性形式で活性化されるものと異なる。細菌の休眠状態および生物膜の存在は、感染部位の炎症反応および免疫細胞の誘致を著しく減少する。そのため、近年、これらの細菌は、抗生物質の作用から広く保護されている。したがって、例えば移植の後の、特に人体における前記生物膜の形成を防止することが重要である。

【0229】

本発明における高分子電解質コーティングまたは埋め込み型装置は、特に移植後の最初の７２時間、特に移植後の最初の４８時間、より好ましくは移植後の最初の２４時間、最初の１２時間、最初の６時間において殺菌活性を有する。このため、本発明における高分子電解質コーティングまたは埋め込み型装置は、細菌の増殖を抑制し、それらの細菌が前記コーティングまたは埋め込み型装置の表面に生物膜を形成することを防止して、細菌感染を防止する。

【0230】

したがって、１つの実施形態において、本発明は、以上に記述されるような埋め込み型装置を提供するステップと、前記埋め込み型装置を人に埋め込むステップを含む埋め込み型装置の移植を受ける人における細菌感染を防止する方法のことを指し、前記埋め込み型装置は細菌感染を防止する。

【0231】

１つの実施形態において、本発明の方法によれば、埋め込み型装置を提供することは、埋め込み型装置を調製することを指す。

【0232】

人は、以上に「装置」というセクションに記述されるようになる。

【0233】

１つの実施形態において、細菌感染は院内感染である。

【0234】

ここで、ＨＡＩとも呼ばれる「院内感染」は、医療施設の環境または職員から得られる感染である。感染は、多くの手段、特に埋め込み型装置により、臨床状況がある感染しやすい患者に広がる。「院内感染」に関わるグラム陽性菌は、例えば黄色ブドウ球菌がある。「院内感染」に関わるグラム陰性菌は、例えば、緑膿菌、バクター・バウマニ、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、大腸菌、レジオネラがある。

【0235】

したがって、１つの実施形態において、院内感染は、以上に「高分子電解質コーティング」というセクションに記述されるような少なくとも１つの細菌から引き起こる感染である。

【0236】

「装置」というセクションにさらに説明するように、生物膜としての細菌感染は通常の感染と異なる。

【0237】

したがって、１つの実施形態において、細菌感染は生物膜感染である。

【0238】

ここで、「生物膜感染」とは、生物膜形成の細菌による細菌感染である。生物膜形成の細菌は、例えば、ブドウ球菌等のグラム陽性菌と、大腸菌や、緑膿菌等のグラム陰性種であり、これに制限されていない。

【0239】

以上の実施形態のいずれの組み合わせは、本発明の一部である。

【0240】

インスタント適用にわたって、用語「含む」は、明確に説明される特性と、任意的な、付加的な、不特定の特性をすべて包含することとして解釈される。ここに使用されるように、用語「含む」の使用は、明確に説明される特性以外の特性が存在しない（すなわち、「からなる」）実施形態も開示する。さらに、「１つ」という表現は、複数のものである場合を除外しない。ある方策が互いに異なる従属クレームに記載されている事実だけは、これらの方策の組み合わせを有利に使用できないことを示さない。

【0241】

以下の実施例を参照しながら、本発明をより詳しく説明する。ここに援用されるすべての文献と特許は、参照によりここに組み込まれる。以上の説明において本発明を具体的に例示し説明するが、実施例は、例示性または代表的なものだけであり、本発明の範囲を制限する意図がない。

【実施例】

【0242】

１．実施例１
１．１材料
以下の高分子電解質により、高分子電解質多層コーティングを積み重ねる。ポリ（Ｌ−アルギニン塩酸塩）（ＰＡＲ）を米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から購入した。用いられる異なるＰＡＲポリマーは、鎖あたりのアルギニンの数が異なり、それぞれがＰＡＲ１０（１０個のアルギニン（Ｒ）、Ｍｗ＝２．１ｋＤａ、ＰＤＩ＝１）、ＰＡＲ３０（３０個のＲ、Ｍｗ＝６．４ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０１）、ＰＡＲ１００（１００個のＲ、Ｍｗ＝２０．６ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０５）、およびＰＡＲ２００（２００個のＲ、Ｍｗ＝４０．８ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０６）である。米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社からポリ（Ｌ−オルニチン塩酸塩）（ＰＬＯ）を購入した。用いられる異なるＰＬＯポリマーは、鎖あたりのオルニチンの数が異なり、それぞれがＰＬＯ３０（３０個のＲ、Ｍｗ＝５．９ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０３）、ＰＬＯ１００（１００個のＲ、Ｍｗ＝１８．５ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０３）、およびＰＬＯ２５０（２５０個のＲ、Ｍｗ＝４４．７ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０２）である。ＰＬＬ３０（３０個のＲ、Ｍｗ＝５．４ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０２）等のポリ（Ｌ−リジン塩酸塩）（ＰＬＬ）は、米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から購入される。

【0243】

ポリアニオンとして用いられるヒアルロン酸（ＨＡ、Ｍｗ＝ １５０ ｋＤａ）は、米国のＬｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄ社から得られる。

【0244】

１．２方法
多層コーティングの積み重ねの監視：原位置の水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ−Ｄ、Ｅ１、Ｑ−Ｓｅｎｓｅ、スウェーデン）を使用してコーティングまたは膜の積み重ねを追跡する。水晶振動子は、その基本周波数（約５ＭＨｚ）と、三番目、五番目、七番目の倍音（それぞれ１５、２５、および３５ＭＨｚに対応するｖ＝３、ｖ＝５、ｖ＝７で示される）に励起される。この四つの周波数に共振周波数（Δｆ）の変化を計測する。Δｆ／ｖの増加は、通常、石英に結合する質量の増加に関連する。ＰＡＲ（すなわち、ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ５０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００）およびＨＡを１５０ｍＭのＮａＣｌとｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）・アミノメタン（ＴＲＩＳ、ドイツのＭｅｒｃｋ社製）を含有する滅菌された緩衝液に、０．５ｍｇ．ｍＬ^−１まで溶解する。水晶振動子を備えるＱＣＭセルに高分子電解質溶液を連続して注入し、ＰＡＲが最初に積層された高分子電解質である。８分間の吸着の後、洗浄ステップをＮａＣｌ−Ｔｒｉｓ緩衝液で５分間かけて行う。

