特許 6979946 ヒト内耳感覚上皮および感覚ニューロンを生成する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6979946

(24)【登録日】2021年11月18日

(45)【発行日】2021年12月15日

(54)【発明の名称】ヒト内耳感覚上皮および感覚ニューロンを生成する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20211202BHJP

   C12N 5/0793 20100101ALI20211202BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071ZNA

   C12N5/0793

【請求項の数】11

【全頁数】60

(21)【出願番号】特願2018-520429(P2018-520429)

(86)(22)【出願日】2016年10月21日

(65)【公表番号】特表2018-531031(P2018-531031A)

(43)【公表日】2018年10月25日

(86)【国際出願番号】US2016058121

(87)【国際公開番号】WO2017070471

(87)【国際公開日】20170427

【審査請求日】2019年10月8日

(31)【優先権主張番号】62/244,568

(32)【優先日】2015年10月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507277642

【氏名又は名称】インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＩＡＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100141195

【弁理士】

【氏名又は名称】西澤 恵美子

(74)【代理人】

【識別番号】100104282

【弁理士】

【氏名又は名称】鈴木 康仁

(72)【発明者】

【氏名】コーラー，カール，アール．

(72)【発明者】

【氏名】橋野 惠里

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０００４５５６（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１３４６５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００４−１５９４７１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００９−５１２４２３（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−２８

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｍ １／００−３／１０

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物を得る方法であって、
（ａ）トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナル伝達の小分子阻害剤、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、およびＦＧＦ−２を含む培養培地中で、約４日間、ヒト誘導多能性幹細胞凝集体を培養するステップと、
（ｂ）（ａ）の培養した凝集体を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびＢＭＰシグナル伝達の小分子阻害剤の存在下で約４日間、さらに培養するステップと、
（ｃ）（ｂ）のさらに培養した凝集体を、Ｗｎｔアゴニストに約４日間接触させるステップであって、それにより、接触させた凝集体内の細胞が、前耳上皮細胞へ分化する、ステップと、
（ｄ）細胞外マトリックスタンパク質を含む半固体培養培地中に、前耳上皮細胞を包埋するステップと、
（ｅ）包埋した前耳上皮細胞を、Ｗｎｔアゴニストの存在下で少なくとも２８〜４８日間、包埋した前耳上皮細胞の耳胞への自己集合を促進する条件下で培養し、それにより、ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物が得られる、ステップと
を含む方法。

【請求項2】

前記ＦＧＦがＦＧＦ−２である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

ＢＭＰシグナル伝達の前記阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

ＴＧＦβ１媒介性シグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＢ４３１５４２およびＡ−８３−０１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ３の阻害剤である、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ＧＳＫ３の前記阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）および６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞外マトリックスが、基底膜抽出物（ＢＭＥ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記三次元組成物が、１つまたは複数の機械感覚細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記三次元組成物が、１つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記三次元組成物が、機械感覚細胞とシナプス結合を形成する１つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含む、請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１５年１０月２１日に出願された米国特許仮出願公開第６２／２４４，５６８号明細書の利点を主張し、それは、その全体が記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦支援の研究または開発に関する記述
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＤＣ０１５６２４、ＤＣ０１２６１７およびＤＣ０１３２９４の下で、政府支援を受けて行われた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。

【0003】

発明の分野
ヒト多能性幹細胞の、内耳感覚上皮および感覚ニューロンへの分化を導く方法が、本明細書中で提供される。より詳細には、ヒト多能性幹細胞由来の前耳（pre-otic）上皮、耳胞、ならびに有毛細胞および支持細胞を含有する内耳感覚上皮、ならびに感覚上皮を神経支配する感覚ニューロンを含む三次元培養物を獲得する方法が、本明細書中で提供される。

【背景技術】

【0004】

世界中でおよそ５億人の人々が、聴力損失しており、いまだに、聴力損失を治療することができる薬理学的療法、遺伝子療法または細胞療法が存在しない。この方法は、細胞療法のための、または創薬における使用のためのヒト内耳幹細胞、支持細胞、有毛細胞およびニューロンを生成するのに使用することができる。

【0005】

したがって、ヒト多能性幹細胞を、臨床的な細胞療法に適した内耳感覚組織へ分化させる効率的で再現性があり、かつ異種材料を含まない方法が、当該技術分野で依然として必要である。

【発明の概要】

【0006】

第１の態様では、ヒト前耳上皮細胞を獲得する方法が、本明細書中で提供される。本明細書中に記載するように、上記方法は、（ａ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、およびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナル伝達の阻害剤を含む培養培地中で、約８〜約１０日間、ヒト多能性幹細胞凝集体を培養するステップと、（ｂ）（ａ）の培養した凝集体を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の存在下で約４日間、さらに培養するステップと、（ｂ）さらに培養した凝集体を、Ｗｎｔアゴニストに約４日間接触させるステップであって、それにより、接触させた凝集体内の細胞が、前耳上皮細胞へ分化する、ステップとを含む。ＦＧＦは、ＦＧＦ−２であり得る。ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４またはＢＭＰ７であり得る。ＢＭＰシグナル伝達の阻害剤は、ＬＤＮ−１９３１８９であり得る。ＴＧＦβ１媒介性シグナル伝達の前記阻害剤は、ＳＢ４３１５４２およびＡ−８３−０１からなる群から選択され得る。Ｗｎｔアゴニストは、ＧＳＫ３の阻害剤であり得る。ＧＳＫ３の阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）および６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）からなる群から選択される。

【0007】

別の態様では、ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物を獲得する方法であって、（ａ）細胞外マトリックスタンパク質を含む半固体培養培地中に、請求項１に記載の方法に従って獲得されるヒト前耳上皮細胞を包埋するステップと、（ｂ）包埋した前耳上皮細胞を、Ｗｎｔアゴニストの存在下で約４０〜約６０日間、包埋した前耳上皮細胞の耳胞への自己集合を促進する条件下で培養するステップであって、それにより、ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物が獲得される、ステップとを含む方法が、本明細書中で提供される。Ｗｎｔアゴニストは、ＧＳＫ３の阻害剤であってもよく、ここで、ＧＳＫ３の阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）および６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）からなる群から選択される。細胞外マトリックスは、基底膜抽出物（ＢＭＥ）であり得る。三次元組成物は、１つまたは複数の機械感覚細胞を含み得る。三次元組成物は、１つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含み得る。三次元組成物は、機械感覚細胞とシナプス結合を形成する１つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含み得る。

【0008】

本明細書中に記載するこれらのおよび他の特徴、態様ならびに利点は、下記図面、詳細な説明および併記の特許請求の範囲を考慮して、より良好に理解されるようになる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1-1】耳プラコード様上皮の段階的誘導に関する例示的なプロトコールを示す図である。ａ、耳プラコード頭蓋領域における哺乳動物外胚葉発生の概説。ｂ、ヒト耳誘導の重要な事象に関する時系列。時系列に関する０日目は、ｈＰＳＣによって表される発生のおおよその段階を示す：およそ１２ｄｐｃ。ｃ、非神経外胚葉（ＮＮＥ）、耳上鰓前駆体ドメイン（otic-epibranchial progenitor domain、ＯＥＰＤ）、および耳プラコード誘導に関する分化戦略。潜在的に任意選択の、または細胞株依存性の処理を括弧内に示す。ｄ、ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭ ＳＢ、またはＳＢＢとして表される１０μＭ ＳＢ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４で処理したＷＡ２５細胞凝集体の分化の２日目のｑＰＣＲ分析。遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣに対して標準化した；ｎ＝３つの生物学的試料、２回の技術的反復；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；エラーバー＝最大／最小。ｅ、ｆ、１０μＭ ＳＢ、または２００ｎＭ ＬＤＮ＋１０μＭ ＳＢで６日間処理したＷＡ２５凝集体における代表的なＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＰＡＸ６発現。ｇ、１０μＭ ＳＢ＋２．５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（ＳＢＢ）で６日目に処理したｍＮＤ２−０ｉＰＳＣにおけるＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＰＡＸ６発現。ｈ、ｉ、８日目のＳＢ処理ＷＡ２５凝集体の代表的な画像：生存している（ｈ）ならびにＰＡＸ８およびＴＦＡＰ２抗体で免疫染色した（ｉ）。パネル（ｈ）およびパネル（ｉ）において形態を比較する場合、外側上皮は、凍結切片プロセス中に凝集体コアへとしわになることに留意されたい。ｊ、ｋ、４日目の５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２および２００ｎＭ ＬＤＮ（ＳＢＦＬ）による処理の８日後のＳＢ処理ＷＡ２５凝集体の代表的な画像：生存している（ｊ）ならびにＰＡＸ８およびＴＦＡＰ２抗体で免疫染色した（ｋ）。ｌ〜ｎ、１２日目のＷＡ２５ＳＢＦＬ処理凝集体。外側上皮は、ＰＡＸ８^＋ＥＣＡＤ^＋細胞（Ｉ）およびＰＡＸ８^＋ＰＡＸ２^＋耳プラコード様細胞の臨時のパッチ（ｍ、ｎ）を含有する。示した検体は、８日目にさらなるＣＤＭ ２５μｌで処理した。スケールバー、１００μｍ（ｅ〜ｍ）、５０μｍ（ｎ）。

【図1-2】耳プラコード様上皮の段階的誘導に関する例示的なプロトコールを示す図である。ａ、耳プラコード頭蓋領域における哺乳動物外胚葉発生の概説。ｂ、ヒト耳誘導の重要な事象に関する時系列。時系列に関する０日目は、ｈＰＳＣによって表される発生のおおよその段階を示す：およそ１２ｄｐｃ。ｃ、非神経外胚葉（ＮＮＥ）、耳上鰓前駆体ドメイン（ＯＥＰＤ）、および耳プラコード誘導に関する分化戦略。潜在的に任意選択の、または細胞株依存性の処理を括弧内に示す。ｄ、ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭ ＳＢ、またはＳＢＢとして表される１０μＭ ＳＢ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４で処理したＷＡ２５細胞凝集体の分化の２日目のｑＰＣＲ分析。遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣに対して標準化した；ｎ＝３つの生物学的試料、２回の技術的反復；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；エラーバー＝最大／最小。ｅ、ｆ、１０μＭ ＳＢ、または２００ｎＭ ＬＤＮ＋１０μＭ ＳＢで６日間処理したＷＡ２５凝集体における代表的なＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＰＡＸ６発現。ｇ、１０μＭ ＳＢ＋２．５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（ＳＢＢ）で６日目に処理したｍＮＤ２−０ｉＰＳＣにおけるＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＰＡＸ６発現。ｈ、ｉ、８日目のＳＢ処理ＷＡ２５凝集体の代表的な画像：生存している（ｈ）ならびにＰＡＸ８およびＴＦＡＰ２抗体で免疫染色した（ｉ）。パネル（ｈ）およびパネル（ｉ）において形態を比較する場合、外側上皮は、凍結切片プロセス中に凝集体コアへとしわになることに留意されたい。ｊ、ｋ、４日目の５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２および２００ｎＭ ＬＤＮ（ＳＢＦＬ）による処理の８日後のＳＢ処理ＷＡ２５凝集体の代表的な画像：生存している（ｊ）ならびにＰＡＸ８およびＴＦＡＰ２抗体で免疫染色した（ｋ）。ｌ〜ｎ、１２日目のＷＡ２５ＳＢＦＬ処理凝集体。外側上皮は、ＰＡＸ８^＋ＥＣＡＤ^＋細胞（Ｉ）およびＰＡＸ８^＋ＰＡＸ２^＋耳プラコード様細胞の臨時のパッチ（ｍ、ｎ）を含有する。示した検体は、８日目にさらなるＣＤＭ ２５μｌで処理した。スケールバー、１００μｍ（ｅ〜ｍ）、５０μｍ（ｎ）。

【図1-3】耳プラコード様上皮の段階的誘導に関する例示的なプロトコールを示す図である。ａ、耳プラコード頭蓋領域における哺乳動物外胚葉発生の概説。ｂ、ヒト耳誘導の重要な事象に関する時系列。時系列に関する０日目は、ｈＰＳＣによって表される発生のおおよその段階を示す：およそ１２ｄｐｃ。ｃ、非神経外胚葉（ＮＮＥ）、耳上鰓前駆体ドメイン（ＯＥＰＤ）、および耳プラコード誘導に関する分化戦略。潜在的に任意選択の、または細胞株依存性の処理を括弧内に示す。ｄ、ＤＭＳＯ（対照）、１０μＭ ＳＢ、またはＳＢＢとして表される１０μＭ ＳＢ＋１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４で処理したＷＡ２５細胞凝集体の分化の２日目のｑＰＣＲ分析。遺伝子発現は、未分化ｈＥＳＣに対して標準化した；ｎ＝３つの生物学的試料、２回の技術的反復；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１；エラーバー＝最大／最小。ｅ、ｆ、１０μＭ ＳＢ、または２００ｎＭ ＬＤＮ＋１０μＭ ＳＢで６日間処理したＷＡ２５凝集体における代表的なＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＰＡＸ６発現。ｇ、１０μＭ ＳＢ＋２．５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（ＳＢＢ）で６日目に処理したｍＮＤ２−０ｉＰＳＣにおけるＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＰＡＸ６発現。ｈ、ｉ、８日目のＳＢ処理ＷＡ２５凝集体の代表的な画像：生存している（ｈ）ならびにＰＡＸ８およびＴＦＡＰ２抗体で免疫染色した（ｉ）。パネル（ｈ）およびパネル（ｉ）において形態を比較する場合、外側上皮は、凍結切片プロセス中に凝集体コアへとしわになることに留意されたい。ｊ、ｋ、４日目の５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２および２００ｎＭ ＬＤＮ（ＳＢＦＬ）による処理の８日後のＳＢ処理ＷＡ２５凝集体の代表的な画像：生存している（ｊ）ならびにＰＡＸ８およびＴＦＡＰ２抗体で免疫染色した（ｋ）。ｌ〜ｎ、１２日目のＷＡ２５ＳＢＦＬ処理凝集体。外側上皮は、ＰＡＸ８^＋ＥＣＡＤ^＋細胞（Ｉ）およびＰＡＸ８^＋ＰＡＸ２^＋耳プラコード様細胞の臨時のパッチ（ｍ、ｎ）を含有する。示した検体は、８日目にさらなるＣＤＭ ２５μｌで処理した。スケールバー、１００μｍ（ｅ〜ｍ）、５０μｍ（ｎ）。

【図2-1】未分化ＷＡ２５ｈＥＳＣ、細胞凝集、および初期非神経外胚葉分化分析を示す図である。ａ、ｂ、準備刺激した（primed）多能性幹細胞のＥ８培地発現マーカーにおけるビトロネクチン−Ｎでコーティングしたプレート上で維持されるＷＡ２５細胞。ｃ、分化戦略および実験条件の概説。ｄ、ｅ、Ｅ８＋２０μＭ Ｙ−２７６３２における単一細胞のｈＥＳＣの凝集は、ＣＤＭ＋２０μＭ Ｙ−２７６３２における凝集よりも少ない細胞残屑を産生した。ｆ、未分化細胞に対して、多能性マーカーは、ビヒクル対照を除く全ての条件で、２日目までに著しくダウンレギュレートされた。ｇ、非神経マーカーＴＦＡＰ２およびＤＬＸ３は、ＳＢおよびＳＢＢ条件でアップレギュレートされた。ｈ、中内胚葉マーカーＢＲＡおよびＥＯＭＥＳは、ＢＭＰ４（Ｂ）処理によってアップレギュレートされた。遺伝子発現は、ｄ０凝集体に対して標準化した。統計学的検定に関して、処理値を、対照（ＣＴＲＬ）値と比較した；ｎ＝３つの生物学的試料、２回の技術的反復；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない；エラーバー＝最大／最小。スケールバー、１００μｍ（ａ、ｄ、ｅ）、２５μｍ（ｂ）。

