特許 6978045 未分化幹細胞を培養し心筋細胞を分化誘導するシステム及び心筋細胞の製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6978045

(24)【登録日】2021年11月15日

(45)【発行日】2021年12月8日

(54)【発明の名称】未分化幹細胞を培養し心筋細胞を分化誘導するシステム及び心筋細胞の製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20211125BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20211125BHJP

   C12M 1/36 20060101ALI20211125BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 B

   C12N5/077

   C12M1/36

【請求項の数】4

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2017-193600(P2017-193600)

(22)【出願日】2017年10月3日

(65)【公開番号】特開2019-62840(P2019-62840A)

(43)【公開日】2019年4月25日

【審査請求日】2020年8月19日

(73)【特許権者】

【識別番号】516182203

【氏名又は名称】Ｈｅａｒｔｓｅｅｄ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100106909

【弁理士】

【氏名又は名称】棚井 澄雄

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100181722

【弁理士】

【氏名又は名称】春田 洋孝

(72)【発明者】

【氏名】遠山 周吾

(72)【発明者】

【氏名】藤田 淳

(72)【発明者】

【氏名】福田 恵一

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／０６９８９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５４０４４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５２−１４５５９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−２６９９２１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−０１４６７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００５／０３３２９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 中国実用新案第２０５３６８３９３（ＣＮ，Ｕ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

Ｃ１２Ｎ ５／０７７

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞培養装置と、
ガス供給装置と、
前記細胞培養装置に供給されるガスの速度が、１層あたり２０ｍＬ／分以上６０ｍＬ／分以下で全層において一定となるように前記ガス供給装置を制御する制御部と、
を備え、
前記細胞培養装置は、
液面高さが２ｍｍ以上１０ｍｍ以下となるように設定された培養液を貯留可能な培養液貯留部と、
供給されたガスが通流するガス供給流路と、
前記ガス供給流路に設けられ、前記培養液貯留部に貯留された前記培養液に対して前記ガスを前記速度で全層において一定となるように吐出するガス吐出口と、
前記培養液に対して吐出された前記ガスを排出するためのガス排出口と、
前記ガス排出口を通じた前記ガスが通流するガス排出流路と、
を備えた培養容器を４層以上備え、
前記培養容器を４層以上積層することにより形成されたものである、未分化幹細胞を培養し心筋細胞を分化誘導するシステム。

【請求項2】

前記４層以上の培養容器は、一の前記培養容器の前記ガス供給流路と他の前記培養容器の前記ガス供給流路と、及び、一の前記培養容器の前記ガス排出流路と、他の前記培養容器の前記ガス排出流路とが、互いに連通可能に接続されることで積層されている請求項１に記載のシステム。

【請求項3】

前記培養液貯留部は、矩形状に形成され、
前記ガス供給流路及び前記ガス排出流路は、前記培養液貯留部における一辺の両端の角部にそれぞれ設けられている請求項１又は請求項２に記載のシステム。

【請求項4】

請求項１〜３のいずれか一項に記載のシステムを用いて、未分化幹細胞を培養し、心筋細胞に分化誘導する分化誘導工程を備える、心筋細胞の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養装置及びその使用に関する。具体的には、細胞培養装置、前記細胞培養装置を備える細胞培養システム、及び、前記細胞培養装置又は前記細胞培養システムを用いた心筋細胞の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

成体における心筋細胞は増殖活性を喪失している。そのため、重症な心筋梗塞、心筋症等の疾患では、従来、心臓移植に頼らざるを得ない状況が続いていた。しかし、近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞についての研究が進んで来た。このことから、これらの多能性幹細胞を分化誘導して心筋細胞を作製し、そのような誘導された心筋細胞を移植医療において使用することが可能になりつつある。

【0003】

これまで、ヒトｉＰＳ細胞の維持及び増殖には懸濁培養系（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍｓ；ＳＣＳｓ）が用いられてきた。ＳＣＳｓでは、培養量を容易にスケールアップすることができ、培地交換が簡単である。また、ＳＣＳｓでは、ヒトｉＰＳ細胞は細胞凝集が自然に起こり、胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ；ＥＢ）形成するため、分化細胞の生成に適している（例えば、非特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】Hemmi N et al., “A Massive Suspension Culture System With Metabolic Purification for Human Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.”, Stem Cells Translational Medicine, Vol. 3, No. 12, p1473-1483, 2014.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、非特許文献１に記載の方法等、ＳＣＳｓによる未分化幹細胞の培養又は分化誘導系では、細胞塊が増殖しにくく、分化効率が不安定であるため、均質なＥＢを得ることが困難である。また、細胞株毎に至適条件が異なるため、羽の回転速度の条件検討が必要である。また、系内に残存する未分化幹細胞の完全除去が困難である。さらに、細胞を移植する際にはスフェロイド状やシート状、ファイバー状等様々な微小組織に変化させることが一般的であり、その際には、細胞を、一度酵素等を用いて単離する必要がある。しかしながら、ＳＣＳｓによる未分化幹細胞の培養又は分化誘導系では、長期間の培養により細胞間の接着が強固であり、単離が極めて困難となる。

【0006】

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、高効率に未分化幹細胞を増殖させ、心筋細胞への分化誘導効率が安定した細胞培養装置及び細胞培養システムを提供する。また、前記細胞培養装置又は前記細胞培養システムを用いた心筋細胞の製造方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
本発明の第１態様に係るシステムは、未分化幹細胞を培養し心筋細胞を分化誘導するシステムであって、細胞培養装置と、ガス供給装置と、前記細胞培養装置に供給されるガスの速度が、１層あたり２０ｍＬ／分以上６０ｍＬ／分以下で全層において一定となるように前記ガス供給装置を制御する制御部と、を備え、前記細胞培養装置は、液面高さが２ｍｍ以上１０ｍｍ以下となるように設定された培養液を貯留可能な培養液貯留部と、供給されたガスが通流するガス供給流路と、前記ガス供給流路に設けられ、前記培養液貯留部に貯留された前記培養液に対して前記ガスを前記速度で全層において一定となるように吐出するガス吐出口と、前記培養液に対して吐出された前記ガスを排出するためのガス排出口と、前記ガス排出口を通じた前記ガスが通流するガス排出流路と、を備えた培養容器を４層以上備え、前記培養容器を４層以上積層することにより形成されたものである。

【0008】

前記４層以上の培養容器は、一の前記培養容器の前記ガス供給流路と他の前記培養容器の前記ガス供給流路と、及び、一の前記培養容器の前記ガス排出流路と、他の前記培養容器の前記ガス排出流路とが、互いに連通可能に接続されることで積層されていてもよい。

