特許 6979427 可溶性Ｆｃ受容体の高濃度製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6979427

(24)【登録日】2021年11月17日

(45)【発行日】2021年12月15日

(54)【発明の名称】可溶性Ｆｃ受容体の高濃度製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/17 20060101AFI20211202BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 47/12 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 19/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 7/00 20060101ALI20211202BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/17ZNA

   A61K9/10

   A61K47/22

   A61K47/12

   A61P37/02

   A61P25/00

   A61P19/00

   A61P29/00 101

   A61P7/00

【請求項の数】7

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2019-135044(P2019-135044)

(22)【出願日】2019年7月23日

(62)【分割の表示】特願2016-509323(P2016-509323)の分割

【原出願日】2014年4月16日

(65)【公開番号】特開2019-203011(P2019-203011A)

(43)【公開日】2019年11月28日

【審査請求日】2019年8月19日

(31)【優先権主張番号】13002211.4

(32)【優先日】2013年4月26日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515115895

【氏名又は名称】サプレモル ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(72)【発明者】

【氏名】ソンデルマン ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ポール トーマス

【審査官】 新熊 忠信

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５２５９８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００２−５３１０８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５１５９８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１２２５４４（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ９／００− ９／７２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｐ ３７／００

Ａ６１Ｐ ２９／００

Ａ６１Ｐ ２５／００

Ａ６１Ｐ １９／００

Ａ６１Ｐ ７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水性緩衝溶液の中に可溶性Fcγ受容体（sFcγR）を含有している製剤であって、該Fcγ受容体の濃度が60mg/mlより高く、生理学的に許容される緩衝物質を含有しており、前記製剤は該受容体を結晶の形態で含有しており、かつ、ヒスチジン緩衝溶液でありかつ製剤のpHが6.0〜7.5に調整されているか、クエン酸緩衝溶液でありかつpHが5.2〜5.9に調整されている、前記製剤。

【請求項2】

前記受容体が、FcγRII受容体、好ましくは、FcγRIIBである、請求項１記載の製剤。

【請求項3】

Fcγ受容体の濃度が、80mg/mlより高い、好ましくは、100mg/mlより高い、より好ましくは、150mg/mlより高い、最も好ましくは、200mg/mlより高い、請求項１または２のいずれか一項記載の製剤。

【請求項4】

糖、塩、および界面活性剤より選択されるさらなる物質を含有している、請求項１〜３のいずれか一項記載の製剤。

【請求項5】

任意で、薬学的に許容される賦形剤および／またはアジュバントおよび／または担体と組み合わせて、請求項１〜４のいずれか一項記載の製剤を含む薬学的組成物。

【請求項6】

自己免疫疾患または炎症性疾患の予防または処置のための有効量のFcγ受容体の皮下注射のための、請求項５記載の薬学的組成物。

【請求項7】

自己免疫疾患、具体的には、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、原発性免疫性血小板減少症、または自己免疫性溶血性貧血の処置または予防における使用のための、請求項１〜４のいずれか一項記載の製剤または請求項５もしくは６記載の薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

説明
本発明は、可溶性Fc受容体の新規製剤、特に、高濃度の可溶性FcγRIIB受容体を含有している製剤に関する。本発明はさらに、自己免疫疾患、感染、および免疫系が関与するその他の状態の処置のための薬学的組成物としての、そのような製剤の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト可溶性FcγRIIBは、特発性血小板減少性紫斑病、全身性エリテマトーデス、およびその他の自己免疫疾患の処置のための有望な候補物質である。それは、過去10〜15年にわたって開発されてきた、複数の可溶性抗体受容体のうちの一つである。

【0003】

WO 00/32767（特許文献1）は、受容体の細胞外部分のみから構成されており、グリコシル化されていない可溶性Fc受容体（sFcR）を記載している。膜貫通ドメインおよびシグナルペプチドの欠如のため、これらのタンパク質は、可溶性の形態で存在し、通常のFc受容体（FcR）のように細胞に結合していない。さらに、WO 00/32767（特許文献1）に記載されたsFcRは、組換え作製が可能であり、免疫系の他の成分に干渉することなく抗体のFc部分に結合する能力のため、自己免疫疾患の処置のために提案されている。WO 00/32767（特許文献1）は、いくつかのsFcRの結晶構造、およびこれらの結晶構造の助けによって、IgGのsFcRとの相互作用を阻害する物質を開発する可能性をさらに記載している。結晶構造の解明は、例えば、利用可能なコンピュータプログラムを使用したデータベースのスクリーニングによって、またはコンピュータ支援の薬物設計によって、そのような阻害剤を見出すことを可能にする。

【0004】

WO 03/043648（特許文献2）において定義された発明は、WO 00/32767（特許文献1）の知見をさらに発展させ、処置方法、具体的には、多発性硬化症（MS）、全身性エリテマトーデス（SLE）、および関節リウマチ（RA）のような疾患、ならびにナチュラルキラー（NK）細胞のレベルの上昇による疾患のための処置方法を提供する。該受容体は、原核生物において組換え作製され、従って、グリコシル化されていなかったにも関わらず、WO 03/043648（特許文献2）の発明者らは、非グリコシル化タンパク質は難溶性であると予想されるが、50mg/ml sFcγR受容体という比較的高い濃度で、可溶性の形態で、当該受容体が精製され得ることを、驚くべきことに見出した。

【0005】

WO 00/32767（特許文献1）、WO 03/043648（特許文献2）、およびその他の刊行物は、免疫系の防御反応におけるFcRの重要な役割を示唆している。病原体が血液循環に侵入した時には、抗体としても知られる免疫グロブリンがそれらに結合する。病原体に対する免疫応答はポリクローナルであるため、多数の抗体が産生され、病原体に結合し、免疫複合体（IC）の形成をもたらす。ICは、その後、免疫系の特異的エフェクター細胞（例えば、食細胞またはマクロファージ）によって貪食され、かくして循環系から除去される。貪食は、病原体と共にICを形成している抗体のFc部分が、前記エフェクター細胞上のFcRに結合することによって媒介される。ナチュラルキラー細胞、好酸球、およびマスト細胞といった免疫系のその他のエフェクター細胞も、FcRを表面上に保持しており、ICの結合によって、免疫応答を支える増殖因子または毒素といった保管されたメディエーターを放出する。

【0006】

これらのエフェクター細胞のFcRは、体液性免疫応答において様々なアイソタイプの免疫グロブリンに特異的に結合するシグナル伝達分子としても機能する。さらに、ナチュラルキラー細胞上に発現されたFcRは、抗体によってコーティングされた標的細胞の破壊（「抗体依存性細胞傷害」、ADCC）において重要な役割を果たす。

【0007】

しかしながら、病原体に対する防御におけるFcRの正の効果に加えて、特に炎症性疾患または自己免疫疾患として出現する、免疫系の望まれない刺激をもたらす、患者における自己抗体の存在によって引き起こされる過剰反応が起こる場合もある。身体の自己物質に対するそのような免疫反応は、依然として主要な医学的問題となっており、それらを処置するためのアプローチは存在するが、これらのアプローチは、全ての患者において等しく有効なわけではない。

【0008】

FcγRファミリーのメンバー、即ち、IgG型の抗体に特異的なFcRは、全て、免疫グロブリン関連ドメインのC2セットに関連した細胞外ドメインを保有しており、1個の膜貫通ドメインおよび可変長の細胞質ドメインを有する、膜内在性糖タンパク質である。FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、およびFcγRIII（CD16）と名付けられた3種のFcγ受容体型が、公知である。本発明は、好ましい態様において、FcγRII（CD32）に特に注目する。

【0009】

FcγRIIタンパク質は、IC内の複合体化されたIgGにのみ結合する40KDaの膜内在性糖タンパク質である。これらの受容体は、単球、マクロファージ、B細胞、NK細胞、好中球、マスト細胞、および血小板を含む全ての造血細胞上に存在する、最も広く発現されているFcγRである。3種のヒトFcγRII遺伝子（FcγRII-a、FcγRII-b、FcγRII-c）が存在し、それらは、全て、凝集物内または免疫複合体内のIgGに結合する。

【0010】

炎症は、身体の白血球が細菌およびウイルスなどの外来物質による感染に反応する過程である。それは、一般的には、影響を受けた組織の疼痛、腫脹、発熱、および発赤を特徴とする。サイトカインおよびプロスタグランジンとして公知のエフェクター物質は、この過程を制御し、秩序立った自己制限的なカスケードで、血液または影響を受けた組織へ放出される。そのようなエフェクター物質の放出は、損傷または感染の区域への血流を増加させる。エフェクター物質のいくつかは、組織への体液の漏出を引き起こし、腫脹をもたらす。この保護過程は、神経を刺激し、疼痛を引き起こし得る。これらの変化は、関連する区域において限定された期間で起こる時、身体の利益のために働く。

【0011】

自己免疫疾患において、患者の免疫系は、身体自身の（「自己」）タンパク質と外来タンパク質とを識別する能力を失っている。その結果、「自己」タンパク質を認識し、免疫複合体を形成する抗体が生成され、「自己」タンパク質は永久に産生され、外来として認識されるため、その免疫複合体は、免疫系を絶えず活性化する。この慢性状態は、何年もの間持続し、最終的には、重度の器官障害をもたらし、おそらくは、患者の死をもたらし得る。様々な方式で身体に影響を与える種々の自己免疫障害が存在する。例えば、多発性硬化症を有する個体においては、脳が影響を受け、クローン病を有する個体においては、腸が影響を受け、関節リウマチに罹患している個体においては、様々な関節の滑膜、骨、および軟骨が影響を受ける。自己免疫障害が進行すると、一つ以上の種類の身体組織の破壊、器官の異常成長、または器官機能の変化が起こり得る。自己免疫疾患は、単一の種類の器官もしくは組織に影響を与える場合もあるし、または複数の器官および組織に影響を与える場合もある。自己免疫障害によって一般的に影響を受ける器官および組織には、赤血球、血管、結合組織、内分泌腺（例えば、甲状腺または膵臓）、筋肉、関節、および皮膚が含まれる。

