特許 6976173 ステビオールグリコシドの酵素的修飾方法、それによって得られる修飾ステビオールグリコシド、およびそれらの甘味料としての使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6976173

(24)【登録日】2021年11月11日

(45)【発行日】2021年12月8日

(54)【発明の名称】ステビオールグリコシドの酵素的修飾方法、それによって得られる修飾ステビオールグリコシド、およびそれらの甘味料としての使用

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/56 20060101AFI20211125BHJP

   A23L 33/20 20160101ALI20211125BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20211125BHJP

   C07H 15/24 20060101ALI20211125BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20211125BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/56

   A23L33/20

   C12N15/54ZNA

   C07H15/24

   !C12N1/20 A

【請求項の数】16

【全頁数】34

(21)【出願番号】特願2017-547452(P2017-547452)

(86)(22)【出願日】2016年3月10日

(65)【公表番号】特表2018-509902(P2018-509902A)

(43)【公表日】2018年4月12日

(86)【国際出願番号】NL2016050172

(87)【国際公開番号】WO2016144175

(87)【国際公開日】20160915

【審査請求日】2019年3月1日

(31)【優先権主張番号】15158421.6

(32)【優先日】2015年3月10日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】514265131

【氏名又は名称】レイクスユニフェルシテイト フローニンゲン

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100132883

【弁理士】

【氏名又は名称】森川 泰司

(74)【代理人】

【識別番号】100148633

【弁理士】

【氏名又は名称】桜田 圭

(74)【代理人】

【識別番号】100147924

【弁理士】

【氏名又は名称】美恵 英樹

(72)【発明者】

【氏名】テ プーレ、エフェリーン マリア

(72)【発明者】

【氏名】デイクハウゼン、ルベルト

(72)【発明者】

【氏名】ヘルヴィッヒ、ヘリット ヨハンネス

(72)【発明者】

【氏名】カーメルリング、ヨハンニス パウルス

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１２／０２１４７５１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／０１９０５０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２０１４−５３０６３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Biomacromolecules，2009年，vol.10, no.3，p.580-588

【文献】 Appl. Microbiol. Biotechnol.，2015年01月15日，vol.99，p.5885-5894

【文献】 Food Science and Technology，2013年，vol.51，p.524-530

【文献】 Food Science and Technology，2014年，vol.57，p.400-405

【文献】 Molecules，2014年，vol.19，p.17345-17355

【文献】 Food Chemistry，2014年，vol.146，p.23-29

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ステビオールグリコシド基質を、グルコース供与体としてのスクロース、および、ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０の変異体である変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼの存在下で、インキュベートすることを含み、
前記ＧＴＦ１８０は配列番号１のアミノ酸配列を有する全長グルカンスクラーゼＧＴＦ１８０を含み、
前記変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端可変ドメイン断片を欠く切断型グルカンスクラーゼＧＴＦ１８０（ＧＴＦ１８０−ΔＮ）、（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＮおよびＣ末端ドメインＶ断片を欠く切断型グルカンスクラーゼＧＴＦ１８０（ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ）、ならびに、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列での位置を用いて示して、Ｓ１１３７Ｙ、Ｑ１１４０Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｙ、Ｌ９８１Ａ、Ｗ１０６５Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｆのアミノ酸置換の１つ以上を含む、前記ＧＴＦ１８０、前記ＧＴＦ１８０−ΔＮ、および前記ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶの変異型（配列番号１のアミノ酸配列でのＳ１１３７、Ｑ１１４０、Ｌ９８１、Ｗ１０６５は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列でのＳ３９８、Ｑ４０１、Ｌ２４２、Ｗ３２６に対応し、配列番号１のアミノ酸配列でのＳ１１３７、Ｑ１１４０、Ｌ９８１、Ｗ１０６５は、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列でのＳ３４５、Ｑ３４８、Ｌ１８９、Ｗ２７３に対応する）、からなる群より選択される１種類以上を含む、
Ｃ−１９位のみが修飾された修飾ステビオールグリコシドを酵素的に提供する方法。

【請求項2】

前記修飾ステビオールグリコシドが少なくとも１つのグルコース残基で修飾されている、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記修飾ステビオールグリコシドが、（α１→６）グリコシド結合、（α１→３）グリコシド結合、またはそれらの組み合わせを介して１つ以上のグルコースで修飾されている、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記修飾ステビオールグリコシドが、Ｃ−１９位においてのみ単一のグルコース残基で修飾されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ［１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシルエステル］、またはステビオシド（１３−｛［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルコピラノシル］オキシ｝エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシルエステル）である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記スクロースは、バッチ方式で添加される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、Ｓ１１３７Ｙ、Ｑ１１４０Ｅ、Ｌ９８１Ａ、Ｗ１０６５Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｆの変異のうちの１つ以上を有する、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、Ｎ末端可変ドメイン断片（ＧＴＦ１８０−ΔＮ）ならびに／またはＮおよびＣ末端ドメインＶ断片（ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ）を欠く切断型変異体である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｎ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＳ１１３７Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｌ９８１Ａ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５Ｌ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５ ＱおよびＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｎ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＳ１１３７Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｌ９８１Ａ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５Ｌ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５ ＱおよびＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５Ｆからなる群より選択される（ただし、変異の位置は配列番号１のアミノ酸配列での位置を用いて示す）、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

（ｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、
（ｉｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、および、
（ｉｉｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、
からなる群から選択される、修飾ステビオールグリコシド。

【請求項11】

低血糖甘味料としての請求項１０に記載の修飾ステビオールグリコシドの使用。

【請求項12】

請求項１０に記載の少なくとも１つの修飾ステビオールグリコシドを含む、甘味組成物。

【請求項13】

請求項１０に記載の少なくとも１つの修飾ステビオールグリコシドを含む消耗品。

【請求項14】

請求項１０に記載の有効量の修飾ステアビオールグリコシドを消耗品に含めることを含む、前記消耗品を甘味化する方法。

【請求項15】

ステビオールグリコシドのＣ−１９位のみを修飾することにより、当該ステビオールグリコシドの苦味および／または後味を完全にまたは部分的に除去するための、所望のトランスグリコシル化活性を有するラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株のＧＴＦ１８０の変異体の使用であって、
前記ＧＴＦ１８０は配列番号１のアミノ酸配列を有する全長グルカンスクラーゼＧＴＦ１８０を含み、
前記変異体は、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を有するＮ末端可変ドメイン断片を欠く切断型グルカンスクラーゼＧＴＦ１８０（ＧＴＦ１８０−ΔＮ）、（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を有するＮおよびＣ末端ドメインＶ断片を欠く切断型グルカンスクラーゼＧＴＦ１８０（ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ）、ならびに、（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列での位置を用いて示して、Ｓ１１３７Ｙ、Ｑ１１４０Ｅ／Ｆ／Ｎ／Ｙ、Ｌ９８１Ａ、Ｗ１０６５Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｆのアミノ酸置換の１つ以上を含む、前記ＧＴＦ１８０、前記ＧＴＦ１８０−ΔＮ、および前記ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶの変異型（配列番号１のアミノ酸配列でのＳ１１３７、Ｑ１１４０、Ｌ９８１、Ｗ１０６５は、それぞれ、配列番号２のアミノ酸配列でのＳ３９８、Ｑ４０１、Ｌ２４２、Ｗ３２６に対応し、配列番号１のアミノ酸配列でのＳ１１３７、Ｑ１１４０、Ｌ９８１、Ｗ１０６５は、それぞれ、配列番号３のアミノ酸配列でのＳ３４５、Ｑ３４８、Ｌ１８９、Ｗ２７３に対応する）、からなる群より選択される１種類以上を含む、
使用。

【請求項16】

ａ）ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株のＧＴＦ１８０の変異体の組を生成する工程、
ｂ）ステビオールグリコシドのグリコシル化を可能にする条件下で、水性反応混合物中のグルコース供与体の存在下で、各変異体をステビオールグリコシド基質とインキュベートする工程、及び
ｃ）少なくとも部分的に反応混合物が濁るのを防ぐ能力を決定することにより、ステビオールグリコシドを修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株のＧＴＦ１８０の少なくとも１つの変異体を選択する工程、
ｄ）修飾ステビオールグリコシドの構造を更に決定すると共に、ステビオールグリコシドのＣ−１９位のみを修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株の変異体ＧＴＦ１８０を選択する工程、
を含む、Ｃ−１９位のみでステビオールグリコシドを修飾することができるグルカンスクラーゼを同定する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は概して、ステビオールグリコシドの製造に関する。特に、本発明は、新規ステビオールグリコシドへのステビオールグリコシドの酵素的修飾方法、およびその甘味料としての使用に関する。

【0002】

甘味料は、食品、飲料および菓子産業において最も一般的に使用される成分としてよく知られている。甘味料は、製造中またはスタンドアローン使用のために、例えば、適切に希釈された場合または卓上用甘味料として、最終食品に組み込まれ得る。甘味料には、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、糖蜜、メープルシロップ、および蜂蜜などの天然甘味料、ならびにアスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースなどの人工甘味料が含まれる。

【0003】

ハーブ植物ステビア・レバウジアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）の葉、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）［キク科雑草（ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）］科の根粒性多年草は、ステビオールグリコシドである天然の甘味化合物の高品種を含む（Ｂｒａｎｄｌｅ ｅｔ ａｌ． １９９８）。ステビオシド（乾燥葉５−１０％ｗ／ｗ）とレバウジオシドＡ（２−４％ｗ／ｗ乾燥葉）が最も豊富で、それらはスクロース（０．４％水溶液）より約２００〜３００倍甘い。したがって、それらは、スクロースおよび人工（合成）甘味料のための「バイオ」代替物と考えられ得る（Ｇｅｕｎｓ ２００３； Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ． ２０１０； Ｐｕｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。

【0004】

甘味に加えて、高用量および通常の消費量における、いくつかのステビオールグリコシドは、抗酸化剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、胃腸保護剤（下痢止め剤）のような多様な薬理学的性質を有し、それらは、腎機能、血圧、および血糖値に正の効果があるようである（Ｃｈａｔｓｕｄｔｈｉｐｏｎｇ ａｎｄ Ｍｕａｎｐｒａｓａｔ ２００９； Ｍａｄａｎ ｅｔ ａｌ． ２０１０； Ｂｒａｈｍａｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ． ２０１１； Ｌｅｍｕｓ−Ｍｏｎｄａｃａ ｅｔ ａｌ． ２０１２； Ｓｈｉｖａｎｎａ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。それらは、肥満、糖尿病、高血圧、フェニルケトン尿症、心臓病および虫歯に苦しむ人々にとって有益であり得る （Ｙａｄａｖ ａｎｄ Ｇｕｌｅｒｉａ ２０１２）。ステビオールグリコシドは非カロリーであり、発がん性ではなく、遺伝毒性ではなく、ヒトの生殖／発生毒性に関係しない（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｆｏｏｄ Ｓａｆｅｔｙ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ， ２０１０）。

