特許 6972064 アイケア効果を有するセッコク抽出物、および当該セッコク抽出物を用いて生成した医薬組成物、ならびに当該医薬組成物の用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6972064

(24)【登録日】2021年11月5日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】アイケア効果を有するセッコク抽出物、および当該セッコク抽出物を用いて生成した医薬組成物、ならびに当該医薬組成物の用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7048 20060101AFI20211111BHJP

   A61K 36/8984 20060101ALI20211111BHJP

   A61K 31/365 20060101ALI20211111BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20211111BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/7048

   A61K36/8984

   A61K31/365

   A61P27/02

【請求項の数】6

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2019-99390(P2019-99390)

(22)【出願日】2019年5月28日

(65)【公開番号】特開2020-132622(P2020-132622A)

(43)【公開日】2020年8月31日

【審査請求日】2019年5月28日

(31)【優先権主張番号】108105682

(32)【優先日】2019年2月20日

(33)【優先権主張国】TW

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】519192784

【氏名又は名称】安益藥業股▲ふん▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】汪 怡岳

(72)【発明者】

【氏名】林 雲蓮

(72)【発明者】

【氏名】許 偉祥

【審査官】 古閑 一実

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０４９５７６１８（ＣＮ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／０２５０２７１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０５６６９６１１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０３５２０５１５（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２００８−５４０３４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Fitoterapia，2017年，Vol.121，p.206-211

【文献】 Natural Product Communications，2017年，Vol.12, No.12，p.1825-1826

【文献】 Phytochemistry，2002年，Vol.61，p.885-890

【文献】 Chem. Pharm. Bull.，2008年，Vol.56, No.6，p.854-857

【文献】 HELVETICA CHIMICA ACTA，2007年，Vol.90，p.2386-2394

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

金釵セッコク抽出物の活性成分としてピクロトキサン構造のセスキテルペン類化合物を含むことを特徴とし、網膜及び視神経の保護に使用するための医薬組成物であり、金釵セッコク抽出物を含む医薬組成物。

【請求項2】

前記ピクロトキサン構造のセスキテルペン類化合物が、２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅまたは２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅを含むことを特徴とする、請求項１に記載の金釵セッコク抽出物を含む医薬組成物。

【請求項3】

前記ピクロトキサン構造のセスキテルペン類化合物の重量比が１２−２０％であることを特徴とする、請求項１に記載の金釵セッコク抽出物を含む医薬組成物。

【請求項4】

金釵セッコク抽出物の活性成分としてピクロトキサン構造のセスキテルペン類化合物を含むことを特徴とし、網膜及び視神経の保護に使用するための医薬組成物であり、金釵セッコク抽出物を含む医薬組成物を製成する方法。

【請求項5】

前記ピクロトキサン構造のセスキテルペン類化合物が、２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅまたは２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅを含むことを特徴とする、請求項４に記載の金釵セッコク抽出物を含む医薬組成物を製成する方法。

【請求項6】

前記ピクロトキサン構造のセスキテルペン類化合物の重量比が１２−２０％であることを特徴とする、請求項４に記載の金釵セッコク抽出物を含む医薬組成物を製成する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、その活性成分として、ピクロトキサン（ｐｉｃｒｏｔｏｘａｎｅ）構造を有するセスキテルペン類化合物を含むことでアイケア効果を有するセッコク抽出物、および当該セッコク抽出物を用いて生成した医薬組成物、ならびに当該医薬組成物の用途に関するものである。

