特許 6974496 ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性の阻害剤としてのカンナビジオール誘導体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6974496

(24)【登録日】2021年11月8日

(45)【発行日】2021年12月1日

(54)【発明の名称】ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ活性の阻害剤としてのカンナビジオール誘導体

(51)【国際特許分類】

   C07C 225/20 20060101AFI20211118BHJP

   A61K 31/133 20060101ALI20211118BHJP

   A61K 31/137 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20211118BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20211118BHJP

【ＦＩ】

   C07C225/20CSP

   A61K31/133

   A61K31/137

   A61P43/00 111

   A61P9/10

   A61P17/02

   A61P7/06

   A61P11/00

   A61P31/00

   A61P37/06

   A61P13/12

   A61P9/00

【請求項の数】4

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2019-553369(P2019-553369)

(86)(22)【出願日】2017年3月29日

(65)【公表番号】特表2020-515590(P2020-515590A)

(43)【公表日】2020年5月28日

(86)【国際出願番号】EP2017057389

(87)【国際公開番号】WO2018177516

(87)【国際公開日】20181004

【審査請求日】2020年3月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】518051846

【氏名又は名称】エメラルド ヘルス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】エドゥアルド ムニョス ブランコ

(72)【発明者】

【氏名】カルメン マリア ナバレテ ルエダ

(72)【発明者】

【氏名】クリスティナ クルス テーノ

(72)【発明者】

【氏名】マリア ルース ベリド カベジョ デ アルバ

【審査官】 高森 ひとみ

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／１５８３８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５２３６２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５１７８６１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５１４１１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５２２４０９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 DEL RIO, C. et al.，The cannabinoid quinol VCE-004.8 alleviates bleomycin-induced scleroderma and exerts potent antifibrotic effects through peroxisome proliferator-activated receptor-γ and CB2 pathways，Scientific Reports，2016年，pp.1-14，DOI:10.1038/srep21703

【文献】 KANG, Ju-Hee et al.，Involvement of Prolyl Hydroxylase Domain Protein in the Rosiglitazone-Induced Suppression of Osteoblast Differentiation，PLOS ONE，2015年，pp.1-16，DIO:10.1371/journal.pone.0139093

【文献】 YAN, L. et al.，Prolyl hydroxylase domain-containing protein inhibitors as stabilizers of hypoxia-inducible factor: small molecule-based therapeutics for anemia，xpert Opinion on Therapeutic Patents，2010年，Vol.20, No.9，pp.1219-1245

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｃ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）の化合物又はその誘導体を含む、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための組成物であって、

【化1】

式中、Ｒは、直鎖若しくは分岐アルキルアミン基、アリールアミン基、直鎖若しくは分岐アルケニルアミン基、又は直鎖若しくは分岐アルキニルアミン基から独立して選択される基の窒素原子であり、
前記ＨＩＦ ＰＨＤ活性阻害から恩恵を受ける状態が、脳卒中、外傷、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、及び動脈疾患からなる群より選択される、
前記組成物。

【請求項2】

前記式（Ｉ）の化合物が、

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

および

【化10】

からなる群より独立して選択される、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

式（Ｉ）の化合物又はその誘導体、及び少なくとも１種の医薬的に不活性な成分を含む、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための組成物であって、

【化11】

式中、Ｒは、直鎖若しくは分岐アルキルアミン基、アリールアミン基、直鎖若しくは分岐アルケニルアミン基、又は直鎖若しくは分岐アルキニルアミン基から独立して選択される基の窒素原子であり、
前記医薬的に不活性な成分は、賦形剤、担体、及びその組み合わせからなる群より場合により選択され、そして
前記ＨＩＦ ＰＨＤ活性阻害から恩恵を受ける状態が、脳卒中、外傷、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、及び動脈疾患からなる群より選択される、
前記組成物。

【請求項4】

前記式（Ｉ）の化合物が、

【化12】

【化13】

【化14】

【化15】

【化16】

【化17】

【化18】

【化19】

【化20】

からなる群より独立して選択される、請求項３に記載の使用のための組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）阻害から恩恵を受ける疾患の治療における使用のための式（Ｉ）のカンナビジオールキノール誘導体の使用に関する。特にＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ阻害剤として、前記化合物はＨＩＦ−１αタンパク質レベル及びＨＩＦ−２αタンパク質レベルを安定化し、ＨＩＦ−１経路の活性化をもたらす。ＰＨＤの阻害は、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、又は動脈疾患などの状態において有用な血管新生及びコラーゲン収縮を誘発する。本発明は、前記疾患を治療するための前記化合物を含む医薬組成物も提供する。

【背景技術】

【0002】

哺乳類の細胞は、好気性代謝及びエネルギー生成を実行するために、適切な酸素恒常性を維持する必要がある。低酸素誘導因子（ＨＩＦ）−１の発見以来、ＨＩＦ転写因子による酸素検知の根底にあるシグナル伝達メカニズムは、生物学的意味合いで広く研究されてきた（Ｗａｎｇら， Ｒｅｄｏｘ Ｒｅｐ． １９９６． ２：８９−９６）。酸素に不安定なαサブユニット及び構成的に発現したβサブユニットで構成されるＨＩＦは、赤血球生成、血管新生、エネルギー代謝、虚血、及び炎症などの多様な細胞プロセスに関与する多数の遺伝子の転写を促進する（Ｓｅｍｅｎｚａら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９４． ２６９：２３７３５７−６３及びＥｌｔｚｓｃｈｉｇら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１４． １３：８５２−６９）。ＨＩＦは、ほぼ以下の２つの形態のみで細胞に存在する：ＨＩＦ−１及びＨＩＦ−２。それらは、構成的に産生された非常に豊富なＨＩＦ−βサブユニットと、ＨＩＦ−１α又はＨＩＦ−２αパートナーのいずれかからなるヘテロ二量体転写因子であり、ＨＩＦ−１及びＨＩＦ−２それぞれの場合において４８％の配列相同性を共有する（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＭＨ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１３． ５６： ９３６９−４０２５）。ＨＩＦ−１は低酸素に対する代謝応答及び血管応答と関連していることが多いが、ＨＩＦ−２は血管系だけでなく赤血球生成とも関連している（Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ ＰＪ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ２００７． １７：８６２−５）。

【0003】

酸素がＨＩＦ−１αを調節するメカニズムは、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）の同定によって明らかにされた（Ｂｒｕｉｃｋ ａｎｄ ＭｃＫｎｉｇｈｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１． ２９４（５５４５）：１３３７−４０）。酸素正常状態では、ＰＨＤはＨＩＦ−１αの酸素依存性分解ドメインのプロリン残基をヒドロキシル化し、それにより、フォン・ヒッペル・リンドウ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ Ｌｉｎｄａｕ）タンパク質（ｐＶＨＬ）−エロンギンＢ−エロンギンＣへの結合が可能になり、半減期が約５分のアクティブなユビキチン化と分解をもたらす。対照的に、低酸素状態（細胞内の酸素不足）下での酸素欠乏は、ＰＨＤによるＨＩＦ−１αのヒドロキシル化を損ない、結果としてＨＩＦ−１α分解の減少、ＨＩＦ−１α安定化の増加、続いて血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ａ及びエリスロポエチン（ＥＰＯ）遺伝子を含む遺伝標的子の過剰な誘導をもたらす（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＭＨ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１３． ５６（２３）：９３６９−４０２５）。ＰＨＤは、触媒活性により酸素、鉄、２−オキシグルタル酸（２−ＯＧ）を必要とするジオキシゲナーゼ酵素のファミリーに属する。３つのＰＨＤアイソフォーム（ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、及びＰＨＤ３）が特定されており、それらの基質は非常に多様でアイソフォーム特異的であることが知られている（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＭＨ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１３． ５６：９３６９−４０２５及びＥｌｔｚｓｃｈｉｇら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１４． １１：８５２−６９）。

【0004】

ＰＨＤ２はＨＩＦ経路の制御に重要であると考えられている。具体的には、ＰＨＤ２の条件付きノックアウトで血管新生の促進、ＶＥＧＦ−Ａレベル及びＥＰレベルの増加が観察された（Ｔａｋｅｄａら， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００７． １１６：７７４−８１）。このような観察は、ＨＩＦがＥＰＯ放出を増強し、同時に赤血球生成を増加させることを示す報告とともに、ＰＨＤの調節によるＨＩＦの活性化が貧血及び虚血関連疾患の患者に有益である可能性を示唆している。したがって、全身性及び局所性の低酸素関連疾患を治療するために、ＰＨＤ活性を阻害することによりＨＩＦ経路を操作する薬理学的アプローチが追求されてきた（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＭＨ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１３． ５６： ９３６９−４０２５及びＥｌｔｚｓｃｈｉｇら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１４． １３：８５２−６９）。

