特許 6972291 核酸増幅方法、核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6972291

(24)【登録日】2021年11月5日

(45)【発行日】2021年11月24日

(54)【発明の名称】核酸増幅方法、核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキット

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6853 20180101AFI20211111BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALI20211111BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20211111BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6853 ZZNA

   C12Q1/6876 Z

   !C12N15/113 Z

【請求項の数】14

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2020-215698(P2020-215698)

(22)【出願日】2020年12月24日

【審査請求日】2021年6月21日

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】000120456

【氏名又は名称】栄研化学株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110001047

【氏名又は名称】特許業務法人セントクレスト国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】浅野 良則

(72)【発明者】

【氏名】毛利 勇太

(72)【発明者】

【氏名】中里 浩章

(72)【発明者】

【氏名】納富 継宣

【審査官】 中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０２６６４１８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１８−１５３１５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１１１９６１７３０（ＣＮ，Ａ）

【文献】 Analytica Chimica Acta, 2020.06.17, vol. 1126, pp. 1-6

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸を増幅する方法であり、
下記の構造（ａ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−３’・・・（ａ）
［ここで、Ｎ３ｃは標的核酸の標的領域の３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＢＬは塩基配列Ｂ２を含むループ領域を示し、Ｂ１ｃとＢ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含むＢｗアダプタープライマーと、前記標的領域とをアニールさせ、Ｂｗアダプタープライマーの３’末端を起点として前記標的領域の５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を合成し、前記標的領域の相補鎖の５’末端にステムループ構造が付加された下記の構造（ｂ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−３’・・・（ｂ）
［ここで、Ｎ５ｃは前記標的領域の５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を示し、Ｎ３ｃ及びＮ５ｃを含む塩基配列は標的領域と相補的な塩基配列Ｎｃを示す。］
からなる第一の鋳型核酸を得る工程Ａと、
下記の構造（ｃ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’−３’・・・（ｃ）
［ここで、Ｎ５’は第一の鋳型核酸の塩基配列Ｎ５ｃと相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＦＬは塩基配列Ｆ２を含むループ領域を示し、Ｆ１ｃとＦ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含み、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているＦｗアダプターヌクレオチドと、第一の鋳型核酸とをアニールさせ、第一の鋳型核酸の３’末端を起点としてＦｗアダプターヌクレオチドの相補鎖を合成し、第一の鋳型核酸の３’末端にステムループ構造が付加された下記の構造（ｄ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−Ｆ１ｃ−ＦＬｃ−Ｆ１−３’・・・（ｄ）
［ここで、ＦＬｃはＦｗアダプターヌクレオチドのＦＬと相補的な塩基配列を示す。］
からなる第二の鋳型核酸を得る工程Ｂと、
第二の鋳型核酸を鋳型として、下記の構造（ｅ）：
５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’・・・（ｅ）
を含むＦｗインナープライマーと下記の構造（ｆ）：
５’−Ｂ１ｃ−Ｂ２−３’・・・（ｆ）
を含むＢｗインナープライマーとを用いて、ＬＡＭＰ法により第二の鋳型核酸の塩基配列Ｎｃを増幅する工程Ｃと、
を含むことを特徴とする、核酸増幅方法。

【請求項2】

塩基配列Ｎｃの長さが１０〜１００塩基長であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸増幅方法。

【請求項3】

前記標的核酸がｍｉＲＮＡであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の核酸増幅方法。

【請求項4】

工程Ａと工程Ｂとが同一反応系で進行することを特徴とする、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法。

【請求項5】

工程Ｂの後、かつ、工程Ｃの前に、工程Ｂの反応産物を８５℃以上に加熱する熱処理工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法。

【請求項6】

工程Ｃの後に、塩基配列Ｎｃの少なくとも一部、又は、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブを用いて塩基配列Ｎｃを検出する検出工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法。

【請求項7】

前記プローブにおいて、塩基配列Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さが５塩基長以下であることを特徴とする、請求項６に記載の核酸増幅方法。

【請求項8】

前記プローブの全長の塩基配列が、塩基配列Ｎ３ｃ又は塩基配列Ｎ５ｃのいずれかに全て含まれないことを特徴とする、請求項６に記載の核酸増幅方法。

【請求項9】

請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法に用いるためのプライマーセットであり、
下記の構造（ａ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−３’・・・（ａ）
［ここで、Ｎ３ｃは標的核酸の標的領域の３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＢＬは塩基配列Ｂ２を含むループ領域を示し、Ｂ１ｃとＢ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含むＢｗアダプタープライマーと、
下記の構造（ｃ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’−３’・・・（ｃ）
［ここで、Ｎ５’は第一の鋳型核酸の塩基配列Ｎ５ｃと相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＦＬは塩基配列Ｆ２を含むループ領域を示し、Ｆ１ｃとＦ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含み、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているＦｗアダプターヌクレオチドと、
を備えることを特徴とする、核酸増幅方法用プライマーセット。

【請求項10】

下記の構造（ｅ）：
５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’・・・（ｅ）
を含むＦｗインナープライマーと、
下記の構造（ｆ）：
５’−Ｂ１ｃ−Ｂ２−３’・・・（ｆ）
を含むＢｗインナープライマーと、
をさらに備えることを特徴とする、請求項９に記載の核酸増幅方法用プライマーセット。

【請求項11】

請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法に用いるためのキットであり、請求項９又は１０に記載のプライマーセットを備えることを特徴とする、核酸増幅方法用キット。

【請求項12】

塩基配列Ｎｃの少なくとも一部、又は、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブをさらに備えることを特徴とする、請求項１１に記載の核酸増幅方法用キット。

【請求項13】

前記プローブにおいて、塩基配列Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さが５塩基長以下であることを特徴とする、請求項１２に記載の核酸増幅方法用キット。

【請求項14】

前記プローブの全長の塩基配列が、塩基配列Ｎ３ｃ又は塩基配列Ｎ５ｃのいずれかに全て含まれないことを特徴とする、請求項１２に記載の核酸増幅方法用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、核酸増幅方法、核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキットに関し、より詳しくは、核酸増幅方法、並びに、これに用いる核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキットに関する。

【背景技術】

【0002】

断片ＤＮＡやｍｉＲＮＡ等の短鎖核酸の検出には、従来、マイクロアレイ上に固定したプローブによって核酸を捕捉して検出するマイクロアレイ法が主に用いられているが、かかるマイクロアレイ法は、操作が複雑であることや、用いる装置が高価であるといった課題を有している。

【0003】

他方、簡便性や経済性の観点から、短鎖核酸の検出にもＰＣＲ等の核酸増幅方法を用いることが検討されている。このような核酸増幅方法としては、例えば、米国特許出願公開第２００９／０２２０９６９号明細書（特許文献１）において、ｍｉＲＮＡにポリＡを付加してからＰＣＲによってこれを増幅する方法（Ｐｏｌｙ−Ａ Ｔａｉｌｉｎｇ）が記載されている。また、例えば、米国特許出願公開第２００５／０２６６４１８号明細書（特許文献２）には、ｍｉＲＮＡにリンカープローブをハイブリダイズさせてステムループ構造を付加してからＰＣＲによってこれを増幅する方法が記載されている。

【0004】

さらに、例えば、特開２０１８−１５３１５７号公報（特許文献３）には、標的ＲＮＡを増幅する方法として、当該標的ＲＮＡを逆転写し、伸長化させた後に、これを増幅する方法が記載されており、前記増幅方法としては、その一例としてＬＡＭＰ法が挙げられている。特許文献３に記載の方法において、かかるＬＡＭＰ法のために設計された逆転写プライマー及び伸長化プライマーは、Ｂ２配列及びＢ１ｃ配列を含むＢＩＰプライマーと、Ｆ２配列及びＦ１ｃ配列を含むＦＩＰプライマーと、Ｂ３配列を含むＢ３プライマーと、Ｆ３配列を含むＦ３プライマーと、の組み合わせであるＬＡＭＰプライマーセットに基づいて、前記逆転写プライマーがＢ１配列、Ｂ２配列、及びＢ３配列をこの順で含み、かつ、前記伸長化プライマーがＦ１配列、Ｆ２配列、及びＦ３配列をこの順で含む構造となっている。

【0005】

また、例えば、Ａ．Ａ．Ａｂｄｕｌｌａｈ ＡＬ−ｍａｓｋｒｉら，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １１２６，２０２０，１−６（非特許文献１）には、ステムループ構造を有する逆転写プライマー（ＳＬ ｐｒｏｂｅ）及び伸長化プライマー（ＰＳ−Ｈ ｐｒｏｂｅ）を用いて、標的ＲＮＡを逆転写し、伸長化させた後に、これをＬＡＭＰ法によって増幅する方法が記載されている。非特許文献１に記載の方法において、前記逆転写プライマーは、Ｆ１ｃ配列、Ｆ２配列、及びＦ１配列をこの順で含み、かつ、前記伸長化プライマーは、Ｂ１ｃ配列、Ｂ２配列、及びＢ１配列をこの順で含み、いずれもステムループ構造を形成する。また、非特許文献１に記載の方法では、前記伸長化プライマーのＢ１ｃ配列及びＢ２配列がホスホロチオエート化されており、伸長化後、当該ホスホロチオエート化されたＢ１ｃ配列及びＢ２配列において二本鎖が解離してＳｅｌｆ−ｆｏｌｄｉｎｇし、両端にステムループ構造を形成するため、ＬＡＭＰ法のためのアウタープライマーを必要としない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】米国特許出願公開第２００９／０２２０９６９号明細書

【特許文献2】米国特許出願公開第２００５／０２６６４１８号明細書

【特許文献3】特開２０１８‐１５３１５７号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Ａ．Ａ．Ａｂｄｕｌｌａｈ ＡＬ−ｍａｓｋｒｉら，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ １１２６，２０２０，１−６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

しかしながら、特許文献１〜２に記載されているように核酸をＰＣＲによって増幅する方法では、特に血液や体液を検体として短鎖核酸を検出する場合に、感度や特異性が十分ではないといった課題を有していた。また、特許文献３に記載されているような方法では、標的ＲＮＡを逆転写し、伸長化させた後の構造がリニア構造となるが、このような構造では、ＬＡＭＰ法を用いた核酸増幅において、増幅産物の検出感度や特異性が十分ではないといった課題を有していることを本発明者らは見出した。他方、非特許文献１に記載されている、標的ＲＮＡを逆転写し、伸長化させた後の構造がステムループ構造となる方法では、感度は向上するものの、ステップ数も多く、簡便性に劣るといった課題を有している。

【0009】

本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、断片ＤＮＡやｍｉＲＮＡ等の短鎖核酸であっても、それを鋳型として簡便かつ特異的に核酸を増幅することができる核酸増幅方法、並びに、これに用いる核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキットを提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ステムループ構造を有するＢｗアダプタープライマーを用い、逆転写反応又は伸長化反応によって標的核酸の標的領域の相補鎖を合成させた後、ステムループ構造を有し、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされたＦｗアダプターヌクレオチドを用いてさらにその相補鎖を合成させることにより、前記標的領域の相補鎖の両末端にステムループ構造が付加されたダンベル構造を簡便かつ特異的に形成できることを見出した。また、これを鋳型としてＬＡＭＰプライマーを作用させ、ＬＡＭＰ法を行うことにより、前記標的核酸が断片ＤＮＡやｍｉＲＮＡ等の短鎖核酸であっても、非特異増幅が十分に抑制され、特異的に標的領域に対応する核酸を増幅することが可能となることも見出した。さらに、上記のように鋳型の合成を簡便かつ特異的に行えることに加えて、その後のＬＡＭＰ法は複雑な温度やサイクルの制御が不要な方法であるため、かかる方法によれば、従来よりもより簡便に核酸増幅を行うことが可能であることも見出し、本発明を完成するに至った。