【背景技術】

【0002】

≪台湾中薬典≫の記載によれば、セッコク生薬の基となる植物には、金釵セッコク（デンドロビウム・ノビル，Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ．）や粉花セッコク（デンドロビウム・ロディゲシィ，Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｌｏｄｄｉｇｅｓｉｉ Ｒｏｌｆｅ．）、黄草セッコク（デンドロビウム・クリサンツム，Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｕｍ Ｗａｌｌ．ｅｘ Ｌｉｎｄｌ．）、馬鞭セッコク、（デンドロビウム・フィンブリアツム， Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．）、鉄皮セッコク（デンドロビウム・オフィシナーレ，Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ Ｍｉｇｏ）、鼓槌セッコク（デンドロビウム・クリソトキサム，Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｔｏｘｔｕｍ Ｌｉｎｄｌ．）、黄花セッコク（デンドロビウム・トサエンセ，Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｔｏｓａｅｎｓｅ Ｍａｋｉｎｏ）等が含まれる。セッコクに関する過去の研究においては、各種活性化合物が分離されており、その内デンドロビン、フェナンスレン（Ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）成分、セスキテルペン化合物、セッコク多糖類、ビベンジル化合物（ｂｉｂｅｎｚｙｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）についてそれぞれ報告がなされている。これらの報告によれば、デンドロビンが主要活性成分と見なされており、フェナンスレン成分が有する生理活性には抗酸化や抗炎症、抗がん等の作用が含まれ、セスキテルペン類化合物は免疫調節作用を、セッコク多糖類は肝臓保護、免疫調節、抗がん、血圧低下等の効果を、ビベンジル化合物は抗酸化及び抗がん等の作用を備える。また、セッコクには肝臓の浄化及び視力向上の効果があるとされ、眼疾患への応用に関しては、ビベンジル化合物モスカチリン（ｍｏｓｃａｔｉｌｉｎ）が低酸素の状況下で網膜の損傷を防ぐ働きを示すという報告がなされている。しかし、モスカチリンは極性が比較的低い化合物で、過去の文献では毒性及び抗がん作用を有すると記載されており、本研究においても、視神経細胞株に対し毒性がある場合は眼疾患の治療に用いる医薬品としては不適切だということが分かっている。臨床分野においては、白内障や緑内障、ドライアイ等の疾患に有効で副作用の少ない薬品はいまだなく、漢方分野におけるセッコクがいかにしてアイケアの効能を発揮するか、そしてその活性成分は何かといった課題も、依然研究による解決が待たれている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

本発明はアイケアの効果を有するセッコク抽出物、および当該セッコク抽出物から生成される医薬組成物、ならびに当該医薬組成物の用途を提供する。また、その活性成分としてピクロトキサン構造を有するセスキテルペン類化合物を使用する。

【0004】

本発明の実施例によれば、本発明はアイケア効果を有するセッコク抽出物を提供し、当該セッコク抽出物の活性成分は、ピクロトキサン構造を有するセスキテルペン類化合物を含む。

【0005】

本発明の更なる実施例によれば、本発明はアイケア用の医薬組成物を提供し、その活性成分は、ピクロトキサン構造を有するセスキテルペン類化合物を含む。

【0006】

本発明の他の実施例によれば、本発明はセッコク抽出物を用いて生成したアイケアの効果を有する医薬組成物の用途を提供し、当該セッコク抽出物の活性成分は、ピクロトキサン構造を有するセスキテルペン類化合物を含む。

【0007】

本発明が獲得するセッコク抽出物はアイケアの効果を有し、且つ本発明は更にこの抽出物の主要活性成分を提供する。故に、本発明は医学的価値を有する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】人間の網膜神経細胞（ＡＲＰＥ−１９）及びラットの視神経節細胞（ＲＧＣ−５）の二種の細胞に対する、過酸化水素、低酸素及び紫外線照射による損傷の下での、セッコクのアルコール／水粗抽出物Ａによる保護作用を示す図である。

【図2】ＡＲＰＥ−１９とＲＧＣ−５の二種の細胞に対する、過酸化水素、低酸素及び紫外線照射による損傷の下での、セッコクの抽出物Ａ−２による保護作用を示す図である。

【図3】過酸化水素、低酸素及び紫外線照射によりＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５細胞が損傷を受ける下での、セッコク活性成分の化合物１、化合物２、化合物３及びルテインによる細胞に対する保護作用を示す図である。

【図4】過酸化水素、低酸素及び紫外線照射によりＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５細胞が損傷を受ける下での、異なる濃度におけるセッコク活性成分の化合物１による細胞に対する保護作用を示す図である。

【図5】ゼブラフィッシュが紫外線照射を受けて白内障を起こす際の、セッコク抽出物Ａ−２及び化合物１による保護作用を示すグラフである。

【図6】セッコク抽出物Ａ−２の液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）による断面図である。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明への更なる理解に資するために、以下、付属の図面と合わせた好ましい実施例の記載を通して、本発明の内容及び効果についての詳細な説明を行う。

