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特許6976941白血病に罹患している対象の治療レジメンを選択するためのアッセイ及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6976941
(24)【登録日】2021年11月12日
(45)【発行日】2021年12月8日
(54)【発明の名称】白血病に罹患している対象の治療レジメンを選択するためのアッセイ及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7068 20060101AFI20211125BHJP
A61K 31/404 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/44 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/496 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/497 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/505 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/517 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/5377 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/553 20060101ALI20211125BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20211125BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20211125BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20211125BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20211125BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7068
A61K31/404
A61K31/44
A61K31/4709
A61K31/496
A61K31/497
A61K31/505
A61K31/517
A61K31/5377
A61K31/553
A61K31/704
A61K45/00
A61P35/02
A61P43/00 121
【請求項の数】4
【全頁数】29
(21)【出願番号】特願2018-525429(P2018-525429)
(86)(22)【出願日】2016年11月10日
(65)【公表番号】特表2018-535975(P2018-535975A)
(43)【公表日】2018年12月6日
(86)【国際出願番号】US2016061444
(87)【国際公開番号】WO2017083592
(87)【国際公開日】20170518
【審査請求日】2019年9月12日
(31)【優先権主張番号】62/254,109
(32)【優先日】2015年11月11日
(33)【優先権主張国】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507250966
【氏名又は名称】セレーター ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド
(73)【特許権者】
【識別番号】518164548
【氏名又は名称】オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティー
【氏名又は名称原語表記】ＯＲＥＧＯＮ ＨＥＡＬＴＨ ＆ ＳＣＩＥＮＣＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ゴードン， マックス
(72)【発明者】
【氏名】ターディ， ポール
(72)【発明者】
【氏名】タイナー， ジェフリー
(72)【発明者】
【氏名】メイヤー， ローレンス
【審査官】
新留 素子
(56)【参考文献】
【文献】
Blood，[online]，2010年11月19日，Vol.116, Issue 21，Abstract 2886，https://ashpublications.org/blood/article/116/21/2886/111972/Evaluation-of-CPX-351-cytarabine-daunorubicin，[2020年7月27日検索]
【文献】
Blood，2014年05月22日，Vol.123, Number 21，pp.3239-3246
【文献】
Blood，2010年01月21日，Vol.115, Number 3，pp.453-474
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４
Ａ６１Ｋ ４５／００
Ａ６１Ｐ １／００−４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＬＴ−３中に活性化変異を示す血液由来癌を有する対象におけるＣＰＸ−３５１による治療の有効性を増強させる方法において使用するためのＦＬＴ阻害剤及びＣＰＸ−３５１の組合せキットであって、前記方法は、ＣＰＸ−３５１と組み合わせて有効量のＦＬＴ−３阻害剤を投与することを含み、ここで、ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤は、同時に投与されるか、又はＣＰＸ−３５１は、ＦＬＴ−３阻害剤による治療の前に投与される、組合せキット。
【請求項2】
ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤が同じ組成物中で投与される、請求項１に記載の組合せキット。
【請求項3】
血液由来癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫からなる群から選択される、請求項１に記載の組合せキット。
【請求項4】
ＦＬＴ−３阻害剤が、キザルチニブ、ミドスタウリン、タンヅチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レスタウルチニブ、クレノラニブ、ギルテリチニブ、ＡＳＴ−４８７、ドビチニブ、又はリニファニブである、請求項１〜３のいずれかに記載の組合せキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照本出願は、２０１５年１１月１１日に出願された米国仮出願６２／２５４，１０９号の優先権を主張する。この文書の内容は本明細書中に参照により組み込まれる。
【0002】
本発明は、癌の診断及び治療の分野に属する。より詳細には、本発明は、ダウノルビシンとシタラビンの相乗的な組合せリポソームを用いた治療により最も利益を得られる患者の同定に関する。
【背景技術】
【0003】
ＣＰＸ−３５１は、５：１のモル比で共にカプセル封入されたシタラビン及びダウノルビシンを含有する、ナノスケール（直径１００ｎｍ）の低コレステロールリポソーム製剤であり（米国特許第８，０２２，２７９号及び第８，４３１，８０６号）、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても最適な相乗作用を有することが示されている。慣用の遊離薬物の組合せから劇的に改善された有効性を示すことがいくつかの前臨床研究において観察されている。より重要なことに、ＣＰＸ−３５１は、臨床試験（一方は新規に診断された高齢の急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者、他方は成人の初回再発のＡＭＬ患者）において、標準療法と比較して完全寛解及び生存率の増加をもたらしている。ＡＭＬの現在の治療法は「標準療法」であり、「７＋３」治療とも呼ばれている。
【0004】
本発明は、現在の「標準療法」に対してＣＰＸ−３５１による治療が有益である患者集団を同定すること、及び個々の患者間で発生する癌の異種性を考慮した分析を提供することに焦点を置いている。
【0005】
ＣＰＸ−３５１を用いた臨床試験で観察された有効性は、１）シタラビン：ダウノルビシンの高濃度が長期間にわたって相乗的な比で循環系中に維持されること（したがって拮抗的な比を回避する）２）骨髄におけるＣＰＸ−３５１の蓄積の増加及び持続、ならびに３）骨髄における正常細胞と比較した白血病細胞によるインタクトなＣＰＸ−３５１リポソームの選択的蓄積及び細胞毒性、に起因する。ＣＰＸ−３５１治療の直前の７＋３シタラビン：ダウノルビシン治療による「標準療法」に応答しなかった患者、ならびに進行性の成人急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）及び脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）患者を含む高リスクのＡＭＬ患者の高い割合において、ＣＰＸ−３５１は、循環系及び骨髄から白血病細胞を迅速に排除する効果が高いことが示されている。
