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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6976429
(24)【登録日】2021年11月11日
(45)【発行日】2021年12月8日
(54)【発明の名称】漢方薬組成物から８種の成分を分離する方法
(51)【国際特許分類】
G01N 30/88 20060101AFI20211125BHJP
B01J 20/287 20060101ALI20211125BHJP
G01N 30/34 20060101ALI20211125BHJP
G01N 30/90 20060101ALI20211125BHJP
G01N 30/80 20060101ALI20211125BHJP
B01J 20/283 20060101ALI20211125BHJP
G01N 30/00 20060101ALI20211125BHJP
G01N 30/74 20060101ALI20211125BHJP
【ＦＩ】
G01N30/88 N
B01J20/287
G01N30/34 E
G01N30/90
G01N30/80 C
B01J20/283
G01N30/00 E
G01N30/74 E
【請求項の数】6
【全頁数】19
(21)【出願番号】特願2020-523706(P2020-523706)
(86)(22)【出願日】2018年10月25日
(65)【公表番号】特表2021-500578(P2021-500578A)
(43)【公表日】2021年1月7日
(86)【国際出願番号】CN2018111846
(87)【国際公開番号】WO2019091287
(87)【国際公開日】20190516
【審査請求日】2020年4月27日
(31)【優先権主張番号】201711103420.2
(32)【優先日】2017年11月10日
(33)【優先権主張国】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】514092032
【氏名又は名称】石家庄以嶺薬業股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＩＪＩＡＺＨＵＡＮＧ ＹＩＬＩＮＧ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】張創峰
(72)【発明者】
【氏名】沈碩
(72)【発明者】
【氏名】宋聯強
【審査官】
大瀧 真理
(56)【参考文献】
【文献】
特開昭５８−１７３４６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１２−１１６８３８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１７／１４８４１８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
国際公開第２０１７／１４８４２６（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｂ０１Ｊ ２０／２８１ − ２０／２９２
Ｇ０１Ｎ ３０／００ − ３０／９６
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
レンギョウ２００〜３００重量部、マオウ６０〜１００重量部、ダイオウ４０〜６０重量部、ギョセイソウ２００〜３００重量部、キンギンカ２００〜３００重量部、バンランコン２００〜３００重量部、コウカッコウ６０〜１００重量部、メンマカンジュウ２００〜３００重量部、コウケイテン６０〜１００重量部、ハッカノウ５〜９重量部、クキョウニン６０〜１００重量部、カンゾウ６０〜１００重量部、セッコウ２００〜３００重量部から製造された漢方薬組成物から８種の成分を分離する方法であって、
（１）前記漢方薬組成物の総エキスをマクロポーラス樹脂で吸着し、水、１０％エタノール、３０％エタノール、５０％エタノールで溶出し、各部分の溶出液をそれぞれ採取し、濃縮させて各部分のエキスを得るステップと、
（２）ステップ（１）で得た５０％エタノールで溶出した部分のエキスに、ＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、サンプルを自然乾燥させた後、サンプルをローディングし、逆相オープンカラムを用いて分離し、体積比が２０：８０、４０：６０、６０：４０、８０：２０のメタノール−水、１００％メタノールで溶出し、順に分画Ａ〜分画Ｅを得るステップと、
（３）ステップ（２）で得た分画Ａのサンプルに、ＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、ＯＤＳ化サンプルをローディングカラムに加え、中圧分取液体クロマトグラフィーにより分離し、中圧分取液体勾配分離を行い、メタノールと水の体積比を２５：７５〜６０：４０とし、流速を２５ｍＬ／ｍｉｎとして、等体積５００ｍＬで分画を三角フラスコに取得し、減圧濃縮させ、薄層クロマトグラフィーにより各三角フラスコ中の分画を検証し、同じ成分の分画を合わせて再度減圧濃縮させ、溶出順に分画Ａ−１〜分画Ａ−７を得るステップと、
（４）ステップ（３）で得た分画Ａ−２のサンプルにシリカゲルを加えて攪拌し、シリカゲルカラムに入れて、体積比が８：１のジクロロメタン−メタノールで均一濃度分離し、等体積５０ｍＬで分画を取得し、溶出体積を８００ｍＬとし、薄層クロマトグラフィーにより各分画を検証し同じ成分の分画を合わせ、溶出順に分画Ａ−２−１〜分画Ａ−２−４を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−２のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が５０：５０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が６〜８ｍｉｎのピーク、９〜１０ｍｉｎのピーク、１２〜１３ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収して、以下のとおりにそれぞれ分離を行い、
６〜８ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が８〜９ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物２のアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得し、
９〜１０ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が４５：５５のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が２１〜２３ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物３のクェルシトリンを取得し、
１２〜１３ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が９〜１０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物４のマタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得るステップと、
（６）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−３のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が３０：７０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１０〜１１ｍｉｎのピーク、１７〜１９ｍｉｎのピーク、２１〜２４ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、１７〜１９ｍｉｎは化合物６のエピボゲロシドであり、２１〜２４ｍｉｎは化合物７のボゲロシドであり、１０〜１１ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が１５：８５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１４〜１６ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物５のリクイリチンアピオシドを得るステップと、
（７）ステップ（３）で得た分画Ａ−３のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が６０：４０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１４〜１５ｍｉｎのピーク、１９〜２１ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、体積比が２：１のジクロロメタン−メタノール溶液において１９〜２１ｍｉｎのピークに対する採取液から白色の沈殿物が析出して、化合物８であるカフェー酸エチルを取得し、１４〜１５ｍｉｎのピークに対して高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が３０：７０のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１８〜２０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物１の１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を得るステップとを含むことを特徴とする８種の成分の分離方法。
（１）前記漢方薬組成物の総エキスをマクロポーラス樹脂で吸着し、水、１０％エタノール、３０％エタノール、５０％エタノールで溶出し、各部分の溶出液をそれぞれ採取し、濃縮させて各部分のエキスを得るステップと、
（２）ステップ（１）で得た５０％エタノールで溶出した部分のエキスに、ＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、サンプルを自然乾燥させた後、サンプルをローディングし、逆相オープンカラムを用いて分離し、体積比が２０：８０、４０：６０、６０：４０、８０：２０のメタノール−水、１００％メタノールで溶出し、順に分画Ａ〜分画Ｅを得るステップと、
（３）ステップ（２）で得た分画Ａのサンプルに、ＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、ＯＤＳ化サンプルをローディングカラムに加え、中圧分取液体クロマトグラフィーにより分離し、中圧分取液体勾配分離を行い、メタノールと水の体積比を２５：７５〜６０：４０とし、流速を２５ｍＬ／ｍｉｎとして、等体積５００ｍＬで分画を三角フラスコに取得し、減圧濃縮させ、薄層クロマトグラフィーにより各三角フラスコ中の分画を検証し、同じ成分の分画を合わせて再度減圧濃縮させ、溶出順に分画Ａ−１〜分画Ａ−７を得るステップと、