【0010】

本発明によるセッコク抽出物の生成方法を次に説明する。まず、セッコク科の生薬材から６０−８０％のエタノール／水による抽出により粗抽出物Ａを獲得する。実施例において、セッコク科植物とはラン科セッコク属（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ）植物における金釵セッコク（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ．）であるが、これに限らず、他の実施例においては鉄皮セッコク（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ Ｍｉｇｏ）、黄草セッコク （Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｕｍ Ｗａｌｌ．ｅｘ Ｌｉｎｄｌ．）、馬鞭セッコク（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｆｉｍｂｒｉａｔｕｍ Ｈｏｏｋ．）、鼓槌セッコク（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｔｏｘｔｕｍ Ｌｉｎｄｌ．）、黄花セッコク （Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｔｏｓａｅｎｓｅ Ｍａｋｉｎｏ）、粉花セッコク（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｌｏｄｄｉｇｅｓｉｉ Ｒｏｌｆｅ．）を使用することもある。実施例において、生薬材とはセッコク科植物の茎部を言う。実施例において、粗抽出物Ａが生薬材に占める重量比は１０〜１６％である。

【0011】

続いて、マクロ孔質樹脂を利用してクロマトグラフィーを行い、水で溶離した後水抽出物Ａ−１を獲得し、更に４０−６０％のエタノール／水による溶離を経て抽出物Ａ−２を獲得する。実施例において、マクロ孔質樹脂とは三菱ケミカルが開発したダイヤイオンＨＰシリーズなどである。抽出物Ａ−２が生薬材に占める重量比は３〜６％である。

【0012】

続いて、抽出物Ａ−２にセファデックスＬＨ−２０吸着剤を用い、メタノールによる溶離によりセスキテルペン類成分を豊富に含む分画層を獲得し、ＩＣＰ‐ＭＳ分析用吸着剤ＲＰ−１８を用いて３０−４５％のメタノール／水によりクロマトグラフィーを行い、複数回の分離を経て一連のセスキテルペン成分を獲得する。当該活性成分は、複数のピクロトキサン構造を有するセスキテルペン類化合物である。実施例において、このセスキテルペン類化合物は化学式１によって示される。

【化1】

化学式中、Ｒ_１はＨまたはグルコース残基（Ｇｌｃ）、Ｒ_２はＨまたはＯＨ、Ｒ_３はＣＨ_３またはＣＨ_２ＯＨ、Ｒ_４はＨまたはＯＨの場合がある。

【0013】

本発明の実施例において、化学式１を有するこの種の化合物はｄｅｎｄｒｏｍｏｎｉｌｉｓｉｄｅ Ｄ（以下、化合物１と言う）であり、その化学式は、２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＵＰＡＣ命名：１Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，５αＲ，６Ｒ，９Ｓ）−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−９−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）−５α−ｍｅｔｈｙｌ−６−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−２−ｙｌ）ｏｘｙ）−ｍｅｔｈｙｌ）ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−１，４−ｍｅｔｈａｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｄ］ｏｘｅｐｉｎ−２−ｏｎｅ）であり、これは化学式２によって示される。

【化2】

【0014】

本発明の実施例において、化学式１を有する別の化合物はｄｅｎｄｒｏｄｅｎｓｉｆｌｏｒｏｌ（以下、化合物２と言う）であり、その化学式は、２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ （ＩＵＰＡＣ命名：（１Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，５αＲ，６Ｒ，９Ｓ）−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−９−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）−５α−ｍｅｔｈｙｌｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−１，４−ｍｅｔｈａｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｄ］ｏｘｅｐｉｎ−２−ｏｎｅ）であり、これは化学式３によって示される。

【化3】

【0015】

本発明の実施例において、化学式１を有するまた別の化合物はｄｅｎｄｒｏｎｏｂｉｌｏｌｉｓｉｄｅ Ａであり（以下、化合物４と言う）であり、その化学式は、２β，３β，１１，１３−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＵＰＡＣ命名（１Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，５αＲ，６Ｒ，９Ｓ）−５−ｈｙｄｒｏｘｙｌ−９−（（Ｓ）−１−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐａｎ−２−ｙｌ）−５−ｍｅｔｈｙｌ−６−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−２−ｙｌ）−ｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−１，４−ｍｅｔｈａｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｄ］ｏｘｅｐｉｎ−２−ｏｎｅ）であり、これは化学式４によって示される。