【0006】
血液悪性腫瘍を有する患者から単離したばかりの白血病細胞を使用した短期間のｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性アッセイは、血液悪性腫瘍に対する治療剤の活性範囲の指標を得るために有用である。このことから、本発明者らは、個々の患者における抗新生物活性を評価するために、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＬＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫を含む広範にわたる血液悪性腫瘍を有する患者から新たに入手した血液サンプルから循環中の芽球を採取及び精製するプロセスを確立した。また、出願人らは、血液悪性腫瘍の種類、及びその悪性腫瘍内の患者の亜型の特定の表現型プロファイルに基づいて分類することにより、多くの新しい治験薬の抗増殖活性／細胞毒性活性のプロファイルを確立した。このアッセイにおける５０及び９０パーセント増殖阻害濃度（それぞれＩＣ５０及びＩＣ９０）は、治療感度が許容可能な薬物濃度を反映しているかどうか、及び臨床試験を設定する上で試験を正当とするために所定の患者クラスの何割が十分な感受性を有するか予測することに用いることができる。よって、薬物感受性と亜集団の表現型との相関により、患者選択の情報を与えるバイオマーカーが同定される。
【0007】
しかし、ナノ粒子（例えば、リポソーム及びナノ粒子）薬物製剤は典型的にはｉｎ ｓｉｔｕにおける薬剤注入リザーバーとして設計されており、それによりビヒクルは癌増殖部位に優先的に蓄積され、当該部位に到達すると遊離薬物をゆっくりと放出し、その後、癌細胞によって取り込まれることから、歴史的に、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるナノ粒子薬物製剤の癌細胞に対する細胞毒性評価は行われていない。通常、ｅｘ ｖｉｖｏでの薬物放出速度はｉｎ ｖｉｖｏで観察されるよりもはるかに遅いため、ｅｘ ｖｉｖｏにおけるカプセル封入された抗癌薬の細胞毒性効果は、対応する遊離薬物で観察される効果よりも数桁低いことが多く、ｅｘ ｖｉｖｏ試験によるｉｎ ｖｉｖｏの成功の予測は信頼性が低い。
【0008】
ＣＰＸ−３５１の場合、出願人らは独自に、ヒト白血病細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で、エネルギー依存性の機構を介してリポソームにカプセル封入した形態のシタラビン及びダウノルビシンを取り込むことを実証した。細胞質内の液胞中に取り込まれた後、リポソームは生物利用可能な薬物を生成し、細胞殺傷活性をもたらす。このことは、シタラビン：ダウノルビシンの相乗的な５：１のモル比の送達を確実にするだけでなく、本明細書中に示すように遊離薬物に匹敵する、場合によってはより強力な、ＣＰＸ−３５１のｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性効果（ＩＣ５０値に基づく）ももたらす。
【0009】
様々な白血病状態由来の新鮮な白血病芽球に対するＣＰＸ−３５１のｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性の試験的検討から、培地中でリポソームからの薬物放出が検出不可能なインキュベーション条件下で５０ｎＭシタラビン：１０ｎＭダウノルビシンと同程度の低いＩＣ５０値が得られた（Ｔｙｎｅｒ，Ｊ．ら、Ｂｌｏｏｄ（２０１０）１１６：アブストラクト２８８６）。これにより、以前記述したインタクトなＣＰＸ−３５１リポソームの白血病細胞株に対する直接的な抗白血病活性が、患者から新たに入手した芽球に関連していることが確認された。また、これにより、遺伝子型／表現型の細胞特性が、ＰＫの寄与とは独立してどのように芽球のＣＰＸ−３５１に対する感受性に影響を与えるか精査できる。
【0010】
したがって、一般的なナノ粒子組成物の性能とは対照的に、新鮮な患者サンプルに対するＣＰＸ−３５１の細胞毒性及び／又は新鮮な患者サンプルによるＣＰＸ−３５１の取り込みのｅｘ ｖｉｖｏ検査は、個々の患者及び集団型におけるＣＰＸ−３５１の抗新生物活性を予測する方法となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
白血病の慣用の標準療法は４０年以上も同じであり、「７＋３」治療として、アントラサイクリン及びシタラビンを連続的にその遊離形態で用いる。この治療は「標準」ではあるが、一部の患者では副作用及び／又は予後不良が存在する。ＣＰＸ−３５１はそのような患者に有益な他の手段を提供することができる。よって、ＣＰＸ−３５１を適切な治療として受けられるように、血液由来癌に罹患している患者を階層化することが必要である。ＣＰＸ−３５１及び／又は慣用の治療レジメンはどの個体にも有効とは言えないため、血液由来癌患者のための適切な治療レジメンの選択を容易とする、診断試験、薬剤、及び／又はマーカーを同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、一態様では、ＡＭＬ及びＣＬＬなどの主要な血液癌群ならびに様々な疾患亜型由来の細胞を含む、血液悪性腫瘍患者から新たに採取した広範囲の芽球種に対するＣＰＸ−３５１の細胞毒性及び／又は取り込みのｅｘ ｖｉｖｏ評価に基づく。結果はｉｎ ｖｉｖｏ治療後の患者の結果と関連付けられる。
【0013】
血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫が含まれる。
【0014】
よって、本態様では、本発明は、ＣＰＸ−３５１のヒト対象への投与が、当該対象の血液癌治療に有効である可能性を予測する方法であって、前記対象由来の癌細胞を、細胞培養物中でＣＰＸ−３５１処理にｅｘ ｖｉｖｏで曝露すること、及び
前記細胞の前記処理に対する応答性を測定すること、を含み；
ここで、その細胞が前記処理に応答性を示す対象が、ＣＰＸ−３５１による治療が有効である可能性が高い対象として同定される、方法に関する。応答性は、例えば、ＩＣ５０若しくはＩＣ９０の決定を用いた細胞毒性として、又はＣＰＸ−３５１の取り込みを測定することにより測定することができる。
【0015】
このように同定された対象に、ＣＰＸ−３５１を有効量で投与する。
【0016】
第２の態様では、本発明は、標準療法の代わりにより高価なＣＰＸ−３５１治療に置き換えることで最も利益を得られる対象を同定し、それによって、これらの対象に対するＣＰＸ−３５１の使用について規制当局の承認をもたらし得ることに関する。これらの対象は、以下に記載する特定の遺伝子型及び表現型の特徴による同定される。
【0017】
特定の実施形態では、同定方法は、前記対象においてＦｍｓ様チロシン受容体キナーゼ３（ＦＬＴ−３）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定することを含み、これによって、前記ＦＬＴ−３遺伝子に変異を示す対象が、ＣＰＸ−３５１による治療から利益を得られる対象として同定され、一部の実施形態では、更に、有効量のＣＰＸ−３５１を前記対象に投与することを含み；かつ／あるいは、前記対象においてヌクレオフォスミン１（ＮＰＭ−１）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定することを含み、これによって、前記ＮＰＭ−１遺伝子に変異を示す対象が、ＣＰＸ−３５１による治療から利益を得られる対象として同定され、一部の実施形態では、更に、有効量のＣＰＸ−３５１を前記対象に投与することを含み；かつ／あるいは、前記対象においてＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定することを含み、これによって、前記ＣＥＢＰα遺伝子に変異を示す対象が、ＣＰＸ３５１による治療から利益を得られる対象として同定され、一部の実施形態では、更に、有効量のＣＰＸ３５１を前記対象に投与することを含む。
【0018】
ＦＬＴ−３変異の場合、当該変異は、この遺伝子の活性化変異、特にＦＬＴ３−ＩＤＴ損傷であり得る。
【0019】
ＣＰＸ−３５１を含む治療レジメンに適した患者（例えば、白血病であるか又は白血病のリスクがある患者）の指標となり得る、上述などのバイオマーカーの１つ又は組合せは、これに限定されるものではないが、ＦＬＴ３−ＩＴＤ損傷若しくはＦＬＴ３−ＴＫＤ損傷、及びＦＬＴ３の変異の任意の組合せを含むＦＬＴ−３遺伝子の少なくとも１つ又はそれ以上の変異、又はそれとＮＰＭ−１遺伝子及び／若しくはＣＥＢＰα遺伝子の変異などの他の遺伝子マーカーとの組合せを含む。承認された場合、ＣＰＸ−３５１は、本明細書中に記載された少なくとも１つ又はそれ以上のバイオマーカーを保有すると選択された対象の血液由来癌に対して、他の抗癌治療（例えば、放射線、手術）が行われていても行われていなくても使用することができる。他の実施形態では、承認された場合、ＣＰＸ−３５１は、本明細書中に記載された少なくとも１つ又はそれ以上のバイオマーカーを保有すると選択された対象のそのような癌を治療するための骨髄前処置剤として使用することができる。
