特許 6976937 酵素的方法によって人参のサポニンからジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃおよびコンパウンドＯを選択的に製造する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6976937

(24)【登録日】2021年11月12日

(45)【発行日】2021年12月8日

(54)【発明の名称】酵素的方法によって人参のサポニンからジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃおよびコンパウンドＯを選択的に製造する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/44 20060101AFI20211125BHJP

   C12P 33/00 20060101ALI20211125BHJP

   C07J 9/00 20060101ALI20211125BHJP

   A61P 43/00 20060101ALN20211125BHJP

   A61K 36/258 20060101ALN20211125BHJP

   A61K 125/00 20060101ALN20211125BHJP

【ＦＩ】

   C12P19/44

   C12P33/00

   C07J9/00

   !A61P43/00 105

   !A61K36/258

   A61K125:00

【請求項の数】5

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2018-519910(P2018-519910)

(86)(22)【出願日】2016年10月21日

(65)【公表番号】特表2018-531018(P2018-531018A)

(43)【公表日】2018年10月25日

(86)【国際出願番号】KR2016011900

(87)【国際公開番号】WO2017069561

(87)【国際公開日】20170427

【審査請求日】2019年9月27日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0147353

(32)【優先日】2015年10月22日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】506213681

【氏名又は名称】アモーレパシフィック コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＡＭＯＲＥＰＡＣＩＦＩＣ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100132230

【弁理士】

【氏名又は名称】佐々木 一也

(74)【代理人】

【識別番号】100082739

【弁理士】

【氏名又は名称】成瀬 勝夫

(74)【代理人】

【識別番号】100198269

【弁理士】

【氏名又は名称】久本 秀治

(72)【発明者】

【氏名】ナム ギ ベク

(72)【発明者】

【氏名】キム ドン ヒュン

(72)【発明者】

【氏名】ホン ヨン ドク

(72)【発明者】

【氏名】パク ジュン ソン

(72)【発明者】

【氏名】ピョン キョン ヒ

【審査官】 中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２７２３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００７−５３０５３１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２００９−００６１１０７（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Process Biochemistry, 2011.12.17, vol. 47, no. 3, pp. 538-543

【文献】 Chem Pharm Bull., 2007.07.25, vol. 55, no. 10, pp. 1522-1527

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／

ＡＧＲＩＣＯＬＡ／ＢＩＯＴＥＣＨＮＯ／ＣＡＢＡ／ＦＳＴＡ／

ＳＣＩＳＥＡＲＣＨ／ＴＯＸＣＥＮＴＥＲ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アスペルギルスアクレアタスから分離したペクチナーゼを用いて、人参のサポニンを転換させることによって、下記の化学式１で示すジンセノサイドＦ２、下記の化学式２で示すコンパウンドＭｃまたは下記の化学式３で示すコンパウンドＯを選択的に製造する方法であって、
［化学式１］

【化1】

［化学式２］

【化2】

［化学式３］

【化3】

（１）基質である人参のサポニンを水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合液中に溶解させ、酵素として前記ペクチナーゼを添加して、加温状態の水浴槽上で撹拌しながら３０〜６０℃で２４〜９６時間反応させ、前記水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合液はｐＨが３〜６の範囲であり、前記の基質である人参のサポニンはジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ又はＲｄを含み、前記酵素は基質の量に対して１０〜４００重量％の量で用いられる段階と、
（２）前記の基質が完全消失したら、酵素を不活性化させて反応を終了させる段階と、
（３）前記段階（２）で得た反応液に酢酸エチルを添加して抽出した後に濃縮させて、ジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃまたはコンパウンドＯを分離する段階と、
を含む方法。

【請求項2】

前記（１）の酵素の反応は、基質の量に対して２００重量％の量で用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記（１）の酵素の反応は、３０℃の温度で行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記（１）の酵素の反応は、２４時間行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記の水性溶媒または水性溶媒と有機溶媒との混合液は、ｐＨが３．５〜５．５の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は人参のサポニンから、本来人参内に微量に存在するジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃおよびコンパウンドＯを選択的に製造する方法に関し、さらに詳細には、人参から得られるサポニンに特定の酵素を処理して、上記サポニンを構造転換させることによって所望する目標化合物、すなわち、ジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃおよびコンパウンドＯを高収率に収得することのできる方法に関する。

【背景技術】

【0002】

人参サポニンは他の植物から発見されるサポニンとは異なる特異な化学構造を有しており、これによって薬理効能も特異なため、人参（ｇｉｎｓｅｎｇ）配糖体（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ）という意味で“ジンセノサイド（ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ）”とも呼ばれる。人参サポニンの具体的な種類としては、パナキサジオール系であるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、コンパウンドＫ、コンパウンドＭｃ、コンパウンドＯなど、およびパナキサトリオール系であるジンセノサイドＲｅ、Ｒｆ、Ｒｇ１、Ｒｇ３、Ｒｇ５、Ｒｈ１、Ｒｈ２などがあって、これら人参サポニンはそれぞれ異なる効能を表す。