【化4】

【0016】

本発明の実施例において、化学式１を有するさらに別の化合物はｄｅｎｄｒｏｓｉｄｅ Ｇ（以下、化合物７と言う）であり、その化学式は、２β，３β，４，１１−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＵＰＡＣ命名：（１Ｓ，４Ｒ，５Ｓ，５αＲ，６Ｒ，９Ｒ）−５，９−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−９−ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−５α−ｍｅｔｈｙｌ−６−（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙ−６−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−ｐｙｒａｎ−２−ｙｌ）ｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−２Ｈ−１，４−ｍｅｔｈａｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａ［ｄ］ｏｘｅｐｉｎ−２−ｏｎｅ）であり、これは化学式５によって示される。

【化5】

【0017】

本発明の実施例において、化学式１を有する活性成分は上述の化合物１、化合物２、化合物４、化合物７の内の一者、二者、三者または全てを含むことができるが、好ましい実施例における活性成分は、化合物１及び化合物２を含み、且つ化合物１の含有量は化合物２の含有量より大きい。その場合、化合物１及び化合物２の抽出物内における含有量の比率は３：１〜１０：１である。実施例において、化学式１を有する活性成分が抽出物Ａ−２に占める重量比は１２〜２０％である。

【0018】

本発明の実施例において、抽出物Ａ−２は更にアルカロイドを含む。このアルカロイドは化学式６によって示される。

【化6】

【0019】

実施例において、このアルカロイドはデンドロビン（ｄｅｎｄｒｏｂｉｎｅ）（Ｒ＝Ｈ）（以下、化合物３と言う）、Ｎ−メチルデンドロビニウム（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｄｅｎｄｒｏｂｉｎｉｕｍ）（Ｒ＝ＣＨ_３）（以下、化合物５と言う）またはＮ−イソペンテニルデンドロビニウム（Ｎ−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｅｎｄｒｏｂｉｎｉｕｍ）（Ｒ＝ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）（以下、化合物６と言う）等である。実施例において、アルカロイドが抽出物Ａ−２に占める重量比は２０〜３５％である。

【0020】

続いて、粗抽出物Ａ、抽出物Ａ−１、抽出物Ａ−２及び活性成分（ピクロトキサン構造を有するセスキテルペン類化合物）について、人間の網膜神経細胞（ＡＲＰＥ−１９）及びラットの視神経節細胞（ＲＧＣ−５）が過酸化水素、低酸素または紫外線照射のそれぞれにより視神経細胞の損傷を起こす状況下での生理活性評価を行う。その内、粗抽出物Ａ、抽出物Ａ−２及び活性成分はアイケア効果を有し、さらに活性成分中の化合物１（ｄｅｎｄｒｏｍｏｎｉｌｉｓｉｄｅ Ｄ）及び化合物２（ｄｅｎｄｒｏｄｅｎｓｉｆｌｏｒｏｌ）は顕著なアイケア効果を有する。本発明の言うアイケア効果とは、視神経細胞の保護、視神経細胞の活性化、または視神経細胞の老化や死亡の抑制といった効果を言う。更に具体的に言えば、セッコク植物の抽出物における活性成分は、フリーラジカルや低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）、紫外線（ＵＶ）によって引き起こされる、例えば白内障、網膜や黄斑部の変性、緑内障といった眼疾患の発生を抑制する。以下に、前述のセッコク抽出物及びその活性成分の生成方法、及び獲得される抽出物によりもたらされるアイケア効果に関する実験について記載する。

【0021】

（実験方法）
（一）成分の抽出及び分析
まず生育一年の金釵セッコク（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ．）の地上茎を刻み、５０℃、６０％のアルコール／水で抽出して一晩寝かせ、抽出液を減圧濃縮することで粗抽出物Ａを獲得する。次に粗抽出物Ａをマクロ孔質樹脂ダイヤイオンＨＰ２０吸着剤に置き、水で溶離した後の溶離液を濃縮して抽出物Ａ−１を獲得し、次に吸着剤により３０−７０％のアルコール／水で溶離し、当該溶離液をさらに減圧濃縮することで抽出物Ａ−２を獲得する。そして抽出物Ａ−２にＩＣＰ‐ＭＳ分析用吸着剤セファデックスＬＨ−２０及びＲＰ−１８を用いることでその内の成分を分離し純化合物を得る。