【0012】

炎症性障害および／または自己免疫障害の例には、原発性免疫性血小板減少症（ITP）、全身性エリテマトーデス（SLE）、関節リウマチ（RA）、自己免疫性溶血性貧血（AIHA）、糖尿病、尋常性天疱瘡、橋本甲状腺炎、自己免疫性内耳疾患、重症筋無力症、悪性貧血、アジソン病、皮膚筋炎、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、多発性硬化症、ライター症候群、グレーブス病、自己免疫性肝炎、家族性大腸腺腫症、および潰瘍性大腸炎が含まれるが、これらに限定されない。

【0013】

FcγRは、活性化型または阻害型であり得る機能によって、2つの一般的なクラスへ分類され得る。活性化型受容体は、コンセンサス配列Y-X₂-L/I-X_6-12-Y-X₂-I/Lを有する細胞質16アミノ酸免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）に関連している（Barrow and Trowsdale,EuJI,2006,36:1646-1653（非特許文献1））。このモチーフは、例えば、FcγRIIAに見出され得る。FcRの他方のクラスは、コンセンサス配列S/I/V/L-X-Y-X₂-I/V/Lを有する6アミノ酸阻害モチーフ（ITIM）を受容体の細胞質部分に含有している阻害型受容体である（Barrow and Trowsdale,EuJI,2006,36:1646-1653（非特許文献1））。そのような阻害型FcRの例は、FcγRIIBである。

【0014】

FcγRIIB（FcγRIIB）は、2種の阻害活性を有している。そのうちの1種は、ITIMモチーフに依存性であり、FcγRIIBがITAMを保持している受容体（例えば、FcγRIIA）にライゲートされた時に起こり、ITAMによって誘発されるカルシウム動員および細胞増殖の阻害をもたらす。FcγRIIBの第2の阻害作用は、アポトーシス促進シグナルを細胞質へ送達する受容体の同種凝集（FcγRIIBクラスター形成）を含む。アポトーシス促進シグナルは、B細胞においてのみ報告されており、B細胞受容体（BCR）へのFcγRIIBのライゲーションによって阻止され得る（JV Ravetch,S.Bolland,Annu Rev.Immunol.2001;19:275-90（非特許文献2））。

【0015】

上述のように、WO 03/043648（特許文献2）において、sFcγRIIBは、例えば、患者への注射のための合理的な体積の処置溶液の中に比較的多量のFcγ受容体が含まれ得る薬学的調製物において使用するために既に記載されている。可溶性のFcγ受容体、特に、sFcγRIIBは、抗体に結合することができるが、免疫系の他の成分には影響を与えないため、自己免疫疾患の処置のために提案されている。従って、可溶性Fc受容体は、血流中の抗体を中和することができ、それは、特に、自己免疫過程に対して減弱効果を及ぼす。WO 03/043648（特許文献2）に既に言及されている可能な適応には、そのような疾患のために従来使用されている処置方法の欠点を回避するための、多発性硬化症（MS）、全身性エリテマトーデス（SLE）、および関節リウマチ（RA）、ならびにNK細胞のレベルの上昇による疾患の処置のための可溶性Fcγ受容体が含まれる。

【0016】

WO 03/043648（特許文献2）の教示は、可溶性Fc受容体を使用して、50mg/mlまでの濃度の可溶性受容体を有する水性溶液を形成することができるという、そこで発見された事実に注目している。ある種の適用のためには、活性薬剤のそのような濃度は十分である。しかしながら、最近の研究において、自己免疫疾患の処置の成功のためには、患者の体重1kg当たり1mgより有意に高い、sFcγRIIBのようなsFcRの治療用量が、有益であるかまたはさらには必要であることが確立された。

【0017】

医薬の皮下投与は、活性薬剤を患者へ送達する、効率的で、比較的複雑でなく、簡便な方法であると考えられている。より高度の医療装置を必要とし、ほとんどの場合、医院または診療所での投与を必要とする静脈内注入と比較して、皮下投与は、患者自身によってすら容易に適用され得る。皮下投与は、作用の開始の遅延、即ち、半減期および最高濃度までの時間の増加ももたらすであろう。また、皮下送達の場合には、最高血漿中濃度が低下することも見出された。これらの効果は、患者の皮膚の下へ投与がなされ、そこから、活性薬剤が血流へ輸送されることに基づいている。約16〜20kDaより大きいタンパク質は、一般に、主としてリンパ系に取り込まれると考えられるが、このことは、標的B細胞集団がリンパ管において成熟し、存在するため、FcγRにとっての利点であり得る（Porter,C.J.H.and Charman,S.A.(2000),J.Pharm Sci.89,297-310（非特許文献3））。

【0018】

しかしながら、皮下投与経路は、好ましくは、1回の適用当たり1.0mlからおそらく1.5mlまでの注射体積に限定される（Gatlin,L.A.and Gatlin,C.A.B,(1999),Gapta,P.K.& Brazeau,G.A.,eds.,Interpharm Press,Denver,pp.401-425（非特許文献4））。従って、WO 03/043648（特許文献2）から公知の水性sFcγR溶液は、皮下投与のためには考慮され得なかった。むしろ、十分に高い受容体の濃度のため、水性溶液中の受容体の沈殿および不要に大きい結晶の形成、従って、針の詰まりおよび／または注射部位における疼痛を、この書類の教示から予想しなければならなかった。

【0019】

従って、期待されるあらゆる利点にも関わらず、皮下投与は、有望な処置経路とは考えられず、むしろ、静脈内への注射または注入が、唯一の実行可能な送達方法であると考えられた。

【0020】

従って、患者へのFc受容体のより複雑でなく面倒でない投与のための、そして自己免疫疾患のための皮下処置レジメンを可能にする十分に高い濃度で受容体を含有している可溶性Fc受容体、特に、可溶性FcγRIIBの水性製剤のための、手段および条件を提供することが、本発明の一つの目的であった。

【0021】

医薬のための通常の保管条件の下で24ヶ月を超えて安定しているすぐに使える形態で、あるいは、長期保管ならびに皮下適用において使用する前の容易で簡単な調整および再構成を可能にする形態で、高濃度可溶性Fc受容体のそのような水性製剤を提供することが、本発明のさらなる目的であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0022】

【特許文献1】WO 00/32767

【特許文献2】WO 03/043648

【非特許文献】

【0023】

【非特許文献1】Barrow and Trowsdale,EuJI,2006,36:1646-1653

【非特許文献2】JV Ravetch,S.Bolland,Annu Rev.Immunol.2001;19:275-90

【非特許文献3】Porter,C.J.H.and Charman,S.A.(2000),J.Pharm Sci.89,297-310

【非特許文献4】Gatlin,L.A.and Gatlin,C.A.B,(1999),Gapta,P.K.& Brazeau,G.A.,eds.,Interpharm Press,Denver,pp.401-425

【発明の概要】

【0024】

これらの目的は、生理学的に許容される緩衝物質を含有している水性緩衝溶液中に50mg/mlより高い濃度で可溶性Fc受容体（sFcR）を含有している製剤によって、本発明に従って解決された。

【0025】

本発明に至った研究において、従来の予想に反して、70mg/mlよりはるかに高い、好ましくは、150mg/mlより高い濃度で、適切な緩衝溶液に溶解した可溶性Fc受容体を提供することが可能であることが、驚くべきことに見出された。それによって、sFcRを、皮下適用のための薬学的組成物の形態でも提供することが初めて可能となる。非経口適用モードとしての皮下適用は、静脈内適用モードより単純で、迅速に適用可能である。上に言及されるように、患者自身ですら、皮下適用を実施することが可能である。

【0026】

皮下投与のためには、短く、一般的には細いカニューレが、必要とされる。本発明の高濃度製剤は、完全に溶解した均質の形態で、これらの細いカニューレの使用を可能にする許容される粘度で、またはこれらの細いカニューレを通過するために十分に小さい結晶を含有している結晶懸濁液として、sFcRを提供する。従って、患者の便宜は相当に増加し、受容体の投与は、皮下経路によって達成され得る。

【0027】

以下に記載される本発明の製剤は、Fc受容体の高い濃度による溶液の粘度の増加によって主として限定される最高値までの濃度で、可溶性FcR、特に、可溶性FcγRIIBを提供することを可能にする。適切な緩衝物質の選択および適切な浸透圧の調整によって、生理学的pHでの220mg/ml sFcγRIIB以上の安定化が、本発明の枠組み内で可能になる。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】図1は、変性pH範囲を決定するための実験の結果を示す。

【図2】図2は、10mMクエン酸、10mM NaCl（pH5.5）と比較して、10mMヒスチジン、10mM NaCl（pH6.7）の存在下で、husFcγRIIBがより容易に結晶し、結晶の収量がはるかに高いことを示す。

【図3】図3は、pHの関数として、10mMヒスチジン、10mM NaClにおいてhusFcγRIIB結晶化が実施された実験を示す。

【図4】図4は、示されたpHの10mMクエン酸、4.5％糖（2:1(w/w)ショ糖:マンニトール）、75mM NaCl中の0.5mg/mL husFcγRIIB（図4（a）および（c））、または示された量の糖（2:1(w/w)ショ糖:マンニトール）および塩が補足された10mMクエン酸（pH7.0）中の0.5mg/mL husFcγRIIB（図4（b）および（d））を使用して入手された、それぞれの結果を示す。