【0245】

浸漬ロボットによる（ＰＡＲ／ＨＡ）２４の積み重ね：自動浸漬ロボット（Ｒｉｅｇｌｅｒ＆Ｋｉｒｓｔｅｉｎ ＧｍｂＨ社、ベルリン、ドイツ）を使用して２４層の二重層のＰＡＲ／ＨＡ（（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４）を構成した。スライドグラス（径が１２ｍｍ）を、まず、２％のＨｅｌｌｍａｎｅｘ（登録商標）ＩＩ溶液、Ｈ_２０、およびエタノールにより洗濯し、そして、気流により乾燥した。高分子電解質の溶液は、ＱＣＭ実験のために以上に説明されるように調製された。各ステップの間に、スライドグラスを交互的にポリカチオン溶液とポリアニオン溶液に浸漬され、十分にＮａＣｌ・Ｔｒｉｓ緩衝液に洗われる。構成された後に、コーティングを、気流により乾燥し、ＮａＣｌ・Ｔｒｉｓ緩衝液に沈み、使用するまで４℃で貯蔵する。得られたコーティングの厚みは、１００μＬのＰＬＬ−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネートで標識されるポリ−Ｌ−リジン、緑色蛍光プローブ）（トリス−ＮａＣｌ緩衝液において０．５ｍｇ．ｍＬ^−１である）のＰＡＲ／ＨＡ多層コーティングのトップへの堆積によって評価される。５分間およびＰＬＬ−ＦＩＴＣの全コーティングへの拡散の後、トリス−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄ステップを行う。共焦点顕微鏡である２０倍の対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ社、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）を使用するＺｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０顕微鏡（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）でコーティングの観察を行う。同様に、２４層の二重層のＰＬＬ／ＨＡ（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４、２４層の二重層のＰＬＯ／ＨＡ（すなわち、（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４、（ＰＬ０１００／ＨＡ）_２４ および（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４）を調製し、ＰＬＯまたはＰＬＬを、１５０ｍＭのＮａＣｌとｐＨ７．４の１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）・アミノメタン（ＴＲＩＳ、ドイツのＭｅｒｃｋ社製）を含有する滅菌された緩衝液に、０．５ｍｇ．ｍＬ^−１まで溶解する。

【0246】

抗細菌分析：
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、ＡＴＣＣ２５９２３）の菌株を使用して試験サンプルの抗細菌性を評価する。ｐＨ７．４でミューラー・ヒントン培養液（ＭＨＢ）培地（Ｍｅｒｃｋ社製、ドイツ）において、３７℃で好気的に菌株を培養。１つのコロニーを１０ｍＬのＭＨＢ培地に転送し３７℃で２０時間をかけて培養して、１０^６ＣＦＵ．ｍＬ^−１の最後の濃度を提供する。対数増殖中期に細菌を得るために、夜間培養の６２０ｎｍでの吸収を０．００１に調整する。

【0247】

ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００を有する（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４で被覆するスライドグラスを、１５分間において紫外線を使用することにより滅菌し、ＮａＣｌ−Ｔｒｉｓ緩衝液で洗濯する。洗濯の後に、各スライドグラスを３００μＬの黄色ブドウ球菌を有し、A_６２０＝０．００１である２４−ウェルプレートに積層し、２４時間において３７℃で培養する。

【0248】

陰性対照について、同様の方法を使用して、直接黄色ブドウ球菌を被覆されていないスライドグラスに培養する。

【0249】

陽性対照について、被覆されていないスライドグラスに接触する黄色ブドウ球菌溶液にテトラサイクリン（１０μｇ．ｍＬ^−１）およびセフォタキシム（０．１μｇ．ｍＬ^−１）を添加する。

【0250】

６２０ｎｍでの上清の吸収を計測して２４時間後の細菌の増殖または抑制を定量化する。

【0251】

（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４、（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４、（ＰＬ０１００／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４で被覆するスライドグラスについて同様に分析を行う。

【0252】

以上に黄色ブドウ球菌について説明する細菌性分析と同様に、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌および緑膿菌について抗細菌分析を行う。

【0253】

細菌生死分析：ＢａｃＬｉｇｈｔ^ＴＭＲｅｄｏｘＳｅｎｓｏｒ^ＴＭＣＴＣ活性キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、フランス）を使用して、表面における細菌の健康を評価する。このキットは、細菌健康と活性を評価する効果的な試薬を提供する。キットは、黄色ブドウ球菌の呼吸活性を評価するのに用いられる５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロライド（ＣＴＣ）を含む。確かに、健康な細菌は、ＣＴＣを吸収し、不溶性の赤色蛍光ホルマザン生成物に還元する。死んだ細菌または低呼吸活性の細菌は、ＣＴＣを還元しないので、赤色蛍光生成物を生成しない。最後、このキットは、健康と不健康な細菌の半定量的評価を行う。ＳＹＴＯ（登録商標）２４による緑色蛍光核酸染色（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、フランス）を使用してすべての細菌を数える。５０ｍＭのＣＴＣと０．００１ｍＭのＳｙｔｏ２４の純水における溶液を調製する。ｐＨ＝７．４（ＰＢＳ）のリン酸緩衝生理食塩水緩衝液で各スライドグラスを洗濯し、そして、２７０μＬのＰＢＳおよび３０μＬのＣＴＣ／Ｓｙｔｏ２４溶液を添加する。３７℃で、光を避けてプレトを３０分間培養する。各表面を油に浸漬して、６３倍の対物レンズを使用して共焦点顕微鏡法（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０顕微鏡、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）により観察する。染色剤の励起／発光波長について、ＣＴＣでは４５０／６３０ｎｍであり、Ｓｙｔｏ２４では、４９０／５１５ｎｍである。

【0254】

細胞傷害テスト：１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、フランス）および１％ のペニシリン ストレプトマイシン（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、フランス）により、３７℃でイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、ＡＣＣ／ＬＧＣ）においてヒト線維芽細胞（ＡＴＣＣ／ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ社からのＣＲＬ−２５２２、フランス）を培養する。２４時間において、２４ウェルプレートの各ウェルに５００００個の細胞が培養される。同時に、（ＰＡＲ／ＨＡ）２４で被覆するスライドグラスを１ｍＬの培地により６ウェルプレートに培養する。２４時間後に、細胞を含有するウェルの培地を除去して、多層に２４時間接触した上清に置換する。ヒト線維芽細胞を３７℃で２４時間培養する。そして、上清を除去して１０％のアラマーブルー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、フランス）により２時間培養する。生成されたレソフリン（励起／ 発光波長＝５６０／５９０ｎｍ）の蛍光を測定することにより細胞の生存率を確定する。ＰＢＳで細胞を二回洗濯し、ＰＦＡ４％の溶液で１０分間固定させ、再びＰＢＳで二回洗濯する。１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりＰＢＳ緩衝液においてファロイジン溶液を調製する。染色溶液を固定された細胞に室温で３０分間置き、ＰＢＳ緩衝液により二回洗濯する。以上と同じ条件で、ＤＡＰＩ溶液を調製して細胞に置く。ニコンデジタルカメラ（ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア付きＤＳ−Ｑ１１ＭＣ、ニコン、フランス）付き６３倍のＰＬ ＡＰＯ（１．４ＮＡ）対物レンズを有するＮｉｋｏｎ Ｅｌｉｐｓｅ Ｔｉ−Ｓを使用して蛍光画像を捕獲し、ＩｍａｇｅＪ（http://rsb.info.nih.gov/ij/）によりその画像を処理する。励起／発光波長について、ローダミンファロイジンでは５４０／５６５ｎｍであり、ＤＡＰＩでは３５０／４７０ｎｍである。