（４）ステップ（３）で得た分画Ａ−２のサンプルにシリカゲルを加えて攪拌し、シリカゲルカラムに入れて、体積比が８：１のジクロロメタン−メタノールで均一濃度分離し、等体積５０ｍＬで分画を取得し、溶出体積を８００ｍＬとし、薄層クロマトグラフィーにより各分画を検証し同じ成分の分画を合わせ、溶出順に分画Ａ−２−１〜分画Ａ−２−４を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−２のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が５０：５０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が６〜８ｍｉｎのピーク、９〜１０ｍｉｎのピーク、１２〜１３ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収して、以下のとおりにそれぞれ分離を行い、
６〜８ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が８〜９ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物２のアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得し、
９〜１０ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が４５：５５のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が２１〜２３ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物３のクェルシトリンを取得し、
１２〜１３ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が９〜１０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物４のマタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得るステップと、
（６）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−３のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が３０：７０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１０〜１１ｍｉｎのピーク、１７〜１９ｍｉｎのピーク、２１〜２４ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、１７〜１９ｍｉｎは化合物６のエピボゲロシドであり、２１〜２４ｍｉｎは化合物７のボゲロシドであり、１０〜１１ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が１５：８５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１４〜１６ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物５のリクイリチンアピオシドを得るステップと、
（７）ステップ（３）で得た分画Ａ−３のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が６０：４０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１４〜１５ｍｉｎのピーク、１９〜２１ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、体積比が２：１のジクロロメタン−メタノール溶液において１９〜２１ｍｉｎのピークに対する採取液から白色の沈殿物が析出して、化合物８であるカフェー酸エチルを取得し、１４〜１５ｍｉｎのピークに対して高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が３０：７０のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１８〜２０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物１の１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を得るステップとを含むことを特徴とする８種の成分の分離方法。
【請求項2】
（１）前記漢方薬組成物の総エキス５ｋｇをマクロポーラス樹脂で吸着し、水１５０Ｌ、１０％エタノール８７．５Ｌ、３０％エタノール２２５Ｌ、５０％エタノール２５０Ｌで溶出し、濃縮させて各部分のエキスを得るステップと、
（２）ステップ（１）で得た５０％エタノールで溶出した部分のエキス２００ｇに、２００ｇのＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、サンプルをローディングし、逆相オープンカラムを用いて分離し、サンプル層とブランク層の高さの比を１：４として、減圧の方式により体積比が２０：８０のメタノール−水６Ｌで溶出し、同４０：６０の７Ｌで溶出し、同６０：４０の７Ｌで溶出し、同８０：２０の５Ｌで溶出し、１００％メタノール３Ｌで溶出して、順に分画Ａ〜分画Ｅを得るステップと、
（３）ステップ（２）で得た分画Ａのサンプル５０．０ｇに、５０ｇのＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、ＯＤＳ化サンプルをローディングカラムに加え、中圧分取液体クロマトグラフィーにより分離し、分離カラムのフィラーにＯＤＳ逆相シリカゲルを用い、中圧分取液体勾配分離を行い、メタノールと水の体積比を２５：７５〜６０：４０とし、流速を２５ｍＬ／ｍｉｎとして、等体積５００ｍＬで分画を三角フラスコに取得し、減圧濃縮させ、薄層クロマトグラフィーにより各三角フラスコ中の分画を検証し、同じ成分の分画を合わせて再度減圧濃縮させ、溶出順に再度減圧濃縮させて、分画Ａ−１〜分画Ａ−７を得るステップと、
（４）ステップ（３）で得た分画Ａ−２のサンプル３．２ｇに２００〜３００メッシュのシリカゲル６．４ｇを加えて攪拌し、シリカゲルカラムに入れて、サンプル層とブランク層の高さの比を１：５０として、体積比が８：１のジクロロメタン−メタノールで均一濃度分離し、等体積５０ｍＬで分画を取得し、溶出体積を８００ｍＬとし、薄層クロマトグラフィーにより各分画を検証し、同じ成分の分画を合わせ、溶出順に分画Ａ−２−１〜分画Ａ−２−４を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−２のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が５０：５０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が６〜８ｍｉｎのピーク、９〜１０ｍｉｎのピーク、１２〜１３ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収して、以下のとおりにそれぞれ分離を行い、
６〜８ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が８〜９ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物２のアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得し、
９〜１０ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が４５：５５のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が２１〜２３ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物３のクェルシトリンを取得し、
１２〜１３ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が９〜１０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物４のマタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得るステップと、
（６）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が３０：７０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１０〜１１ｍｉｎのピーク、１７〜１９ｍｉｎのピーク、２１〜２４ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、１７〜１９ｍｉｎは化合物６のエピボゲロシドであり、２１〜２４ｍｉｎは化合物７のボゲロシドであり、１０〜１１ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が１５：８５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１４〜１６ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物５のリクイリチンアピオシドを得るステップと、
（７）ステップ（３）で得た分画Ａ−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が６０：４０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１４〜１５ｍｉｎのピーク、１９〜２１ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、体積比が２：１のジクロロメタン−メタノール溶液において１９〜２１ｍｉｎのピークに対する採取液から白色の沈殿物が析出して、化合物８であるカフェー酸エチルを取得し、１４〜１５ｍｉｎのピークに対して高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が３０：７０のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１８〜２０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物１の１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を得るステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載の８種の成分の分離方法。
（２）ステップ（１）で得た５０％エタノールで溶出した部分のエキス２００ｇに、２００ｇのＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、サンプルをローディングし、逆相オープンカラムを用いて分離し、サンプル層とブランク層の高さの比を１：４として、減圧の方式により体積比が２０：８０のメタノール−水６Ｌで溶出し、同４０：６０の７Ｌで溶出し、同６０：４０の７Ｌで溶出し、同８０：２０の５Ｌで溶出し、１００％メタノール３Ｌで溶出して、順に分画Ａ〜分画Ｅを得るステップと、