【図5】図5は、7.5％糖の添加は、およそ1℃、Tmを増加させた（10mMクエン酸におけるpH、糖、および塩濃度の関数としてのhusFcγRIIB融解温度の変化を示す。

【図6】図6は、37℃におけるクエン酸緩衝husFcγRIIB製剤の加速安定性を示す。

【図7】図7は、40℃でのクエン酸緩衝husFcγRIIB製剤の加速安定性を示す。

【図8】図8は、husFcγRIIBの存在下で遊離のポリソルベート20を決定する実験を示す。

【図9】図9は、10mMクエン酸、25mM NaCl（pH7.0）におけるhusFcγRIIBの溶液粘度を20℃で測定した結果を示す。

【図10】図10は、蛍光顕微鏡法によって決定されるような選択された製剤の粒子量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明に従って使用される生理学的に許容される緩衝物質は、適切な溶液の薬学的適用のために一般に使用される緩衝剤である。しかしながら、本発明の枠組み内では、使用される緩衝物質によって、溶液のpH値が、Fc受容体の溶解度に相当の影響を及ぼすことが見出された。特に、目的が結晶sFcRを含有していない製剤を提供することである場合には、Fc受容体の所望の溶解度を達成するため、選択された緩衝剤に応じて、pH値を決定された範囲内に、特に、特定の最適値に、調整しなければならない。

【0030】

正の電荷を有するアミノ酸および負の電荷を有するアミノ酸の存在のため、タンパク質自体が、緩衝剤として十分に作用し得ることが、さらに見出された。従って、例えば、タンパク質のアミノ酸側鎖のpK値に基づく適切なpH値を選択することによって、生理学的に許容される緩衝物質として作用するために適切な量のタンパク質が溶液中に存在する限り、別の緩衝物質の添加を省略することが可能である。

【0031】

本発明の好ましい態様において、製剤は、緩衝物質として、ヒスチジン緩衝剤、クエン酸緩衝剤、またはリン酸緩衝剤のうちの1種を含有している。しかしながら、ヒスチジン緩衝剤またはクエン酸緩衝剤のいずれかを用いて製剤を調製することが特に好ましい。いずれの場合にも、これらの緩衝溶液中のpH値の調整が、Fc受容体の溶解度の調節を可能にし、使用された緩衝物質に応じて、pH値を増加させるかまたは減少させることによって、高濃度のFc受容体を溶解させることができるが、結晶化を引き起こすこともできることが見出された。pH値の単なる調節によってsFcRの可溶性の形態と結晶の形態とを変化させるこの可能性は、薬学的組成物の適用可能性、保存、および保管安定性に関する調節を考慮すると、相当の利点を示唆する。

【0032】

例えば、販売許可の手続きにおいて、医薬の十分な保管安定性を立証しなければならない。これに関して、5℃の温度での少なくとも12ヶ月の保管の安定性データが、販売許可を請求する者によって含まれることが必要である。しかしながら、対応する条件の下で24ヶ月を超える保管安定性が達成されることが望ましく、有利である。そのため、言及された保管条件を考慮すると、薬学的薬剤の実質的な量、好ましくは、90％が、期間終了後に活性型として存在している必要がある。

【0033】

これに関して、本発明の製剤は、特定の利点を示す。例えば、それらは、溶解したFc受容体を排他的に含有しており、高い保管安定性を示す、液体の形態の高濃度sFcR製剤を提示することを可能にする。

【0034】

さらに、本発明の製剤は、固体の保管形態を提供するため、凍結乾燥に供されてもよい。そのような固体の形態は、液体製剤と比較して、さらに改善された保管安定性を示し得る。従って、そのような製剤は、本発明のさらなる主題である。

【0035】

凍結乾燥は、タンパク質の凍結乾燥のための当業者に公知の適切な様式で実施され得る。好ましくは、タンパク質分解を回避するため、可能な限り温和な条件が使用される。

【0036】

固体の形態から、再び完全に溶解した形態のFc受容体を提供するため、注射用水、生理食塩水、もしくは緩衝水性溶液の添加によって、すぐに使える液体製剤を容易に復元することもできるし、または所望により溶解度を調節する中間工程を選ぶこともできる。

【0037】

本発明の製剤の濃縮された形態も、本発明のさらなる主題である。そのような濃縮された形態は、例えば、液体の一部を溶解限度未満まで除去して、少なくともいくらかの結晶受容体を含有している製剤をもたらすことによって入手され得る。また、活性sFcRの所望の濃度、特に、sFcRが完全に溶解した形態で存在する濃度まで、注射用水、生理食塩水、もしくは緩衝水性溶液を添加することによって、そのような製剤からすぐに使える液体製剤へと、sFcRを再構成することもできる。

【0038】

本発明による製剤におけるFc受容体の溶解度のpH依存性のため、製剤は、Fc受容体を、pHの調節によって事実上完全に結晶化することができ、（例えば、沈降または遠心分離の後に）濃縮結晶懸濁液として入手することができるという付加的な利点を提供する。それによって入手可能な結晶は、特に、結晶化条件に応じて、極めて小さくなり得る（微結晶）。結晶化が速いほど、結晶は小さくなる。先行技術に反して、本発明は、可溶化されたsFcRのタンパク質微結晶への迅速でほぼ定量的な変換、およびその逆を可能にし、従って、それぞれの溶液および製剤の溶解特性を目的に合わせることを可能にする。これは、活性薬剤の優れた保管安定性、具体的には、極めて小さな保管スペースのみの必要性を保証するさらなる可能性である。活性薬剤は、次いで、適切なpH値を有する適切な緩衝水性溶液への溶解によって、完全にまたは主に可溶性の形態へ変換され得る。これは、例えば、医薬として適用する直前に、濃縮結晶懸濁液を適切な緩衝液と混合することによって行われ得る。あるいは、本発明は、受容体を、微結晶、即ち、カニューレまたは細い針を通過するために十分に小さい結晶へ変換する手段を提供するため、微結晶の懸濁液または製剤を、皮下適用によって直接投与することが可能である。そのような微結晶懸濁液の粘度は、高濃度液体製剤と比較してはるかに低く、タンパク質濃度の増加によって指数関数的には上昇しない。

【0039】

本発明の目的のため、本発明の説明に関連して上記に使用されたように、Fc受容体は、結晶が直径500μmより大きい平均サイズを有している時、「結晶」と見なされ、微結晶の形態は、直径500μm以下のサイズを有する微結晶を含有している。

【0040】

本発明は、直ちにまたは将来的に薬学的に使用するために適切な種々の形態で、高濃度の可溶性Fc受容体を提供することを初めて可能にする。上記に例示されたように、これは、すぐに使える溶解した形態で達成されてもよいし、またはそのような溶液から入手された固体、例えば、凍結乾燥物の形態で、もしくはpH値調節によって沈殿した微結晶の形態で達成されてもよい。それらは、次いで、所望のpH値の適切な緩衝溶液に高濃度のFc受容体が含有されている製剤がもたらされるよう、再可溶化によって再構成され得る。

【0041】

本発明の好ましい態様において、本発明の製剤は、Fc受容体としてsFcγ受容体を含有している。自己免疫疾患の処置の可能性に関しては、sFcγRII受容体、特に、sFcγRIIBを考慮しなければならない。従って、特に好ましい本発明の製剤は、適切な緩衝物質を含む薬学的に適用可能な溶液の中に可溶性FcγRIIB受容体を含有している。

【0042】

本発明の目的のため、FcγRIIB受容体は、先行技術、具体的には、特に、FcγRIIB、そして特に、sFcγRIIBに言及しているWO 00/32767およびWO 03/043648またはその他の書類に記載されるような配列を有している。さらに、その用語には、特に、N末端部分が異なっていてもよい受容体の形態が包含されるものとする。特に好ましいsFcγRIIBタンパク質は、SEQ ID NO:1に示される。この配列は、例えば、原核生物発現のために必要とされるが、産生されたタンパク質の大部分において、細菌の機序によって後に切除されるメチオニン残基を、N末端に含有している。従って、N末端メチオニンを欠くSEQ ID NO:1によるタンパク質も、本発明に包含され、N末端Metを含むタンパク質と含まないタンパク質との混合物も同様である。さらに、産生過程および細菌産生株の条件によって、N末端の5アミノ酸における付加的な変化が起こり得る。例えば、メチオニンに加えて、以下の残基が切除されてもよいし、またはノルロイシンのような他のアミノ酸にメチオニンが交換されてもよい。従って、N末端が異なっており、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列をコードするDNA配列を使用した産生過程に起因する、全てのこれらのタンパク質の混合物も、sFcγRIIBの本定義に、特に、husFcγRIIBという用語に包含される。

【0043】

さらなる好ましい態様において、FcγRIIBタンパク質は、SEQ ID NO:1のタンパク質との少なくとも90％の同一性を有する限り、本発明に包含されると見なされる。配列同一性の決定のためには、アミノ酸の最大の一致が提供されるよう、配列を整列させることによって、比較がなされる。特許請求の範囲に記載されたタンパク質における違いは、最初の10アミノ酸、最も好ましくは、最初の5アミノ酸でのみ起こることが、特に好ましい。タンパク質は、少なくとも95％のアミノ酸同一性を有しており、欠失、置換、および付加のうちの少なくとも1種に基づくアミノ酸の違いは、SEQ ID NO:1の最初の5アミノ酸において起こっていることが特に好ましい。