【0005】

低酸素症などの脳損傷に続発する神経損傷は、複雑なプロセスである。ＨＩＦ−１αの安定化及びトランス活性化によって媒介される、生存又は細胞死に関連する一般的なメカニズムの活性化は、これらの条件で観察されている。ＰＨＤは、ＨＩＦ−１αの酸素依存性分解のゲートキーパーであり、細胞代謝の統合センサーとしても機能する（Ａｒａｇｏｎｅｓら， Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２００９． ９：１１−２２）。低酸素プレコンディショニング（ＨＰ：ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）がそれに続く重篤な無酸素症を防ぐ現象は、約２０年前に見出された。その後、ＨＰの効果はインビトロ及びインビボの低酸素モデルで集中的に研究されてきた。正確なメカニズムは完全には開示されていないが、基礎となる分子メカニズムが仮定されている。例えば、ＨＰは、ＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αレベルの安定化を含む多種多様な内因性保護メディエーターを活性化し、重度の酸素欠乏下での細胞生存能力を向上させる（Ｗｕら， ２０１２， Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉｃ ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ＣＮＳ， Ａｎｏｘｉａ， Ｄｒ． Ｐａｍｅｌａ Ｐａｄｉｌｌａ （Ｅｄ．）， ＩｎＴｅｃｈ， ＤＯＩ： １０．５７７２／２７６２１）。

【0006】

脳の低酸素症が発生する疾患には、脳卒中、外傷などがある。これまでに、これらの疾患から脳を保護する有効な薬物は存在していない。ＨＰのメカニズムの開示は、上記疾患の予防のための創薬に貢献する。低酸素症に対する多くの細胞適応応答はＨＩＦ−１αによって媒介され、ＨＰによるこの因子の活性化は重篤な無酸素症又は虚血に耐える能力を高める。一方、ＨＩＦ−１の標的遺伝子は、赤血球形成の制御におけるＥＰＯ、血管新生における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、グルコース取り込みにおけるグルコーストランスミッター（ＧＬＵＴ）、及び嫌気性解糖の解糖酵素など、エネルギー恒常性に関与している（Ｓｐｅｅｒら， Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｏ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２０１３． ６２：２３−３６）。さらに、乏突起膠細胞におけるＨＩＦ−１αの活性化は、ＥＰＯを誘導し、それにより興奮毒性に対する乏突起膠細胞の保護を付与することが報告されている（Ｓｕｎら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２０１０． ３０：９６２１−３０）。この意味で、脳卒中、脱髄性疾患、外傷性脳損傷などのいくつかの疾患におけるＥＰＯの利点も実証されている（Ｐｅｎｇら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ２０１４． １：６５３−６４、Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈら， Ｓｔｒｏｋｅ ２００９ ４０ （１２）： ｅ６４７−５６、Ｌｉら， Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２００４． ５６：７６７−７７）。さらに、デフェロキサミン（ＤＦＸ）などの低酸素模倣剤は、３−ニトロプロピオン酸（3-nitropoionic acid）によって誘発された神経損傷を保護する（Ｙａｎｇら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ２００５． ９６： ５１３−２５）。したがって、低酸素性小分子によるＰＨＤの阻害は、脳卒中や外傷などの低酸素症が生じる状態の臨床管理のための興味深い戦略又は治療法の開発を示す。

【0007】

かなりの数の薬理学的研究（一般に非特異的ＰＤＨ２阻害剤を使用）が動物モデルで実施されており、いくつかの臨床研究が実施されている。実際、いくつかの企業は、貧血や、ＩＢＤ、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、及び動脈疾患などの他の適応症に対するＰＨＤ阻害剤の創薬と開発に携わっており、これらはＰＨＤ阻害剤が、新規治療アプローチとして多くの研究者によって積極的に追求されている分野である（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＭＨ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１３． ５６：９３６９−４０２５及びＥｌｔｚｓｃｈｉｇら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１４． １３：８５２−６９）。さらに、ＰＤＨ阻害剤は創傷治癒及び組織リモデリングに影響を与え、コラーゲンゲルモデルシステムは組織リモデリングに関連する機能的アウトプットの測定に使用されることが示されている（Ｐｈｉｌｉｐｓら， Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２００５； ３１０：７９−８７）。

【0008】

ＨＩＦ発現の調節因子としてのＨＩＦ選択的ＰＨＤの本来の説明により、ＰＨＤに基づいた分子ツール及び治療法の開発のためのテンプレートが提示された。２−ＯＧアナログによるＰＨＤの薬理学的不活性化はＨＩＦ−１αを安定化するのに十分であるが、この作用は個々のＰＨＤアイソフォームに関して非特異的であり、インビトロの研究では、ＨＩＦ−１αの酸素分解ドメイン配列がＰＨＤ２によって最も効率的にヒドロキシル化されることが判明した（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＭＨ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１３． ５６：９３６９−４０２５）。これらの観察により、酵素修飾小分子阻害剤の特定に大きな関心が寄せられている。実に、いくつかのＰＨＤ阻害剤クラスが記述されており、ＤＦＸ、ヒドララジン、ＡＫＢ-４９２４、ＦＧ-２２２９、ＴＭ-６００８、及びＬ-ミモシンなどの鉄キレート剤、ＭＬＮ４９２４などのＣＵＬ２脱ＮＥＤＤ化剤（CUL2 deneddylators）、キシメチルオキサリルグリシンやＮ−オキサリル−ｄ−フェニルアラニンなどの２−ＯＧ模倣体、ピラゾロピリジン、８-ヒドロキシキノリ、化合物Ａ、ＦＧ-４４９７、及びＴＭ-６０８９などのＰＨＤ活性部位遮断薬、並びにＣｏ²⁺、Ｎｉ²⁺、及びＣｕ²⁺などのＦｅ２＋代替物質が含まれる。これらの化合物の作用機序は、必須Ｆｅ²⁺イオンを含む触媒ドメインへの補助基質２ＯＧの結合が、ＰＨＤ２酵素活性にとって重要であるという観察に基づいている。したがって、Ｎ−オキサリルグリシン又はその前駆体ＤＭＯＧ（ジメチルオキサロイルグリシン）などの２ＯＧを構造的に模倣する化合物は、前記補助基質の侵入をブロックすることによりＰＨＤ２を阻害する（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ＭＨ， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２０１３． ５６：９３６９−４０２５及びＥｌｔｚｓｃｈｉｇら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１４． １３：８５２−６９）。

【0009】

カンナビジオール（ＣＢＤ）は、大麻種に由来するフィトカンナビノイドであり、精神活性作用を有さず、鎮痛作用、抗炎症作用、抗新生物作用、及び化学予防作用を持つ。投与により、カンナビジオール（ＣＢＤ）は、カンナビノイド受容体１型（ＣＢ１）及びカンナビノイド受容体２型（ＣＢ２）によるシグナル伝達を含まない可能性が高い様々なメカニズムを介して、その抗増殖活性及びアポトーシス促進活性を発揮する。また、ＣＢＤはＰＰＡＲγの弱いアゴニストである（Ｇｒａｎｊａら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２０１２． ７：１００２−１６）。ＣＢＤは、癌細胞の浸潤と転移を阻害し、ＨＩＦ−１αの低酸素誘導安定化も阻害する（Ｓｏｌｉｎａｓら， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３． ８（１０）：ｅ７６９１８）核内受容体ＰＰＡＲγの弱い活性化因子である。対照的に、いくつかのＣＤＢキノール誘導体は、この核内受容体のより強い結合と活性化能力を示した（ｄｅｌ Ｒｉｏら， Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１６． ６：２１７０３）（Ｖｉｖａｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｅｓｐａｎａ， Ｓ．Ｌ． ２０１５． Ｎｏｖｅｌ Ｃａｎｎａｂｉｄｉｏｌ ｑｕｉｎｏｎｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ． ＷＯ２０１５１５８３８１Ａ１）。

【発明の概要】

【0010】

従来技術とは異なり、本発明の課題は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）を阻害する活性を示し、その結果ＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２α レベルの安定化をもたらし、ＨＩＦ依存性転写活性を誘導する化合物を提供することにある。したがって、本発明の課題は、ＰＨＤ活性の阻害から恩恵を受ける状態の治療に使用するための化合物を提供することにある。