【0009】

前記培養液貯留部は、矩形状に形成され、前記ガス供給流路及び前記ガス排出流路は、前記培養液貯留部における一辺の両端の角部にそれぞれ設けられていてもよい。

【0013】

本発明の第２態様に係る心筋細胞の製造方法は、上記第１態様に係るシステムを用いて、未分化幹細胞を培養し、心筋細胞に分化誘導する分化誘導工程を備える方法である。

【発明の効果】

【0014】

上記態様の細胞培養装置及び細胞培養システムによれば、高効率に未分化幹細胞を増殖させ、安定した分化誘導効率で心筋細胞を得ることができる。上記態様の心筋細胞の製造方法によれば、未分化幹細胞から安定した分化誘導効率で心筋細胞を大量に得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

【図1A】本実施形態の細胞培養装置の一例を示す概略構成図（斜視図）である。

【図1B】本実施形態の細胞培養装置の一例を示す概略構成図（正面図）である。

【図2】本実施形態の細胞培養システムの一例を示す概略構成図である。

【図3A】参考例１におけるヒトｉＰＳ細胞の培養試験のフローを示す概略構成図である。

【図3B】参考例１におけるヒトｉＰＳ細胞のアルカリフォスファターゼ染色の結果を示す画像である。

【図3C】参考例１におけるヒトｉＰＳ細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。上は、明視野における画像であり、下は、蛍光を検出した画像である。スケールバーは１００μｍである。

【図4A】実施例１におけるヒトｉＰＳ細胞の培養試験のフローを示す概略構成図である。

【図4B】参考例１及び実施例１におけるヒトｉＰＳ細胞の増殖効率を示すグラフである。

【図4C】実施例１におけるヒトｉＰＳ細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。左は、明視野における画像であり、右は、蛍光を検出した画像である。スケールバーは１００μｍである。

【図4D】実施例１におけるＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下でヒトｉＰＳ細胞を培養した培養液中のＣＯ_２分圧、Ｏ_２分圧、ｐＨ、グルコース濃度及びグルタミン濃度の経時変化を示すグラフである。

【図5】実施例２におけるＰＢＳ中のフェノールレッドの色の経時的な変化を示す画像である。

【図6A】実施例２におけるＡＧＶ条件下でのガス置換速度を示すグラフである。

【図6B】実施例２におけるＮＧＶ条件下でのガス置換速度を示すグラフである。

【図7A】実施例２におけるヒトｉＰＳ細胞の培養試験のフローを示す概略構成図である。

【図7B】実施例２におけるＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下でのヒトｉＰＳ細胞の細胞数の経時変化を示すグラフである。

【図7C】実施例２におけるＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下でのヒトｉＰＳ細胞の増殖効率を示すグラフである。

【図7D】実施例２におけるヒトｉＰＳ細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。上は、明視野における画像であり、下は、蛍光を検出した画像である。スケールバーは１００μｍである。

【図7E】実施例２におけるＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下でヒトｉＰＳ細胞を培養した培養液中のＣＯ_２分圧、Ｏ_２分圧及びｐＨの経時変化を示すグラフである。

【図8A】実施例３におけるヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導試験のフローを示す概略構成図である。

【図8B】実施例３における各条件で培養したヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞の細胞生存率を示すグラフである。

【図8C】実施例３における各条件で培養したヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞の細胞数を示すグラフである。グラフ中、「ｎｏｎ−ＣＭｓ」とは、心筋細胞ではない細胞の数を示し、「ＣＭｓ」とは心筋細胞に分化した細胞の数を示す。

【図8D】実施例３における各条件で培養したヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞中のトロポニンＴ陽性細胞の割合を示すグラフ（左）及びヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の細胞数を示すグラフ（右）である。

【図8E】実施例３における各条件で培養したヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。上は、ヒトｉＰＳ細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。真ん中は、代謝選択前の細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。下は、代謝選択後の細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。

【図8F】実施例３におけるヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞の免疫蛍光染色の結果を示す画像である。左は代謝選択前の細胞の蛍光検出画像であり、右は代謝選択後の細胞の蛍光検出画像である。スケールバーは５００μｍである。

【発明を実施するための形態】

【0016】

≪細胞培養装置≫
図１Ａ（斜視図）及び図１Ｂ（正面図）は、本実施形態の細胞培養装置の一例を示す概略構成図である。図１Ａ及び図１Ｂを参照しながら、本実施形態の細胞培養装置の各構成について以下に詳細を説明する。

【0017】

図１Ａ及び図１Ｂに示す細胞培養装置１００は、培養容器１０を複数備える。培養容器１０は、培養液貯留部１と、ガス供給流路２と、ガス吐出口３と、ガス排出口４と、ガス排出流路５と、を備える。また、細胞培養装置１００は、複数の培養容器１０を積層することにより形成されている。図１Ａ及び図１Ｂにおいて、培養容器１０が１０層積層されたものを例示したが、積層される数は、２層以上であればよく、これに限定されない。

【0018】

培養容器１０において、培養液貯留部１は、所定の液面高さとなるように培養液７を貯留するためのものである。

【0019】

培養液貯留部１において、培養液の液面高さは２ｍｍ以上１０ｍｍ以下となるように設定されていることが好ましく、２ｍｍ以上６ｍｍ以下となるように設定されていることがより好ましく、２ｍｍ以上４ｍｍ以下となるように設定されていることがさらに好ましい。
培養液の液面高さが上記下限値以上であることにより、細胞を乾燥させることなく十分な栄養を与えながら、培養液中においてより高効率で増殖させることができる。一方、上記上限値以下であることにより、培養液中に供給されるガスをより高効率で溶存させることができる。

【0020】

また、培養液貯留部１の形状としては、特別な限定はないが、天面から見たときの形状が矩形状であることが好ましい。

【0021】

また、培養液貯留部１の底面には、未分化幹細胞を培養することができる公知のマトリックスで被覆されていることが好ましい。公知のマトリックスとしては、例えば、成長因子が低減されたマトリゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｌａｍｉｎｉｎ ５１１Ｅ８（Ｎｉｐｐｉ社製）、Ｌａｍｉｎｉｎ ５１１／５２１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社製）、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ（Ｒ＆Ｄ社製）、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）等が挙げられ、これらに限定されない。