【0011】

かかる知見により得られた本発明の態様は以下のとおりである。
［１］
核酸を増幅する方法であり、
下記の構造（ａ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−３’・・・（ａ）
［ここで、Ｎ３ｃは標的核酸の標的領域の３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＢＬは塩基配列Ｂ２を含むループ領域を示し、Ｂ１ｃとＢ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含むＢｗアダプタープライマーと、前記標的領域とをアニールさせ、Ｂｗアダプタープライマーの３’末端を起点として前記標的領域の５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を合成し、前記標的領域の相補鎖の５’末端にステムループ構造が付加された下記の構造（ｂ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−３’・・・（ｂ）
［ここで、Ｎ５ｃは前記標的領域の５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を示し、Ｎ３ｃ及びＮ５ｃを含む塩基配列は前記標的領域と相補的な塩基配列Ｎｃを示す。］
からなる第一の鋳型核酸を得る工程Ａと、
下記の構造（ｃ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’−３’・・・（ｃ）
［ここで、Ｎ５’は第一の鋳型核酸の塩基配列Ｎ５ｃと相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＦＬは塩基配列Ｆ２を含むループ領域を示し、Ｆ１ｃとＦ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含み、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているＦｗアダプターヌクレオチドと、第一の鋳型核酸とをアニールさせ、第一の鋳型核酸の３’末端を起点としてＦｗアダプターヌクレオチドの相補鎖を合成し、第一の鋳型核酸の３’末端にステムループ構造が付加された下記の構造（ｄ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−Ｆ１ｃ−ＦＬｃ−Ｆ１−３’・・・（ｄ）
［ここで、ＦＬｃはＦｗアダプターヌクレオチドのＦＬと相補的な塩基配列を示す。］
からなる第二の鋳型核酸を得る工程Ｂと、
第二の鋳型核酸を鋳型として、下記の構造（ｅ）：
５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’・・・（ｅ）
を含むＦｗインナープライマーと下記の構造（ｆ）：
５’−Ｂ１ｃ−Ｂ２−３’・・・（ｆ）
を含むＢｗインナープライマーとを用いて、ＬＡＭＰ法により第二の鋳型核酸の塩基配列Ｎｃを増幅する工程Ｃと、
を含むことを特徴とする、核酸増幅方法。
［２］
塩基配列Ｎｃの長さが１０〜１００塩基長であることを特徴とする、［１］に記載の核酸増幅方法。
［３］
前記標的核酸がｍｉＲＮＡであることを特徴とする、［１］又は［２］に記載の核酸増幅方法。
［４］
工程Ａと工程Ｂとが同一反応系で進行することを特徴とする、［１］〜［３］のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
［５］
工程Ｂの後、かつ、工程Ｃの前に、工程Ｂの反応産物を８５℃以上に加熱する熱処理工程をさらに含むことを特徴とする、［１］〜［４］のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
［６］
工程Ｃの後に、塩基配列Ｎｃの少なくとも一部、又は、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブを用いて塩基配列Ｎｃを検出する検出工程をさらに含むことを特徴とする、［１］〜［５］のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
［７］
前記プローブにおいて、塩基配列Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さが５塩基長以下であることを特徴とする、［６］に記載の核酸増幅方法。
［８］
前記プローブの全長の塩基配列が、塩基配列Ｎ３ｃ又は塩基配列Ｎ５ｃのいずれかに全て含まれないことを特徴とする、［６］に記載の核酸増幅方法。
［９］
［１］〜［８］のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法に用いるためのプライマーセットであり、
下記の構造（ａ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−３’・・・（ａ）
［ここで、Ｎ３ｃは標的核酸の標的領域の３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＢＬは塩基配列Ｂ２を含むループ領域を示し、Ｂ１ｃとＢ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含むＢｗアダプタープライマーと、
下記の構造（ｃ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’−３’・・・（ｃ）
［ここで、Ｎ５’は第一の鋳型核酸の塩基配列Ｎ５ｃと相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＦＬは塩基配列Ｆ２を含むループ領域を示し、Ｆ１ｃとＦ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含み、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているＦｗアダプターヌクレオチドと、
を備えることを特徴とする、核酸増幅方法用プライマーセット。
［１０］
下記の構造（ｅ）：
５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’・・・（ｅ）
を含むＦｗインナープライマーと、
下記の構造（ｆ）：
５’−Ｂ１ｃ−Ｂ２−３’・・・（ｆ）
を含むＢｗインナープライマーと、
をさらに備えることを特徴とする、［９］に記載の核酸増幅方法用プライマーセット。
［１１］
［６］〜［８］のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法に用いるためのプローブであり、
塩基配列Ｎｃの少なくとも一部、又は、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズすることを特徴とする、プローブ。
［１２］
塩基配列Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さが５塩基長以下であることを特徴とする、［１１］に記載のプローブ。
［１３］
全長の塩基配列が、塩基配列Ｎ３ｃ又は塩基配列Ｎ５ｃのいずれかに全て含まれないことを特徴とする、［１１］に記載のプローブ。
［１４］
［１］〜［８］のうちのいずれか一項に記載の核酸増幅方法に用いるためのキットであり、［９］又は［１０］に記載のプライマーセットを備えることを特徴とする、核酸増幅方法用キット。
［１５］
［１１］〜［１３］のうちのいずれか一項に記載のプローブをさらに備えることを特徴とする、［１４］に記載の核酸増幅方法用キット。

【0012】

なお、本発明の構成によって上記目的が達成される理由は必ずしも定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。すなわち、本発明では、先ず、ＬＡＭＰ法に用いるための鋳型核酸を標的核酸を基に合成するが、この際、ステムループ構造を有するＢｗアダプタープライマーを用いて標的核酸の標的領域との二量体を形成させるため、スタッキング効果によって当該二量体（例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ、又はＤＮＡ／ＤＮＡホモ）の熱的安定性が増大し、相補鎖合成（逆転写反応又は伸長化反応）が促進されるものと推察される。また、その後、同じくステムループ構造を有するＦｗアダプターヌクレオチドを用いてこれを鋳型としてさらに相補鎖合成を進め、鋳型核酸の構造を、両端にステムループ構造が付加されたダンベル構造とするため、ＬＡＭＰ法における増幅反応が効率よく進む。さらにこのとき、上記のＦｗアダプターヌクレオチドの３’末端に伸長化阻害修飾がなされているため、ＢｗアダプタープライマーとＦｗアダプターヌクレオチドとのミスマッチ伸長による非特異増幅も十分に抑制され、優れた特異性が発揮されるものと推察する。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、断片ＤＮＡやｍｉＲＮＡ等の短鎖核酸であっても、その全長の長さによってプライマー設計が制限されることなく、それを鋳型として簡便かつ特異的に核酸を増幅することができる核酸増幅方法、並びに、これに用いる核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキットを提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】本発明の核酸増幅方法の一形態を示す模式概念図である。

【図2A】試験例２の伸長化反応後の熱処理効果の検証でｍｉＲ−２１−５ｐを用いて得られた蛍光強度−反応時間曲線を示す。（ａ）は熱処理なしの結果を示し、（ｂ）は熱処理ありの結果を示す。

【図2B】試験例２の伸長化反応後の熱処理効果の検証でＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いて得られた蛍光強度−反応時間曲線を示す。（ａ）は熱処理なしの結果を示し、（ｂ）は熱処理ありの結果を示す。

【図3A】試験例３のＦｗアダプターヌクレオチドの３’末端リン酸化効果の検証でｍｉＲ−２１−５ｐを用いて得られた蛍光強度−反応時間曲線を示す。（ａ）はリン酸化なしの結果を示し、（ｂ）はリン酸化ありの結果を示す。

【図3B】試験例３のＦｗアダプターヌクレオチドの３’末端リン酸化効果の検証でＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いて得られた蛍光強度−反応時間曲線を示す。（ａ）はリン酸化なしの結果を示し、（ｂ）はリン酸化ありの結果を示す。

【図4A】試験例４の蛍光消光プローブ検出でｍｉＲ−２１−５ｐを用いて得られた融解曲線を示す。（ａ）はｍｉＲ−２１−５ｐ領域設計プローブを用いたときの結果を示し、（ｂ）はループ領域設計プローブを用いたときの結果を示す。

【図4B】試験例４の蛍光消光プローブ検出でＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いて得られた融解曲線を示す。（ａ）はＬｅｔ−７ａ−５ｐ領域設計プローブを用いたときの結果を示し、（ｂ）はループ領域設計プローブを用いたときの結果を示す。

【図5】試験例５のプローブ設計領域の検証で得られた融解曲線を示す。（ａ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−１、（ｂ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−２、（ｃ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−３、（ｄ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−４、（ｅ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−５、（ｆ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−６、（ｇ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−７、（ｈ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−８、の各蛍光消光プローブを用いたときの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下、本発明の好ましい実施形態を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

【0016】

＜核酸増幅方法＞
本発明の核酸増幅方法は、
下記の構造（ａ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−３’・・・（ａ）
［ここで、Ｎ３ｃは標的核酸の標的領域の３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＢＬは塩基配列Ｂ２を含むループ領域を示し、Ｂ１ｃとＢ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含むＢｗアダプタープライマーと、前記標的領域とをアニールさせ、Ｂｗアダプタープライマーの３’末端を起点として前記標的領域の５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を合成し、前記標的領域の相補鎖の５’末端にステムループ構造が付加された下記の構造（ｂ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−３’・・・（ｂ）
［ここで、Ｎ５ｃは前記標的領域の５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を示し、Ｎ３ｃ及びＮ５ｃを含む塩基配列は前記標的領域と相補的な塩基配列Ｎｃを示す。］
からなる第一の鋳型核酸を得る工程Ａと、
下記の構造（ｃ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’−３’・・・（ｃ）
［ここで、Ｎ５’は第一の鋳型核酸の塩基配列Ｎ５ｃと相補的な塩基配列からなるアニール領域を示し、ＦＬは塩基配列Ｆ２を含むループ領域を示し、Ｆ１ｃとＦ１とは互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。］
を含み、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているＦｗアダプターヌクレオチドと、第一の鋳型核酸とをアニールさせ、第一の鋳型核酸の３’末端を起点としてＦｗアダプターヌクレオチドの相補鎖を合成し、第一の鋳型核酸の３’末端にステムループ構造が付加された下記の構造（ｄ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−Ｆ１ｃ−ＦＬｃ−Ｆ１−３’・・・（ｄ）
［ここで、ＦＬｃはＦｗアダプターヌクレオチドのＦＬと相補的な塩基配列を示す。］
からなる第二の鋳型核酸を得る工程Ｂと、
第二の鋳型核酸を鋳型として、下記の構造（ｅ）：
５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’・・・（ｅ）
を含むＦｗインナープライマーと下記の構造（ｆ）：
５’−Ｂ１ｃ−Ｂ２−３’・・・（ｆ）
を含むＢｗインナープライマーとを用いて、ＬＡＭＰ法により第二の鋳型核酸の塩基配列Ｎｃを増幅する工程Ｃと、
を含む、核酸を増幅する方法である。

【0017】

以下、本発明の核酸増幅方法の好ましい形態について、場合により図１を参照しながら例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。図１は、本発明の核酸増幅方法の一形態を示す模式概念図である。なお、以下の説明及び図面中、同一又は相当する要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。