【0003】

［反応式１］

【化1】

【0004】

上記の反応式１に示すように、特にパナキサジオール系サポニンであるジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃなどは微生物代謝によって他の人参サポニンに転換され得るため、人参サポニンから他の種類の特定の人参サポニンに転換させる方法として酵素を用いる方法が以前から使用されている。

【0005】

しかしながら、従来の酵素を用いる転換反応は、基質に対する酵素の非特異性が大きいため用いられるサポニン基質対比極めて多い量の酵素を使用せざるを得ず、酵素反応が所望する人参サポニンで終了されるのではなく、追加反応が非特異的に行われるため、所望する人参サポニンにのみ転換されずに他の人参サポニンが多様に生成されて所望する人参サポニンの収率が極めて低かった。

【0006】

また、人参サポニンを収得する従来の方法は、所望する特定の人参サポニンだけに転換させるのではなく、転換された多様な人参サポニンを抽出などを通して収得した後、これを精製して、所望する人参サポニンのみを分離することを技術的解決策としている。

【0007】

ところが、このような従来方法は、純粋な特定の人参サポニンを収得するために精製による追加的な費用、時間などが所要されるため、人参サポニンの販売価が上昇せざるを得ず、これによって関連製品に人参サポニンを多量に適用するには限界がある。

【0008】

さらに、ジンセノサイドＲｂ１において糖の非選択的除去によりジンセノサイドＲｄ、ジンセノサイドＸＶII、ジンセノサイドＬＸＸＶ、コンパウンドＫなどが生成され、ジンセノサイドＲｂ２において糖の非選択的除去によりコンパウンドＹが生成され、ジンセノサイドＲｃにおいて糖の非選択的除去によりコンパウンドＭｃ１が生成され得るため、酵素反応が非特異的に行われると、ジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃなどのような代謝物を高収率に得ることは難しくなる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【特許文献1】大韓民国公開特許第１０−２００２−００５８１５３号（２００２年７月１２日公開）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従来の方法により特定の人参サポニンを収得するためには、費用が多くかかるのみならず、所望する人参サポニンを大量に入手することが困難であった。したがって、目標人参サポニンを大量に生産することができ、かつ費用を節減することのできる製造方法を開発する必要性が存在した。

【0011】

それゆえ、本発明は、所望する特定の人参サポニンを高収率に収得することができ、かつ実施が容易な人参サポニンの転換方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0012】

上記の目的を達成するため、本発明は、アスペルギルス属から分離したペクチナーゼおよびベータ‐グルカナーゼからなる群より選択される一種以上を用いて、人参のサポニンを転換させることによって、ジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃ、コンパウンドＯを製造する方法を提供する。

【発明の効果】

【0013】

本発明による人参サポニンへの転換方法を用いることによって、所望する人参サポニンを高収率で容易に収得することができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、人参サポニンへの転換反応後に生成されるジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃ、コンパウンドＯをシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって確認した結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は酵素的方法によって人参のサポニン、特にパナキサジオール系サポニンを転換させて下記の化学式１で示すジンセノサイドＦ２、下記の化学式２で示すコンパウンドＭｃおよび下記の化学式３で示すコンパウンドＯを選択的に製造する方法に関する。具体的に、糖の選択的除去を通じてジンセノサイドＲｂ１をジンセノサイドＦ２に転換することができ、ジンセノサイドＲｃをコンパウンドＭｃに転換することができ、ジンセノサイドＲｂ２をコンパウンドＯに転換することによって、所望する人参サポニンを選択的に製造することができる。

【0016】

［化学式１］

【化2】

【0017】

［化学式２］

【化3】

【0018】

［化学式３］

【化4】

【0019】

本発明の方法によると、微生物由来の酵素を用いることによって、人参のサポニンから所望する人参サポニンへの転換が効率的に行われるようにして、高収率にジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃおよびコンパウンドＯを収得することができる。

【0020】

具体的には、本発明において用いられる酵素は、好ましくはアスペルギルス属の微生物、特にアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルスアクレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルスルチュエンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｌｕｃｈｕｅｎｓｉｓ）およびアスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）からなる群より選択される一種以上の微生物から得られるものであって、最も好ましくはアスペルギルスアクレアタスから得られるものである。

【0021】

さらに、本発明において用いられる酵素は、アスペルギルス属の微生物から分離したラクターゼ、セルラーゼ、ベータ‐ガラクトシダーゼ、ナリンギナーゼ、ヘミセルラーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、ペクチナーゼ、またはこれらの混合物であることができ、好ましくはペクチナーゼ、ベータ‐グルカナーゼ、またはこれらの混合物である。