【0005】

構造的に、ステビオールグリコシドは、アグリコンとしてエント−１３−ヒドロキシカウル−１６−エン−１９−酸を有するが、炭水化物組成物とは異なる（図１参照）。

【0006】

１３−ｔｅｒｔ−水酸基のグルコース単位数と１９−カルボキシル基のグルコース単位数との比は、甘味およびステビオールグリコシドの味の質との関係を有するようである（Ｄａｒｉｓｅ ｅｔ ａｌ． １９８４）。例えば、レバウジオシドＡはステビオシドより苦味が少ない。ステビオシドの酵素的グルコシル化研究は、グリコシド結合特異性がステビオールグリコシドの官能特性にも影響を及ぼすことを示している。Ｆｕｋｕｎａｇａら（１９８９）は、Ｃ−１３位でのステビオシドのモノ−およびジ−（α１→４）−グルコシル化の両方が、甘味の強度および品質の両方において顕著な改善を伴う生成物を与えることを見出した。しかしながら、Ｃ−１９位でのモノ−およびジ−（α１→４）−グリコシル化の両方は、苦味のある後味を増加させ、より低い甘味強度をもたらした（Ｆｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ． １９８９）。一方、Ｃ−１９位のグルコース単位のＣ−６ヒドロキシル基へのα−結合グルコースの結合は、味の質において顕著な改善をもたらした（Ｌｏｂｏｖ ｅｔ ａｌ． １９９１）。明らかに、グリコシド結合のアノメリック性は、甘さおよび苦さ味覚に大きな影響を与えないが、いくつかの最近の研究は、１９−Ｏ−グルコシル部分に１つおよび２つのβ−結合グルコース単位をそれぞれ余分に有する、レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭ、両レバウジオシドＡ誘導体は、両方ともレバウジオシドＡおよび多くの他のステビオールグリコシドよりも望ましい味プロファイルを有する（Ｈｅｌｌｆｒｉｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ． ２０１２；特許文献１、特許文献２；Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。レバウジオシドＡと比較して、レバウジオシドＤは甘味が増し、水および炭酸飲料系での苦味を減少させた。レバウジオシドＭは、レバウジオシドＡと比べて苦味が減少したが、水溶液中の類似の甘味強度を示した。酸性化した水では、レバウジオシドＡと比較して、苦味の減少およびより高い甘味が認められた（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。更に、ステビオシドのＣ−１９位のグルコース単位のＣ−２ヒドロキシル基への（α１→２）−または（β１→２）−（レバウジオシドＥ）結合グルコースの結合は、ステビオシドの感覚刺激生成物を改善し、同様の甘味を有するが苦味を低減した化合物を生成した（Ｙｅ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。

【0007】

ステビア甘味料の商業化の成功の主な欠点は、そのわずかな苦味と渋み（特にステビオシド）である。これらの望ましくない特性は、ステビオールグリコシドのグリコシル部分を修飾することによって低減または排除することができる。

【0008】

ステビオールグリコシドの化学修飾は、これらの化合物の味の質を改善する目的で行われてきた。例えば、ステビオシドおよびレバウジオシドＡは、（ソジオスルホ）プロピル［（ＣＨ_２）_３ＳＯ_３Ｎａ］部分による１９−Ｏ−グルコシル残基の置換によって改善され得る（ＤｕＢｏｉｓ ｅｔ ａｌ． １９８１； ＤｕＢｏｉｓ ａｎｄ Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ １９８５）。更に、ステビオシドのいくつかの類似体は、別の単糖（例えば、β−Ｄ−Ｘｙｌ、α−Ｌ−Ａｒａ、α−Ｄ−Ｍａｎ、またはα−Ｌ−Ｒｈａ）のＣ−１９−Ｏ−β−Ｄ−グルコシル部分を置換すること、あるいは単糖（α−Ｌ−Ｒｈａまたはα−Ｌ−Ｑｕｉ）を有するＣ−１９β−Ｄ−グルコシル部分の伸長によって合成されている。しかしながら、選択的保護−脱保護合成戦略において多段階配列の必要性のために、ステビオールグリコシドを修飾するための化学的方法の適用は実用的でないと一般に考えられている。更に、有機溶媒および金属塩の使用は、食品産業において得られた誘導体の降心に問題を引き起こす。これらの問題を克服するために、生物触媒の代替物がより好ましく、「グリーン」ケミストリーの目的にも好ましい。

【0009】

有望な手順は、酵素的なトランスグリコシル化の反応にステビオールグリコシドを供することであり、それによって分子に新しい単糖残基を導入する。単糖残基の数、位置およびアノマー性（ａｎｏｍｅｒｉｃｉｔｙ）に依存して、化合物の味の質および効力は変化する。

【0010】

味を改善するために、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴアーゼ）（特許文献３、特許文献２）およびシクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴアーゼ）の間で、異なる酵素システムを用いてステビオールグリコシドの炭水化物部分の酵素的修飾を行った（Ｄａｒｉｓｅ ｅｔ ａｌ １９８４； Ｌｉ ｅｔ ａｌ ２０１３；特許文献４）。ＵＧＴａｓｅは、高い位置特異性を有する効率的な酵素であり、α−またはβ−結合グルコースの特定の位置への転移を触媒する。しかしながら、ＵＧＴａｓｅは、グリコシル供与体として高価なヌクレオチド活性化糖を必要とするため、工業的用途にはそれほど魅力的ではない。ＣＧＴａｓｅは、カップリングおよび不均化反応を触媒し、グルコース残基をデンプンまたはシクロデキストリンから受容体分子に転移させる。分子間のトランスグルコシル化反応は、ＣＧＴａｓｅ酵素の受容体特異性のために、ステビオールグリコシドの非還元末端グルコース残基のＣ−４−ヒドロキシル基でのみ起こると予想される。しばしば高収率が得られるが、ＣＧＴａｓｅは、ほとんどＣ−１３およびＣ−１９にα−Ｄ−グルコシル伸長を有する化合物の混合物であるステビオールグリコシドを生成するＣ−１３／Ｃ−１９レジオ特異性が低い。更に、ＣＧＴａｓｅ酵素によって導入された（α１→４）結合は、唾液中に存在するデンプン分解酵素によってヒトの口腔内で急速に加水分解され、それによりステビオールグリコシドのカロリー含量を増加させる。したがって、（α１→６）および（α１→３）結合のようなα−アミラーゼ耐性グリコシド結合の導入は、低カロリー食品およびゼロカロリー食品に対する消費者の要求に答えるので、より望ましい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１３／００７７１５２１号明細書

【特許文献2】国際公開第２０１４／１２２２２７号

【特許文献3】国際公開第２０１３／１７６７３８号（Ａ９）

【特許文献4】米国特許出願公開第２０１４／０２２７４２１号明細書

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、本発明者らは、酵素的に修飾されたステビオールグリコシドを提供するための新規な手段および方法を目指した。特に、彼らは、非修飾ステビオールグリコシドと比較して、減少した苦味および／またはより高い甘味を示す化合物を産生する酵素的方法を開発することに着手した。好ましくは、該方法は工業規模で経済的に魅力的であり、好ましくはグリコシル供与体として高価なヌクレオチド活性化糖を必要としない。

【課題を解決するための手段】

【0013】

この目的のために、ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）のような、酵素の大部分のメンバーが一般に安全と認められる（ＧＲＡＳ）というステータスを有する、種々の乳酸桿菌（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）のグルカンスクラーゼ酵素およびフルクタンスクラーゼ酵素のグルコシル化潜在性をスクリーニングした。グルカンスクラーゼは細胞外酵素であり、これは乳酸菌においてのみ起こることが報告されている。それらは、安価な供与体基質スクロースからα−グルカンポリマーを合成する。グルカンスクラーゼ酵素に依存して、種々のグリコシド結合（の混合）、すなわち（α１→２）−、（α１→３）−、（α１→４）−および（α１→６）結合がそのグルカン生成物に導入される（Ｌｅｅｍｈｕｉｓ ｅｔ ａｌ． ２０１３）。グルカンスクラーゼ酵素によって使用されるグルコシル供与体基質スクロースの低コストは、それらの工業的用途にとって大きな利点である。最も重要なことに、グルカンスクラーゼ酵素によって導入された（α１→２）−、（α１→３）−および（α１→６）結合は、唾液中に存在するアミロリシス酵素によって口腔内で加水分解されない。種々のラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株からの種々の産物特異性を有する野生型および変異体グルカンスクラーゼおよびフルクタンスクラーゼ酵素からなる１００を超える酵素を、ステビオールグリコシドレバウジオシドＡをグルコシル化する能力についてスクリーニングした。セミ分取ＮＰ−ＨＰＬＣによりレバウジオシドＡグルコシドを単離し、その構造をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析および１Ｄ／２Ｄ ^１Ｈ／^１３Ｃ ＮＭＲ分光法により解明した。新しいレバウジオシドＡグルコシドの味覚属性を決定するために官能評価を行った。

【0014】

驚くべきことに、ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０由来のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６９７４３０）のみがレバウジオシドＡをグルコシル化することができたことが判明した。レバウジオシドＡグルコシル化生成物のＮＭＲ構造分析は、ＧＴＦ１８０が、Ｃ−１９β−結合グルコース残基においてのみ特異的にレバウジオシドＡをグルコシル化することを示した。興味深いことに、いくつかのＧＴＦ１８０点変異体は、レバウジオシドＡに対してより高いトランスグルコシル化活性を示した。１つの変異体Ｑ１１４０Ｅは、約９６％のレバウジオシドＡ変換率を示した。ステビオシドの修飾に関しても同様の結果が観察された。

【0015】

したがって、一実施形態では、本発明は、ステビオールグリコシド基質をグルコース供与体およびラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の存在下でインキュベートすることを含む、修飾ステビオールグリコシドを酵素的に提供する方法を提供する。

【0016】

私たちの知るところでは、グルカンスクラーゼを用いたステビオシドのグルコシル化に関する唯一の報告がある。Ｍｕｓａらは、ステビオシドの生物変換におけるロイコノストック・シトレウム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ）ＳＫ２４．００２からのアルテルナンスクラーゼによる酵素修飾が、ステビオシドの苦味を完全にまたは部分的に除去することを報告している。最適化された反応条件では、ステビオシドで４３．７％の最大トランスグルコシル化収率が達成された。１〜３個のα−グルコース単位が結合したステビオシドグリコシドが得られた。フォローアップ研究では、生成物の構造が、１３−｛［α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルコピラノシル］オキシ｝エント−カウル−１６−エン−１９−酸β−Ｄ−グルコピラノシルエステルであると特徴づけられた（Ｍｕｓａ ｅｔ ａｌ． ２０１４）。したがって、Ｍｕｓａらの方法は、異なる酵素を使用し、より低い収率を示し、Ｃ−１９位ではなくＣ−１３位で異なるタイプの修飾、すなわちα−グルコシル化をもたらす。