【0255】

経時的な顕微鏡法：紫外線を１５分間使用して（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４で被覆するスライドグラスを滅菌し、そして、ＮａＣｌ−Ｔｒｉｓ緩衝液により洗濯する。洗濯後に、３７℃で、５％のＣ０_２、１ｍＬμｌの黄色ブドウ球菌（以上に説明するように使用され、Ａ_６２０＝０．００１）があるＬｕｄｉｎ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ社、スウィツァーランド）に各スライドグラスを載せ、培養においてＳｙｔｏ２４により染色する。６０倍のＰＬ Ａｐｏ ｏｉｌ（１．４ＮＡ）対物レンズ付きニコンＴＩＥ顕微鏡により２４時間経時的な手順を行い、Ａｎｄｏｒ社のＺｙｌａ ｓＣＭＯＳカメラ（Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ株式会社、英国）をニコンのＮＩＳ-Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ａｒソフトウェア（ニコン、フランス）とともに使用する。２４時間かけて５分間ごとに位相差と蛍光 画像を取得する。ＩｍａｇｅＪにより画像を処理する。

【0256】

円偏光二色性：Ｊａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＫ）を使用して、円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、データピッチ０．１ｎｍと走査速度２０ｎｍ/分で２２℃で１８０〜３００ｎｍにおいて経路長１ｍｍのクォーツ製キュベットを使用して得られる３回の走査の平均として記録する。緩衝液スペクトルの減算によりすべてのスペクトルを修正する。各ＰＡＲについて、ＮａＣｌ−Ｔｒｉｓ緩衝液における２ｍｇ．ｍＬ^−１の濃度でスペクトルを得る。すべてのＣＤデータを平均残り楕円率として示す。

【0257】

ＰＡＲの蛍光標識：ＰＡＲ鎖を標識するために、室温でモル比１：２のＰＡＲ／ＦＩＴＣで３時間かけて、フルオレセインチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、フランス）によりＰＡＲ（１００ｍＭのｐＨ８．３のＮａＨＣ０_３緩衝液において１５ｍｇ．ｍＬ^−１である）を培養する。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ透析カセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ、米国）により４℃で１Ｌの水に対してこの溶液を透析し、カットオフ＝３５００ＭＷＣＯである。そして、ＰＡＲ−ＦＩＴＣが生成され２ｍＬの分割量（ＮａＣｌ−Ｔｒｉｓ緩衝液において０．５ｍｇ．ｍＬ^−１である）で貯蔵される。

【0258】

放出実験：一回目の実験について、ＰＡＲ−ＦＩＴＣを使用して多層コーティング（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４を形成する。ＭＨＢ培地または黄色ブドウ球菌／ＭＨＢ溶液（Ａ_６２０＝０．００１）の存在で、放出 実験を３７℃で２４時間かけて行う。監視中の蒸発を防止するため、上清のトップに３００μＬの鉱油を添加する。４８８／５１７ｎｍの励起／発光波長で、蛍光分光計（ＳＡＦＡＳ Ｇｅｎｉｕｓ ＸＣ蛍光分光計、Ｍｏｎａｃｏ）により経時的に上清の蛍光を測定することにより、溶液へのＰＡＲ−ＦＩＴＣの放出を行う。各条件で三つのサンプルを研究する。

【0259】

二回目の実験について、Ａ）３００μＬの黄色ブドウ球菌溶液Ａ６２０＝０．００１およびＢ）３００μＬのＭＨＢのみでの２つの条件で、３７℃で多層膜（ＰＡＲ３０／ＨＡ）２４を培養する。２４時間後に、ＬｂＬに接触する上清を取り新しい黄色ブドウ球菌溶液で培養して最後にＡ６２０＝０．００１にする。３７℃で２４時間後に、６２０ｎｍでの吸収を測定する。各条件で三つのサンプルを研究する。

【0260】

光退色（FRAP）後の蛍光回復の実験：光退色実験（ＦＲＡＰ、光退色後の蛍光回復）を行うことによって、ＰＡＲ−ＦＩＴＣを含有する（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４多層の拡散係数Ｄ、および運動分子比率ｐを測定する。

【0261】

多層で被覆するスライドグラスを自製のサンプルホルダーに導入し、２００μＬのＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液に浸漬する。１つの円形領域（半径が４．４μｍであり、３５μｍ×３５μｍの画像において「Ｒ４」と呼ばれるか、半径が１０．６μｍであり、８５μｍ×８５μｍの画像において「Ｒ１０」と呼ばれる）を最大出力（λ＝４８８ｎｍ）に設置するレーザー光に７００ミリ秒暴露する。そして、退色領域での蛍光回復を経時的に観察する。２０倍の対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ、Ｐｌａｎ Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ）を使用するＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０顕微鏡（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）により観察する。

【0262】

（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の架橋：（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４膜をＮａＣｌ（０．１５Ｍ）にＥＤＣ（１００ｍＭ）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍＭ）を含有した溶液に４℃で１５時間浸すことにより架橋させる。ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）溶液で膜を２回洗う。膜をエタノールアミン溶液（１Ｍ）に４℃で４０分間浸漬して反応しないすべてのカルボキシレート官能基を中和する。ＮａＣｌ溶液で膜を洗い、ＮａＣｌ−Ｔｒｉｓ緩衝液溶液を最後の洗浄ステップに使用する。

【0263】

１．３結果
水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を使用してＰＡＲ／ＨＡコーティングの積み重ねを測定する。図１は、様々な分子量のＰＡＲ（それぞれＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００の表記に対応する１０、３０、１００または２００個の残基）について、ＱＣＭにより監視された交互積層に対応する。第１の概算において、正規化頻度の増加が積層される質量または厚みの増加（ＲＥＦ）に関連することが知られる。ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００のコーティングの積み重ねについて、積層ステップ数での正規化頻度の指数増殖が観察された。より大きいＰＡＲ鎖について最も重要な増殖が監視された。ＰＡＲ_１０の場合に、積層数での正規化頻度の増加がより弱く、しかし、指数増殖が既に観察される（図１）。最後に、このポリペプチドの短い長さにもかかわらず、交互増殖が効果的である。

【0264】

以前に、様々なＭＷのキトサンを有するキトサン／ＨＡによる多層コーティングの積み重ねについて、反対の挙動が観察された（Ｒｉｃｈｅｒｔ２００４、Ｌａｎｇｍｕｉｒ）。用いられたすべてのＭＷのキトサンについてコーティングの指数増殖が観察されたが、しかし、キトサン鎖の質量が小さい程、コーティングの積み重ねが速い。この挙動は、コーティングにおけるキトサン鎖の拡散特性に関連し、より短い鎖が一層にコーティングに拡散し、毎回の積層の後、より高い質量増加を引き起こす。しかし、本研究において、ホモポリペプチドが多糖の代わりにポリカチオンとして選択され、それらの鎖長の範囲がより小さいので、実験条件が異なる。