【0022】

上述のセッコク抽出物Ａ−２は、液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）によりその断面図が分析される。図６、即ちセッコク抽出物Ａ−２の液体クロマトグラフィー／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）による断面図を参照すると、セスキテルペン類成分が含まれることが確認でき、このセスキテルペン成分には、２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（化合物１；ｄｅｎｄｒｏｍｏｎｉｌｉｓｉｄｅ Ｄ ）（滞留時間，１６．４５９分）や、２β，３β，１１，１２−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ（化合物２；ｄｅｎｄｒｏｄｅｎｓｉｆｌｏｒｏｌ）（滞留時間，２０．４１０分）、２β，３β，１１，１３−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（化合物４；ｄｅｎｄｒｏｎｏｂｉｌｏｌｉｓｉｄｅ Ａ）（滞留時間，１８．３７５分）や、２β，３β，４，１１−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｒｏｔｏｘａｎｐｉｃｒｏｔｏｘａｎ−３（１５）−ｏｌｉｄｅ １１−Ｏ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（化合物７；ｄｅｎｄｒｏｓｉｄｅ Ｇ）（滞留時間，２０．７６７分）等がある。また、アルカロイド類化合物も含まれており、このアルカロイド類化合物には、Ｎ−メチルデンドロビニウム（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｄｅｎｄｒｏｂｉｎｉｕｍ）（化合物５）（滯留時間，１８．６３３分）、デンドロビン（ｄｅｎｄｒｏｂｉｎｅ）（化合物３）（滯留時間，１９．８９４分）及びＮ−イソペンテニルデンドロビニウム（Ｎ−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ ｄｅｎｄｒｏｂｉｎｉｕｍ）（化合物６）（滯留時間，３３．０２４分）等が含まれる。

【0023】

また、ＬＣ／ＭＳ分析の条件は、以下の通りである。
・機器：Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−２０４０ Ｃ，ＬＣ／ＭＳ２０２０
・吸着剤：Ｐｕｒｏｓｐｈｅｒ（登録商標）ＳＴＡＲ，ＲＰ−１８ ｅｎｄｃａｐｐｅｄ（２μｍ）
・クロマトグラフィー溶剤Ａ：アセトニトリル
・クロマトグラフィー溶剤Ｂ：０．１％ギ酸
・分析の流れ：０−２分，１−５％Ａ；２−８分，５−１０％Ａ；８−１８分，１０−１５％Ａ；１８−２０分，１５％Ａ；２０−２５分，１５−２０％Ａ；２５−３０分，２０−３０％Ａ；３０−３５分，３０％Ａ；３５−４０分，３０−７０％Ａ；４０−４５分，７０％Ａ
・注射量：１μｌ
・流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ

【0024】

（二）視神経細胞の活性に関する実験
１．細胞株とその培養
当実験では人間の網膜神経細胞株（ＡＲＰＥ−１９）及びラットの視神経節細胞株（ＲＧＣ−５）を採用する。ＡＲＰＥ−１９細胞はＤＭＥＭ−Ｆ１２培養液内で培養され、培養液内には１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０、２％の炭酸水素ナトリウム及び抗生物質（ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）が含まれる。ラットの視神経節細胞株（ＲＧＣ−５）はＤＭＥＭ培養液内で培養され、培養液内には１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び抗生物質（ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）が含まれる。

【0025】

２．過酸化水素、低酸素または紫外線により細胞の損傷を誘発する実験
過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）または紫外線（ＵＶ）照射により、ＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５の細胞の死亡が引き起こされる事に鑑み、本発明では細胞生存率の測定を行っている。測定方法としては、まず細胞を９６ウェル細胞培養プレートに置いて一日待ち、異なる濃度のセッコク抽出物または化合物１乃至４により２４時間の前処理を行った後、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２；５００μＭ）を加えるかまたは低酸素環境内に放置して２４時間培養する。或いは紫外線（ＵＶ；３０μＪ／ｃｍ２）照射を行う場合には、連続で三回の照射を行い（一回の照射は６０秒とし、各回の間隔は６０秒とする）、その後細胞培養ボックス内で２４時間の培養を行う。そしてスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）による呈色法により生存細胞の分析を行う。分析の際は、それぞれのウェルに５０μｌの５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加える（即ち各ウェルには１０％のＴＣＡが含まれる）ことで細胞を固定し、４℃の環境に一時間放置した後、二次水で５回洗い、完全に乾くのを待って、各ウェルに１００μｌの０．４％ＳＲＢを加える（ｗ／ｖ、１％の酢酸に溶ける）ことで６０分間染色し、１％の酢酸で数回洗う。再び完全に乾いた後、１０ｍＭトリス塩基（Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ）溶液によりＳＲＢを抽出し、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒで５４０ｎｍの吸光度を測定し、処理を加えていない統制グループの吸光度を細胞生存率１００％のものとすることで、各処理の百分率を計算する。