【図2-2】未分化ＷＡ２５ｈＥＳＣ、細胞凝集、および初期非神経外胚葉分化分析を示す図である。ａ、ｂ、準備刺激した（primed）多能性幹細胞のＥ８培地発現マーカーにおけるビトロネクチン−Ｎでコーティングしたプレート上で維持されるＷＡ２５細胞。ｃ、分化戦略および実験条件の概説。ｄ、ｅ、Ｅ８＋２０μＭ Ｙ−２７６３２における単一細胞のｈＥＳＣの凝集は、ＣＤＭ＋２０μＭ Ｙ−２７６３２における凝集よりも少ない細胞残屑を産生した。ｆ、未分化細胞に対して、多能性マーカーは、ビヒクル対照を除く全ての条件で、２日目までに著しくダウンレギュレートされた。ｇ、非神経マーカーＴＦＡＰ２およびＤＬＸ３は、ＳＢおよびＳＢＢ条件でアップレギュレートされた。ｈ、中内胚葉マーカーＢＲＡおよびＥＯＭＥＳは、ＢＭＰ４（Ｂ）処理によってアップレギュレートされた。遺伝子発現は、ｄ０凝集体に対して標準化した。統計学的検定に関して、処理値を、対照（ＣＴＲＬ）値と比較した；ｎ＝３つの生物学的試料、２回の技術的反復；^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない；エラーバー＝最大／最小。スケールバー、１００μｍ（ａ、ｄ、ｅ）、２５μｍ（ｂ）。

【図3-1】ＷＡ２５ｈＥＳＣを使用した非神経誘導を示す図である。ａ、ｂ、分化戦略の概説。ｃ〜ｅ、培養における経時的な凝集体直径（ｃ）および真円度（ｄ）。凝集体の真円度は、外側上皮がしわになるにつれ、経時的に減少する（ｅ）。ｆ、ｇ、ＯＣＴ４発現細胞、コアにおけるＳＯＸ２／ＥＣＡＤ発現細胞、ならびに外側コアおよび上皮におけるＴＦＡＰ２／ＥＣＡＤ発現細胞のほぼ完全な欠如を示す代表的な４日目の凝集体。エラーバーは、最大／最小である。スケールバー、１００μｍ。

【図3-2】ＷＡ２５ｈＥＳＣを使用した非神経誘導を示す図である。ａ、ｂ、分化戦略の概説。ｃ〜ｅ、培養における経時的な凝集体直径（ｃ）および真円度（ｄ）。凝集体の真円度は、外側上皮がしわになるにつれ、経時的に減少する（ｅ）。ｆ、ｇ、ＯＣＴ４発現細胞、コアにおけるＳＯＸ２／ＥＣＡＤ発現細胞、ならびに外側コアおよび上皮におけるＴＦＡＰ２／ＥＣＡＤ発現細胞のほぼ完全な欠如を示す代表的な４日目の凝集体。エラーバーは、最大／最小である。スケールバー、１００μｍ。

【図4-1】Ｗｎｔシグナル伝達活性化が、前庭様有毛細胞を含有する内耳オルガノイドの自己組織化および成熟を開始させることを示す図である。ａ、内耳オルガノイド誘導戦略。１２日目の凝集体は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ液滴中に包埋して、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）形成を支持した。ｂ〜ｄ、ＣＨＩＲ処理試料では、耳窩様構造が、外側上皮から膨出する（evaginate）が、ＤＭＳＯ（対照）試料では、膨出しない（ｄ）。ｅ〜ｉ、１４〜３５日目の間に、窩および小胞は、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＪＡＧ１、ＰＡＸ８、ＰＡＸ２およびＦＢＸＯ２などの耳特異的マーカーを発現した。小胞が生じる上皮は、３５日目までに表皮ケラチノサイトマーカーＫＲＴ５を発現し始める（ｈ）。ｊ、４０〜６０日目までに、凝集体は、多重オルガノイド、通常、ＤＩＣ画像化下で可視性の単一表皮単位を含有する。内耳オルガノイドは、およそ２５〜４０μｍの見かけの厚さを有する規定上皮および管腔（挿入図ｊ）によって識別可能である。ｋ、内耳オルガノイドは通常、表皮単位周辺に配向され、ＡＮＸＡ４^＋ＰＣＲ４^＋有毛細胞を有する感覚上皮を含有する。オルガノイドの管腔表面は、ファロイジン染色によって示されるように、アクチンリッチである（ｋ’’）。ｌ〜ｏ、有毛細胞は、ＭＹＯ７Ａ^＋ＳＯＸ２^＋であり、支持細胞はＳＯＸ２^＋である。Ｆ−アクチンリッチな毛束は、有毛細胞から管腔へ突出する（ｎ、ｏ；アスタリスクは、ｍにおける毛束位置を示す）。ｐ、ｑ、ｍＮＤ−２−０ｉＰＳＣ由来感覚上皮は、ＷＡ２５ｈＥＳＣ由来の感覚上皮に類似した形態を有し、ＰＣＰ４^＋ＡＮＸＡ４^＋有毛細胞を含有する。ＳＯＸ１０は、支持および非感覚上皮細胞集団全体にわたって発現されるが、有毛細胞では発現されない（ｐ）。支持細胞は、卵形嚢支持細胞マーカーＳＰＡＲＣＬ１を発現する（ｑ）。ｒ、オルガノイドにおける有毛細胞は、単一のアセチル化チューブリン（ＴＵＢＡ４Ａ）^＋動毛を有するＥＳＰＮ^＋毛束を有する。スケールバー、２００μｍ（ｊ）、１００μｍ（ｂ、ｃ、ｅ）、５０μｍ（ｇ、ｈ、ｋ）、２５μｍ（ｄ、ｆ、ｉ、ｌ、ｍ、ｐ）、１０μｍ（ｎ、ｑ）、５μｍ（ｒ）、２．５μｍ（ｏ）。

【図4-2】Ｗｎｔシグナル伝達活性化が、前庭様有毛細胞を含有する内耳オルガノイドの自己組織化および成熟を開始させることを示す図である。ａ、内耳オルガノイド誘導戦略。１２日目の凝集体は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ液滴中に包埋して、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）形成を支持した。ｂ〜ｄ、ＣＨＩＲ処理試料では、耳窩様構造が、外側上皮から膨出するが、ＤＭＳＯ（対照）試料では、膨出しない（ｄ）。ｅ〜ｉ、１４〜３５日目の間に、窩および小胞は、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＪＡＧ１、ＰＡＸ８、ＰＡＸ２およびＦＢＸＯ２などの耳特異的マーカーを発現した。小胞が生じる上皮は、３５日目までに表皮ケラチノサイトマーカーＫＲＴ５を発現し始める（ｈ）。ｊ、４０〜６０日目までに、凝集体は、多重オルガノイド、通常、ＤＩＣ画像化下で可視性の単一表皮単位を含有する。内耳オルガノイドは、およそ２５〜４０μｍの見かけの厚さを有する規定上皮および管腔（挿入図ｊ）によって識別可能である。ｋ、内耳オルガノイドは通常、表皮単位周辺に配向され、ＡＮＸＡ４^＋ＰＣＲ４^＋有毛細胞を有する感覚上皮を含有する。オルガノイドの管腔表面は、ファロイジン染色によって示されるように、アクチンリッチである（ｋ’’）。ｌ〜ｏ、有毛細胞は、ＭＹＯ７Ａ^＋ＳＯＸ２^＋であり、支持細胞はＳＯＸ２^＋である。Ｆ−アクチンリッチな毛束は、有毛細胞から管腔へ突出する（ｎ、ｏ；アスタリスクは、ｍにおける毛束位置を示す）。ｐ、ｑ、ｍＮＤ−２−０ｉＰＳＣ由来感覚上皮は、ＷＡ２５ｈＥＳＣ由来の感覚上皮に類似した形態を有し、ＰＣＰ４^＋ＡＮＸＡ４^＋有毛細胞を含有する。ＳＯＸ１０は、支持および非感覚上皮細胞集団全体にわたって発現されるが、有毛細胞では発現されない（ｐ）。支持細胞は、卵形嚢支持細胞マーカーＳＰＡＲＣＬ１を発現する（ｑ）。ｒ、オルガノイドにおける有毛細胞は、単一のアセチル化チューブリン（ＴＵＢＡ４Ａ）^＋動毛を有するＥＳＰＮ^＋毛束を有する。スケールバー、２００μｍ（ｊ）、１００μｍ（ｂ、ｃ、ｅ）、５０μｍ（ｇ、ｈ、ｋ）、２５μｍ（ｄ、ｆ、ｉ、ｌ、ｍ、ｐ）、１０μｍ（ｎ、ｑ）、５μｍ（ｒ）、２．５μｍ（ｏ）。

【図4-3】Ｗｎｔシグナル伝達活性化が、前庭様有毛細胞を含有する内耳オルガノイドの自己組織化および成熟を開始させることを示す図である。ａ、内耳オルガノイド誘導戦略。１２日目の凝集体は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ液滴中に包埋して、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）形成を支持した。ｂ〜ｄ、ＣＨＩＲ処理試料では、耳窩様構造が、外側上皮から膨出するが、ＤＭＳＯ（対照）試料では、膨出しない（ｄ）。ｅ〜ｉ、１４〜３５日目の間に、窩および小胞は、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＪＡＧ１、ＰＡＸ８、ＰＡＸ２およびＦＢＸＯ２などの耳特異的マーカーを発現した。小胞が生じる上皮は、３５日目までに表皮ケラチノサイトマーカーＫＲＴ５を発現し始める（ｈ）。ｊ、４０〜６０日目までに、凝集体は、多重オルガノイド、通常、ＤＩＣ画像化下で可視性の単一表皮単位を含有する。内耳オルガノイドは、およそ２５〜４０μｍの見かけの厚さを有する規定上皮および管腔（挿入図ｊ）によって識別可能である。ｋ、内耳オルガノイドは通常、表皮単位周辺に配向され、ＡＮＸＡ４^＋ＰＣＲ４^＋有毛細胞を有する感覚上皮を含有する。オルガノイドの管腔表面は、ファロイジン染色によって示されるように、アクチンリッチである（ｋ’’）。ｌ〜ｏ、有毛細胞は、ＭＹＯ７Ａ^＋ＳＯＸ２^＋であり、支持細胞はＳＯＸ２^＋である。Ｆ−アクチンリッチな毛束は、有毛細胞から管腔へ突出する（ｎ、ｏ；アスタリスクは、ｍにおける毛束位置を示す）。ｐ、ｑ、ｍＮＤ−２−０ｉＰＳＣ由来感覚上皮は、ＷＡ２５ｈＥＳＣ由来の感覚上皮に類似した形態を有し、ＰＣＰ４^＋ＡＮＸＡ４^＋有毛細胞を含有する。ＳＯＸ１０は、支持および非感覚上皮細胞集団全体にわたって発現されるが、有毛細胞では発現されない（ｐ）。支持細胞は、卵形嚢支持細胞マーカーＳＰＡＲＣＬ１を発現する（ｑ）。ｒ、オルガノイドにおける有毛細胞は、単一のアセチル化チューブリン（ＴＵＢＡ４Ａ）^＋動毛を有するＥＳＰＮ^＋毛束を有する。スケールバー、２００μｍ（ｊ）、１００μｍ（ｂ、ｃ、ｅ）、５０μｍ（ｇ、ｈ、ｋ）、２５μｍ（ｄ、ｆ、ｉ、ｌ、ｍ、ｐ）、１０μｍ（ｎ、ｑ）、５μｍ（ｒ）、２．５μｍ（ｏ）。

【図4-4】Ｗｎｔシグナル伝達活性化が、前庭様有毛細胞を含有する内耳オルガノイドの自己組織化および成熟を開始させることを示す図である。ａ、内耳オルガノイド誘導戦略。１２日目の凝集体は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ液滴中に包埋して、小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）形成を支持した。ｂ〜ｄ、ＣＨＩＲ処理試料では、耳窩様構造が、外側上皮から膨出するが、ＤＭＳＯ（対照）試料では、膨出しない（ｄ）。ｅ〜ｉ、１４〜３５日目の間に、窩および小胞は、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＪＡＧ１、ＰＡＸ８、ＰＡＸ２およびＦＢＸＯ２などの耳特異的マーカーを発現した。小胞が生じる上皮は、３５日目までに表皮ケラチノサイトマーカーＫＲＴ５を発現し始める（ｈ）。ｊ、４０〜６０日目までに、凝集体は、多重オルガノイド、通常、ＤＩＣ画像化下で可視性の単一表皮単位を含有する。内耳オルガノイドは、およそ２５〜４０μｍの見かけの厚さを有する規定上皮および管腔（挿入図ｊ）によって識別可能である。ｋ、内耳オルガノイドは通常、表皮単位周辺に配向され、ＡＮＸＡ４^＋ＰＣＲ４^＋有毛細胞を有する感覚上皮を含有する。オルガノイドの管腔表面は、ファロイジン染色によって示されるように、アクチンリッチである（ｋ’’）。ｌ〜ｏ、有毛細胞は、ＭＹＯ７Ａ^＋ＳＯＸ２^＋であり、支持細胞はＳＯＸ２^＋である。Ｆ−アクチンリッチな毛束は、有毛細胞から管腔へ突出する（ｎ、ｏ；アスタリスクは、ｍにおける毛束位置を示す）。ｐ、ｑ、ｍＮＤ−２−０ｉＰＳＣ由来感覚上皮は、ＷＡ２５ｈＥＳＣ由来の感覚上皮に類似した形態を有し、ＰＣＰ４^＋ＡＮＸＡ４^＋有毛細胞を含有する。ＳＯＸ１０は、支持および非感覚上皮細胞集団全体にわたって発現されるが、有毛細胞では発現されない（ｐ）。支持細胞は、卵形嚢支持細胞マーカーＳＰＡＲＣＬ１を発現する（ｑ）。ｒ、オルガノイドにおける有毛細胞は、単一のアセチル化チューブリン（ＴＵＢＡ４Ａ）^＋動毛を有するＥＳＰＮ^＋毛束を有する。スケールバー、２００μｍ（ｊ）、１００μｍ（ｂ、ｃ、ｅ）、５０μｍ（ｇ、ｈ、ｋ）、２５μｍ（ｄ、ｆ、ｉ、ｌ、ｍ、ｐ）、１０μｍ（ｎ、ｑ）、５μｍ（ｒ）、２．５μｍ（ｏ）。

【図5-1】自然有毛細胞の電気生理学的特性に類似した電気生理学的特性を有するｈＥＳＣ由来の有毛細胞を示す図である。ａ、ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ ＣＲＩＳＰＲ設計。２つのガイドＲＮＡ（青色、ＰＡＭ配列は赤色で）は、ＡＴＯＨ１の停止コドン（ピンク色の背景で下線を付してある）付近に２つのニック（赤色三角形）を作製するようにＣａｓ９ｎを導く。生じたＤＮＡ二重鎖切断は、ドナーベクターによって修復され、それは、２Ａ−ｅＧＦＰ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏカセットならびに１ｋｂの左および右相同性アーム（ＬＨＡおよびＲＨＡ）を有する。続いて、ＬｏｘＰ隣接ＰＧＫ−Ｐｕｒｏサブカセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって除去される。有毛細胞を発現するＡＴＯＨ１において、ｅＧＦＰは、ＡＴＯＨ１と一緒に転写される。ｂ〜ｄ、５０および１００日齢の内耳オルガノイドにおける２Ａ−ｅＧＦＰ^＋有毛細胞の代表的な生細胞画像。パネル（ｂ）において、軟骨結節（ｃｎ）およびアスタリスクは、別々の２Ａ−ｅＧＦＰ^＋有毛細胞パッチを示す。パネル（ｃ）におけるアスタリスクは、パネル（ｄ）における有毛細胞のおおよその位置を示す。ｅ、１４０日齢のｅＧＦＰ^＋有毛細胞におけるＢＲＮ３Ｃの発現。ｆ、１００日齢のｅＧＦＰ^＋有毛細胞の毛束におけるＥＳＰＮの発現。ｇ、ヒトオルガノイド有毛細胞は、顕著な外向き電流を示した（ｄ６４）。ｈ、細胞は、マウス前庭ＩＩ型有毛細胞において見られるのと類似した特徴を有する整流電位の偏りをもって電流注入に応答した。ｉ、ヒトオルガノイド有毛細胞は、上昇期時に初期ピークを伴う正弦波刺激に続くことが可能である（周波数掃引を除く）。ｊ、電位依存性電流は、培養においてこの時点でわずかに小さかったが、全体の電位依存性は、マウス有毛細胞において見られるのと密接に類似していた（６４〜６７日間プールされた非漏出性の記録、Ｐ４マウス卵形嚢からの比較）。ｋ、しかしながら、マウス卵形嚢およびオルガノイド細胞において−８０ｍＶ以下で見られる内向き整流電流は、ヒトオルガノイド細胞では顕著ではなかった。スケールバー、２００μｍ（ｂ）、１００μｍ（ｃ）、２５μｍ（ｅ）、５μｍ（ｄ、ｆ）。