【0011】

上述の通り、カンナビジオール（ＣＢＤ）はＨＩＦ−１α安定化を阻害するが、出願人は驚くべきことに、一部のＣＢＤキノール誘導体がＰＨＤ活性の阻害剤であり、したがってＣＢＤ前駆体のように安定化を阻害することなく、ＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αレベルを安定化することを見出した。

【0012】

より具体的には、本発明は、下記式（Ｉ）の化合物（ＣＢＤ−Ｑ誘導体）に関する：

【0013】

【化1】

【0014】

式中、Ｒは、アリール基、直鎖若しくは分岐アルケニル基、直鎖若しくは分岐アルキニル基、アシル基、又はアルコキシカルボニル基から独立して選択される基の炭素原子であるか、Ｒは、直鎖若しくは分岐アルキルアミン基、アリールアミン基、直鎖若しくは分岐アルケニルアミン基、又は直鎖若しくは分岐アルキニルアミン基から独立して選択される基の窒素原子であり、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための、前記化合物又はその誘導体。

【0015】

したがって、そうした式（Ｉ）の化合物及びそれを含む組成物はＰＨＤの阻害剤であり、その結果前記化合物及び組成物はＨＩＦ−１αタンパク質レベル及びＨＩＦ−２αタンパク質レベルを安定化し、異なる細胞型においてＨＩＦ経路を活性化し、ヒト血管内皮細胞の血管新生を誘導し、ＨＩＦ−１依存性遺伝子の発現を誘導し、コラーゲン収縮を仲介する能力を発揮する。よって、前記式（Ｉ）の化合物は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療において有用である。

【0016】

ＰＨＤ活性の阻害は、ＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−１βレベルの安定化をもたらし、これにより、酸素欠乏又は低酸素下での細胞生存能力が増強する。したがって、ＰＨＤ活性の阻害から恩恵を受ける条件は、低酸素症（細胞内の酸素不足）が起こる条件であり、したがって、ＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−１βレベルの安定化がその治療に有利となる条件である。酸素不足（低酸素症）が発生すると、一時的な生物学的応答によりＨＩＦ経路が活性化される。前記一時的な応答は、しばしば、前述の低酸素症によって生物に生じた損傷を修復し回避するのに十分な長さではない。本発明で開示される化合物は、ＰＨＤの活性を阻害することにより、低酸素症の場合の身体の応答を模倣し、ＨＩＦタンパク質のレベルを安定化し、ＨＩＦ経路を活性化することが可能であり、それにより低酸素症に見られる酸素の不足によって引き起こされる細胞損傷の保護に関与する血管新生、創傷治癒、及び／又は遺伝子の発現を誘導する。

【0017】

よって、ＰＨＤの阻害は、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、又は動脈疾患などの状態において有用な、ＨＩＦ依存性遺伝子の発現、血管新生、及びコラーゲン収縮を誘発する。

【0018】

本発明の目的のために、前記ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態は、限定されるものではないが、脳卒中、外傷、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、又は動脈疾患である。

【0019】

本明細書における説明目的のために、脳卒中は、脳血管が原因の神経学的欠損を指す。脳卒中は、虚血性及び出血性の２つの主要なカテゴリに分類され得る。虚血性脳卒中は、脳への血液供給の中断によって引き起こされるが、出血性脳卒中は、血管の破裂又は異常な血管構造から生じる。どちらの場合も、脳への酸素の正常な供給が中断されるため、脳卒中により脳細胞が低酸素状態になる。ＨＩＦ経路の薬理学的活性化は、その産物が急性低酸素イベントによって引き起こされる損傷から神経細胞を保護できる遺伝子の発現を高める。

【0020】

本明細書の目的のために、外傷は、救急医療を要する突然の発症及び重症度による身体的損傷を指す。外傷は、鈍的損傷、貫通、火傷のメカニズムによるものである。上記の外傷には、自動車の衝突、スポーツによる負傷、転倒、自然災害、その他の多数の身体的負傷が含まれる。これらのイベントでは、負傷により、しばしば細胞への血液供給が遮られるので、血管を通る酸素の通常の供給の中断による低酸素状態をもたらす。ＰＨＤ活性の阻害及びその結果としてのＨＩＦ経路の活性化は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生を促進し、組織への酸素供給を高める新しい血管の形成を増加させる。

【0021】

本明細書の目的のために、貧血は、血液中の赤血球又はヘモグロビンの総量の減少を指す。これは、細胞内の酸素供給量に影響を与え、低酸素状態に至る。ＰＨＤ活性の阻害及びその結果としてのＨＩＦ経路の活性化は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の産生を促進し、赤血球の産生を増加させる。

【0022】

本明細書の目的のために、心筋虚血−再灌流障害は、心筋虚血又は酸素不足（無酸素症、低酸素症）の期間後に血液供給が組織に戻るときに引き起こされる組織損傷を指す。ＰＨＤ活性の阻害及びその結果としてのＨＩＦ経路の活性化は、虚血性プレコンディショニングによる心臓保護を誘導する。虚血性プレコンディショニングは、短期間の虚血の非致死性エピソードへの事前曝露により、その後の虚血−再灌流障害中に心筋組織傷害が減弱する実験的戦略である。

【0023】

本明細書の目的のために、急性肺障害は、急性重症低酸素症を特徴とする状態を指し、その診断は、重篤患者の非心原性肺浮腫及び呼吸不全の存在に基づく。マウスにおけるＰＨＤ活性の阻害及びその結果としてのＨＩＦ経路の活性化は、機械的換気によって誘発される急性肺障害中の生存率の劇的な増加と関連していた（Ｅｃｋｌｅ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． ２０１３． ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． １１， ｅ１００１６６５）。

【0024】

本明細書の目的のために、感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫、又は真菌などの病原性微生物によって引き起こされる疾患を指し、前記疾患は、直接的又は間接的に人から人へと伝染し得る。ＰＨＤ活性の阻害及びその結果としてのＨＩＦ経路の活性化は、感染を除去する骨髄細胞の機能に関与している。ＨＩＦ１は食細胞の解糖代謝をサポートするために不可欠であるだけでなく、細菌の取り込み、抗菌エフェクター分子の産生、及び好中球の寿命延長などの重要な機能も制御する（Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇ， Ｈ．Ｋ． ａｎｄ Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ， Ｐ． Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２０１１． ３６４， ６５６-６６５）。

【0025】

本説明の目的のために、糖尿病性及び慢性創傷は、一連の順序立った経過でほとんどの創傷が治癒する予測可能な期間で治癒しない、糖尿病状態によって引き起こされる可能性のある創傷を指す。一般に、３か月以内に治癒しない創傷は、しばしば慢性と見なされる。ＰＨＤ活性の阻害及びその結果としてのＨＩＦレベルの安定化は、（１）治癒を促進する血管新生の強化、並びに（２）創傷治癒及び組織リモデリングにも影響するコラーゲン収縮をもたらす。

【0026】

本明細書の目的のために、急性腎障害は、７日以内に発症する多くの原因による腎機能の突然の喪失を指す。前記腎機能の突然の喪失は、腎組織の損傷を引き起こし、一般的に腎血流の減少（腎虚血）によって引き起こされる。

【0027】

臓器移植に関する本明細書の目的のために、いくつかの研究は、ＨＩＦ活性化因子が、心臓、腎臓、肺、又は肝臓移植などの固形臓器移植中の早期移植片不全を予防できることを示唆している。他の研究は、虚血及び再灌流も早期肝拒絶の重症度に影響を及ぼすなど、臓器移植において重要な免疫学的結果をもたらすことを示している（Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１４． １３：８５２−６９）。

【0028】

本説明の目的のために、動脈疾患には、末梢動脈の虚血及び慢性血管閉塞を伴う疾患のクラスが含まれる。虚血は通常、血管新生サイトカインの産生及び骨髄由来血管新生細胞のホーミングを誘導するが、ＨＩＦの発現低下により、これらの適応応答は加齢とともに損なわれる。ＨＩＦ経路の活性化は、大腿動脈結紮を受けた老齢マウスの灌流、運動機能、及び救肢を増加させた。同様に、別の研究により、Ｐｈｄ１の遺伝的欠失を有するマウスが、ＨＩＦレベルの増加の結果として後肢虚血中に保護されることを強く示す証拠が提示された（Ｅｌｔｚｓｃｈｉｇら， Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ． ２０１４． １３：８５２−６９）。