【0022】

本実施形態の細胞培養装置において用いられる培養液は、細胞の生育に有効な成分を含有していてもよく、例えば、アミノ酸、ビタミン類、無機塩類、糖類、成長因子等の各種成分が挙げられる。その他、抗生物質、緩衝液、キレート剤、フェノールレッド指示薬等の成分を含有していてもよい。

【0023】

培養液としては、例えば、従来培地として用いられている一般的な細胞培養液と同様の組成としてもよい。前記従来培地として用いられている一般的な細胞培養液として具体的には、例えば、ダルベッコ改変イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ＭＥＭ培養液（例えば、α−ＭＥＭ、ＭＥＭ［Ｈａｎｋ’ｓ ＢＳＳ］）、ＲＰＭＩ培養液（例えば、ＲＰＭＩ １６４０等）、Ｆ１２培養液、ＳｔｅｍＰｒｏ３４、ｍＴｅＳＲ１等が挙げられる。

【0024】

また、培養液としては、例えば、未分化幹細胞維持培地として用いられている一般的な細胞培養液と同様の組成としてもよい。前記未分化幹細胞維持培地として具体的には、例えばＳｔｅｍＦｉｔ培地、ｍＴｅＳＲ（登録商標） Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（登録商標）培地、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）培地等が挙げられる。

【0025】

なお、本明細書において、「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する多能性幹細胞を包含する概念として用いられる。未分化幹細胞としては、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｉＰＳ細胞）、及び、これらの幹細胞から誘導された分化多能性を有する細胞、並びに各種体性幹細胞が含まれる。「未分化幹細胞」は、分化多能性を有する細胞であれば特に限定されず、上記例示したＥＳ細胞やｉＰＳ細胞と同等の性質を有する未知の細胞も包含する。

【0026】

細胞が未分化幹細胞であることは、未分化幹細胞に特異的な性質の有無や、未分化幹細胞に特異的な各種マーカーの発現等から判断することができる。例えば、未分化幹細胞に特異的な性質としては、自己複製能を有し、未分化幹細胞とは異なる性質を有する別種の細胞へと分化可能である性質が挙げられる。また、テラトーマ形成能やキメラマウス形成能等も未分化幹細胞に特異的な性質として挙げられる。

【0027】

未分化幹細胞に特異的な各種マーカー（以下、「未分化幹細胞マーカー」と称する場合がある）とは、未分化幹細胞に特異的に発現する因子である。未分化幹細胞マーカーとして具体的には、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５等が挙げられる。これら未分化幹細胞マーカーの少なくとも１つの発現が観察された場合には、当該細胞を未分化幹細胞と判断することができる。未分化幹細胞マーカーは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。一実施形態として、Ｏｃｔ３／４を発現する細胞を未分化幹細胞と判断してもよい。なお、細胞における未分化幹細胞マーカーの発現は、ＲＴ−ＰＣＲやマイクロアレイ等の公知の方法を用いて確認することができる。

【0028】

未分化幹細胞は、哺乳類の未分化幹細胞であってもよく、げっ歯類の未分化幹細胞であってもよく、霊長類の未分化幹細胞であってもよく、ヒトの未分化幹細胞であってもよい。未分化幹細胞の一例として、ヒト由来の未分化幹細胞が挙げられる。未分化幹細胞として、より具体的な例としては、ヒトｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞等が挙げられる。

【0029】

本明細書において、「分化細胞」とは、上記「未分化幹細胞」の性質を有しない細胞のことを指す。分化細胞は、未分化幹細胞から誘導及び分化された細胞であり得るが、分化多能性を有しない。分化細胞としては、例えば、ＥＳ細胞から分化した細胞、ｉＰＳ細胞から分化した細胞であってよい。分化細胞の例としては、心筋細胞、筋細胞、繊維芽細胞、神経細胞、リンパ球等の免疫細胞、血管細胞、網膜色素上皮細胞等の眼細胞、巨核球や赤血球等の血液細胞、その他各組織細胞、及び、それらの前駆細胞等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞培養装置を用いて未分化幹細胞から誘導及び分化される細胞としては、心筋細胞であることが好ましい。

【0030】

未分化幹細胞から心筋細胞を製造する場合、心筋細胞への分化が進行するにつれて、未分化中胚葉、心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）を経て心筋細胞に分化すると考えられている。ここで、未分化中胚葉とは、未分化中胚葉に特異的なＢｒａｃｈｙｕｒｙタンパク質の発現が認められる段階をいう。一方、心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）とは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ等の未分化中胚葉に特異的なタンパク質の発現が認められ、且つ、同一細胞においてＮｋｘ２．５やアクチニン等の心筋細胞特異的タンパク質の発現を認めない細胞でを意味する。さらに、心臓中胚葉（又は予定心筋細胞）は、培養液に対して新たに物質が加えられることを必要とせず、専ら心筋細胞へ分化する能力を有する細胞を意味する。心筋細胞とは、自律拍動を行っている細胞のことを意味する。心筋細胞は、Ｎｋｘ２．５、ＧＡＴＡ４、アクチニン等のマーカーを発現する。

【0031】

未分化幹細胞から心筋細胞を製造する場合、例えば、未分化幹細胞を培養する培養液に、心筋細胞への分化を惹起する物質を添加することにより、心筋細胞への分化及び誘導を行ってもよい。心筋細胞への分化を惹起する物質としては、例えば、サイトカイン、接着分子、ビタミン、転写因子、心筋細胞由来の細胞外基質、ＢＭＰアンタゴニスト等を挙げられる。なお、後述の実施例に示すように、分化初期にＷｎｔシグナル及びＢＭＰシグナルを活性化する物質（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１等）を添加し、分化後期にＷｎｔシグナルを抑制する物質（例えば、ＩＷＲ１、Ｄｋｋ、ＩＷＰ２等）を添加することが好ましい。

【0032】

前記サイトカインとしては、例えば、デメチラーゼ、５−アザシチジン、ＤＭＳＯなどの染色体ＤＮＡ脱メチル化剤；ＰＤＧＦ、繊維芽細胞増殖因子８（ＦＧＦ−８）、エンドセリン１（ＥＴ１）、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）骨形成因子４（ＢＭＰ−４）、Ｇ−ＣＳＦ、Ａｃｔｉｖｅ Ａ等が挙げられる。

【0033】

前記接着分子としては、例えば、ゼラチン、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン等が挙げられる。