【図5-2】自然有毛細胞の電気生理学的特性に類似した電気生理学的特性を有するｈＥＳＣ由来の有毛細胞を示す図である。ａ、ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ ＣＲＩＳＰＲ設計。２つのガイドＲＮＡ（青色、ＰＡＭ配列は赤色で）は、ＡＴＯＨ１の停止コドン（ピンク色の背景で下線を付してある）付近に２つのニック（赤色三角形）を作製するようにＣａｓ９ｎを導く。生じたＤＮＡ二重鎖切断は、ドナーベクターによって修復され、それは、２Ａ−ｅＧＦＰ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏカセットならびに１ｋｂの左および右相同性アーム（ＬＨＡおよびＲＨＡ）を有する。続いて、ＬｏｘＰ隣接ＰＧＫ−Ｐｕｒｏサブカセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって除去される。有毛細胞を発現するＡＴＯＨ１において、ｅＧＦＰは、ＡＴＯＨ１と一緒に転写される。ｂ〜ｄ、５０および１００日齢の内耳オルガノイドにおける２Ａ−ｅＧＦＰ^＋有毛細胞の代表的な生細胞画像。パネル（ｂ）において、軟骨結節（ｃｎ）およびアスタリスクは、別々の２Ａ−ｅＧＦＰ^＋有毛細胞パッチを示す。パネル（ｃ）におけるアスタリスクは、パネル（ｄ）における有毛細胞のおおよその位置を示す。ｅ、１４０日齢のｅＧＦＰ^＋有毛細胞におけるＢＲＮ３Ｃの発現。ｆ、１００日齢のｅＧＦＰ^＋有毛細胞の毛束におけるＥＳＰＮの発現。ｇ、ヒトオルガノイド有毛細胞は、顕著な外向き電流を示した（ｄ６４）。ｈ、細胞は、マウス前庭ＩＩ型有毛細胞において見られるのと類似した特徴を有する整流電位の偏りをもって電流注入に応答した。ｉ、ヒトオルガノイド有毛細胞は、上昇期時に初期ピークを伴う正弦波刺激に続くことが可能である（周波数掃引を除く）。ｊ、電位依存性電流は、培養においてこの時点でわずかに小さかったが、全体の電位依存性は、マウス有毛細胞において見られるのと密接に類似していた（６４〜６７日間プールされた非漏出性の記録、Ｐ４マウス卵形嚢からの比較）。ｋ、しかしながら、マウス卵形嚢およびオルガノイド細胞において−８０ｍＶ以下で見られる内向き整流電流は、ヒトオルガノイド細胞では顕著ではなかった。スケールバー、２００μｍ（ｂ）、１００μｍ（ｃ）、２５μｍ（ｅ）、５μｍ（ｄ、ｆ）。

【図5-3】自然有毛細胞の電気生理学的特性に類似した電気生理学的特性を有するｈＥＳＣ由来の有毛細胞を示す図である。ａ、ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ ＣＲＩＳＰＲ設計。２つのガイドＲＮＡ（青色、ＰＡＭ配列は赤色で）は、ＡＴＯＨ１の停止コドン（ピンク色の背景で下線を付してある）付近に２つのニック（赤色三角形）を作製するようにＣａｓ９ｎを導く。生じたＤＮＡ二重鎖切断は、ドナーベクターによって修復され、それは、２Ａ−ｅＧＦＰ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏカセットならびに１ｋｂの左および右相同性アーム（ＬＨＡおよびＲＨＡ）を有する。続いて、ＬｏｘＰ隣接ＰＧＫ−Ｐｕｒｏサブカセットは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって除去される。有毛細胞を発現するＡＴＯＨ１において、ｅＧＦＰは、ＡＴＯＨ１と一緒に転写される。ｂ〜ｄ、５０および１００日齢の内耳オルガノイドにおける２Ａ−ｅＧＦＰ^＋有毛細胞の代表的な生細胞画像。パネル（ｂ）において、軟骨結節（ｃｎ）およびアスタリスクは、別々の２Ａ−ｅＧＦＰ^＋有毛細胞パッチを示す。パネル（ｃ）におけるアスタリスクは、パネル（ｄ）における有毛細胞のおおよその位置を示す。ｅ、１４０日齢のｅＧＦＰ^＋有毛細胞におけるＢＲＮ３Ｃの発現。ｆ、１００日齢のｅＧＦＰ^＋有毛細胞の毛束におけるＥＳＰＮの発現。ｇ、ヒトオルガノイド有毛細胞は、顕著な外向き電流を示した（ｄ６４）。ｈ、細胞は、マウス前庭ＩＩ型有毛細胞において見られるのと類似した特徴を有する整流電位の偏りをもって電流注入に応答した。ｉ、ヒトオルガノイド有毛細胞は、上昇期時に初期ピークを伴う正弦波刺激に続くことが可能である（周波数掃引を除く）。ｊ、電位依存性電流は、培養においてこの時点でわずかに小さかったが、全体の電位依存性は、マウス有毛細胞において見られるのと密接に類似していた（６４〜６７日間プールされた非漏出性の記録、Ｐ４マウス卵形嚢からの比較）。ｋ、しかしながら、マウス卵形嚢およびオルガノイド細胞において−８０ｍＶ以下で見られる内向き整流電流は、ヒトオルガノイド細胞では顕著ではなかった。スケールバー、２００μｍ（ｂ）、１００μｍ（ｃ）、２５μｍ（ｅ）、５μｍ（ｄ、ｆ）。

【図6-1】ＳＢ処理凝集体が、ケラチノサイトを生成することを示す図である。ａ、非神経およびケラチノサイト誘導プロセスの概説。ｂ〜ｄ、３Ｄ培養において、非神経外胚葉誘導は、特徴的な形態学的変化を伴う。６〜８日までに、上皮がコアから分離して、半透明の球体を形成する（ｃ）。上皮は、依然としてスポーク様構造を介してコアに結合されたままである（ａ、ｃ）。２０日後、コア由来のスポークは存在せず、上皮球体は通常、細胞残屑で充填される（ｄ）。ｅ、２０日目の上皮は、ＴＦＡＰ２＋ＫＲＴ５＋細胞を含有し、表皮ケラチノサイトを示す。スケールバー、２５０μｍ（ｂ〜ｄ）、１００μｍ（ｅ）、５μｍ（ｅ’）。

【図6-2】ＳＢ処理凝集体が、ケラチノサイトを生成することを示す図である。ａ、非神経およびケラチノサイト誘導プロセスの概説。ｂ〜ｄ、３Ｄ培養において、非神経外胚葉誘導は、特徴的な形態学的変化を伴う。６〜８日までに、上皮がコアから分離して、半透明の球体を形成する（ｃ）。上皮は、依然としてスポーク様構造を介してコアに結合されたままである（ａ、ｃ）。２０日後、コア由来のスポークは存在せず、上皮球体は通常、細胞残屑で充填される（ｄ）。ｅ、２０日目の上皮は、ＴＦＡＰ２＋ＫＲＴ５＋細胞を含有し、表皮ケラチノサイトを示す。スケールバー、２５０μｍ（ｂ〜ｄ）、１００μｍ（ｅ）、５μｍ（ｅ’）。

【図7-1】ＳＢ処理ＷＡ２５凝集体における非神経外胚葉誘導が、内因性ＢＭＰシグナル伝達に起因することを示す図である。ａ、内因性ＢＭＰシグナル伝達が、非神経誘導に影響を与えるかどうかを試験するための実験の概説。ｂ〜ｄ、ＬＳＢ処理は、凝集体全体にわたって、ＮＣＡＤ発現を引き起こす。ＮＣＡＤ＋ＰＡＸ６＋細胞の亜集団（図１Ｅを参照）が、ＳＢ処理凝集体のコアにおいて出現することに留意されたい。スケールバー、５０μｍ。

【図7-2】ＳＢ処理ＷＡ２５凝集体における非神経外胚葉誘導が、内因性ＢＭＰシグナル伝達に起因することを示す図である。ａ、内因性ＢＭＰシグナル伝達が、非神経誘導に影響を与えるかどうかを試験するための実験の概説。ｂ〜ｄ、ＬＳＢ処理は、凝集体全体にわたって、ＮＣＡＤ発現を引き起こす。ＮＣＡＤ＋ＰＡＸ６＋細胞の亜集団（図１Ｅを参照）が、ＳＢ処理凝集体のコアにおいて出現することに留意されたい。スケールバー、５０μｍ。

【図8-1】ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣによる非神経外胚葉誘導を示す図である。ａ、ｂ、Ｅ８培地においてビトロネクチン−Ｎでコーティングしたプレート上に維持したＷＡ２５細胞は、準備刺激した多能性幹細胞のマーカーを発現する。ｃ、分化戦略および実験条件の概説。他のＢＭＰ濃度を、予備実験で試験し（１．２５、２．５、５、１０、２０、４０ｎｇ／ｍｌ）、２．５ｎｇ／ｍｌを、ＳＢ処理ＷＡ２５細胞において見られる形態学的変化（即ち、半透明の球体）をもたらす最小濃度として選択した（図６Ｃを参照）。ｄ、０〜６日目のＳＢまたはＳＢＢ処理凝集体の代表的な画像。ｅ、ｆ、ＳＢ処理凝集体は、６日目までに、ＰＡＸ６＋ＮＣＡＤ＋上皮、ＴＦＡＰ２＋遊走性細胞および数個のＥＣＡＤ＋細胞を生成し、神経外胚葉および神経堤細胞の異種ミックスを示唆する。ｇ、内因性のＢＭＰシグナル伝達は、ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣにおいて、非神経変換には不十分であり、したがって、さらなるＢＭＰ４が必要である。スケールバー、１００μｍ（ｄ）、２５μｍ（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）。

【図8-2】ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣによる非神経外胚葉誘導を示す図である。ａ、ｂ、Ｅ８培地においてビトロネクチン−Ｎでコーティングしたプレート上に維持したＷＡ２５細胞は、準備刺激した多能性幹細胞のマーカーを発現する。ｃ、分化戦略および実験条件の概説。他のＢＭＰ濃度を、予備実験で試験し（１．２５、２．５、５、１０、２０、４０ｎｇ／ｍｌ）、２．５ｎｇ／ｍｌを、ＳＢ処理ＷＡ２５細胞において見られる形態学的変化（即ち、半透明の球体）をもたらす最小濃度として選択した（図６Ｃを参照）。ｄ、０〜６日目のＳＢまたはＳＢＢ処理凝集体の代表的な画像。ｅ、ｆ、ＳＢ処理凝集体は、６日目までに、ＰＡＸ６＋ＮＣＡＤ＋上皮、ＴＦＡＰ２＋遊走性細胞および数個のＥＣＡＤ＋細胞を生成し、神経外胚葉および神経堤細胞の異種ミックスを示唆する。ｇ、内因性のＢＭＰシグナル伝達は、ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣにおいて、非神経変換には不十分であり、したがって、さらなるＢＭＰ４が必要である。スケールバー、１００μｍ（ｄ）、２５μｍ（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）。

【図9】非神経外胚葉誘導が、中内胚葉細胞のオフターゲット誘導を伴わずに起きることを示す図である。０日目に１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（ａ）、１０μＭ ＳＢ（ｂ）および１０μＭ ＳＢ＋２．５ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４（ｃ）で処理した４日目の凝集体における代表的なブラキュリ（ＢＲＡ）免疫組織化学。スケールバー、５０μｍ。

【図10-1】ＦＧＦ−２およびＬＤＮ（「ＦＬ」）処理によるＷＡ２５ｈＥＳＣおよびｍＮＤ２−０ｉＰＳＣ凝集体におけるＯＥＰＤ様上皮の誘導を示す図である。ａ、ｂ、ＳＯＸ２、ＴＦＡＰ２およびＥＣＡＤは、４日目のＦＬ処理後に、８日目にＳＢ処理ＷＡ凝集体全体にわたって発現される。ＰＡＸ８発現は、外側上皮に制限される。上鰓および耳プラコードの独自の特徴は、ＥＣＡＤおよびＮＣＡＤの同時発現である。ここで、ＮＣＡＤ発現は、最も内部のコアを除いて、凝集体全体にわたって観察された。ｃ、ｄ、ＳＢＢで処理したｉＰＳＣは、ＰＡＸ８を全く発現しない。４日目のＦＬ処理は、より厚い外側上皮形態およびＰＡＸ８の発現を誘導する。ＥＣＡＤおよびＴＦＡＰ２は、ＳＢＢ＋ＦＬ（ｄ４）処理ｉＰＳＣ凝集体全体にわたって発現される。スケールバー、１００μｍ。

【図10-2】ＦＧＦ−２およびＬＤＮ（「ＦＬ」）処理によるＷＡ２５ｈＥＳＣおよびｍＮＤ２−０ｉＰＳＣ凝集体におけるＯＥＰＤ様上皮の誘導を示す図である。ａ、ｂ、ＳＯＸ２、ＴＦＡＰ２およびＥＣＡＤは、４日目のＦＬ処理後に、８日目にＳＢ処理ＷＡ凝集体全体にわたって発現される。ＰＡＸ８発現は、外側上皮に制限される。上鰓および耳プラコードの独自の特徴は、ＥＣＡＤおよびＮＣＡＤの同時発現である。ここで、ＮＣＡＤ発現は、最も内部のコアを除いて、凝集体全体にわたって観察された。ｃ、ｄ、ＳＢＢで処理したｉＰＳＣは、ＰＡＸ８を全く発現しない。４日目のＦＬ処理は、より厚い外側上皮形態およびＰＡＸ８の発現を誘導する。ＥＣＡＤおよびＴＦＡＰ２は、ＳＢＢ＋ＦＬ（ｄ４）処理ｉＰＳＣ凝集体全体にわたって発現される。スケールバー、１００μｍ。

【図11-1】ＯＥＰＤ誘導凝集体が、最小培地浮遊培養において感覚様ニューロンを自発的に生成することを示す図である。ａ、実験の概説。ＳＢＦＬ処理凝集体を、分化の８日目にＯＭＭに移動した。ｂ〜ｄ、２０日目に、凝集体は、ＢＲＮ３Ａ＋ＴＵＪ１＋ＨＵＣ＋ＥＣＡＤ周囲のニューロン＋上皮のパッチで構成された。ニューロンパッチは通常、ＰＡＸ８＋上皮と関連付けられた。凝集体をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）液滴に含めた形で蒔いた場合、それらは、神経突起伸長をもたらした（ｅ）。ｆ、ＰＡＸ８＋ＥＣＡＤ＋上皮から出現するＢＲＮ３Ａ＋ニューロンは、上鰓プラコードニューロン新生と一致するが、これらのデータは、感覚ニューロンの起源として、ＰＡＸ８＋ＥＣＡＤ＋上皮を直接的に確立しない。スケールバー、１００ｕｍ（ｂ、ｃ、ｄ）、５０μｍ（ｅ）。

【図11-2】ＯＥＰＤ誘導凝集体が、最小培地浮遊培養において感覚様ニューロンを自発的に生成することを示す図である。ａ、実験の概説。ＳＢＦＬ処理凝集体を、分化の８日目にＯＭＭに移動した。ｂ〜ｄ、２０日目に、凝集体は、ＢＲＮ３Ａ＋ＴＵＪ１＋ＨＵＣ＋ＥＣＡＤ周囲のニューロン＋上皮のパッチで構成された。ニューロンパッチは通常、ＰＡＸ８＋上皮と関連付けられた。凝集体をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）液滴に含めた形で蒔いた場合、それらは、神経突起伸長をもたらした（ｅ）。ｆ、ＰＡＸ８＋ＥＣＡＤ＋上皮から出現するＢＲＮ３Ａ＋ニューロンは、上鰓プラコードニューロン新生と一致するが、これらのデータは、感覚ニューロンの起源として、ＰＡＸ８＋ＥＣＡＤ＋上皮を直接的に確立しない。スケールバー、１００ｕｍ（ｂ、ｃ、ｄ）、５０μｍ（ｅ）。