【0020】
ＦＬＴ−３、ＮＰＭ−１、及びＣＥＢＰαマーカーに加えて、他の核型は、以下の実施例１中に記載の欧州白血病ネット（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ＬｅｕｋｅｍｉａＮｅｔ、ＥＬＮ）の指針に従って、１つ又は２つのＣＰＸ−３５１応答性の対立遺伝子を含んでいてもよい。
【0021】
したがって、本発明はまた、対象を好適リスク（ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｒｉｓｋ）、中間−Ｉ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−Ｉ）、中間−ＩＩ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ＩＩ）、又は有害リスク（ａｄｖｅｒｓｅ ｒｉｓｋ）に分類するために、ＥＬＮシステムに従って対象の遺伝子型を決定することを含む、ＣＰＸ−３５１による治療から利益を得られる癌患者を同定する方法に関する。中間−ＩＩ又は有害リスクである患者はＣＰＸ−３５１治療により利益を得られる可能性が高いと同定され、そのように治療される。ＥＬＮシステムは標準の７＋３療法に対する応答性に基づいており、有害リスクを有する者の応答は良好ではない。
【0022】
治療から利益を得られる対象を決定するために、ＥＬＮに従った分類と前述の遺伝子マーカーとを組み合わせることができることは明らかである。
【0023】
したがって、一般に、上述の態様では、本発明は、血液由来癌（例えば白血病）であるか若しくは血液由来癌（例えば白血病）のリスクがある対象の治療レジメンを選択するため、血液由来癌（例えば白血病）である対象を治療するため、並びに／あるいは、血液由来癌（例えば白血病）であるか若しくは血液由来癌（例えば白血病）のリスクがある対象に推奨され若しくは投与される治療レジメンの有効性を改善するための、アッセイ、方法、システム、及びキットに関する。
【0024】
本明細書中に記載のアッセイ、方法、システム、又はキットにおいて使用するための被検サンプルは、骨髄などの対象の生体サンプル、あるいは対象からの血液サンプル又は血漿若しくは血清サンプルに由来することができる。
【0025】
本明細書中に記載の少なくとも１つのバイオマーカーの選択に応じて、例えば、これに限定されるものではないが、遺伝子型決定アッセイ、発現アッセイ（例えば、タンパク質及び／若しくは転写物のレベル）、遺伝子型を同定することができる他のアッセイ、又はそれらの任意の組合せを含む、１つ以上の分析を被験サンプルについて行うことができる。多数のそのようなアッセイが当分野で知られており、マイクロアレイ（例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標））及びシーケンシング（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ）などの多くが市販されている。
【0026】
血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫を含む。
【0027】
別の態様では、本発明は、ＦＬＴ−３遺伝子に活性化変異を有する血液癌患者における、ＣＰＸ−３５１による治療の有効性を増強させる方法であって、ＣＰＸ−３５１と組み合わせて有効量のＦＬＴ−３阻害剤を投与することを含む方法に関する。組合せは、同時に若しくは同じ組成物中で投与することができ、又はＣＰＸ−３５１が最初に投与される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1A】ＣＰＸ−３５１に対するＡＭＬ患者細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおける感受性を示すチャートである。ＩＣ５０値は、チャート上に注釈をつけたより詳細なＡＭＬリスク亜型と相関している。これらのリスク群のそれぞれに含まれる患者のＣＰＸ−３５１のＩＣ５０値を示す。
【図1B】ＩＣ５０に関して、リスク分類とｅｘ ｖｉｖｏ応答との相関を示す。図に見られるように、中間−Ｉ、中間−ＩＩ、及び有害群の対象のほとんどが有利なＩＣ５０値を示した一方で、好適リスク群の対象では大部分が示さなかった。各場合において一部の外れ値が存在しており、個々の応答性が重要であることを指摘している。
【図1C】標準療法７＋３レジメンに対する臨床反応と、ＩＣ５０ ｅｘ ｖｉｖｏとして決定された応答性との間の相関を示す。７＋３標準療法に対する応答において低い範囲のＩＣ５０ ｅｘ ｖｉｖｏを示した群間では、大差が見られなかった。
【図2A】ＣＰＸ−３５１に対するＡＬＬ患者細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおける感受性を示す。１２７人のＡＬＬ患者から得られた末梢血又は骨髄検体からの白血病細胞を分析した。ＩＣ５０値を、具体的な診断の注釈と共に示す。
【図2B】ＣＰＸ−３５１に対するＭＤＳ／ＭＰＮ患者細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおける感受性を示す。１２７人のＭＤＳ／ＭＰＮ患者から得られた末梢血又は骨髄検体からの白血病細胞を分析した。これらの場合のＩＣ５０値を、具体的な診断の注釈と共に示す
【図2C】ＣＰＸ−３５１に対するＣＬＬ患者細胞のｅｘ ｖｉｖｏにおける感受性を示す。１２７人のＣＬＬ患者からえら得た末梢血又は骨髄検体からの白血病細胞を分析した。これらの場合のＩＣ５０値を、具体的な診断の注釈と共に示す。
【図3】図３Ａは、ＦＬＴ３−ＩＴＤを有するＡＭＬ細胞のＣＰＸ−３５１誘導性の細胞毒性に対する感受性が増加していることを示すグラフである。ＦＬＴ３−ＩＴＤは１４人の患者で陽性であり、２８人で陰性であった。図３Ｂ及び３Ｃは、それぞれ、変異ＮＰＭ−１及び変異ＣＥＢＰαを有する対象の結果を示す。ＮＰＭ−１における挿入が１３人の患者で同定され、２９人では観察されなかった。ＣＥＢＰαにおける挿入／欠失が４人の患者で観察され、３４人では検出されなかった。値は平均±標準誤差を表し、ｐ値をそれぞれのチャート上に示す。
【図4A】ＣＰＸ−３５１の薬物取り込みをフローサイトメトリー分析したものを示し、薬物取り込みと細胞毒性との間の相関を実証する結果が得られた。
【図4B】同上
【図4C】同上
【図5】正常な骨髄細胞と比較した、骨髄中の白血病細胞によるインタクトなＣＰＸ−３５１の取り込みを示す。図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ、ＣＰＸ−３５１からのシタラビン及びダウノルビシンの取り込みを示し、図５Ｃは脂質の取り込みを示す。
【図6】標準の７＋３療法と比較した場合の、臨床試験においてＣＰＸ−３５１で治療された、ＦＬＴ−３、ＮＰＭ−１、及びＣＥＢＰαに変異のある患者の応答率を示す。
【図7A】ＦＬＴ−３の変異を有する、標準の７＋３で治療した患者と比較した、ＣＰＸ−３５１で治療した患者の生存率の比較を示す。
【図7B】ＮＰＭ−１の変異を有する、標準の７＋３で治療した患者と比較した、ＣＰＸ−３５１で治療した患者の生存率の比較を示す。
【図7C】ＣＥＢＰαの変異を有する、標準の７＋３で治療した患者と比較した、ＣＰＸ−３５１で治療した患者の生存率の比較を示す。
【図8A】ＦＬＴ−３変異有り及び無しを含む様々な細胞株について、ＩＣ５０値の比較を示す。
【図8B】ＦＬＴ−３変異有り及び無しを含む様々な細胞株について、ＣＰＸ−３５１の取り込みの測定値を正規化したものの比較を示す。
【図9A】ＦＬＴ−３の変異を有する２種類の異なる細胞株について、キザルチニブによる前処置がある場合及びない場合のＣＰＸ−３５１の取り込みの比較を示す。
【図9B】同上
【図9C】同上
【図9D】同上
【図10A】図１０Ａ〜Ｃは、ＣＰＸ−３５１と、キザルチニブ又はミドスタウリンのどちらかとの、相乗的な相互作用を決定した結果を示す。図１０Ａは、示された薬物の様々な濃度に基づいて作成される図表の性質を示す。
【図10B】超過ブリス相加性（Ｅｘｃｅｓｓ Ｏｖｅｒ Ｂｌｉｓｓ Ａｄｄｉｔｉｖｉｔｙ、ＥＯＢＡ）アルゴリズム（Ｂｅｒｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｃ．、Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８１）３５：２６９〜３３５）に従った相乗効果を描写する図である。
【図10C】個々の細胞株の生存率の結果、及び組合せの様々な投与プロトコルを、ＥＯＢＡ分析の結果と共に示す。
【図11A】図１１Ａ〜Ｃは、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙアルゴリズム（Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．（１９８４）２２：２７〜５５）を使用して相乗効果を決定した結果を示す。図１１Ａは、分析に供した薬物の様々な濃度の組合せについて、マルチウェルプレート中の位置を示す。