（３）ステップ（２）で得た分画Ａのサンプル５０．０ｇに、５０ｇのＯＤＳ逆相シリカゲルを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、ＯＤＳ化サンプルをローディングカラムに加え、中圧分取液体クロマトグラフィーにより分離し、分離カラムのフィラーにＯＤＳ逆相シリカゲルを用い、中圧分取液体勾配分離を行い、メタノールと水の体積比を２５：７５〜６０：４０とし、流速を２５ｍＬ／ｍｉｎとして、等体積５００ｍＬで分画を三角フラスコに取得し、減圧濃縮させ、薄層クロマトグラフィーにより各三角フラスコ中の分画を検証し、同じ成分の分画を合わせて再度減圧濃縮させ、溶出順に再度減圧濃縮させて、分画Ａ−１〜分画Ａ−７を得るステップと、
（４）ステップ（３）で得た分画Ａ−２のサンプル３．２ｇに２００〜３００メッシュのシリカゲル６．４ｇを加えて攪拌し、シリカゲルカラムに入れて、サンプル層とブランク層の高さの比を１：５０として、体積比が８：１のジクロロメタン−メタノールで均一濃度分離し、等体積５０ｍＬで分画を取得し、溶出体積を８００ｍＬとし、薄層クロマトグラフィーにより各分画を検証し、同じ成分の分画を合わせ、溶出順に分画Ａ−２−１〜分画Ａ−２−４を得るステップと、
（５）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−２のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が５０：５０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が６〜８ｍｉｎのピーク、９〜１０ｍｉｎのピーク、１２〜１３ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収して、以下のとおりにそれぞれ分離を行い、
６〜８ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が８〜９ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物２のアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを取得し、
９〜１０ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が４５：５５のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が２１〜２３ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物３のクェルシトリンを取得し、
１２〜１３ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が９〜１０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物４のマタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得るステップと、
（６）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が３０：７０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１０〜１１ｍｉｎのピーク、１７〜１９ｍｉｎのピーク、２１〜２４ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、１７〜１９ｍｉｎは化合物６のエピボゲロシドであり、２１〜２４ｍｉｎは化合物７のボゲロシドであり、１０〜１１ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が１５：８５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１４〜１６ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物５のリクイリチンアピオシドを得るステップと、
（７）ステップ（３）で得た分画Ａ−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が６０：４０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１４〜１５ｍｉｎのピーク、１９〜２１ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、体積比が２：１のジクロロメタン−メタノール溶液において１９〜２１ｍｉｎのピークに対する採取液から白色の沈殿物が析出して、化合物８であるカフェー酸エチルを取得し、１４〜１５ｍｉｎのピークに対して高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が３０：７０のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムに液体クロマトグラフィーカラムを使用し、この条件において保持時間が１８〜２０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物１の１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を得るステップとを含むことを特徴とする請求項１に記載の８種の成分の分離方法。
【請求項3】
前記漢方薬組成物は、レンギョウ２００重量部、キンギンカ３００重量部、バンランコン２００重量部、ダイオウ４０重量部、コウカッコウ６０重量部、メンマカンジュウ３００重量部、コウケイテン１００重量部、ハッカノウ９重量部、マオウ６０重量部、クキョウニン１００重量部、ギョセイソウ２００重量部、カンゾウ１００重量部、セッコウ２００重量部から製造されることを特徴とする請求項１又は２に記載の８種の成分の分離方法。
【請求項4】
前記漢方薬組成物は、レンギョウ３００重量部、キンギンカ２００重量部、バンランコン３００重量部、ダイオウ６０重量部、コウカッコウ１００重量部、メンマカンジュウ２００重量部、コウケイテン６０重量部、ハッカノウ５重量部、マオウ１００重量部、クキョウニン６０重量部、ギョセイソウ３００重量部、カンゾウ６０重量部、セッコウ３００重量部から製造されることを特徴とする請求項１又は２に記載の８種の成分の分離方法。
【請求項5】
前記漢方薬組成物は、レンギョウ２７８重量部、キンギンカ２９４重量部、バンランコン２８５重量部、ダイオウ５５重量部、コウカッコウ９５重量部、メンマカンジュウ２９０重量部、コウケイテン８７重量部、ハッカノウ８．５重量部、マオウ８８重量部、クキョウニン８０重量部、ギョセイソウ２８４重量部、カンゾウ９５重量部、セッコウ２７７重量部から製造されることを特徴とする請求項１又は２に記載の８種の成分の分離方法。
【請求項6】
前記漢方薬組成物の総エキスは、
（１）重量比で生薬を秤量し、洗浄し、適宜破砕するステップと、
（２）コウカッコウを破砕し、１０倍の量の水を加えて揮発油を抽出し、８時間抽出して揮発油を採取し、使用に備え、抽出液を濾過して、残渣を捨て、濾液を使用に備えるステップと、
（３）レンギョウ、マオウ、ギョセイソウ、ダイオウを１２倍の量の７０％エタノールで３回抽出し、毎回２．５時間とし、抽出液を合併して濾過し、エタノールを回収して、濾液を使用に備えるステップと、
（４）キンギンカ、セッコウ、バンランコン、メンマカンジュウ、カンゾウ、コウケイテンに１２倍の量の水を加えて、沸騰するまで煎出し、クキョウニンを加えて、２回煎出し、毎回１時間とし、抽出液を合併して濾過し、濾液をステップ（２）のコウカッコウから揮発油抽出後の濾液と合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１０〜１．１５であるように濃縮させて軟エキスを取得し、エタノールを加え、アルコール濃度が７０％であるように調節し、冷蔵し、濾過して、エタノールのにおいがなくなるまでエタノールを回収し、軟エキスを得て使用に備えるステップと、
（５）ステップ（４）で得た軟エキスとステップ（３）で得たアルコール抽出液を合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１５〜１．２０であるように濃縮させて軟エキスを取得し、乾燥させて、総エキスを得て使用に備えるステップとにより調製されることを特徴とする請求項１又は２に記載の８種の成分の分離方法。
（１）重量比で生薬を秤量し、洗浄し、適宜破砕するステップと、
（２）コウカッコウを破砕し、１０倍の量の水を加えて揮発油を抽出し、８時間抽出して揮発油を採取し、使用に備え、抽出液を濾過して、残渣を捨て、濾液を使用に備えるステップと、
（３）レンギョウ、マオウ、ギョセイソウ、ダイオウを１２倍の量の７０％エタノールで３回抽出し、毎回２．５時間とし、抽出液を合併して濾過し、エタノールを回収して、濾液を使用に備えるステップと、
（４）キンギンカ、セッコウ、バンランコン、メンマカンジュウ、カンゾウ、コウケイテンに１２倍の量の水を加えて、沸騰するまで煎出し、クキョウニンを加えて、２回煎出し、毎回１時間とし、抽出液を合併して濾過し、濾液をステップ（２）のコウカッコウから揮発油抽出後の濾液と合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１０〜１．１５であるように濃縮させて軟エキスを取得し、エタノールを加え、アルコール濃度が７０％であるように調節し、冷蔵し、濾過して、エタノールのにおいがなくなるまでエタノールを回収し、軟エキスを得て使用に備えるステップと、
（５）ステップ（４）で得た軟エキスとステップ（３）で得たアルコール抽出液を合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１５〜１．２０であるように濃縮させて軟エキスを取得し、乾燥させて、総エキスを得て使用に備えるステップとにより調製されることを特徴とする請求項１又は２に記載の８種の成分の分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、漢方薬組成物から複数種の成分を分離する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