【図12】分化の８日〜１０日間のＷＮＴおよびＦＧＦシグナル伝達調節およびＰＡＸ８／ＰＡＸ２発現を示す図である。ａ、これらのｑＰＣＲデータは、ＯＥＰＤ誘導後にＰＡＸ２発現を増加させることができるシグナル伝達モジュレーターを同定することに焦点を当てた予備的な実験の１つを代表する。ｂ、ｃ、ＰＤ−１７３０７４を使用したＦＧＦ阻害は、発生研究に基づいて予想されるように、ＰＡＸ２発現を阻害する可能性が高い（Groves et al., Development 139, 245-257 (2012)）。対比して、ＷＮＴ阻害剤であるＸＡＶ９３９、およびＷＮＴアゴニストであるＣＨＩＲ９９０２１は、ＤＭＳＯ対照と比較して、ＰＡＸ２発現に対して控えめの正または負の影響を有するに過ぎなかった。これらの結果およびＰＡＸ２発現に関する広範な免疫染色に基づいて、本発明者らは、ＯＥＰＤ上皮が、それが耳誘導性の指示に応答する前に多くの時間を要し得ると推論した。したがって、本発明者らは、初期培養期を１２日に延長すること（８日目の新鮮な培地の添加を伴う）、および凝集体をＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）液滴へ移行することの効果を試験することによって戦略を変更した。

【図13-1】耳胞が表皮ケラチノサイトのコア上皮付近で放射状に膨出することを示す図である。ａ〜ｃ、表皮および耳胞上皮の内部組織化を示す３５日目の凝集体を通しての系列切片。ＫＲＴ５発現は、表皮に制限される一方で、ＥＣＡＤは、表皮および耳胞上皮細胞の両方において発現される。（ａ）において、矢頭は、ＳＯＸ１０＋耳胞を標識する。凝集体の間葉系層におけるＣＮＣ様ＳＯＸ１０＋ＴＦＡＰ２−およびＳＯＸ１０＋ＴＦＡＰ２＋細胞に留意されたい。パネル（ｃ）で強調される小胞の対は、パネル（ｂ）では、より低倍率および異なる配向性で標識される。（ｃ）で見られる小胞は、耳胞マーカーＳＯＸ１０、ＰＡＸ２、ＦＢＸＯ２、ＪＡＧ１およびＥＣＡＤを同時発現することが示されていた。ｄ〜ｇ、表皮コアおよび周囲耳胞を明らかにするためのＥＣＡＤに関してホールマウント免疫染色した３５日目の凝集体。スケールバー、２５０μｍ（ｄ、ｆ）、１００μｍ（ａ、ｂ）、２５μｍ（ｃ、ｇ）。

【図13-2】耳胞が表皮ケラチノサイトのコア上皮付近で放射状に膨出することを示す図である。ａ〜ｃ、表皮および耳胞上皮の内部組織化を示す３５日目の凝集体を通しての系列切片。ＫＲＴ５発現は、表皮に制限される一方で、ＥＣＡＤは、表皮および耳胞上皮細胞の両方において発現される。（ａ）において、矢頭は、ＳＯＸ１０＋耳胞を標識する。凝集体の間葉系層におけるＣＮＣ様ＳＯＸ１０＋ＴＦＡＰ２−およびＳＯＸ１０＋ＴＦＡＰ２＋細胞に留意されたい。パネル（ｃ）で強調される小胞の対は、パネル（ｂ）では、より低倍率および異なる配向性で標識される。（ｃ）で見られる小胞は、耳胞マーカーＳＯＸ１０、ＰＡＸ２、ＦＢＸＯ２、ＪＡＧ１およびＥＣＡＤを同時発現することが示されていた。ｄ〜ｇ、表皮コアおよび周囲耳胞を明らかにするためのＥＣＡＤに関してホールマウント免疫染色した３５日目の凝集体。スケールバー、２５０μｍ（ｄ、ｆ）、１００μｍ（ａ、ｂ）、２５μｍ（ｃ、ｇ）。

【図14-1】内耳オルガノイドが前庭様感覚上皮を生成することを示す図である。ａ、３つの可視的な内耳オルガノイド（矢頭）を有する４８日目の凝集体。この検体は、図２Ｊで見られる検体とは別個の実験に由来していたことに留意されたい。ｂ、オルガノイド有毛細胞は、ＩＩ型前庭および内蝸牛有毛細胞マーカーＣＡＬＢ２を発現する。ｃ、支持細胞全体にわたってＳＰＡＲＣＬ１の発現を示す感覚上皮の断面。ＳＯＸ２は、支持細胞およびＰＣＰ４＋有毛細胞の両方において発現している。ｄ〜ｆ、ＳＯＸ１０は、支持細胞および非感覚上皮細胞全体にわたって発現される。Ｆ−アクチンリッチな外周ベルトは、感覚および非感覚上皮の両方において観察された。スケールバー、１００μｍ（ａ、ｄ、ｅ）、２５μｍ（ｂ、ｃ）、１０μｍ（ｆ）。

【図14-2】内耳オルガノイドが前庭様感覚上皮を生成することを示す図である。ａ、３つの可視的な内耳オルガノイド（矢頭）を有する４８日目の凝集体。この検体は、図２Ｊで見られる検体とは別個の実験に由来していたことに留意されたい。ｂ、オルガノイド有毛細胞は、ＩＩ型前庭および内蝸牛有毛細胞マーカーＣＡＬＢ２を発現する。ｃ、支持細胞全体にわたってＳＰＡＲＣＬ１の発現を示す感覚上皮の断面。ＳＯＸ２は、支持細胞およびＰＣＰ４＋有毛細胞の両方において発現している。ｄ〜ｆ、ＳＯＸ１０は、支持細胞および非感覚上皮細胞全体にわたって発現される。Ｆ−アクチンリッチな外周ベルトは、感覚および非感覚上皮の両方において観察された。スケールバー、１００μｍ（ａ、ｄ、ｅ）、２５μｍ（ｂ、ｃ）、１０μｍ（ｆ）。

【図15】ヒト内耳誘導研究の比較を示す図である。２Ｄ、二次元。３Ｄ、三次元。ＯＥＰ、耳上皮前駆体。注釈：Chen et al. (2002)のプロトコールでは、ＯＥＰ生成の効率は、細胞株、播種密度および細胞分離の度合いに依存する。Ronaghi et al. (2014)のプロトコールでは、有毛細胞様細胞生成効率１．７９％が、中レベルのＡｔｏｈ１−ｎＧＦＰ発現を伴う細胞から算出され（１９．８％×９．０３％＝１．７９％）、それは、「潜在的な有毛細胞表現型の指標」であると考えられる。高いＡｔｏｈ１−ｎＧＦＰ発現を有する細胞およびＡｔｏｈ１−ｎＧＦＰ発現に関して陰性である細胞も考慮すると、有毛細胞様細胞生成効率は、５．８９％である（７７．１％×５．２４％＋１９．８％×９．０３％＋３．１％×２．０８％＝５．８９％）。

【図16】耳ニューロン新生を示す図である。（ａ〜ｂ）ＳＯＸ２＋耳胞および窩は通常、ＩＳＬ１＋ＴＵＪ１＋神経芽細胞と関連付けられる（１４日目）。耳胞の上皮は、この段階で高度にニューロン原性であるようであり、全体にわたって弱いＴＵＪ１染色を伴う。（ｃ）ＮＧＮ１およびＮＧＮ２は、ＣＨＩＲ処理試料において１４日目に発現される。未分化ＰＳＣに対して標準化（ｎ＝３）。スケール、１００（ａ）、２０（ｂ）μｍ。

【図17】感覚ニューロン伸長および成熟を示す図である。Ｍａｔｒｉｇｅｌ上に蒔いたＨＩＲ処理オルガノイドは、双極性形態を有するＴＵＪ１＋ＢＲＮ３Ａ＋ニューロンを生じる。成長円錐（ｂにおける挿入図）。スケール、５００（ａ）、５０（ｂ）、１０（ｃ）。

【図18】内耳オルガノイド由来の有毛細胞が、リボンシナプス様構造を有し、感覚ニューロンによって神経交配されることを示す図である。Ａ〜Ｂ、分化の６０日目のＷＡ２５ｈＥＳＣ由来のＰＣＰ４陽性有毛細胞におけるＣＴＢＰ２陽性斑点。Ｃ、内耳オルガノイド感覚上皮を神経交配するニューロンの代表的な画像。スケールバー、１００μｍ（Ｃ）、２５μｍ（Ａ、Ｂ）。

【図19-1】ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏドナープラスミド配列（配列番号２１）を表す図である。

【図19-2】ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏドナープラスミド配列（配列番号２１）を表す図である。

【図20】ＡＴＯＨ１遺伝子座におけるホモ接合性／二対立遺伝子ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ細胞株のゲノム配列（配列番号２２）を表す図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

詳細な説明
本明細書中で言及する刊行物、特許および特許出願は全て、それぞれ個々の刊行物、特許および特許出願が、具体的にかつ個々に、参照により組み込まれるように示されるかのように、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0011】

本発明は、分化およびリモデリングに対して許容的である条件下で培養されるヒト多能性幹細胞由来の前駆細胞が、ヒト内耳感覚上皮の複雑さおよび組織化を再現し、また機能性有毛細胞を含む内耳組織の高度に一様な組成物を形成するという本発明者らの発見に少なくとも部分的に基づいている。本発明者らは、大規模で定量的なｉｎ ｖｉｔｒｏでのモデリングおよびスクリーニング用途に必要な一様性を有する複雑なヒト組織を産生することが可能であることを発見した。

【0012】

したがって、本発明は、三次元組織構築物および培養物を含む組成物、ならびにヒト内耳組織の高度に一様なモデルのような組成物を使用する方法および薬物候補物をスクリーニングする方法に関する。特に、移植用のヒト有毛細胞の供給源として、感覚消失を理解するためのモデルとして、および薬物候補物をスクリーニングするためのプラットフォームとして適切な、複雑で組織化されたヒト内耳感覚組織を効率的にかつ再現性よく、産生ならびに増殖させる方法が、本明細書中に提供される。本明細書中に提供する方法および系の重要な利点は、単一細胞供給源から多重機能性細胞型を含む複雑な組織構築物を生成する能力である。さらに、本明細書中に提供する方法および系は、複雑で組織化された内耳構造層のｉｎ ｖｉｖｏでの発生を忠実に再現する。本発明は、ヒト内耳感覚組織を生成するための測定可能かつ頑強な系、ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒトモデルにおいてかかる組織を研究するための重要な機会を提供する。さらに、本発明の方法は、材料を同定するのに、およびヒト組織工学に関するコンビナトリアル戦略に有用である。

【0013】

方法
例示的な実施形態では、本明細書中に提供する方法は、多能性幹細胞の内耳感覚組織への分化を促進する条件下で、ヒト多能性幹細胞を分化させることを含む。概して、内耳感覚組織の細胞は、それらの表面の表現型によって、増殖因子に応答する能力によって、および特定の細胞系列へｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで分化することが可能であることによって同定される。

【0014】

第１の態様では、ヒト内耳感覚組織を獲得する方法は、ヒト多能性幹細胞をスフェロイドへ凝集させることと、非神経上皮（ＮＮＥ）の誘導を促進する要素を含む培養培地の存在下で約３〜４日間、スフェロイドを培養することとを含む。かかる培養培地は、下記の化学的に明確な（chemically defined）構成成分：骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）および例えば、ＳＢ−４３１５４２（「ＳＢ」）などのトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナル伝達の阻害剤を含むか、またはそれらから本質的になり、それにより、多能性幹細胞の少なくともサブセットが、分化するように誘導されて、各凝集体内で中胚葉細胞のコアを形成する。好ましくは、中胚葉細胞のコアを含む凝集体は、ＢＭＰ４およびＴＧＦβシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＳＢ）の存在下で、約８日〜約１０日間培養される。ＳＢ−４３１５４２は、アクチビン受容体様キナーゼ受容体ＡＬＫ５、ＡＬＫ４およびＡＬＫ７の特異的な阻害剤である。８〜１０日の培養後に、中胚葉コアの細胞は、凝集体の表面に遊走して、非神経上皮の層を生じ、その内部で、内耳オルガノイドが発生する。ここで凝集体のコアを裏打ちしている内耳オルガノイドを生じる非神経上皮は、最終的に表皮組織へ分化することができる。

【0015】

図１を参照すると、上記で概要する培養ステップに従って形成されるＮＮＥ細胞は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）（例えば、ＦＧＦ−２）および骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達の阻害剤の組合せの存在下で培養され、それにより、ＮＮＥ細胞は、耳上鰓前駆体ドメイン（ＯＥＰＤ）としても公知である前耳上皮へ分化し、耳プラコードはそれに由来する。ＯＥＰＤは、ＴＧＦβシグナル伝達阻害剤単独の存在下で培養されるＮＮＥ細胞と比較して肥厚し、ＰＡＸ８、ＳＯＸ２、ＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＮＣＡＤなどの後プラコードマーカーの組合せを発現する。本明細書中に提供する方法に従う使用に適したＢＭＰシグナル伝達の阻害剤として、ＬＤＮ−１９３１８９およびＳＢ−４３１５４２が挙げられるが、限定されない。ＬＤＮ−１９３１８９は、ＢＭＰ Ｉ型受容体ＡＬＫ２およびＡＬＫ３の転写活性を阻害する選択的ＢＭＰシグナル伝達阻害剤である。

【0016】

次に、前耳上皮（即ち、ＯＥＰＤ）を含む凝集体を、例えば細胞外マトリックスタンパク質の半固体組成物などの半固体培養培地中に包埋する。続いて、包埋した凝集体を、前耳上皮が、組織化された耳胞へ自己集合するまで、Ｗｎｔアゴニストの存在下で培養する。幾つかの場合において、前耳上皮を含む凝集体を、Ｗｎｔアゴニストの存在下で、約１０日〜約１４日（例えば、約１０、１１、１２、１３または１４日）間培養する。

【0017】

耳胞を含んだ（Otic vesicle-laden）凝集体を、少なくとも約４０日（例えば、約４０日、約４５日、約５０日、約６０日、約６５日、約７０日、約７５日、またはそれ以上）の間さらに培養し、その間に、機械感覚細胞（例えば、有毛細胞）を含む内耳オルガノイドが獲得される。有毛細胞は、聴覚および平衡を媒介する脊椎動物内耳ならびに側線器官の特殊機械感覚受容体細胞である。

【0018】

凝集体を形成するために、多能性幹細胞のコンフルエントな培養物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などの表面から、凝集塊、凝集体、または単一細胞へと、化学的に、酵素的にまたは機械的に解離させることができる。例示的な実施形態では、解離された細胞（凝集塊、凝集体、または単一細胞として）は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ１２、ｍＴｅＳＲ（商標）（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；バンクーバー、ブリティッシュコロンビア、カナダ）およびＴｅＳＲ（商標）などのタンパク質を含まない基本培地中の表面上へ蒔かれる。ＴｅＳＲ（商標）の完全な成分および使用方法は、Ludwigらにおいて記載されている。例えば、Ludwig T, et al., "Feeder-independent culture of human embryonic stem cells," Nat. Methods 3:637-646 (2006)およびLudwig T, et al., "Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions," Nat. Biotechnol. 24:185-187 (2006)を参照されたい。それらはそれぞれ、その全体が記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中の使用に適した他のＤＭＥＭ配合物として、例えば、Ｘ−Ｖｉｖｏ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、ウォーカーズビル、ＭＤ）およびＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カールズバッド、ＣＡ）が挙げられる。

【0019】

幾つかの場合において、多能性幹細胞の凝集体は、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で培養される。ＲＯＣＫ阻害剤などのキナーゼ阻害剤は、単一細胞および細胞の小さな凝集体を保護することが知られている。例えば、その全体が記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１７１３８５号明細書、およびWatanabe K, et al., "A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells," Nat. Biotechnol. 25:681-686 (2007)を参照されたい。化学的に明確な表面上で多能性細胞生存を著しく増加させるためのＲＯＣＫ阻害剤を以下に示す。本明細書中の使用に適したＲＯＣＫ阻害剤として、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−１−［（４−メチル−５−イソキノリニル）スルホニル］ホモピペラジン二塩酸塩（非公式名称：Ｈ−１１５２）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ピペラジン塩酸塩（非公式名称：Ｈ−１００）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−２−メチルピペラジン（非公式名称：Ｈ−７）、１−（５−イソキノリンスルホニル）−３−メチルピペラジン（非公式名称：イソＨ−７）、Ｎ−２−（メチルアミノ）エチル−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（非公式名称：Ｈ−８）、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（非公式名称：Ｈ−９）、Ｎ−［２−ｐ−ブロモシンナミルアミノ）エチル］−５−イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（非公式名称：Ｈ−８９）、Ｎ−（２−グアニジノエチル）−５−イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（非公式名称：ＨＡ−１００４）、１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（非公式名称：ＨＡ−１０７７）、（Ｓ）−（＋）−２−メチル−４−グリシル−１−（４−メチルイソキノリニル−５−スルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（非公式名称：グリシルＨ−１１５２）および（＋）−（Ｒ）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキシアミド二塩酸塩（非公式名称：Ｙ−２７６３２）が挙げられるが、これらに限定されない。キナーゼ阻害剤は、細胞が生存して、表面上に結合したままであるほど十分高い濃度で供給され得る。約３μＭ〜約１０μＭの阻害剤濃度が適切であり得る。より低濃度では、またはＲＯＣＫ阻害剤が供給されない場合では、未分化細胞は通常、剥離するのに対して、分化細胞は、規定表面に結合したままである。