【0044】

特に好ましい態様において、本発明によるこの製剤は、60mg/mlより高い、より好ましくは、60〜80mg/mlより高い、さらに好ましくは、80mg/mlより高い、さらに好ましくは、100mg/mlより高い、特に好ましくは、150mg/mlより高い、最も好ましくは、200mg/mlより高い濃度で、sFc受容体、特に、sFcγRIIB受容体を含有している。

【0045】

本発明の製剤は、例えば、溶液のイオン強度の調整ならびに／または含有されている受容体タンパク質の可溶性および安定性の促進のために使用される薬学的に許容される物質を、任意で、さらに含有している。そのような物質は、当業者に公知である。イオン強度の調整のため、本発明の製剤は、任意で、塩、好ましくは、NaClを含有している。タンパク質の安定化のためには、ポリオール、特に、ショ糖またはマンニトールのような糖および糖アルコールが使用され得る。さらに、本発明の製剤は、好ましくは、薬学的適用のために適切な界面活性剤、例えば、ポリソルベートを含有している。

【0046】

緩衝物質は、好ましくは、0.1μM〜300mMの量で本発明の製剤に含有されている。より好ましい態様において、生理学的に許容される緩衝剤は、0.1〜150mM、特に、1〜50mMの量で存在する。

【0047】

少なくとも、製剤が患者への直接投与のためのものである限り、浸透圧（等張性）の調整のため、塩化ナトリウムのような塩が、好ましくは、生理学的浸透圧を調整するような量で、適切である。溶液の浸透圧は、広範囲に調整され得、Fc受容体の溶解度に対して顕著な効果を及ぼすことなく、10mOsm/kg〜600mOsm/kg以上に設定され得る。

【0048】

塩、好ましくは、NaClは、約0〜250mM、好ましくは、5〜200mM、最も好ましくは、10〜50mMの濃度で製剤中に存在する。

【0049】

ショ糖のようなポリオールは、本発明の製剤の中に必ずしも含有されないが、好ましい態様において、少なくとも1.0％、より好ましくは、少なくとも2.0％の量で存在する。ポリオールの量の好ましい上限は、およそ25％、より好ましくは、15％、最も好ましくは、8％である。糖は溶液中のタンパク質を安定化することが公知である。製剤の浸透圧を調節するため、好ましくは、等張にするため、塩と糖とのバランスを保つ必要がある。製剤中に含有されている糖が多いほど、添加され得る塩はより少なく、その逆も正しい。

【0050】

本発明に関連して好ましくは使用される界面活性剤の適切な量は、0.001〜0.1％、特に、0.005〜0.05％である。

【0051】

既に上記に言及されたように、本発明の枠組み内で得られた知見は、50mg/mlより多いFc受容体の含量のために、完全に溶解した形態または微結晶の形態のいずれかで、患者への投与のための受容体の所定の供給が可能となるよう、可溶性Fc受容体、特に、sFcγRIIBのための溶解条件の調節を可能にする。上記に言及されたように、完全に溶解した形態で、または少なくとも溶解した形態へ変換可能な形態で、可能な限り高い濃度を提供することが、患者への投与のためにしばしば有利である。

【0052】

微結晶sFcRを含有している製剤について、微結晶が投与後に完全に溶解し、生理学的効果を有する活性物質が利用可能となるような患者への投与も可能であり得る。その他の投与および保管のためには、むしろ、分解に対して、従って、活性の損失に対して特に安定している結晶の形態で、受容体を維持することが有利であり得る。

【0053】

従って、本発明の好ましい態様は、完全に液体であり、受容体が可溶化された形態または適切な微結晶の形態で存在する製剤である。

【0054】

本発明の特に好ましい製剤は、クエン酸緩衝溶液の中に可溶性FcγRIIB受容体を含有しており、6以上のpH値を保有する。pH値は、好ましくは、6.0〜7.5の範囲内で調整される。生理学的pH値を有するそのようなクエン酸緩衝溶液において、FcγRIIB受容体は、140mg/mlより高い濃度で可溶性である。生理学的pH値のため、そのような製剤は、投与の部位における疼痛のような副作用を引き起こすことなく、患者へ直接投与され得るという利点も有する。

【0055】

もう一つの好ましい態様において、可溶性FcγRIIB受容体は、5.2〜5.9のpH値を有するヒスチジン緩衝溶液の中に含有されている。ヒスチジン緩衝剤を使用する時、sFcγRIIBは、100mg/mlより高い濃度で可溶性である。

【0056】

およそ6.0のpHにおいて、受容体の溶解度はまだ比較的高いが、結晶の沈殿物が形成され始め、より高いpHにおいては、受容体の実質的に低い溶解度しか観察されない。

【0057】

上記の製剤は、いずれも、可溶化されたsFcγRIIB受容体の高い濃度を可能にし、これは、およそ220mg/mlまでの粘度によって制限されるレジメンで、言及されたクエン酸緩衝製剤およびヒスチジン緩衝製剤の両方について示された（内含されている実施例を参照すること）。

【0058】

本発明の製剤は、さらに、優れた凍結／解凍安定性特性を有し、2℃〜8℃の低温においても優れた安定性を有している。これらの溶液については、室温における安定性すら優れている。

【0059】

いずれの溶液も、患者への直接投与のためにも使用可能であるし、結晶を含有していてもよく、患者によって直接再構成可能な注射溶液の保管または生成のために便利である、凍結乾燥製剤または高濃度製剤の作製においても使用可能である。

【0060】

直接投与のためには、既に上記に言及されたように、生理学的pH値を有するクエン酸緩衝溶液が、特に好ましい。

【0061】

本発明の特に好ましいさらなる主題は、結晶の形態の受容体を含有している製剤である。そのような製剤は、好ましくは、5.2〜5.9のpH値を有するクエン酸緩衝懸濁液あるいは6.0〜7.5のpH値のヒスチジン緩衝懸濁液として具体化される。そのような懸濁液は、例えば、好ましくは、患者への投与のため、pH調整によって高濃度の可溶化された受容体を含有している製剤へ変換され得る保管安定形態として使用され得る。さらに、高濃度結晶懸濁液を入手するため、それらを濃縮することもできるし、または溶液の分離によって、それらから受容体を入手することもできる。受容体は、適切なpH値の適切な緩衝液での再構成によって、完全に溶解した形態で回収され得る。

【0062】

記載された本発明の製剤、および、ある種の緩衝物質を使用して、pH値に応じて、異なる可溶性レベルのFc受容体を実現することができるという知見は、一方では、患者への皮下投与のためのすぐに使える注射剤の提供を可能にし、他方では、結晶Fc受容体を含有している特に保管安定性の高い別形態の提供を可能にする。適切な溶液の単純な添加によって、高濃度の可溶性受容体を含有しているすぐに使える形態へ変換され得る、受容体の凍結乾燥物の形態またはその他の固体の形態も、提供される。

【0063】

従って、本発明のさらなる主題は、薬学的に許容されるさらなる賦形剤および／またはアジュバントおよび／または担体が存在していてもよい、上記のような本発明による製剤を含む薬学的組成物である。特に好ましい態様において、これらの薬学的組成物は、有効量の可溶性Fc受容体の皮下注射のため、特に、自己免疫疾患の処置のため、直接適用可能である。

【0064】

一つの好ましい態様において、薬学的組成物は、好ましくは、適切な緩衝物質の中に、生理学的pH値で、十分な量の完全に溶解したsFc受容体を含有している。そのような薬学的組成物は、すぐに使える医薬であり、患者へ直接適用され得る。溶解した可溶性受容体は、例えば、患者のリンパ循環系へ容易に吸収され、直接、そこで有効であるか、または血液もしくは体液の循環によって患者の体内で輸送された後に有効となる。

【0065】

あるいは、薬学的組成物は、高濃度の、少なくとも、部分的に微結晶または結晶の形態で、受容体を含有することができる。薬学的組成物は、必要に応じて、適切な緩衝溶液によって希釈され、有効量のFc受容体の皮下注射のために、再び、特に適切になる。

【0066】

本発明の説明に関連して既に上記に説明されたように、Fc受容体は、結晶が直径500μmより大きい平均サイズを有している時、「結晶」と見なされ、微結晶の形態は、直径500μm以下のサイズを有する微結晶を含有している。患者への直接適用が考慮される限り、当然、完全に溶解したFc受容体を含有している薬学的組成物が使用され得るが、完全にまたは部分的に微結晶の形態でFc受容体を含む製剤を含有している薬学的組成物も、薬学的適用において長所を有する。これらの微結晶は、皮下適用のための針を詰まらせないために十分に小さい。微結晶を含有している溶液の使用は、例えば、患者の全身への活性sFc受容体の放出の遅延または徐放のために有益であり得、ある種の状況において、そのような微結晶の形態も、好ましい薬学的組成物と見なされ得る。

【0067】

Fc受容体の微結晶または結晶の形態を含有している本発明の薬学的組成物は、例えば、限外ろ過のような従来の濃縮技術によって、その溶解度を超えてsFcを濃縮することによって入手される。ある量の結晶または微結晶を含有している液体の形態で医薬を維持することが可能である。結晶または微結晶を入手するために機械的な濃縮法を使用する代わりに、受容体が著しく低い溶解度を有する値へpHを調整することによって、受容体を結晶化することも可能であり、本発明の好ましい態様である。沈殿した結晶または微結晶を、溶液から分離し、保管およびその後の再構成または直接投与のために使用することができる。受容体製剤の固体の形態は、特に、保管安定性が高く、少なくとも24ヶ月を超えて、有効性を維持する。