【0029】

好ましい実施形態では、Ｒは、直鎖若しくは分岐アルキルアミン基、アリールアミン基、直鎖若しくは分岐アルケニルアミン基、又は直鎖若しくは分岐アルキニルアミン基から独立して選択される基の窒素である。

【0030】

好ましい実施形態では、Ｒは直鎖アルキルアミンの窒素原子である。別の好ましい実施形態では、Ｒは分岐アルキルアミンの窒素原子である。別の好ましい実施形態では、Ｒはアリールアミンの窒素原子である。

【0031】

したがって、式（Ｉ）の化合物は、以下の能力を示す：
−本明細書で以下に開示する実施例２に示すように、ＰＨＤの活性を阻害する、すなわち、前記化合物はＰＨＤによるＨＩＦタンパク質のヒドロキシル化を阻害する、
−以下に開示する実施例１に示すように、ＨＩＦ経路を活性化する、
−本明細書で以下に開示する実施例２に示すように、ＨＩＦタンパク質レベルを安定化する、
−本明細書で以下に開示される実施例３に示されるように、ヒト血管内皮細胞において血管新生を誘導する、
−本明細書で以下に開示される実施例４に示されるように、ＨＩＦ−１α依存性遺伝子の発現を誘導する、及び
−以下に開示される実施例５に示されるように、コラーゲン収縮を誘発する。

【0032】

ＰＨＤのヒドロキシラーゼ活性の阻害及びその結果によるＨＩＦ−１αタンパク質レベル及びＨＩＦ−２αタンパク質レベルの安定化は、低酸素下での酸素欠乏がＰＨＤによるＨＩＦ−１αのヒドロキシル化を損ない、ＨＩＦ経路を活性化する状況を模倣する。

【0033】

本発明はまた、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物の誘導体を含む。前記式（Ｉ）の化合物の誘導体は、互変異性体、異性体、立体異性体、多形体、エステル、医薬的に許容される塩又は医薬的に許容される溶媒和物を指す。より好ましい実施形態では、前記式（Ｉ）の化合物の誘導体は、その医薬的に許容される塩を指す。

【0034】

「互変異性体」という用語は、化学プロセス（互変異性化）によって容易に相互変換される有機化合物の構成異性体である。

【0035】

「異性体」又は「立体異性体」という用語は、同一の化学構成を有するが、空間内の原子又は基の配置に関して異なる化合物を指す。

【0036】

本明細書で使用する用語「多形体」とは、同じ化学組成を有するが、結晶を形成する分子、原子、及び／又はイオンの空間配置が異なる結晶形を指す。

【0037】

「医薬的に許容される塩」という用語は、患者への投与時に本明細書に記載の化合物を（直接的又は間接的に）提供することができる任意の医薬的に許容される塩を指す。そのような塩は、生理学的に許容される有機酸又は無機酸との酸付加塩であることが好ましい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、及びリン酸塩などの鉱酸付加塩、並びに例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、及びｐ−トルエンスルホン酸塩などの有機酸付加塩が挙げられる。アルカリ付加塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、及びアンモニウム塩などの無機塩、並びに例えば、エチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ、Ｎ−ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、及び塩基性アミノ酸塩などの有機アルカリ塩が挙げられる。しかし、医薬的に許容されない塩も、意訳的に許容される塩の調製に有用である可能性があるため、医薬的許容されない塩も本発明の範囲に含まれることが理解されよう。塩形成の手順は、当技術分野で慣習的である。

【0038】

本発明による「溶媒和物」という用語は、本発明による活性化合物の任意の形態を意味すると理解されるべきであり、前記化合物は、非共有結合により別の分子（通常、極性溶媒）に結合し、特に水和物及びアルコラートを含む。

【0039】

本発明の好ましい実施形態では、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療において有用である前記式（Ｉ）の化合物は、下記式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）、及び（ＸＩ）の化合物である。

【0040】

【化2】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（エチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0041】

【化3】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0042】

【化4】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（イソブチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0043】

【化5】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ブチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0044】

【化6】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（メチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0045】

【化7】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（イソプロピルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0046】

【化8】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ベンジルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0047】

【化9】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ネオペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−）−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0048】

【化10】

（１’Ｒ，６’Ｒ）３−（イソペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−アミン−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0049】

ＶＣＥ−００４は、本発明による使用のための式ＩＩ〜Ｘの化合物の前駆体であり、ＣＢＤ（ＴＨＣ Ｐｈａｒｍａ、ドイツ、参照番号：ＴＨＣ−１０７３Ｇ−１０）から容易に合成できる（ｄｅｌ Ｒｉｏら， Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１６． ６：２１７０３及びＷＯ２０１５１５８３８１Ａ１）。

【0050】

【化11】

【化12】

【0051】

以下の実施例と図から推測されるように、式Ｉに含まれる３’位の修飾は、本発明の化合物にＨＩＦ経路を活性化する能力を付与し、したがって、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療に有用な化合物となる。

【0052】

重要なことは、ＣＢＤもＶＣＥ−００４（キノール環の前記３位に置換がないことを特徴とする既知のＣＢＤ誘導体）もＨＩＦ経路を活性化しないことから、本発明に記載の式（Ｉ）のＣＢＤ誘導体により示されるように、ＶＣＥ−００４のキノール環の３位の特定の修飾がＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害に重要であることが実証される。

【0053】

本明細書の実施例及び図に示されるように、式（Ｉ）の化合物に含まれる修飾は、本明細書に開示される化合物にＰＨＤの活性を阻害する能力を付与する。その結果、前記化合物は、ＨＩＦ−１αタンパク質レベル及びＨＩＦ−２αタンパク質レベルを安定化し、異なる細胞型でＨＩＦ経路を活性化し、ヒト血管内皮細胞で血管新生を誘導し、異なるＨＩＦ−１α依存性遺伝子の発現を誘導し、コラーゲン収縮を増加させる。

【0054】

本発明の一実施形態は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療に使用するための、本明細書の前記式（Ｉ）の化合物又は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）、及び（ＸＩ）の化合物のいずれかに関し、前記状態は、脳卒中、外傷、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、又は動脈疾患から独立して選択される。

【0055】

好ましい実施形態は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療に使用するための、本明細書の前記式（Ｉ）の化合物又は式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）、及び（ＸＩ）の化合物のいずれかに言及し、前記状態は、脳卒中、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、糖尿病性及び慢性創傷、急性腎障害、又は動脈疾患などの前記ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から独立して選択される。

【0056】

本明細書に開示される実施形態は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための、少なくとも下記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体、及び少なくとも１つの賦形剤又は担体を含む組成物、特に医薬組成物に言及する。

【0057】

【化13】

【0058】

式中、Ｒは、アリール基、直鎖若しくは分岐アルケニル基、直鎖若しくは分岐アルキニル基、アシル基、又はアルコキシカルボニル基から独立して選択される基の炭素原子であるか、Ｒは、直鎖若しくは分岐アルキルアミン基、アリールアミン基、直鎖若しくは分岐アルケニルアミン基、又は直鎖若しくは分岐アルキニルアミン基から独立して選択される基の窒素原子である。

【0059】

好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物の前記誘導体は、互変異性体、異性体、立体異性体、多形体、エステル、医薬的に許容される塩又は医薬的に許容される溶媒和物を指す。より好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物の前記誘導体は、その医薬的に許容される塩を指す。

【0060】

前記賦形剤又は担体は、本発明の目的のために、共溶媒、界面活性剤、油、保湿剤、皮膚軟化剤、防腐剤、安定剤、及び酸化防止剤などの不活性成分を指すが、これらに限定されない。トリス（ＴＲＩＳ）又はリン酸緩衝液など薬理学的に許容される緩衝液を使用してもよい。

【0061】

本発明による使用のための典型的な組成物は、一例として、担体又は希釈剤であり得る医薬的に許容される賦形剤と関連する本明細書で上述した式（Ｉ）の化合物又はその誘導体を含む。そのような組成物は、カプセル、小袋、紙、又は他の容器の形態であり得る。前記組成物の製造において、医薬組成物の調製のための従来技術を使用してもよい。例えば、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物は、担体と混合するか、担体で希釈するか、アンプル、カプセル、小袋、紙、又は他の容器の形態である担体内に封入することも可能である。前記担体が希釈剤として機能する場合、活性化合物の媒体、賦形剤、又は培地として作用する固体、半固体、または液体材料であり得る。本明細書で上述した使用のための式（Ｉ）の前記化合物及びそれを含む組成物は、例えば小袋内の粒状固体容器に吸着させることができる。適切な担体の例としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシ化ヒマシ油、落花生油、オリーブ油、乳糖、白土、ショ糖、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸又はセルロースの低級アルキルエーテル、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリド及びジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンである。同様に、前記担体又は希釈剤は、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの当技術分野で知られている徐放性材料を単独で、またはワックスと混合して含んでもよい。前記組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁剤、保存料、甘味剤、又は香味剤も含み得る。本発明に記載のＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための組成物は、当技術分野で周知の手順を使用することにより、患者への投与後、本明細書に開示される式（Ｉ）の化合物の即時放出、持続放出、又は遅延放出を提供するように処方され得る。