【0018】

（標的核酸）
本発明において、「標的核酸」とは、下記の核酸増幅方法によって検出する目的の標的領域を含みうる核酸である。また、本発明において、「核酸」とは、デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドが混在するポリヌクレオチドを示し、断片であっても、その全部又は一部が修飾されたものであっても、その全部又は一部に非天然型のヌクレオチドや特定の配列を含むものであってもよい。前記修飾としては、例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡのメチル化や脱アミノ化；ラジオアイソトープ、結合性リガンド（ビオチン、ジゴキシン等）による標識が挙げられる。前記非天然型のヌクレオチドとしては、例えば、ＰＮＡ（ｐｏｌｙａｍｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（登録商標、ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（登録商標、２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）が挙げられる。また、これら核酸としては、下記のＢｗアダプタープライマーがアニールしうるものであれば特に制限されず、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造等の３次元構造を有するものであってもよい。これらの中でも、本発明に係る標的核酸としては、本発明の核酸増幅方法を特に有効に適用することができる観点からは、断片核酸（断片ＤＮＡ、断片ＲＮＡ等）、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等の短鎖核酸であることが好ましく、ｍｉＲＮＡであることがより好ましい。なお、「ｍｉＲＮＡ」は、通常、２０〜２５塩基長の一本鎖ＲＮＡ分子を示し、タンパク質には翻訳されず、真核生物において、主に、遺伝子の転写後の発現調節に関与するといわれている。

【0019】

このような標的核酸としては、特に制限されず、当該標的核酸を含みうる試料から抽出されたものであっても、人工的に合成されたものであってもよい。前記標的核酸を含みうる試料としても特に制限されず、例えば、化学合成した核酸を含む溶液の他、各種生物（細胞、組織、器官、個体を含む）及びその抽出液；ヒト及び動物の体液（唾液、涙、汗、尿、血液、リンパ液等）；植物生体液；生物培養液；環境中の水（河川、湖沼、港湾、水路、地下水、浄水、下水、排水等）；固形物（土壌、燃え殻等）の懸濁液等を目的に応じて適宜用いることができる。また、前記試料としては、適宜、希釈液で適宜希釈又は懸濁したものであっても、ｐＨ調整したものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グッド緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が挙げられる。前記試料から標的核酸を抽出する方法としては、適宜公知の方法を採用することができる。

【0020】

（標的領域）
本発明において、「標的領域」とは、前記標的核酸上の、本発明の核酸増幅方法によって検出することを目的とする領域を示し、前記標的核酸が断片ＤＮＡやｍｉＲＮＡ等の短鎖核酸である場合、当該標的領域は、前記標的核酸の全部であってもよい。また、下記の工程Ａにおいては、一本鎖又は動的平衡状態にある二本鎖であることが好ましい。下記のＢｗアダプタープライマー及びＦｗアダプターヌクレオチドとの対応を示すために、以下場合により、便宜的に、標的領域を「標的領域Ｎ」とし、その５’末端側の塩基配列を「塩基配列Ｎ５」、３’末端側の塩基配列を「塩基配列Ｎ３」とする。また、標的領域Ｎは、塩基配列Ｎ５及び塩基配列Ｎ３からなるもの（すなわち、Ｎ＝５’−Ｎ５−Ｎ３−３’）、又は、塩基配列Ｎ５と塩基配列Ｎ３との間に介在塩基配列を含むもの（すなわち、Ｎ＝５’−Ｎ５−介在塩基配列−Ｎ３−３’）であるものとする。

【0021】

本発明に係る標的領域Ｎの長さとしては、通常、５〜５，０００塩基長である。また、本発明の核酸増幅方法は、直接増幅することが困難な短鎖核酸に対しても好適に実施することができるため、標的領域Ｎの長さが、１０〜１００塩基長、さらには、２０〜５０塩基長、あるいは２０〜２５塩基長であっても、検出の目的とすることが可能である。

【0022】

（Ｂｗアダプタープライマー）
本発明に係る「Ｂｗアダプタープライマー」は、下記の構造（ａ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−３’・・・（ａ）
を含むプライマーである。

【0023】

構造（ａ）中、「Ｎ３ｃ」は、前記標的核酸の標的領域Ｎ（図１では、１１）の３’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列からなるアニール領域（図１では、２４）を示す。なお、本明細書中、Ｂｗアダプタープライマーのアニール領域Ｎ３ｃがアニールする対象となる標的領域Ｎ上の塩基配列を「塩基配列Ｎ３」という。これにより、Ｂｗアダプタープライマー（図１では、２０）が標的領域Ｎの塩基配列Ｎ３とアニール（本明細書中、「ハイブリダイズ」もアニールと同義で用いる）して二量体を形成する。

【0024】

本発明において、ある配列に対して「相補的な塩基配列」とは、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成可能な塩基配列であればよく、完全に相補的でなくともよい。本発明において、かかるハイブリダイズの条件としては、「塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが二本鎖を形成可能」又は「塩基配列Ｘが塩基配列Ｙに対して相補的な塩基配列である」という場合、塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとの配列相補性としては、８０％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることが好ましい。なお、前記配列相補性は、当業者であれば公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いて適宜計算することができる。

【0025】

また、本発明において、前記ハイブリダイズの条件としては、「塩基配列Ｘと塩基配列Ｙとが二本鎖を形成可能」又は「塩基配列Ｘが塩基配列Ｙに対して相補的な塩基配列である」という場合、塩基配列Ｘは、塩基配列Ｙの全長に対して完全に相補的な塩基配列の１〜複数個所において、連続して１〜５塩基（好ましくは１〜３塩基、例えば、３塩基、２塩基、１塩基）の塩基が挿入、欠失、又は置換されたものであってもよい。

【0026】

このようなアニール領域Ｎ３ｃを構成する塩基配列は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、目的の標的領域Ｎ及び塩基配列Ｎ３の塩基配列に合わせて、より好ましくは他の領域にハイブリダイズすることがないように、適宜設計することができる。

【0027】

本発明に係るアニール領域Ｎ３ｃの長さとしては、５〜２００塩基長であることが好ましく、５〜５０塩基長であることがより好ましい。

【0028】

構造（ａ）中、「ＢＬ」は塩基配列Ｂ２を含むループ領域を示す。塩基配列Ｂ２は、下記のＢｗインナープライマーを第二の鋳型核酸の相補鎖（第三の鋳型核酸）にアニールさせるために設計される配列である。またこれにより、標的領域Ｎの相補鎖の５’末端側に当該ループ領域ＢＬからなるループ構造が付加される。

【0029】

ループ領域ＢＬとしては、下記のＢｗインナープライマーに対応する塩基配列Ｂ２のみからなる領域であっても、その５’末端側及び／又は３’末端側にスペーサー配列（スペーサーＢＳ）を含む領域であってもよい。図１では、ループ領域ＢＬの一例として、塩基配列Ｂ２（図１では、２２１）と、その３’末端側のスペーサーＢＳ（図１では、２２２）とからなる構成を示すが、これに限定されるものではない。

【0030】

ループ領域ＢＬがスペーサーＢＳを含む場合、そのスペーサーＢＳの長さ（塩基配列Ｂ２の５’末端側及び３’末端側の両端にある場合にはそれらの長さの合計）としては、１〜５００塩基長であることが好ましく、１〜１００塩基長であることが好ましく、１０〜７０塩基長であることがより好ましい。

【0031】

また、塩基配列Ｂ２の長さとしては、５〜２００塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましい。

【0032】

さらに、ループ領域ＢＬの長さは、スペーサーＢＳを含まない場合には塩基配列Ｂ２の長さに、スペーサーＢＳを含む場合にはスペーサーＢＳの長さ及び塩基配列Ｂ２の長さの合計に、それぞれ相当するが、５〜３００塩基長であることがより好ましく、２０〜１２０塩基長であることがさらに好ましい。ループ領域ＢＬの長さが前記下限未満であると、ステムループ構造が形成されなくなったり安定性が低下したりする傾向にあり、他方、前記上限を超えると、自己アニールが優先的に行われなくなって他のプライマー等とのミスマッチが生じやすくなる傾向にある。

【0033】

構造（ａ）中、「Ｂ１ｃ」と「Ｂ１」とは、互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。ステム領域Ｂ１ｃとステム領域Ｂ１とは、互いにハイブリダイズしてステム構造（二本鎖）を形成するように設計される相補的な塩基配列である。またこれにより、標的領域Ｎの相補鎖の５’末端側に、ループ領域ＢＬ、並びに、ステム領域Ｂ１ｃ及びステム領域Ｂ１からなるステムループ構造が付加される。

【0034】

ステム領域Ｂ１ｃ及びステム領域Ｂ１としては、互いに二本鎖を形成可能な塩基配列が含まれていればよく、ステム領域Ｂ１ｃの５’末端側及び／又はステム領域Ｂ１の３’末端側に二本鎖を形成しない塩基配列（介在塩基配列）が含まれていてもよい。ただし、このような介在塩基配列の長さとしては、互いに独立して、５塩基長以下であることが好ましく、３塩基長以下であることがより好ましい。

【0035】

ステム領域Ｂ１ｃとステム領域Ｂ１との間で二本鎖を形成可能な塩基配列の長さとしては、互いに、５〜２００塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましい。前記長さが前記下限未満であると、ステムループ構造が形成されなくなったり安定性が低下したりする傾向にあり、他方、前記上限を超えると、自己アニールが優先的に行われなくなって他のプライマー等とのミスマッチが生じやすくなる傾向にある。

【0036】

さらに、ステム領域Ｂ１ｃの全体の長さ及びステム領域Ｂ１の全体の長さは、前記介在塩基配列を含まない場合には前記二本鎖を形成可能な塩基配列の長さに、前記介在塩基配列を含む場合には当該介在塩基配列の長さと前記二本鎖を形成可能な塩基配列の長さとの合計に、それぞれ相当するが、５〜２００塩基長であることがより好ましく、１０〜５０塩基長であることがさらに好ましい。

【0037】

このようなＢｗインナープライマーの塩基配列は、標的領域Ｎ及び塩基配列Ｎ３の塩基配列に基づいて上記ハイブリダイズの条件を満たすように、上記のステムループ構造を形成可能となるように、また、ループ構造に含まれる塩基配列Ｂ２の配列がＢｗインナープライマーが他の領域にハイブリダイズするような配列とならないように、等を勘案して、適宜設計することができる。

【0038】

また、Ｂｗインナープライマーを得る方法としては、特に制限されず、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、市販の合成機によって化学的に合成し、合成ＤＮＡとして製造することができる。また、Ｂｗインナープライマーは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド）のみから構成されていなくともよく、また例えば、前記非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよいが、安定性の観点から、天然又は非天然のデオキシリボヌクレオチドのみから構成されることが好ましい。

【0039】

（第一の鋳型核酸）
本発明に係る「第一の鋳型核酸」は、下記の構造（ｂ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−３’・・・（ｂ）
からなる核酸である。第一の鋳型核酸（図１では、４０）は、Ｂｗアダプタープライマーと、標的領域Ｎ（塩基配列Ｎ３）とをアニールさせ、Ｂｗアダプタープライマーの３’末端を起点として合成された、標的領域Ｎの相補鎖の５’末端にステムループ構造が付加された核酸である。かかる第一の鋳型核酸としては、デオキシリボヌクレオチドからなるものであってもリボヌクレオチドからなるものであってもこれらが混在するものであってもよいが、核酸増幅反応の安定性の観点から、デオキシリボヌクレオチドのみからなるものであることが好ましい。

【0040】

構造（ｂ）中、「Ｎ５ｃ」は、標的領域Ｎの５’末端側の塩基配列Ｎ５と相補的な塩基配列を示し、下記のＦｗアダプターヌクレオチドのアニール領域Ｎ５’がアニールする対象となる塩基配列を示す。Ｎ３ｃ及びＮ５ｃを含む塩基配列は標的領域Ｎと相補的な塩基配列Ｎｃを示す。図１において、塩基配列Ｎ５ｃ（２５）と塩基配列Ｎ３ｃ（２４）とは隣接しているが、塩基配列Ｎｃにおいて、塩基配列Ｎ５ｃと塩基配列Ｎ３ｃとの間には、介在塩基配列（すなわち、塩基配列Ｎ５と塩基配列Ｎ３との間の介在塩基配列と相補的な塩基配列）をさらに含んでいてもよい。