【0265】

そして、共焦点顕微鏡法により２４層の二重層（（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４）のコーティングを観察する。コーティングを蛍光標識するために、コーティングのトップに最後の層としてポリ（リジン）−ＦＩＴＣを加える。異なる残基数のＰＡＲで積み重ねたコーティングの断面図は、全コーティングセクションにわたって緑色標識の厚帯を描く（図２）。これは、コーティング生成物がすべての条件で表面に均一的に積層される（１０から２００個の残基を有するＰＡＲ）ことを示す。

【0266】

次に、残基数が異なるＰＡＲについて、（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４多層の抗菌性を評価する。院内感染、より詳しくはインプラント関連感染に関係あることがよく知られる菌株であるグラム陽性菌の黄色ブドウ球菌に対して膜を測定する。例えば、整形外科インプラントの場合に、表皮ブドウ球菌に伴う黄色ブドウ球菌は、７０％の感染（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ８４、２０１６、３０１）に関わる。（ＰＡＲ／ＨＡ）２４コーティングにＭＨＢ培地の存在で３７℃で黄色ブドウ球菌を２４時間培養する。細菌は、ＭＨＢ培地の存在で３７℃で表面に高濃度で２４時間培養される。病原体の正規化増殖（％）は、多層膜がある場合の６２０ｎｍでの吸収と陽性対照（多層膜がなく、培地に抗生物質がある）および陰性対照（多層膜がなく、培地に抗生物質がない）と対比することにより推定される。ＰＡＲ１０、ＰＡＲ５０、ＰＡＲ１００およびＰＡＲ２００で構成する膜について、著しい抑制が観察されていない。しかし、ＰＡＲ３０（３０個の残基）について、２４時間後に、９５％以上の細菌増殖抑制が観察される。これは、ＰＡＲ３０が黄色ブドウ球菌の生存率に大きな影響を及ぼすことを示す。分子量作用が極めて著しく、これまでこのような多層膜のどんな機能である機能性への作用が観察されていないことを説明しなければならない（図３参照）。

【0267】

表面に接触する細菌の健康をより正確に評価するために、５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロライド（ＣＴＣ）を使用する黄色ブドウ球菌の呼吸活性を監視する。健康な細菌は、ＣＴＣを吸収し不溶性で赤色蛍光性のホルマザン生成物に還元するが、死んだ細菌はＣＴＣを還元しないので、蛍光性の生成物を生成しない（データ未記載）。完全な細菌抑制が（ＰＡＲ３０／ＨＡ）表面に明らかに観察され、少ない細菌がある領域を見つけることが極めてめずらしい（データ未記載）。これに対して、ＰＡＲ１０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００の表面は、細菌付着および増殖を防止しなく、処理されない表面と同様な健康な細菌の濃度がある。この目立った結果は、完全に以上に説明する上清における増殖抑制に関連し、そこに、ＰＡＲ３０が細菌に対して強い効果がある唯一のコーティングである。

【0268】

（ＰＡＲ／ＨＡ）２４コーティングの細菌増殖抑制が黄色ブドウ球菌に制限されるかどうかを解明するため、他のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対してさらに（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の細菌増殖抑制を測定する。したがって、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌および緑膿菌に対して、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４多層の抗菌性を評価する。図１６に示す結果は、コーティングが異なるグラム陰性およびグラム陽性菌に対して抗細菌活性を有することを示す。

【0269】

以上のことにより、本発明者らは、抗細菌活性がここに説明する（ＰＡＲ／ＨＡ）多層コーティングに制限されるかどうか、あるいはポリカチオンとして別のポリペプチドを含むコーティングも同じ抗細菌活性を示すかどうかに関心がある。本発明者らは、残基数が異なるＰＬＬおよびＰＬＯに対して（ＰＬＬ／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ／ＨＡ）_２４多層をさらに評価する。意外に、図４、６、９、１０および１７から決定されるように、（ＰＬＬ／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ／ＨＡ）_２４多層も黄色ブドウ球菌およびミクロコッカス・ルテウスに対して高い増殖抑制を示す。

【0270】

以下、本発明者らは、本発明のコーティングに表面および上清での強い抑制特性を与える根本的な機構をさらに解明することを意図する。例として、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングをさらに調査する。したがって、実験セクションに説明されるような細菌分析を使用して溶液におけるＰＡＲの最小抑制濃度（ＭＩＣ）を確定する。０．０４ｍｇ．ｍＬ^−１までの濃度について、すべてのＰＡＲ（ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００）は、完全に黄色ブドウ球菌の増殖を抑制する（図１１）。しかし、ＰＡＲ濃度を低減する時、ＰＡＲの間に相違が観察される。０．０３ｍｇ．ｍＬ^−１の濃度のものについて、より長いＰＡＲ、すなわち、ＰＡＲ２００について、部分的な抑制だけ（約４５％）が測定され、その以外、すべてのＰＡＲについて、黄色ブドウ球菌に対する完全な抑制増殖が観察される。最後に、濃度が０．０１ｍｇ．ｍＬ^−１であるＰＡＲについて、ＰＡＲ_３０だけが１００％の抑制を示す。より長いまたは短いＰＡＲ鎖（ＰＡＲ１０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００）は、黄色ブドウ球菌の増殖を部分的に（４０％以下）しか抑制しない。これは、ＰＡＲ３０が溶液においてより有効であることを示す。この理由は、ＰＡＲの濃度値を質量（ｍｇ．ｍＬ^−１）として表す場合に適切であるので、アルギニンモノマーの数に関係がある。しかし、グラフをμＭ（そして、鎖の数に比例する）としての濃度でプロットする場合、すなわち、濃度が鎖の数に関連する場合に、異なる解釈がある。低濃度の場合、より長い鎖がより有効である。１μＭである時、ＰＡＲ１００およびＰＡＲ２００は、完全に細菌増殖を抑制するが、ＰＡＲ３０についての同様な効果が約２μＭの時に現れる。最後に、本発明者らは、これらの結果から、すべてのＰＡＲ鎖が溶液において黄色ブドウ球菌の増殖を抑制することに効果があるという結論を得る。所定の質量のＰＡＲについて、ＰＡＲ３０は最も効果がある。なお、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００に対して得られるＭＩＣ１００値は、とても低い濃度（１μＭ以上２μＭ以下）の範囲にあり、周知の抗菌ペプチド（例えば黄色ブドウ球菌に対するカテスリチンの方が３０μＭであり、Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２０１３、 ２３、４８０１−４８０９参照）と対比して驚くべきである。このため、ＰＡＲは、黄色ブドウ球菌と闘う強力な選択である。しかし、長さが異なるＰＡＲの間にＭＩＣが異なっても、桁によって異なることがないので、少なくとも単に、ＰＡＲ／ＨＡ多層に対して観察された驚いた分子量効果から由来することがないと思う。