【0034】

前記ビタミンとしては、例えば、レチノイン酸等が挙げられる。

【0035】

前記転写因子としては、例えば、Ｎｋｘ２．５／Ｃｓｘ、ＧＡＴＡ４、ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、ｄＨＡＮＤ、ｅＨＡＮＤ、ＴＥＦ−１、ＴＥＦ−３、ＴＥＦ−５、ＭｅｓＰ１等が挙げられる。

【0036】

前記ＢＭＰアンタゴニストとしては、例えば、ノギン、コーディン、フェチュイン、フォリスタチン、スクレロスチン、ダン、サーベラス、グレムリン、ダンテ等が挙げられる。

【0037】

ガス供給流路２は、供給されたガスが通流するためのものである。

【0038】

本実施形態の細胞培養装置において供給されるガスとしては、細胞培養に用いられる組成のガスであればよい。中でも、供給されるガスとしては、ガス中の二酸化炭素の濃度が３％以上１０％以下であることが好ましく、４％以上８％以下であることがより好ましく、５％以上６％以下であることがさらに好ましい。ガス中の二酸化炭素の濃度が上記範囲であることにより、より高効率で細胞を増殖させることができる。

【0039】

また、供給されるガスの組成としては、その他に酸素（ガス中の濃度：例えば１０％以上３０％以下程度）及び窒素（ガス中の濃度：例えば７０％以上９０％以下程度）等を含むことができる。

【0040】

ガス吐出口３は、ガス供給流路２に設けられ、培養液貯留部１に貯留された培養液７に対してガスを吐出するためのものである。これにより培養液７中にガスが溶存し、高効率で細胞を増殖させることができる。

【0041】

ガス排出口４は、培養液７に対して吐出されたガスを排出するためのものである。これにより、培養容器１０内の空気を高効率で置換することができ、培養容器１０内の空気の組成を一定に保つことができる。

【0042】

ガス排出流路５は、ガス排出口４を通じたガスが通流するためのものである。これにより、排出されたガスは培養系外へと排出される。

【0043】

また、複数の培養容器において、一の培養容器のガス供給流路と、他の培養容器のガス供給流路とがそれぞれ独立していてもよく、互いに連通可能に接続されていてもよい。中でも、一の培養容器のガス供給流路と、他の培養容器のガス供給流路とが互いに連通可能に接続されていることが好ましい。これにより、各培養容器間の空気の組成を一定に保つことができる。

【0044】

また、複数の培養容器において、一の培養容器のガス排出流路と、他の培養容器のガス排出流路とがそれぞれ独立していてもよく、互いに連通可能に接続されていてもよい。中でも、一の培養容器のガス排出流路と、他の培養容器のガス排出流路とが互いに連通可能に接続されていることが好ましい。これにより、各培養容器間の空気の組成を一定に保つことができる。

【0045】

また、培養容器１０におけるガス供給流路２及びガス排出流路５の位置は特別な限定はなく、培養液貯留部１の天面からみた形状が矩形状である場合、培養液貯留部１における一辺の両端の角部にガス供給流路２及びガス排出流路５が設けられていてもよい。又は、培養液貯留部１における対角線上の角部にガス供給流路２及びガス排出流路５が設けられていてもよい。中でも、培養液貯留部１の天面からみた形状が矩形状である場合、培養液貯留部１における一辺の両端の角部にガス供給流路２及びガス排出流路５が設けられていることが好ましい。これにより、培養容器１０内に空気の流れにより液面を波立たせることなく、適度に培養容器１０内の空気が置換され、より高効率で細胞を増殖させることができる。

【0046】

≪細胞培養システム≫
図２は、本実施形態の細胞培養システムの一例を示す概略構成図である。図２を参照しながら、本実施形態の細胞培養システムの各構成について以下に詳細を説明する。

【0047】

図２に示す細胞培養システムＡは、上記実施形態に係る細胞培養装置１００と、ガス供給装置２００と、を備える。

【0048】

ガス供給装置２００は、ガス供給流路２と互いに連通可能に接続している。ガス供給装置２００は、二酸化炭素ボンベ１１ａ、酸素ボンベ１１ｂ及び窒素ボンベ１１ｃと、弁１２ａ、弁１２ｂ及び弁１２ｃと、ポンプ１３とを備える。ガス供給装置２００において、弁１２ａ、弁１２ｂ及び弁１２ｃを制御することで、細胞培養装置１００に供給されるガス中の二酸化炭素、酸素及び窒素の濃度が上記細胞培養装置において示した範囲となるように、二酸化炭素ボンベ１１ａ、酸素ボンベ１１ｂ及び窒素ボンベ１１ｃからそれぞれ二酸化炭素、酸素及び窒素を供給することができる。

【0049】

また、図２に示すように、弁１２ａ、弁１２ｂ及び弁１２ｃは、制御部３００としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータからの指令に基づいて動作するようになっていてもよい。制御部３００は、細胞培養装置１００に供給されるガス中の二酸化炭素、酸素及び窒素の濃度が上記細胞培養装置において示した範囲となるように、弁１２ａ、弁１２ｂ及び弁１２ｃを制御して、二酸化炭素ボンベ１１ａ、酸素ボンベ１１ｂ及び窒素ボンベ１１ｃからそれぞれ二酸化炭素、酸素及び窒素を供給することができる。

【0050】

また、図２に示さないが、培養容器１０のうち少なくとも１つは、溶存ガス濃度検出器（図示せず）を備えてもよい。さらに、この溶存ガス濃度検出器は、制御部３００としてのコンピュータに電気的に接続していてもよい。これにより、溶存ガス濃度検出器で検出された培養液中の溶存ガス濃度が制御部３００に伝達することができる。例えば、培養液中の溶存ガス濃度が上記の細胞培養装置において示した範囲から外れている場合、当該範囲内におさまるように、弁１２ａ、弁１２ｂ及び弁１２ｃを制御することで、二酸化炭素ボンベ１１ａ、酸素ボンベ１１ｂ及び窒素ボンベ１１ｃからそれぞれ二酸化炭素、酸素及び窒素を供給して、培養液内の溶存ガス濃度を制御することができる。

【0051】

また、図２に示さないが、ポンプ１３は、制御部３００としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータからの指令に基づいて動作するようになっていてもよい。これにより、制御部３００は、ポンプ１３を制御して、供給されるガスの速度を制御することができる。

【0052】

供給されるガスの速度としては、１層あたり５ｍＬ／分以上１００ｍＬ／分以下であることが好ましく、１０ｍＬ／分以上８０ｍＬ／分以下であることがより好ましく、２０ｍＬ／分以上６０ｍＬ／分以下であることがさらに好ましい。ガスの速度が上記範囲であることにより、培養容器１０内の空気をより高効率で置換することができる。