【0020】

ＦＧＦ−２は、ＦＧＦシグナル伝達のアゴニストであり、ＦＧＦシグナル伝達は、例えば、小分子阻害剤ＰＤ−１７３０７４を使用して拮抗させることができる。ＢＭＰ４は、ＢＭＰシグナル伝達のアゴニストであり、ＢＭＰシグナル伝達は、例えば、小分子阻害剤ＬＤＮ−１９３１８９を使用して拮抗させることができる。ＴＧＦβ−１およびアクチビンＡは、ＴＧＦβシグナル伝達のアゴニストであり、ＴＧＦβシグナル伝達は、例えば、小分子阻害剤ＳＢ−４３１５４２を使用して拮抗させることができる。ＣＨＩＲ−９９０２１は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路のアゴニストであり、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、例えば、小分子阻害剤ＸＡＶ−９３９を使用して拮抗させることができる。他のＷｎｔアゴニストとして、分子グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）の阻害剤／アンタゴニストが挙げられる。

【0021】

幾つかの場合において、細胞外マトリックスタンパク質の半固体組成物は、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）基底膜マトリックスなどの市販の製品である。Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）基底膜マトリックスは、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭまたはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地系を使用したヒト多能性幹細胞適用を用いた使用に適している。他の場合において、半固体組成物は、例えば、ラミニン、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、コラーゲン、またはそれらの組合せなどの２つまたはそれ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む。

【0022】

好ましくは、ヒト多能性幹細胞は、その全体が記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれるChen et al., Nature Methods 8:424-429 (2011)に記載されるように、培養培地「ＤＦ３Ｓ」の規定構成成分を含む化学的に明確な基本培養培地配合物中で培養される。本明細書中で使用する場合、「Ｅ７培養培地」および「Ｅ７」という用語は、交換可能に使用され、インスリン（２０μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１０．６７ｎｇ／ｍＬ）およびヒト線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）（１００ｎｇ／ｍＬ）をさらに含むように補充されたＤＦ３Ｓを含むか、またはそれから本質的になる化学的に明確な培養培地を指す。本明細書中で使用する場合、「Ｅ８培養培地」および「Ｅ８」という用語は、交換可能に使用され、インスリン（２０μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン（１０．６７ｎｇ／ｍＬ）、ヒトＦＧＦ２（１００ｎｇ／ｍＬ）およびヒトＴＧＦβ１（トランスフォーミング増殖因子ベータ１）（１．７５ｎｇ／ｍＬ）の添加によって補充されたＤＦ３Ｓを含むか、またはそれから本質的になる化学的に明確な培養培地を指す。

【0023】

任意の適切な方法を使用して、本明細書中に記載する細胞型に特徴的な生物学的マーカーの発現を検出することができる。例えば、１つまたは複数の生物学的マーカーの有無は、例えば、ＲＮＡ配列決定、免疫組織化学、ポリメラーゼ連鎖反応、ｑＲＴ−ＰＣＲ、または遺伝子発現を検出もしくは測定する他の技法を使用して検出することができる。例示的な実施形態では、本明細書中に提供する方法に従って獲得される細胞集団を、Ｆｏｘｉ１、Ｄｌｘ遺伝子、Ｐａｘ８、Ｐａｘ２、Ｓｏｘ３、Ｅｙａ１、Ｇａｔａ３、Ｇｂｘ２およびＳｏｘ９などの前耳上皮細胞および耳プラコードの生物学的マーカーの発現（またはそれらの非存在）に関して評価する。細胞集団においてタンパク質レベルでマーカーの発現を評価する定量的な方法もまた、当該技術分野で公知である。例えば、フローサイトメトリーは、目的の生物学的マーカーを発現するか、またはそれらを発現しない所定の細胞集団における細胞の割合を確定するのに使用される。分化細胞の独自性（identity）はまた、ＮＡＮＯＧおよびＯＣＴ４などの多能性マーカーのダウンレギュレーション（ヒトＥＳ細胞または誘導多能性幹細胞に対して）と関連付けられる。

【0024】

本明細書中で使用する場合、本発明の方法に従う使用に適した「多能性幹細胞」は、３つの胚葉全ての細胞へ分化する能力を有する細胞である。本明細書中の使用に適した多能性細胞は、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を含む。本明細書中で使用する場合、「胚幹細胞」または「ＥＳＣ」は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性細胞または多能性細胞の集団を意味する。Thomson et al., Science 282:1145-1147 (1998)を参照されたい。これらの細胞は、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を発現し、細胞質に対する核の高い比および顕著な核小体を有する密集したコロニーとして現れる。ＥＳＣは、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（マディソン、Ｗｉｓ．）などの供給源から市販されている。本明細書中で使用する場合、「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」は、元となるそれらの分化体細胞に関して変動する場合があり、効力決定因子の特異的な組に関して変動する場合があり、またそれらを単離するのに使用する培養条件に関して変動する場合があるが、それにも関わらず、元となるそれら各々の分化体細胞と実質的に遺伝的に同一であり、本明細書中に記載するように、ＥＳＣなどのより高い効率の細胞に類似した特徴を示す多能性細胞または多能性細胞の集団を意味する。例えば、Yu et al., Science 318:1917-1920 (2007)を参照されたい。

【0025】

誘導多能性幹細胞は、ＥＳＣと類似した形態学的特性（例えば、円形、大きな核小体および乏しい細胞質）および成長特性（例えば、約１７〜１８時間の倍加時間）を示す。さらに、ｉＰＳ細胞は、多能性細胞特異的マーカー（例えば、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０またはＴｒａ−１−８１、但しＳＳＥＡ−１ではない）を発現する。しかしながら、誘導多能性幹細胞は、胚から即時に得られるわけではない。本明細書中で使用する場合、「胚から即時に得られるわけでない」は、ｉＰＳ細胞を産生するための開始細胞型が、多分化能細胞などの非多能性細胞または生後の個体から得られる体細胞などの最終分化細胞であることを意味する。

【0026】

ヒトｉＰＳ細胞は、本明細書中に記載する方法に従って使用して、特定のヒト対象の遺伝的相補体を有する原始マクロファージおよびミクログリア細胞を獲得することができる。例えば、特定の哺乳動物対象の特定の疾患または障害と関連付けられるか、またはそれから生じる１つまたは複数の特異的な表現型を示す内耳感覚細胞を獲得することは、好適であり得る。かかる場合において、ｉＰＳ細胞は、当該技術分野で公知の方法に従って、特定のヒト対象の体細胞を再プログラミングすることによって獲得される。例えば、Yu et al., Science 324(5928):797-801 (2009)；Chen et al., Nat. Methods 8(5):424-9 (2011)；Ebert et al., Nature 457(7227):277-80 (2009)；Howden et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108(16):6537-42 (2011)を参照されたい。誘導多能性幹細胞由来の内耳感覚組織を使用して、例えば特定の疾患を有する個体において内耳感覚組織を再現する組織構築物における薬物候補物をスクリーニングすることができる。誘導多能性幹細胞へ再プログラミングするための対象特異的な体細胞は、バイオプシーまたは他の組織サンプリング方法によって、目的の標的組織から獲得または分離され得る。幾つかの場合において、対象特異的な細胞は、本発明の三次元組織構築物において使用する前に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作される。例えば、対象特異的な細胞は、増殖させることができるか、分化させることができるか、遺伝的に修飾することができるか、ポリペプチド、核酸もしくは他の因子に接触させることができるか、冷凍保存することができるか、またはそうでなければ、三次元組織構築物への導入前に修飾することができる。

【0027】

好ましくは、ヒト多能性幹細胞（例えば、ヒトＥＳＣまたはｉＰＳ細胞）は、フィーダー層（例えば、線維芽細胞層）、条件培地、またはあまり規定されていないか、もしくは未規定の構成成分を含む培養培地の非存在下で培養される。本明細書中で使用する場合、「化学的に明確な培地」および「化学的に明確な培養培地」という用語はまた、完全に開示されているか、または同定可能な成分の配合物を含有する培養培地を指し、それらの正確な量は、知られているか、または同定可能であり、個々に制御することができる。したがって、培養培地は、（１）培地成分全ての化学的および構造的独自性が未知である場合、（２）培地が、未知量の任意の成分を含有する場合、または（３）その両方の場合に、化学的に明確ではない。化学的に明確な培養培地を使用することによって培養条件を標準化することにより、細胞が細胞培養中に曝露される材料におけるロット間またはバッチ間変動の可能性が最低限に抑えられる。したがって、様々な分化因子の効果は、化学的に明確な条件下で培養された細胞および組織に添加する場合には、より予想可能である。本明細書中で使用する場合、「無血清」という用語は、動物（例えば、ウシ胎児）血液から獲得される血清を含まない細胞培養材料を指す。概して、動物由来の材料の非存在下で（即ち、異種を含まない条件下で）細胞または組織を培養することにより、種間ウイルスもしくはプリオン伝播の可能性が低減または排除される。

【0028】

別記しない限り、本明細書中で使用する技術および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載する方法および材料に類似するか、またはそれらに等価な任意の方法および材料を、本発明の実施または実験において使用することができるが、好ましい方法および材料を本明細書中に記載する。

【0029】

本明細書中で使用する場合、「から本質的になる培地」は、指定成分およびその基本特性に実質的に影響を及ぼさない成分を含有する培地を意味する。

【0030】

本明細書中で使用する場合、「有効な量」は、本発明に従って、指定細胞効果を誘起するのに十分な作用物質の量を意味する。

【0031】

本明細書中で使用する場合、「約」は、表明した濃度範囲、密度、温度または時間枠の５％以内を意味する。


本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
ヒト前耳上皮細胞を得る方法であって、
（ａ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、およびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）シグナル伝達の阻害剤を含む培養培地中で、約８〜約１０日間、ヒト多能性幹細胞凝集体を培養するステップと、
（ｂ）（ａ）の培養した凝集体を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびＢＭＰシグナル伝達の阻害剤の存在下で約４日間、さらに培養するステップと、
（ｂ）（ｂ）のさらに培養した凝集体を、Ｗｎｔアゴニストに約４日間接触させるステップであって、それにより、接触させた凝集体内の細胞が、前耳上皮細胞へ分化する、ステップと
を含む方法。
［２］
前記ＦＧＦがＦＧＦ−２である、請求項１に記載の方法。
［３］
前記ＢＭＰが、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４およびＢＭＰ７からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
［４］
ＢＭＰシグナル伝達の前記阻害剤が、ＬＤＮ−１９３１８９である、請求項１に記載の方法。
［５］
ＴＧＦβ１媒介性シグナル伝達の前記阻害剤が、ＳＢ４３１５４２およびＡ−８３−０１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
［６］
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ３の阻害剤である、請求項１に記載の方法。
［７］
ＧＳＫ３の前記阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）および６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
［８］
ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物を得る方法であって、
（ａ）細胞外マトリックスタンパク質を含む半固体培養培地中に、請求項１に記載の方法に従って得られたヒト前耳上皮細胞を包埋するステップと、
（ｂ）包埋した前耳上皮細胞を、Ｗｎｔアゴニストの存在下で約４０〜約６０日間、包埋した前耳上皮細胞の耳胞への自己集合を促進する条件下で培養し、それにより、ヒト内耳感覚組織を含む三次元組成物が得られる、ステップと
を含む方法。
［９］
前記Ｗｎｔアゴニストが、ＧＳＫ３の阻害剤である、請求項８に記載の方法。
［１０］
ＧＳＫ３の前記阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）および６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
［１１］
前記細胞外マトリックスが、基底膜抽出物（ＢＭＥ）である、請求項８に記載の方法。
［１２］
前記三次元組成物が、１つまたは複数の機械感覚細胞を含む、請求項８に記載の方法。
［１３］
前記三次元組成物が、１つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含む、請求項８に記載の方法。
［１４］
前記三次元組成物が、機械感覚細胞とシナプス結合を形成する１つまたは複数の感覚ニューロン細胞を含む、請求項８に記載の方法。

【0032】

本発明は、下記の非限定的な実施例を熟考して、より完全に理解される。開示する方法は、一般的に多能性幹細胞に適していることが、具体的に意図される。本明細書中に開示する論文および特許は全て、その全体が記載されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
［実施例］

【実施例1】

【0033】

ヒト多能性幹細胞からの、機能性有毛細胞を有する内耳オルガノイドの生成
ヒト内耳は、機械感受性不動毛束を介して音および動きを検出するおよそ２０，０００個の感覚有毛細胞を含有する^１。遺伝子突然変異または大きな雑音などの環境障害は、これらの有毛細胞に対して回復不能な損傷を引き起こして、眩暈または聴力損失を引き起こし得る^２、３。本発明者らはこれまでに、３Ｄ培養系においてＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＢＭＰおよびＷｎｔシグナル伝達経路の時限操作を使用して、マウス多能性幹細胞（ＰＳＣ）から内耳オルガノイドをどのように生成するかを示した^４〜６。本発明者らは、マウス内耳オルガノイドが、マウス内耳における自然前庭有毛細胞に類似した構造および機能を有する感覚有毛細胞を含有することを示してきた^７。さらに、本発明者らの過去の見解は、ＢＭＰシグナル伝達活性化およびＴＧＦβ阻害が非神経外胚葉を最初に特定し、続くＢＭＰ阻害およびＦＧＦ活性化が前耳の運命を誘導するという^８、９、耳誘導シグナル伝達動態の実用モデルを支持した。幾つかの最近の試みにもかかわらず、ヒトＰＳＣ（ｈＰＳＣ）から機能性有毛細胞を獲得するための発生的に忠実なアプローチは、いまだに記載されていない^{１０〜１５}。ここで、ｈＰＳＣからヒト内耳組織を生成するために、本発明者らはまず、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト内耳器官形成の時系列を確立させた（図１Ａ、図１Ｂ）。内耳は、外胚葉層から生じ、ヒトでは、受胎のおよそ５２日後（ｄｐｃ）までに、第１の最終分化有毛細胞を生じる^１６。エピブラストにおける多能性細胞から始まって、内耳誘導は、外胚葉上皮の形成を伴って、およそ１２ｄｐｃで開始される。続いて、上皮は、非神経外胚葉（表面外胚葉としても知られている）および神経外胚葉に分割する（図１Ａ、図１Ｂ）。非神経外胚葉は、最終的には内耳および皮膚の表皮を生じ、したがって、本発明者らの初期の実験では、本発明者らは、非神経外胚葉上皮の標的誘導に関して、化学的に明確な３Ｄ培養系を確立しようとしており、本発明者らは、それから内耳オルガノイドを得ることができた（図１Ａ〜図１Ｃ）。

【0034】

本発明者らはまず、解離ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ、ＷＡ２５細胞株、ＷｉＣｅｌｌ）が、ＲＯＣＫ阻害剤、Ｙ−２７６３２を含有するＥ８培地において良好に凝集し、化学的に明確な分化培地（これ以降、ＣＤＭ、図２Ａ〜図２Ｈおよび表１）において凝集した細胞と比較して、優れた一様性および細胞生存を示した。