【0041】

（Ｆｗアダプターヌクレオチド）
本発明に係る「Ｆｗアダプターヌクレオチド」は、下記の構造（ｃ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’−３’・・・（ｃ）
を含み、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているヌクレオチドである。

【0042】

構造（ｃ）中、「Ｎ５’」は、第一の鋳型核酸（図１では、４０）の３’末端側の塩基配列Ｎ５ｃ（図１では、２５）と相補的な塩基配列からなるアニール領域（図１では、３４）を示す。これにより、Ｆｗアダプターヌクレオチド（図１では、３０）が第一の鋳型核酸の塩基配列Ｎ５ｃとアニールして二量体を形成する。

【0043】

本発明に係るアニール領域Ｎ５’は、原理的には、標的領域Ｎの塩基配列Ｎ５と同じ配列であるが、例えば、標的領域ＮがＲＮＡであり、かつ、ＦｗアダプターヌクレオチドがＤＮＡである場合には互いに対応する配列であればよい。また、塩基配列Ｎ５ｃとアニール領域Ｎ５’とが上記ハイブリダイズの条件を満たす限り、塩基配列Ｎ５とアニール領域Ｎ５’とは完全に対応する配列でなくともよい。

【0044】

このようなアニール領域Ｎ５’を構成する塩基配列は、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、第一の鋳型核酸及び塩基配列Ｎ５ｃ（あるいは、目的の標的領域Ｎ及び塩基配列Ｎ５）の塩基配列に合わせて、より好ましくは他の領域にハイブリダイズすることがないように、適宜設計することができる。

【0045】

本発明に係るアニール領域Ｎ５’の長さとしては、５〜２００塩基長であることが好ましく、５〜５０塩基長であることがより好ましい。

【0046】

構造（ｃ）中、「ＦＬ」は塩基配列Ｆ２を含むループ領域を示す。塩基配列Ｆ２は、下記のＦｗインナープライマーを第二の鋳型核酸にアニールさせるために設計される配列である。またこれを鋳型とすることにより、第一の鋳型核酸の３’末端側に、当該ループ領域ＦＬと相補的な、下記の塩基配列ＦＬｃからなるループ構造が付加される。

【0047】

ループ領域ＦＬとしては、下記のＦｗインナープライマーに対応する塩基配列Ｆ２のみからなる領域であっても、その５’末端側及び／又は３’末端側にスペーサー配列（スペーサーＦＳ）を含む領域であってもよい。図１では、ループ領域ＦＬの一例として、塩基配列Ｆ２（図１では、３２１）と、その３’末端側のスペーサーＦＳ（図１では、３２２）とからなる構成を示すが、これに限定されるものではない。

【0048】

ループ領域ＦＬがスペーサーＦＳを含む場合、そのスペーサーＦＳの長さ（塩基配列Ｆ２の５’末端側及び３’末端側の両端にある場合にはそれらの長さの合計）としては、１〜５００塩基長であることが好ましく、１〜１００塩基長であることが好ましく、１０〜７０塩基長であることがより好ましい。

【0049】

また、塩基配列Ｆ２の長さとしては、５〜２００塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましい。

【0050】

さらに、ループ領域ＦＬの長さは、スペーサーＦＳを含まない場合には塩基配列Ｆ２の長さに、スペーサーＦＳを含む場合にはスペーサーＦＳの長さ及び塩基配列Ｆ２の長さの合計に、それぞれ相当するが、５〜３００塩基長であることがより好ましく、２０〜１２０塩基長であることがさらに好ましい。ループ領域ＦＬの長さが前記下限未満であると、ステムループ構造が形成されなくなったり安定性が低下したりする傾向にあり、他方、前記上限を超えると、自己アニールが優先的に行われなくなって他のプライマー等とのミスマッチが生じやすくなる傾向にある。

【0051】

構造（ｃ）中、「Ｆ１ｃ」と「Ｆ１」とは、互いに相補的な塩基配列からなる領域であって二本鎖を形成可能なステム領域を示す。ステム領域Ｆ１ｃとステム領域Ｆ１とは、互いにハイブリダイズしてステム構造（二本鎖）を形成するように設計される相補的な塩基配列である。またこれらを鋳型とすることにより、第一の鋳型核酸の３’末端側にループ領域ＦＬと相補的な塩基配列ＦＬｃ、並びに、ステム領域Ｆ１ｃ及びステム領域Ｆ１と相補的な塩基配列（それぞれステム領域Ｆ１及びステム領域Ｆ１ｃ）からなるステムループ構造が付加される。

【0052】

ステム領域Ｆ１ｃ及びステム領域Ｆ１としては、互いに二本鎖を形成可能な塩基配列が含まれていればよく、ステム領域Ｆ１ｃの５’末端側及び／又はステム領域Ｆ１の３’末端側に二本鎖を形成しない塩基配列（介在塩基配列）が含まれていてもよい。ただし、このような介在塩基配列の長さとしては、互いに独立して、５塩基長以下であることが好ましく、３塩基長以下であることがより好ましい。

【0053】

ステム領域Ｆ１ｃとステム領域Ｆ１との間で二本鎖を形成可能な塩基配列の長さとしては、互いに、５〜２００塩基長であることが好ましく、１０〜５０塩基長であることがより好ましい。前記長さが前記下限未満であると、ステムループ構造が形成されなくなったり安定性が低下したりする傾向にあり、他方、前記上限を超えると、前記上限を超えると、自己アニールが優先的に行われなくなって他のプライマー等とのミスマッチが生じやすくなる傾向にある。

【0054】

さらに、ステム領域Ｆ１ｃの全体の長さ及びステム領域Ｆ１の全体の長さは、前記介在塩基配列を含まない場合には前記二本鎖を形成可能な塩基配列の長さに、前記介在塩基配列を含む場合には当該介在塩基配列の長さと前記二本鎖を形成可能な塩基配列との長さの合計に、それぞれ相当するが、５〜２００塩基長であることがより好ましく、１０〜５０塩基長であることがさらに好ましい。

【0055】

このようなＦｗアダプターヌクレオチドの塩基配列は、標的領域Ｎ及び塩基配列Ｎ５の塩基配列に基づく第一の鋳型核酸の塩基配列に基づいて上記ハイブリダイズの条件を満たすように、上記のステムループ構造を形成可能となるように、また、ループ構造に含まれる塩基配列Ｆ２の配列がＦｗインナープライマーが他の領域にハイブリダイズするような配列とならないように、等を勘案して、適宜設計することができる。

【0056】

Ｆｗアダプターヌクレオチドを得る方法としては、特に制限されず、Ｂｗアダプタープライマーを得る方法と同様に従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。また、Ｆｗアダプターヌクレオチドは、天然のヌクレオチドのみから構成されていなくともよく、例えば、前記非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよいが、安定性の観点から、天然又は非天然のデオキシリボヌクレオチドのみから構成されることが好ましい。

【0057】

本発明において、Ｆｗアダプターヌクレオチドは、３’末端に伸長化阻害修飾がなされている。これにより、ＢｗアダプタープライマーとＦｗアダプターヌクレオチドとのミスマッチ伸長による非特異増幅が抑制されるものと考えられる。Ｆｗアダプターヌクレオチドの３’末端の伸長化阻害修飾としては、ヌクレオチドの３’末端の伸長化反応を阻害可能な修飾であれば特に制限されない。例えば、ポリヌクレオチドの末端のリボースの３’位のＯＨ基を、リン酸基等の他の物質に置換する修飾を行うことにより、ポリメラーゼによる伸長化反応を阻害（好ましくは停止）することができるが、これに限定されるものではない。

【0058】

（第二の鋳型核酸）
本発明に係る「第二の鋳型核酸」は、下記の構造（ｄ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−Ｎ５ｃ−Ｆ１ｃ−ＦＬｃ−Ｆ１−３’・・・（ｄ）
からなる核酸である。第二の鋳型核酸（図１では、５０）は、Ｆｗアダプターヌクレオチドと、第一の鋳型核酸とをアニールさせ、第一の鋳型核酸の３’末端を起点として合成された、第一の鋳型核酸の３’末端にステムループ構造が付加された核酸である。かかる第二の鋳型核酸としては、デオキシリボヌクレオチドからなるものであってもリボヌクレオチドからなるものであってもこれらが混在するものであってもよいが、核酸増幅反応の安定性の観点から、デオキシリボヌクレオチドのみからなるものであることが好ましい。

【0059】

構造（ｄ）中、「ＦＬｃ」は、ＦｗアダプターヌクレオチドのＦＬと相補的な塩基配列を示す。そのため、塩基配列ＦＬｃは、ループ領域ＦＬに対応して、塩基配列Ｆ２に相補的な塩基配列（本明細書中、場合により「塩基配列Ｆ２ｃ」という）のみからなる領域であっても、その５’末端側及び／又は３’末端側にスペーサーＦＳに相補的な塩基配列（本明細書中、場合により「塩基配列ＦＳｃ」という）を含む領域であってもよい。図１では、塩基配列ＦＬｃの一例として、塩基配列Ｆ２に相補的な塩基配列Ｆ２ｃ（図１では、３６１）と、その５’末端側の、スペーサーＦＳに相補的な塩基配列ＦＳｃ（図１では、３６２）とからなる構成を示すが、これに限定されるものではない。塩基配列ＦＬｃ、塩基配列Ｆ２ｃ、及び塩基配列ＦＳｃの好ましい態様としては、それぞれ、上記のループ領域ＦＬ、塩基配列Ｆ２、及びスペーサーＦＳにおいて挙げた各好ましい態様に対応する。

【0060】

（Ｆｗインナープライマー）
本発明に係る「Ｆｗインナープライマー」は、下記の構造（ｅ）：
５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’・・・（ｅ）
を含むプライマー（図１では、６０）である。

【0061】

構造（ｅ）中、「Ｆ１ｃ」及び「Ｆ２」は、上記Ｆｗアダプターヌクレオチドにおける「Ｆ１ｃ」及び「Ｆ２」とそれぞれ同義である。これにより、第二の鋳型核酸（図１では、５０）のループ構造上にある塩基配列Ｆ２ｃ（図１では、３６１）に、Ｆｗインナープライマーの塩基配列Ｆ２がアニールし、同Ｆｗインナープライマーの３’末端を起点として、第二の鋳型核酸の相補鎖（第三の鋳型核酸）を合成することができる。

【0062】

このようなＦｗインナープライマーの塩基配列は、Ｆｗアダプターヌクレオチドに対応させて、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、適宜設計することができる。また、Ｆｗインナープライマーを得る方法としては、特に制限されず、Ｂｗアダプタープライマーを得る方法と同様に従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。Ｆｗインナープライマーは、天然のヌクレオチドのみから構成されていなくともよく、例えば、前記非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよいが、安定性の観点から、天然又は非天然のデオキシリボヌクレオチドのみから構成されることが好ましい。

【0063】

（第三の鋳型核酸）
本発明に係る「第三の鋳型核酸」は、下記の構造（ｇ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’’−Ｎ３’’−Ｂ１ｃ−ＢＬｃ−Ｂ１−３’・・・（ｇ）
からなる核酸である（図示せず）。第三の鋳型核酸は、第二の鋳型核酸と、Ｆｗインナープライマーとをアニールさせ、同Ｆｗインナープライマーの３’末端を起点として合成される、第二の鋳型核酸の相補鎖である。