【0026】

３．ＵＶＣによりゼブラフィッシュの白内障を引き起こす実験
まず、ゼブラフィッシュをランダムにグループ分けする（毎グループ１２匹とする）。グループは、対照グループ、ＵＶＣ（３００μＪ／ｃｍ^２）照射グループ、及びＵＶＣ照射＋施薬の実験グループとなる。ＵＶＣ照射＋施薬の実験グループは、抽出物Ａ−２をそれぞれ０．４９５、０．９９及び４．９５ｍｇ／ｍｌ与えた三組、そして化合物１をそれぞれ０．１及び１．０ｍＭ与えた二組となる。ゼブラフィッシュには予めセッコク抽出物Ａ−２または化合物１を一週間与え、その後ＵＶＣ照射を行い、ゼブラフィッシュの水晶体の変化を毎日観察する。ＵＶＣ照射の前にゼブラフィッシュに麻酔を施し、ゼブラフィッシュの眼を露出させて、ＵＶＣ（３２５μＪ／ｃｍ^２）に三分間曝す。七日連続でＵＶ実験を行った後、ゼブラフィッシュの水晶体の変化を毎日観察するが、その際ゼブラフィッシュの白内障の深刻度として、水晶体の澄清さの度合いに基づいて１乃至３の白内障レベルを設ける。レベルが高いほど水晶体は混濁している。

【0027】

（実験結果）
１．過酸化水素、低酸素及び紫外線により細胞損傷を誘発する実験の結果
酸素とは一連の酸化作用を通じて、活動に必要なエネルギーを提供するものである。エネルギー生成の過程においてはフリーラジカルが発生し、フリーラジカルは脂肪に作用して過酸化脂質を生成し、更にはＤＮＡ、タンパク質及び細胞膜への酸化傷害を引き起こす。よって酸素が多い組織であるほど高エネルギーの組織となり、所謂「酸化圧力」を伴う。黄斑部はまさに人体において高度な酸化圧力を伴う組織である。故に、酸化圧力が各種眼疾患及び失明の主な原因となる。この他、目の変性を引き起こすもう一つの主な理由として網膜虚血があり、この網膜虚血は網膜周辺の低酸素状態を引き起こすことで細胞を壊死させる。

【0028】

これらに鑑み、本発明では過酸化水素、低酸素または紫外線により損傷を受ける細胞のモデルをそれぞれ定義することで、アイケアの活性を有する細胞の選別に供している。図１及び図２に示すのは、セッコクのアルコール／水粗抽出物Ａ、及び抽出物Ａ−２による、過酸化水素、低酸素及び紫外線照射の下でのＲＧＣ−５及びＡＲＰＥ−１９細胞に対する保護作用における細胞の生存率である。図１に見られる符号＊＊、＃及び＃＃については、符号＊＊は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶを加えず且つ粗抽出物Ａも加えていない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０１である。符号＃は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶの影響下で、粗抽出物Ａ処理を加えたグループと粗抽出物Ａを加えない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０５であり、符号＃＃は、同様の条件での比較で、ｐ＜０．０１である。図２に見られる符号＊＊、＃及び＃＃については、符号＊＊は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶを加えず且つ抽出物Ａ−２も加えない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０１である。符号＃は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶの影響下で、抽出物Ａ−２処理を加えたグループと抽出物Ａ−２を加えない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０５であり、符号＃＃は、同様の条件での比較で、ｐ＜０．０１である。試験結果として、金釵セッコクの粗抽出物Ａ及び抽出物Ａ−２が、ＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５が５００μＭ過酸化水素を加えた状況、または低酸素状況、或いはＵＶ照射による損傷を受けた状況のいずれの状況においても保護作用を備えることが分かった。粗抽出物Ａは１０−１００μｇ／ｍｌの濃度において、過酸化水素、低酸素、ＵＶいずれの状況でも濃度効果を呈し、１００μｇ／ｍｌの濃度においてのみ顕著な活性を有した。抽出物Ａ−２は濃度効果を呈したのみならず、５０μｇ／ｍｌの濃度において顕著な活性を有し、尚且つ粗抽出物Ａに比べ高い保護活性を示した。