【0022】

大部分が同一な作用を行う同じ種類の酵素であっても、酵素が由来した微生物の種によって、具体的に酵素が基質内で作用する部位が相違して基質特異性に差が生じる。したがって、本発明においては、最も好ましくはアスペルギルスアクレアタスから得られるペクチナーゼおよびベータ‐グルカナーゼからなる群より選択される一種以上を用いることである。

【0023】

本発明においては、人参のサポニンを溶媒に０．０１〜２０重量％の量で溶解させた後、上記酵素を用いて酵素的方法によって、サポニンを所望する人参サポニンに転換させる。このとき用いられる溶媒としては、酵素の活性を阻止しないものを使用することが好ましく、例えば、水または緩衝溶液のような水性溶媒、あるいは水または緩衝溶液のような水性溶媒と有機溶媒との混合液を使用することができる。具体的にこのとき用いられる緩衝溶液としては酢酸、クエン酸、リン酸またはクエン酸‐リン酸などであり、有機溶媒としてはアセトニトリル、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、１‐プロパノール、２‐プロパノールなどである。好ましくは、用いられる溶媒としてはｐＨ範囲が２．５〜７．５、より好ましくは３〜６、さらに好ましくは３．５〜５．５である。

【0024】

本発明の方法において、用いられる酵素は、使用する基質の量に対して、１〜５００重量％の量で添加されるのが好ましく、より好ましくは１０〜４００重量％、さらに好ましくは１０〜２００重量％の量で添加される。

【0025】

反応温度は、酵素の不活性化が行われない温度条件でなければならないが、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは３５〜６０℃、さらに好ましくは４０〜５５℃の範囲で温度を維持することである。

【0026】

さらに、反応時間も酵素の活性が維持される期間であれば特に制限を受けないが、１〜１２０時間、好ましくは１〜９６時間、より好ましくは２４〜９６時間、さらに好ましくは２４〜７２時間撹拌しながら反応させることである。

【0027】

以降、沸騰水浴槽における加熱のような公知の方法を用いて、酵素を不活性化することによってジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃおよびコンパウンドＯを多量含有した反応液を得ることができる。

【実施例】

【0028】

以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明する。但し、次の実施例で本発明の範疇が限定されるものではない。

【0029】

［参考例１］人参精製サポニンの製造
紅参、白参、水参、尾参あるいはこれらの人参の葉、人参の花、人参の実２ｋｇにエタノール２０リットル（Ｌ）を入れ、３回還流抽出した後、１５℃で６日間沈積させた。その後、ろ過布ろ過と遠心分離を通じて残渣とろ液を分離し、分離されたろ液を減圧濃縮して得られたエキスを水に懸濁した後に、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１‐ブタノール１Ｌで３回抽出した。これから得られた総１‐ブタノール層を５％ＫＯＨで処理した後に、蒸留水で洗浄し、減圧濃縮して１‐ブタノールエキスを収得し、これを少量のメタノールに溶かした後、大量の酢酸エチルに加えて、生成された沈殿物を乾燥させることによって、人参精製サポニン（ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆなどを含む）４０〜８０ｇを収得した。

【0030】

［実施例１］酵素反応を通じたジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃ、コンパウンドＯの製造
上記参考例１の人参精製サポニン（ジンセノサイドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、Ｒｇ１、Ｒｆなどを含む）１０ｇを水１Ｌに入れて溶解した。
その後、上記混合液にアスペルギルスアクレアタスから分離したペクチナーゼを基質対比２００重量％添加した後、３０℃で２４時間反応させた。薄層クロマトグラフィーによって周期的に確認して基質が完全に消失されると、沸騰水浴槽で１０分間加熱して酵素を不活性化させて、反応を終了させた。最後に、反応液に酢酸エチルを１：１の比率（反応液に対する体積比）で入れて、３回抽出した後に濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝９：１）によって、図1に示すようにジンセノサイドＦ２、コンパウンドＭｃ、コンパウンドＯを分離した。

【0031】

使用した参考例１の人参サポニン１０ｇには、２．６６ｇのジンセノサイドＲｂ１、０．７３ｇのジンセノサイドＲｂ２、１．２３ｇのジンセノサイドＲｃおよび０．３８ｇのジンセノサイドＲｄが存在した。ジンセノサイドＦ２は、ジンセノサイドＲｂ１およびジンセノサイドＲｄから９５％以上の収率で転換し、コンパウンドＭｃは、ジンセノサイドＲｃから９５％以上の収率で転換し、コンパウンドＯはジンセノサイドＲｂ２から９５％以上の収率で転換した。

【図1】