【0035】

【表1】

【0036】

Ｅ８培地中での２日間のインキュベーション後、本発明者らは、凝集体を、低濃度のＭａｔｒｉｇｅｌおよびＦＧＦ−２を含有するＣＤＭへ移動して、凝集体表面上で上皮化および外胚葉分化を刺激した。本発明者らは、ＢＭＰ４およびＴＧＦβ阻害剤ＳＢ−４３１５４２（これ以降、「ＳＢ」）の組合せが、マウスＰＳＣ（ｍＰＳＣ）からの非神経誘導を促進することをこれまでに示した^６。本発明者らは、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ４および１０μＭ ＳＢを組み合わせること（「ＳＢＢ」と称される二重ＳＢ／ＢＭＰ４処理）により、ＴＦＡＰ２およびＤＬＸ３などの非神経マーカー遺伝子だけでなく、胚外マーカーＣＤＸ２も誘導することを見出した（図１Ｄ；図３Ａ〜図３Ｇ）^１７。対比して、ＳＢ処理単独は、相当するＣＤＸ２発現を伴わずに、ＴＦＡＰ２およびＤＬＸ３発現の増加をもたらした（図１Ｄ）。注目すべきことに、ＳＢ処理凝集体の１００％は、ヒト胚形成と一致する時間尺度である、分化の４〜６日目までに表面外胚葉形態を伴って、ＴＦＡＰ２^＋Ｅ−カドヘリン（ＥＣＡＤ）^＋上皮を生成した（ｎ＝１５個の凝集体、３回の実験、図１Ｂ〜図１Ｅ、図３Ａ〜図３Ｇ）。２０日の期間にわたって、上皮は、ＴＦＡＰ２^＋ケラチン−５（ＫＲＴ５）^＋ケラチノサイト様細胞で構成されるシストへと増殖した（図６Ａ〜図６Ｅ）。これらの見解から、本発明者らは、ＷＡ２５細胞凝集体をＳＢで処理することが、非神経上皮を誘導するのに十分であると結論付けた。

【0037】

内因性ＢＭＰ活性が、非神経特定に十分であるかどうかに関心を持ったので、本発明者らは、ＢＭＰ阻害剤であるＬＤＮ−１９３１８９で同時処理を実施した（これ以降、ＬＳＢ；ＬＳＢと称される二重ＬＤＮ／ＳＢ処理）。ｈＥＳＣ単層培養においてこれまでに示されるように^１８、ＷＡ２５凝集体へのＬＳＢ処理は、ＰＡＸ６およびＮ−カドヘリン（ＮＣＡＤ）などの神経外胚葉マーカーをアップレギュレートして、ＴＦＡＰ２およびＥＣＡＤ発現を消滅させ、内因性ＢＭＰシグナルが、非神経変換を駆動させることを示唆した（図１Ｆ、図７Ａ〜図７Ｄ）。本発明者らのアプローチをさらに確証するために、本発明者らは、ヒトｉＰＳＣ（ｍＮＤ２−０、ＷｉＣｅｌｌ）をＳＢで処理して、ＷＡ２５ｈＥＳＣを用いた場合の本発明者らの結果に反して、ＳＢのみの条件が、ＰＡＸ６^＋神経外胚葉およびＴＦＡＰ２^＋ＥＣＡＤ⁻神経堤様細胞を生成した（図８Ａ〜図８Ｇ）。本発明者らは、内因性ＢＭＰレベルにおける変動が、種々の結末の根底にある可能性があり、ＢＭＰ濃度を、各細胞株に関して微調整する必要があり得ると推論した。したがって、ＳＢ（ＳＢＢ）に加えて、低濃度のＢＭＰ４（２．５ｎｇ／ｍｌ）は、ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣからＴＦＡＰ２^＋ＥＣＡＤ^＋非神経上皮を生成することができた（図１Ｇ、図８Ａ〜図８Ｇ）。ＳＢまたはＳＢＢアプローチのいずれかを用いて、得られた上皮は、ｍＰＳＣを用いて生成された非上皮に酷似していた^５、６。本発明者らのマウス培養と比較して、非神経変換は、ブラキュリ（ＢＲＡ）^＋中内胚葉細胞のオフターゲット誘導を伴わずに起きる（図９Ａ〜図９Ｃ）。下記データは、ＳＢ（ＷＡ２５）またはＳＢＢ（ｍＮＤ２−０）アプローチのいずれかを使用して作成された。

【0038】

次に、本発明者らは、ケラチノサイト決定（commitment）前に、非神経上皮を耳プラコード上皮へ変換しようと試みた。ヒト頭蓋プラコードは、およそ１８〜２４ｄｐｃで生じ、したがって、ｈＰＳＣは、およそ１２ｄｐｃの細胞を表すと仮定して、耳プラコードは、適正なシグナル伝達調節によって、分化の最初の６〜１２日以内に本発明者らの培養物において発生する（図１Ｂ）。ＦＧＦ活性化およびＢＭＰ阻害が、ｍＰＳＣ培養物からの前プラコードおよび耳誘導に必須であるという本発明者らのこれまでの見解に着目して、本発明者らは、４日目の凝集体を、ＦＧＦ−２およびＬＤＮの組合せ（これ以降、「ＳＢＦＬ」）で処理した。ＳＢＦＬ処理を用いた場合、外側上皮は、ＳＢ処理試料に対して肥厚し、ＰＡＸ８、ＳＯＸ２、ＴＦＡＰ２、ＥＣＡＤおよびＮＣＡＤなどの後プラコードマーカーの組合せを発現し、耳プラコードが生じる耳上鰓前駆体ドメイン（ＯＥＰＤ）に類似した表現型を示した（図１Ｈ〜図１Ｋ；図１０Ａ〜図１０Ｄ）。最小培地において自己誘導分化を受けることが可能である場合、本発明者らは、ＳＢＦＬ凝集体が、１０〜３０日目の間にＢＲＮ３Ａ^＋ＴＵＪ１^＋感覚様ニューロンを生成することを見出した（図１１Ａ〜図１１Ｆ）。上鰓プラコードおよび耳胞の両方が、感覚ニューロンを生じるため、本発明者らは、どの組織型が発生したかに興味を持った。とりわけ、本発明者らは、耳マーカーＰＡＸ２の発現も検出せず、また本発明者らは、ＳＢＦＬ処理凝集体においていかなる小胞も観察せず、それらは耳誘導を示す（データは示していない）。したがって、本発明者らは、ＳＢＦＬ処理が、上鰓ニューロンを誘導するのに十分である場合があるが、まだ耳誘導を開始させることはできないと結論付けた。

【0039】

ＰＡＸ２発現および小胞形成を促進するために、本発明者らは、様々なシグナル伝達モジュレーターを試験し始めた（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。本発明者らが試験した条件はいずれも、ｑＰＣＲ分析を使用したＰＡＸ２遺伝子発現に対して検出可能な効果を持たなかったが、広範な免疫染色により、ｉｎ ｖｉｖｏでの耳プラコードを連想させる１２日目の対照試料の凝集体の上皮におけるＰＡＸ２^＋ＰＡＸ８^＋ＥＣＡＤ^＋細胞の小集団に、本発明者らは注目を集めた（図１Ｌ〜図１Ｎ）。本発明者らは、細胞外マトリックスが、小胞形成に関する構造的な支持を提供することができると感じ、したがって、本発明者らは、１２日目の凝集体を、最小培地においてＭａｔｒｉｇｅｌ液滴に移動させた（図４Ａ）。これらの培養物において、本発明者らは、遊走性細胞の放射状の産生を観察したが、小胞様構造またはＰＡＸ２^＋細胞は明白ではなかった（図２Ｂ）。Ｗｎｔ活性化は、ｉｎ ｖｉｖｏで耳の発生に関して必須であるようだが、上鰓発生に関しては必須ではないようであり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、マウス内耳オルガノイドの産生を増強させることができる^{４、１９〜２１}。注目すべきことに、１２〜１６日目の間にＷｎｔシグナル伝達アゴニストであるＣＨＩＲ９９０２１で処理したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）包埋凝集体（ｎ＝８４、７回の実験）の９０．９±５．２％において、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏで小胞発生に先行する耳窩を連想させる上皮突出を目の当たりにした（図４Ｃ）。本発明者らは、耳窩様構造が、ＰＡＸ２^＋ＰＡＸ８^＋ＳＯＸ２^＋ＳＯＸ１０^＋ＪＡＧ１^＋であることを確定し、耳独自性を確認した（図４Ｄ〜図４Ｈ）。興味深いことに、耳窩は、ｉｎ ｖｉｖｏでの内耳周囲の間葉に類似して、耳窩周辺に間葉を形成するＴＦＡＰ２^＋ＳＬＵＧ^＋ＳＯＸ１０^＋頭蓋神経堤様細胞を遊走することに付随した（図４Ｃ〜図４Ｆ）。

【0040】

本発明者らは、１８日目まで定常液滴に含めた形で凝集体を培養し、続いて、さらなる自己組織化された成熟のために、オービタルシェーカー上の２４ウェルプレートまたはスピナーフラスコへそれらを移動し、両方の方式が、匹敵する結果をもたらした。培養の２０〜３０日目に、小胞は、検査した凝集体の７１．７±２３．３％の表面の至るところで依然として可視的であった（ｎ＝３７、３回の実験、図１３Ａ〜図１３Ｇ）。本発明者らが免疫染色した各凝集体において、本発明者らは、基底ケラチノサイトマーカーＴＦＡＰ２およびＫＲＴ５を発現する中心コア上皮周囲に、多重耳胞を見出した（図４Ｇ〜図４Ｉ）。３５日目になってようやく、本発明者らは、表皮上皮に部分的に結合されるか、または組み込まれるように見える小胞および耳プラコード様上皮を観察した（図４Ｈ）。さらに、より古い小胞（３０日を超える）は、転写因子ＦＢＸＯ２を発現し、それは、マウスにおいて内耳上皮を発生させるのに非常に特異的であることが最近わかった（図４Ｉ）^２２。

【0041】

インキュベーションの４０〜６０日後に、複雑なマルチチャンバー形態を有する小胞が、凝集体表面の至るところで可視的であった（図４Ｊ）。注目すべきことに、本発明者らは、ＷＡ２５およびｍＮＤ２−０由来の凝集体の両方における小胞のサブセットが、ＭＹＯ７Ａ、ＰＣＰ４、ＡＮＸＡ４、ＳＯＸ２およびＣＡＬＢ２を含む多重有毛細胞マーカーを発現する細胞を含有する上皮を発生させることを見出した（図４Ｋ〜図４Ｑ、図１４Ａ〜図１４Ｅ）。感覚様上皮はまた、哺乳動物卵形嚢における支持細胞を連想させるＳＯＸ２^＋ＳＯＸ１０^＋ＳＰＡＲＣＬ１^＋細胞を含有した^２３。これらの上皮における管腔細胞は、内耳感覚上皮に特徴的なＦ−アクチンリッチな尖端接合部を有する形態を伸長させていた（図４Ｌ〜図４Ｏ）。有毛細胞マーカーを発現する細胞はまた、アセチル化アルファチューブリン（ＴＵＢＡ４Ａ）^＋動毛と関連付けられる小胞管腔へ突出するＦ−アクチンリッチで、またエスピン（ＥＳＰＮ）^＋尖端不動毛束を有した（図４Ｍ〜図４Ｐ、図４Ｒ）。まとめると、これらの見解により、ｈＰＳＣ由来の耳胞が、有毛細胞および支持細胞を含有する感覚上皮を有する内耳オルガノイドを生成することが確認される。

【0042】

生細胞画像化および電気生理学的実験を容易にするために、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の増強を伴って、有毛細胞を内因的に標識するように、新規ｈＥＳＣレポーター細胞株を操作した。本発明者らは、有毛細胞誘導および初期熟成中に高度に発現されるＡＴＯＨ１遺伝子の停止コドンで２Ａ−ｅＧＦＰ遺伝子カセットを挿入するためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した（図５Ａ）^７。本発明者らは、本発明者らの確立されたプロトコールを使用して２Ａ−ｅＧＦＰカセットの適正な二対立遺伝子挿入を含有する２つのクローンからの内耳オルガノイド誘導を検証した（これ以降、ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ細胞）。注目すべきことに、早くも３９日目に、本発明者らは、内耳オルガノイドにおいて出現するｅＧＦＰ^＋有毛細胞様細胞を観察した（データは示していない）。本発明者らは、個々のオルガノイドが多くの場合、数百ものｅＧＦＰ^＋細胞を伴う多重の別個のパッチを含有することを認めた（図５Ｂ〜図５Ｄ）。ＢＲＮ３ＣおよびＥＳＰＮなどの有毛細胞マーカーを用いた免疫染色により、ｅＧＦＰ^＋細胞の有毛細胞独自性が確認された（図５Ｅ、図５Ｆ）。６０〜１００日目の間に、凝集体の１７．４±４．０％が、少なくとも１つの有毛細胞を保有するオルガノイドを含有した（ｎ＝１４６、６回の実験）。有毛細胞誘導の外見上低い効率は、本発明者らが凝集体内の深部にあるオルガノイドを検出することができないことに起因し得るか、または感覚上皮形成に要される内因性シグナルが、凝集体間で変動することが示され得る。とりわけ、６０〜１００日目の間に検査したＷＡ２５およびｍＮＤ２−０凝集体は全て、ＳＯＸ１０^＋非感覚上皮を有するオルガノイドを含有し、オルガノイド誘導は、非常に再現性があり得るが、非感覚内耳上皮が優先的に誘導されることを示唆した（ｎ＝１７、４回の実験、図１４Ｅ）。発生する２Ａ−ｅＧＦＰ^＋有毛細胞は、浮遊培養で１５０日にわたって維持され、切開および植え継ぎ培養後でさえ、毛束形態を保持することができる（図５Ｂ〜図５Ｆ）。

【0043】

最終的に、本発明者らは、得られた有毛細胞が、自然哺乳動物有毛細胞と類似して機能するかどうかに興味を持った。ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ細胞から生じる凝集体を使用して、本発明者らは、分化の６３〜６７日目の間に、内耳オルガノイドを切開して、平らにマウントした（flat-mounted）。本発明者らの知る限りでは、これらは、ｈＰＳＣに由来するヒト有毛細胞の第１の読取りを構成する。細胞は、大きな外向き整流性電流を有したが、Ｎａ^＋電流（発生中の齧歯類有毛細胞で見られるが、ほとんどの成熟有毛細胞では存在しない）は、本発明者らの試料においては検出されなかった（図５Ｇ、図５Ｊ）。公称１００ｍＶでのＫ^＋電流振幅は、下記の通りであった：６３日目：３９９、７４７、３４０ｐＡ；６４日目：４６９５、２５３８、２６０９ｐＡ；６７日目：５１９８、６５２８、６１２７ｐＡ。これは、２２日目のマウスオルガノイド有毛細胞に関する６０９９ｐＡの平均値に匹敵する。ステップおよび正弦波電流注入に対する応答（図５Ｈ、図５Ｉ）は、初期ピーク、続く再分極を伴い、脱分極電流よりも加分極電流により大きく偏っており、齧歯類有毛細胞の応答と似ていた。しかしながら、細胞の静止電位は、齧歯類で見られるよりも一貫してわずかに高かった：６４日目：−４３、−４５；６７日目：−４８、−４９ｍＶ。おそらく関連して、有毛細胞分化において初期に発生し、全ての齧歯類前庭有毛細胞およびマウスオルガノイド有毛細胞中に存在するＫｉｒ２．１によって保有されると考えられる顕著な閾値以下の内向き整流性電流は、ヒトオルガノイド細胞において、存在しなかったか、または大幅に低減された（図５Ｋ）^{２４、２５}。Ｋｉｒ２．１の発生、発現、機能または調節は、ヒト組織では異なる可能性がある。重要なことに、ほとんどの６０日齢を超えるオルガノイドにおいて、および読取りに使用するオルガノイド全てにおいて見られる収縮管腔形態は、メカノトランスダクション分析用の毛束への直接的な接近を厳しくさせた（図５Ｂ〜図５Ｅ）。それにもかかわらず、本発明者らのデータは、マウス内耳オルガノイド^２５と同様に、ヒトオルガノイドは、未熟前庭有毛細胞を含有することを強力に示唆する。

【0044】

結論として、本発明者らは、培養においてヒト内耳オルガノイドの発生を導くための頑強な培養系を確立した（図１５）。本発明者らの見解は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの前耳誘導の本発明者らのこれまでのモデルをさらに支持し、耳前駆体分化におけるＷｎｔシグナル伝達の重要性を強調する。興味深いことに、ヒト内耳オルガノイドの得られた渦巻き状のマルチチャンバー形態は、内耳の膜迷路に非常によく似ており、それは、感覚および非感覚上皮を含有する一連の管およびチャンバーで構成される。さらに、マウスオルガノイドにかなり類似して、ｈＰＳＣ由来のオルガノイドは、デフォルトによって前庭感覚上皮のみを形成するようであり、したがって、さらなるシグナル伝達操作が、蝸牛器官形成を開始するのに必要とされる^６、２５。本発明者らは、この培養系が、ヒト内耳発生のメカニズムを明らかにして、潜在的な内耳療法を試験するための強力なツールであることを期待する。