【図11B】各組合せの結果をプロットするため用いられるダイアグラムの一例を示す。
【図11C】試験した組合せの結果を示す。
【図11D】試験した組合せの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0029】
血液由来の癌は異種性である、すなわち、ＡＭＬ又は他の血液癌の全ての患者が同じ予後又は基本的な遺伝子型を有するものではないため、対象となる特定の個体に有益な治療を決定するために個々のヒトサンプルを試験することが重要である。
【0030】
上述のように、リポソーム及びナノ粒子薬物製剤による過去の経験とは対照的に、ＣＰＸ−３５１は、封入されたシタラビン及びダウノルビシンの投与された比と共に、（正常な骨髄細胞より優先して）白血病細胞に取り込まれることができる。（Ｌｉｍ，Ｗ．Ｓ．ら、Ｌｅｕｋ．Ｒｅｓ．（２０１０）３４：１２１４〜１２２３。）これにより、ＣＰＸ−３５１による治療に対する個々の血液癌の感受性をｅｘ ｖｉｖｏで試験することが可能となる。アッセイは、細胞が顕著な量のＣＰＸ−３５１を取り込む能力、及び／又は患者サンプルに対するＣＰＸ−３５１の細胞毒性の一方又は両方を含み得る。このことは、一般に治療に対する個々の患者の応答の異種性、及びＣＰＸ−３５１による治療が特定の個体に有効かどうかを予め把握できる利点があることから重要である。ナノ粒子製剤は、血流中に蓄積され、薬剤そのもののみが癌細胞に入るように内包された治療剤を放出するように設計されているため、一般に、そのようなｅｘ ｖｉｖｏ試験は、ナノ粒子製剤中で送達される薬物とは対照的に、遊離薬物に限定されている。
【0031】
したがって、本発明の一態様は、個々の患者がＣＰＸ−３５１に対してうまく応答するかどうかを決定するためのｅｘ ｖｉｖｏアッセイを提供する。よって、血液癌患者から癌細胞を採取し、該細胞をＣＰＸ−３５１と接触させ、例えばこれらの細胞に対するＩＣ５０若しくはＩＣ９０を決定することによりかつ／又は任意の適切な方法でリポソーム系の取り込みを測定することにより、細胞毒性を決定するｅｘ ｖｉｖｏ試験に供される。以下に示すように、ＣＰＸ−３５１がインタクトな状態で白血病細胞に送達されることが、このｅｘ ｖｉｖｏ試験に信頼性をもたらす。新鮮なＡＭＬ芽球、ならびに急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、リンパ腫、及び骨髄増殖性新生物患者からの芽球に対するＣＰＸ−３５１のｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性は、遺伝子型及び表現型のプロファイルならびに芽球サンプルを得た患者の臨床成績と相関する。
【0032】
また、特定の遺伝子、特にはＦＬＴ−３、ＮＰＭ−１、及びＣＥＢＰαにおける変異は、対象がこれらの変異を示す場合、特に標準の７＋３療法と比較して、ＣＰＸ−３５１に対する血液癌の感受性を増強させることが判明した。したがって、標準の７＋３レジメンに対してＣＰＸ−３５１を用いたｉｎ ｖｉｖｏ治療が成功する癌マーカーとしてこれらの変異を使用することができる。これらの変異の存在は、遺伝子検査を行うことにより直接、又は下流の発現産物として変異を示すマーカーを評価することによって、測定することができる。例えば、ＦＬＴ−３を活性化させる変異は、対象又は癌細胞におけるＦＬＴ−３活性の増強によって同定することができる。このような判定の適切な材料には、血液、血漿、血清、及び唾液が含まれる。
【0033】
例えば、一部の実施形態では、適切なアッセイは、白血病であるか又は白血病のリスクを有すると診断されたヒト対象からの被験サンプルを、ＦＬＴ−３遺伝子変異（例えばＦＬＴ３−ＩＴＤ）の遺伝子型を決定するように設定された少なくとも１つの遺伝子型決定アッセイに供すること、及び任意で、有効量のＣＰＸ−３５１を含む治療レジメンでヒト対象に投与することを含むことができる。
【0034】
同様の結果が、ＮＰＭ−１遺伝子変異、ＣＥＢＰα遺伝子変異、ならびにその癌がＥＬＮシステムの中間−ＩＩ及び有害リスク分類に該当する個体について示される。
【0035】
上述のように、あらゆる適切な方法で測定した変異の組合せを使用して、アッセイを改善することができる。特に、これらの遺伝子変異状態と特定の核型との組み合わせを使用して、標準の７＋３療法に対する応答性に応じて患者を群分けできることが知られている。この分類はＲｏｌｌｉｇ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１１）２９：１〜７に記載されており、オンラインでは２０１１年５月３１日に１０．１２００／ＪＣＯ．２１０．３２．８５００として公開されている。このランク付けシステムは欧州白血病ネット（ＥＬＮ）システムと命名され、ＡＭＬ患者は好適リスク、中間−Ｉ、中間−ＩＩ、及び有害リスクに分類される。中間−ＩＩ又は有害リスクとして分類された者は、定義によれば７＋３標準レジメンに良好に応答しない。対照的に、本出願人らは、臨床試験においてこれらの患者がＣＰＸ−３５１に応答性であることを見出した。したがって、特定の患者の癌細胞が中間−ＩＩ又は有害リスクを示すと同定されることは、その患者がＣＰＸ−３５１で治療することが望ましいことを明示する。出願人らによって示された結果は、標準療法での経験からは予想外のことである。
【0036】
前述の事例の全てにおいて、適切な対象の同定の後、これらの治験で承認されたプロトコルに従ってＣＰＸ−３５１を適宜投与する。その結果、血液癌に関連する少なくとも１つの症状を軽減させるために有効な量のＣＰＸ−３５１が投与される。上述のように、血液癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ＡＬＬ、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫などを含む、多数の癌のうちの１つであり得る。
【0037】
有効量のＣＰＸ−３５１は、選択されたヒト対象に、適切な投与経路、例えば静脈内投与を介して、ＣＰＸ−３５１投薬レジメンによって投与することができる。ＣＰＸ−３５１を用いた治療プロトコルは、本明細書中に参考として組み込まれている米国特許第８，０９２，８２８号に記載されている。
【0038】
本発明のさらに別の態様は、ＦＬＴ−３阻害剤と組み合わせたＣＰＸ−３５１の組合せを、ＩＴＤなどのＦＬＴ−３の変異を有する個体の血液癌を治療するための増強されたシステム設計である。ＦＬＴ−３阻害剤は当分野で利用可能であり、キザルチニブ、ミドスタウリン、タンヅチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レスタウルチニブ、クレノラニブ、ギルテリチニブ、ＡＳＴ−４８７、ドビチニブ、及びリニファニブが含まれる。予想外なことに、投与のタイミングが重要であることが判明した。２つの薬物は、同時に、ある場合には同じ組成物中で投与されなければならず、あるいは、ＣＰＸ−３５１を該阻害剤の前に投与しなければならず、これは、ＣＰＸ−３５１投与の１０〜２４時間前若しくはその間に含まれる時間前の投与を含む。ＣＰＸ−３５１投与前にＦＬＴ−３阻害剤に長期間曝露されることは効果的ではないことが示されている。
【0039】
また、本明細書中に記載のアッセイ及び／又は方法の任意の態様に使用するためのコンピュータシステムも提供される。例えば、本明細書が提供する一実施形態は、少なくとも１人の対象から入手した少なくとも１つの被験サンプルからデータを得るためのコンピュータシステムである。
【0040】
ある実施形態では、コンピュータシステムの決定モジュールは、少なくとも１つの被験サンプルを分析して、上述の状態のうちの少なくとも２つの存在又は非存在を決定するように構成することができる。
【0041】
ある実施形態では、決定モジュールは、決定モジュールからのデータ出力を、記憶装置に格納されている参照データと比較するように適応された比較モジュールをさらに含むことができる。
【0042】
ある実施形態では、記憶装置は、少なくとも１人の対象の身体的情報を格納するようにさらに構成することができ、このような情報は、例えば、測定方法に関わらず、ＦＬＴ−３遺伝子及び／又はＮＰＭ−１遺伝子及び／又はＣＥＢＰα遺伝子及び／又はＥＬＮ核型の１つ以上の変異を被検体が有するかどうかの指標を含む。
【0043】