【0271】

ＰＡＲ鎖の構造を提出し、ＰＡＲ３０鎖がより長いまたは短い鎖と対比する抑制特性を説明できる具体的な二次構成を有するかどうかを検査するために、円偏光二色性（ＣＤ）実験を行う。まず、ＮａＣｌ／ＴＲＩＳ緩衝液 溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４）におけるＰＡＲ鎖の二次構成（データ未記載）を検出する。ＰＡＲ鎖（ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００およびＰＡＲ２００）のすべてのＣＤスペクトルは、溶液におけるランダムコイル構造を特徴とする約２００ｎｍで、特有の負の最小値を示す。第二のステップにおいて、ＰＡＲ／ＨＡ多層コーティングにおけるＰＡＲ構造を監視する（データ未記載）。驚いたことに、コーティングのスペクトルは、完全に異なるプロフィルを示し、２００ｎｍで最小値が観察されなく、しかし、２００ｎｍ（ランダムコイル）で特有の負の最小値を示す（ＰＡＲ１０／ＨＡ）２４の他に、約１０ｎｍで1つの最小値、約２２２ｎｍでもう1つの最小値が観察される。それらがｐＨ７．４の溶液において無規則な構造を有することが知られるので、ＨＡ鎖に起因する可能性がない（Ｚａｈｏｕａｎｉ、ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、２０１６、印刷中）。なお、ＰＡＲ／ＨＡのスペクトルがその2つの最小値を特徴とするα−螺旋構造の鎖に対応することはより可能性がある。これは、ＰＡＲ鎖が溶液におけるコイル構造からコーティングにおけるα−螺旋構造に変化するべきことを示す。前に、ポリリジンとポリ（グルタミン酸）で構成するＬｂＬについて同様な挙動が観察されている（Ｂｏｕｌｍｅｄａｉｓ Ｆ．等、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、２００２、１８、４５２３）。おもしろいことに、無規則な抗菌ペプチドは、細菌膜と相互に作用する時にα−螺旋構造を採用し、この機構が作用機構の重点である（Ｐｏｒｃｅｌｌｉｎｉ Ｆ．等、２００８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７、５５６５およびＬｕｇａｒｄｏｎ Ｋ．等、２００１、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７６（３８）：３５８７５）。ここで、高分子電解質の多層コーティングにおいて、ＰＡＲ鎖は、ＰＡＲとＨＡの間の相互作用およびＰＡＲの局所的な高濃度のせいでα−螺旋構造を採用する可能性が高い。この機構は、より速くてより効率的に侵入する細菌に闘うことに役立つ。

【0272】

しかし、異なるＰＡＲ鎖長で構成する膜は同様なスペクトルを示すので、ＰＡＲ鎖の二次構成は、ＰＡＲ３０／ＨＡ膜の殺菌特性に対する驚いた分子量効果を説明することができない。

【0273】

より短いまたは長いＰＡＲ鎖に対比する場合の、溶液におけるＰＡＲ３０の特定特性の欠如を考慮して、ＰＡＲ３０／ＨＡ膜の抗菌能力は、その自身の膜特性に関係がある。これに関連して、膜の殺菌性が多層から溶液へのＰＡＲ３０鎖の放出に起因するかどうか、または、細菌を殺すために膜に接触させる必要があるかどうかを調査する。この目的で、二種類の実験を行う。蛍光標識されたＰＡＲ３０鎖を使用して、まず、黄色ブドウ球菌があるＭＨ培地および黄色ブドウ球菌がないＭＨ培地のみを含有する溶液へのＰＡＲ３０鎖の放出を確定する。図１３は、典型な放出動態カーブを示す。確かに、２４時間の時間尺度にわたる遅い放出プロセスが観察されるが、２４時間の後においても、溶液に達成するＰＡＲ３０の濃度が対応するＭＩＣ濃度より著しく低く、放出されるＰＡＲ３０が２４時間後に約０．１８μＭであり、ＭＩＣ９０が約２μＭである。なお、膜と２４時間接触した後に、上清を先の実験と同じな最後濃度の細菌を含有する懸濁液に接触させ、細菌増殖の抑制が全然観察されなく、ＭＩＣが上清に至らないことを確認する（図１５）。最後、細菌を（ＰＡＲ３０／ＨＡ）２４の膜に２４時間接触させる実験も行う。細菌増殖が完全に抑制される。この実験の上清を除去して新しい細菌の懸濁液に接触させる。もう一度、細菌増殖がさらに抑制されることがない（データ未記載）。これらの結果は、膜から上清へのＰＡＲ３０鎖の放出が殺菌作用の起因でないことを示す。最後、殺菌作用が接触致死の多層として機能するＰＡＲ３０／ＨＡ膜との細菌の接触に直接関連することを仮定できる。

【0274】

そして、本発明者らは、ＰＡＲ３０／ＨＡ多層の殺菌活性がこれらの鎖の膜における運動性に関連するかどうかを調査する。確かに、多層の指数特性が各積層ステップにおいて膜内外への多層の少なくとも１つの成分の拡散能力に関連することは知られる。まず、ＦＲＡＰ方法を使用して、異なる鎖、ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００およびＰＡＲ２００の（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４多層への運動性を確定する。図１４には、時間の平方根の関数として、漂白領域における正規化蛍光の進化を示す。これらのカーブから、実験の時間尺度にわたる不動鎖の割合を推定することができる。８０％のＰＡＲ１０およびＰＡＲ３０鎖が運動性を持ち、それぞれ６０％だけのＰＡＲ１００および２０％だけのＰＡＲ２００が運動性を持つことは明らかである（データ未記載）。鎖長が３０から１００または２００個の残基に増加する場合に、運動鎖の割合が大きく増加する。

【0275】

また、本発明者らは、アミンとカルボキシル基の標準ＥＤＣ−ＮＨＳ架橋方法を使用してＰＡＲ３０／ＨＡ多層を架橋される。架橋後に、ＦＲＡＰにより測定された不動鎖の比率が増加することを見つける（データ未記載）。このような膜を黄色ブドウ球菌に接触させる場合に、２４時間の接触の後、３０％だけの細菌増殖の抑制が観察される。これらの結果は、多層における運動ＰＡＲ鎖の百分率が膜の殺菌性を制御する重要なパラメーターであることを示す（図１１）。