【0017】

本発明の一実施形態では、ステビオールグリコシドは、Ｃ−１９β−結合グルコース残基において少なくとも１つのα−グルコース残基により修飾される。例えば、ステビオールグリコシドには、（α１→６）、（α１→３）グリコシド結合、またはそれらの組み合わせを介して１つ以上のグルコースが備わる。特定の態様では、修飾は、（α１→６）グリコシド結合（β−イソマルトース）または（α１→３）グリコシド結合（β−ニゲロース）を介した１つのグルコースの付加を含む（図５Ａ）。別の特定の態様では、修飾は、β結合グルコースにおける（α１→６）グリコシド結合を介したグルコシルグルコース単位の付加を含む。単位内では、グルコース残基は（α１→６）グリコシド結合（イソマルトース）または（α１→３）グリコシド結合（ニゲロース）（図５Ｂおよび５Ｃ）を介して結合することができる。

【0018】

ステビオールグリコシドは、複数の位置で修飾され得る。例えば、ステビオールアグリコンのＣ−１３位および／またはＣ−１９位（複数可）で修飾が起こり得る。レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭの魅力的な味覚特徴の観点から、ステビオールグリコシドは、好ましくは、少なくともステビオールグリコシドのＣ−１９位で修飾されている。

【0019】

より好ましくは、修飾ステビオールグリコシドは、ステビオールグリコシドのＣ−１９位でのみ修飾される。例えば、一実施形態では、本発明は、ステビオールアグリコンのＣ−１９位においてのみ単一のグルコース残基により修飾された修飾ステビオールグリコシドの酵素的生産方法を提供する。一実施形態では、修飾は、Ｃ−１９β結合グルコース残基における単一の（α１→６）グルコースの付加を含む。

【0020】

ステビオールグリコシド基質は、いかなるタイプのものであってもよい。例えば、それは、ステビオシド、ルブソシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥを含むレバウジオシドおよびズルコシド化合物からなる群から選択される。一実施形態では、ステビオールグリコシド基質は、ステビオールグルコシドのＣ−１９位に少なくとも１つの単糖部分を有する。

【0021】

特定の一実施形態では、ステビオールグリコシド基質はレバウジオシドである。本発明者らは、Ｃ−１９位でのレバウジオシドＡのα−グルコシル化が、レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭよりも類似またはより良好な味プロファイルを有するレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＭアノマー異性体を生じることができると仮定した。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、レバウジオシドＡ［１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシルエステル］の酵素的修飾方法を提供する。

【0022】

別の特定の実施形態では、ステビオールグリコシド基質はステビオシドであり、最も豊富で最も苦い味の１つである、ステビア抽出物に存在するステビオールグリコシドである。

【0023】

典型的には、乾燥重量に基づき、ステビアの葉に見られる４つの主要なステビオールグリコシドは、ズルコシドＡ（０．３％）、レバウジオシドＣ（０．６−１．０％）、レバウジオシドＡ（２−４％）およびステビオシド（５−１０％）である。ステビア抽出物において合理的な量で同定される他のグリコシドは、レバウジオシドＢ、Ｄ、Ｅ、およびＦ、ステビオールビオシドおよびルブソシドを含む。これらの中でも、現在、商業的規模では、ステビオシドおよびレバウジオシドＡのみが入手可能である。

【0024】

ステビオールグリコシドは、典型的には水または有機溶媒抽出のいずれかを含む当該技術分野で公知の方法を用いて葉から抽出することができる。超臨界流体抽出法および水蒸気蒸留法もまた記載されている。超臨界ＣＯ_２、膜技術、および水、またはメタノールおよびエタノールなどの有機溶媒を使用するステビア・レバウジアナ（Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）からのジテルペン甘味グリコシドの回収方法も使用することができる。

【0025】

米国特許出願公開第２０１４／３４３２６２号明細書は、以下の工程を含む、ステビオールグリコシドを精製する方法を開示する：ａ．吸着されたステビオールグリコシドを有する少なくとも１つのカラムを提供するために、吸着樹脂を充填した複数のカラムを含むマルチカラムシステムにステビオールグリコシドの溶液を通す工程、およびｂ．ステビオールグリコシドを吸着した少なくとも１つのカラムからの低含量のレバウジオシドＸ（米国特許出願公開第２０１４／０２２７４２１号明細書； Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ ２０１４）を有する画分を溶出して、ステビオールグリコシドを含む溶出溶液を提供する工程。

【0026】

レバウジオシドＡは一般的に≦８０％の純度で入手可能である。主な不純物は、ステビオシド、ステビオールビオシド、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＦおよび他のステビオールグリコシドを含む。多くの研究は、高い回収率での高純度のレバウジオシドＡの回収に焦点を当てていた。米国特許第５，９６２，６７８号明細書は、８０％純度のレバウジオシドＡを得るために無水メタノール溶液を用いてレバウジオシドＡを再結晶化することを開示している。無水メタノールで再結晶を何度も繰り返すことにより、レバウジオシドＡの純度を９５％以上に高めることができる。米国特許出願公開第２００６／００８３８３８号明細書は、エタノールと４〜１５％の水とを含む溶媒による再結晶によるレバウジオシドＡの精製を開示している。特願昭第５５−２３７５６号は、水性エタノール（＞７０％）からの結晶化によりレバウジオシドＡおよびステビオシドを精製して純度８０％のレバウジオシドＡを得る方法を開示している。米国特許出願公開第２００７／００８２１０３号明細書は、エタノール水溶液からの再結晶化によってレバウジオシドＡを精製する方法を開示しており、粗レバウジオシド（６０％）からの２段階再結晶により９７％収率で少なくとも純度９８％のレバウジオシドＡが生成される。米国特許第８，７９１，２５３号明細書は、単一の再結晶化工程のみを使用して、実質的に純粋なレバウジオシドＡ組成物を提供する。

【0027】

本発明の方法におけるステビオールグリコシド基質の濃度は、例えば、基質の種類、所望の修飾等によって異なる。典型的には、反応混合物は、少なくとも２０ｍＭ、好ましくは少なくとも３０ｍＭ、より好ましくは少なくとも５０ｍＭ、例えば６０、７０、８０、９０〜１００ｍＭの修飾されるステビオールグリコシドを含む。最大濃度は、とりわけ、水性反応媒体中の基質溶解度に依存する。例えば、基質として５０〜１００ｍＭのレバウジオシドＡまたはステビオシドを用いて良好な結果が得られた。

【0028】

本発明の方法は、グルコース供与体としてスクロースを使用する。スクロースは安価で広く入手可能である。スクロースが少なくとも５０ｍＭ、好ましくは少なくとも１００ｍＭ、より好ましくは少なくとも５００ｍＭの濃度で使用される場合、良好な結果が得られた。例えば、反応混合物は、少なくとも５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭまたは１Ｍスクロースを含む。２Ｍまたは３Ｍまでのより高い濃度を使用することもできる。グルコース供与体は、反応の開始時にその総量で添加され得る。いくつかの実施形態では、バッチ法式でスクロースを添加することが有利である。例えば、スクロースは、バッチ方式で、例えば、開始時に、１．５時間後および３時間後に、少なくとも１μＭ、より好ましくは少なくとも２μＭの最終量まで添加される。

【0029】

反応は、典型的には約２０〜７０℃の温度、３〜７のｐＨ範囲で実施される。好ましくは、約３７℃の温度が使用される。

【0030】

反応は、所望の量の修飾ステビオールグリコシドが生成されるまで進行させる。典型的には、インキュベーションは、約１時間〜一晩にわたり実施される。

【0031】

当業者は、所与の反応条件下で所望の程度の酵素修飾を得るために使用されるＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼ酵素の量を決定することができるであろう。例えば、１〜５０Ｕ／ｍＬを使用することができる。好ましくは、少なくとも３Ｕ／ｍＬが使用される。経済的理由から、３５Ｕ／ｍＬまで使用することが有利であり得る。一実施形態では、５〜３０Ｕ／ｍＬが使用される。１単位（Ｕ）の酵素は、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、１ｍＭのＣａＣｌ_２、および３７℃での１Ｍのスクロースを含む反応混合物中で１分間当たり１μｍｏｌの単糖を生成するのに必要な酵素の量として定義される。

【0032】

一実施形態では、ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株１８０由来の野生型ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼが使用される（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ６９７４３０）。別の実施形態では、変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼが使用される。本明細書中で使用される場合、変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、野生型アミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸欠失および／またはアミノ酸挿入を含む酵素を指す。

【0033】

好ましい実施形態では、本発明によるステビオールグリコシドの酵素的修飾のためのＧＴＦ１８０変異体は、Ｓ１１３７、Ｑ１１４０、Ｌ９８１および／またはＷ１０６５（ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＹ６９７４３０に基づくナンバリング）位に置換変異体を含む。好ましくは、変異体は非保存的置換、すなわち天然アミノ酸とは異なる性質を有するアミノ酸変化をもたらす変異体である。例えば、前記変異体は、以下のアミノ酸置換の１つ以上を有する：Ｓ１１３７Ｙ、Ｑ１１４０Ｅ、Ｌ９８１Ａ、Ｗ１０６５Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｆ。

【0034】

別の実施形態では、変異体ＧＴＦ１８０は、欠失変異体または切断型変異体であり、少なくとも１０アミノ酸のストレッチがＮ−および／またはＣ−末端から除去される。一態様では、切断型変異体は、Ｎ末端可変ドメインが欠失している残基７４２−１７７２を含むＧＴＦ１８０−ΔＮである。例えば、ＧＴＦ１８０全長野生型タンパク質の１１７ｋＤａのＮ末端切断型（７４１残基）断片であるＧＴＦ１８０−ΔＮで良好な結果が得られた。ＧＴＦ１８０−ΔＮは完全に活性であり、全長酵素と同様のサイズおよび結合分布を有するα−グルカンポリマーを産生する（Ｋｒａｌｊ ｅｔ ａｌ． ２００４ａ）。レバウジオシドＡグルコシル化生成物のＮＭＲ構造分析は、ＧＴＦ１８０−ΔＮが、Ｃ−１９β−結合グルコース残基においてのみ特異的にレバウジオシドＡをグルコシル化することを示した。興味深いことに、いくつかのＧＴＦ１８０−ΔＮ置換変異体は、レバウジオシドＡに対してＧＴＦ１８０−ΔＮよりもはるかに高いトランスグルコシル化活性を示した。１つの変異体Ｑ１１４０Ｅは、ＧＴＦ１８０−ΔＮによる約５５％のレバウジオシドＡ変換と比較して約９６％のレバウジオシドＡ変換を示した（図３および図４）。したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法は、例えばＱ１１４０、Ｓ１１３７、Ｌ９８１および／またはＷ１０６５の位置に、１つ以上のアミノ酸置換を有するＧＴＦ１８０−ΔＮを用いる。具体的な例示的変異体酵素には、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｎ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｒ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＳ１１３７Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｌ９８１Ａ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＷ１０６５Ｌ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＷ１０６５Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＷ１０６５ＱおよびＧＴＦ１８０−ΔＮＷ１０６５Ｆを含む。