漢方薬は主に配合処方の形態で使用されている。数千年の臨床的使用において、配合処方は単一種類の生薬よりも優れた治療効果があることから、配合処方の合理性が十分に証明されている。本発明に係る医薬組成物は、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａ ｓｕｓｐｅｎｓａ）、キンギンカ（Ｌｏｎｉｃｅｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、シャマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ Ｈｅｒｂ）等の１３種類の生薬からなり、感染性の発熱及びそれに伴う症状と肺の症状を改善する効果があり、インフルエンザの治療に用いられる。臨床試験により、本発明に係る医薬組成物でインフルエンザ、急性上気道感染症を治療する場合は、確実で且つ明らかな効果があることが証明されている。配合処方の薬理作用の原理及び配合医薬品における配合規則の科学的原理を釈明するために、それを構成する基本物質に対する系統的な研究は特に必要である。これを踏まえて、本発明に係る医薬組成物の化学成分について高度な研究を行って、１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、アロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、クェルシトリン、マタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシド（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ−４′−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、リクイリチンアピオシド、エピボゲロシド（ｅｐｉ−ｖｏｇｅｌｏｓｉｄｅ）、ボゲロシド（ｖｏｇｅｌｏｓｉｄｅ）、カフェー酸エチルの８種の化合物を分離していることで、本発明に係る医薬組成物の品質管理のための新規な方法を提供している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
本発明は、漢方薬組成物から８種の化合物を分離する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0004】
当該漢方薬組成物は、レンギョウ２００〜３００重量部、マオウ６０〜１００重量部、ダイオウ（Ｒｈｅｕｍ ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ）４０〜６０重量部、ギョセイソウ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）２００〜３００重量部、キンギンカ２００〜３００重量部、バンランコン（Ｉｓａｔｉｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉａ）２００〜３００重量部、コウカッコウ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ ｃａｂｌｉｎ）６０〜１００重量部、メンマカンジュウ（Ｄｒｙｏｐｔｅｒｉｓ ｃｒａｓｓｉｒｈｉｚｏｍａ）２００〜３００重量部、コウケイテン（Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ）６０〜１００重量部、ハッカノウ（メントール）５〜９重量部、クキョウニン（Ａｒｍｅｎｉａｃａｅ Ｓｅｍｅｎ）６０〜１００重量部、カンゾウ（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ）６０〜１００重量部、セッコウ２００〜３００重量部から製造される。
【0005】
本発明に係る分離方法は、以下のステップ（１）〜（７）を含む。（１）当該漢方薬組成物の総エキスをＡＢ−８マクロポーラス樹脂で吸着し、水、１０％エタノール、３０％エタノール、５０％エタノールで溶出し、各部分の溶出液をそれぞれ採取し、濃縮させて各部分のエキスを得る。
（２）ステップ（１）で得た５０％エタノールで溶出した部分のエキスに、逆相シリカゲルＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧを加えて攪拌し、サンプルを自然乾燥させた後、サンプルをローディングし、逆相ＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧオープンカラムを用いて分離し、体積比が２０：８０、４０：６０、６０：４０、８０：２０のメタノール−水、１００％メタノールで溶出し、順に分画Ａ〜分画Ｅを得る。
（３）ステップ（２）で得た分画Ａのサンプルに、逆相シリカゲルＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、ＯＤＳ化サンプルをローディングカラムに加え、中圧分取液体クロマトグラフィーにより分離し、中圧分取液体勾配分離を行い、メタノールと水の体積比を２５：７５〜６０：４０とし、流速を２５ｍＬ／ｍｉｎとして、等体積５００ｍＬで分画を三角フラスコに取得し、減圧濃縮させ、薄層クロマトグラフィーにより検証し分画を合併して再度減圧濃縮させて、分画Ａ−１〜分画Ａ−７を得る。
（４）ステップ（３）で得た分画Ａ−２のサンプルにシリカゲルを加えて攪拌し、シリカゲルカラムに入れて、体積比が８：１のジクロロメタン−メタノールで均一濃度分離し、等体積５０ｍＬで分画を取得し、溶出体積を８００ｍＬとし、薄層クロマトグラフィーにより検証し分画を合併して分画Ａ−２−１〜分画Ａ−２−４を得る。
（５）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−２のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が５０：５０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が６〜８ｍｉｎのピーク、９〜１０ｍｉｎのピーク、１２〜１３ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収して、以下のとおりにそれぞれ分離を行う。
６〜８ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が８〜９ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物２のアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを得る。
９〜１０ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が４５：５５のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が２１〜２３ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物３のクェルシトリンを得る。
１２〜１３ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が９〜１０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物４のマタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得る。
（６）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−３のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が３０：７０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１０〜１１ｍｉｎのピーク、１７〜１９ｍｉｎのピーク、２１〜２４ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収する。１７〜１９ｍｉｎは化合物６のエピボゲロシドであり、２１〜２４ｍｉｎは化合物７のボゲロシドである。１０〜１１ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が１５：８５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が１４〜１６ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物５のリクイリチンアピオシドを得る。
（７）ステップ（３）で得た分画Ａ−３のサンプルをメタノールで溶解し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が６０：４０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１４〜１５ｍｉｎのピーク、１９〜２１ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、体積比が２：１のジクロロメタン−メタノール溶液において１９〜２１ｍｉｎのピークに対する採取液から白色の沈殿物が析出して、化合物８であるカフェー酸エチルを得る。１４〜１５ｍｉｎのピークに対して高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が３０：７０のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が１８〜２０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物１の１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を得る。
【0006】
好ましくは、本発明に係る分離方法は、以下のステップ（１）〜（７）を含む。（１）当該漢方薬組成物の総エキス５ｋｇをＡＢ−８マクロポーラス樹脂で吸着し、水１５０Ｌ、１０％エタノール８７．５Ｌ、３０％エタノール２２５Ｌ、５０％エタノール２５０Ｌで溶出し、濃縮させて各部分のエキスを得る。
（２）ステップ（１）で得た５０％エタノールで溶出した部分のエキス２００ｇに、２００ｇの逆相シリカゲルＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、サンプルをローディングし、逆相ＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍオープンカラムを用いて分離し、サンプル層とブランク層の高さの比を１：４として、減圧の方式により体積比が２０：８０のメタノール−水６Ｌで溶出し、同４０：６０の７Ｌで溶出し、同６０：４０の７Ｌで溶出し、同８０：２０の５Ｌで溶出し、１００％メタノール３Ｌで溶出して、順に分画Ａ〜分画Ｅを得る。
（３）ステップ（２）で得た分画Ａのサンプル５０．０ｇに、５０ｇの逆相シリカゲルＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、ＯＤＳ化サンプルをローディングカラムに加え、中圧分取液体クロマトグラフィーにより分離し、分離カラムのフィラーにＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍを用い、中圧分取液体勾配分離を行い、メタノールと水の体積比を２５：７５〜６０：４０とし、流速を２５ｍＬ／ｍｉｎとして、等体積５００ｍＬで分画を三角フラスコに取得し、減圧濃縮させ、薄層クロマトグラフィーにより検証し分画を合併して再度減圧濃縮させて、分画Ａ−１〜分画Ａ−７を得る。
（４）ステップ（３）で得た分画Ａ−２のサンプル３．２ｇに２００〜３００メッシュのシリカゲル６．４ｇを加えて攪拌し、シリカゲルカラムに入れて、サンプル層とブランク層の高さの比を１：５０として、体積比が８：１のジクロロメタン−メタノールで均一濃度分離し、等体積５０ｍＬで分画を取得し、溶出体積を８００ｍＬとし、薄層クロマトグラフィーにより検証し分画を合併して分画Ａ−２−１〜分画Ａ−２−４を得る。