【0276】

最後に、本発明者らは、共焦点顕微鏡法を使用して、細菌と２４時間接触した後の膜の構成も調査する（データ未記載）。この目的で、蛍光標識されるＰＡＲ３０鎖を組み込むことにより膜を形成する。２４時間の接触の後、膜が均一でないが、非蛍光領域が出現しないことは見つけられる。これらの領域がスムーズな形状を持つので、膜の再組織化を示す。このような挙動が膜を均一に保持する細菌がない場合に観察されていない。このような再組織化を連続して膜におけるＰＡＲ鎖を減少し、以下の 殺菌性機構を示す。すなわち、細菌を多層に接触させる時、負の細菌膜がＰＡＲ鎖に対して強い引力がある表面として機能する。このため、運動性のＰＡＲ鎖は、細菌膜により膜の外へ浸され、それらを不安定化する。溶液において決定されるＭＩＣから出てくるので、分子量が大きい鎖は、分子量がより小さいものより、強い膜不安定化能がある。ＰＡＲ１０鎖は、活性がＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００鎖より１０倍小さいが、ＰＡＲ３０鎖は、活性がＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００鎖より２倍だけ小さい。けれども、膜について、アルギニンモノマーの濃度がＰＡＲ鎖の分子量からかなり独立していることを仮定できる。そして、高分子電解質の分子量が増加する時、鎖の濃度が低下する。例えば、膜におけるＰＡＲ３０鎖の濃度は、ＰＡＲ１００より３倍高い必要がある。また、９０％のＰＡＲ１０鎖は運動性があることに対して、７０％のみのＰＡＲ１００鎖は運動性がある。これは、膜においてＰＡＲ１０鎖がＰＡＲ１００より４倍多いことにつながる。ＰＡＲ３０で形成されるＰＡＲ／ＨＡ膜がより強い殺菌性を持つ傾向について、他の原因があるとも言えるが、鎖運動度がもちろん１つの重要な原因である。

【0277】

要するに、本発明者らは、ポリカチオンとしてＰＡＲ、ＰＬＬまたはＰＬＯ、ポリアニオンとしてＨＡを含む多層コーティングが黄色ブドウ球菌、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌および緑膿菌に対して強い抗菌作用を示すことを見つける。この作用はポリペプチド鎖の分子量に大きく依存する。この作用は、多層における運動鎖の濃度および分子量の関数としての細菌を殺す能力により説明される。これらの結果は、関数が高分子電解質の分子量により調節される高分子電解質多層、特に抗細菌多層の新型適用に経路を開放する。

【0278】

２．実施例２
２．１材料
以上のセクション１．１に説明された高分子電解質を使用して高分子電解質の多層コーティングを形成する。加えて、以下の高分子電解質が用いられる。ポリ（Ｌ−アルギニン塩酸塩）（ＰＡＲ）のポリカチオンが米国のＡｌａｍａｎｄａ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から購入される。用いられる異なるＰＡＲポリマーは、鎖あたりのアルギニンの数が異なり、ＰＡＲ５０（５０個のアルギニン（Ｒ）、Ｍｗ＝９．６ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０３）、ＰＡＲ７０（７０個のアルギニン（Ｒ）、Ｍｗ＝１３．４ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０１）、ＰＡＲ１５０（１５０個のアルギニン（Ｒ）、Ｍｗ＝２９ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０４）。

【0279】

２．２方法
使用する方法は、以上の段落１．２の対応するセクションに説明されるようになる。

【0280】

２．３結果
２．３．１ＰＡＲ／ＨＡ抗菌活性へのアルギニン残基数の影響:２４時間培養後のＰＡＲ３０、ＰＡＲ５０、ＰＡＲ７０、ＰＡＲ１００およびＰＡＲ１５０によるコーティング
３０、５０、１００および１５０個の残基があるＰＡＲを測定して、先の結果を確認し、満足した結果を得る。以上に説明するように、（ＰＡＲ／ＨＡ）２４（すなわち、２４層のＨＡと交互する２４層のＰＡＲ）で被覆し、２４ウエル−プレトに配置するスライドグラスにより測定を行う（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２０１６、２８、８７００）。３００μＬの濃度８．１０５ＣＦＵ・ｍＬ^−１の黄色ブドウ球菌を各ウエルに堆積し３７℃で２４時間培養する。そして、６２０ｎｍでの上清の吸収を測定する。

【0281】

２４層の二重層のＰＡＲ５０／ＨＡ対ＰＡＲ３０／ＨＡ
２４層の二重層で形成するＰＡＲ５０／ＨＡ膜は、細菌に対して完全な殺菌作用を示す（図１９と２０）。なお、ＣＴＣ／Ｓｙｔｏ２４標識を使用する共焦点顕微鏡による観察は、コーティングに細菌がほとんどないことを示す（データ未記載）。

【0282】

４８層の二重層のＰＡＲ５０／ＨＡ対ＰＡＲ３０／ＨＡ
二重層の数を２４から４８に増加することは、同様な結果を示す。ＰＡＲ５０またはＰＡＲ３０に基づいたコーティングについて、黄色ブドウ球菌の増殖が完全に抑制される（図２１と２２）。これらの結果は共焦点顕微鏡法による観察で確認される。ＰＡＲ５０／ＨＡコーティングまたはＰＡＲ３０／ＨＡコーティングに細菌が観察されていない。

【0283】

ＰＡＲ１００／ＨＡ and ＰＡＲ１５０／ＨＡ 対ＰＡＲ３０／ＨＡ with ２４層の二重層
２４層の二重層で形成するＰＡＲ１００／ＨＡコーティングは、完全な抗菌活性を表現する（図２３）。一方、ＰＡＲ１５０／ＨＡコーティングは細菌を抑制しなく、コーティングはまったく効果がない。共焦点顕微鏡法の観察は、これらの結果を確認し、ＰＡＲ１００／ＨＡとＰＡＲ３０／ＨＡコーティングに細菌が観察されていない一方、ＰＡＲ１５０／ＨＡコーティングに多くの細菌を見える。

【0284】

２４層の二重層のＰＡＲ１０／ＨＡ対ＰＡＲ３０／ＨＡ
２４層の二重層のＰＡＲ１０／ＨＡコーティングは、上清において細菌を完全に抑制する（図２４）。対照として、ＰＡＲ５０／ＨＡとＰＡＲ３０／ＨＡコーティングは、以上に説明するような抗菌活性を確認する。共焦点顕微鏡法による表面の観察から同様な結果を得ることができる。

【0285】

２４層の二重層のＰＡＲ７０／ＨＡ対ＰＡＲ３０／ＨＡ
ＰＡＲ７０／ＨＡコーティングがある上清における細菌は完全に抑制される（図２５）。これは共焦点実験により確認される。

【0286】

２．３．２．ＰＡＲ／ＨＡコーティングの長期抗菌活性：２４／４８または７２時間の培養後のＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ５０、ＰＡＲ１００およびＰＯＲ３０
２４／４８または７２時間の培養後の２４層の二重層のＰＡＲ３０／ＨＡ対ＰＯＲ３０／ＨＡ
（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４または（POR３０／ＨＡ）_２４コーティングを使用する時に、２４、４８または７２時間後に、上清において細菌が観察されていない（図２６〜２８）。共焦点顕微鏡により表面を可視化する場合に、同様な結論が得られる。