【0068】

そのような場合、薬学的組成物は、固体または高濃度のsFcRに加えて、注射可能溶液の再構成のために適切な液体も含む、薬学的キット形式で、便利に提供される。従って、本発明のさらなる主題は、可溶性Fc受容体の結晶または凍結乾燥物と、注射溶液の再構成のための緩衝溶液または単純な水のような適切な薬学的に許容される液体とを、適切な別々の保管ユニットに含有している薬学的キットである。

【0069】

sFcR受容体および注射溶液の再構成のための緩衝溶液が、単純な混合に適した装置で提供され、かつ汚染に対して十分に保護されている場合、それは、本発明の薬学的キットのために特に好ましい。好ましくは、キットは、リン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤に基づく緩衝溶液を含有している。緩衝溶液について、Fc受容体の最適の溶解度を提供するため、pHが調節されることは、さらに好ましい。本発明の特に好ましい態様において、緩衝溶液は、6より高い、特に、6.1〜7.5のpHを有するクエン酸緩衝溶液、または6.0未満、特に、5.2〜5.9のpHを有するヒスチジン緩衝溶液である。クエン酸緩衝溶液は、本発明による薬学的キットに含有される最も好ましい緩衝液である。

【0070】

薬学的キット内に含有される緩衝溶液の量は、キット中の固体のまたは濃縮されたsFcRの量によって調節される。sFc受容体の完全溶解が望まれるか、いくらかの量の微結晶を維持することが望まれるかに応じて、対応する緩衝液が、適切な液体の量で選択され、溶液のpHも、本明細書に提供されるsFcRの溶解度に関する教示に従って調節される。

【0071】

本発明のさらなる主題は、自己免疫疾患の予防または処置のための本発明の製剤、薬学的組成物、および薬学的キットの使用である。より具体的には、本発明は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、原発性免疫性血小板減少症、および自己免疫性溶血性貧血（AIHA）の予防または処置の枠組みにおいて使用するためのものである。さらに、製剤、薬学的薬剤、および薬学的キットは、炎症性障害の処置のために使用され得る。本発明の主題は、必要性が既に記載されているかまたは将来的に適切であると考えられる全ての適応症のためのFc受容体の適用を可能にする。本発明の製剤および薬学的組成物およびキットは、特に、極めて効率的であり、患者へ（または患者によって）容易に適用可能である皮下投与を可能にする。特に多い量および高い濃度のFc受容体を投与することが可能であることは、本発明の具体的な利点である。

【0072】

以下の実施例は、本発明およびその有利な効果および態様をさらに説明するものである。

【実施例】

【0073】

実施例：皮下送達のために適切な高濃度液体husFcγRIIb製剤の開発
1. 材料
husFcγRIIB（SEQ ID NO:1に示されるアミノ酸配列を有する可溶性ヒトFcγRIIB受容体）の以下の溶液を、全ての実験のため、親材料として使用した：
（a）注入用の溶液のためのhusFcγRIIB 5mg/ml濃縮物
5.3mM NaH₂PO₄、1.94mM KH₂PO₄、150mM NaCl、2％(w/v)マンニトール、0.005％ポリソルベート20（pH6.5）中の5mg/mL husFcγRIIB
（b）注入用の溶液のためのhusFcγRIIB 20mg/ml濃縮物
20mMヒスチジン、150mM NaCl、2％(w/v)ショ糖、1％(w/v)マンニトール、0.005％ポリソルベート20（pH6.5）中の20mg/mL husFcγRIIB

【0074】

少なくとも示された等級の以下の化学物質を使用した：

【0075】

2. 方法
（a）紫外可視分光法によるhusFcγRIIB含量
試料を、UVマイクロキュベット（UV cuvette micro、Plastibrand、Brand）に移し、それぞれの緩衝液をブランクとして使用して、分光光度計（Cary 100、Varian）によって吸光度を測定した。husFcγRIIB濃度を、以下の方程式によって計算した：
husFcγRIIB濃度［mg/mL］＝(A₂₈₀−A₃₂₀)×DF×0.64
DF≡希釈係数

【0076】

（b）陽イオン交換クロマトグラフィによるhusFcγRIIB緩衝液交換
1000〜1800mgのhusFcγRIIB（注入用の溶液のためのhusFcγRIIB 5mg/mL濃縮物）を、伝導率が5.0±0.1mS/cmに達するまで、10mMクエン酸/NaOH（pH6.5）によって注意深く希釈した。希釈されたタンパク質を、ろ過し（0.2μm DuraporeメンブレンPVDF、親水性、47mm、Millipore）、10mMクエン酸/NaOH、20mM NaCl（pH6.5）で平衡化された57mL SP Sepharose HP陽イオン交換（CEX）樹脂（26×107mm、GE Healthcare；17.5〜31.6mgのhusFcγRIIB/mL樹脂に等しい）へ5.5mL/分でロードした。結合したタンパク質を、200mLの10mMクエン酸/NaOH、20mM NaCl（pH6.5）によって5.5mL/分で洗浄し、10mMクエン酸/NaOH（pH6.5）中20mM〜600mM NaClの範囲の300mL直線勾配によって溶出させた。OD₂₈₀が250mAU（AU：吸光単位）を越えた後、溶出液収集を開始し、200mAU未満に低下した後、中止した（1cm光路長、Akta Explorer 100、GE Healthcare）。カラムを100mLの1M NaClによって再生させ、150mLのMilliQ H₂O（超純水、Millipore Corp.）によって洗浄し、さらに使用するまで20％エタノール中に保管した。紫外可視分光法によるhusFcγRIIB含量測定の後、溶出液をろ過し（Millex 33mm、0.2μm Durapore PVDF（フッ化ポリビニリデン）、親水性、いずれもMillipore Corp.）、等分し、液体窒素中で急速凍結させ、使用するまで-70℃以下で保管した。

【0077】

10mMクエン酸/NaOH、20mM NaClおよび10mMクエン酸/NaOH、600mM NaClで測定された伝導率と、溶出液の平均伝導率を相関させることによって、NaCl含量を計算した。

【0078】

同様に、10mMヒスチジン/HClを緩衝種として使用して、ヒスチジン緩衝husFcγRIIBを調製した。

【0079】

（c）pH安定性スクリーニング
20mMヒスチジン、324mM NaCl（pH6.5）中の濃縮husFcγRIIB溶液を、適切なストック溶液を使用して、0.5mg/mL husFcγRIIB、20mMヒスチジン、150mM NaCl、2.5×Sypro Orange（DMSO中5000×、Molecular Probes（商標）、Invitrogen）に調整した。0.2M HClまたは0.2M NaOHによって、実験的滴定曲線に基づき、溶液のpHをpH4〜pH12の間に調整した。40μLの溶液を、封鎖された96穴ハーフエリアウェルプレート（μクリア、黒、中結合；Greiner BioOne）において25℃で3時間インキュベートし、Sypro Orange蛍光についてアッセイした（励起485nm、放射590nm、ゲイン60、ラグタイム0μs、インテグレーションタイム40μs；TECAN Spectrofluor plus）。

【0080】

（d）高濃度製剤の調製
ヒスチジン緩衝またはクエン酸緩衝のhusFcγRIIB（初期濃度およそ200〜300mM NaCl）の必要とされるNaCl含量を、適切な緩衝液（10mMクエン酸または10mMヒスチジン（pH6.5））による希釈およびその後の限外ろ過（Vivaspin 20、5kDa MWCO、Sartorius）によって調整した。加工体積を小さくしておくため、その手順を全部で3サイクルまで繰り返した。最終希釈の後、pHを測定し（pHメーターHI8314、pH電極HI1217、Hanna instruments）、適切な緩衝液中の0.2M NaOHまたは0.2M HClによって調整し、タンパク質溶液を濃縮した。husFcγRIIB含量をトリプリケートで紫外可視分光法によって測定し、husFcγRIIB濃度を適切な緩衝液によって調整し、溶液をろ過した（Ultrafree MC、0.2μm Durapore PVDF、親水性、Millipore）。

【0081】

（e）384穴フォーマットでのhusFcγRIIB溶解度スクリーニング
緩衝種、pH、塩濃度、および糖／ポリオール濃度に関係した高濃度husFcγRIIB溶液の溶解度を、384穴フォーマット（μクリア、白色、非結合、Greiner BioOne）において、1ウェル当たり30μLを使用して査定した。ろ過されたストック溶液の各ウェルへの直接添加によって最終製剤を調製した。以下のストック溶液を使用した：10mMクエン酸（pH7.0）または10mMヒスチジン（pH5.5）のいずれかにおける100〜195mg/mL husFcγRIIB、1.5M NaCl、および30％(w/v)ショ糖＋15％(w/v)マンニトール。各溶液に、0.01％(w/w)ポリソルベート20を追加し、スクリーニングに応じて、10〜50mM NaClを追加した。

【0082】

各ウェルのpHを、0.5M〜0.75M HClまたはNaOHによって調整した。必要とされる酸または塩基の量は、husFcγRIIB（pK_a＝6.00）の9個のヒスチジン残基が全て付加的な緩衝能力を提供すると仮定した理論上の滴定曲線に基づき計算された。プレートを遠心分離し（500g、1分）、接着テープ（microtest tape、permacel、neo-lab）によって封鎖し、暗所で5±3℃で保管した。

【0083】

各製剤の視覚的な外観を、光学顕微鏡法（Axiovert 25f、Carl Zeiss）によって査定し、自由尺度に従ってランク付けした（0＝結晶は存在しない；1＝いくつかの結晶が存在するが、ほとんど可視でない；2＝いくつかの結晶が明白に可視である； 3＝1ウェル当たり30個を超える結晶が明白に可視である；4＝多数の結晶の不完全な層が存在する（ウェルは完全には覆われていない）；5＝多数の結晶の完全な層が存在する（ウェルが完全に覆われている）。