（５）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−２のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が５０：５０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が６〜８ｍｉｎのピーク、９〜１０ｍｉｎのピーク、１２〜１３ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収して、以下のとおりにそれぞれ分離を行う。
６〜８ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が８〜９ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物２のアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを得る。
９〜１０ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が４５：５５のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が２１〜２３ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物３のクェルシトリンを得る。
１２〜１３ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が９〜１０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物４のマタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得る。
（６）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が３０：７０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１０〜１１ｍｉｎのピーク、１７〜１９ｍｉｎのピーク、２１〜２４ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収する。１７〜１９ｍｉｎは化合物６のエピボゲロシドであり、２１〜２４ｍｉｎは化合物７のボゲロシドである。１０〜１１ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が１５：８５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が１４〜１６ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物５のリクイリチンアピオシドを得る。
（７）ステップ（３）で得た分画Ａ−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が６０：４０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１４〜１５ｍｉｎのピーク、１９〜２１ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、体積比が２：１のジクロロメタン−メタノール溶液において１９〜２１ｍｉｎのピークに対する採取液から白色の沈殿物が析出して、化合物８であるカフェー酸エチルを得る。１４〜１５ｍｉｎのピークに対して高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が３０：７０のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が１８〜２０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物１の１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を得る。
【0007】
好ましくは、当該漢方薬組成物は、以下の重量部の生薬から製造される。レンギョウ２００、キンギンカ３００、バンランコン２００、ダイオウ４０、コウカッコウ６０、メンマカンジュウ３００、コウケイテン１００、ハッカノウ９、マオウ６０、クキョウニン１００、ギョセイソウ２００、カンゾウ１００、セッコウ２００。
【0008】
好ましくは、当該漢方薬組成物は、以下の重量部の生薬から製造される。レンギョウ３００、キンギンカ２００、バンランコン３００、ダイオウ６０、コウカッコウ１００、メンマカンジュウ２００、コウケイテン６０、ハッカノウ５、マオウ１００、クキョウニン６０、ギョセイソウ３００、カンゾウ６０、セッコウ３００。
【0009】
好ましくは、当該漢方薬組成物は、以下の重量部の生薬から製造される。レンギョウ２７８、キンギンカ２９４、バンランコン２８５、ダイオウ５５、コウカッコウ９５、メンマカンジュウ２９０、コウケイテン８７、ハッカノウ８．５、マオウ８８、クキョウニン８０、ギョセイソウ２８４、カンゾウ９５、セッコウ２７７。
【0010】
本発明に係る漢方薬組成物の総エキスは、以下のステップで調製される。（１）重量比で生薬を秤量し、洗浄し、適宜破砕する。
（２）コウカッコウを破砕し、１０倍の量の水を加えて揮発油を抽出し、８時間抽出して揮発油を採取し、使用に備え、抽出液を濾過して、残渣を捨て、濾液を使用に備える。
（３）レンギョウ、マオウ、ギョセイソウ、ダイオウを１２倍の量の７０％エタノールで３回抽出し、毎回２．５時間とし、抽出液を合併して濾過し、エタノールを回収して、濾液を使用に備える。
（４）キンギンカ、セッコウ、バンランコン、メンマカンジュウ、カンゾウ、コウケイテンに１２倍の量の水を加えて、沸騰するまで煎出し、クキョウニンを加えて、２回煎出し、毎回１時間とし、抽出液を合併して濾過し、濾液をステップ（２）のコウカッコウから揮発油抽出後の濾液と合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１０〜１．１５であるように濃縮させて軟エキスを取得し、エタノールを加え、アルコール濃度が７０％であるように調節し、冷蔵し、濾過して、エタノールのにおいがなくなるまでエタノールを回収し、軟エキスを得て使用に備える。
（５）ステップ（４）で得た軟エキスとステップ（３）で得たアルコール抽出液を合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１５〜１．２０であるように濃縮させて軟エキスを取得し、乾燥させて、総エキスを得て使用に備える。
【発明の効果】
【0011】
本発明の分離方法は、１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）、アロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド、クェルシトリン、マタイレシノール−４′−Ｏ−グルコシド（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ−４′−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、リクイリチンアピオシド、エピボゲロシド（ｅｐｉ−ｖｏｇｅｌｏｓｉｄｅ）、ボゲロシド（ｖｏｇｅｌｏｓｉｄｅ）、カフェー酸エチルの８種の化合物を分離できる。
【発明を実施するための形態】
【0012】
（実施例１）レンギョウ２０ｋｇ、キンギンカ３０ｋｇ、バンランコン２０ｋｇ、ダイオウ４ｋｇ、コウカッコウ６ｋｇ、メンマカンジュウ３０ｋｇ、コウケイテン１０ｋｇ、ハッカノウ０．９ｋｇ、マオウ６ｋｇ、クキョウニン１０ｋｇ、ギョセイソウ２０ｋｇ、カンゾウ１０ｋｇ、セッコウ２０ｋｇを秤量し、以下のプロセスで抽出する。
（１）重量比で生薬を秤量し、洗浄し、適宜破砕する。
（２）コウカッコウを破砕し、１０倍の量の水を加えて揮発油を抽出し、８時間抽出して揮発油を採取し、使用に備え、抽出液を濾過して、残渣を捨て、濾液を使用に備える。
（３）レンギョウ、マオウ、ギョセイソウ、ダイオウを１２倍の量の７０％エタノールで３回抽出し、毎回２．５時間とし、抽出液を合併して濾過し、エタノールを回収して、濾液を使用に備える。
（４）キンギンカ、セッコウ、バンランコン、メンマカンジュウ、カンゾウ、コウケイテンに１２倍の量の水を加えて、沸騰するまで煎出し、クキョウニンを加えて、２回煎出し、毎回１時間とし、抽出液を合併して濾過し、濾液をステップ（２）のコウカッコウから揮発油抽出後の濾液と合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１５であるように濃縮させて軟エキスを取得し、エタノールを加え、アルコール濃度が７０％であるように調節し、冷蔵し、濾過して、エタノールのにおいがなくなるまでエタノールを回収し、軟エキスを得て使用に備える。
（５）ステップ（４）で得た軟エキスとステップ（３）で得たアルコール抽出液を合併し、６０℃で測定された相対密度が１．２０であるように濃縮させて軟エキスを取得し、乾燥させて、総エキスを得て使用に備える。
【0013】
分離方法のステップは以下のとおりである。１．装置と材料
Ｂｒｕｋｅｒ Ａｌｐｈａ赤外線分光計（スイスＢｒｕｋｅｒ社）、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩＩＨＤ ６００核磁気共鳴分光計（スイスＢｒｕｋｅｒ社）、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２−Ｓ Ｍａｓｓ質量分析計（米Ｗａｔｅｒｓ社）、Ｃｏｍｂｉ Ｆｌａｓｈ Ｒｆ中低圧分取液体クロマトグラフ（米Ｔｅｌｅｄｖｎｅ ＩＳＣＯ社）、ＮＰ７０００分取液体クロマトグラフ（江蘇漢邦科技有限公司）、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ純水装置（米Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、ＡＬ２０４分析用電子天秤（米Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ社）、ＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ ５０μｍ逆相シリカゲル（日本ＹＭＣ）、カラムクロマトグラフィー用シリカゲル（１００〜２００メッシュ、２００〜３００メッシュ、青島海洋化工厂）、薄層クロマトグラフィー用シリカゲルシートＧＦ２５４（青島海洋化工厂）、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ（２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍ、日本ＹＭＣ）、本発明の漢方薬組成物の総エキス（石家庄以嶺薬業股フン有限公司、ロットナンバー：Ｂ１５０９００１）、クロマトグラフィー用アセトニトリル、メタノール（上海阿達瑪斯試剤公司）、分析試薬（北京化工厂）。
【0014】
２．抽出と分離（１）当該漢方薬組成物の総エキス５ｋｇをＡＢ−８マクロポーラス樹脂で吸着し、水１５０Ｌ、１０％エタノール８７．５Ｌ、３０％エタノール２２５Ｌ、５０％エタノール２５０Ｌで溶出し、濃縮させて各部分のエキスを得る。