【0062】

前記医薬組成物は、所望により、本明細書に開示した前記化合物と有害に反応しない補助剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液及び／又は着色物質などと滅菌し混合することができる。

【0063】

本明細書に開示される別実施形態は、以下の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、又は（Ｘ）から選択される式（Ｉ）の化合物のいずれかを含む、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための組成物、特に医薬組成物に言及する。

【0064】

【化14】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（エチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0065】

【化15】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0066】

【化16】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（イソブチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0067】

【化17】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ブチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0068】

【化18】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（メチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0069】

【化19】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（イソプロピルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0070】

【化20】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ベンジルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0071】

【化21】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ネオペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−）−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0072】

【化22】

（１’Ｒ，６’Ｒ）３−（イソペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−アミン−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0073】

よって、上述の組成物は、ＰＨＤ活性を阻害する能力を発揮し、その結果、ＨＩＦ−１αタンパク質レベル及びＨＩＦ−２αタンパク質レベルを安定化し、異なる細胞型においてＨＩＦ経路を活性化し、ヒト血管内皮細胞の血管新生を誘導し、ＨＩＦ−１依存性遺伝子の発現を誘導し、コラーゲン収縮を誘導する。

【0074】

本明細書に記載の別の実施形態は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療に使用するための、少なくとも式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、又は（Ｘ）のカンナビジオール誘導体又はその誘導体を含む前記医薬組成物に言及し、前記状態は、脳卒中、外傷、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、又は動脈疾患から独立して選択される。前記組成物は、ヒト又は動物に投与されたときに治療効果を発揮する別の活性成分をさらに含んでいてもよい。

【0075】

前記使用のための医薬組成物の投与経路は、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体を、適切な又は所望の作用部位に効果的に輸送する、経口、経鼻、局所、経肺、経皮又は、例えば直腸、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、眼科用、又は軟膏による非経口投与などの任意の経路であり得る。

【0076】

経鼻投与の場合、前記組成物は、エアゾール用途のために、液体担体、特に水性担体に溶解又は懸濁した、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体を含み得る。前記担体は、可溶化剤、例えばプロピレングリコール、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）又はシクロデキストリンなどの吸収促進剤、若しくはパラベンなどの防腐剤などの添加剤を含んでいてもよい。

【0077】

局所組成物を調製するために、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体は、当技術分野で公知の皮膚科用媒体に入れられる。本明細書に開示した式（Ｉ）の化合物又はその誘導体の投与量及び局所製剤中の前記化合物の濃度は、選択された媒体、送達システム、又はデバイス、患者の臨床状態、副作用、及び製剤中の化合物の安定性によって決定する。したがって、医師は、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体を適切な濃度で含む適切な製剤を使用し、対象となる患者又は類似の患者の臨床経験に応じて、投与する製剤の量を選択する。

【0078】

眼科用途の場合、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体は、眼における使用に適した溶液、懸濁液、及び軟膏に処方される。前記濃度は通常、局所製剤について本明細書で上述した通りである。

【0079】

経口投与の場合、固体又は液体の単位剤形を調製できる。錠剤などの固体組成物を調製するために、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、乳糖、アカシア、メチルセルロース、及び医薬希釈剤又は担体と機能的に類似した材料などの従来の成分を含む製剤に混合される。

【0080】

カプセルは、本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体を不活性医薬希釈剤と混合し、混合物を適切なサイズの硬ゼラチンカプセルに充填することにより調製される。軟ゼラチンカプセルは、前記式（Ｉ）の化合物のスラリーを、許容される植物油、軽流動ワセリン、又は他の不活性油で機械的にカプセル化することにより調製される。シロップ剤、エリキシル剤、及び懸濁液などの経口投与用の流体単位剤形を調製することができる。水溶性剤形は、糖、芳香性香料、及び防腐剤とともに水性媒体に溶解してシロップを形成することができる。エリキシル剤は、砂糖やサッカリンなどの適切な甘味料と芳香性香料を含む水性アルコール（エタノールなど）を使用して調製される。懸濁液は、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁剤を助剤として、水性媒体で調製することができる。

【0081】

非経口使用のための適切な組成物は、適切な注射可能な溶液又は懸濁液の使用など、当業者には明らかである。無菌の組成物は、皮内、筋肉内、血管内、及び皮下を含む様々な局所又は非経口投与経路に適している。

【0082】

本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体に加えて、前記組成物は、所望の組成物及び送達様式に応じて、動物又はヒトへの投与のための医薬組成物を形成するために一般的に使用される媒体を含む、医薬的に許容される非毒性の担体又は希釈剤を含み得る。前記希釈剤は、組み合わせにおける生物学的活性に過度に影響しないように選択される。

【0083】

注射製剤に特に有用であるそうした希釈剤として、水、様々な生理食塩水、有機又は無機塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液が挙げられる。さらに、前記医薬組成物又は製剤は、アジュバント又は非毒性、非治療的、非免疫原性の安定剤など他の担体などの添加物を含んでいてもよい。

【0084】

さらに、前記開示組成物は、賦形剤を含むことができる。例として、共溶媒、界面活性剤、油、保湿剤、皮膚軟化剤、防腐剤、安定剤、及び酸化防止剤が挙げられる、これらに限定されない。トリス又はリン酸緩衝液など薬理学的に許容される緩衝液を使用してもよい。希釈剤、添加剤、及び賦形剤の有効量は、溶解度、生物活性などの点で医薬的に許容される製剤を得るのに有効な量である。

【0085】

本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体を含む前記医薬組成物は、ミクロスフェアに組み込まれていてもよい。本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体は、アルブミンミクロスフェアに充填することが可能であり、そのようなミクロスフェアを経鼻投与用の乾燥粉末で回収可能である。ミクロスフェアの調製に適した他の材料には、寒天、アルギン酸塩、キトサン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アルブミン、アガロース、デキストラン、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、及びカゼインが挙げられる。ミクロスフェアは、噴霧乾燥プロセス又は乳化プロセスなどの当業者に公知の様々なプロセスによって生成することができる。

【0086】

例えば、アルブミンミクロスフェアは、ウサギ血清アルブミンを含むリン酸緩衝液をオリーブオイルに攪拌しながら加えて油中水エマルジョンを生成することにより調製できる。グルタルアルデヒド溶液を前記エマルジョンに添加し、攪拌してアルブミンを架橋する。その後、ミクロスフェアを遠心分離によって単離し、オイルを除去し、スフェアを、例えば、石油エーテルそしてさらにエタノールで洗浄する。最後に、ミクロスフェアをふるいにかけ、回収し、ろ過により乾燥させることができる。

【0087】

澱粉ミクロスフェアは、ジャガイモ澱粉などの温かい澱粉水溶液を、攪拌しながらポリエチレングリコールを含む水の加熱溶液に加えてエマルジョンを形成することにより調製できる。二相系（澱粉溶液の内相を有する）が形成されたら、攪拌を続けながら混合物を室温まで冷却すると、内相がゲル粒子に変換される。次に、これらの粒子を室温でろ過し、エタノールなどの溶媒でスラリー化し、その後、粒子を再びろ過し、静置して大気乾燥する。前記ミクロスフェアは、熱処理などの周知の架橋手順によって、又は化学架橋剤を使用して硬化させることができる。適切な薬剤には、グリオキサール、マロンジアルデヒド、コハク酸アルデヒド、アジポアルデヒド、グルタルアルデヒド、及びフタルアルデヒドなどのジアルデヒド、ブタジオンなどのジケトン、エピクロロヒドリン、ポリリン酸塩、並びにホウ酸塩が挙げられる。ジアルデヒドは、アミノ基との相互作用によりアルブミンなどのタンパク質を架橋するために使用され、ジケトンはアミノ基とシッフ塩基を形成する。エピクロロヒドリンは、アミノ又はヒドロキシルなどの求核試薬を含む化合物をエポキシド誘導体に活性化する。