【0035】

別の態様では、切断変異体は、Ｎ末端可変ドメインおよびＮ末端ドメインＶ断片（最初の７９３個のＮ末端アミノ酸に対応する）と、ドメインＶＣ末端断片（最後の１３６個のＣ末端アミノ酸に対応する）が欠失して（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１５ａ）、アミノ酸７９４−１６３６からなるＧＴＦ１８０変異体との両方をもたらすＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶである。「触媒コア」と見なすことができるこのＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ切断変異体は、全長ＧＴＦ１８０野生型と比較して約５０％のサイズの減少を有し、完全に活性であり、ＧＴＦ１８０野生型と同様のグリコシド結合分布を生成するが、高分子量の多糖類合成においては、著しく害される。

【0036】

本発明の切断変異体は、例えばその触媒特性を改善するために付加的な置換変異体（複数可）を更に含んでいてもよい。一実施形態では、変異体はＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶであり、更に位置（複数可）Ｓ１１３７、Ｑ１１４０、Ｌ９８１および／またはＷ１０６５において置換変異体を含む。例えば、前記変異体は、以下のアミノ酸置換の１つ以上を有する：Ｓ１１３７Ｙ、Ｑ１１４０Ｅ、Ｌ９８１Ａ、Ｗ１０６５Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｆ。具体的な例示的変異体酵素には、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｎ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｒ ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＳ１１３７Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＬ９８１Ａ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＷ１０６５Ｌ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＷ１０６５Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＷ１０６５ＱおよびＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＷ１０６５Ｆを含む。

【0037】

変異ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、例えば、Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎらにより説明され、それは、ＧＴＦ１８０−ΔＮ酵素の特定のアミノ酸残基の変異誘発を報告し、スクロースから修飾されたエキソポリサッカライド（ｍＥＰＳ）を産生する１２の変異体酵素を産生した（ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００９）。本発明者らは、ＧＴＦ１８０−ΔＮの単一変異体のうちの２つであるＱ１１４０ＥおよびＳ１１３７Ｙが、ＧＴＦ１８０−ΔＮよりもレバウジオシドＡに対するトランスグルコシル化活性がはるかに高く、ＧＴＦ１８０−ΔＮによる約５５％レバウジオシドＡ変換と比べて、それぞれ約９６％および約７３％のレバウジオシドＡ変換を示すことを見出した（図３および図４）。変異体Ｑ１１４０Ｅは主としてモノ−α−グルコシル化レバウジオシドＡを産生したが、ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体Ｓ１１３７Ｙは少なくとも８までのＤＰを有する複数のα−グルコシル化形態を産生した。α−グルコシル化生成物のＮＭＲ構造解析は、ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体Ｑ１１４０ＥおよびＳ１１３７Ｙが、Ｃ−１９位においてのみ特異的にレバウジオシドＡをグルコシル化することを示した。３つの酵素は、Ｃ−１９β−結合グルコースにおいて専ら（α１→６）結合グルコースでレバウジオシドＡをグルコシル化し、ＲｅｂＡＧ１を生成した。ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体Ｓ１１３７Ｙのジ−グルコシル化レバウジオシドＡ生成物は、末端α−グルコース残基において結合した（α１→３）結合グルコース（約７５％）または別の（α１→６）結合グルコース（約２５％）による両方のＲｅｂＡＧ１の伸長であった。したがって、特に好ましい変異体は、ＧＴＦ１８０−ΔＮのＱ１１４０ＥおよびＳ１１３７Ｙを含む。

【0038】

ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｌ９８１ＡおよびＷ１０６５Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｆ（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１５ｂ）は、レバウジオシドＡをα−グルコシル化することができるが、重合（すなわち、オリゴ糖およびグルカン形成）活性をほとんど示さない。これは、下流の処理、単糖、二糖、オリゴ糖およびグルカンからの伸長レバウジオシドＡ生成物の精製の間の明確な利点である。最も重要な副反応であるα−グルカン合成を排除することにより、より高いグリコシル化収率がレバウジオシドＡについて得られた。２００ｍＭスクロースにおいて、および１．５時間のインキュベーション時間で、これらの変異体は、レバウジオシドＡ上のＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体Ｑ１１４０ＥおよびＳ１１３７Ｙと同等またはそれ以上のトランスグルコシル化活性を有する。レバウジオシドＡを受容体分子として観察すると、変異体Ｑ１１４０Ｅもステビオシドを主にモノ−α−グルコシル化生成物に変換した。したがって、一実施形態では、変異体酵素は変異体Ｌ９８１Ａおよび／またはＷ１０６５Ｌ、Ｗ１０６５Ｅ、Ｗ１０６５Ｑ、Ｗ１０６５Ｆを含む。

【0039】

また、ステビオールグリコシドの感覚刺激特性を増強または改善するために、例えば、甘味を完全に増強するために、または苦味および／もしくはステビオールグリコシド、好ましくはレバウジオシドＡもしくはステビオシドの後味を部分的に除去するために、ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の使用が本明細書において提供される。

【0040】

レバウジオシドＡを修飾するのに有用な置換変異体のスクリーニングにおいて、レバウジオシドＡをα−グルコシル化することができない不活性変異体または酵素を含む反応混合物が、レバウジオシドＡの経時的な漸進的沈殿によりに濁ったことが観察された一方で、レバウジオシドＡをα−グリコシル化することができる活性酵素を含むものは透明のままであった。理論に縛られることを望むものではないが、レバウジオシドＡにグルコース部分を付加すると、その溶解性が増大する。この現象は、好ましくは最終レバウジオシドＡ濃度が最低５０ｍＭの場合には約６時間のインキュベーション後、最終レバウジオシドＡ濃度が最低３０ｍＭの場合には約１６時間インキュベーション後に、反応混合物の外観を評価することによって活性変異体の迅速な選択を可能にする。例えば、反応がマイクロタイタープレートまたは他のタイプの透明容器で行われる場合、更なる特徴付けのために１つ以上の変異体を同定するには単なる目視検査のみで十分であり得る。

【0041】

したがって、本発明はまた、ステビオールグリコシド、好ましくはレバウジオシドＡまたはステビオシドを修飾することができるグルカンスクラーゼを同定する方法であって、該方法は、
ａ）ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株１８０のＧＴＦ１８０の変異体のパネルを生成する工程、
ｂ）ステビオールグリコシドのグリコシル化を可能にする条件下で、水性反応混合物中のグルコース供与体の存在下で、各変異体をステビオールグリコシドとインキュベートする工程、及び
ｃ）少なくとも部分的に反応混合物が濁るのを防ぐ能力を決定することにより、ステビオールグリコシドを修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０のＧＴＦ１８０の少なくとも１つの変異体を選択する工程、
ｄ）任意に、修飾ステビオールグリコシドの構造を更に決定すると共に、ステビオールグリコシドのＣ−１９位を修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０の変異体ＧＴＦ１８０を選択する工程、を含む。

【0042】

好ましくは、変異体パネルは、Ｎ末端可変ドメイン（ＧＴＦ１８０−ΔＮ）ならびに／またはＮおよびＣ末端ドメインＶ断片（ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ）を欠く切断型変異体のような、切断型ＧＴＦ１８０酵素から出発して調製される。

【0043】

一実施形態では、変異体パネルは、異なる置換変異体、好ましくは非保存的置換変異体を含む。例えば、スクリーニング方法は、Ｑ１１４０位に異なる（非保存的）アミノ酸置換を有するＧＴＦ１８０（切断型）変異体のパネルを作製し、ステビオールグリコシドα−グルコシル化についてＱ１１４０変異体を全て試験することを含む。本明細書の以下の図８を参照。

【0044】

本発明の更なる態様は、本発明による方法によって得ることができる修飾ステロイドグリコシドに関する。一実施形態では、ステビオールグリコシドは、少なくとも１つのグルコース残基で修飾される。特定の態様では、修飾は、（α１→６）グリコシド結合（β−イソマルトース）を介して１つのグルコースの付加を含む（図５Ａ）。別の特定の態様では、修飾は、β結合グルコースにおける（α１→６）グリコシド結合を介したグルコシルグルコース単位の付加を含む。単位内では、グルコース残基は（α１→６）グリコシド結合（イソマルトース）または（α１→３）グリコシド結合（ニゲロース）（図５Ｂおよび５Ｃ）を介して結合することができる。

【0045】

本発明は、好ましくは、ステビオールグリコシドのＣ−１９位で修飾されたステビオールグリコシドを提供する。より好ましくは、修飾ステビオールグリコシドは、ステビオールグリコシドのＣ−１９位でのみ修飾される。例えば、一実施形態では、本発明は、ステビオールグリコシドのＣ−１９位で単一のα−グルコース残基でのみ修飾された修飾ステビオールグリコシドを提供する。一実施形態では、Ｃ−１９位は、単一の（α１→６）結合グルコースで修飾される。

【0046】

本発明の例示的な修飾ステビオールグリコシドは、
（ｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル（図５Ａ）
（ｉｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル（図５Ｂ）
（ｉｉｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル（図５Ｃ）からなる群から選択される。

【0047】

レバウジオシドＡの１９−Ｏ−グルコシル部分における（α１→６）グルコシル化のレバウジオシドＡの甘味および苦味に対する効果を測定するために、新規レバウジオシドＡグルコシドの１つ、つまり、（ｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステルをレバウジオシドＡと比較して味の評価を行った。このために、ブラインドテストでは、ステビオールグリコシドの苦い後味を知覚することができた１２人の試験者に、０から５の尺度で甘味と苦味を評価するように要求した。ここで、スコア０は甘味／苦味を示さない、５は非常に甘い／非常に苦いことを示す。新規レバウジオシドＡグルコシドがレバウジオシドＡと比較してより自然な甘味を増大させかつ苦味を減少させたことを示す明確な傾向が観察された（図７）。

【0048】

また、低血糖甘味料としての本発明による修飾ステビオールグリコシドの使用、および場合によっては他の食用成分、甘味料および／または甘味増強剤と組み合わせた、有効量の修飾ステビオールグリコシドを消耗品に含めることを含む、消耗品を甘味化する方法が提供される。

【0049】

更なる態様は、本明細書で提供される少なくとも１つの修飾ステビオールグリコシドを含む甘味組成物に関する。特定の実施形態では、甘味料組成物は、調理に使用されるか、または消費者によって飲料または他の食品に添加されるのに適した卓上甘味料である。そのような甘味料組成物は、包装してバルクで販売され得る。あるいは、特定の実施形態では、甘味料組成物は、消費者によって使用されるときに開封される一回分のパケットに包装される。特定の実施形態による甘味組成物の少なくとも１つの他の食用成分は、風味料、例えば、閾値知覚レベルでもしくはそれ未満もしくはわずかにそれを上回っている風味料、または消費者が容易に知覚できる量の風味料、流動剤、着色料、甘味料組成物が使用される飲料および他の食品中の取り扱いの容易さおよび／または改善された口当たりを提供する増量剤、ならびに／または他の適切な成分、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせであり得る。特定の実施形態では、増量剤（複数可）は、甘味料組成物によって前もってもたらされた甘味を増大させることによって、改善された甘味プロファイルを提供することができる。特定の実施形態では、少なくとも１つの他の食用成分は、エリスリトール、Ｄ−タガトース、および／またはＤ−プシコースであり、例えば、これらの成分の２つ以上の組み合わせが、甘味料組成物に含まれ、組み合わせは、例えば、エリスリトールおよびＤ−タガトース、またはエリスリトールおよびＤ−プシコース、またはＤ−タガトースおよびＤ−プシコースである。