【0084】

溶解した塩、糖、およびタンパク質を考慮に入れて、各製剤の浸透圧を、以下の方程式に従って計算した：

式中、v_iは、I^th溶質の1分子の解離によって形成される粒子の数であり、m_iはI^th溶質のモル濃度である。単純のため、各溶質のモル浸透圧係数F_m,iは1に等しいと仮定した。

【0085】

（f）husFcγRIIBの小規模結晶化
10mMヒスチジン、10mM NaCl、0.01％ポリソルベート20（pH5.5）中50〜140mg/mLの10μL〜450μLのhusFcγRIIBを、1.5mLポリプロピレン反応チューブにおいて、適切な希釈剤によって、10mMヒスチジン、10mM NaCl、0.01％ポリソルベート20中40mg/mL husFcγRIIBへ希釈した。4.38〜6.23体積％（希釈剤の添加後の最終体積）の0.3M NaOHの添加によって、pHを6.5〜7.2に調整した。必要とされる酸または塩基の量は、husFcγRIIB（pK_a＝6.00）の9個のヒスチジン残基が全て付加的な緩衝能力を提供すると仮定した理論上の滴定曲線に基づき計算された。

【0086】

（g）示差走査蛍光光度法
0.5mg/mL husFcγRIIBを含有している各製剤120μLを、上記の2（e）に記載された手順と同様に、1.5mL試験管において調製した。Sypro Orange（DMSO中5000×、Molecular Probes（商標）、Invitrogen）を、適切な緩衝液で、200×ストックを使用して、2.5×最終濃度で添加した。各製剤30μLをウェルプレート（MicroAmp 96穴光学反応プレート、Applied Biosystems）へトリプリケートで移し、プレートを接着テープ（MicroAmp光学接着フィルム、Applied Biosystems）によって封鎖した。プレートを、1℃/分の勾配による19℃から90℃への温度上昇に供し、610nmにおける蛍光放射を記録した（7300 Real Time PCR system、Applied Biosystems）。蛍光を時間に関して微分し、スプラインを計算し、最初の検出された極大を、husFcγRIIBの融解温度として報告した（Origin 8.0、OriginLab）。

【0087】

（h）384穴フォーマットでの濁度スクリーニング
husFcγRIIB製剤を、上記の2（3)に記載された手順と同様に、1.5mL試験管において調製した。30μLの各製剤を384穴プレート（μクリア、白色、非結合、Greiner）へデュプリケートに移し、プレートを接着テープ（microtest tape、permacel、neo-lab）によって封鎖し、インキュベータ内に置いた。対照として、それぞれのプラセボ溶液を調製した。濁度を、360nmで測定した（Spectrafluor、バンドパスフィルター360/35nm、3フラッシュ、Tecan）。水の凝縮による測定の妨害を回避するため、プレートリーダを、アッセイ温度へ予め加熱した。

【0088】

（i）圧力低下測定による動的粘度
液体がフローチャンネル（m-Vroc、Rheosense）を流れる際の圧力低下を測定することによって、husFcγRIIB含有製剤の動的粘度を決定した。各測定のため、製剤を含有している100μLを、200μLピペットによって100μL気密シリンジ（Hamilton）のシリンダに充填した。シリンジを流量計へ取り付け、80μLを、50μL/分の流速および20℃でインジェクトした。

【0089】

（j）定量的ポリソルベート20アッセイ
Brown and Hayes,(1955)Analyst 80,755-767によって最初に記載された比色定量アッセイに基づく修飾型のプロトコルによって、ポリソルベート含量を決定した。分析される溶液500μLを、1.5mLポリプロピレンチューブ（VWR）で500μLの酢酸エチルによって3回抽出した。相分離を加速するため、チューブを遠心分離した（20000g、5分、25℃）。有機上清を、HPLCバイアル（ND9、ねじ山付き、円錐底、PTFEスクリューキャップ、VWR）において合わせ、溶媒を蒸発させた（25℃、10mbar、0.5時間〜1時間）。残余固体を、800μLの試薬溶液（水中の100mM Co(N0₃)₂、2.63M NH₄SCN）に懸濁させ、150μLのCHCl₃によって抽出した。100μLのCHCl₃抽出物を石英UVマイクロキュベット（Hellma）に移し、200〜800nmからのスペクトルを測定し（8453ダイオードアレイ分光光度計、Agilent）、530nmにおける吸光度によって補正された620nmにおける吸光度を記録した。ブランクとして、ポリソルベート20を含有していない等しい溶液の抽出物を使用した。各試料をデュプリケートで調製した。それぞれの緩衝液における0〜0.006％(w/w)ポリソルベート20からの標準曲線に基づき、ポリソルベート20含量を決定した。

【0090】

（k）凍結乾燥
5mMクエン酸、10〜25mM NaCl、2〜8％(w/v)ショ糖、トレハロース、またはマンニトール、および0.005〜0.01％(w/v) ポリソルベート20中に15〜120mg/mL husFcγRIIBを含有している59の製剤を調製し、400μLを1.5mL透明HPLCバイアル（32×11.6 mm、広口径、VWR）に充填した。バイアルを、フリーズドライヤーEpsilon 2-12D FD02（Martin Christ、Osterrode、Germany）を使用して、保存的な凍結乾燥サイクルに供した。フリーズドライ過程の間の真空は、MKS Capacitance Manometerによって制御された。試料を-45℃で凍結させ、一次乾燥を45℃〜15℃、0.12mbarで15時間実施し、二次乾燥を15℃〜20℃、0.12mbarで10時間実施した。凍結乾燥物を、100〜400μLの注射用水で再構成した。その溶液を、視覚的検査、濁度測定、および蛍光顕微鏡法によって、粒子の形成に関して分析した。簡単に説明すると、蛍光顕微鏡検査のため、50μLのhusFcγRIIB含有溶液を384穴プレート（μクリア、白色、非結合、Greiner）に置き、5mMクエン酸、10mM NaCl（pH6.7）中の25×Sypro Orange（DMSO中5000×、Molecular Probes（商標）、Invitrogen）5μL と混合した。プレートを25℃で10分間インキュベートし、遠心分離し（1000g、3分）、各製剤の外観を、蛍光顕微鏡法（Axiovert25f、励起フィルター470/20nm、二色493nm、放射フィルター503〜530nm、Carl Zeiss）によって査定した。

【0091】

3. 結果
（a）高濃度husFcγRIIB溶液のためのpH範囲および緩衝種の定義
アンフォールドしたタンパク質の存在の指標としてSypro Orangeを使用して、husFcγRIIBを変性させるpH範囲を決定した。Sypro Orangeは、疎水性構造への結合後に、蛍光放射が強く増加する環境感受性色素である（Layton & Hellinga,2010,Biochemistry 49(51),10831-10841）。図1は、変性pH範囲を決定するための実験の結果を示す。従って、20mMヒスチジン、150mM NaCl（白丸）およびブランク緩衝液（＋）中の0.5mg/mL husFcγRIIBを、室温で3時間、それぞれのpHでインキュベートした。Sypro Orange蛍光の増加は、変性したhusFcγRIIBの存在を示した。図1に示されるように、husFcγRIIBはpH5.2から少なくともpH11までアンフォールドしなかった。

【0092】

皮下投与の際の疼痛を防止するため、投与される溶液は、生理学的範囲内のpHを有しているべきである。この範囲において緩衝作用を示し、一般に安全と見なされている典型的な緩衝種には、ヒスチジン（pkaおよそ6.0）、クエン酸（pKa₃およそ6.4）、およびリン酸（pKa₂およそ7.2）が含まれる。凍結／解凍中のpHシフトを促進する傾向のため（MacKenzie,1977）、リン酸はその後の溶解度スクリーニングに含めなかった。

【0093】

タンパク質沈殿に関して限定されるhusFcγRIIB濃度を決定する初期の試みにおいて、可視の沈殿物が形成されるまで、10mMヒスチジンまたは10mMクエン酸および10mM NaClの存在下での限外ろ過によって、husFcγRIIBを濃縮した。表1に示されるように、ヒスチジン緩衝husFcγRIIBは、pH5.5から6.0までのわずかに酸性の範囲において増加した溶解度を示し、緩衝種としてのクエン酸は、pH6.5付近のほぼ中性のpH範囲において可溶性を提供した。要約すると、様々なpHにおけるhusFcγRIIBの溶解度は、概して使用される緩衝種に依存性である。顕微鏡法によって、沈殿物が針状晶から構成されていることが示された。

【0094】

（表１）低いイオン強度、pH5.5〜7.5における10mMヒスチジンまたは10mMクエン酸におけるhusFcγRIIB溶解限度（mg/mL）。溶液が濁るまで、限外ろ過によって、husFcγRIIBを濃縮した。ヒスチジン緩衝husFcγRIIBは、pH6.0、6.5、および7.0で沈殿し、クエン酸緩衝husFcγRIIBは、pH5.5およびpH6.0で沈殿した。沈降物はhusFcγRIIB結晶として同定された。