【0064】

構造（ｇ）中、「Ｎ５’’」及び「Ｎ３’’」は、それぞれ、第二の鋳型核酸の塩基配列Ｎ５ｃ及びＮ３ｃと相補的な塩基配列を示し、Ｎ５’’及びＮ３’’を含む塩基配列は、第二の鋳型核酸の塩基配列Ｎｃと相補的な塩基配列Ｎ’’（本明細書中、場合により「塩基配列Ｎｃの相補鎖Ｎ’’」ともいう）を示す。塩基配列Ｎ’’は、原理的には、標的領域Ｎと同じ配列であるが、例えば、標的領域ＮがＲＮＡであり、かつ、第三の鋳型核酸がＤＮＡである場合には互いに対応する配列であればよい。

【0065】

構造（ｇ）中、「ＢＬｃ」は、第二の鋳型核酸のＢＬと相補的な塩基配列を示す。そのため、塩基配列ＢＬｃは、ループ領域ＢＬの塩基配列に対応して、塩基配列Ｂ２に相補的な塩基配列（本明細書中、場合により「塩基配列Ｂ２ｃ」という）のみからなる領域であっても、その５’末端側及び／又は３’末端側にスペーサーＢＳに相補的な塩基配列（本明細書中、場合により「塩基配列ＢＳｃ」という）を含む領域であってもよい。塩基配列ＢＬｃ、塩基配列Ｂ２ｃ、及び塩基配列ＢＳｃの好ましい態様としては、それぞれ、上記のループ領域ＢＬ、塩基配列Ｂ２、及びスペーサーＢＳにおいて挙げた各好ましい態様に対応する。

【0066】

（Ｂｗインナープライマー）
本発明に係る「Ｂｗインナープライマー」は、下記の構造（ｆ）：
５’−Ｂ１ｃ−Ｂ２−３’・・・（ｆ）
を含むプライマー（図示せず）である。

【0067】

構造（ｆ）中、「Ｂ１ｃ」及び「Ｂ２」は、上記Ｂｗアダプタープライマーにおける「Ｂ１ｃ」及び「Ｂ２」とそれぞれ同義である。これにより、第三の鋳型核酸のループ構造上にある塩基配列Ｂ２ｃに、Ｂｗインナープライマーの塩基配列Ｂ２がアニールし、同Ｂｗインナープライマーの３’末端を起点として、さらに第三の鋳型核酸の相補鎖を合成することができる。

【0068】

このようなＢｗインナープライマーの塩基配列は、Ｂｗアダプタープライマーに対応させて、上記ハイブリダイズの条件を満たすように、適宜設計することができる。また、Ｂｗインナープライマーを得る方法としては、特に制限されず、Ｂｗアダプタープライマーを得る方法と同様に従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができる。Ｂｗインナープライマーは、天然のヌクレオチドのみから構成されていなくともよく、例えば、前記非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよいが、安定性の観点から、天然又は非天然のデオキシリボヌクレオチドのみから構成されることが好ましい。

【0069】

Ｂｗアダプタープライマー及びＦｗアダプターヌクレオチドにおいて、アニール領域Ｎ３ｃ及びアニール領域Ｎ５’は、それぞれ、標的領域Ｎの塩基配列に応じて個別に設計する必要があるが、それ以外の領域（ループ領域ＢＬ及びループ領域ＦＬ；ステム領域Ｂ１ｃ、Ｂ１及びステム領域Ｆ１ｃ、Ｆ１等）や、Ｆｗインナープライマー及びＢｗインナープライマーについては、必ずしも標的領域Ｎの塩基配列に応じて設計する必要はなく、多種の標的核酸の検出において、共通の塩基配列とすることができる。したがって、本発明の核酸増幅方法においては、各プライマー及びヌクレオチドの設計において、アニール領域Ｎ３ｃ及びアニール領域Ｎ５’のポリヌクレオチド部分だけを標的領域Ｎの塩基配列に応じて設計すればよく、簡便にプライマーを設計することが可能である。

【0070】

（工程Ａ）
本発明の核酸増幅方法では、先ず、工程Ａとして、Ｂｗアダプタープライマーと、標的領域Ｎ（塩基配列Ｎ３）とをアニールさせ、Ｂｗアダプタープライマーの３’末端を起点として標的領域Ｎの５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を合成し、標的領域Ｎの相補鎖Ｎｃの５’末端にステムループ構造が付加された第一の鋳型核酸を得る（図１では（ａ）及び（ｂ）上段）。

【0071】

工程Ａでは、例えば、前記標的核酸（又は当該標的核酸を含みうる試料）に、Ｂｗアダプタープライマー及び相補鎖合成酵素を添加することにより、目的の標的領域Ｎが存在する場合にはこれにＢｗアダプタープライマーがアニールして、標的領域Ｎの５’末端側の残りの塩基配列と相補的な塩基配列（塩基配列Ｎ５ｃ又は介在塩基配列と塩基配列Ｎ５ｃ）が合成され、第一の鋳型核酸を得ることができる。

【0072】

このとき、前記標的核酸が二本鎖である場合には、これを一本鎖又は動的平衡状態とするために、加熱することが好ましい。この場合には、本発明に係るＢｗアダプタープライマーのアニール領域Ｎ３ｃの塩基配列に基づいて、Ｔｍ（融解温度）を算出し、算出したＴｍよりも低い温度で加熱することが好ましい。

【0073】

前記標的核酸がＲＮＡである場合、標的領域Ｎの相補鎖の合成は、ＲＮＡからＤＮＡを合成する逆転写反応であることが好ましい。前記逆転写反応の場合の相補鎖合成酵素（すなわち、逆転写酵素；図１では、１０１）としては、特に制限されず、例えば、Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）由来組み換え酵素（ＡＭＶ）、Ｃｌｏｎｅｄ ＡＭＶ、ＭＭＬ、ＶＲｅｃｏｎｂｉｎａｎｔ ＨＩＶの逆転写酵素、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶ、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ、Ｏｍｉｎｉｓｃｒｉｐｔ、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔのうちの１種又は２種以上の組み合わせを用いることができるが、これらに限定されるものではない。この場合の反応温度や時間、指摘ｐＨ等の反応条件としては、選択する逆転写酵素に応じて適宜調整することができる。

【0074】

前記標的核酸がＤＮＡである場合、標的領域Ｎの相補鎖の合成は、ＤＮＡを伸長させる伸長化反応であることが好ましい。前記伸長化反応の場合の相補鎖合成酵素（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ）としては、特に制限されず、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ ポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ ＤＮＡ ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡ ポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡ ポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡ ポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｃｓａ ＤＮＡポリメラーゼのうちの１種又は２種以上の組み合わせを用いることができる。これらの中でも、比較的活性が高く、かつ、Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ仕様であるために非特異増幅を抑制することができる観点から、Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ポリメラーゼが好ましい。この場合の反応温度や時間、指摘ｐＨ等の反応条件としては、選択するＤＮＡポリメラーゼに応じて適宜調整することができる。

【0075】

（工程Ｂ）
本発明の核酸増幅方法では、次いで、工程Ｂとして、Ｆｗアダプターヌクレオチドと、第一の鋳型核酸とをアニールさせ、第一の鋳型核酸の３’末端を起点としてＦｗアダプターヌクレオチドの相補鎖を合成し、第一の鋳型核酸の３’末端にステムループ構造が付加された第二の鋳型核酸を得る（図１では（ｂ））。

【0076】

工程Ｂでは、例えば、工程Ａの反応産物に、Ｆｗアダプターヌクレオチド及び必要に応じて相補鎖合成酵素を添加することにより、目的の標的領域Ｎが存在する場合に合成される第一の鋳型核酸に、Ｆｗアダプターヌクレオチドがアニールして、Ｆｗアダプターヌクレオチドと相補的な塩基配列：５’−Ｆ１ｃ−ＦＬｃ−Ｆ１−３’が合成され、第二の鋳型核酸を得ることができる。

【0077】

Ｆｗアダプターヌクレオチドの相補鎖の合成は、ＤＮＡを伸長させる伸長化反応であることが好ましい。前記伸長化反応の場合の相補鎖合成酵素（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ）としては、上記の工程Ａに挙げたものと同様のものが挙げられる。この場合の反応温度や時間、指摘ｐＨ等の反応条件としては、選択するＤＮＡポリメラーゼに応じて適宜調整することができる。

【0078】

また、本発明の核酸増幅方法においては、工程Ａと工程Ｂとを同一反応系で行うことが可能であり、さらなる簡便性の観点から好ましい。前記標的核酸がＲＮＡであり、各プライマーとしてＤＮＡを用いる場合には、例えば、工程Ｂにおける相補鎖合成酵素として、等温鎖置換活性型ポリメラーゼ酵素を用いることにより、逆転写酵素と同一容器において、同時に、工程Ａの逆転写反応と工程Ｂの伸長化反応とを行うことができる。前記等温鎖置換活性型ポリメラーゼ酵素としては、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｃｓａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ポリメラーゼのうちの１種又は２種以上の組み合わせを用いることができるが、これらに限定されるものではない。これらの中でも、Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ仕様であるために逆転写非特異増幅を抑制することができる観点から、Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ポリメラーゼが好ましい。また、この場合の逆転写酵素としては、例えば、Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）由来組み換え酵素（ＡＭＶ）が挙げられる。

【0079】

工程Ａと工程Ｂとを同一反応系で行う場合の反応温度としては、３０〜７５℃であることが好ましく、４０〜７０℃であることがより好ましい。さらに、この場合の反応時間としては、５〜１２０分間であることが好ましく、１５〜６０分間であることがより好ましい。

【0080】

工程Ｂでは、Ｆｗアダプターヌクレオチドの３’末端に伸長化阻害修飾がなされているため、同Ｆｗアダプターヌクレオチドの３’末端を起点とする第一の鋳型核酸の相補鎖の合成が抑制される。そのため、鋳型核酸としては、図１の（ｄ）に示すような、第三の鋳型核酸と同様の構造を有する核酸の合成は阻害される。

【0081】

（熱処理工程）
本発明の核酸増幅方法としては、次いで、下記の工程Ｃの前に、工程Ｂの反応産物を８５℃以上に加熱する熱処理工程をさらに含むことが好ましい。これにより、下記のＬＡＭＰ法においてＦｗインナープライマーが第二の鋳型核酸にアニールする効率が高まり、感度が向上する。

【0082】

前記熱処理における温度としては、８５〜１００℃であることが好ましく、９０〜１００℃であることがより好ましい。さらに、この場合の熱処理時間としては、１〜３０分間であることが好ましく、１〜１０分間であることがより好ましい。

【0083】

（工程Ｃ）
本発明の核酸増幅方法では、次いで、工程Ｃとして、第二の鋳型核酸を鋳型として、ＦｗインナープライマーとＢｗインナープライマーとを用いて、ＬＡＭＰ法により第二の鋳型核酸の塩基配列Ｎｃを増幅する（図１では（ｃ））。

【0084】

第二の鋳型核酸は、上記のように両端にステムループ構造を有するいわゆるダンベル型の構造となっているため、これを鋳型としてＬＡＭＰ法で増幅することにより、塩基配列Ｎｃを増幅することができる。つまり、塩基配列Ｎｃは標的領域Ｎの相補鎖であるから、これにより、標的領域Ｎを間接的に増幅することが可能となる。

【0085】

ＬＡＭＰ法による増幅方法としては、従来公知の方法又はそれに準じた方法を適宜採用することができ、例えば、国際公開第００／２８０８２号に記載の方法を採用することができる。

【0086】

より具体的には、例えば、第二の鋳型核酸（又は、工程Ｂ若しくは熱処理工程の反応産物）と、Ｆｗインナープライマーと、Ｂｗインナープライマーと、相補鎖合成酵素と、を混合し、温度を一定範囲内に保つことにより、第二の鋳型核酸が存在する場合には、以下のステップが進行する。