【0050】

また、本発明による少なくとも１つの修飾ステビオールグリコシドを含み、任意に他の甘味料および／または甘味増強剤と組み合わされた消耗品も提供される。例えば、消耗品は、飲料、食料品、口腔ケア製品、たばこ製品、医薬品および栄養補助製品の群から選択される。

【0051】

典型的には、食料品は、甘味化量の本発明の修飾ステビオールグリコシドと、少なくとも１つの他の食品成分とを含む。本明細書で使用される場合、「食品成分」という用語は、風味、栄養、色、増量剤、食感または他の口当たり、安定性、酸味度、増粘性、固化防止性等またはこれらの任意の２つ以上の組み合わせを提供するのに適した任意の食用物質を意味する。以下に更に論じるように、本明細書で開示する新規な食品に使用するのに適した典型的な食品成分には、穀物成分、炭酸または非炭酸水、他の甘味料、例えば、甘味化量の少なくとも１つの栄養甘味料、風味料、酸味料、着色料、増量剤などを含む。特定の例示的な（すなわち、非限定的な）実施形態では、食品は、一回分の量で包装される。本開示のこの態様の食品には、例えば、固形食品、ゲル、飲料などが含まれる。

【0052】

適切な甘味料および甘味増強剤の例には、スクロース、フルクトース、グルコース、高フルクトースコーンシロップ、コーンシロップ、キシロース，アラビノース、ラムノース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、アセスルフェームカリウム、アスパルテーム、ネオテーム、スクラロース、サッカリン、およびそれらの混合物；トリロバチン、ヘスペレチンジヒドロカルコングルコシド、ナリンジンジヒドロカルコン、モグロシドＶを含むモグロシド、羅漢郭抽出物、ルブソシド、ルブス抽出物、グリシフィリン、イソモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、ネオモグロシド、ムクロジオシドＩｉｂ（ｍｕｋｕｒｏｚｉｏｓｉｄｅ Ｉｉｂ）、（＋）−ヘルナンズルチン、４β−ヒドロキシヘルナンズルチン、バイユノシド、フロミソシドＩ、ブリオドコシド、ブリオシドブリオノシド、アブルソシドＡ〜Ｅ、シクロカリオシドＡ、シクロカリオシドＩ、アルビジアサポニンＡ−Ｅ、グリチルリチン、アラボグリシルリチン、ペリアアンドリン１−Ｖ、プテロカリオシドＡおよびＢ、オスラジン、ポリポドシドＡおよびＢ、テロスモシドＡ８−１８、フィロズルチン、ハンキオシドＥ（Ｈｕａｎｇｑｉｏｓｉｄｅ Ｅ）ネオアスチルビン（ｎｅｏａｓｔｉｌｂｉｎ）、モナチン、３−アセトキシ−５，７−ジヒドロキシ−４’−メトキシフラバノン、２Ｒ，３Ｒ−（＋）−３−アセトキシ−５，７，４’−トリヒドロキシフラバノン、（２Ｒ，３Ｒ）−ジヒドロケルセチン３−Ｏ−アセテート、ジヒドロケルセチン３−Ｏ−アセテート４−メチルエーテル、ブラゼイン、クルクリン、マビンリン、モネリン、ネオクリン、ペンタジン、タウマチン、およびそれらの組み合わせを含む。上記の化合物のいくつかは、甘味増強剤および甘味料として知られている。甘味増強剤として使用される場合、それらは通常、甘味検出閾値未満で使用される。

【0053】

飲料には、例えば、ジュース飲料（例えば、１つ以上の果汁および／または１つ以上の野菜ジュースを含む飲料）、水分補給飲料、炭酸飲料（ＣＳＤ）、冷凍飲料、凍結炭酸飲料、ダイエットまたは他の減カロリー飲料などを含む。これらのカテゴリー間に重複があることは、当業者には認識されるであろう。本明細書で使用される場合、「減カロリー飲料」とは、フルカロリーバージョン（通常は以前市販されていた完全カロリーバージョン）と比較して飲料を提供する８オンス当たり少なくとも２５％のカロリーを減少させた飲料を意味し、（例えば、甘味料の実質的に全てが、スクロース、ＨＦＣＳなどの栄養甘味料に由来する）。少なくとも特定の実施形態では、低カロリー飲料は、完全カロリーバージョンと比較して提供する８オンスあたり約５０％のカロリーを減少させる。本明細書で使用する「低カロリー飲料」は、飲料と比較して提供する８オンスあたり４０カロリー未満である。本明細書で使用される場合、「ゼロカロリー」または「ダイエット」は、１回の提供当たり、例えば、飲料の８オンスあたり５カロリー未満を意味する。

【0054】

別の態様によれば、水、および少なくとも１つの酸を含む酸味料構成成分、少なくとも１つの風味成分を含む風味構成成分、甘味化量の修飾ステビオールグルコシドを含む甘味料構成成分、ならびに任意で甘味化量の１つ以上の他の甘味料を含む飲料製品が提供される。この態様による飲料製品の特定の例示的な実施形態では、飲料製品は、３．０より高く４．０より低いｐＨを有するすぐに飲める飲料である。そのようなすぐに飲める飲料は、例えば、水分補給飲料（スポーツ飲料とも呼ばれ、電解質を加えたもの）であってもよい。他の例示的な実施形態では、すぐに飲める飲料は、炭酸飲料、例えば減カロリーまたはダイエットコーラ飲料である。この態様による飲料製品の特定の例示的な実施形態では、飲料製品は、例えば、炭酸水又は非炭酸水で１：５の割合で希釈してすぐに飲める飲料を製造するのに適したシロップである。

【0055】

特定の実施形態によれば、本発明の修飾ステビオールグリコシドは、消耗品の全甘味料の少なくとも１０％を提供し、例えば、ダイエットコーラシロップ、すぐに飲めるダイエットコーラ飲料、別の飲料製品、または本開示に従った別の食品を提供する。特定の実施形態によれば、それは全甘味料の少なくとも２０％、または全甘味料の少なくとも３０％、または全甘味料の少なくとも４０％、または全甘味料の少なくとも半分、または全甘味料の少なくとも６０％または少なくとも７０％、または全甘味料の少なくとも８０％、または全甘味料の少なくとも９０％を提供する。任意に、それぞれの追加の甘味料成分は有機甘味料である。任意に、それぞれの甘味料成分は天然甘味料である。任意に、それぞれの甘味料成分はステビオールグリコシドである。任意に、それぞれの成分は、有機および／または天然の成分であり、従って、カロリー低減（例えば、ダイエット）炭酸コーラ飲料製品は対応して有機および／または天然の飲料製品である。

【0056】

好ましくは、消耗品は、図５に示すものから選択される少なくとも１つの修飾レバウジオシドＡを含む。

【0057】

例えば、飲料は、約３０ｐｐｍ〜約７５０ｐｐｍ（例えば、約５０ｐｐｍ〜３５０ｐｐｍ）の濃度の修飾レバウジオシドＡを含み得る。しかしながら、追加される量は、主に所望の甘味のレベルに依存し、他の成分の存在に依存し得る。例えば、果汁は糖を含み、したがって甘味のレベルに寄与する。一実施形態では、修飾レバウジオシドＡは、風味付けされた飲料に追加される唯一の甘味料である。別の実施形態において、修飾レバウジオシドＡは、他の甘味料および／または甘味増強剤と組み合わせることができる。好ましい実施形態において、修飾レバウジオシドＡは、モグロシドＶのようなモグロシドと組み合わされる。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】ステビオシド、レバウジオシドＡおよびＢ、およびステビオールビオシドの化学構造。［Ｇｌｃ１］など、ＮＭＲ割り当てのためのグルコース残基の表示。

【図2】０．１２ｍｇ／ｍＬの精製酵素を用いたトランスグルコシル化（黒棒）および加水分解（斜線棒）活性に対するレバウジオシドＡおよびスクロース濃度の影響：（Ａ）ＧＴＦ１８０−ΔＮ、（Ｂ）ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｓ１１３７Ｙおよび（Ｃ）ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｑ１１４０Ｅ。

【図3】１０Ｕ／ｍＬ ＧＴＦ１８０−ΔＮ（ＷＴ）、変異体Ｓ１１３７Ｙ、ならびに５０ｍＭレバウジオシドＡ（＊）および１Ｍスクロース（＊＊＝ＲｅｂＡＧ１）を有する変異体Ｑ１１４０Ｅの４時間のインキュベーションのＮＰ−ＨＰＬＣ生成物プロファイル。

【図4】１０Ｕ／ｍＬの酵素を用いたレバウジオシドＡ利用（破線）およびα−グルコシル化（実線）によるＲｅｂＡＧ１形成の時間経過：（Ａ）ＧＴＦ１８０−ΔＮ、（Ｂ）ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｓ１１３７Ｙおよび（Ｃ）ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｑ１１４０Ｅはそれぞれ、５５％、７３％および９６％の転換率を示した。

【図5(A)】ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮＳ１１３７ＹおよびＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅによって産生される修飾レバウジオシドＡグルコシドの構造：（Ａ）ＲｅｂＡＧ１＝１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル

【図5(B)】ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮＳ１１３７ＹおよびＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅによって産生される修飾レバウジオシドＡグルコシドの構造：（Ｂ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル

【図5(C)】ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮＳ１１３７ＹおよびＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅによって産生される修飾レバウジオシドＡグルコシドの構造：（Ｃ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル

【図5(D)】３３４ＫでＤ_２Ｏに記録されたＧＴＦ１８０−ΔＮ（ａ）および変異体Ｑ１１４０Ｅ（ｂ）およびＳ１１３７Ｙ（ｃ）のＲｅｂＡＧ１生成物の５００ＭＨｚ ^１Ｈ ＮＭＲスペクトル。

【図6】５０ｍＭステビオシドおよび５０ｍＭレバウジオシドＡと１００ｍＭスクロースとの１時間のインキュベーションで、２０Ｕ／ｍｌのＱ１１４０Ｅ有りおよび無しで、１ＭのＮａＯＨによるアルカリ鹸化の前後で得られた生成物のＴＬＣ分析。

【図7】いくつかの甘味料の官能評価（ｎ＝１２）：ステビオシド（２５０ｍｇ／Ｌ）、レバウジオシドＡ（３００ｍｇ／Ｌ）、ＲｅｂＡＧ１（３５０ｍｇ／ｍＬ）、およびスクロース（６０ｇ／Ｌ）。評価された味覚属性は、甘味（ハッチングされた棒）および苦味（実線）であった。スコア０＝甘くない／苦くない、スコア５＝非常に甘い／非常に苦い。