本明細書中に記載のアッセイ、方法、システム、及び／又はキットは、これらの機能を命令及び管理する１人の責任者の指示の下、複数の組織（ｅｎｔｉｔｙ）によって行われかつ／又は使用されることができる。そのような組織は、ヒト対象の被験サンプルにおける本明細書中に記載の少なくとも１つの状態の存在又は非存在を決定するために提供するサービスに料金を課してもよく、例えば、この決定はヒト対象の治療レジメンを選択する方法の一部としてヒト血液癌患者の治療レジメンの選択を容易にするためであってもよい。一例では、適切なアッセイは、（ａ）ＡＭＬである、又はそのリスクを有すると診断されたヒト対象から被験サンプルを入手すること；（ｂ）該被験サンプルを、少なくとも１つのバイオマーカー分析（例えば、これに限定されるものではないが、遺伝子型決定アッセイ、発現アッセイ（例えば、タンパク質及び／又は転写物レベル）、活性化ＦＬＴ−３を同定することができる他のアッセイ、又はそれらの任意の組合せを含む）に供して、本明細書中に記載の少なくとも１つのバイオマーカー（例えば、これに限定されるものではないが、ＦＬＴ３−ＩＴＤ）のパラメータを決定すること；（ｃ）選択されたバイオマーカーのパラメータから、少なくとも１つの要求された状態の存在を決定すること；及び、（ｄ）要求された状態のうちの少なくとも１つが被験サンプルにおいて検出されたかどうかを示す出力結果（例えば、これに限定されるものではないが、ＦＬＴ３遺伝子変異のリスト）を提供することを含む。少なくとも１つの状態が存在すれば、責任者はさらに有効量のＣＰＸ−３５１を含む治療レジメンを選択して該ヒト対象に投与することができる。
【0044】
ある実施形態では、上記方法のステップのうちの１つ以上は、ヒトではなく機械によって行われる。
【0045】
本明細書における文献又は文書の引用は、それらの全てが関連する先行技術であると認めることを意図せず、かつ、これらの文献又は文書の内容又は日付のいかなる承認をも構成しない。本明細書中で引用する全ての文書は、参照により本明細書中に組み込まれる。本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］ＦＬＴ−３中に活性化変異を示す血液由来癌を有する対象におけるＣＰＸ−３５１による治療の有効性を増強させる方法において使用するためのＦＬＴ阻害剤及びＣＰＸ−３５１の組合せであって、前記方法は、ＣＰＸ−３５１と組み合わせて有効量のＦＬＴ−３阻害剤を投与することを含み、ここで、ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤は、同時に投与されるか、又はＣＰＸ−３５１は、ＦＬＴ−３阻害剤による治療の前に投与される、組合せ。
［実施形態２］ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤が同じ組成物中で投与される、実施形態１に記載の組合せ。
［実施形態３］血液由来癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫からなる群から選択される、実施形態１に記載の組合せ。
［実施形態４］ＦＬＴ−３阻害剤が、キザルチニブ、ミドスタウリン、タンヅチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レスタウルチニブ、クレノラニブ、ギルテリチニブ、ＡＳＴ−４８７、ドビチニブ、又はリニファニブである、実施形態１〜３のいずれかに記載の組合せ。
［実施形態５］ＦＬＴ−３中に活性化変異を示す血液由来癌を有する対象におけるＣＰＸ−３５１による治療の有効性を増強させる方法であって、ＣＰＸ−３５１と組み合わせて有効量のＦＬＴ−３阻害剤を投与することを含み、ここで、ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤が、同時に投与されるか、又はＣＰＸ−３５１が、ＦＬＴ−３阻害剤による治療の前に投与される、方法。
［実施形態６］ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤が同じ組成物中で投与される、実施形態５に記載の方法。
［実施形態７］血液由来癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫からなる群から選択される、実施形態５に記載の方法。
［実施形態８］ＦＬＴ−３阻害剤が、キザルチニブ、ミドスタウリン、タンヅチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、レスタウルチニブ、クレノラニブ、ギルテリチニブ、ＡＳＴ−４８７、ドビチニブ、又はリニファニブである、実施形態５〜７のいずれかに記載の方法。
［実施形態９］血液由来癌を有するヒト対象の、ＣＰＸ−３５１による治療に対する感受性を決定する方法であって、前記対象の生体サンプルをアッセイして以下を決定することを含む方法：
ａ）前記対象におけるＦｍｓ様チロシン受容体キナーゼ３（ＦＬＴ−３）遺伝子における変異の存在又は非存在；及び／又は
ｂ）前記対象におけるヌクレオフォスミン１（ＮＰＭ−１）遺伝子における変異の存在又は非存在；及び／又は
ｃ）前記対象におけるＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）遺伝子における変異の存在又は非存在；及び／又は
ｄ）好適リスク、中間−Ｉ、中間−ＩＩ又は有害リスクとしての前記対象の遺伝子型。
［実施形態１０］血液由来癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫からなる群から選択される、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１１］前記生体サンプルが血液、血清、血漿、唾液、又は芽球を含む、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１２］前記対象におけるＦｍｓ様チロシン受容体キナーゼ３（ＦＬＴ−３）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定することを含む、実施形態９〜１１のいずれかに記載の方法。
［実施形態１３］前記変異がＦＬＴ−３活性化変異である、実施形態１２に記載の方法。
［実施形態１４］前記変異がＦＬＴ−３−ＩＴＤ又はＦＬＴ−３−ＴＫＤである、実施形態１２に記載の方法。
［実施形態１５］前記対象においてヌクレオフォスミン１（ＮＰＭ−１）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定することを含む、実施形態９〜１１のいずれかに記載の方法。
［実施形態１６］前記対象においてＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定することを含む、実施形態９〜１１のいずれかに記載の方法。
［実施形態１７］前記対象の遺伝子型を好適リスク、中間−Ｉ、中間−ＩＩ又は有害リスクとして決定することを含む、実施形態９〜１１のいずれかに記載の方法。
［実施形態１８］血液由来癌を有するヒト対象の、ＣＰＸ−３５１による治療に対する応答性を決定する方法であって、
（ａ）前記対象由来の血液由来癌細胞を、細胞培養物中のＣＰＸ−３５１にｅｘ ｖｉｖｏで曝露すること、及び
（ｂ）前記細胞の前記曝露に対する応答性を測定すること
を含む、方法。
［実施形態１９］前記細胞の応答性が、前記細胞培養物中の細胞のＣＰＸ−３５１のＩＣ５０又はＩＣ９０を測定することによって決定される、実施形態１８に記載の方法。
［実施形態２０］前記細胞の応答性が、前記細胞培養物中の細胞によるＣＰＸ−３５１の取り込みを測定することによって決定される、実施形態１８に記載の方法。
［実施形態２１］前記血液由来癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫からなる群から選択される、実施形態１８〜２０のいずれかに記載の方法。
［実施形態２２］ヒト対象において血液由来癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象におけるＦｍｓ様チロシン受容体キナーゼ３（ＦＬＴ−３）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定すること、及び
（ｂ）前記ＦＬＴ−３遺伝子に変異を示す対象に有効量のＣＰＸ−３５１を投与すること、ならびに／又は
（ｃ）前記対象におけるヌクレオフォスミン１（ＮＰＭ−１）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定すること、及び
（ｄ）前記ＮＰＭ−１遺伝子に変異を示す対象に有効量のＣＰＸ−３５１を投与すること、ならびに／又は
（ｅ）前記対象におけるＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定すること、及び
（ｆ）前記ＣＥＢＰα遺伝子に変異を示す対象に有効量のＣＰＸ−３５１を投与すること、ならびに／又は
（ｇ）前記対象の遺伝子型を好適リスク、中間−Ｉ、中間−ＩＩ、若しくは有害リスクとして決定すること、及び
（ｈ）その遺伝子型が有害リスク若しくは中間−ＩＩである対象に治療上有効な量のＣＰＸ−３５１を投与すること
を含む、方法。
［実施形態２３］（ａ）前記対象においてＦｍｓ様チロシン受容体キナーゼ３（ＦＬＴ−３）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定すること、及び
（ｂ）前記ＦＬＴ−３遺伝子に変異を示す対象に有効量のＣＰＸ−３５１を投与することを含む、実施形態２２に記載の方法。
［実施形態２４］変異がＦＬＴ−３活性化変異である、実施形態２３に記載の方法。