【0087】

（ステップ１）
先ず、第二の鋳型核酸において、３’末端（ステム領域Ｆ１）を起点として、自己を鋳型としたＤＮＡ鎖が伸長化反応によって合成される。このとき、５’末端側のステムループ構造は剥がされて一本鎖となる。さらに、第二の鋳型核酸は、３’末端側に一本鎖のループ構造（塩基配列ＦＬｃからなる構造）を有するため、ここにＦｗインナープライマーの塩基配列Ｆ２がアニールすることができ、同Ｆｗインナープライマーの３’末端を起点とする伸長化反応によって第二の鋳型核酸を鋳型としたＤＮＡ鎖（第三の鋳型核酸）が合成される。このとき、既にある二本鎖を剥がしながら第三の鋳型核酸の伸長化反応が進む。

【0088】

（ステップ２）
他方、Ｆｗインナープライマーを起点とする第三の鋳型核酸の伸長化反応によって剥がされて一本鎖となったＤＮＡ鎖では、３’末端側に互いに相補的な塩基配列、すなわち、Ｂ１ｃ及びＢ１を有しているため、ステムループ構造を形成する。

【0089】

（ステップ３）
次いで、このステムループ構造の３’末端（ステム領域Ｂ１）を起点として、一本鎖となった自己を鋳型とした新たなＤＮＡ鎖の合成が始まり、二本鎖を形成している、Ｆｗインナープライマーから合成された第三の鋳型核酸を剥がしながら伸長する。

【0090】

（ステップ４）
また、上記の過程によって一本鎖となった、Ｆｗインナープライマーから合成された第三の鋳型核酸は、その両端にそれぞれ相補的な塩基配列、すなわち、Ｆ１及びＦ１ｃ、並びに、Ｂ１ｃ及びＢ１を有しているため、自己アニールしてステムループ構造を形成する。この第三の鋳型核酸の構造は、上記のとおり、第二の鋳型核酸と全く相補的な構造となる。

【0091】

（ステップ５）
ステップ４で得られた構造では、ステップ１の第二の鋳型核酸と同様に、３’末端（ステム領域Ｂ１）を起点として、自己を鋳型としたＤＮＡ鎖が伸長化反応によって合成される。このとき、５’末端側のステムループ構造は剥がされて一本鎖となる。さらに、第三の鋳型核酸は、３’末端側に一本鎖のループ構造（塩基配列ＢＬｃからなる構造）を有するため、ここにＢｗインナープライマーの塩基配列Ｂ２がアニールすることができ、同Ｂｗインナープライマーの３’末端を起点とする伸長化反応によって第三の鋳型核酸を鋳型としたＤＮＡ鎖が合成される。このとき、既にあるＤＮＡ鎖を剥がしながら新たなＤＮＡ鎖の伸長化反応が進む。

【0092】

（ステップ６）
ステップ５以降は、ステップ２〜４と同様の過程を経ることにより、再び第二の鋳型核酸の構造が得られる。

【0093】

（ステップ７）
また、ステップ３で得られた新たなＤＮＡ鎖においては、一本鎖となっているループ構造（塩基配列ＢＬｃからなる構造）にＢｗインナープライマーの塩基配列Ｂ２がアニールし、二本鎖部分を剥がしながらＤＮＡ鎖が合成される。

【0094】

以上のステップが繰り返されることにより、同一鎖上に、塩基配列Ｎｃ及びその相補鎖と、互いに相補的な塩基配列（すなわち、Ｆ１及びＦ１ｃ、並びに、Ｂ１ｃ及びＢ１）とを繰り返す構造の増幅産物を、様々なサイズで得ることができる。

【0095】

かかるＬＡＭＰ法に用いる相補鎖合成酵素としては、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｃｓａ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ポリメラーゼのうちの１種又は２種以上の組み合わせを用いることができるが、これらに限定されるものではない。

【0096】

本発明に係るＬＡＭＰ法における反応温度としては、特に制限されないが、５０〜７０℃であることが好ましく、６０〜７０℃であることがより好ましい。さらに、本発明に係るＬＡＭＰ法における反応時間としては、１０〜６０分間であることが好ましく、１５〜４０分間であることがより好ましい。

【0097】

（検出工程）
工程Ｃで得られた増幅産物（本明細書中、場合により「ＬＡＭＰ産物」ともいう）は、適宜公知の方法又はそれに準じた方法で検出することができる。これにより、塩基配列Ｎｃ又はその相補鎖を検出するが、塩基配列Ｎｃは標的領域Ｎの相補鎖であるから、つまり、これにより、標的領域Ｎを間接的に検出することが可能となる。

【0098】

前記検出方法としては、例えば、得られたＬＡＭＰ産物に蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド、Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ６３等）をインターカレートして蛍光強度を測定することにより、塩基配列Ｎｃ又はその相補鎖を定量し、標的領域Ｎの量とすることができる。また、前記ＬＡＭＰ法と検出工程とを、例えば、リアルタイムで行うことにより、前記定量を同時に行うことができる。このような方法としては、例えば、インターカレーション法（いわゆるＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ法）に代表される、蛍光色素の存在下でＬＡＭＰ法を行う方法；ダブルダイプローブ法（いわゆるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法）に代表される、蛍光色素を結合させたオリゴヌクレオチドプローブ（以下、場合により単に「プローブ」という）を用いる方法が挙げられる。

【0099】

これらの中でも、本発明の核酸増幅方法としては、工程Ｃの後に、塩基配列Ｎｃの少なくとも一部、又は、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ（より好ましくは、塩基配列Ｎｃの少なくとも一部、又は、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズする塩基配列のみからなるプローブ）を用いて塩基配列Ｎｃを検出する（塩基配列Ｎｃの相補鎖の検出による塩基配列Ｎｃの検出を含む。以下同様）検出工程をさらに含むことが好ましい。塩基配列Ｎｃ又は塩基配列Ｎｃの相補鎖上にハイブリダイズするように設計されたプローブを用いてこれらを検出することにより、プライマーダイマーに起因する非特異反応の検出をより低減することが可能となる。

【0100】

前記検出方法に係るプローブとしては、塩基配列Ｎｃや塩基配列Ｎｃの相補鎖の塩基配列に基づいて適宜設計することができるが、下記の第一のプローブ又は第二のプローブを用いることにより、さらに非特異反応の検出を低減することが可能となるため好ましい。

【0101】

〔第一のプローブ〕
前記検出方法に係るプローブを、塩基配列Ｎｃの少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ（「第一のプローブ」という）とする場合には、塩基配列Ｎｃのうち、塩基配列Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さが５塩基長以下であることが好ましい。これにより、すなわち、Ｂｗアダプタープライマーの塩基配列Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さも５塩基長以下となり、第一のプローブとＢｗアダプタープライマーとのハイブリダイズが抑制されるため、工程Ｃと検出工程とを同時に行う場合（すなわち、リアルタイムで行う場合）、かかるハイブリダイズによる非特異増幅反応をさらに低減することが可能となる。

【0102】

第一のプローブにおいて、塩基配列Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さとしては、５塩基長以下であることが好ましいが、４塩基長以下であることがより好ましく、３塩基長以下であることがさらに好ましい。

【0103】

〔第二のプローブ〕
また、前記検出方法に係る別の態様として、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ（「第二のプローブ」という）とする場合には、その全長の塩基配列が、塩基配列Ｎ３ｃ又は塩基配列Ｎ５ｃのいずれかに全て含まれるものではないことが好ましい。これにより、第二のプローブの塩基配列が、Ｂｗアダプタープライマーの塩基配列Ｎ３ｃ、又は、Ｆｗアダプターヌクレオチドの塩基配列Ｎ５’の相補鎖（Ｎ５ｃ）のいずれか一方に包含されることがないため、原理どおりに形成されたＬＡＭＰ産物に完全一致する増幅産物のみを検出することができ、非特異検出をさらに低減することができる。

【0104】

第二のプローブとしては、塩基配列Ｎ３ｃに含まれる塩基配列、及び塩基配列Ｎ５ｃに含まれる塩基配列が、それぞれ、プローブの全長の９０％以下であることが好ましく、８０％以下であることがより好ましく、７０％以下であることがさらに好ましい。

【0105】

前記検出方法に係るプローブとしては、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において、各ハイブリダイズ対象の領域に特異的にハイブリダイズするものが好ましく、例えば、上記ハイブリダイズの条件を満たすことが好ましく、各ハイブリダイズ対象の領域の塩基配列情報に基づいて、従来公知の方法又はそれに準じた方法で設計することができる。

【0106】

前記検出方法に係るプローブの鎖長は、少なくとも５塩基である。通常は、５〜１００塩基であり、好ましくは５〜３０塩基である。当該プローブは、例えば、市販のオリゴヌクレオチド合成機により合成することができる。また、前記プローブは、天然のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチド）のみから構成されていなくともよく、例えば、前記非天然型のヌクレオチドにてその一部又は全部が構成されていてもよい。

【0107】

また、前記プローブとしては、適宜、標識物質によって標識されていることが好ましい。これにより、前記標識物質に応じたシグナルを、塩基配列Ｎｃ又はその相補鎖の指標として検出することができる。前記「シグナル」には、呈色（発色）、反射光、発光、消光、蛍光、放射性同位体による放射線等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた測定方法・装置によって確認できるものも含まれる。

【0108】

前記標識物質としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、ＤＥＡＣ、Ｒ６Ｇ、ＴｅｘＲｅｄ、ＴＡＭＲＡ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ５、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ等の蛍光物質；β−Ｄ−グルコシダ―ゼ、ルシフェラーゼ、ＨＲＰ等の酵素；^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１２３Ｉ等の放射性同位体；ビオチン、ストレプトアビジン等の親和性物質；ルミノール、ルシフェリン、ルシゲニン等の発光物質が挙げられる。

【0109】

＜プライマーセット、プローブ、キット＞
本発明は、上記の本発明の核酸増幅方法に用いるためのプライマーセット、プローブ、及びキットも提供する。

【0110】

本発明の核酸増幅方法用プライマーセットは、
構造（ａ）：
５’−Ｂ１ｃ−ＢＬ−Ｂ１−Ｎ３ｃ−３’・・・（ａ）
を含むＢｗアダプタープライマーと、
構造（ｃ）：
５’−Ｆ１ｃ−ＦＬ−Ｆ１−Ｎ５’−３’・・・（ｃ）
を含み、かつ、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているＦｗアダプターヌクレオチドと、
を備える、本発明の核酸増幅方法に用いるためのプライマーセットである。本発明の核酸増幅方法用プライマーセットとしては、
構造（ｅ）：
５’−Ｆ１ｃ−Ｆ２−３’・・・（ｅ）
を含むＦｗインナープライマーと、
構造（ｆ）：
５’−Ｂ１ｃ−Ｂ２−３’・・・（ｆ）
を含むＢｗインナープライマーと、
をさらに備えることが好ましい。また、本発明の核酸増幅方法用プローブは、
塩基配列Ｎｃの少なくとも一部、又は、塩基配列Ｎｃの相補鎖の少なくとも一部にハイブリダイズする、本発明の核酸増幅方法に用いるためのプローブである。

【0111】

さらに、本発明の核酸増幅方法用キットは、本発明の核酸増幅方法用プライマーセットを備える、本発明の核酸増幅方法に用いるためのキットであり、本発明の核酸増幅方法用プローブをさらに備えることが好ましい。

【0112】

上記の本発明の核酸増幅方法に用いるためのプライマーセット、プローブ、及びキットにおいて、Ｂｗアダプタープライマー、Ｆｗアダプターヌクレオチド、Ｆｗインナープライマー、Ｂｗインナープライマー、及びプローブとしては、その好ましい態様も含めて、それぞれ、本発明の核酸増幅方法において述べたとおりである。