【図8】ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ（Ｑ）、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０アミノ酸置換変異体Ｑ１１４０Ｇ／Ｓ／Ｉ／Ｖ／Ｗ／Ｄ／Ｍ／Ｃ／Ｅ／Ｌ／Ｋ／Ｔ／Ｐ／Ｒ／Ｆ／Ｎ／Ｙ、またはＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅ（Ｅ＊）での５０ｍＭのレバウジオシドＡおよび２００ｍＭスクロースの２時間のインキュベーションで得られた生成物のＴＬＣ分析。

【図9(A)】ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０由来のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０のアミノ酸配列。パネル（Ａ）全長タンパク質。

【図9(B)】ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０由来のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０のアミノ酸配列。パネル（Ｂ）Ｎ末端切断型変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮ。

【図9(C)】ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０由来のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０のアミノ酸配列。パネル（Ｃ）Ｎ末端切断型およびドメインＶ切断型変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ。

【発明を実施するための形態】

【0059】

実験セクション
以下のセクションは、ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株１８０のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０−ΔＮおよびその誘導された単一アミノ酸置換変異体が、α−グルコシル化レバウジオシドＡに有利に使用されることを例示する。ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび誘導された変異体酵素は、唾液中に存在するデンプン分解酵素による加水分解に対して耐性である（α１→６）および（α１→３）グリコシド結合を導入して、Ｃ−１９位に特異的にレバウジオシドＡをグルコシル化する。いくつかのＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体は、ＧＴＦ１８０−ΔＮよりもレバウジオシドＡに対してはるかに高いトランスグルコシル化活性を示した。興味深いことに、１つの変異体Ｑ１１４０Ｅは、レバウジオシドＡのほぼ１００％の変換を示し、レバウジオシドＡのＣ−１９位でほとんどが単一の（α１→６）−グルコースに結合した。

【0060】

生成された新規レバウジオシドＡグルコシドは、非常に興味深く、Ｃ−１９β−結合グルコースにおいて特異的に１つおよび２つの（α１→６）結合グルコース単位を運ぶ。モノ−α−グルコシル化レバウジオシドＡ生成物、ＲｅｂＡＧ１は、レバウジオシドＡと比較して、より天然の甘味を増大させ、かつ苦味を減少させる。本発明のこれらの改良された新規ステビオールグリコシドは、機能性食品成分として非常に興味深い。

【0061】

材料および方法
ステビオールグリコシド基質
レバウジオシドＡ（２）およびステビオシド（１）はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。

【0062】

グルカンスクラーゼ酵素
全てのグルカンスクラーゼおよびフルクタンスクラーゼ酵素は、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ （２０１４）に記載されているように製造され、Ｋｒａｌｊ ｅｔ ａｌ （２００４ｂ）に記載されているように精製された。ＧＴＦ１８０−ΔＮは、１１７ｋＤａのＧＴＦ１８０全長タンパク質のＮ末端切断型（７４１残基）断片である（Ｋｒａｌｊ ｅｔ ａｌ． ２００４ａ）。ＧＴＦ１８０酵素のアミノ酸７９４−１６３６からなる切断型変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶの構築物は、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５ａ）に記載され、ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体酵素はｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ｅｔ ａｌ． （２００９）、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５ａ）、及びＭｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５ｂ）によって生成された。切断型変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶにおけるアミノ酸置換は、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１５ｂ）に記載されているように生成された。

【0063】

酵素活性アッセイ
酵素活性アッセイは、２５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）；１ｍＭのＣａＣｌ_２；３７℃で０．１２ｍｇ／ｍＬの精製したＧＴＦ１８０−ΔＮ酵素またはＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体酵素中の５０ｍＭレバウジオシドＡの有無にかかわらず、１００ｍＭおよび１０００ｍＭスクロースで実施した。１００μＬのサンプルを３０秒ごとに４分間採取し、２０μＬの１０００ｍＭであるＮａＯＨと共に３０分間インキュベートすることにより反応を直ちに停止させた。前述のように、不活性化サンプルを脱イオン水で２倍に希釈し、ヘキソキナーゼおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ／ホスホグルコースイソメラーゼアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を用いたＮＡＤＰの還元をモニターすることにより、１０μＬの希釈サンプルからグルコースおよびフルクトース濃度を酵素的に測定した（Ｍａｙｅｒ １９８７）。スクロースからのグルコースおよびフルクトースの放出の定量的決定は、グルカンスクラーゼ酵素の活性の推定を可能にした（ｖａｎ Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ． １９９９）。フルクトース放出は、全酵素活性に対応し、グルコース放出は、加水分解活性に対応する。トランスグリコシル化活性は、全活性から加水分解活性を差し引くことによって得ることができる。１単位（Ｕ）の酵素は、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、１ｍＭのＣａＣｌ_２、および３７℃での１０００ｍＭのスクロースを含む反応混合物中で１分間当たり１μｍｏｌの単糖を生成するのに必要な酵素の量として定義される。

【0064】

ステビオールグリコシドの酵素的グリコシル化
インキュベーション反応は、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、１ｍＭのＣａＣｌ_２、５０〜１０００ｍＭのスクロース、５０〜１００ｍＭのステビオールグリコシド、および２〜３０Ｕ／ｍＬの精製したＧＴＦ１８０−ΔＮ酵素またはＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体酵素中で３７℃で１５分〜２４時間行った。熱不活性化（１００℃で１５分間）により反応を停止させた。不活性化サンプルから２５０ｕＬを１０００ｍｌの１０ｍＭであるカテコール（内部標準）と混合し、続いてＳｔｒａｔａ−Ｘ ３３ｕ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｐｈａｓｅカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いた固相抽出によって精製した。ＨＰＬＣ分析のために、２０μＬの精製サンプルを、Ｌｕｎａ１０μｍＮＨ２クロマトグラフィーカラム（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）に注入した。反応構成成分を勾配溶出条件下で１ｍＬ／分の流速で分離し、７０％溶媒Ａの２分間のアイソクラティックステップから開始し、続いて９分間にわたる７０〜５５％溶媒Ａの直線勾配（溶媒Ａ＝アセトニトリル；溶媒Ｂ＝０．０２５％酢酸）を行った。レバウジオシドＡおよびモノ−α−グルコシル化レバウジオシドＡ生成物の濃度は、対応する１．５６〜５０ｍＭの較正曲線を用いてＮＰ−ＨＰＬＣで測定した。全てのデータは、カテコールを内部標準として標準化した。反応の標準偏差は５％未満であった。Ｅｎｄｕｒａｎｃｅオートサンプラー（Ｓｐａｒｋ Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を備えたＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００クロマトグラフィーシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）上で全てのＮＰ−ＨＰＬＣ分析を実施した。

【0065】

α−グルコシル化レバウジオシドＡ生成物の定量的合成
ＧＴＦ１８０−ΔＮおよびその誘導された変異体を用いたα−グルコシル化レバウジオシドＡ生成物の定量的合成のために、５ｍＬ、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、１ｍＭのＣａＣｌ_２、５０ｍＭのステビオールグリコシド中で、合計２，０００ｍＭのスクロースに対する、１０００ｍＭ当量のスクロース供与体の２つのバッチ（ｔ＝０および３時間）と共に、３７℃で１０Ｕ／ｍＬの酵素を用いて２４時間インキュベートした。Ｓｔｒａｔａ−Ｘ ３３ｕポリマー逆相カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いた固相抽出によって、インキュベーション混合物から生成物を精製した。生成物をＬｕｎａ１０μｍＮＨ_２セミ分取クロマトグラフィーカラム（２５０ｍｍ×１０ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で分離し、流速４．６ｍＬ／分で手動で回収し、８０％溶媒Ａの２分間のアイソクラティックステップから開始して、８０分〜５０％の溶媒Ａの３８分にわたる直線勾配（溶媒Ａ＝アセトニトリル；溶媒Ｂ＝０．０２５％酢酸）が続いた。集めた画分の溶媒を窒素ガスの気流下で蒸発させ、乾燥した材料を脱イオン水に溶解した。

【0066】

薄層クロマトグラフィー
ｎ−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１で展開したＴＬＣシート（Ｍｅｒｃｋ Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４、２０×２０ｃｍ）上にサンプルをスポットした。スポットは、オルシノール／硫酸染色によって視覚化し、標準化合物の同時分析と比較した。

【0067】

アルカリ鹸化
１９−Ｏ結合グリコシル部分を放出させるために、４ｍｇの各ステビオールグリコシド生成物を１ＭのＮａＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、８０℃で２．５時間加熱した。

【0068】

質量分析
窒素レーザー（３３７ｎｍ、３ｎｓのパルス幅）を備えたＡｘｉｍａ（商標）質量分析計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｋｒａｔｏｓ Ｉｎｃ．，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）実験を行った。陽イオンモードスペクトルは、５０００ＦＷＨＭの分解能および４５０ｎｓの遅延抽出で反射モードを使用して記録した。加速電圧は１９ｋＶであり、グリッド電圧は７５．２％であった。ミラー電圧比は１．１２であり、取得質量範囲は２００−６０００Ｄａであった。マトリックス溶液として７０％ＡＣＮ中の１μＬ、１０％の２，５−ジヒドロキシ安息香酸と１μＬのサンプル溶液を混合することによってサンプルを調製した。

【0069】

ＮＭＲ分光法
解像度が向上した１Ｄ／２Ｄ ５００ＭＨｚ １Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＤＲＸ−５００スペクトロメータ（Ｂｉｊｖｏｅｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， Ｕｔｒｅｃｈｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＤ_２Ｏで３３４Ｋのプローブ温度で記録した。データ収集および処理はＢｒｕｋｅｒ Ｔｏｐｓｐｉｎ ２．１で行った。分析前に、中間凍結乾燥したＤ_２Ｏ（９９．９原子％Ｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ａｎｄｏｖｅｒ， ＭＡ）中でサンプルを２回交換し、次いで０．６ｍＬのＤ_２Ｏに溶解した。重水素水信号（４．４０ｐｐｍでのＨＯＤ）の抑制は、１Ｄ ＮＭＲ実験にＷＥＦＴ（水除去フーリエ変換）パルスシーケンスを適用し、２Ｄ実験で緩和遅延の間に１秒の事前飽和を適用することによって達成された。２Ｄ ＴＯＣＳＹスペクトルは、４０〜２００ｍ秒のスピンロック時間を有するＭＬＥＶ−１７（Ｌｅｖｉｔｔ ｅｔ ａｌ （１９８２）によって考案された複合パルス）混合シーケンスを使用して記録した。２Ｄ ＲＯＥＳＹスペクトルは、２００ｍ秒の混合時間で標準Ｂｒｕｋｅｒ ＸＷＩＮＮＭＲソフトウェアを用いて記録した。搬送周波数は、スピンロック中のＴＯＣＳＹ転送を最小にするために、スペクトルのダウンフィールドエッジで設定した。^１Ｈ ＦＩＤの取得中にデカップリングすることなく、自然の豊富な２Ｄ ^１３Ｃ−^１Ｈ ＨＳＱＣ実験（^１Ｈ周波数５００．０８２１ＭＨｚ、^１３Ｃ周波数１２５．７５５２ＭＨｚ）を記録した。スペクトルの分解能向上は、１Ｄスペクトルのローレンツ−ガウス変換、または２Ｄスペクトルに対してπ／（２．３）シフトした二乗ベル関数位相を用いた乗算によって行われ、必要に応じて５次の多項式ベースライン補正を行った。化学シフト（δ）は、内部アセトン（^１Ｈではδ２．２２５、^１３Ｃではδ３１．０７）を基準としてｐｐｍで表される。