【0029】

２．セッコクの成分が有する細胞保護活性
図３に示すのは、金釵セッコク活性成分の化合物１（図内ではｃｏｍｐｏｕｎｄ １）、化合物２（図内ではｃｏｍｐｏｕｎｄ ２）、化合物３（図内ではｃｏｍｐｏｕｎｄ ３）及びルテイン（図内ではｃｏｍｐｏｕｎｄ ４）による、過酸化水素、低酸素及びＵＶによりＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５細胞が損傷を受ける下での、細胞に対する保護作用を示す細胞生存率である。図３に見られる符号＊＊、＃及び＃＃については、符号＊＊は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶを加えず且つｃｏｍｐｏｕｎｄも加えない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０１である。符号＃は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶの影響下でのｃｏｍｐｏｕｎｄ処理を加えたグループと、ｃｏｍｐｏｕｎｄを加えない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０５であり、符号＃＃は、同様の条件での比較で、ｐ＜０．０１である。図３に示すように、セッコクから分離した主にセスキテルペン純化合物の化合物１は、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、低酸素（Ｈｙｐｏｘｉａ）及び紫外線（ＵＶ）のいずれの処理下においても、ＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５細胞の損傷に対し保護活性を有し、その保護活性はルテイン（図内ではｃｏｍｐｏｕｎｄ ４）よりも優れていた。もう一方のセスキテルペン成分の化合物２も、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）及び紫外線（ＵＶ）に対し保護作用を有し、その保護活性はルテイン（図内ではｃｏｍｐｏｕｎｄ ４）と同等であった。対照的に、セッコクの指標成分であるデンドロビン（化合物３）（図内ではｃｏｍｐｏｕｎｄ ３）は保護活性を有さなかった。

【0030】

図４に示すのは、異なる濃度におけるセッコク活性成分の化合物１による、過酸化水素、低酸素またはＵＶによりＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５細胞が損傷を受ける下での細胞生存率である。図４に見られる符号＊＊、＃及び＃＃については、符号＊＊は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶを加えず且つ化合物１（ｃｏｍｐｏｕｎｄ １）も加えない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０１である。符号＃は、Ｈ_２Ｏ_２またはＨｙｐｏｘｉａまたはＵＶの影響下で、化合物１処理を加えたグループと、化合物１を加えない対照グループとの比較を表し、ｐ＜０．０５であり、符号＃＃は、同様の条件での比較で、ｐ＜０．０１である。図４に示すように、活性成分化合物１は更に濃度依存性試験を行っており、１−１０ｍＭ濃度における、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）及び紫外線（ＵＶ）によりＡＲＰＥ−１９及びＲＧＣ−５細胞に引き起こされた損傷に対しては、いずれも濃度依存性の保護反応を呈し、また１０ｍＭ濃度においては８０％以上の保護活性に達し、且つ毒性反応を呈さなかった。

【0031】

３．ＵＶＣによりゼブラフィッシュの白内障を引起こす実験の結果
図５は、金釵セッコク抽出物Ａ−２及び化合物１による、ゼブラフィッシュが紫外線照射を受けて白内障を起こす際の保護作用を示すグラフである。図５に見られる符号＊及び＊＊については、符号＊は、その実験グループと、ＵＶＣを加えた且つセッコク抽出物Ａ−２または化合物１（ｃｏｍｐｏｕｎｄ １）を加えないグループとの比較を表し、ｐ＜０．０５であり、符号＊＊は、その実験グループと、ＵＶＣを加えた且つ抽出物Ａ−２または化合物１の薬品処理を加えたグループとの比較を表し、ｐ＜０．０１である。図５に示すように、紫外線を浴び且つ薬品処理されてないグループは四日目で白内障が起こり、セッコク抽出物Ａ−２を与えられた場合は、四日目または七日目に関わらず、０．４９５−４．９５ｍｇ／ｍｌの濃度において、明らかな白内障発生の抑制がみられた。活性成分化合物１については、０．１及び１．０ｍＭの濃度において白内障発生の顕著な抑制がみられ、特に１．０ｍＭの濃度においては四日目では殆ど白内障の発生が見られなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】