【0053】

また、図２に示さないが、ガス排出流路は、ガスを排出するためのポンプを備えていてもよい。これにより、培養装置１００内のガスをより高効率に培養系外に排出することができる。また、このガスを排出するためのポンプについても、制御部３００としてのコンピュータに電気的に接続しており、コンピュータからの指令に基づいて動作するようになっていてもよい。

【0054】

≪心筋細胞の製造方法≫
本発明の一実施形態に係る心筋細胞の製造方法は、上記実施形態に係る細胞培養装置、又は、上記実施形態に係る細胞培養システムを用いて、未分化幹細胞を培養し、心筋細胞に分化誘導する分化誘導工程を備える方法である。

【0055】

本実施形態の心筋細胞の製造方法によれば、未分化幹細胞から安定した分化誘導効率で心筋細胞を大量に得ることができる。図１Ａ、図１Ｂ及び図２を参照しながら、本実施形態の心筋細胞の製造方法について以下に詳細を説明する。

【0056】

［分化誘導工程］
まず、培養容器１０に未分化幹細胞８を播種する。播種する細胞数としては、特別な限定はなく、例えば、１．０×１０^３個／ｃｍ^２以上５．０×１０^３個／ｃｍ^２以下程度であればよい。また、未分化幹細胞としては、上記細胞培養装置において例示されたものと同様のものが挙げられる。

【0057】

次いで、心筋細胞への分化を惹起する物質を含む培養液７を用いて、培養を開始する。心筋細胞への分化を惹起する物質及び培養液としては、上記細胞培養装置において例示されたものと同様のものが挙げられる。培養液は、１日以上３日以下おきに交換することができる。

【0058】

分化誘導工程において、細胞培養装置１００に、ガスを積極的に供給することが好ましい。供給されるガスとしては、上記細胞培養装置において例示されたものと同様のものが挙げられる。中でも、供給されるガス中の二酸化炭素の濃度が３％以上１０％以下であることが好ましく、４％以上８％以下であることがより好ましく、５％以上６％以下であることがさらに好ましい。ガス中の二酸化炭素の濃度が上記範囲であることにより、より高効率で細胞を増殖させることができる。

【0059】

また、供給されるガスの速度としては、１層あたり５ｍＬ／分以上１００ｍＬ／分以下であることが好ましく、１０ｍＬ／分以上８０ｍＬ／分以下であることがより好ましく、２０ｍＬ／分以上６０ｍＬ／分以下であることがさらに好ましい。ガスの速度が上記範囲であることにより、培養容器１０内の空気をより高効率で置換することができる。

【0060】

培養温度としては、例えば３０℃以上４０℃以下とすることができる。培養時間としては、７日以上１４日以下であることが好ましい。培養時間が上記範囲内であることにより、培養することで、未分化幹細胞から心筋細胞への分化誘導を完了させることができる。

【0061】

図２に示す細胞培養システムＡを使用する場合、供給されるガスの組成及び速度は、制御部３００としてのコンピュータにより自動で制御することができる。

【0062】

本実施形態の心筋細胞の製造方法は、分化誘導工程に加えて、他の工程を備えていてもよい。他の工程としては、例えば、分化細胞を精製する工程、分化細胞を回収する工程等が挙げられる。これらの工程を追加する場合、これらの工程は、上記分化誘導工程の後に行われる。

【0063】

心筋細胞の精製工程や回収工程としては、例えば、国際公開第２００６／０２２３７７号（参考文献１）、国際公開第２００７／０８８８７４号（参考文献２）、国際公開２０１６／０１０１６５号（参考文献３）に記載の方法等を、精製工程に適用してもよい。また、回収工程としては、遠心分離法等を適用してもよい。

【0064】

本実施形態の製造方法において得られる心筋細胞は、例えば、分化細胞／（未分化幹細胞＋分化細胞）×１００で表される分化細胞率が、５０％以上であってよく、７０％以上であってよく、８０％以上であってよく、９０％以上であってよく、９５％以上であってよい。なお、死細胞は上記細胞数に含めないものとする。

【0065】

さらに、他の実施形態において、本発明は、上記分化誘導工程を含む心筋細胞の製造方法によって製造された心筋細胞、を提供する。

【実施例】

【0066】

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0067】

［参考例１］１層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞の培養
１．ヒトｉＰＳ細胞の準備
ヒトｉＰＳ細胞系統（２５３Ｇ４）は、京都大学ｉＰＳＣリサーチアンドアプリケーションセンターから入手した。

【0068】

２．ヒトｉＰＳ細胞の培養
次いで、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ４）１×１０^６個を１層のプレート（培養面積：６３２ｃｍ^２、成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種した（図３Ａ参照）。培養液としては、改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地（味の素社製）１２０ｍＬを用いて、１日おきに交換した。

【0069】

なお、改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地の組成としては、２１種のアミノ酸、１０種のビタミン、５種の微量ミネラル及び塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む７種の成長因子である。２１種のアミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸。Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン及びＬ−バリンである。１０種のビタミンとしては、Ｌ−アスコルビン酸、コバラミン、ビオチン、葉酸、Ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−ペンチテン酸カルシウム、ピリドキシン、リボフラビン及びチオアミン塩酸塩である。５種の微量ミネラルとしては、硫酸銅（ＩＩ）、硫酸鉄（ＩＩ），硝酸鉄（ＩＩ）、硫酸亜鉛及び亜セレン酸ナトリウムである。改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地では、通常のＳｔｅｍ Ｆｉｔ培地と比較して、大量培養のために、ほとんどの成分を８倍量含有している。

【0070】

また、正常ガスインキュベーター中で７日間培養した。次いで、培養後の細胞を収集し、成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート上で改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地（味の素社製）（１０μＭのＹ２７６３２（和光純薬工業社製）含有）に細胞を再懸濁した。次いで、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、細胞数を計測した。７日後の細胞数は、７．９×１０^８個（３．０×１０^５細胞／ｃｍ^２）であり、細胞の増殖効率は１８７倍であった。なお、ヒトｉＰＳ細胞の増殖効率とは、細胞培養装置への播種細胞数に対する、７日後の細胞培養装置中の合計細胞数の割合である。

【0071】

３．ヒトｉＰＳ細胞の形質確認
（１）アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）染色
Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて、「１．」で７日間培養したヒトｉＰＳ細胞を染色した。結果を図３Ｂに示す。