【0070】

レバウジオシドＡの新規α−グルコシル化生成物の官能評価
レバウジオシドＡ（３５０ｍｇ／Ｌ）の新規α−グルコシル化生成物をスクロース（６０ｇ／Ｌ）、レバウジオシドＡ（３００ｍｇ／Ｌ）、ステビオシド（２５０ｍｇ／Ｌ）と比較した味覚の評価を行った。ブラインドテストでは、ステビオールグリコシドの苦い後味を知覚することができた１２人の試験者に、０から５の尺度で甘味と苦味を評価するように要求した。ここで、０は甘味／苦味を示さない、５は非常に甘い／非常に苦いことを示す。

【0071】

結果
レバウジオシドＡのα−グルコシル化のためのグルカンおよびフルクタンサクラーゼ酵素のスクリーニング
主にラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）由来の１００以上のグルカンおよびフルクタンスクラーゼ野生型および変異体酵素を、レバウジオシドＡα−グルコシル化についてスクリーニングした。このために、酵素を５０ｍＭのレバウジオシドＡ（図１）および１０００ｍＭのスクロース中で３時間インキュベートした。反応混合物のＨＰＬＣおよびＴＬＣ分析は、ＧＴＦ１８０−ΔＮ酵素およびＧＴＦ１８０−ΔＮの変異体酵素のみがレバウジオシドＡをグリコシル化し得ることを示した（表１）。興味深いことに、移行状態安定化残基Ｄ１１３６（ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００９）に近い単一のアミノ酸置換である２つの単一のＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｓ１１３７ＹおよびＱ１１４０Ｅは、レバウジオシドＡに対するＧＴＦ１８０−ΔＮよりも優れたトランスグルコシル化活性を示した。また、ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｌ９８１ＡおよびＷ１０６５Ｌ（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ２０１５ｂ）は、レバウジオシドＡ（表１）をα−グルコシル化することができたが、重合（すなわち、スクロースからのオリゴ糖およびグルカン形成）活性はほとんど示されなかった（データを示していない）。これは、下流の処理、単糖、二糖、オリゴ糖およびグルカンからのα−グルコシル化レバウジオシドＡ生成物の精製の間の明確な利点である。α−グルカン合成を排除することにより、最も重要な副反応である、より高いグリコシル化収率がレバウジオシドＡについて得られた。より低いスクロース濃度（２００ｍＭ）では、これらの変異体は、ＧＴＦ１８０−ΔＮならびに変異体Ｓ１１３７ＹおよびＱ１１４０ＥよりもレバウジオシドＡと同等またはそれより高いトランスグルコシル化活性を有していた（データを示していない）。

【0072】

【表1】

【0073】

レバウジオシドＡのグルコシル化に対する反応条件を最適化するために、ＧＴＦ１８０−ΔＮならびに変異体Ｓ１１３７ＹおよびＱ１１４０Ｅのトランスグルコシル化活性に対するレバウジオシドＡおよびスクロースの効果を測定した。このために、５０ｍＭレバウジオシドＡの有無にかかわらず、１００ｍＭおよび１０００ｍＭのスクロースで酵素活性アッセイを実施した。３つの酵素は全て、低スクロース濃度でより加水分解した（図２）。両方の変異体酵素は１００ｍＭスクロースでほぼ完全に加水分解した。しかし、５０ｍＭレバウジオシドＡを反応に添加した場合、またはスクロース濃度を１０００ｍＭに増加させた場合、３つの酵素全てのトランスグルコシル化活性が顕著に増加し、１Ｍのスクロースおよび５０ｍＭのレバウジオシドＡで最高の全活性および最も高いトランスグルコシル化対加水分解比を示した。これらの反応条件は、ＧＴＦ１８０−ΔＮならびに変異体Ｓ１１３７ＹおよびＱ１１４０ＥによるレバウジオシドＡのα−グルコシル化をより詳細に追跡するために用いられた。

【0074】

５０ｍＭのレバウジオシドＡ、１０００ｍＭのスクロース、および１０Ｕ／ｍＬ酵素を使用した場合、ＧＴＦ１８０−ΔＮによる約５５％と比較して、変異体Ｓ１１３７ＹおよびＱ１１４０Ｅはそれぞれ約７３％および約９６％のレバウジオシドＡをグルコシル化した（図４）。驚くべきことに、変異体Ｑ１１４０Ｅは、主にモノグルコシル化レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡＧ１）を産生し、５０ｍＭのレバウジオシドＡから約３５ｍＭのＲｅｂＡＧ１を産生した（図３および図４）。変異体Ｓ１１３７Ｙは、ＧＴＦ１８０−ΔＮ酵素（約１３ｍＭ）と同様の量のＲｅｂＡＧ１を産生したが（図３）、より多い量の複合グリコシドを合成した（図３）。

【0075】

試験した全てのグルカンおよびフルクタンスクラーゼ酵素から、変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅは最も高いレバウジオシドＡグルコシル化活性を示し、主にレバウジオシドＡのモノグルコシル化を示した。したがって、変異体Ｑ１１４０Ｅ／Ａ／Ｈに加えて、変異体ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶにおいて位置Ｑ１１４０における更なるアミノ酸置換も生じ、レバウジオシドＡグルコシル化について試験された（図８）。このために、１ｍｇ／ｍｌの酵素を緩衝液（２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．７）、１ｍＭのＣａＣｌ_２）中の５０ｍＭのレバウジオシドＡおよび２００ｍＭのスクロースと共に３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション混合物をＴＬＣで分析した（図８）。これらの条件下で、いくつかのＱ１１４０置換変異体（例えばＱ１１４０Ｆ／Ｎ／Ｙの場合）は、変異体Ｑ１１４０Ｅよりも高いレバウジオシドＡグルコシル化を示したが、後者はまだ最高のモノ−グルコシル化収率を有していた。いくつかの変異体（例えば、Ｑ１１４０Ｄ）は、レバウジオシドＡグルコシル化に対してわずかに負の効果を有した。興味深いことに、変異体Ｑ１１４０Ｒはスクロースに対してほとんど活性を示さなかったが、レバウジオシドＡのグルコシル化は変異体の影響をほとんど受けなかった。スクロースは主にレバウジオシドＡのグルコシル化に使用され、オリゴ糖形成などの副反応には使用されなかったようである。

【0076】

ＧＴＦ１８０−ΔＮならびにＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｓ１１３７ＹおよびＱ１１４０Ｅによって産生されるレバウジオシドＡグルコシドのα−グルコシル化生成物の単離および特徴付け
レバウジオシドＡ（図１）の分子構造を見ると、総１４個の遊離ヒドロキシル基を有する４つのＧｌｃｐ残基（Ｇｌｃ１、Ｇｌｃ２、Ｇｌｃ３およびＧｌｃ４）があり、これらはトランスグルコシル化の受容体として作用することができる。

【0077】

ＧＴＦ１８０−ΔＮは、スクロースをオリゴ糖および多糖に変換し、（α１→３）−および（α１→６）−結合におけるＧｌｃｐ残基のトランスグルコシル化を触媒し（ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ｅｔ ａｌ． ２００８）、Ｇｌｃ残基の最初の結合のためにレバウジオシドＡに存在する３つの潜在的（１→３）部位および４つの潜在的（１→６）部位が存在する。

【0078】

構造的特徴付けのレバウジオシドＡグルコシドのα−グルコシル化生成物を単離するために、５０ｍＭのレバウジオシドＡおよび１０００ｍＭのスクロースを含む１０Ｕ／ｍＬ酵素と共にインキュベーションを行った。３時間後、１０００ｍＭの過剰のスクロースを反応混合物に添加し、更に２１時間インキュベーションした。セミ分取ＮＰ−ＨＰＬＣを用いて反応混合物からグルコシドを単離した。興味深いことに、モノ−α−グルコシル化生成物のＮＭＲ構造分析およびメチル化分析は、Ｃ−１９β結合グルコースにおいてのみ、ＧＴＦ１８０−ΔＮならびに変異体Ｓ１１３７ＹおよびＱ１１４０Ｅが特異的にレバウジオシドＡをグルコシル化し、（α１→６）結合グルコース（１００％）を結合して、ＲｅｂＡＧ１を産生する（図５Ａも参照のこと）ことを示した。

【化1】

【0079】

ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび変異体Ｓ１１３７Ｙのジ−グルコシル化レバウジオシドＡ生成物は、（α１→３）結合グルコース（約７５％）（図５Ｃ）または別の（α１→６）結合グルコース（約２５％）によるＲｅｂＡＧ１の構造の両線状伸長であった（図５Ｂ）。図５Ｄのパネル（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、それぞれＧＴＦ１８０−ΔＮ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０ＥおよびＧＴＦ１８０−ΔＮＳ１１３７Ｙによって産生されたＲｅｂＡＧ１の５００ＭＨｚ ^１Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。

【0080】

レバウジオシドＡのＣ−１９β−グルコシル部分のみに生じるＧＴＦ１８０−ΔＮによるトランスグルコシル化による過剰のＧｌｃｐ残基の導入が起こったことを確認するために、単離された画分をアルカリ鹸化に付して、１９−カルボキシル−グルコシルエステル結合を特異的に加水分解した（図１および図６）。ＴＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ｍ／ｚ８２６［Ｍ＋Ｈ］^＋）およびＮＭＲ分光法により、同一の生成物をレバウジオシドＡおよびレバウジオシドＡのα−グルコシル化生成物から得た。ここで、レバウジオシドＡは、Ｃ−１９において完全なグルコシル部分を欠いている。得られた構造体は、レバウジオシドＢ（３）（図１）として知られている。