【0088】

本発明の別の好ましい実施形態は、本明細書で上述したＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療に使用するための、式（Ｉ）の化合物又はその誘導体及び前記化合物を含む組成物の投与スキームである。「単位剤形」という用語は、対象、例えばヒト、イヌ、ネコ、及びげっ歯類などの哺乳類の対象における単位投与量として適切な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬希釈剤、担体、又は媒体に関連して所望の医薬効果を生み出すために計算された所定量の活性物質を含む。単位剤形の仕様は、（ａ）本明細書に開示した前記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体の固有の特徴及び達成される特定の効果、並びに（ｂ）ヒト及び動物にける使用のための前記式（Ｉ）の化合物を配合する技術に固有の制限、によって指示されそれらに準拠する。単位剤形の例として、錠剤、カプセル、丸薬、粉末パケット、ウエハース、座薬、顆粒、カプセル剤、小さじ量、大さじ量、スポイト量、アンプル、バイアル、定量吐出エアロゾル、それらのいずれかの複数回投与形態、及びその他本明細書に記載の形態が挙げられる。本明細書に開示の使用のための組成物は、前記組成物の１又は複数の単位剤形及び本明細書に記載の１又は複数の疾患を治療するための使用説明書を含むキットに含まれ得る。

【0089】

いくつかの生体高分子（生体に基づいたシステム）、リポソーム、コロイド、樹脂、及び他の高分子送達システム又は区画化リザーバーを使用するシステムのいずれかを含む徐放又は持続放出送達システムを、本明細書に記載の組成物と共に利用して、 治療化合物の継続的又は長期的な供給源を提供する。そのような徐放システムは、局所、眼内、経口、及び非経口経路を介した送達のための製剤に適用可能である。

【0090】

本明細書で上述した式（Ｉ）の化合物又はその誘導体の有効量は、本発明に記載されるように、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態の治療における使用のための組成物に含まれる。本発明による使用のための前記化合物の有効量は、化合物及び治療される状態、例えば受益者である患者の年齢、体重、及び臨床状態に応じて変更される。他の要因には、投与経路、患者、患者の病歴、疾患プロセスの重症度、及び特定の化合物の効力が挙げられる。有効量は、患者に許容できない毒性を生じることなく、治療される疾患の症状又は兆候を改善するのに十分な量である。一般的に、化合物の有効量は、臨床医又は他の資格のある観察者が指摘するように、症状の主観的な軽減又は客観的に特定可能な改善のいずれかを提供する量である。

【0091】

本明細書に記載の一つの実施形態は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態を患う対象を治療する方法であって、下記式（Ｉ）の化合物又はその誘導体の何れか、又はそれを含む組成物、特に医薬組成物の有効量を前記対象に投与することを含み、

【0092】

【化23】

【0093】

式中、Ｒは、アリール基、直鎖若しくは分岐アルケニル基、直鎖若しくは分岐アルキニル基、アシル基、又はアルコキシカルボニル基から独立して選択される基の炭素原子であるか、Ｒは、直鎖若しくは分岐アルキルアミン基、アリールアミン基、直鎖若しくは分岐アルケニルアミン基、又は直鎖若しくは分岐アルキニルアミン基から独立して選択される基の窒素原子である、前記方法に言及する。

【0094】

好ましい実施形態では、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態を患う対象を治療する前記方法は、下記（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、又は（Ｘ）から独立して選択される式（Ｉ）の化合物のいずれかの有効量又はそれを含む組成物を前記対象に投与することを含む。

【0095】

【化24】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（エチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0096】

【化25】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0097】

【化26】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（イソブチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0098】

【化27】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ブチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0099】

【化28】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（メチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0100】

【化29】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（イソプロピルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0101】

【化30】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ベンジルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0102】

【化31】

（１’Ｒ，６’Ｒ）−３−（ネオペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−３’−メチル−）−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン

【0103】

【化32】

（１’Ｒ，６’Ｒ）３−（イソペンチルアミン）−６−ヒドロキシ−アミン−３’−メチル−４−ペンチル−６’−（プロプ−１−エン−２−イル）−［１，１’−ビ（シクロヘキサン）］−２’，３，６−トリエン−２，５−ジオン。

【0104】

本明細書に記載の別の実施形態は、ＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）活性阻害から恩恵を受ける状態を患う対照を治療する方法であって、前記方法は、有効量の式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、若しくは（Ｘ）の化合物又はその誘導体のいずれか、又はそれを含む組成物、特に医薬組成物を前記対象に投与することを含み、前記状態が、脳卒中、外傷、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、又は動脈疾患から独立して選択される、前記方法に言及する。

【図面の簡単な説明】

【0105】

【図1】図１は、式（Ｉ）のカンナビジオール誘導体による乏突起膠細胞でＨＩＦ−１αレベルの安定化誘導を示した図である。ウエスタンブロットによりＨＩＦ−１α及びα−チューブリンの発現を測定するために、１５０μＭのＤＦＸ、１μＭのカンナビジオール（ＣＢＤ）、ＶＣＥ−００４、化合物ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ若しくはＶ（図１Ａ）、又は化合物ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ若しくはＸ（図１Ｂ）のいずれかにより、ヒト乏突起膠細胞ＭＯ１３．３細胞を６時間刺激した。

【図2】図２は、乏突起膠細胞でのＨＩＦ−１αレベルの安定化を示した図である。

【図2A】図２Ａは、６時間の間に化合物ＶＩＩＩの濃度を増加又はＤＦＸ（１５０μＭ）によるＭＯ３．１３細胞への刺激を示した図である。タンパク質であるＨＩＦ−１α及びα−チューブリンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットにより決定した。

【図2B】図２Ｂは、２．５μＭの化合物ＶＩＩＩ又は１５０μＭのＤＦＸで刺激したＭＯ３．１３細胞におけるＨＩＦ−１α安定化の経時的誘導（１〜１２時間）を示した図である。タンパク質であるＨＩＦ−１α及びα−チューブリンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットにより決定した。

【図3】図３は、乏突起膠細胞でのＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αレベルの安定化ＰＨＤの発現に影響を及ぼさない、化合物ＶＩＩＩによって誘導されるＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αレベルの安定化を示した図である。ＭＯ３．１３細胞を、化合物ＶＩＩＩ又は１５０μＭのＤＦＸの濃度を増加することにより６時間刺激した。タンパク質であるＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＤＨ３、及びアクチンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットによって決定した。

【図4】図４は、カンナビジオールキノール誘導体によるＰＨＤ活性阻害を示した図である。ＰＨＤのＨＩＦ−１αヒドロキシル化活性の阻害及び化合物ＶＩＩＩによるＨＩＦ−１αの安定化を示す。プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２の存在下で、ＭＯ３．１３細胞を、化合物ＶＩＩＩ又は１５０μＭのＤＦＸの濃度を増加することにより６時間刺激した。タンパク質であるヒドロキシル化されたＨＩＦ−１α（ＯＨ−ＨＩＦ−１α）、ＨＩＦ−１α、及びアクチンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットによって決定した。

【図5】図５は、ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）でのＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αレベルの安定化を示した図である。

【図5A】図５Ａは、化合物ＶＩＩＩ濃度の増加又はＤＦＸ（１５０μＭ）によりＨＭＥＣに刺激を３時間付与したことを示した図である。タンパク質であるＨＩＦ−１α及びα−チューブリンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットにより決定した。

【図5B】図５Ｂは、２．５μＭの化合物ＶＩＩＩ又は１５０μＭのＤＦＸで刺激したＨＭＥＣにおけるＨＩＦ−１α安定化の経時的誘導を示した図である。タンパク質であるＨＩＦ−１α及びα−チューブリンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットにより決定した。

【図5C】図５Ｃは、ＨＭＥＣにおけるＰＨＤの発現に影響を及ぼさない、化合物ＶＩＩＩによって誘導されるＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αレベルの安定化を示した図である。ＨＭＥＣを、化合物ＶＩＩＩ又は１５０μＭのＤＦＸの濃度を増加することにより６時間刺激した。タンパク質であるＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、ＰＨＤ１、ＰＨＤ２、ＰＤＨ３、及びアクチンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットによって決定した。

【図6】図６は、神経細胞におけるＨＩＦ−１αレベルの安定化を示した図である。化合物ＶＩＩＩの濃度を増加又はＤＦＸ（１５０μＭ）により、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞へ刺激を６時間付与。タンパク質であるＨＩＦ−１α及びα−チューブリンの定常状態レベルは、ウエスタンブロットにより決定した。