（２）ステップ（１）で得た５０％エタノールで溶出した部分のエキス２００ｇに、２００ｇの逆相シリカゲルＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、サンプルをローディングし、逆相ＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍオープンカラムを用いて分離し、サンプル層とブランク層の高さの比を１：４として、減圧の方式により体積比が２０：８０のメタノール−水６Ｌで溶出し、同４０：６０の７Ｌで溶出し、同６０：４０の７Ｌで溶出し、同８０：２０の５Ｌで溶出し、１００％メタノール３Ｌで溶出して、順に分画Ａ〜分画Ｅを得る。
（３）ステップ（２）で得た分画Ａのサンプル５０．０ｇに、５０ｇの逆相シリカゲルＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍを加えて攪拌し、ＯＤＳ化サンプルを自然乾燥させた後、ＯＤＳ化サンプルをローディングカラムに加え、中圧分取液体クロマトグラフィーにより分離し、分離カラムのフィラーにＯＤＳ−ＡＱ−ＨＧ Ｓ−５０μｍを用い、中圧分取液体勾配分離を行い、メタノールと水の体積比を２５：７５〜６０：４０とし、流速を２５ｍＬ／ｍｉｎとして、等体積５００ｍＬで分画を三角フラスコに取得し、減圧濃縮させ、薄層クロマトグラフィーにより検証し分画を合併して再度減圧濃縮させて、分画Ａ−１〜分画Ａ−７を得る。
（４）ステップ（３）で得た分画Ａ−２のサンプル３．２ｇに２００〜３００メッシュのシリカゲル６．４ｇを加えて攪拌し、シリカゲルカラムに入れて、サンプル層とブランク層の高さの比を１：５０として、体積比が８：１のジクロロメタン−メタノールで均一濃度分離し、等体積５０ｍＬで分画を取得し、溶出体積を８００ｍＬとし、薄層クロマトグラフィーにより検証し分画を合併して分画Ａ−２−１〜分画Ａ−２−４を得る。
（５）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−２のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が５０：５０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が６〜８ｍｉｎのピーク、９〜１０ｍｉｎのピーク、１２〜１３ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収して、以下のとおりにそれぞれ分離を行う。
６〜８ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が８〜９ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物２のアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを得る。
９〜１０ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が４５：５５のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が２１〜２３ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物３のクェルシトリンを得る。
１２〜１３ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に２５：７５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が９〜１０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物４のマタイレシノール−４′−Ｏ−β−Ｄ−グルコシドを得る。
（６）ステップ（４）で得た分画Ａ−２−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が３０：７０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１０〜１１ｍｉｎのピーク、１７〜１９ｍｉｎのピーク、２１〜２４ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収する。１７〜１９ｍｉｎは化合物６のエピボゲロシドであり、２１〜２４ｍｉｎは化合物７のボゲロシドである。１０〜１１ｍｉｎのピークに対して、高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が１５：８５のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が１４〜１６ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物５のリクイリチンアピオシドを得る。
（７）ステップ（３）で得た分画Ａ−３のサンプルをメタノールで溶解し、溶解液を０．４５μｍ微多孔質濾過フィルムで濾過し、高速液体クロマトグラフィーを採用し、移動相に体積比が６０：４０のメタノール−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとして、一次分離を行い、保持時間が１４〜１５ｍｉｎのピーク、１９〜２１ｍｉｎのピークに対してそれぞれ採取し、溶媒を減圧回収し、体積比が２：１のジクロロメタン−メタノール溶液において１９〜２１ｍｉｎのピークに対する採取液から白色の沈殿物が析出して、化合物８であるカフェー酸エチルを得る。１４〜１５ｍｉｎのピークに対して高速液体クロマトグラフィーによりさらに精製し、移動相に体積比が３０：７０のアセトニトリル−水を用い、流速を１２ｍＬ／ｍｉｎとし、検出波長を２１０ｎｍとし、クロマトグラフィーカラムにＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｒ＆Ｄ ＯＤＳ−Ａ、２５０×２０ｍｍ、Ｓ−１０μｍを使用し、この条件において保持時間が１８〜２０ｍｉｎのピークに対して採取し、溶媒を減圧回収して、化合物１の１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を得る。
【0015】
３．構造同定３．１．新規化合物の構造同定
化合物１：淡黄色の粉末、ＵＶ λｍａｘ（ＭｅＯＨ）：２２８、３１２ｎｍ。赤外分光測定でヒドロキシ基（３３３０ｃｍ−１）、α，β−不飽和カルボニル基（１６８０、１６３０ｃｍ−１）、ベンゼン環（１６０３、１５１４ｃｍ−１）を有することが示される。ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：５２１．１６９９［Ｍ−Ｈ］−（計算値：５２１．１６５９）で、ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ２５Ｈ３０Ｏ１２に決定する。不飽和度は１１である。
【0016】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，６００ＭＨｚ）スペクトル（表１）より、当該化合物は１対のトランス二重結合δ７．５６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ）と６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ）、ＡＢ系芳香族水素δ７．５５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）と６．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）を含むことが示される。１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの化学シフトは４．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）であり、糖の末端水素として推定される。
【0017】
１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１５０ＭＨｚ）スペクトル（表１）より、当該化合物は２つの共役カルボニル炭素（δＣ：１６８．４、１６７．２）と、２つの明確な断片とを含むことが示される。δＣ：１１６．２（２Ｃ）、１３０．８（２Ｃ）、１６０．２はパラヒドロキシフェニル基断片、δＣ：９９．３、７７．６、７７．１、７３．６、７０．４，６１．６はグルコシル基断片として推定される。
【0018】
ＨＭＢＣにより、二重結合δＨ７．５６、６．３９がフェニル基炭素δＣ１２５．５に関係があり、二重結合δＨ６．３９と−ＣＨ２−δＨ４．１２はいずれもカルボニル基δＣ１６７．２に関係があることが判明し、上記の断片が他のＣ、Ｈ化学シフトと関係がないため、当該断片は独立なパラヒドロキシシンナモイル基断片で、残りの部分から糖基断片を除去したものは母核であると推定される。計算の結果、母核の不飽和度は４である（１つのカルボニル基と二重結合を含む）ため、当該母核が二環構造であると推定される。ＨＳＱＣ、ＨＭＢＣにより帰属を決定し関連付けを行うと、当該化合物はイリドイド系化合物であると推定される。文献を検索すると、当該化合物の母核はアドキソシド酸（ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）であることが決定される。
【0019】
残りの断片はパラヒドロキシケイ皮酸であり、しかも母核のアドキソシド酸（ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）の１０位にエステルを形成していることが分かる。ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ、Ｒｅａｘｙｓのデータベースを検索して、当該化合物が新規化合物で（本試験では当該化合物の配置が確認されず、後続の研究において確認する）、１０−Ｏ−（ｐ−ヒドロキシシンナモイル）−アドキソシド酸（１０−Ｏ−（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｏｙｌ）−ａｄｏｘｏｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ）であることが決定される。
【0020】
[表１]化合物１のＮＭＲデータ【0021】
[化１]【0022】
３．２既存化合物の構造同定化合物２：黄色の粉末、ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：４３１［Ｍ−Ｈ］−。ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ２１Ｈ２０Ｏ１０に決定する。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，６００ＭＨｚ）δＨ：１２．８８（１Ｈ，ｓ，ＯＨ），７．８９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．４Ｈｚ，Ｈ−５），７．８６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−６），７．７２（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．４Ｈｚ，Ｈ−７），７．６６（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−４），７．２８（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２），５．１７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，ａｎｏｍｅｒｉｃ−Ｈ），４．６２（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２ＯＨ），３．７２〜３．２３（Ｇｌｃ−Ｈ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１５０ＭＨｚ）δＨ：１８８．８（Ｃ−９），１８２．６（Ｃ−１０），１６２．２（Ｃ−１），１５８．７（Ｃ−８），１５２．７（Ｃ−３），１３６．４（Ｃ−６），１３５．３（Ｃ−１０ａ），１３２．７（Ｃ−４ａ），１２２．９（Ｃ−７），１２１．２（Ｃ−２），１２１．０（Ｃ−５），１１６．４（Ｃ−８ａ，Ｃ−９ａ），１００．９（Ｃ−１′），７７．７（Ｃ−５′），７７．０（Ｃ−３′），７３．７（Ｃ−２′），７０．０（Ｃ−４′），６２．５（ＣＨ２ＯＨ），６１．０（Ｃ−６′）。