【0081】

ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｑ１１４０ＥによるステビオシドのＣ−１９位特異的α−グルコシル化
商業的目的のために、全ステビオールグリコシド葉抽出物の甘味を改善し、苦味を減少させることが望ましい場合がある。ステビオシド（約５〜１０％ｗ／ｗ乾燥葉）は最も豊富で最も苦味のあるステビオールグリコシドの１つであるため、我々の目的はステビオシドの味覚を高めることでもあった。したがって、ＧＴＦ１８０−ΔＮおよび受容体分子としてのステビオシドを有するその誘導された置換変異体を用いたグルコシル化反応も行った。３つの酵素は全てステビオシドをα−グルコシル化することもできた。受容体分子としてのレバウジオシドＡを観察すると、変異体Ｑ１１４０Ｅはステビオシドを主に単一のモノ−α−グルコシル化生成物に変換した（データ示さず）。ＧＴＦ１８０−ΔＮ変異体Ｑ１１４０ＥがステビオシドをＣ−１９位で特異的にグルコシル化するか否かを決定するために、Ｑ１１４０Ｅによって産生されたステビオールグルコシドを、１ＭのＮａＯＨで１９−カルボキシル−グルコシルエステル結合をアルカリ鹸化して、Ｃ−１９部分を特異的に除去した。Ｑ１１４０Ｅステビオールグルコシドのアルカリ鹸化によりステビオールビオシド（４）（図１）（すなわち、ステビオシドからＣ−１９部分を除いた）が得られると、グルコシル化はステビオシドのＣ−１９位で特異的に起こった。ＴＬＣプレート上で、複数のステビオールグリコシドがＱ１１４０Ｅを有するステビオシドの１時間のインキュベーションで視認された（図６）。しかし、インキュベーション混合物を１ＭのＮａＯＨで処理し、ステビオシド陽性対照の鹸化後に生成した生成物と同じ高さで移動した場合には、ただ１つのスポットしか観察されなかった。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により、６６５．５９の分子量が検出され、これはステビオールビオシドのナトリウム付加物に対応する。これらの結果は、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０ＥがまたＣ−１９β結合グルコシル部分においてステビオシドを特異的にα−グルコシル化することを示している。

【0082】

レバウジオシドＡの新規合成α−グルコシル化生成物の味覚評価
レバウジオシドＡの１９−Ｏ−グルコシル部分における（α１→６）グルコシル化が甘味および苦味に及ぼす影響を決定するために、レバウジオシドＡの新規α−グルコシル化生成物の１つである、ＲｅｂＡＧ１をレバウジオシドＡと比較して味覚の評価を行った。このために、ブラインドテストでは、ステビオールグリコシドの苦い後味を知覚することができた１２人の試験者に、０から５の尺度で甘味と苦味を評価するように要求した。ここで、０は甘味／苦味を示さない、５は非常に甘い／非常に苦いことを示す。新規ＲｅｂＡＧ１がレバウジオシドＡと比較してより自然な甘味を増大させかつ苦味を減少させたことを示す明確な傾向が観察された（図７）。

【0083】

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【0111】

ｖａｎ Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ ＧＨ， Ｆａｂｅｒ ＥＪ， Ｓｍｉｔ Ｅ， Ｂｏｎｔｉｎｇ Ｋ， Ｓｍｉｔｈ ＭＲ， Ｔｅｎ Ｂｒｉｎｋ Ｂ， Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ ＪＰ， Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ ＪＦＧ， Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ Ｌ （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｌｕｃａｎ ａｎｄ ｆｒｕｃｔａｎ ｅｘｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ． Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６５：３００８−３０１４．

【0112】

ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ＳＳ， Ｋｒａｌｊ Ｓ， Ｅｅｕｗｅｍａ Ｗ， Ｇｅｒｗｉｇ ＧＪ， Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ Ｌ， Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ ＪＰ （２００９） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ α−Ｄ−Ｇｌｕｃａｎｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ ｇｌｕｃａｎｓｕｃｒａｓｅ ＧＴＦ１８０ ｅｎｚｙｍｅｓ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｓｔｒａｉｎ １８０． Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １０：５８０−５８８．

【0113】

ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ ＳＳ， Ｋｒａｌｊ Ｓ， ｖａｎ Ｇｅｅｌ−Ｓｃｈｕｔｔｅｎ ＩＨ， Ｇｅｒｗｉｇ ＧＪ， Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ Ｌ， Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ ＪＰ （２００８） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｐｈａ−Ｄ−ｇｌｕｃａｎ （ＥＰＳ１８０） ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ ｓｔｒａｉｎ １８０ ｇｌｕｃａｎｓｕｃｒａｓｅ ＧＴＦ１８０ ｅｎｚｙｍｅ． Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ ３４３：１２３７−５０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｃａｒｒｅｓ．２００８．０１．０４２

【0114】

Ｙａｄａｖ ＳＫ， Ｇｕｌｅｒｉａ Ｐ （２０１２） Ｓｔｅｖｉｏｌ ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｅｖｉａ： ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｏｏｄｓ ａｎｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｎｕｔｒ ５２：９８８−９８． ｄｏｉ： １０．１０８０／１０４０８３９８．２０１０．５１９４４７

【0115】

Ｙｅ Ｆ， Ｙａｎｇ Ｒ， Ｈｕａ Ｘ， Ｓｈｅｎ Ｑ， Ｚｈａｏ Ｗ， Ｚｈａｎｇ Ｗ （２０１３） Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ ｕｓｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ α−ａｍｙｌａｓｅ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｉｔｓ ｂｉｔｔｅｒ ａｆｔｅｒｔａｓｔｅ． ＬＷＴ − Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ ５１：５２４−５３０． ｄｏｉ： １０．１０１６／ｊ．ｌｗｔ．２０１２．１２．００５

【0116】

（付記）
（付記１）
ステビオールグリコシド基質を、グルコース供与体としてのスクロース、およびラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０株のグルカンスクラーゼＧＴＦ１８０、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の存在下でインキュベートすることを含む、修飾ステビオールグリコシドを酵素的に提供する方法。

【0117】

（付記２）
前記修飾ステビオールグリコシドが少なくとも１つのグルコース残基で修飾されている、付記１に記載の方法。

【0118】

（付記３）
前記修飾ステビオールグリコシドが、（α１→６）グリコシド結合、（α１→３）グリコシド結合、またはそれらの組み合わせを介して１つ以上のグルコースで修飾されている、付記１または２に記載の方法。

【0119】

（付記４）
前記修飾ステビオールグリコシドが、ステビオールグリコシドのＣ−１３位および／またはＣ−１９位において修飾されている、付記１から３のいずれか１つに記載の方法。

【0120】

（付記５）
前記修飾ステビオールグリコシドがＣ−１９位においてのみ修飾される、付記４に記載の方法。

【0121】

（付記６）
前記修飾ステビオールグリコシドが、Ｃ−１９位においてのみ単一のグルコース残基で修飾されている、付記５に記載の方法。

【0122】

（付記７）
前記ステビオールグリコシド基質がステビオールグリコシドである、付記１〜６のいずれか１つに記載の方法。

【0123】

（付記８）
前記ステビオールグリコシドが、レバウジオシドＡ［１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシルエステル］、またはステビオシド（１３−｛［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−グルコピラノシル］オキシ｝エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシルエステル）である、付記７に記載の方法。

【0124】

（付記９）
前記スクロースは、バッチ方式で、好ましくは最終量が少なくとも１Ｍ、より好ましくは少なくとも２Ｍになるまで添加される、付記１から８のいずれか１つに記載の方法。

【0125】

（付記１０）
前記変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、Ｓ１１３７、Ｑ１１４０、Ｌ９８１および／またはＷ１０６５においてアミノ酸置換基を含み、好ましくは前記変異体が、Ｓ１１３７Ｙ、Ｑ１１４０Ｅ、Ｌ９８１Ａ、Ｗ１０６５Ｌ／Ｅ／Ｑ／Ｆの変異体のうちの１つ以上を有する、付記１から９のいずれか１つに記載の方法。

【0126】

（付記１１）
前記変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、Ｎ末端可変ドメイン断片（ＧＴＦ１８０−ΔＮ）ならびに／またはＮおよびＣ末端ドメインＶ断片（ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ）を欠く切断型変異体である、付記１から１０のいずれか１つに記載の方法。

【0127】

（付記１２）
前記変異体ＧＴＦ１８０グルカンスクラーゼは、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｎ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＱ１１４０Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮＳ１１３７Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｌ９８１Ａ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５Ｌ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５ ＱおよびＧＴＦ１８０−ΔＮ Ｗ１０６５Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｆ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｎ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＱ１１４０Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶＳ１１３７Ｙ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｌ９８１Ａ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５Ｌ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５Ｅ、ＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５ ＱおよびＧＴＦ１８０−ΔＮΔＶ Ｗ１０６５Ｆである、付記１１に記載の方法。

【0128】

（付記１３）
付記１から１２のいずれか１つに記載の方法によって得られる修飾ステビオールグリコシド。

【0129】

（付記１４）
（ｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、
（ｉｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、および、
（ｉｉｉ）１３−（｛β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−］β−Ｄ−グルコピラノシル｝オキシ）エント−カウル−１６−エン−１９−酸α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→３）−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→６）−β−Ｄ−グルコピラノシルエステル、
からなる群から選択される、修飾ステビオールグリコシド。

【0130】

（付記１５）
低血糖甘味料としての付記１３または１４に記載の修飾ステビオールグリコシドの使用。

【0131】

（付記１６）
付記１３または１４に記載の少なくとも１つの修飾ステビオールグリコシドを含む、甘味組成物。

【0132】

（付記１７）
任意に他の甘味料および／または甘味増強剤と組み合わされた、付記１３または１４に記載の少なくとも１つの修飾ステビオールグリコシドを含む消耗品。

【0133】

（付記１８）
飲料、食料品、口腔ケア製品、たばこ製品、医薬品および栄養補助製品からなる群から選択される、付記１７に記載の消耗品。

【0134】

（付記１９）
任意に他の甘味料および／または甘味増強剤と組み合わせた、付記１３または１４に記載の有効量の修飾ステアビオールグリコシドを消耗品に含めることを含む、前記消耗品を甘味化する方法。

【0135】

（付記２０）
ラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０のＧＴＦ１８０、または所望のトランスグリコシル化活性を有するその変異体の、ステビオールグリコシドの感覚刺激特性を増強するための使用であって、好ましくは前記ステビオールグリコシドがレバウジオシドＡまたはステビオシドである、使用。

【0136】

（付記２１）
ステビオールグリコシドの苦味および／または後味を完全にまたは部分的に除去するための、付記２０に記載の使用。

【0137】

（付記２２）
ａ）変異体のパネル、好ましくはラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）株１８０のＧＴＦ１８０の置換変異体を生成する工程、
ｂ）ステビオールグリコシドのグリコシル化を可能にする条件下で、水性反応混合物中のグルコース供与体の存在下で、各変異体をステビオールグリコシド基質、好ましくはレバウジオシドＡとインキュベートする工程、及び
ｃ）少なくとも部分的に反応混合物が濁るのを防ぐ能力を決定することにより、ステビオールグリコシドを修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０のＧＴＦ１８０の少なくとも１つの変異体を選択する工程、
ｄ）任意に、修飾レバウジオシドＡの構造を更に決定すると共に、ステビオールグリコシドのＣ−１９位を修飾することができるラクトバチルス・ロイテリ菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）１８０の変異体ＧＴＦ１８０を選択する工程、
を含む、ステビオールグリコシド、好ましくはレバウジオシドＡを修飾することができるグルカンスクラーゼを同定する方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5(A)】

【図5(B)】

【図5(C)】

【図5(D)】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9(A)】

【図9(B)】

【図9(C)】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]