【0045】

方法および材料
ｈＰＳＣ培養：ヒトＰＳＣ（ＷＡ２５ｈＥＳＣ、継代数２２〜５０；ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣ、継代数２８〜４６）を、確立したプロトコールに従って、組換えヒトビトロネクチン−Ｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした６ウェルプレート上で、１００μｇ／ｍｌ ノルモシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地またはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｅ８ｆ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した^{１２、１３}。８０％コンフルエンシーで、または４〜５日毎に、ＥＤＴＡ溶液を使用して、１：１０〜１：２０の分割比で、細胞を継代培養した。細胞株はともに、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから獲得し、検証および信頼性の記述とともに届けられた。さらなる確証および試験情報は、ワールドワイドウェブ上のwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa25.cmsxおよびwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/mirjt7i-mnd2-0.cmsxで利用可能な細胞株ウェブページに見出すことができる。細胞株は、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマ混入を含まないと確定された。

【0046】

ｈＰＳＣ分化。分化を開始するために、ｈＰＳＣ細胞をＳｔｅｍＰｒｏ Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて解離して、１ウェル当たり５，０００個の細胞を、２０μＭ Ｙ−２７６３２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）およびノルモシンを含有するＥ８培地中で、９６ウェルＶ底プレート上へ分配した。４８時間のインキュベーション後に、凝集体を、４ｎｇ ｍｌ^−１ＦＧＦ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１０μＭ ＳＢ−４３１５４２（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、および幾つかの実験に関しては、２．５ｎｇ ｍｌ^−１ＢＭＰ４（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、および２％増殖因子低減（ＧＦＲ）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を含有する化学的に明確な培地（ＣＤＭ）１００μｌ中で、９６ウェルＵ底プレートへ移動して、非神経誘導を開始させた−即ち、分化０日目。ＣＤＭは、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１×化学的に明確な脂質濃縮物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、７μｇ ｍｌ^−１インスリン（Ｓｉｇｍａ）、１５μｇ ｍｌ^−１トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ）、４５０μＭ モノチオグリセロールおよびノルモシンをさらに補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを有するＦ−１２栄養分混合物（Ｇｉｂｃｏ）とＧｌｕｔａＭＡＸを有するイスコブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ）の５０：５０の混合物（Ｇｉｂｃｏ）を含有した（詳細な配合に関しては表１を参照）。４日のインキュベーション後に、２５０ｎｇ ｍｌ^−１ＦＧＦ−２（最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）および１μＭ ＬＤＮ−１９３１８９（最終濃度２００ｎＭ）を含有するＣＤＭ ２５μｌを、各ウェルにおける既存の１００μｌの培地に添加した。さらに４日（総計８日）後、ＣＤＭ ２５μｌを培地に添加した。幾つかの実験に関しては、１８μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（最終濃度３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を含有するＣＤＭを、各ウェルにおける既存の１２５μｌの培地に添加して、本発明者らは、この処理が、内耳オルガノイド産生にとって任意選択であるが、耳プラコード様細胞の誘導を改善し得ると確定した。分化の１２日目に、凝集体を一緒にプールして、０．５×Ｎ２サプリメント（Ｇｉｂｃｏ）、ビタミンＡを有さない０．５×Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ）およびノルモシンを補充した、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ）およびＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｇｉｂｃｏ）の５０：５０の混合物を含有する調製したてのオルガノイド成熟培地（ＯＭＭ）で洗浄した（詳細な配合に関しては表３を参照）。

【0047】

【表2】

【0048】

表３に記載する配合は、培地５０ｍＬを提供し、それは、２週未満で使用すべきである。ＯＭＭは、脳および胃オルガノイドを生成するのにこれまでに使用されている２つの培地の特注ハイブリッドである^６、７。ビタミンＡを有さないＢ２７を使用して、内因的に産生されるレチノイン酸の影響を制限した。

【0049】

凝集体は、氷冷した未希釈ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌ中に再懸濁させて、１００ｍｍの細菌培養プレートの表面上で液滴およそ２５μｌ中に配置させた。３７℃で少なくとも３０分のインキュベーション後、液滴を３μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を含有するＯＭＭ １０ｍｌ中に浸した。非液滴耳誘導のために、凝集体を洗浄して、３μＭ ＣＨＩＲおよび１％ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌを含有するＯＭＭ中で、２４ウェル低細胞接着プレートの各ウェルへ個々に蒔いた。分化の１８日後、ＣＨＩＲを、洗浄することによって培地から除去して、液滴凝集体を浮遊培養へと動かした。広口１０００Ｐチップを使用して、液滴を慎重に取り出して、１２５ｍｌの使い捨てスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の新鮮なＯＭＭ ７５ｍｌに移動させた。スピナーフラスコは、インキュベーター内攪拌プレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で６５ＲＰＭにて、分化の最大１８０日間維持した。幾つかの実験に関しては、凝集体は、インキュベーター内オービタルシェーカー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で、ＯＭＭ １ｍｌ中で、２４ウェル低細胞接着プレートの個々のウェルにおいて、最大１４０日間維持した。

【0050】

培地構成成分の選択：本発明者らは、規定の欠如またはヒト細胞との乏しい適合性に起因した結果における変動を招き得る２つの培地構成成分を使用した：ＧＦＲ ＭａｔｒｉｇｅｌおよびＢＳＡ。ＧＦＲ（増殖因子低減）Ｍａｔｒｉｇｅｌは、０．１ｐｇ ｍｌ^−１未満のＦＧＦ−２、０．５ｎｇ ｍｌ^−１未満のＥＧＦ、５ｎｇ ｍｌ^−１ ＩＧＦ−１、５ｐｇ ｍｌ^−１未満のＰＤＧＦ、０．２ｎｇ ｍｌ^−１未満のＮＧＦおよび１．７ｎｇ ｍｌ^−１ ＴＧＦβを含有する。特に、本発明者らは、培養のその相中では培地中にＴＧＦβ阻害剤を含まなかったため、ＧＦＲ ＭａｔｒｉｇｅｌにおけるＴＧＦβは、１２日目またはそれ以降に、細胞運命特定に影響を与えてきた。ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌは、それが、３Ｄ培養において多能性幹細胞からの自己組織化用上皮の信頼性のある誘導物質であることが示されているため選択した^２６。ＧＦＲ Ｍａｔｒｉｇｅｌは、Ｅｇｆ、Ｉｇｆ１、Ｆｇｆ２およびＴＧＦβなどの増殖因子の濃度は、細胞運命特定に対してごくわずかな影響を及ぼすはずであるレベルにまで最低限に抑えられている、Ｍａｔｒｉｇｅｌに対するより規定された代替物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌに対する他の代替物として、基底膜形成およびＰＳＣを上皮へ分化する自己組織化を支持する合成ヒドロゲルおよび組換えタンパク質ベースのマトリックスが挙げられるが、限定されない。例えば、精製ラミニン／エンタクチン複合体（Ｃｏｒｎｉｎｇ）は、適切な完全に化学的に明確なの代替物であり得る^２７。ＣＤＭにおいて、ＢＳＡは、費用効率がよく、それぞれヒト血清アルブミンおよびポリビニルアルコール（ＰＶＡ）に対する溶解しやすい代替物として選択された。ＰＶＡは、ＣＤＭ中のＢＳＡに代わる適切な化学的に明確な代用品であることがわかっている^２８。

【0051】

シグナル伝達分子および組換えタンパク質。下記小分子および組換えタンパク質を使用した：組換えヒトＢＭＰ４（２．５〜１０ｎｇ ｍｌ^−１；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ヒトＦＧＦ−２（２５ｎｇ ｍｌ^−１；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＳＢ−４３１５４２（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、およびＬＤＮ−１９３１８９（２００ｎＭ；Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）。

【0052】

定量的ＰＣＲ。分析は、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＢｉｏ−Ｒａｄ ＣＦＸ９６定量的ＰＣＲ機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、これまでに記載されるように実施した^６。データは、Ｌ２７発現（内部対照）に対して標準化され、倍率変化は、ΔΔＣＴ法を使用して、ｄ０ ＷＡ２５凝集体からのＣｔ値に対して算出した。別記しない限り、データは、別個の実験からの少なくとも３つの別個の生物学的試料を表す。統計学的有意性の指標は全て、所定の条件と対照群との間の比較を指す。プライマーの詳細については、表４を参照されたい。

【0053】

【表3-1】

【0054】

【表3-2】

【0055】

免疫組織化学。凝集体を、４％パラホルムアルデヒドで、室温で２０分間、または４℃で一晩固定した。固定した検体を、１５％および３０％ショ糖の段階的処理で凍結保護し、続いて組織凍結培地中に包埋した。凍結組織ブロックを、Ｌｅｉｃａ ＣＭ−１８６０クリオスタット上で１２μｍの凍結切片に切片化した。免疫染色に関して、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １×ＰＢＳ溶液中の１０％ヤギまたはウマ血清をブロッキングに使用し、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １×ＰＢＳ溶液中の３％ヤギまたはウマ血清を、一次／二次抗体インキュベーションに使用した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒコンジュゲート抗マウス、ウサギまたはヤギＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を二次抗体として使用した。ＤＡＰＩを有するＰｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、試料をマウントし、細胞核を可視化させた。ホールマウント染色に関して、類似の染色パラダイムを使用したが、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００濃度を０．５％に増加させ、ブロッキングおよび一次／二次インキュベーションは、３７℃にて回転シェーカー上で、それぞれ２４時間および４８時間行った。各インキュベーション後、試料を、３７℃にて回転シェーカー上で、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する１×ＰＢＳ中で１時間の洗浄を３回行った。ホールマウント試料は、ＳｃａｌｅＡ２クリアリング溶液中で１〜２日間、またはＳｃａｌｅＳＱ（５）クリアリング溶液中で１〜２時間マウントした後に画像化した^２９。顕微鏡法は、Ｌｅｉｃａ ＤＭｉ８倒立顕微鏡、Ｎｉｋｏｎ ＴＥ２０００倒立顕微鏡、またはＯｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００−ＭＰＥ Ｃｏｎｆｏｃａｌ／Ｍｕｌｔｉｐｈｏｔｏｎ顕微鏡で実施した。３Ｄ再構築は、Ｉｎｄｉａｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙで収納されているＩｍａｒｉｓ ８ソフトウェアパッケージ（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用して実施した。セグメンテーション分析に関して、２Ａ−ｅＧＦＰ細胞は、Ｉｍａｒｉｓにおける「Ｓｐｏｔｓ」モジュールを使用して加工処理した。分類は、推定サイズ、品質およびシグナル強度に基づいた。画像の境界に触れる物体は排除した。下記構築パラメーターを使用して、２Ａ−ｅＧＦＰ^＋細胞体を同定した：推定ＸＹ直径＝３．５０μｍ；推定Ｚ直径＝７．００μｍ；２０．０を超える「品質」；０．００１μｍを超える「境界ＸＹＺを画像化するための距離」；１，５００を超える「強度中心Ｃｈ＝１」。原画像フィルムからＩｍａｒｉｓにおいて、動画を作成し、Ａｄｏｂｅ Ｐｒｅｍｉｅｒｅ Ｐｒｏで編集して、表題および本文を加えた。抗体のリストに関しては、表５を参照されたい。

【0056】

【表4】

【0057】

電気生理学的記録。ヒトオルガノイドを、６２日目に、１×ＧｌｕｔａＭａｘ、１×Ｂ２７サプリメントおよびノルモシンを補充した冷Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ Ａ培地中で輸送した。それらは、６３日目に、５％ＣＯ_２および３７℃のインキュベーターにおいて、ＯＭＭへ戻した。記録日に、オルガノイドは、鋭いタングステン針（Ｆｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ）を使用してばらばらにして、カバーガラス上にピンで留めた。２Ａ−ｅＧＦＰ^＋シグナルを使用して、有毛細胞を有する領域を見出して、記録に関して有毛細胞を標的とした。ホールセルパッチクランプを、４〜５ＭΩのガラス電極を用いて、セミインタクト組織に関して実施した。データは、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して獲得し、５０００Ｈｚでフィルタリングして、続いてＤｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａ変換機により２０ｋＨｚでデジタル化した。記録用ピペット溶液は、１３５ ＫＣｌ、５ ＨＥＰＥＳ、５ ＥＧＴＡ、２．５ ＭｇＣｌ_２、２．５ Ｋ_２−ＡＴＰ、０．１ ＣａＣｌ_２を含有し（ｍＭで）、ＫＯＨを用いてｐＨ７．４に調節された。およそ２８５ｍｍｏｌ ｋｇ^−１。外部溶液は、１３７ ＮａＣｌ、５．８ ＫＣｌ、０．７ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ ＨＥＰＥＳ、１．３ ＣａＣｌ_２、０．９ ＭｇＣｌ_２、５．６ グルコースを含有し、ビタミンおよび必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ）を補充し、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調節された。およそ３１０ｍｍｏｌ ｋｇ^−１。記録は、４０％補正して、細胞は、電位クランプに関して−６６ｍＶで維持した。平均値は、記録値±ＳＥＭである。

【0058】

ＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰレポーター細胞株の生成。ＡＴＯＨ１の停止コドン領域を標的とするｇＲＮＡ（５’−ＴＣＧＧＡＴＧＡＧＧＣＡＡＧＴＴＡＧＧＡ−３’（配列番号１７）および５’−ＧＴＣＡＣＴＧＴＡＡＴＧＧＧＡＡＴＧＧＧ−３’（配列番号１８）、オフセット＝０ｂｐ）を、ＣＢｈプロモーター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８８７３）の制御下でＣａｓ９ｎを発現するｐＳｐＣａｓ９ｎ（ＢＢ）ベクターにクローニングした^３０。ドナーベクターを構築するために、抽出したＷＡ２５ｈＥＳＣゲノムＤＮＡから増幅させた２つの１ｋｂの相同性アームＰＣＲに隣接される２Ａ−ｅＧＦＰ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏカセット（Ａｄｄｇｅｎｅ＃３１９３８）^１７を、ｐＵＣ１９バックボーンにクローニングした。２つのｇＲＮＡベクターおよびドナーベクター、ならびにＣＭＶプロモーターの制御下でＣａｓ９ｎを発現するベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４１８１６）^１８を、Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＸキットおよびＰｒｏｇｒａｍ ＣＢ−１５０を使用して、４Ｄ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）を用いてＷＡ２５ｈＥＳＣにトランスフェクトした。ヌクレオフェクション（nucleofection）後、細胞を、細胞生存率の改善のための１×ＲｅｖｉｔａＣｅｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、およびより高いＨＤＲ効率のための１μＭのＳｃｒ７（Ｘｃｅｓｓｂｉｏ）を含有する成長培地中に蒔いた^３１。０．５μｇ μｌ^−１ピューロマイシン選択は、ヌクレオフェクションの４８時間後に始めて、１０日間実施した。２つのＬｏｘＰ部位に隣接されるＰＧＫ−Ｐｕｒｏサブカセットを、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１３７７５）のヌクレオフェクションによるピューロマイシン選択後に、ゲノムから除去した。クローン細胞株を、解離単一ｈＥＳＣの低密度播種（１〜３個の細胞ｃｍ^−２）によって樹立した後、増殖の５〜７日後に、ｈＥＳＣコロニーの単離を行った。クローン細胞株の遺伝子型を、ＰＣＲ増幅、続くゲル電気泳動によって、およびＴＯＰＯベクターへクローニングされた総ＰＣＲアンプリコンまたは個々のＰＣＲアンプリコンのＳａｎｇｅｒ配列決定によって分析した。二対立遺伝子２Ａ−ｅＧＦＰ組込みを有する細胞株を、内耳有毛細胞分化に使用した。

【0059】

統計学的分析。統計学は全て、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェアを使用して実施した。Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ正規性検定は、データが正規分布を有することを確定するために分析前に使用した。統計学的有意性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続く対照群（例えば、ビヒクル処理）に対する多重比較用のＤｕｎｎｅｔｔの事後検定を使用して確定した。試料群間の変動が類似していることを確定するために、Ｂｒｏｗｎ−Ｆｏｒｓｙｔｈｅ検定を使用した。標本サイズを予め確定するのに統計学的検定を使用せず、研究者らは、治療群に対して盲検ではなく、試料は、無作為化されなかった。