【0095】

（b）husFcγRIIBの結晶化
ヒスチジン緩衝husFcγRIIBは、低いイオン強度で、pH5.5で、100mg/mLを超えて可溶性のままであり、中和によって結晶化され得るが、反対に、クエン酸緩衝husFcγRIIBは、低いイオン強度で、中性pHで、100mg/mLを超えて可溶性のままであり、温和な酸性化によって結晶化され得る（表1）。さらなる試験において、husFcγRIIBの結晶化を、緩衝液中の糖およびNaClの存在および量への依存に関して調査した。husFcγRIIB結晶化を、NaClおよび糖（2:1ショ糖:マンニトール）の濃度の関数として、10mMヒスチジン（pH6.7）（図2a）または10mMクエン酸（pH5.5）（図2b）において実施した。それぞれ、10mMヒスチジン、10mM NaCl（pH5.5）または10mMクエン酸、10mM NaCl（pH7.0）中のhusFcγRIIBを、限外ろ過によって140mg/mLへ濃縮し、適切なストック溶液によって40mg/mLへ希釈した。ヒスチジン緩衝husFcγRIIBの場合には、2〜8℃で3日後に上清中のhusFcγRIIB濃度を測定することによって、結晶の収量を決定した。クエン酸緩衝husFcγRIIBの場合には、10日目まで結晶成長が検出されなかった。従って、2.8℃で14日後に結晶の収量を決定した。各溶液は、0.01％ポリソルベート20を含有していた。

【0096】

図2は、10mMクエン酸、10mM NaCl（pH5.5）と比較して、10mMヒスチジン、10mM NaCl（pH6.7）の存在下で、husFcγRIIBがより容易に結晶し、結晶の収量がはるかに高いことを示す。塩化ナトリウム濃度の10mMから5mMへのさらなる低下は、緩衝種としてヒスチジンを使用した時には、結晶収量のわずかな増加をもたらしたが、クエン酸緩衝液を使用した時には、強力な効果を示した。5mM未満への塩濃度の低下および／またはpHの低下は、クエン酸の存在下での結晶化過程をさらに刺激する可能性がある。NaCl濃度の増加、または5％を超えるポリオール、例えば、ショ糖もしくはマンニトールの添加は、結晶化過程を阻害した。

【0097】

図3は、pHの関数として、10mMヒスチジン、10mM NaClにおいてhusFcγRIIB結晶化が実施された実験を示す。10mMヒスチジン、10mM NaCl（pH5.5）中のhusFcγRIIBを、限外ろ過によって140mg/mLに濃縮し、適切なストック溶液によって40mg/mLに希釈した。2.8℃で3日後に上清中のhusFcγRIIB濃度を測定することによって、結晶収量を決定した。各溶液は0.01％ポリソルベート20を含有していた。

【0098】

少なくとも0.5単位のpH範囲内で、93％を超えるヒスチジン緩衝husFcγRIIBが結晶化され得る。40mg/mLの全husFcγRIIB濃度で、10mMヒスチジン、10mM NaCl（pH6.7〜7.2）におけるhusFcγRIIBの溶解限度は、2.8mg/mL未満である。pH6.9で、結晶化は、25℃で1時間未満で完全であった。

【0099】

（c）husFcγRIIB溶解度スクリーニング
いわゆる溶解度スイートスポット、即ち、husFcγRIIBが100mg/mLを超えて可溶性のままであり結晶化しない条件を定義するため、様々なhusFcγRIIB製剤を384穴マイクロタイタープレートにおいて調製し、2〜8℃で少なくとも4週間インキュベートした。スクリーニングに含まれたパラメータは、husFcγRIIB濃度（70、100、120、および150mg/mL）、緩衝種（ヒスチジンまたはクエン酸）、pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、NaCl濃度（10〜225mM）、ならびに糖含量（0〜7.5％）であった。70mg/mL（表2および表5）ならびに100mg/mL husFcγRIIB（表3および表6）における一次スクリーニングを、2つの糖レベル（0％または3％）および4つの異なるNaCl濃度（10、50、225mM）で実施した。

【0100】

基本的に、これらのプレスクリーニングは、上述の濃度スクリーニング（実施例2a）および結晶化スクリーニング（実施例2b）において既に入手された結果を再現した。ヒスチジン緩衝husFcγRIIBは、pH5.5より上で結晶化し、クエン酸緩衝husFcγRIIBは、pH5.5〜6.0で結晶化する。NaClまたは糖の濃度の増加は、いずれの場合にも結晶化過程を低下させた。

【0101】

120mg/mLおよび150mg/mL husFcγRIIBにおける全てのその後のスクリーニングには、血液と等張である、即ち、308mOsmol/kg程度の計算浸透圧を有する製剤のみを含めた。その理由のため、高い糖濃度を、低いNaClの濃度とマッチさせるか、またはその逆とした。120mg/mL husFcγRIIBを含むヒスチジンに基づく製剤は、中性pHおよび高いイオン強度の下でhusFcγRIIBの結晶化を防止することができたが、150mg/mL husFcγRIIBのヒスチジンに基づく製剤は、一つの例外を除き、全て、2〜8℃で4週間後に強力な結晶成長を示した（表4）。他方、クエン酸に基づく製剤は、pH6.5〜7.5で、試験された全ての糖／塩組み合わせで、150mg/mL husFcγRIIBまで安定していた（表7）。

【0102】

従って、クエン酸緩衝husFcγRIIBは、皮下適用のために適切な、即ち、生理学的なpHおよび張度を有する高濃度液体製剤の開発の最良の基本を表す。

【0103】

（表２）70mg/mL husFcγRIIBおよび2〜8℃におけるヒスチジンに基づく溶解度スクリーニング。各製剤の視覚的な外観を、光学顕微鏡法によって査定し、自由尺度に従ってランク付けした（0＝結晶は存在しない；1＝いくつかの結晶が存在するが、ほとんど可視でない；2＝いくつかの結晶が明白に可視である； 3＝1ウェル当たり30個を超える結晶が明白に可視である；4＝多数の結晶の層が存在する（ウェルは完全には覆われていない）；5＝多数の結晶の層が存在する（ウェルが完全に覆われている）。

【0104】

（表３）100mg/mL husFcγRIIBおよび2〜8℃におけるヒスチジンに基づく溶解度スクリーニング。各製剤の視覚的な外観を、光学顕微鏡法によって査定し、自由尺度に従ってランク付けした（0＝結晶は存在しない；1＝いくつかの結晶が存在するが、ほとんど可視でない；2＝いくつかの結晶が明白に可視である； 3＝1ウェル当たり30個を超える結晶が明白に可視である；4＝多数の結晶の層が存在する（ウェルは完全には覆われていない）；5＝多数の結晶の層が存在する（ウェルが完全に覆われている）。

【0105】

（表４）120mg/mL/150mg/mL husFcγRIIBおよび2〜8℃におけるヒスチジンに基づく溶解度スクリーニング。各製剤の視覚的な外観を、光学顕微鏡法によって査定し、自由尺度に従ってランク付けした（0＝結晶は存在しない；1＝いくつかの結晶が存在するが、ほとんど可視でない；2＝いくつかの結晶が明白に可視である； 3＝1ウェル当たり30個を超える結晶が明白に可視である；4＝多数の結晶の層が存在する（ウェルは完全には覆われていない）；5＝多数の結晶の層が存在する（ウェルが完全に覆われている）。

【0106】

（表５）70mg/mL husFcγRIIBおよび2〜8℃におけるクエン酸に基づく溶解度スクリーニング。各製剤の視覚的な外観を、光学顕微鏡法によって査定し、自由尺度に従ってランク付けした（0＝結晶は存在しない；1＝いくつかの結晶が存在するが、ほとんど可視でない；2＝いくつかの結晶が明白に可視である； 3＝1ウェル当たり30個を超える結晶が明白に可視である；4＝多数の結晶の層が存在する（ウェルは完全には覆われていない）；5＝多数の結晶の層が存在する（ウェルが完全に覆われている）。

【0107】

（表６）100mg/mL husFcγRIIBおよび2〜8℃におけるクエン酸に基づく溶解度スクリーニング。各製剤の視覚的な外観を、光学顕微鏡法によって査定し、自由尺度に従ってランク付けした（0＝結晶は存在しない；1＝いくつかの結晶が存在するが、ほとんど可視でない；2＝いくつかの結晶が明白に可視である； 3＝1ウェル当たり30個を超える結晶が明白に可視である；4＝多数の結晶の不完全な層が存在する（ウェルは完全には覆われていない）；5＝多数の結晶の完全な層が存在する（ウェルが完全に覆われている）。

【0108】

（表７）120mg/mL/150mg/mL husFcγRIIBおよび2〜8℃におけるクエン酸に基づく溶解度スクリーニング。各製剤の視覚的な外観を、光学顕微鏡法によって査定し、自由尺度に従ってランク付けした（0＝結晶は存在しない；1＝いくつかの結晶が存在するが、ほとんど可視でない；2＝いくつかの結晶が明白に可視である； 3＝1ウェル当たり30個を超える結晶が明白に可視である；4＝多数の結晶の層が存在する（ウェルは完全には覆われていない）；5＝多数の結晶の層が存在する（ウェルが完全に覆われている）。

【0109】

（d）高濃度husFcγRIIB製剤の熱安定性
変性タンパク質の凝集物および粒子の形成は、高濃度タンパク質製剤の開発のために主要な障壁となり得る（Shire et al.,2010,Chapter 15.High-concentration antibody formulations.In Formulation and Process Development Strategies for Manufacturing Biopharmaceuticals.Jameel,F.& Hershenson,S.,eds.,John Wiley,Hoboken,NJ）。その理由のため、熱ストレスの存在下でhusFcγRIIBの未変性構造を保存し、従って、変性凝集を抑止する能力に関して、製剤候補（実施例2cを参照すること）を評価した。

【0110】

最初に、クエン酸緩衝husFcγRIIB製剤の融解温度T_mを、示差走査蛍光定量法によって測定した。図4は、示されたpHの10mMクエン酸、4.5％糖（2:1(w/w)ショ糖:マンニトール）、75mM NaCl中の0.5mg/mL husFcγRIIB（図4（a）および（c））、または示された量の糖（2:1(w/w)ショ糖:マンニトール）および塩が補足された10mMクエン酸（pH7.0）中の0.5mg/mL husFcγRIIB（図4（b）および（d））を使用して入手された、それぞれの結果を示す。husFcγRIIB製剤を、Sypro Orangeの存在下で、1℃/分で、96穴マイクロタイタープレートにおいて加熱し、610nmにおける蛍光放射を記録した。蛍光対温度プロット（a）および（b）、ならびにそれらの一次導関数（c）および（d）が示される。dF/dTプロットにおける最初の極大を、husFcγRIIB融解温度として定義した。