【0072】

図３Ｂから、全てのコロニーにおいてＡＬＰ陽性であり、多能性状態が保たれていた。また、図３Ｂに示すように、ヒトｉＰＳ細胞はプレート全体にわたって均一に培養されていた。

【0073】

（２）未分化幹細胞マーカーの検出
「１．」で７日間培養したヒトｉＰＳ細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。次いで、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ社製）を用いて、室温で５分間浸透させた。次いで、一次抗体として、以下のａ）〜ｃ）を用いて４℃で一晩インキュベートした。
ａ）マウス抗ＴＲＡ１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の１／２００希釈物
ｂ）マウス抗ＴＲＡ１−８１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の１／２００希釈物
ｃ）マウス抗ＳＳＥＡ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の１／２００希釈物

【0074】

次いで、細胞をｎ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。次いで、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８／５９４抗マウスＩｇＧを用いて、室温で１時間インキュベーションした。

【0075】

次いで、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で核染色した。蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、染色細胞を検出した。結果を図３Ｃに示す。上は明視野での画像であり、下は蛍光検出画像である。図３Ｃにおいて、上及び下共に、スケールバーは１００μｍである。

【0076】

図３Ｃから、すべてのコロニーにおいて、未分化幹細胞マーカーの強い発現が観察された。

【0077】

以上のことから、１層からなる細胞培養装置を用いた２Ｄ培養系がヒトｉＰＳ細胞における多能性の維持に適していることが強く示唆された。

【0078】

［実施例１］４層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞の培養
１．ヒトｉＰＳ細胞の準備
参考例１の「１．」と同様に、ヒトｉＰＳ細胞系統（２５３Ｇ４）を準備した。

【0079】

２．ヒトｉＰＳ細胞の培養
次いで、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ４）１×１０^６個／１層（合計４×１０^６個）を４層のプレート（培養面積：６３２ｃｍ^２×４層＝２５２８ｃｍ^２、成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種した（図４Ａ参照）。培養液としては、改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地（味の素社製）５００ｍＬ／４層を用いて、１日おきに交換した。また、多層ガスインキュベーター（ＭＧ−７０Ｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製）（以下、「ＡＧＶ」と称する場合がある）を用いて、１層当たり５０ｍＬ／分の速度で５％ＣＯ_２含有ガスを積極的に通気しながら、細胞を３７℃で７日間培養した。また、対照として、正常ガスインキュベーター（以下、「ＮＧＶ」と称する場合がある）を用いて、細胞を３７℃で７日間培養した。次いで、培養後の細胞を収集し、成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート上で改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地（味の素社製）（１０μＭのＹ２７６３２（和光純薬工業社製）含有）に細胞を再懸濁した。次いで、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、細胞数を計測した。

【0080】

その結果、４層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞の増殖効率は、１７９倍であり、１層からなる細胞培養装置を用いた場合（１８７倍）と、ほぼ同等であった（図４Ｂ参照）。

【0081】

３．ヒトｉＰＳ細胞の形質確認
（１）未分化幹細胞マーカーの検出
「１．」で７日間培養したヒトｉＰＳ細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。次いで、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ社製）を用いて、室温で５分間浸透させた。次いで、一次抗体として、以下のａ）〜ｄ）を用いて４℃で一晩インキュベートした。
ａ）ウサギ抗ＮＡＮＯＧ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）の１／２００希釈物
ｂ）マウス抗ＯＣＴ４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）の１／２００希釈物
ｃ）マウス抗ＴＲＡ１−６０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の１／２００希釈物
ｄ）マウス抗ＳＳＥＡ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の１／２００希釈物

【0082】

次いで、細胞を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。次いで、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８／５９４抗マウスＩｇＧ、又は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８／５９４抗ウサギＩｇＧを用いて、室温で１時間インキュベーションした。

【0083】

次いで、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で核染色した。蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、染色細胞を検出した。結果を図４Ｃに示す。左は明視野での画像であり、右は蛍光検出画像である。図４Ｃにおいて、左及び右共に、スケールバーは１００μｍである。

【0084】

図４Ｃから、すべてのコロニーにおいて、未分化幹細胞マーカーの強い発現が観察された。

【0085】

４．培養液中のバイオプロファイル分析
ＡＧＶ又はＮＧＶ条件下での培養開始から３、５及び７日後の培養液中のＣＯ_２分圧（ｐＣＯ_２）、Ｏ_２分圧（ｐＯ_２）、ｐＨ、グルコース濃度及びグルタミン濃度を、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ ４００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）を用いて測定した。結果を図４Ｄに示す。

【0086】

図４Ｄから、培養液中のＣＯ_２分圧は、ＡＧＶ条件下では、培養開始から３、５及び７日後のいずれの時点でも安定であった。一方、ＮＧＶ条件下では、培養液中のＣＯ_２分圧は、時間の経過とともに有意に増加した。

【0087】

また、いずれの条件下でも、培養液のｐＨは低下し、培養液中のＯ_２分圧は有意に変化しなかった。また、いずれの条件下でも、培地中のグルコース濃度及びグルタミン濃度は、時間の経過とともに著しく減少した。

【0088】

［実施例２］１０層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞の培養
１．ヒトｉＰＳ細胞の準備
参考例１の「１．」と同様に、ヒトｉＰＳ細胞系統（２５３Ｇ４）を準備した。

【0089】

２．各層におけるＣＯ_２透過性の確認
１０層からなる細胞培養装置に２ＬのＰＢＳ（２０ｍｇのフェノールレッド含有）を満たし、多層ガスインキュベーター（ＭＧ−７０Ｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて、１層当たり５０ｍＬ／分の速度で５％ＣＯ_２含有ガスを３７℃で１時間積極的に細胞培養装置内に通気した。また、開始から１０分毎に写真を撮影した。結果を図５に示す。

【0090】

図５から、ＡＧＶ条件下では、ＰＢＳ中のフェノールレッドから１時間後には、赤色から黄色に変化していた。このことから、培養液中に十分にＣＯ_２が供給されることが確かめられた。