［実施形態２５］変異がＦＬＴ−３−ＩＴＤ又はＦＬＴ−３−ＴＫＤである、実施形態２４に記載の方法。
［実施形態２６］（ａ）前記対象においてヌクレオフォスミン１（ＮＰＭ−１）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定すること、及び
（ｂ）前記ＮＰＭ−１遺伝子に変異を示す対象に有効量のＣＰＸ−３５１を投与することを含む、実施形態２２に記載の方法。
［実施形態２７］（ａ）前記対象においてＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）遺伝子における変異の存在又は非存在を決定すること、及び
（ｂ）前記ＣＥＢＰα遺伝子に変異を示す対象に有効量のＣＰＸ−３５１を投与することを含む、実施形態２２に記載の方法。
［実施形態２８］（ａ）前記対象の遺伝子型を好適リスク、中間−Ｉ、中間−ＩＩ、又は有害リスクとして決定すること、及び
（ｂ）その遺伝子型が有害リスク又は中間−ＩＩである対象に治療上有効な量のＣＰＸ−３５１を投与することを含む、実施形態２２に記載の方法。
［実施形態２９］ヒト対象における血液由来癌を治療する方法であって、
（ａ）前記対象由来の血液由来癌細胞を、細胞培養物中のＣＰＸ−３５１にｅｘ ｖｉｖｏで曝露すること；及び
（ｂ）前記細胞の前記曝露に対する応答性を測定すること；及び
その細胞が前記曝露に対して応答を示す対象に治療上有効な量のＣＰＸ−３５１を投与すること
を含む、方法。
［実施形態３０］前記細胞の応答性が、前記細胞培養物中の細胞のＣＰＸ−３５１のＩＣ５０又はＩＣ９０を測定することによって決定される、実施形態２９に記載の方法。
［実施形態３１］前記細胞の応答性が、前記細胞培養物中の細胞によるＣＰＸ−３５１の取り込みを測定することによって決定される、実施形態２９に記載の方法。
［実施形態３２］血液由来癌が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄増殖性新生物（ＭＰＮ）、及びリンパ腫からなる群から選択される、実施形態２９〜３１のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【0046】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり本発明を限定するものではない。
【0047】
製剤ＡＣＰＸ−３５１製剤及び単純な調製
ＣＰＸ−３５１（シタラビン：ダウノルビシンの注射用リポソーム）は、５０ｍＬのバイアル中に、無菌的で発熱物質を含まない紫色の凍結乾燥製品として供給されている。１単位を１．０ｍｇのシタラビン＋０．４４ｍｇのダウノルビシン（ベースとして）とすると、各バイアルは１００単位を含有する。これらの物質は１９ｍＬの注射用水で再構成し、室温で１０分間穏やかに回旋させた。再構成した生成物の作業用アリコートは、−２０℃で１２カ月を超えない期間、凍結保存した。
【0048】
患者の検体採取及び調製法；末梢血（ＰＢ）又は骨髄（ＢＭ）検体を、ＡＭＬ、ＡＬＬ、ＭＰＮ、又はＣＬＬと診断された患者から治療前に入手した。全ての検体は、オレゴンヘルスアンドサイエンス大学の学内審査委員会によって承認されたプロトコルに基づき、インフォームドコンセントを得て入手した。血液又は骨髄検体を、フィコール勾配、次いで塩化アンモニウムカリウム（ＡＣＫ）緩衝液を用いた赤血球溶解により分離した。
【0049】
（実施例１）患者の白血病細胞に対するＣＰＸ−３５１のｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性の決定薬物感受性試験を、標準の既知の方法によって実施した。簡潔には、患者骨髄検体からの単核細胞を、１０−４Ｍの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲ１０（１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ジョージア州Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中で培養した。リンパ系白血病サンプルからの細胞を、１０−４Ｍの２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）及びインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲ２０（２０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ジョージア州Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、及びＦｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地）中で培養した。
【0050】
細胞を９６ウェルプレート（５０，０００細胞／ウェル）中で培養し、段階的な濃度のＣＰＸ−３５１に３日間曝露し、この時点でテトラゾリウムベースのＭＴＳアッセイ（９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、各ウェル中の生細胞の相対数を評価した。薬物全く存在しないウェルに播種した細胞の細胞生存率の値を生存率１００％として、ＣＰＸ−３５１用量応答曲線の各点を、この薬物なしの条件の細胞生存率の値に対して正規化した。三次多項式曲線適合を使用して、各検体のＩＣ５０値を得た。
【0051】
ＡＭＬは現在ＣＰＸ−３５１が標的とする適応症であることから、異なる臨床的特徴を示すＡＭＬ患者のコホートに関する複数の臨床研究において有効性を示す有望な証拠が得られている。５３人のＡＭＬ患者から得た末梢血又は骨髄検体からのＡＭＬ芽球を段階的な濃度のＣＰＸ−３５１（１０：２μＭ；１：０．２μＭ；０．１：０．０２μＭ；０．０１：０．００２μＭ）と共に、又は薬物なしで３日間培養し、生細胞の相対数をテトラゾリウムベースのＭＴＳアッセイで評価した。薬物の非存在下で培養した細胞のＭＴＳ値を１００％として、各用量点のＭＴＳ値を、未処置の細胞のＭＴＳ値に対して正規化した。三次多項式曲線適合を使用して、各検体のＩＣ５０値を計算した。完全な患者統計データ及び臨床データはこれらのうち４２名について利用可能であり、表１に要約した。ＡＭＬリスク群を評価するための完全な細胞遺伝学的データは４０人の患者について利用可能であり、欧州白血病ネット（ＥＬＮ）指針を用いた分類により、３、２１、１２、及び４人の患者が、それぞれ好適、中間−Ｉ、中間−ＩＩ、及び有害の群に該当していた。
【0052】
好適リスクには、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）、ｉｎｖ（１６）（ｐ１３．１ｑ２２）又はｔ（１６；１６）（ｐ１３．１ｑ２２）の正常な核型と変異ＮＰＭ１、及び正常な核型と変異ＣＥＢＰαが含まれる。
【0053】
中間−Ｉリスクには、ＦＬＴ３−ＩＴＤと変異ＮＰＭ１及び正常な核型、ＦＬＴ３−ＩＴＤと野生型ＮＰＭ１及び正常な核型、ＦＬＴ３−ＩＴＤが無い野生型ＮＰＭ１及び正常な核型が含まれる。
【0054】
中間−ＩＩリスクには、ｔ（９；１１）（ｐ２２；ｑ２３）、及び好適又は有害と分類されないあらゆる細胞遺伝学的型が含まれる。
【0055】
有害リスクには、ｉｎｖ（３）（ｑ２１ｑ２６．２）又はｔ（３；３）（ｑ２１ｑ２６．２）、ｔ（６；９）（ｐ２３；ｑ３４）、ｔ（ｖ；１１）（ｖ；ｑ２３）、モノソミー５又はｄｅｌ（５ｑ）、モノソミー７、異常な１７ｐ、及び複合核型（３つ以上の異常）が含まれる。
【0056】
検体の大多数はｄｅ ｎｏｖｏでＡＭＬと新しく診断された患者から入手し（３４／４２人、８１％）、患者の大多数はサンプル採取後に７＋３療法レジメンを受けた（３２／４２人、７６％）。研究対象のＡＭＬ患者のうちの３５人を、検体採取後に７＋３レジメンで治療された。これらの患者のうちの２４人が初期の完全応答を達成した一方で、１１人の患者が進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）を示した。完全応答又は進行を示す患者のＣＰＸ−３５１のＩＣ５０値を表す。診察時の基本的な患者統計学的特徴及びＷＢＣ数などの臨床的パラメータの割合、並びに、遺伝学的−細胞遺伝学的なリスク層は、ＡＭＬ患者の一般的な集団の代表的なものであった。
【0057】
図１Ａ及び表２のデータが示すとおり、原発性ＡＭＬ白血病芽球は一般にｅｘ ｖｉｖｏでＣＰＸ−３５１細胞毒性に対して感受性があった。ＩＣ５０値は０．０３５：０．００７μＭ〜９．７７：１．９５μＭの範囲であった。１つ以外の全てのサンプル（９８％）が投与の７２時間後のヒト血漿ＣＰＸ−３５１濃度の１／１０よりも低いＩＣ５０を示し（６０：１２μＭのシタラビン：ダウノルビシン）、これらの患者において、ＣＰＸ−３５１治療により臨床応答を潜在的に達成できることを示唆している。
【0058】
図１Ｂに示すように、ｅｘ ｖｉｖｏでのＣＰＸ−３５１処理（低ＩＣ５０）に対する強力な抗増殖応答が、典型的には悪い予後と慣用の化学療法への耐性と関連する中間−ＩＩ又は有害な細胞遺伝子学的異常を有する細胞で観察された。