【0287】

２４／４８または７２時間の培養後の２４層の二重層のＰＡＲ１０／ＨＡ、ＰＡＲ５０／ＨＡおよびＰＡＲ１００／ＨＡ
ＰＡＲ１０／ＨＡ、ＰＡＲ５０／ＨＡおよびＰＡＲ１００／ＨＡコーティングに同様な実験を行う。２４時間後に、すべてのコーティングについて、上清に細菌が検出されていない（図２９）。４８時間後に、ＰＡＲ５０／ＨＡまたはＰＡＲ１００／ＨＡコーティングについて細菌がない一方、ＰＡＲ１０／ＨＡコーティングは効果がなく、黄色ブドウ球菌の増殖がコーティングのない表面と同程度のレベルになる（図３０）。７２時間後に、同様な結果が得られ、ＰＡＲ１０／ＨＡコーティングの場合に細菌が生きていてるが、ＰＡＲ５０／ＨＡまたはＰＡＲ１００／ＨＡコーティングの場合に細菌が死んだ（図３１）。すべての結果が共焦点顕微鏡観察により確認される。

【0288】

２．３．３ＰＡＲ／ＨＡコーティングの貯蔵および滅菌
ＰＡＲ／ＨＡコーティングの貯蔵
ＰＡＲ／ＨＡコーティングの乾燥手順および貯蔵が抗菌活性を保持するかどうかを確認するために、乾燥し（純水で洗浄し室温で乾燥する）４℃で１または７日貯蔵された後、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングを測定する（図３２と３３）。この２つのプロセス後に、抗菌活性の変化が観察されていなく、細菌はコーティングを含有するウエルの上清に全然増殖しない。これは、膜が乾燥手順の後に安定し、数日間の貯蔵が特性を変更することがないことを示す。

【0289】

ＰＡＲ／ＨＡコーティングの滅菌
乾燥手順と医療装置滅菌の規則的な周期（１２１℃で３０分間の周期）を従うオートクレーブ滅菌の後に、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングの活性を測定する（図３４）。この滅菌手順は、コーティングの抗菌活性を変更しなく、全体の殺菌活性に変化が検出されていない。

【0290】

２．４結論
最後に、これらの研究からいくつかの結論を取り：
-ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ５０、ＰＡＲ７０、ＰＡＲ１００で形成する（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４コーティングは、２４時間の接種後に、黄色ブドウ球菌に対して完全な抗菌活性を示す。しかし、以前の予備研究において、ＰＡＲ１０とＰＡＲ１００は、２４時間においていつも活性を持つことがない。これは、恐らくＰＡＲ１０とＰＡＲ１００が有効である限界値の鎖長に対応するためである。これに対して、私たちの実験において、ＰＡＲ３０とＰＡＲ５０は、いつも完全な抗菌活性がある（両方の場合に、少なくとも１０人以上の実験を行う）。２４時間の黄色ブドウ球菌の培養後に、（ＰＡＲ１５０／ＨＡ）_２４コーティングは、抗菌活性を全然示さない。
-２４／４８または７２時間の培養後のＰＡＲ３０、ＰＡＲ５０、ＰＡＲ１００およびＰＯＲ３０で形成する（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４コーティングは、完全な細菌抑制を示し、３日間と３つの連続汚染にわたって効率を示す。これに対して、ＰＡＲ１０は、三番目の接種の後（７２時間）、活性がない。
−活性を全く損なうことなく、乾燥後に４℃で数日間（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４コーティングを貯蔵することができる。なお、医療装置用の標準滅菌手順を（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４コーティングに適用することができ、コーティング活性の抗菌性が保持される。