【0091】

３．ガス交換速度の確認
ＡＧＶ条件下では、１０層からなる細胞培養装置に多層ガスインキュベーター（ＭＧ−７０Ｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製）を用いて、１層当たり５０ｍＬ／分の速度でＮ_２ガスを積極的に通気した。また、ＮＧＶ条件下では、１０層からなる細胞培養装置を低酸素状態（１％Ｏ_２）下に静置した。ＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下の１０層からなる細胞培養装置の第５層に、センサチップ（ＳＰ−ＰＳｔ３−ＹＡＵ−Ｄ５、ＰｒｅＳｅｎｓ社製）及び光ファイバ（ＰＯＦ−１ＭＳＡ、ＰｒｅＳｅｎｓ社製）を配置した。Ｆｉｂｏｘ ３（ＰｒｅＳｅｎｓ社製）を用いて、層内の酸素濃度を測定した。結果を図６Ａ（ＡＧＶ条件下）及び図６Ｂ（ＮＧＶ条件下）に示す。

【0092】

図６Ａから、ＡＧＶ条件下では、４時間でガス交換が完了した。一方、図６Ｂから、ＮＧＶ条件下では、２４時間の間に、ガス交換が完了することができなかった。

【0093】

４．ヒトｉＰＳ細胞の培養
次いで、ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ４）１×１０^６個／１層（合計１×１０^７個）を１０層のプレート（培養面積：６３２ｃｍ^２×１０層＝６３２０ｃｍ^２、成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種した（図７Ａ参照）。培養液としては、改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地（味の素社製）１２００ｍＬ／１０層を用いて、１日おきに交換した。また、多層ガスインキュベーター（ＭＧ−７０Ｍ、ＴＡＩＴＥＣ社製）（以下、「ＡＧＶ」と称する場合がある）を用いて、１層当たり５０ｍＬ／分の速度で５％ＣＯ_２含有ガスを積極的に通気しながら、細胞を３７℃で７日間培養した。また、対照として、正常ガスインキュベーター（以下、「ＮＧＶ」と称する場合がある）を用いて、細胞を３７℃で２８日間培養した。なお、ヒトｉＰＳ細胞は、１週間（７日）毎に、Ｄ−ＰＢＳで洗浄し、細胞分散剤として、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、継代した。

【0094】

また、培養開始から７、１４、２１及び２８日後に細胞を収集し、成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート上で改変Ｓｔｅｍ Ｆｉｔ培地（味の素社製）（１０μＭのＹ２７６３２（和光純薬工業社製）含有）に細胞を再懸濁した。次いで、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、細胞数を計測した。ＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下での１０層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞の細胞数の経時変化を図７Ｂに示す。また、ＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下での培養開始から７日後のヒトｉＰＳ細胞の増殖効率を図７Ｃに示す。

【0095】

図７Ｂから、ＡＧＶ条件下では、ＮＧＶ条件下よりも、ヒトｉＰＳ細胞の増殖が安定していた。

【0096】

図７Ｃから、ＡＧＶ条件下では、培養開始から７日後のヒトｉＰＳ細胞の細胞数が１．７×１０^９個であり、ＮＧＶ条件下よりも４４％程度細胞数が多かった。

【0097】

５．ヒトｉＰＳ細胞の形質確認
（１）未分化幹細胞マーカーの検出
実施例１の「３．」の（１）と同様の方法を用いて、ＡＧＶ条件下で培養したヒトｉＰＳ細胞について、未分化幹細胞マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、ＴＲＡ１−６０及びＳＳＥＡ４）を検出した。結果を図７Ｄに示す。図７Ｄにおいて、上及び下共に、スケールバーは１００μｍである。

【0098】

図７Ｄから、すべてのコロニーにおいて、未分化幹細胞マーカーの強い発現が観察された。

【0099】

６．培養液中のバイオプロファイル分析
実施例１の「４．」と同様の方法を用いて、ＡＧＶ条件下及びＮＧＶ条件下での培養開始から３、５及び７日後の培養液中のＣＯ_２分圧（ｐＣＯ_２）、Ｏ_２分圧（ｐＯ_２）及びｐＨを測定した。結果を図７Ｅに示す。

【0100】

図７Ｅから、実施例１と同様に、いずれの条件下でも、培養液のｐＨは低下した。一方、Ｏ_２分圧は、実施例１とは異なり、ＮＧＶ条件下で有意に減少した。

【0101】

また、ＣＯ_２分圧は、ＡＧＶ条件下では、通常の１０ｃｍディッシュを用いた培養と同様に、安定していることが確認された。一方、ＮＧＶ条件下では、ＣＯ_２分圧は、培養開始から３日後では、ＡＧＶ条件下でのＣＯ_２分圧よりも顕著に低く、時間の経過とともに有意に増加した。

【0102】

以上のことから、１０層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞の培養において、ＡＧＶ条件下であることにより、ヒトｉＰＳ細胞を効率的に培養できることが明らかとなった。

【0103】

［実施例３］１層、４層又は１０層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の製造
１．ヒトｉＰＳ細胞の準備
参考例１の「１．」と同様に、ヒトｉＰＳ細胞系統（２５３Ｇ４）を準備した。また、ヒトｉＰＳ細胞系統（２０１Ｂ７及びＦｆ１４）についても、京都大学ｉＰＳＣリサーチアンドアプリケーションセンターから入手した。ヒトｉＰＳ細胞系統（２５３Ｇ４、２０１Ｂ７及びＦｆ１４）をそれぞれ、分化誘導開始の４日前にＮＧＶ条件下にて１層又は１０層のプレート（成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種し、ＡＧＶ条件下にて、４層又は１０層のプレート（成長因子低減マトリゲルで被覆されたプレート）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種し、分化誘導開始日に細胞が９０％コンエンスに達するように予め培養した（図８Ａ参照）。

【0104】

２．ヒトｉＰＳ細胞の心筋細胞への分化誘導
次いで、Ｂ２７（インシュリン不含（−））（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、６μＭのＣＨＩＲ９９０２１（和光純薬工業社製）及び１ｎｇ／ｍＬの骨形態形成タンパク質４（Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むＲＰＭＩ（和光純薬工業社製）に培養液を交換し、１日間培養した。次いで、分化誘導開始から１日目から２日目までは、Ｂ２７（インシュリン不含（−））を含むＲＰＭＩに培養液を交換して、培養した。次いで、分化誘導開始から３日目から５日目まで、Ｂ２７（インシュリン不含（−））及び５μＭのＩＷＲ１（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を含むＲＰＭＩに培養液を交換して、培養した。次いで、分化誘導開始から６日目に、Ｂ２７（インシュリン不含（−））を含むＲＰＭＩに培養液を交換して、培養した。次いで、分化誘導開始から７日目に、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）含有ＭＥＭαに培養液を交換して、培養を維持した。次いで、分化誘導開始から１０日目に、ＶｉＣｅｌｌ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いたトリパンブルー染色により、解離した単細胞の数及び細胞生存率を評価した。結果を図８Ｂ（細胞生存率）及び図８Ｃ（細胞数）に示す。なお、図８Ｃにおいて、「ｎｏｎ−ＣＭｓ」とは、心筋細胞へ未分化の細胞の数を示し、「ＣＭｓ」とは心筋細胞に分化した細胞の数を示す。