【図7】図７は、化合物ＶＩＩＩによる血管新生誘導を示した図である。初代線維芽細胞と共培養し、化合物ＶＩＩＩ（１μＭ）又はＶＥＧＦＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）で７日間別々に刺激した、緑色蛍光ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における血管新生のモデルとしての内皮細胞管形成の測定ネットワーク長の値（ｍｍ／ｍｍ²）は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）を表す。

【図8】図８は、化合物ＶＩＩＩによるＨＩＦ−１α依存性遺伝子であるＶＧＦＡ及びＥＰＯの発現誘導を示した図である。ＭＯ１３．３細胞（図８Ａ）及びＨＢＭＥＣ細胞（図８Ｂ）を１２時間にわたって濃度を増加させた化合物ＶＩＩＩで刺激し、ＶＧＦＡ及びＥＰＯのｍＲＮＡの発現をｑＰＣＲにより決定した。データを平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）として表す。

【図9】図９は、コラーゲンゲル収縮に対する化合物ＶＩＩＩの影響を示した図である。ＮＩＨ ３Ｔ３−ＥＰＯ−Ｌｕｃ線維芽細胞を、提示した濃度の化合物ＶＩＩＩの有無にかかわらず、コラーゲンゲルに組み込んだ。

【図9A】図９Ａは、化合物ＶＩＩＩ（１μＭ、２．５μＭ、及び５μＭ）又はＤＭＧＯに反応して収縮したゲルマトリックスの２４時間画像を示した図である。

【図9B】図９Ｂは、ＩｍａｇｅＪを使用して合計ピクセル数で定量化したゲル表面積、＊ｐ＜０．０２５及び＊＊ｐ＜０．０１、を示した図である。

【実施例】

【0106】

以下に説明する本発明の実施例は、本発明の保護範囲を限定することなく本発明の実施形態を例示することを目的としている。

【0107】

実施例１．ＨＩＦ経路の活性化
異なる化合物の生物学的活性を調べるために、ＮＩＨ−３Ｔ３−ＥＰＯ−Ｌｕｃ細胞（表１）又はＨａＣａＴ−ＥＰＯ−ｌｕｃ細胞（表２）のいずれかでＨＩＦ−１αトランス活性化アッセイを実施した。ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＯ−ｌｕｃ細胞及びＨａＣａＴ−ＥＰＯ−ｌｕｃ細胞は、Ｅｐｏ−Ｌｕｃプラスミドで安定的にトランスフェクトされている。ＥＰＯ−低酸素応答性領域（ＨＲＥ）−ルシフェラーゼレポータープラスミドには、ルシフェラーゼ遺伝子に融合したエリスロポエチン遺伝子のプロモーターからのＨＲＥコンセンサス配列の３つのコピーが含まれている。

【0108】

ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＯ−ｌｕｃ細胞は、５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気下、３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで維持した。デフェロキサミン（ＤＦＸ）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国）から購入した。アッセイ前日に、細胞を（９６ウェルプレートに１ｘ１０⁴個／ウェルで）播種した。翌日、カンナビジオール（ＣＢＤ）、ＶＣＥ−００４、又は化合物ＩＩ〜Ｘのいずれかの濃度を増加して細胞を刺激した。６時間刺激後、細胞を、２５ｍＭトリスリン酸ｐＨ７．８、８ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び７％グリセロール中で、水平シェーカーを用いて室温で１５分間溶解した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州マディソン）の説明書に従って、マイクロプレート用ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）を使用して測定した。

【0109】

ＨａＣａＴ−ＥＰＯ−Ｌｕｃ細胞は、５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気下、３７℃で１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭで維持した。アッセイ前日に、細胞を（２４ウェルプレートに１ｘ１０⁵個／ウェルで）播種し、その後、カンナビジオール（ＣＢＤ）、ＶＣＥ−００４、又は化合物ＩＩ〜Ｘのいずれかの濃度を増加して細胞を刺激した。６時間刺激後、細胞を、２５ｍＭトリスリン酸（ｐＨ７．８）、８ｍＭのＭｇＣｌ₂、１ｍＭのＤＴＴ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及び７％グリセロール中で、水平シェーカーを用いて室温で１５分間溶解した。ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＯ−Ｌｕｃ細胞について示されているように、前記細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を測定した。ＲＬＵを計算し、両方の細胞株のＥＣ５０及びＩＲＡ（固有相対活性）値は、１５０μＭデフェロキサミン（ＤＦＸ）に対して以下の式を用いて決定した：ＩＲＡ係数＝（ＥＣ_50-DFX×Ｅ_max）／（ＥＣ₅₀×Ｅ_max-DFX）。ここでＥＣ₅₀及びＥ_maxはアゴニストのＥＣ₅₀及びＥ_maxを示し、ＥＣ_50-DFX及びＥ_max-DFXは標準アゴニストＤＦＸのＥＣ₅₀及びＥ_max値を示す（表１及び表２）。

【0110】

【表1】

【0111】

【表2】

【0112】

未処理細胞と比較して、全てのカンナビノイド誘導体でルシフェラーゼ活性の有意な増加が見られた。したがって、ＶＣＥ−００４の３位の化学修飾はＨＩＦ経路を活性化するために重要であると結論付けることができる。

【0113】

実施例２．カンナビノイド誘導体は、異なる細胞型でＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αレベルを安定化し、ＰＨＤのプロリルヒドロラーゼ活性を阻害する
式（Ｉ）の化合物によるＨＩＦ−１α安定化の制御に関する洞察を得るために、異なる細胞型におけるＨＩＦ−１α発現への影響を調べた。ヒト乏突起膠細胞であるＭＯ１３．３細胞を、１５０μＭのＤＦＸ又は１μＭのカンナビジオール（ＣＢＤ）、ＶＣＥ−００４、化合物ＩＩ〜Ｖ（図１Ａ）、化合物ＶＩ〜Ｘ（図１Ｂ）のいずれかにで６時間刺激した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＮａ₃ＶＯ₄、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１μｇ／ｍＬのペプスタチン、１μｇ／ｍＬのアプロチニン、及び１μＬ／ｍＬの飽和ＰＭＳＦを添加した、５０μＬのＮＰ−４０緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％グリセロール、及び１％ＮＰ−４０）でインキュベートした。遠心分離後、上清をＳＤＳサンプルバッファーと混合し、９５℃で沸騰させた。タンパク質を８％〜１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン膜（膜あたり２０Ｖで３０分）に転写した。脱脂乳又はＢＳＡ含有ＴＢＳＴ緩衝液でブロッキングした後、一次抗体を加えた。洗浄した膜を、増強化学発光システム（ＵＳＢ）によって検出された西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した適切な二次抗体とともにインキュベートした。ＨＩＦ−１αに対する抗体（６１０９５９）はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入し、抗−β−チューブリン抗体（クローンＡＡ２）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。

【0114】

本発明に記載の全ての化合物は、酸素正常状態（２１％Ｏ₂）下でＨＩＦ−１αタンパク質レベルを上昇させた。誘導の程度は、ＨＩＦ−１αレベルを安定化することが知られている鉄キレート剤であるデスフェリオキサミン（ＤＦＸ）と同等であった（図１Ａ及び図１Ｂ）。

【0115】

次に、ＭＯ１３．３細胞（乏突起膠細胞細胞株）を、化合物ＶＩＩＩの濃度を上げるかＤＦＸ（１５０μＭ）を用いて、６時間刺激した。その後、図１のようにタンパク質の分離とウエスタンブロットを行った。結果は、化合物ＶＩＩＩが濃度依存的にＨＩＦ−１αレベルの安定化を誘導することを示している（図２Ａ）。図２Ｂは、化合物ＶＩＩＩで処理したＭＯ１３．３のＨＩＦ−１αレベルの安定化の経時的経過を示す。

【0116】

ＨＩＦ−１αタンパク質レベル及びＨＩＦ−２αタンパク質レベルの安定化は、ＰＨＤタンパク質の発現の減少又はそのプロリルヒドロラーゼ活性の阻害により説明され得る。したがって、前記メカニズムのどれが前記安定化の原因であるかを特定するために、ＨＩＦ−１αタンパク質、ＨＩＦ−２αタンパク質、及びＰＤＨ（ＰＤＨ１、ＰＤＨ２、及びＰＤＨ３）タンパク質の発現をウエスタンブロットにより分析した。ＭＯ１３．３細胞を、化合物ＶＩＩＩの濃度を上げるかＤＦＸ（１５０μＭ）を用いて、６時間刺激した。その後、図１のようにタンパク質の分離とウエスタンブロットを行った。抗ＨＩＦ−２α抗体（ａｂ８３６５）、抗ＰＨＤ３抗体（ａｂ３０７８２）、抗ＰＨＤ１抗体（ａｂ８０３６１）、及び抗ＰＨＤ２抗体（ａｂ１０９０８８）は、Ａｂｃａｍ（英国ケンブリッジ）から購入した。