【0059】
表２中で強調するように、中間−ＩＩ又は有害の細胞遺伝学的リスク分類の患者から合計１７個のサンプルを入手した。図１Ｂに示すように、この患者亜群の全体的なｅｘ ｖｉｖｏでのＣＰＸ−３５１への応答は、中間−ＩＩ及び好適リスクの患者のそれと同様であり、４つのリスク群間でＣＰＸ−３５１に対するｅｘ ｖｉｖｏでの応答性に有意差はなかった。このｅｘ ｖｉｖｏでの応答性は、慣用のリスク層別化とは無関係に多様な亜分類にわたるＡＭＬ患者において完全応答の誘発が幅広く観察されたＣＰＸ−３５１の臨床活性と良く相関している。
【0060】
慣用の７＋３シタラビン：ダウノルビシン治療に対する臨床反応を、その芽球を採取した後に７＋３療法レジメンを受けた３５人のＡＭＬ患者におけるＣＰＸ−３５１に対するｅｘ ｖｉｖｏ応答と比較し、評価した。図１Ｃに示すように、これら３５人の患者のうち、２４人が完全応答（ＣＲ）を達成し、１１が進行（ＰＤ）を示した。これらの患者由来の白血病芽球は、最初に７＋３に応答したかどうかにかかわらず、ｅｘ ｖｉｖｏでＣＰＸ−３５１細胞毒性に対して同様の感受性を示した。
【0061】
【表1】
【0062】
【表2】
【0063】
ＣＰＸ−３５１のｅｘ ｖｉｖｏにおける感受性はまた、血液悪性腫瘍の様々な亜型にわたって特徴づけられた。ＡＬＬ（３８人）、ＭＰＮ／ＭＤＳ（１８人）、及びリンパ腫（７１人）を含む１２７人の追加の患者検体を用いた。ＩＣ５０により推定されるＣＰＸ−３５１の細胞毒性効力を、各個人の患者サンプルについてｅｘ ｖｉｖｏで決定し、図２Ａ〜２Ｃに示した。各診断的分類の中で広範囲のＩＣ５０値が観察された（０．０３／０．００６μＭ〜１０／２μＭ）。試験した１８０個全ての患者サンプル（５３人のＡＭＬが含まれる）のＩＣ５０の中央値は０．５５８：０．１１２μＭであり、大多数（１５３／１８０個、８５％）が２．０：０．４μＭ未満のＩＣ５０値を示し、これは、白血病患者で観察された７２時間血漿薬物濃度として報告された６０：１２μＭ（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＡＣＲ（２０１６年４月）５７：アブストラクト＃２８７）よりも３０倍低い。観察された、循環薬物濃度に対して低いＣＰＸ−３５１のＩＣ５０の中央値は、広範囲の診断からの白血病細胞の増殖又は生存を潜在的に阻害する、ＣＰＸ−３５１の一般に高い効力を示している。
【0064】
（実施例２）遺伝子変異の効果より高いＣＰＸ−３５１の効力が、ＦＬＴ３−ＩＴＤ表現型を有するＡＭＬ患者の芽球で観察される。ＦＭＳ様チロシン受容体キナーゼ（ＦＬＴ３）は正常な造血及び白血病誘発において重要な役割を果たし、ほとんどのＡＭＬ芽球中で発現している。ＡＭＬ患者の２０％〜２５％で、ＦＬＴ３遺伝子はＦＬＴ３の膜近傍ドメイン内に内部タンデム複製（ＦＬＴ３−ＩＴＤ）を獲得し、患者の予後不良に関連している。ＦＬＴ３−ＩＴＤの状態が既に判明している、実施例１の研究の４２人のＡＭＬ患者のうち、１４人の患者がＦＬＴ３−ＩＴＤ変異を保有すると特定され、残りの２８人はＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性であった。ｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性の結果は、ＦＬＴ３−ＩＴＤの陽性が、驚くべきことに、ＣＰＸ−３５１誘導性の細胞毒性へのより高い感受性に関連していることを示している（図３Ａ参照）。具体的には、ＦＬＴ３−ＩＴＤを示す白血病芽球は、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陰性患者の芽球サンプル（ＩＣ５０＝１．３２：０．２６μｍｏｌ）と比較して十分に低いＩＣ５０値（０．２９：０．０５８μｍｏｌ）を示した。ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性と陰性のサンプル間の、ＣＰＸ−３５１細胞毒性に対する応答の相違は統計的に有意であった（ｐ＝０．０４７）。また、ＦＬＴ３−ＩＴＤ陽性患者は、白血球数（ＷＢＣ）の平均値が９１，０００／ｍｍ３であり、診断時の平均の２９，０００／ｍｍ３に対して有意に（ｐ＝０．０００２）多いことも注目された。
【0065】
ヌクレオフォスミン（ＮＰＭ１）及びＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（ＣＥＢＰα）を含む他のよく知られた変異は、それぞれ、１３人及び４人の患者で見つかった。しかし、ＣＥＢＰα陽性例で感受性がより高い傾向があったものの、これら２つのよく知られた変異はいずれも、ｅｘ ｖｉｖｏのＣＰＸ−３５１処理への応答に顕著な影響を示さなかった。（図３Ｂ及び３Ｃ。）
【0066】
（実施例３）患者の白血病芽球におけるｅｘ ｖｉｖｏ感受性とＣＰＸ−３５１の取り込みとの相関前臨床の白血病動物モデルにより、ＣＰＸ−３５１を注射した際、これらの動物に移植した骨髄中の白血病細胞は、シタラビン及びダウノルビシンを大部分は相乗的な薬物比を維持するインタクトなリポソーム形態で素早く取り込むことができ、その結果、遊離薬物のカクテル投与と比較して白血病細胞中での薬物蓄積が増加し長期化することが実証された。以下のデータは、遊離薬物と比較して増強されたＣＰＸ−３５１の取り込みを示す。したがって、ｅｘ ｖｉｖｏでのＣＰＸ−３５１の取り込み及び細胞毒性は、臨床的なＣＰＸ−３５１の成功の予測に用いることができる。
【0067】
ｅｘ ｖｉｖｏでＣＰＸ−３５１への感受性についてスクリーニングした患者検体からの生存凍結細胞を、最大試験濃度のＣＰＸ−３５１（１０：２μＭのシタラビン：ダウノルビシン）で２４時間曝露した。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ダウノルビシン蛍光の取り込みについてＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーターを用いて分析した。
【0068】
ダウノルビシンの固有の蛍光を細胞内で生物利用可能な薬物の半定量的指標として利用して、フローサイトメトリー分析を上述の１２個の患者サンプルについて行った。サンプルは６人のＡＭＬ及び６人のＣＬＬのものであり、初期ｅｘ ｖｉｖｏスクリーニングで広範囲のＩＣ５０値を示した。細胞を段階的な濃度のＣＰＸ−３５１に２４時間曝露した後、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａフローサイトメーターでダウノルビシンの取り込みについて分析した。生細胞をＦＳＣ対ＳＳＣの散布図中で特定し、全蛍光強度を定量した（図４Ａ、左）。未処理の細胞に対するＣＰＸ−３５１に曝露した細胞の平均蛍光強度の比を使用して薬物取り込みの指数を生成した。ここで、指数１は取り込みなしを示し、１より高い数値はダウノルビシンの取り込みを示す。
【0069】
統計分析：片側ｐ値を用いた独立ｔ検定を用いて、変異型と野生型のＦＬＴ３（ＩＴＤ）、ＮＰＭ１、及びＣＥＢＰα群におけるＣＰＸ−３５１活性を比較した。＜０．０５のｐ値を有意であるとみなした。一方向ＡＮＯＶＡ分析を用いて、複数の遺伝学的−細胞遺伝学的リスク群間の効果を比較した。統計分析はＰｒｉｓｍソフトウェアバージョン５．０ａを使用して行った。
【0070】
未処理の細胞と比較して、ＣＰＸ−３５１で処理した細胞は細胞内蛍光強度の量が著しく増加していた。ＣＰＸ−３５１内にカプセル封入されたダウノルビシンの蛍光は完全に消光されることから、このことは遊離ダウノルビシンが存在することを示している。ダウノルビシンの取り込みにおける処理と未処理の細胞サンプルの相違は、細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）のシフトとして示されている（図４Ａ、右）。図４Ｂは取り込み及び細胞毒性の比較を示す。１２個のサンプルに対するＣＰＸ−３５１のＩＣ５０値を対応するＭＦＩ値に対してプロットすると、ＣＰＸ−３５１に対する細胞感受性（ＩＣ５０）とＣＰＸ−３５１の取り込み効率（ＭＦＩ）との間に強い相関があることが明らかとなり、その相関係数は０．７０３であった（図４Ｃ）。
【0071】
白血病骨髄細胞によるＣＰＸ−３５１のインタクトなままの選択的取り込みは以下のように示された。１用量（ｄｏｓｅ）のＣＰＸ−３５１で処理した、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（白血病）移植マウスの大腿骨髄細胞を、薬物投与の１８時間後に採取した。白血病細胞及び正常な骨髄細胞をヒトＣＤ４５特異的磁気ビーズで分離し、ＣＰＸ−３５１の取り込みについて分析した。シタラビン及びリポソーム脂質をそれぞれ３Ｈ及び１４Ｃで標識し、液体シンチレーションで定量した。ダウノルビシンはＨＰＬＣで分析した。結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。１回の試験あたり１０本の大腿骨（５匹のマウス）を用い、各バーは、３回の反復試験の平均±標準偏差を表す。
【0072】