【0291】

図面の簡単な説明
図１は、ＱＣＭで追跡するＳｉ０_２被覆結晶への（ＰＡＲ／ＨＡ）多層コーティングの積み重ねを示す図である。様々な分子量のＰＡＲ（それぞれＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００という表記に対応する１０、３０、１００または２００個の残基）をＨＡとともに使用する。吸着される層数の関数と正規化頻度−Δｆｖ／ｖ（ｖ＝３）の進化である。ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００で積み重ねたコーティングについて、積層ステップ数での正規化頻度の指数増殖が観察される。より大きいＰＡＲ鎖について、最も重要な重大な増殖が監視される。ＰＡＲ１０の場合に、積層数での正規化頻度の増加がより弱く、しかし、指数増殖がすでに観察される。
図２は、ＰＡＲ／ＨＡコーティングのセクション（ｘ、ｚ）の共焦点顕微鏡法画像を示す画像である。ＱＣＭで追跡するＳｉ０_２被覆結晶上の（ＰＡＲ／ＨＡ）多層コーティングのＰＡＲ／ＨＡコーティングの積み重ねについての、ＰＡＲ／ＨＡコーティングのセクション（ｘ、ｚ）の共焦点顕微鏡法による観察である。様々な分子量のＰＡＲ、すなわち、ＰＡＲ１０、ＰＡＲ３０、ＰＡＲ１００またはＰＡＲ２００による（ＰＡＲ／ＨＡ）多層コーティングの積み重ねが比較されている。この画像は、得られたコーティングがすべての条件で表面に均一に積層されることを示す（１０〜２００個の残基のＰＡＲの場合）。
図３は、ＰＡＲ本発明のコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。様々な残基のポリ−Ｌ−アルギニンを含む（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各々の値は、３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４の場合に約８０％であり、（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４の場合に７５％であり、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４の場合に約９０％であり、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に５％以下であるので、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に、９５％以上の強い増殖抑制を示す。
図４は、本発明のＰＬＬコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間（Ｊ＋１）、２日間および３日間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各２４時間後に、コーティングを黄色ブドウ球菌の新鮮な懸濁液に接触する。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に１と２日間後５％以下であるので、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に、最初の４８時間に９５％以上の強い増殖抑制を示す。
図５は、コーティング（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４を使用してミクロコッカス・ルテウスの増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２０時間接触した後に上清に観察された正規化のミクロコッカス・ルテウス増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。ミクロコッカス・ルテウスの増殖について、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に２％以下であるので、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に９８％以上の強い増殖抑制を示す。
図６は、ポリアニオンＨＡがないＰＡＲ３０またはＰＬＬ３０コーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。ポリアニオン層ＨＡがないＰＬＬ３０またはＰＡＲ３０のポリカチオン層に２４時間接触した後に、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各２４時間後に、コーティングを黄色ブドウ球菌の新鮮な懸濁液に接触させる。。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、ＰＬＬ３０ の場合に約６５％であり、ＰＡＲ３０の場合に約１００％であるので、ＰＬＬ３０の場合に３５％のみの小さい増殖抑制を示し、ＰＡＲ３０の場合に増殖抑制を示さない。
図７は、本発明の（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０を使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。最後層のＰＡＲ３０を多層コーティング（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４に加えるので、多層コーティング（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０が生成される。（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０多層コーティングに２４時間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に１％以下であるので、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に９９％以上の強い増殖抑制を示す。
図８は、本発明の（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０を使用してミクロコッカス・ルテウスの増殖抑制を示す図である。最後層のＰＡＲ３０を多層コーティング（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４に加えるので、多層コーティング（ＰＡＲ_２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ_３０が生成される。ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０多層コーティングに２４時間接触した後、上清に観察された正規化のミクロコッカス・ルテウス増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。ミクロコッカス・ルテウスの増殖について、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に１％以下であるので、（ＰＡＲ２００／ＨＡ）_２４−ＰＡＲ３０の場合に９９％以上の強い増殖抑制を示す。
図９は、本発明のＰＬＯコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。異なる残基数のポリ−Ｌ−オルニチンを含む（ＰＬＯ／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清に得られた正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す、すなわち、（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ１００／ＨＡ）_２４。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４の場合に約８０％であり、（ＰＬＯ１００／ＨＡ）_２４の場合に５％以下のであり、（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４の場合に３％以下であるので、（ＰＬＯ１００／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ３０／ＨＡ）_２４の場合に９５％以上の強い増殖抑制を示す。
図１０は、（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）２４または架橋（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４を使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。０．５ＭのＥＤＣと０．１ＭのＮＨＳを有するＥＤＣ／ＮＨＳにより、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４を４℃で１５時間架橋させる。エタノールアミンを使用して未反応のカルボキシル基を中和する。（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４または架橋（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清において正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を測定する。黄色ブドウ球菌の増殖について、架橋（ＰＬＬ_３０／ＨＡ）_２４の場合に約６５％であり、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に１８％以下であるので、架橋が著しくコーティングの殺菌活性を低減することを示す。
図１１は、（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４または架橋（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４を使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。０．５ＭのＥＤＣと０．１ＭのＮＨＳを有するＥＤＣ／ＮＨＳを使用して（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４を４℃で１５時間架橋する。エタノールアミンを使用して未反応のカルボキシル基を中和する。（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４または架橋（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清において正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を測定する。黄色ブドウ球菌の増殖について、架橋（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４の場合に約６５％であり、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に５％以下であるので、架橋がコーティングの殺菌活性を低減することを示す。
図１２は、１０、３０、１００または２００個のアルギニン残基を有する可溶性ＰＡＲの最小抑制濃度（ＭＩＣ_１００）を示す図である。黄色ブドウ球菌の１００％抑制を引き起こす最小抑制濃度（ＭＩＣ_１００）を溶液において測定する。１０、３０、１００または２００個のアルギニン残基を有するＰＡＲに検査を行う。０．０４ｍｇ．ｍＬ^−１までの濃度で、すべてのＰＡＲ（ＰＡＲ_１０、ＰＡＲ_３０、ＰＡＲ_１００またはＰＡＲ_２００）は、黄色ブドウ球菌増殖を完全に抑制する。
図１３は、放出実験の結果を示す図である。以上の「放出実験」というセクションに説明するように放出実験を行う。ＰＡＲ−ＦＩＴＣを有する 多層コーティング（ＰＡＲ３０ＦＩＴＣ／ＨＡ）_２４をＭＨＢ培地または黄色ブドウ球菌／ＭＨＢ溶液（Ａ_６２０＝０．００１）に接触させる。ＰＡＲ−ＦＩＴＣの放出を経時的に監視する。各条件で３つのサンプルを研究する。
図１４は、ＭＷによる（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４コーティングにおける運転ＰＡＲの比率（％）を示す図である。以上の「光退色（ＦＲＡＰ）実験後の蛍光回復」というセクションに説明する光退色実験（ＦＲＡＰ、光退色後の蛍光回復）により、ＰＡＲ−ＦＩＴＣを含有する（ＰＡＲ／ＨＡ）_２４多層に対して拡散係数D、および運転分子の比率pを測定する。
図１５は、コーティングから溶液に拡散するＰＡＲ３０の濃度が黄色ブドウ球菌の増殖を効率的に抑制するのに不十分であることを示す図である。多層膜（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４で培養する培地に２４時間接触した後の正規化の黄色ブドウ球菌増殖を示す。培地Ａ）には３００μＬの黄色ブドウ球菌溶液Ａ６２０＝０．００１があり、Ｂ）には３００μＬのＭＨＢのみがある。細菌増殖抑制が観察されていない。
図１６は、（ＰＡＲ_３０／ＨＡ）_２４を使用して異なる細菌の増殖抑制を示す図である。コーティング（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４で被覆するガラスに２４時間接触した後の正規化の細菌増殖を示す。黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌株、ミクロコッカス・ルテウス、大腸菌および緑膿菌について細菌増殖が９０％以上抑制される。
図１７は、本発明のＰＬＬコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。異なる残基数のポリ−Ｌ−リジンを含む（ＰＬＬ／ＨＡ）_２４、すなわち、（ＰＬＬ１０／ＨＡ）_２４、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４、（ＰＬＬ１００／ＨＡ）_２４および（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４多層コーティングに２４時間接触した後、上清において観察された正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、ガラスと抗生物質の組み合わせの場合に３％以下であり、（ＰＬＬ３０／ＨＡ）_２４の場合に６％以下である。一方、細菌増殖について、（ＰＬＯ２５０／ＨＡ）_２４の場合に約７５％であり、（ＰＬＬ１００／ＨＡ）_２４の場合に約８５％であり、（ＰＬＬ１０／ＨＡ）_２４の場合に約９０％である。
図１８は、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４を使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４多層コーティングに１日、２日と３日接触した後、上清において得られる正規化の黄色ブドウ球菌増殖（％）を示す。各２４時間の後、コーティングを黄色ブドウ球菌の新鮮な懸濁液に接触させる。各々の値は３つの実験の平均値に対応し、エラーバーは標準偏差に対応する。黄色ブドウ球菌の増殖について、１日と２日後の（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４の場合に５％以下であるので、最初の４８時間に（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４に対して９５％以上の強い増殖抑制を示す。３日後に、抑制活性が低減する。
図１９と２０は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行い、ａ）およびｂ）は２つの同様な独立した実験に対応する。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図２０と２１は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_４８コーティングの上清のの抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_４８および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行い、ａ）およびｂ）は２つの同様な独立した実験に対応する。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図２３は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４（ＰＡＲ１５０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図２４は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４および対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図２５は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ７０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図２６、２７と２８は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４（POR３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図２９、３０と３１は、本発明のＰＡＲコーティングを使用して経時的に黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。（ＰＡＲ１０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ５０／ＨＡ）_２４、（ＰＡＲ１００／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、２４、４８または７２時間の黄色ブドウ球菌の培養後の対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。ｔ＝０、２４時間と４８時間に、細菌による新しい接種を行う。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図３２と３３は、本発明のＰＡＲコーティングを異なる貯蔵条件に暴露させた後の黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。予め乾燥され４℃で１日間（ａ）または７日間貯蔵される（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。
図３４は、本発明のＰＡＲコーティングを異なる貯蔵条件に暴露させた後の黄色ブドウ球菌の増殖抑制を示す図である。オートクレーブで予め滅菌される（ＰＡＲ３０／ＨＡ）_２４コーティングの上清の抗菌活性の評価と、対照組（「ガラス」または「ガラス＋抗生物質」と表現するコーティングのないガラス）との対比を示す。各々の実験は、３つのスライドグラスにより行う。「培地」条件は細菌のないウェルのことを意味し、培地のＯＤのみを測定する。エラーバーは標準偏差に対応する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】