【0117】

結果は、化合物ＶＩＩＩがＰＤＨ１、ＰＤＨ２、及びＰＤＨ３の発現に影響を与えることなくＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αの発現を安定化したことを明確に示している（図３）。

【0118】

ＨＩＦ−１αレベルの安定化におけるＰＤＨの活性を検討するために、ＭＯ１３．３細胞を化合物ＶＩＩＩの濃度を増加させながら処理し、ヒドロキシル化ＨＩＦ−１α（ＯＨ−ＨＩＦ−１α）及び総ＨＩＦ−１αの定常状態レベルをウエスタンブロットにより同定した。図４に示すように、化合物ＶＩＩＩは総ＨＩＦ−１αタンパク質の発現の増加と並行して、ＯＨ−ＨＩＦ−１αの発現の減少を導いた。

【0119】

全体として、結果は、化合物ＶＩＩＩがＰＤＨのプロリルヒドロラーゼ活性を阻害し、結果としてＨＩＦ−１αレベル及びＨＩＦ−２αのタンパク質レベルが安定化されることを示している。

【0120】

式（Ｉ）の化合物によるＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−２αのタンパク質レベルの安定化は、他の細胞型でも示された。
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）は、化合物ＶＩＩＩの濃度を増加させながら処理し（図５Ａ）、異なる時点において化合物ＶＩＩＩ（２．５μＭ）で処理した（図５Ｂ）。化合物ＶＩＩＩが、濃度依存的にＭＯ１３．３細胞のＨＩＦ−１αレベルの安定化を誘導することが示されている（図５Ａ）。さらに、化合物ＶＩＩＩは、ＰＤＨ１、ＰＨＤ２、及びＰＨＤ３の発現に影響を与えることなく、このタイプの細胞でＨＩＦ−２αレベルの安定化も誘導する（図５Ｃ）。ＨＩＦ−１αの最大発現は、化合物ＶＩＩＩによる３時間の処理後に達成されたことも示されている（図５Ｂ）。同様に、化合物ＶＩＩＩは、神経細胞株であるＳＫ−Ｎ−ＳＨのＨＩＦ−１αレベルの安定化も誘導する（図６）。

【0121】

実施例３．式（Ｉ）の化合物により誘導される血管新生
生理学的モデルで化合物ＶＩＩＩによる刺激の機能的結果をテストするために、血管新生のモデルとして内皮細胞管形成を測定した。ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ（商標）ＧＦＰ ＡｎｇｉｏＫｉｔ−９６（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．、英国ウェルインガーデンシティ）は、尿細管形成の初期段階におけるヒトマトリックス（通常のヒト皮膚線維芽細胞、ＮＨＤＦ）及び内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖共培養系として提供された。ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ ９６ウェル動的血管新生アッセイを、製造元のプロトコルに従って実施した。簡単に説明すると、レンチウイルス感染した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）-ＨＵＶＥＣを、９６ウェルマイクロプレートで正常なヒト皮膚線維芽細胞と共培養した。プレートをＩｎｃｕＣｙｔｅに載置し、６時間ごとに７日間、位相及び蛍光の両方で画像を自動的に取得した。１日目に、化合物ＶＩＩＩ（１μＭ）又はｒｈＶＥＧＦＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）を内皮管腔ネットワークに添加し、実験中ずっと維持した。Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅを使用して、７日間のアッセイでの管腔形成を定量化した。このモジュールは、管腔の長さや分岐点の形成など、ネットワーク形成に対する血管新生の影響を評価するために使用される複数のアッセイ測定基準を提供する。簡単に説明すると、蛍光画像を分析して、インビトロネットワークに非常に近いセグメンテーションマスクを生成した。次に、マスクを改良して管腔形成イベントを具体的に識別し、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェア及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して動的応答をプロットした。

【0122】

図７に、１μＭの化合物ＶＩＩＩ及び陽性対照ＶｒｈＥＧＦＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）がＨＵＶＥＣ細胞のネットワーク長を著しく増加させたことを示す。

【0123】

実施例４．式（Ｉ）の化合物は、ＨＩＦ−１α転写因子によって調節される遺伝子の発現を調節する

【0124】

化合物ＶＩＩＩの効果の基礎となる分子メカニズムを理解するために、ＨＭＥＣ細胞を化合物ＶＩＩＩ（５μＭ）で１２時間処理した後、ｍＲＮＡそして低酸素症に関与する８４遺伝子の発現を、製造元の説明書（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｂｅｒｉａ、スペイン、マドリード）に従って、ヒト低酸素シグナル伝達経路ＲＴ²プロファイラーＰＣＲアレイを使用して分析した。このアレイには、線維症の発症に関与する８４の重要な遺伝子が含まれている。２^-ΔΔCt法を使用してデータを分析し、５つのハウスキーピング遺伝子で正規化した。

【0125】

表３に示すように、化合物ＶＩＩＩは、低酸素症及びＨＩＦ ＰＤＨ阻害剤に応答して上方制御されることが知られているＡＮＧＰＴＬ４及びＶＥＧＦＡを含む一連の遺伝子の発現を明確に上方制御した。

【0126】

【表3】

【0127】

式（Ｉ）の化合物によって制御される遺伝子発現の解析をさらに拡張するために、ヒト脳微小血管細胞（ＨＢＭＥＣ）及びＭＯ１３．３細胞を化合物ＶＩＩＩの濃度を増加させて１２時間処理し、ｍＲＮＡを単離した。ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、最大１μｇの全ＲＮＡから一本鎖相補ＤＮＡを合成した。反応混合物は、酵素増幅まで−２０℃で凍結した。ｉＱ（商標）ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ＶＥＧＦＡ及びＥＰＯのｍＲＮＡレベルを定量した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、リアルタイムＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を使用して、各試料のｍＲＮＡ発現レベルを標準化した。発現量は、２^-ΔΔCt法を使用して計算した。オリゴヌクレオチドプライマーの配列を表４に示す。

【0128】

化合物ＶＩＩＩは、ＭＯ１３．３細胞及びＨＢＭＥＣ細胞の両方でＥＰＯ及びＶＥＧＦＡの発現を上方制御した（図８Ａ及び図８Ｂ）。

【表4】

【0129】

実施例５．式（Ｉ）の化合物はコラーゲン収縮を誘発する

【0130】

式（Ｉ）の化合物が創傷治癒と組織リモデリングに影響するかを調べた。この目的のために、創傷治癒のモデルを使用して、線維芽細胞コラーゲンゲル収縮に対する化合物ＶＩＩＩの影響を評価した。ＮＩＨ３Ｔ３−ＥＰＯ−Ｌｕｃをトリプシンで培養プレートから持ち上げ、ＰＢＳで洗浄し、５００，０００細胞／ｍＬで完全培地に再懸濁した。コラーゲンゲルは前述の記載の通りに作成した（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ａｎｄ Ｂｏｎａｓｓａｒ． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２００５． ３１０：７９-８７）。全てのゲルには、化合物ＶＩＩＩ又は１ｍＭのＤＭＯＧ（ジメチルオキサロイルグリシン）の表示濃度の有無にかかわらず、最終濃度で１５０，０００個の細胞／ｍＬ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩが含まれていた。ゲルは、リリース後（ｔ＝０）とその後の様々な時点でデジタル画像化した。ゲル表面積は、ＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用してピクセル数で定量化した。表面積の相対的な変化は、元の表面積の割合として報告される。図９に示すように、化合物ＶＩＩＩへの線維芽細胞包埋ゲルの曝露は、陽性対照として使用されたＤＭＯＧと同じ程度で、コラーゲンゲルの収縮を促進した。これらの知見は、化合物ＶＩＩＩが組織のリモデリング及び創傷収縮に直接関係していることを示している。

【0131】

本結果は、脳卒中、外傷、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、及び動脈疾患などのＰＨＤ活性の阻害又はＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１βの安定化から恩恵を受ける状態（脳卒中、外傷、貧血、心筋虚血−再灌流障害、急性肺障害、感染症、糖尿病性及び慢性創傷、臓器移植、急性腎障害、及び動脈疾患など）の臨床管理のための、本発明に記載の化合物の治療的使用を実証する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]