【0105】

図８Ｂから、いずれの条件においても、細胞生存率は９５％以上であった。

【0106】

図８Ｃから、１層（ＮＧＶ条件下）、４層（ＡＧＶ条件下）又は１０層（ＡＧＶ条件下）の細胞培養装置を用いた場合において、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導後の総細胞数は、それぞれ１．５×１０^６個、６．７×１０^８個及び１．５×１０^９個であった。

【0107】

３．代謝選択によるヒトｉＰＳ細胞由来の心筋細胞の精製
分化誘導開始から１２〜１４日目に、ヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞からＢ２７（インスリン不含（−））含有ＲＰＭＩを除去し、Ｄ−ＰＢＳとともに３分間インキュベートした。次いで、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（ナカライタスク社製）を用いて、細胞を解離させた。次いで、解離した細胞を回収し、５％ＦＢＳ含有ＭＥＭαに懸濁し、１型コラーゲン被覆１５ｃｍディッシュ（ＩＷＡＫＩ社製）、フィブロネクチン被覆１５ｃｍディッシュ（シグマ社製）、又は、フィブロネクチンが被覆された１層の細胞培養装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に播種した。次いで、５％ＦＢＳ含有ＭＥＭαを用いて、１〜２日間培養した。次いで、５％ＦＢＳ含有ＭＥＭαを除去し、Ｄ−ＰＢＳとともに３分間インキュベートした。次いで、グルコース不含及びグルタミン不含ＤＭＥＭ（味の素社製）（４ｍＭ Ｌ−乳酸及び０．１％ＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）含有）に培養液を交換して、３〜６日間培養した。なお、培養液は、２〜３日毎に交換し、死細胞を排除した。この代謝選択により精製されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞を凍結保存し、免疫蛍光染色及びＦＡＣＳ分析に用いた。

【0108】

４．分化効率の評価
分化誘導開始から１０日目に細胞を回収し、免疫蛍光染色及びフローサイトメトリーを用いて分析した。具体的には、以下に示すとおりである。

【0109】

（１）免疫蛍光染色
「２．」で回収された分化誘導開始から１０日目のヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞、及び、「３．」で得られた代謝選択により精製されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞をそれぞれ４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。次いで、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ社製）を用いて、室温で５分間浸透させた。次いで、一次抗体として、マウス抗α−アクチニン（シグマ社製）の１／５００希釈物を用いて４℃で一晩インキュベートした。

【0110】

次いで、細胞を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。次いで、二次抗体として、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８／５９４抗マウスＩｇＧを用いて、室温で１時間インキュベーションした。

【0111】

次いで、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で核染色した。蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社製）を用いて、染色細胞を検出した。結果を図８Ｆに示す。左は代謝選択前の細胞の蛍光検出画像であり、右は代謝選択後の細胞の蛍光検出画像である。図８Ｆにおいて、左及び右共に、スケールバーは５００μｍである。

【0112】

図８Ｆから、代謝選択前及び代謝選択後の細胞において、心筋マーカーであるα−アクチンの蛍光が確認された。特に、代謝選択後の細胞において、α−アクチンの蛍光が顕著に確認された。

【0113】

（２）ＦＡＣＳ分析
「２．」で回収された分化誘導開始から１０日目のヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞、及び、「３．」で得られた代謝選択により精製されたヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞をそれぞれ４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定した。次いで、細胞を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（シグマ社製）を用いて、室温で５分間浸透させた。次いで、一次抗体として、マウス抗心筋トロポニンＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の１／２００希釈物を用いて４℃で一晩インキュベートした。

【0114】

次いで、細胞を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄した。次いで、二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、室温で２時間インキュベーションした。

【0115】

次いで、ＦＡＣＳ（Ｇａｌｌｉｏｓ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社製）を用いて、細胞を分析した。結果を図８Ｅに示す。上は、ヒトｉＰＳ細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。真ん中は、代謝選択前の細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。下は、代謝選択後の細胞を用いたＦＡＣＳ分析の結果を示すグラフである。

【0116】

また、図８Ｄは、図８ＥのＦＡＣＳ分析の結果から算出されたものである。左は、ヒトｉＰＳ細胞由来の分化細胞中のトロポニンＴ陽性細胞の割合を示すグラフであり、右は、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞の細胞数を示すグラフである。

【0117】

図８Ｄから、心筋細胞への分化効率は、ＡＧＶ条件下とＮＧＶ条件下とで有意差はなかった。一方、心筋細胞の細胞数は、ＡＧＶ条件下のほうが、ＮＧＶ条件下よりも多かった。これは、ＮＧＶ条件下では、１０層中の６層以下の下層における細胞の増殖効率が低いためであると推察された。

【0118】

図８Ｅから、代謝選択前の細胞では、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（トロポニンＴ陽性細胞）の割合は、約８０％程度であった。一方、代謝選択後の細胞では、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（トロポニンＴ陽性細胞）の割合は、９７％以上であり、ほとんど全ての細胞において、トロポニンＴが発現されていることが確認された。

【0119】

以上のことから、１０層からなる細胞培養装置を用いたヒトｉＰＳ細胞の培養において、ＡＧＶ条件下であることにより、ヒトｉＰＳ細胞から心筋細胞へ効率的で分化誘導できることが明らかとなった。さらに、心筋細胞を大量に得られることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0120】

本実施形態の細胞培養装置及び細胞培養システムによれば、高効率に未分化幹細胞を増殖させ、安定した分化誘導効率で心筋細胞を得ることができる。本実施形態の心筋細胞の製造方法によれば、未分化幹細胞から安定した分化誘導効率で心筋細胞を大量に得ることができる。

【符号の説明】

【0121】

１…培養液貯留部、２…ガス供給流路、３…ガス吐出口、４…ガス排出口、５…ガス排出流路、７…培養液、８…未分化幹細胞、１０…培養容器、１１ａ…二酸化炭素ボンベ、１１ｂ…酸素ボンベ、１１ｃ…窒素ボンベ、１２ａ，１２ｂ，１２ｃ…弁、１３…ポンプ、１００…細胞培養装置、２００…ガス供給装置、３００…制御部（コンピュータ）、Ａ…細胞培養システム。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】