【0113】

本発明の核酸増幅方法用プライマーセット、及びプローブにおいて、各プライマー、ヌクレオチド、及びプローブとしては、緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等の他の成分が添加してあってもよい。

【0114】

また、本発明の核酸増幅方法用キットとしては、標的核酸を抽出、精製するための試薬や希釈液：各酵素反応に必要な酵素、緩衝液、ｐＨ調整剤等の試薬；標準核酸；使用説明書等をさらに備えていてもよい。

【実施例】

【0115】

以下、下記試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の例に限定されるものではない。

【0116】

（試験例１）アダプタープライマーのステムループ構造による反応への影響
（１）逆転写反応・伸長化反応（鋳型核酸合成）
逆転写反応及び伸長化反応は、ＫＣｌ、Ｔｗｅｅｎ ＭｇＳＯ_４ ｄＮＴＰを含むバッファーにおいて、終濃度で、１２５ｎＭのＢｗアダプタープライマー、５ｎＭのＦｗアダプターヌクレオチド、０．９Ｕ ＡＭＶ（Ｒｏｃｈｅ）、及び３．６Ｕ Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を混合し、標的核酸として、ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−２１−５ｐ（塩基配列を配列番号：３に示す）又はＬｅｔ−７ａ−５ｐ（塩基配列を配列番号：６に示す）を、各１０^９コピー添加して、又は添加せず（ＮＣ）、４２℃において４５分間行い、鋳型核酸を合成した。ｍｉＲ−２１−５ｐ及びＬｅｔ−７ａ−５ｐに対して用いたＢｗアダプタープライマー及びＦｗアダプターヌクレオチドの組み合わせを、それぞれ、下記の表１に示す。表１において、Ｂｗアダプタープライマーの「ＣＴ」は、ステムループ構造を持つプライマーを示し、その対照として、「ＳＴ１」及び「ＳＴ２」は、それぞれステムループ構造を形成しないプライマー（ＢｗアダプタープライマーのＢ１ｃに相当する領域をＢ１に相当する領域と塩基対を形成しない配列に置換したもの）を示し、「Ｄ１」は、ＢｗアダプタープライマーのＢ１ｃに相当する領域を欠損させたプライマーを示す。また、表１の各Ｆｗアダプターヌクレオチドの配列中、「‐」で区切った各ブロックは、５’末端側から順に、Ｆ１ｃ、Ｆ２、ＦＳ、Ｆ１、Ｎ５’に相当する塩基配列を示し、各Ｂｗアダプタープライマーの配列中、「‐」で区切った各ブロックは、５’末端側から順に、Ｂ１ｃ、Ｂ２、ＢＳ、Ｂ１、Ｎ３ｃに相当する塩基配列を示す。

【0117】

【表1】

【0118】

（２）ＰＣＲ増幅反応・蛍光検出
上記の逆転写反応・伸長化反応後の反応液に、終濃度で、１μＭのＰＣＲ−Ｆ―プライマー（塩基配列を配列番号：１２に示す）、１μＭのＰＣＲ−Ｂ―プライマー（塩基配列を配列番号：１３に示す）、ＳＹＴＯ６３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及び０．０３Ｕ／μＭ Ｔａｋａｒａ Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を添加し、ＰＣＲ増幅反応液を調製した。各ＰＣＲプライマー（Ｆ―プライマー／Ｂ―プライマー）は、各Ｂｗアダプタープライマー及びＦｗアダプターヌクレオチドの各々のループ領域の配列上に設計した。ＰＣＲ増幅反応は、前記ＰＣＲ増幅反応液について、９５℃を１０秒維持した後、［９５℃で１５秒、６０℃で６０秒］×４０サイクルで行った。ＰＣＲ産物量は、リアルタイムで、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、励起波長６１８ｎｍ、測定波長６６０ｎｍの条件下で蛍光強度を検出して測定した。

【0119】

測定して得られた蛍光強度−反応時間曲線から各Ｃｔ値を求め、ＮＣのＣｔ値との差（ＮＣのＣｔ値−標的核酸１０^９コピーのＣｔ値）をΔＣｔとして算出した。結果を下記の表２、３に示す。

【0120】

【表2】

【0121】

【表3】

【0122】

表２、３に示したように、標的核酸としてｍｉＲ−２１−５ｐを用いた場合及びＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いた場合のいずれにおいても、ＢｗアダプタープライマーとしてＣＴを用いたときのΔＣＴ値と比較して、ＳＴ１、ＳＴ２、及びＤ１を用いたときのΔＣＴ値は低下した（すなわち、Ｃｔ値が上昇した）。これらの結果より、Ｂｗアダプタープライマーの構造をリニア構造からステムループ構造として鋳型核酸にステムループ構造を導入することによって、増幅サイクルが早くなって反応性が向上することが示唆された。

【0123】

（試験例２）伸長化反応後の熱処理効果の検証
（１）逆転写反応・伸長化反応（鋳型核酸合成）
逆転写反応及び伸長化反応は、ＫＣｌ、Ｔｗｅｅｎ ＭｇＳＯ_４ ｄＮＴＰを含むバッファーにおいて、終濃度で、５ｎＭのＢｗアダプタープライマー（配列番号：２、５）、Ｆｗアダプターヌクレオチドとして、配列番号１、４に示す塩基配列において３’末端がリン酸化されていないアダプターヌクレオチドを５ｎＭ、０．９Ｕ ＡＭＶ（Ｒｏｃｈｅ）、及び３．６Ｕ Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を混合し、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号：３）又はＬｅｔ−７ａ−５ｐ（配列番号：６）を、各１０^７コピー、１０^９コピー、又は１０^１１コピー添加して、又は添加せず（ＮＣ）、４２℃において４５分間行い、鋳型核酸を合成した。その後、９５℃で５分間加熱して熱処理した。また、この対照として、同様に逆転写反応・伸長化反応後を行った後、熱処理を行わなかった。

【0124】

（２）ＬＡＭＰ増幅反応・蛍光検出
上記の熱処理後（熱処理あり）、又は逆転写反応・伸長化反応後（熱処理なし）の反応液に、終濃度で、０．８μＭのＦｗインナープライマー（塩基配列を配列番号：１４に示す）、０．８μＭのＢｗインナープライマー（塩基配列を配列番号：１５に示す）、ＳＹＴＯ６３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、及び２．４Ｕ Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを添加し、ＬＡＭＰ増幅反応液を調製した。かかる反応液について、６２℃において６０分間、ＬＡＭＰ増幅反応を行った。ＬＡＭＰ産物量は、リアルタイムで、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、励起波長６１８ｎｍ、測定波長６６０ｎｍの条件下で蛍光強度を検出して測定した。測定して得られた蛍光強度−反応時間曲線を図２Ａ及び図２Ｂに示す。図２Ａは標的核酸としてｍｉＲ−２１−５ｐを用いた結果を示し、図２Ｂは標的核酸としてＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いた結果を示し、図２Ａ及び図２Ｂ中、それぞれ、（ａ）は熱処理なしの結果を示し、（ｂ）は熱処理ありの結果を示す。

【0125】

図２Ａ及び図２Ｂに示したように、標的核酸としてｍｉＲ−２１−５ｐを用いた場合及びＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いた場合のいずれにおいても、熱処理なし（ａ）では、標的核酸のコピー数が少なくなると、蛍光強度−反応時間曲線の立ち上がりが遅くなる現象が確認された。一方、熱処理あり（ｂ）では、標的核酸のコピー数が少なくても前記曲線の十分な立ち上がりが確認された。ただし、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを用いた場合には熱処理ありのＮＣにおいても、前記曲線の立ち上がりが早くなった（図２Ｂ（ｂ））。これらの結果から、相補鎖合成後の熱処理が増幅産物の検出の感度向上に寄与することが確認された。

【0126】

（試験例３）Ｆｗアダプターヌクレオチドの３’末端リン酸化効果（３’末端伸長化阻害修飾効果）の検証
試験例２において、Ｌｅｔ−７ａ−５ｐを用いた場合にＮＣでの非特異増幅反応が確認されたことから、かかる非特異増幅反応の抑制を目的として、Ｆｗアダプターヌクレオチドの３’末端リン酸化効果を検証した。

【0127】

すなわち、先ず、試験例２の（１）と同様の方法で、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号：３）又はＬｅｔ−７ａ−５ｐ（配列番号：６）を、各１０^１１コピー添加して、又は添加せず（ＮＣ）、逆転写反応・伸長化反応を行った（リン酸化なし）。また、Ｆｗアダプターヌクレオチドとして、表１及び配列番号１、４に示す塩基配列の３’末端がリン酸化されたアダプターヌクレオチドをそれぞれ用いたこと以外は同様にして、逆転写反応・伸長化反応を行った（リン酸化あり）。次いで、各逆転写反応・伸長化反応の後、９５℃で５分間加熱して熱処理した。次いで、試験例２の（２）と同様の方法で、ＬＡＭＰ増幅反応及び蛍光検出を行い、各蛍光強度−反応時間曲線を得た。得られた蛍光強度−反応時間曲線を図３Ａ及び図３Ｂに示す。図３Ａは標的核酸としてｍｉＲ−２１−５ｐを用いた結果を示し、図３Ｂは標的核酸としてＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いた結果を示し、図３Ａ及び図３Ｂ中、それぞれ、（ａ）はリン酸化なしの結果を示し、（ｂ）はリン酸化ありの結果を示す。

【0128】

図３Ａ及び図３Ｂに示したように、標的核酸としてｍｉＲ−２１−５ｐを用いた場合及びＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いた場合のいずれにおいても、Ｆｗアダプターヌクレオチドの３’末端のリン酸化がない場合（ａ）には、ＮＣにおいて反応時間が２０分〜３０分の間で蛍光強度−反応時間曲線の立ち上がりが確認された。一方、リン酸化がある場合（ｂ）には、いずれにおいても、ＮＣにおける当該立ち上がりが確認されなかった。また、標的核酸が１０^１１コピーにおける立ち上がり時間は、Ｆｗアダプターヌクレオチドの３’末端のリン酸化の有無で、ほとんど差はなかった。これらの結果から、Ｆｗアダプターヌクレオチドの３‘末端リン酸化は、標的核酸の存在における検出には影響せずに、非特異増幅反応を抑制できることが確認された。

【0129】

（試験例４）蛍光消光プローブ検出
（１）逆転写反応・伸長化反応（鋳型核酸合成）
Ｂｗアダプタープライマー（配列番号：２、５）を終濃度で１２５ｎＭとし、Ｆｗアダプターヌクレオチドとして、表１及び配列番号１、４に示す塩基配列の３’末端がリン酸化されたアダプターヌクレオチドをそれぞれ用い、かつ、Ｆｗアダプターヌクレオチド（配列番号：１、４）を終濃度で５０ｎＭとしたこと以外は、試験例２の（１）と同様の方法で、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号：３）又はＬｅｔ−７ａ−５ｐ（配列番号：６）を、各１０^１１コピー添加して、又は添加せず（ＮＣ）、逆転写反応・伸長化反応を行い、鋳型核酸を合成した。その後、９５℃で５分間加熱して熱処理した。