上記の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの特徴及び１３Ｃ−ＮＭＲデータが文献の報告とほぼ一致しているため、当該化合物をアロエ−エモジン−８−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドに同定する。
【0023】
化合物３：黄色の粉末、ＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ：４４７［Ｍ−Ｈ］−。ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ２１Ｈ２０Ｏ１１に決定する。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，６００ＭＨｚ）δＨ：１２．６６（１Ｈ，ｓ，５−ＯＨ），７．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−２′），７．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４，８．４Ｈｚ，Ｈ−６′），６．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−５′），６．３９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−８），６．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−６），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，ａｎｏｍｅｒｉｃ−Ｈ），０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，ＣＨ３）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１５０ＭＨｚ）δＣ：１７８．２（Ｃ−４），１６４．６（Ｃ−７），１６１．７（Ｃ−５），１５７．７（Ｃ−２），１５６．９（Ｃ−９），１４８．９（Ｃ−４′），１４５．６（Ｃ−３′），１３４．７（Ｃ−３），１２１．５（Ｃ−６′），１２１．２（Ｃ−１′），１１６．１（Ｃ−５′），１１５．９（Ｃ−２′），１０４．５（Ｃ−１０），１０２．３（Ｃ−１′′），９９．１（Ｃ−６），９４．１（Ｃ−８），７１．６（Ｃ−４′′），７１．０（Ｃ−３′′），７０．８（Ｃ−２′′），７０．５（Ｃ−５′′），１７．９（Ｃ−６′′）。
上記の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの特徴及び１３Ｃ−ＮＭＲデータが文献の報告とほぼ一致しているため、当該化合物をクェルシトリンに同定する。
【0024】
化合物４：黄色の粉末、ＥＳＩ−ＭＳｍ／ｚ：５１９［Ｍ−Ｈ］−。ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ２６Ｈ３２Ｏ１１に決定する。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，６００ＭＨｚ）δＨ：６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−５），６．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−２′），６．６７（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−６′），６．６３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２），６．５０（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．８，８．４Ｈｚ，Ｈ−６），４．８４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１′′），４．０９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−９ａ），３．８６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−９ｂ），３．７２（６Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２×ＯＣＨ３）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１５０ＭＨｚ）δＣ：１７８．９（Ｃ−９′），１４９．１（Ｃ−３′），１４７．９（Ｃ−３），１４５．７（Ｃ−４′），１４５．４（Ｃ−４），１３２．２（Ｃ−１′），１３０．０（Ｃ−１），１２１．８（Ｃ−６′），１２１．２（Ｃ−６），１１５．９（Ｃ−５′），１１５．６（Ｃ−５），１１４．３（Ｃ−２′），１１３．１（Ｃ−２），１００．６（Ｃ−１′′），７７．４（Ｃ−５′′），７７．３（Ｃ−３′′），７３．７（Ｃ−２′′），７１．１（Ｃ−９），７０．１（Ｃ−４′′），６１．１（Ｃ−６′′），５６．１（ＯＣＨ３），５６．０（ＯＣＨ３），４６．０（Ｃ−８′），４１．３（Ｃ−８），３７．３（Ｃ−７），３３．９（Ｃ−７′）。
上記の１３Ｃ−ＮＭＲデータが文献の報告とほぼ一致しているため、当該化合物をマタイレシノール−４′−Ｏ−グルコシド（ｍａｔａｉｒｅｓｉｎｏｌ−４′−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）に同定する。
【0025】
化合物５：白色の粉末、ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：５４９［Ｍ−Ｈ］−。ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ２６Ｈ３０Ｏ１３に決定する。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δＨ：７．７０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｈ−５），７．４０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，Ｈ−２′，６′），７．０９（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，Ｈ−３′，５′），６．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，９．０Ｈｚ，Ｈ−６），６．３４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−８），５．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｈ−１′′′），５．３９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，１３．２Ｈｚ，Ｈ−２），４．９８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−１′′），４．０４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−５′′′ａ），３．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｈ−２′′′），３．８８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，１２．０Ｈｚ，Ｈ−６′′ａ），３．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，Ｈ−５′′′ｂ），２．９９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３ａ），２．７４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４，１６．８Ｈｚ，Ｈ−３ｂ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δＣ：１９３．２（Ｃ−４），１６６．７（Ｃ−７），１６５．３（Ｃ−８ａ），１５９．０（Ｃ−４′），１３４．３（Ｃ−１′），１２９．９（Ｃ−５），１２８．８（Ｃ−２′，６′），１１７．６（Ｃ−３′，５′），１１４．９（Ｃ−４ａ），１１１．８（Ｃ−６），１１０．７（Ｃ−１′′′），１０３．８（Ｃ−８），１００．７（Ｃ−１′′），８０．７（Ｃ−２），８０．６（Ｃ−３′′′），７８．８（Ｃ−５′′），７８．６（Ｃ−２′′′），７８．０（Ｃ−２′′），７７．９（Ｃ−３′′），７５．４（Ｃ−４′′′），７１．４（Ｃ−４′′），６６．０（Ｃ−５′′′），６２．４（Ｃ−６′′），４４．９（Ｃ−３）。
上記の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの特徴及び１３Ｃ−ＮＭＲデータが文献の報告とほぼ一致しているため、当該化合物をリクイリチンアピオシドに同定する。
【0026】