図５Ｃに示すように、１０６細胞あたり約２２５ｐｍｏｌのリポソームの標識した脂質が白血病細胞に取り込まれたが、正常な骨髄には約１１０ｐｍｏｌ／１０６細胞しか取り込まれなかった。リポソーム内に含有されていた薬物のレベルも、白血病細胞によって良好に取り込まれ、白血病細胞ではシタラビンは２４ｐｍｏｌ／１０６細胞が、ダウノルビシンは約１６ｐｍｏｌ／１０６細胞が取り込まれ、いずれの薬物についても正常な骨髄ではより低いレベルであった（シタラビンは約３ｐｍｏｌ／１０６細胞、ダウノルビシンは約７ｐｍｏｌ／１０６細胞）。リポソームの脂質とそれに内包されていた薬物とのモル比は約１０：１であり、この結果は、これらの細胞によって取り込まれる際に薬物がリポソーム内に留まっていたことを示している。
【0073】
（実施例４）ＣＰＸ−３５１はＦＬＴ３−ＩＴＤ＋ＡＭＬ患者に優れた抗腫瘍効果を示す本実施例では、ＦＬＴ−３遺伝子に活性化変異を有するかどうかを決定するようにＡＭＬ患者をスクリーニングして、第３相臨床試験を行った。活性化変異ＡＭＬ−ＩＴＤ＋を持つことが判明したＡＭＬ患者には、３用量のＣＰＸ−３５１を、１日目に１回目の投与ステップ、３日目に２回目の投与ステップ、及び５日目に３回目の投与ステップからなる投与サイクルで投与した。ＣＰＸ−３５１を用いた治療プロトコルは米国特許第８，０９２，８２８号に記載されている。血漿及び／又は骨髄サンプルの分析を含む患者の応答性を測定及びモニタリングし、応答率及び生存率を測定した。ＮＰＭ１及び／又はＣＥＢＰαの変異が陽性であった患者の亜群も含まれていた。初期研究はＦＬＴ−３の変異に焦点をあて、ＮＰＭ−１及びＣＥＢＰαの変異を持つ個体も含まれていた。研究に参加した患者を表３に示す。
【0074】
【表3】
【0075】
ＦＬＴ−３の変異を有する又は有さない対象に関する応答性を表４に示す。
【0076】
【表4】
【0077】
図６では、これらの変異の保有者のＣＰＸ−３５１と７＋３療法の応答率を比較した。図６に示すように、ＦＬＴ−３にＩＴＤ又はＴＫＤ変異のどちらかを有する者は、ＣＰＸ−３５１に対して６８．２％の応答率を示したが、７＋３に対しては２５．０％の応答率しか示さなかった。ＮＰＭ−１変異を有する患者は、ＣＰＸ−３５１に対して９２．３％の応答率を示したが、７＋３に対しては５８．３％の応答率しか示さなかった。ＣＥＢＰαの変異を有する個体では、ＣＰＸ−３５１の応答率は３３．３％であり、７＋３の応答率は２０．０％であった。
【0078】
本研究におけるＦＬＴ−３変異陽性及びＦＬＴ−３の変異陰性の両方の参加者の生存率を表５に示す。
【0079】
【表5】
【0080】
様々なコホートの生存率を図７Ａ〜７Ｃに示す。全ての事例において、生存率は変異の保有者において大きく改善されており、特に、ＣＥＢＰαに変異を有する対象の２５％が、ＣＰＸ−３５１で治療した場合に２７カ月を超える生存を示した一方で、７＋３で治療した患者では、３カ月を超えて生存した者はいなかった。
【0081】
（実施例５）ＦＬＴ−３変異細胞のＣＰＸ−３５１に対する感受性、及びＣＰＸ−３５１＋ＦＬＴ−３阻害剤の併用治療に対する感受性本実施例では、細胞生存率、及びフローサイトメトリーによって決定されたダウノルビシン蛍光に基づく細胞内取り込みを、実施例１及び３に記載のとおり測定した。
【0082】
Ａ．ＡＭＬ細胞株（ＦＬＴ−３−ＩＴＤを有するＭＯＬＭ−１３及びＭＯＬＭ−１４、ならびにＭＥ−１（変異体を含み、ＦＬＴ−３が活性化されている）を含む）の、ＣＰＸ−３５１に対する感受性及びＣＰＸ−３５１の取り込みを決定した。また、ＦＬＴ−３変異を持たない、Ｕ−９３７、ＨＬ−６０、ＫＧ−１、及びＧＤＭ−１を含む細胞についても比較した。これらの細胞の培養物をＣＰＸ−３５１で処理し、ＩＣ５０及びＣＰＸ−３５１の取り込みについてアッセイした。図８Ａは、細胞生存率パーセントをＣＰＸ−３５１のｎＭ濃度に対してプロットすることによって、ＩＣ５０に関する結果を示す。図８Ａに見られるように、ＦＬＴ−３変異細胞は、ＦＬＴ−３非変異細胞よりも低いＩＣ５０を示す。図８Ｂは取り込みの結果を示す。ＣＰＸ−３５１のｎＭによる濃度を、本来有する蛍光を考慮するために正規化した平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対してプロットしている。ＦＬＴ−３変異を有する細胞は、有しない細胞よりもＣＰＸ−３５１の取り込みがより効率的である。
【0083】
Ｂ．ＦＬＴ−３阻害剤との併用効果を決定するために、キザルチニブ又はミドスタウリン（ＦＬＴ−３阻害剤）処理と共に又は当該処理なしで、細胞をＣＰＸ−３５に曝露した。一つのプロトコルでは、ＭＥ−１及びＭＯＬＭ−１４細胞を、１０ｎＭのキザルチニブによる前処理に０、２、８、１６、及び２４時間曝露し、その後、１００μＭのＣＰＸ−３５１を２時間添加した。ＣＰＸ−３５１の取り込みを、未処理の対照に対して正規化したフローサイトメトリーによって決定したダウノルビシン蛍光によって測定した。結果を図９Ａ〜９Ｄに示す。グラフ中のｘ軸はＣＰＸ−３５１の取り込みを蛍光の標準単位で示し、ｙ軸は正規化した細胞数を表す。図９Ａ及び９Ｂに示すとおり、全ての未処理細胞が取り込みを全く示さなかった一方で、ＣＰＸ−３５１で処理した細胞は最終的には２つの細胞集団に分かれ、その一方は他方よりもＣＰＸ−３５１の取り込みが効率的であった。図９Ａ及び９Ｂから、前処置時間を延長するにつれて一部の細胞のＣＰＸ−３５１取り込み能力が減少することが明らかである。図９Ｃ及び９Ｄに示す結果は、２４時間までの様々な時点の合成である。
【0084】
Ｃ．相乗作用を決定するために、細胞株を３８４ウェルプレートに播き、カスタマイズした、用量が段階的に増加する濃度のＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤に曝露した。ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤を、（ａ）同時に（Ｃ＋Ｑ又はＣ＋Ｍ）、（ｂ）２４時間のＣＰＸ−３５１の前処理（Ｃ→Ｑ若しくはＣ→Ｍ）、又は（ｃ）２４時間のＦＬＴ−３阻害剤の前処理（Ｑ→Ｃ若しくはＭ→Ｃ）のいずれかで加えた。各薬物の組合せの相乗作用を決定するために、ＥＯＢＡアルゴリズムを用いた。
【0085】
図１０Ａは、プロトコルの概要をＣＰＸ−３５１又はＦＬＴ−３阻害剤の対応する濃度をｎＭの数値と共に示す。図１０Ｂは、用いた２つの薬物の様々な濃度の生存率を測定し、ＥＯＢＡアルゴリズムを使用して得られる結果を拮抗的、相加的、又は相乗的として示す。図１０Ｃは、様々な濃度の組合せ及び上述の様々なプロトコルの結果として得られた生存率の結果、ならびにそれにより得られた、ＥＯＢＡアルゴリズムに基づいた相乗作用の決定を示す。上述のプロトコルについて、ＫＧ−１、ＭＥ−１、ＭＯＬＭ−１３、及びＭＯＬＭ−１４の結果を図１０Ｃに示す。示すように、ＣＰＸ−３５１とキザルチニブ又はミドスタウリンのどちらかとの特定の組合せは、ＣＰＸ−３５１の投与がＦＬＴ−３阻害剤の投与に先行する場合、又はこれらを同時に投与する場合に、高い相乗作用を示す。
【0086】
Ｄ．ＦＬＴ−３阻害剤及びプロトコルの様々な組合せを２つの細胞株で比較して、相乗作用を他の方法で決定した。段落Ｃの実験手順を行い、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙアルゴリズムを使用して結果を分析した。図１１Ａに示すように、ＣＰＸ−３５１とＦＬＴ−３阻害剤の様々な組合せを、陰影をつけたボックスによって表すウェル中で試験した。図１１Ｂは、上述の３つのプロトコル全てについて、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ分析の結果、すなわち組合せ指数（ＣＩ）を図１１Ａに示すそれぞれの濃度についてプロットする、アイソボログラムの一例を示す。図１１Ｃは、これらの３つのプロトコル及び図１１Ａに示す濃度レベルの、ＧＤＭ−１細胞及びＭＯＬＭ−１４細胞の結果を示す。各グラフ上の円は、図１１Ａに示す各四角の濃度の組合せを表す。図に見られるように、ＭＯＬＭ−１４細胞では、キザルチニブ又はミドスタウリンのどちらかと共に又はその前にＣＰＸ−３５１を投与することはにより、相乗作用を示す多数のウェルが得られた一方で、これらの薬物をＣＰＸ−３５１の前に投与すると、より拮抗的な結果を示した。ＧＤＭ−１細胞の結果には有意差はなかった。図１１Ｄは、図１１Ｃに示す各プロトコルについて、その組合せ指数（ＣＩ）値に基づいて様々な分類に該当させたデータ点の数を示す一連のグラフである。
【0087】
Ｅ．要約すると、ＦＬＴ−３−ＩＴＤ又はＦＬＴ−３−活性化変異を含有する細胞株は、他の遺伝子異常を有する細胞株と比較して、ＣＰＸ−３５１に対してより感受性が高く、増加したＣＰＸ−３５１の取り込みを示した。
【0088】
１６時間のキザルチニブを用いた前処理により、全細胞集団の約５０％がダウノルビシン蛍光の減少を示し、これは、ＦＬＴ−３阻害への長期の事前曝露がこの亜集団においてＣＰＸ−３５１の取り込みを減少させ得ることを示している。
【0089】
しかし、ＣＰＸ−３５１及びＦＬＴ−３阻害剤を同時に提供した場合、又はＦＬＴ−３阻害剤の曝露の２４時間前に細胞をＣＰＸ−３５１に曝露した場合に、強い相乗作用が観察された。