【0130】

（２）ＬＡＭＰ増幅反応
上記の熱処理後の反応液に、終濃度で、０．８μＭのＦｗインナープライマー（配列番号：１４）、０．８μＭのＢｗインナープライマー（配列番号：１５）、２．４Ｕ Ｂｓｔ２．０ Ｗａｒｍ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、及び０．０４μＭの蛍光消光プローブ（蛍光色素：ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）を添加し、ＬＡＭＰ増幅反応液を調製した。ｍｉＲ−２１−５ｐ及びＬｅｔ−７ａ−５ｐに対して用いた蛍光消光プローブを、それぞれ、下記の表４に示す。表４において、「ｍｉＲ−２１−５ｐ領域設計プローブ」は、標的核酸ｍｉＲ−２１−５ｐの塩基配列（配列番号：３）にハイブリダイズするように設計したプローブ（塩基配列を配列番号：１６に示す）であり、「Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ領域設計プローブ」は、標的核酸Ｌｅｔ−７ａ−５ｐの塩基配列（配列番号：６）にハイブリダイズするように設計したプローブ（塩基配列を配列番号：１７に示す）であり、その対照として、「ループ領域設計プローブ」は、各Ｂｗアダプタープライマー（配列番号：２、５）のループ領域（ＢＬ、特にＢ２に相当する領域）の相補鎖にハイブリダイズするように設計したプローブ（塩基配列を配列番号：１８に示す）である。ＬＡＭＰ増幅反応は、前記ＬＡＭＰ増幅反応液について、６２℃で６０分間行った。

【0131】

【表4】

【0132】

（３）融解曲線解析
上記のＬＡＭＰ増幅反応後の反応液を９５℃で５分間加熱して熱変性せしめ、次いで、２０℃まで温度を下げながら、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用い、励起波長４６５ｎｍ、測定波長５１０ｎｍの条件下で蛍光強度を測定し、融解曲線を得た。測定して得られた融解曲線を図４Ａ及び図４Ｂに示す。図４Ａは標的核酸としてｍｉＲ−２１−５ｐを用いた結果を示し、図４Ｂは標的核酸としてＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いた結果を示し、図４Ａ及び図４Ｂ中、それぞれ、（ａ）は各標的核酸の塩基配列にハイブリダイズするように設計したプローブ（配列番号：１６又は配列番号：１７）を用いた結果を示し、（ｂ）は各Ｂｗアダプタープライマーのループ領域の相補鎖にハイブリダイズするように設計したプローブ（配列番号：１８）を用いた結果を示す。

【0133】

図４Ａ及び図４Ｂに示したように、標的核酸としてｍｉＲ−２１−５ｐを用いた場合及びＬｅｔ−７ａ−５ｐを用いた場合のいずれにおいても、Ｂｗアダプタープライマーのループ領域の相補鎖にハイブリダイズするように設計したプローブを用いた場合（ｂ）には、標的核酸の存在条件下だけではなく、ＮＣにおいても消光が観測された。一方、標的核酸の塩基配列にハイブリダイズするように設計したプローブを用いた場合（ａ）には、標的核酸の存在条件下で消光が観測され、ＮＣにおいては観測されなかった。これらの結果から、プローブによってＬＡＭＰ増幅産物を検出する場合には、標的核酸の塩基配列にハイブリダイズするように、すなわち、鋳型核酸の標的核酸に対応する領域上にプローブを設計することにより、非特異消光が抑制され、より特異的な検出が可能となることが確認された。

【0134】

（試験例５）プローブ設計領域の検証
試験例４において、鋳型核酸の標的核酸に対応する領域上にプローブを設計することによってより特異的な検出が可能となったことから、プローブの設計領域についてさらに詳細に検証した。

【0135】

すなわち、先ず、Ｂｗアダプタープライマー（配列番号：２）を終濃度で１２５ｎＭとし、Ｆｗアダプターヌクレオチドとして、表１及び配列番号１に示す塩基配列の３’末端がリン酸化されたアダプターヌクレオチドを用い、かつ、Ｆｗアダプターヌクレオチド（配列番号：１）を終濃度で５０ｎＭとしたこと以外は、試験例２の（１）と同様の方法で、ｍｉＲ−２１−５ｐ（配列番号：３）を１０^７コピー添加して、又は添加せず（ＮＣ）、逆転写反応・伸長化反応を行い、鋳型核酸を合成した。その後、９５℃で５分間加熱して熱処理した。次いで、下記の表５に示す蛍光消光プローブを用いたこと以外は、試験例４の（２）と同様の方法で、ＬＡＭＰ増幅反応を行った。表５中、「ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−１」〜「ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−７」は、標的核酸ｍｉＲ−２１−５ｐの塩基配列（配列番号：３）又はその相補鎖にハイブリダイズするように、かつ、各ハイブリダイズする塩基数が異なるように設計したプローブ（Ｐｒｏｂｅ−２〜７の塩基配列を配列番号：１９〜２４に示す）であり、「ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−８」は、上記「ｍｉＲ−２１−５ｐ領域設計プローブ（配列番号：１６）」と同じである。また、表５には、標的核酸ｍｉＲ−２１−５ｐのセンス鎖及びアンチセンス鎖の塩基配列も合わせて示し、Ｂｗアダプタープライマーの塩基配列Ｎ３ｃ又はその相補鎖に対応する配列を下線で示す。

【0136】

【表5】

【0137】

（３）融解曲線解析
上記のＬＡＭＰ増幅反応後の反応液を９５℃で５分間加熱して熱変性せしめ、次いで、４℃まで温度を下げながら、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｄｅｅｐ ＷｅｌｌリアルタイムＰＣＲ解析システム（バイオラッド社製）を用い、励起波長４５０〜４９０ｎｍ、測定波長５１５〜５３０ｎｍの条件下で蛍光強度を測定し、融解曲線を得た。測定して得られた融解曲線を図５に示す。図５中、各曲線の縦軸は−（ｄ／ｄｔ）を示し、横軸は温度（℃）を示す。（ａ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−１、（ｂ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−２、（ｃ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−３、（ｄ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−４、（ｅ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−５、（ｆ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−６、（ｇ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−７、（ｈ）はｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−８、の各蛍光消光プローブを用いたときの結果を示す。

【0138】

図５に示したように、標的核酸のセンス鎖にプローブを設計する場合（標的核酸のアンチセンス鎖にハイブリダイズするようにプローブを設計する場合）、すなわち、鋳型核酸上の、前記センス鎖に相補的な塩基配列（塩基配列Ｎｃ）にハイブリダイズするようにプローブを設計した場合（（ａ）〜（ｆ））においては、ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−１〜４（（ａ）〜（ｄ））で、標的核酸の存在条件下においてのみ消光が観測され、ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−５〜６（（ｅ）〜（ｆ））ではＮＣにおいても消光が観測された。ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−５〜６では、Ｂｗアダプタープライマーがプローブに干渉し、非特異増幅が生じたと考えられた。

【0139】

他方、標的核酸のアンチセンス鎖にプローブを設計する場合（標的核酸のセンス鎖の塩基配列にハイブリダイズするようにプローブを設計する場合）、すなわち、鋳型核酸上の、塩基配列Ｎｃの相補鎖にハイブリダイズするようにプローブを設計した場合（（ｇ）〜（ｈ））においては、ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−７（ｇ）で、ＮＣにおいても消光が観測され、ｍｉＲＮＡ２１Ｐｒｏｂｅ−８では、標的核酸の存在条件下においてのみ消光が観測された。

【0140】

これらの結果から、標的核酸のセンス鎖にプローブを設計する場合、すなわち、鋳型核酸の塩基配列Ｎｃにハイブリダイズするようにプローブを設計する場合は、Ｂｗアダプタープライマーに結合可能な長さ（Ｎ３ｃとハイブリダイズする塩基配列の長さ）が短くなるように設計することにより、一方、標的核酸のアンチセンス鎖にプローブを設計する場合、すなわち、鋳型核酸の塩基配列Ｎｃの相補鎖にハイブリダイズするようにプローブを設計する場合は、プローブの全配列が、少なくともＢｗアダプタープライマーの塩基配列に含まれないように（特に、プローブの全配列が、塩基配列Ｎ３ｃの相補鎖にハイブリダイズすることがないように）、設計することにより、非特異消光が抑制され、より特異的な検出が可能となることが確認された。

【産業上の利用可能性】

【0141】

以上説明したように、本発明によれば、断片ＤＮＡやｍｉＲＮＡ等の短鎖核酸であっても、それを鋳型として簡便かつ特異的に核酸を増幅することができる核酸増幅方法、並びに、これに用いる核酸増幅方法用プライマーセット、プローブ、及びキットを提供することが可能となる。

【符号の説明】

【0142】

１１…標的核酸（標的領域Ｎ）、２０…Ｂｗアダプタープライマー、２１…ステム領域Ｂ１ｃ、２２１…塩基配列Ｂ２、２２２…スペーサーＢＳ、２３…ステム領域Ｂ１、２４…アニール領域Ｎ３ｃ、２５…塩基配列Ｎ５ｃ、３０…Ｆｗアダプターヌクレオチド、３１…ステム領域Ｆ１ｃ、３２１…塩基配列Ｆ２、３２２…スペーサーＦＳ、３３…ステム領域Ｆ１、３４…アニール領域Ｎ５’、３６１…塩基配列Ｆ２に相補的な塩基配列Ｆ２ｃ、３６２…スペーサーＦＳに相補的な塩基配列ＦＳｃ、４０…第一の鋳型核酸、５０…第二の鋳型核酸、６０…Ｆｗインナープライマー、１０１…逆転写酵素、１０２…ＤＮＡポリメラーゼ。

【配列表フリーテキスト】

【0143】

配列番号：１
＜２２３＞ ｍｉＲ−２１−５ｐ Ｆｗアダプターヌクレオチド
配列番号：２
＜２２３＞ ｍｉＲ−２１−５ｐ Ｂｗアダプタープライマー ＣＴ
配列番号：４
＜２２３＞ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ Ｆｗアダプターヌクレオチド
配列番号：５
＜２２３＞ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ Ｂｗアダプタープライマー ＣＴ
配列番号：７
＜２２３＞ ｍｉＲ−２１−５ｐ Ｂｗアダプタープライマー ＳＴ１
配列番号：８
＜２２３＞ ｍｉＲ−２１−５ｐ Ｂｗアダプタープライマー ＳＴ２
配列番号：９
＜２２３＞ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ Ｂｗアダプタープライマー Ｄ１
配列番号：１０
＜２２３＞ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ Ｂｗアダプタープライマー ＳＴ１
配列番号：１１
＜２２３＞ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ Ｂｗアダプタープライマー ＳＴ２
配列番号：１２
＜２２３＞ ＰＣＲ−Ｆ―プライマー
配列番号：１３
＜２２３＞ ＰＣＲ−Ｂ―プライマー
配列番号：１４
＜２２３＞ Ｆｗインナープライマー
配列番号：１５
＜２２３＞ Ｂｗインナープライマー
配列番号：１６
＜２２３＞ ｍｉＲ−２１−５ｐ領域設計プローブ
配列番号：１７
＜２２３＞ Ｌｅｔ−７ａ−５ｐ領域設計プローブ
配列番号：１８
＜２２３＞ ループ領域設計プローブ
＜２２３＞ ｎはイノシンを示す

【要約】      （修正有）

【課題】断片ＤＮＡやｍｉＲＮＡ等の短鎖核酸を鋳型として簡便且つ特異的に増幅する、核酸増幅方法を提供する。
【解決手段】Ｂｗアダプタープライマーと、標的核酸の標的領域とをアニールさせ、Ｂｗアダプタープライマーの３’末端を起点として標的領域の５’末端側の塩基配列と相補的な塩基配列を合成し、標的領域の相補鎖の５’末端にステムループ構造が付加された第一の鋳型核酸を得る工程Ａと、３’末端に伸長化阻害修飾がなされているＦｗアダプターヌクレオチドと、第一の鋳型核酸とをアニールさせ、第一の鋳型核酸の３’末端を起点としてＦｗアダプターヌクレオチドの相補鎖を合成し、第一の鋳型核酸の３’末端にステムループ構造が付加された構造からなる第二の鋳型核酸を得る工程Ｂと、第二の鋳型核酸を鋳型としてＦｗインナープライマーとＢｗインナープライマーとを用いて、ＬＡＭＰ法により第二の鋳型核酸を増幅する工程Ｃと、を含む核酸増幅方法。
【選択図】なし

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]