化合物６：白色の粉末、ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：３８７［Ｍ−Ｈ］−。ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ１７Ｈ２４Ｏ１０に決定する。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δＨ：７．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−３），５．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，Ｈ−１），５．４８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），５．３１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），５．２９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０ａ），５．２５（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０ｂ），４．６７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１′），３．５０（１Ｈ，ｓ，７−ＯＣＨ３），３．１８（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．６３（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），１．８５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝６．０，１３．２Ｈｚ，Ｈ−６ａ），１．６９（１Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝３．０，１３．８Ｈｚ，Ｈ−６ｂ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δＣ：１６７．４（Ｃ−１１），１５４．４（Ｃ−４），１３３．３（Ｃ−８），１２１．０（Ｃ−１０），１０５．３（Ｃ−４），１０３．３（Ｃ−７），１００．３（Ｃ−１′），９８．５（Ｃ−１），７８．３（Ｃ−５′），７８．０（Ｃ−３′），７４．６（Ｃ−２′），７１．４（Ｃ−４′），６２．６（Ｃ−６′），５７．０（７−ＯＣＨ３），４３．５（Ｃ−９），３０．２（Ｃ−６），２２．８（Ｃ−５）。
上記の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの特徴及び１３Ｃ−ＮＭＲデータが文献の報告とほぼ一致しているため、当該化合物をエピボゲロシド（ｅｐｉ−ｖｏｇｅｌｏｓｉｄｅ）に同定する。
【0027】
化合物７：白色の粉末、ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：３８７［Ｍ−Ｈ］−。ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ１７Ｈ２４Ｏ１０に決定する。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，６００ＭＨｚ）δＨ：７．５８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，Ｈ−３），５．５５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，Ｈ−１），５．４７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８），５．３１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７），５．２９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０ａ），５．２６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−１０ｂ），４．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，Ｈ−１′），３．５４（１Ｈ，ｓ，７−ＯＣＨ３），３．１６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−５），２．６７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−９），１．９７（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６ａ），１．４４（１Ｈ，ｍ，Ｈ−６ｂ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，１５０ＭＨｚ）δＣ：１６７．６（Ｃ−１１），１５４．１（Ｃ−４），１３３．０（Ｃ−８），１２１．１（Ｃ−１０），１０５．４（Ｃ−４），１０５．１（Ｃ−７），９９．７（Ｃ−１′），９７．９（Ｃ−１），７８．４（Ｃ−５′），７７．８（Ｃ−３′），７４．７（Ｃ−２′），７１．５（Ｃ−４′），６２．６（Ｃ−６′），５７．１（７−ＯＣＨ３），４３．７（Ｃ−９），３１．７（Ｃ−６），２５．３（Ｃ−５）。
上記の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの特徴が文献の報告とほぼ一致しており、炭素信号の帰属を決定して当該化合物をボゲロシド（ｖｏｇｅｌｏｓｉｄｅ）に同定する。
【0028】
化合物８：白色の粉末、ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ：２０９［Ｍ＋Ｈ］＋。ＮＭＲデータと組み合わせて当該化合物の分子式をＣ１１Ｈ１２Ｏ４に決定する。１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，６００ＭＨｚ）δＨ：７．４６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，Ｈ−７），７．０４（１Ｈ，ｂｒｓ，Ｈ−２），６．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−６），６．７５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，Ｈ−５），６．２４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１５．９Ｈｚ，Ｈ−８），４．１５（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｈ−１０），１．２４（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｈ−１１）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１５０ＭＨｚ）δＣ：１６６．５（Ｃ−９），１４８．６（Ｃ−４），１４５．０（Ｃ−７），１４５．６（Ｃ−３），１２１．３（Ｃ−６），１２５．３（Ｃ−１），１１５．７（Ｃ−５），１１４．７（Ｃ−２），１１３．９（Ｃ−８），５９．６（Ｃ−１０），１４．３（Ｃ−１１）。
上記の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの特徴及び１３Ｃ−ＮＭＲデータが文献の報告とほぼ一致しているため、当該化合物をカフェー酸エチルに同定する。
【0029】
（実施例２）レンギョウ３０ｋｇ、キンギンカ２０ｋｇ、バンランコン３０ｋｇ、ダイオウ６ｋｇ、コウカッコウ１０ｋｇ、メンマカンジュウ２０ｋｇ、コウケイテン６ｋｇ、ハッカノウ０．５ｋｇ、マオウ１０ｋｇ、クキョウニン６ｋｇ、ギョセイソウ３０ｋｇ、カンゾウ６ｋｇ、セッコウ３０ｋｇを秤量し、以下のプロセスで抽出する。
（１）重量比で生薬を秤量し、洗浄し、適宜破砕する。
（２）コウカッコウを破砕し、１０倍の量の水を加えて揮発油を抽出し、８時間抽出して揮発油を採取し、使用に備え、抽出液を濾過して、残渣を捨て、濾液を使用に備える。
（３）レンギョウ、マオウ、ギョセイソウ、ダイオウを１２倍の量の７０％エタノールで３回抽出し、毎回２．５時間とし、抽出液を合併して濾過し、エタノールを回収して、濾液を使用に備える。
（４）キンギンカ、セッコウ、バンランコン、メンマカンジュウ、カンゾウ、コウケイテンに１２倍の量の水を加えて、沸騰するまで煎出し、クキョウニンを加えて、２回煎出し、毎回１時間とし、抽出液を合併して濾過し、濾液をステップ（２）のコウカッコウから揮発油抽出後の濾液と合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１０であるように濃縮させて軟エキスを取得し、エタノールを加え、アルコール濃度が７０％であるように調節し、冷蔵し、濾過して、エタノールのにおいがなくなるまでエタノールを回収し、軟エキスを得て使用に備える。
（５）ステップ（４）で得た軟エキスとステップ（３）で得たアルコール抽出液を合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１５であるように濃縮させて軟エキスを取得し、乾燥させて、総エキスを得て使用に備える。
【0030】
１．装置と材料は実施例１と同じである。２．抽出と分離：
本発明の漢方薬組成物の総エキス５ｋｇをｄ−１０１マクロポーラス樹脂で吸着し、水、１０％エタノール、３０％エタノール、５０％エタノールで溶出し、濃縮させて各部分のエキスを得る。残りのステップは実施例１と同じである。
３．結果の同定：
実施例１と同じである。分離した８種の化合物は実施例１で得たものと完全に同じである。
【0031】
（実施例３）生薬の配合は、レンギョウ２７．８ｋｇ、キンギンカ２９．４ｋｇ、バンランコン２８．５ｋｇ、ダイオウ５．５ｋｇ、コウカッコウ９．５ｋｇ、メンマカンジュウ２９ｋｇ、コウケイテン８．７ｋｇ、ハッカノウ０．８５ｋｇ、マオウ８．８ｋｇ、クキョウニン８ｋｇ、ギョセイソウ２８．４ｋｇ、カンゾウ９．５ｋｇ、セッコウ２７．７ｋｇである。以下のプロセスで抽出する。
（１）重量比で生薬を秤量し、洗浄し、適宜破砕する。
（２）コウカッコウを破砕し、１０倍の量の水を加えて揮発油を抽出し、８時間抽出して揮発油を採取し、使用に備え、抽出液を濾過して、残渣を捨て、濾液を使用に備える。
（３）レンギョウ、マオウ、ギョセイソウ、ダイオウを１２倍の量の７０％エタノールで３回抽出し、毎回２．５時間とし、抽出液を合併して濾過し、エタノールを回収して、濾液を使用に備える。
（４）キンギンカ、セッコウ、バンランコン、メンマカンジュウ、カンゾウ、コウケイテンに１２倍の量の水を加えて、沸騰するまで煎出し、クキョウニンを加えて、２回煎出し、毎回１時間とし、抽出液を合併して濾過し、濾液をステップ（２）のコウカッコウから揮発油抽出後の濾液と合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１３であるように濃縮させて軟エキスを取得し、エタノールを加え、アルコール濃度が７０％であるように調節し、冷蔵し、濾過して、エタノールのにおいがなくなるまでエタノールを回収し、軟エキスを得て使用に備える。
（５）ステップ（４）で得た軟エキスとステップ（３）で得たアルコール抽出液を合併し、６０℃で測定された相対密度が１．１８であるように濃縮させて軟エキスを取得し、乾燥させて、総エキスを得て使用に備える。
【0032】
１．装置と材料は実施例１と同じである。２．抽出と分離：
本発明の漢方薬組成物の総エキス５ｋｇをＨＰＤ−１００マクロポーラス樹脂で吸着し、水、１０％エタノール、３０％エタノール、５０％エタノールで溶出し、濃縮させて各部分のエキスを得る。残りのステップは実施例１と同じである。
３．結果の同定：
実施例１と同じである。分離した８種の化合物は実施例１で得たものと完全に同じである。
【0033】
上述した内容は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明を限定するためのものではない。本発明の趣旨の範囲内でなされた補正、同等な差し替え又は改善等は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。