【0111】

それぞれの製剤候補の組成に応じて、50.8℃から55.5℃までのT_m値が測定された。融解温度に対する最大の影響は、pHが有しており、pHが7.5から6.5に低下した時、T_mがおよそ3.5℃増加した。7.5％糖の添加は、およそ1℃、T_mを増加させた（10mMクエン酸におけるpH、糖、および塩濃度の関数としてのhusFcγRIIB融解温度の変化を示している図5。3個の独立したウェルからの平均値および標準偏差が示される）。NaCl濃度は平行して低下したが、初期の実験において示されたように（示されないデータ）、そして優先的排除（preferential exclusion）の理論に従って（Timasheff,1992,Chapter 9.Stabilization of Protein Structure.In Stability of Protein Pharmaceuticals,Part B:In vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization.Ahern,T.J.& Manning,M.C.,eds.,Plenum Press,New York,pp.265-285）、熱安定性の増加は、明らかに、塩含量の減少ではなく糖濃度の増加の関数である。これは、6.2℃のT_m増加をもたらした7.5％から40％への糖濃度の上昇によっても例証される。

【0112】

次に、高い融解温度によって示されるような、husFcγRIIBの二次構造および三次構造の安定化が、どの程度、不溶性のタンパク質凝集物の形成を阻害するかを決定した。従って、クエン酸緩衝husFcγRIIB製剤の濁度を、測定されたT_mより十分に低い温度、37℃でのインキュベーションの後に測定した。この目的のため、37℃におけるクエン酸緩衝husFcγRIIB製剤の加速された安定性を決定した。360nmにおける光学濃度を、1時間後（a）、12時間後（b）、および7日後（c）に、husFcγRIIB濃度およびショ糖濃度の関数として測定した。全ての製剤が、10mMクエン酸（pH7.0）、25mM NaClを含有していた。緩衝液対照の光学濃度を差し引いた。40％ショ糖で、最高濃度の製剤は、60mg/mL husFcγRIIBのみを含有し、80mg/mLは含有していなかった。

【0113】

結果は図6に示される。ショ糖濃度の増加（図6の全てのグラフにおいて、濃度はZ軸上の後方から前方へ増加している）、即ち、タンパク質の融解温度の増加によって、濁度の上昇は遅延する。ショ糖が添加されない時、10mg/mL husFcγRIIB以上の強度を有する全ての製剤が、37℃で1時間後に既に濁ったが、40％ショ糖では、60mg/mL husFcγRIIBまで、37℃で7日後ですら、濁度の有意な増加は観察されなかった。あるタンパク質濃度より上で、絶対的な濁度は、husFcγRIIB濃度の増加と共に直線的に増加するが、その閾値未満では、不溶性のタンパク質凝集物の形成は極めて遅くなるかまたは阻害すらされる。ショ糖濃度の増加によって、この閾値はより高いhusFcγRIIB濃度にシフトするが、37℃および60mg/mLを越える濃度でhusFcγRIIBを安定化するためには、生理学的観点から許容されない高いショ糖濃度が、必要とされるであろう。

【0114】

40℃でのクエン酸緩衝husFcγRIIB製剤の加速された安定性に関して、さらなる試験を実施した。結果は図7に示される。360nmにおける光学濃度の増加を、10％/292mMショ糖（a、白三角）、10％/292mMトレハロース（a、白四角）、5％/274mMマンニトール（a、白丸）、30％/876mMショ糖（b、白三角）、30％/876mM トレハロース（b、白四角）、15％/822mM マンニトール（b、白丸）が補足された10mMクエン酸、150mM NaCl（pH7.0）において、10mg/mL husFcγRIIBで測定した。20％ショ糖が補足された緩衝液対照も示される（黒丸）。

【0115】

これらの観察に基づき、異なる糖および糖アルコールを、不溶性のタンパク質凝集物の形成を抑制する能力に関してランク付けした。図7に示されるように、最も効率的な安定剤はショ糖である。

【0116】

（e）必要とされる界面活性剤濃度の定義
濁度アッセイ（示されないデータ）は、発表されたデータ（Timasheff,1992,Chapter 9.Stabilization of Protein Structure.In Stability of Protein Pharmaceuticals,Part B:In vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization.Ahern,T.J.& Manning,M.C.,eds.,Plenum Press,New York,pp.265-285）と一致して、界面活性剤濃度の増加がhusFcγRIIBを不安定化することを示した。また、高い界面活性剤濃度の使用は、免疫原性の増加をもたらし得ると推測されている（Hermeling et al.,2003,Pharm.Res.20,1903-1907）。その理由のため、表面ストレスに対する安定化効果を損なうことなく、界面活性剤の濃度を可能な限り低く維持することは必須であろう。

【0117】

理想的には、ポリソルベート20濃度は、5〜20mg/mL husFcγRIIBを含有している既に確立されている液体husFcγRIIB製剤のために使用されている濃度、0.005％に固定されるであろう。しかし、新たに開発された製剤の強度が50mg/mLを超えており、ポリソルベート20がタンパク質に結合する可能性があるため、界面活性剤の濃度を0.005％より上に上昇させなければならないか否かが問われた。

【0118】

タンパク質による非特異的な界面活性剤結合の仮説を試験するため、0.005％ポリソルベート20を含有しているクエン酸緩衝製剤候補に、増加する濃度のhusFcγRIIBを追加し、溶液を、室温、およびhusFcγRIIBの決定されたT_mより十分に高い温度である60℃で、1時間インキュベートした。タンパク質および仮説的に結合したポリソルベート20を陽イオン交換クロマトグラフィによって除去した後、遊離のポリソルベートの量を測定した。図8に、husFcγRIIBの存在下で遊離のポリソルベート20を決定する実験が示される。10mMクエン酸、25mMNaCl、3％ショ糖、1.5％マンニトール、0.005％ポリソルベート20（pH6.7）中のhusFcγRIIBを、25℃（未変性husFcγRIIB）および60℃（変性husFcγRIIB）で1時間インキュベートした。husFcγRIIBを陽イオン交換クロマトグラフィ（CEX）によって除去した後、ポリソルベート20の量を測定した（a）。ブランクは、husFcγRIIBまたは界面活性剤が添加されていない緩衝液を表す。システム適合性試験（SST）は、0.005％ポリソルベート20を含む緩衝液を表し、SST2はCEX処理されたもの、SST1は未処理であった。対数husFcγRIIB濃度に対するポリソルベート濃度の直線回帰（R²＞0.998）によって、0.08〜0.72mg/mL husFcγRIIBで測定されたポリソルベート含量を、10mg/mLを超えるhusFcγRIIB濃度へ外挿した（b）。

【0119】

図8に示されるように、遊離のポリソルベート含量と対数husFcγRIIB濃度との間の直線的な関係が確立された。従って、製剤の強度が20mg/mLから100mg/mLへ増加した場合、遊離のポリソルベートの濃度は、わずかに、およそ0.0001〜0.0002％しか変化しないであろうと予想される。0.005％の対照と比較された、試料中の有意に低いポリソルベート濃度は、概して、カラムローディング中に、ポリソルベート20なしで調製されたCEX平衡化緩衝液によって試料が希釈されたという事実に起因する（図8 SST1対SST2を参照すること）。

【0120】

（f）高濃度husFcγRIIB製剤の粘度
高濃度タンパク質製剤は、高い粘度を特徴とする（Shire et al.,2010（前記））。従って、高濃度タンパク質製剤の製造可能性は、タンジェンシャルフローろ過による濃縮過程が許容されないほどに遅くなり得るため、粘度によって妨げられる可能性がある。さらなる実験において、10mMクエン酸、25mM NaCl（pH7.0）におけるhusFcγRIIBの溶液粘度を20℃で測定した。図9（白丸）に示されるような実験データは、指数関数的増加関数（−、R²＞0.992）に適合し、製剤の溶液粘度が、少なくとも210mg/mLまで、経済的なTFF過程を実行するために十分に低いことを見出した。

【0121】

（g）husFcγRIIB含有製剤の凍結乾燥
変動するhusFcγRIIB、糖、塩、および界面活性剤の含量を含む59の製剤を、保存的な凍結乾燥サイクルに供した。最初の体積以下の体積の注射用水によって固体を再構成した後、凍結乾燥過程を行った。そうすることにおいて、再構成後のhusFcγRIIB含量を、60〜180mg/mLの名目上の含量に調整した。凍結乾燥のための様々な製剤の適合性を、再構成時間および再構成後の粒子汚染に基づき評価した。2分未満で再構成することができ、濁度の増加も、可視および可視以下の範囲の粒子の形成も示さない、いくつかの製剤が同定された。上記の凍結乾燥スクリーニングに基づき、理想的な製剤は、凍結乾燥前に少量のhusFcγRIIB（例えば、15〜60mg/mL）を含有しており、少量の注射用水によって再構成され、従って、最終界面活性剤濃度を増加させることが示された。蛍光顕微鏡法によって決定されるような選択された製剤の粒子量は、図10に示される。全ての製剤が、5mMクエン酸（pH6.7）、ならびに示された量の塩、糖、および界面活性剤を含有していた。製剤を、凍結乾燥させ、示されたhusFcγRIIB含量へ再構成した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]