【0060】

代表的なデータおよび再現性。別記しない限り、画像は、少なくとも３回の別個の実験から獲得される検体を代表している。０〜１２日目の間の凝集体のＩＨＣ分析に関して、本発明者らは通常、各実験における各条件から、３〜６個の凝集体を切片化した。プロトコールの後期段階に関するＩＨＣ分析は、実験１回当たり各条件からの少なくとも２個の凝集体で実施した。仕上げの培養方法は、ＷＡ２５（野生型またはＡＴＯＨ１−２Ａ−ｅＧＦＰ）細胞株を使用して、４人の独立した研究者によって、１５回首尾よく再現された。顕著な修飾を含む方法は、ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣ株を使用して３回再現された。再現は、１２〜１８日の間に窩／小胞形成を確認すること、および分化の５０〜１００日目に少なくとも１つの凝集体において内耳オルガノイドを明確に同定することによって、首尾よいとみなされた。窩が、１２〜１８日の間に観察されなかった場合、実験は、分析から排除した。

【0061】

参照文献
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【実施例2】

【0062】

耳ニューロン新生のモデリング
１２日目の凝集体において、本発明者らは、耳プラコードを連想させるＰＡＸ８＋ＰＡＸ２＋上皮のパッチを観察し、したがって、本発明者らは、耳胞形成を促進する培養条件に関してアッセイした。対照条件（ＤＭＳＯ）下で、本発明者らは、小胞形成を観察しなかった（データは示していない）。耳誘導は、Ｗｎｔシグナル伝達に依存しているため、本発明者らは、１２日目の凝集体を、１２〜１８日目の間に、強力なＧＳＫ３β阻害剤および公知のＷｎｔシグナル伝達アゴニスト２７、ＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）で処理した。これらの条件下で、ＰＡＸ８＋ＰＡＸ２＋ＳＯＸ１０＋小胞は、外側上皮から膨出する（凝集体１個当たりおよそ１０〜３０個の小胞、図４Ａ〜図４Ｒ）。注目すべきことに、Ｉｓｌｅｔ１＋（ＩＳＬ１＋）神経芽細胞は、耳胞から離層するようである（図１６Ａ〜図１６Ｂ）。本発明者らはまた、ＤＭＳＯ処理凝集体において、およびＣＨＩＲ処理凝集体の非耳内部において、神経芽細胞を確認する（図１６Ａ、矢頭）。したがって、本発明者らは、ＣＨＩＲ処理凝集体が、耳（即ち、小胞由来）および上鰓（即ち、上皮由来の）ニューロンの混合物を生じると仮定した（図４Ａを参照）。この仮定の裏付けとして、本発明者らは、耳ニューロンのマーカーであるニューロン原性因子Ｎｅｕｒｏｇ１（ＮＧＮ１）、および上鰓ニューロンのマーカーであるＮｅｕｒｏｇ２（ＮＧＮ２）が、ＣＨＩＲ処理凝集体において発現されることを確認した（図１６Ｃ）。

【0063】

分化の１２日後、耳誘導凝集体を、３μＭ ＣＨＩＲを含有する培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ液滴に含めた形で細菌皿上に蒔いた。図１７Ａ〜図１７Ｃを参照されたい。２２日目に、凝集体を固定して、感覚ニューロンのマーカーであるＢＲＮ３ＡおよびβＩＩＩ−チューブリン（ＴＵＪ１）に関して抗体で免疫染色した。放射上に配向されるＢＲＮ３Ａ＋ＴＵＪ１＋ニューロンは、成長円錐を伴って成長中の突起を生じて、オルガノイド培養において、広範な感覚ニューロン新生を確認した。

【0064】

本発明者らの培養系における内耳器官形成のさらなる証拠として、有毛細胞は、６０〜７０日の培養によってＣＴＢＰ２^＋斑点を示し、推定リボンシナプス様構造を示した（図１８Ａ〜図１８Ｂ、ｎ＝７個の感覚上皮）。先述したように、本発明者らは、小胞形成段階中に、細胞凝集体において、ＢＲＮ３ａ陽性感覚様ニューロンを観察した。さらに、本発明者らは、有毛細胞を有する感覚上皮に対して標的とされるＴＵＪ１^＋ニューロン突起を観察した（図１８Ｃ）。まとめると、本発明者らの見解により、ヒト内耳オルガノイドモデルは、有毛細胞と感覚ニューロンとの間に感音性回路の構築を再現し得ることが示唆される。

【実施例3】

【0065】

内耳オルガノイドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの産生に関する例示的なプロトコール
この実施例は、ヒト多能性幹細胞から非神経外胚葉および内耳感覚組織の形成を誘導するためのプロトコールについて記載する。下記パラグラフにおいてより詳細に記載するように、多能性幹細胞凝集体を、基底膜タンパク質に富んでいるＭａｔｒｉｇｅｌを含有する培地中で培養して、凝集体表面上に外胚葉発生および外胚葉上皮の産生を誘導した。次に、本発明者らは、骨形成タンパク質−４（ＢＭＰ４）および小分子ＳＢ−４３１５４２（「ＳＢ」）などのトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）阻害剤の組合せ処理を使用して、上皮において非神経分化を促進した。内耳誘導をさらに開始させるために、ＢＭＰシグナル伝達を阻害して、初期ＢＭＰ４およびＳＢ処理のおよそ２４時間後に、組換えＦＧＦ−２を使用して、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）シグナル伝達を活性化させた。意外にも、組合せ処理プロトコールは、機能性前庭感覚上皮を含有する内耳オルガノイドへ後に発生する耳胞の自己組織化を開始させた。

【0066】

方法
ビトロネクチンでコーティングされたプレート上でのＥ８培地におけるＥＳ細胞培養（ステップ１〜ステップ７）。本発明者らは、フィーダーを含まない条件下でＥ８培地において本発明者らのｈＰＳ細胞を維持して、継代培養にＥＤＴＡを使用する（Beersらによるこれまでのプロトコールを参照）。ｈＰＳ細胞維持のこの方法は、本発明者らが扱う限り、限られた時間および労力で自発的な分化を低減させるので、本発明者らは、それを好む。

【0067】

非神経外胚葉および前耳誘導（ステップ８〜ステップ２７）。分化を開始するために、ｈＰＳ細胞を解離させて、９６ウェルＶ底プレート上へ、ウェル１個当たり５，０００個の細胞を分配した。この初期凝集ステップに関して、本発明者らは、強力なＲＯＣＫシグナル伝達阻害剤であるＹ−２７６３２を含有するＥ８培地を使用する。ＲＯＣＫシグナル伝達阻害は、ｈＰＳ細胞において、解離誘導性アポトーシスの量を制限することがわかっている。さらに、本発明者らは、Ｅ８培地における凝集が細胞生存に役立ち、より一様な細胞凝集体をもたらし、それは、プロトコールの再現性に影響を与えることを見出した。ＳＢ処理は、ＴＧＦβを阻害して、外胚葉発生を誘導する。内因性ＢＭＰシグナル伝達は、神経外胚葉ではなく、非神経外胚葉を生成する。ＦＧＦ−２およびＬＤＮ処理は、前プラコード発生を誘導する。８日目までに、外側上皮は、ＰＡＸ８を発現し始めて、耳上鰓プラコード（ＯＥＰＤ）様特性を示す。８日目のＣＨＩＲ処理は、ＰＡＸ２＋細胞の小さなパッチを誘導して、１２日目までに耳プラコード発生の最も初期の兆候を示す。

【0068】

耳プロセンサリー（prosensory）胞および内耳オルガノイド形成（ステップ２８〜ステップ４３）。低濃度の細胞外マトリックスタンパク質（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））は、耳胞形成を支持しないようである。耳プラコード様パッチが、耳胞として上皮から膨出してくびれ切れるように促すために、本発明者らは、Ｍａｔｉｇｅｌ中に１２日目の凝集体を包埋した。Ｍａｔｒｉｇｅｌに包埋した凝集体を、細胞皿の表面上に硬化させて、組織自己組織化を支持することがこれまで示されているＮ２およびＢ２７サプリメントを含有する無血清培地（これ以降、オルガノイド培地）中に浸す。この支持的環境は、ＣＨＩＲへの継続曝露と組み合わせて、１２〜１８日目の間に、多数の小胞を、上皮から発芽させる。耳胞形成は、４回の独立した実験にわたって９５％を超える凝集体において観察された。さらに、１２〜１８日目の間に、神経芽細胞は、上皮の他の部分から離層して、感覚ニューロンへ分化する。これらの感覚ニューロンが、頭蓋神経ＶＩＩ、ＩＸおよびＸのニューロンなどの上鰓ニューロン、または前庭もしくはらせん神経節ニューロンなどの内耳ニューロンであるかどうかは、現時点で明らかでない。間葉含有軟骨細胞前駆細胞の形成もまた観察された。しかしながら、軟骨細胞前駆細胞が、外胚葉上皮から生じたか、または中胚葉細胞の別の集団から生じたかどうかは明らかではなかった。

【0069】

１８日目に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に包埋した凝集体を、静置培養皿から取り出して、任意の添加増殖因子または小分子を欠如するオルガノイド培地を含有するスピナーフラスコへピペッティングした（pipetted）。総計２２日後に、１０〜３０個の小胞が、位相差画像法を使用して、各凝集体において観察された。これらの小胞は、ＰＡＸ２、ＰＡＸ８、ＳＯＸ２およびＪＡＧ１タンパク質を発現した。これは耳細胞運命を示す。小胞は、２２〜３５日目の間には、ゆっくりと成長するように見え、それらが包埋される間葉系細胞塊の高まる密度に起因して、この期間中に位相差画像法を使用して小胞を観察することが困難となった。３５〜４０日目までに、小胞は概して、凝集体内部においてよりはっきり見えた。小胞は通常、簡素な球状または卵形状の耳胞と対比して、渦巻き状のマルチチャンバー形態を示した。４５日目までに、小胞は、ＭＹＯ７Ａ^＋有毛細胞様細胞を発生させて、内耳オルガノイドとして同定された。６０〜８０日目の間に、本発明者らは、Ｆ−アクチンリッチで、かつＥｓｐｉｎ^＋毛束を有するＭＹＯ７Ａ^＋有毛細胞を観察し、決定的な有毛細胞独自性を示した。

【0070】

材料および試薬
ｈｐＳＣ培養：ヒトＰＳＣ（ＷＡ２５ｈＥＳＣ、継代数２２〜５０；ｍＮＤ２−０ｉＰＳＣ、継代数２８〜４６）を、確立したプロトコールに従って、組換えヒトビトロネクチン−Ｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でコーティングした６ウェルプレート上で、１００μｇ／ｍｌ ノルモシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８（Ｅ８）培地またはＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８ Ｆｌｅｘ培地（Ｅ８ｆ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で培養した^{１２、１３}。８０％コンフルエンシーで、または４〜５日毎に、ＥＤＴＡ溶液を使用して、１：１０〜１：２０の分割比で、細胞を継代培養した。細胞株はともに、ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから獲得し、検証および信頼性の記述とともに届けられた。さらなる確証および試験情報は、ワールドワイドウェブ上のwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/wa25.cmsxおよびwicell.org/home/stem-cell-lines/catalog-of-stem-cell-lines/mirjt7i-mnd2-0.cmsxで利用可能な細胞株ウェブページに見出すことができる。細胞株は、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ検出キット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、マイコプラズマ混入を含まないと確定された。

【0071】

この例示的なプロトコールにおいて使用する他の試薬を表６に記載する。

【0072】

【表5】

【0073】

培養培地およびストック溶液
ヒト組換えＢＭＰ７ストック溶液（１００ｎｇ／μＬ）：バイオセーフティキャビネットにおいて、滅菌４ｍＭ ＨＣＬ １００μＬを、ＢＭＰ７ １０μｇに添加する；溶液をボルテックスして、卓上用遠心分離機において遠心沈殿させる。ＢＭＰ４溶液を５μＬ分取量で、−２０℃にて６カ月間または−８０℃で１年間保管する。

【0074】

ヒト組換えＦＧＦ−２ストック溶液（２００ｎｇ／μＬ）：バイオセーフティキャビネットにおいて、滅菌ＰＢＳまたは５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６） ２５０μＬを、ＦＧＦ−２ ５０μｇに添加する；溶液をボルテックスして、卓上用遠心分離機において遠心沈殿させる。ＦＧＦ−２溶液を６μＬ分取量で、−２０℃にて６カ月間または−８０℃で１年間保管する。

【0075】

ヒトトランスフェリンストック溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）：バイオセーフティキャビネットにおいて、ＩＭＤＭ ５ｍｌ中に組換えヒトトランスフェリン１００ｍｇを溶解させる。完全に溶解させるために、チューブをボルテックスして、それを回転シェーカー上に、室温（ＲＴ）で５〜１０分間配置する。トランスフェリン溶液を１５０μＬ分取量で、−２０℃にて６カ月間または−８０℃で１年間保管する。

【0076】

ＥＤＴＡ溶液（ｈＥＳ細胞を継代培養するため）：バイオセーフティキャビネットにおいて、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ５０μｌを、ＤＰＢＳ ５０ｍｌへ混合する。溶液を濾過滅菌する。ＥＤＴＡ溶液は、ＲＴで６カ月間保管することができる。

【0077】

化学的に明確な培地（ＣＤＭ）：ＣＤＭ ２００ｍＬを調製するために、２５０ｍＬの瓶中にＢＳＡ １ｇを量り分ける。Ｆ−１２栄養分混合物＋ＧｌｕｔａＭＡＸ １００ｍＬ、ＩＭＤＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ １００ｍＬ、化学的に明確な脂質濃縮物２ｍＬ、インスリン１４０μＬ、トランスフェリン１５０μＬおよび１−チオグリセロール８μＬ中にＢＳＡを溶解させる。低タンパク質結合フィルターを使用して、フィルターを滅菌する。ＣＤＭは、最大２週間使用され、４℃で保管されるべきである。ＣＤＭ１ｍＬ当たり２μｌの希釈で、使用直前にノルモシンを培地に添加する。迅速な参照レシピについては、表１を参照されたい。

【0078】

分化ＣＤＭ：５０ｍＬのコニカルチューブにおいて、氷冷Ｇｅｌｔｒｅｘ ４５０μＬを、氷冷ＣＤＭ ３４．５ｍＬに添加する（最終濃度１．２５％）。チューブを十分にボルテックスして、Ｇｅｌｔｒｅｘを完全に溶解させる。この溶液３０ｍＬを、新たな５０ｍＬのコニカルチューブ中に配置させる。ＦＧＦ−２ ０．６μＬ（最終濃度４ｎｇ／ｍＬ）およびＳＢ−４３１５４２ ３０μＬ（最終濃度１０μＭ）を添加する。チューブを十分にボルテックスして、混合する。分化ＣＤＭは、分化の０日目に新鮮な状態にすべきである。ＣＤＭ＋Ｇｅｌｔｒｅｘの残り５ｍＬを使用して、蒔く前に凝集体を洗浄する。

【0079】

オルガノイド成熟培地（ＯＭＭ）：ＯＭＭ ５０ｍＬを調製するために、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ２４．５ｍＬ、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地 ２４．５ｍＬ、ビタミンＡを有さないＢ−２７サプリメント５００μＬ、ＧｌｕｔａＭＡＸ ５００μＬ、Ｎ２−サプリメント２５０μＬおよびノルモシン１００μＬを、滅菌５０ｍＬのコニカルチューブにおいて組み合わせる。ＯＭＭは、４℃で保管される場合、最大２週間使用することができる。迅速な参照レシピについては、表３を参照されたい。

【0080】

手順
ｈＥＳ細胞維持および継代培養：
１．バイオセーフティキャビネットにおいて、ＤＰＢＳ ６ｍＬ中にビトロネクチン６０μＬを希釈して、希釈したビトロネクチン１ｍＬを、６−ウェル培養プレートの各ウェルに添加する。ＲＴで少なくとも１時間インキュベートして、平均時間で、ステップ２に進む。

【0081】

２．ノルモシンを含有するＥ８培地 少なくとも２０ｍＬをＲＴに平衡化する。

【0082】

３．７０〜８０％コンフルエントなｈＥＳ細胞の解離を始めるために、消費したＥ８培地を１つのウェルから吸引して、ＤＰＢＳで二度洗浄する。

【0083】

４．ＥＤＴＡ溶液１ｍＬを添加して、３７℃のインキュベーター中で、４〜８分間インキュベートする。顕微鏡下で、孔がコロニーの中心で形成されたことを確認する。

【0084】

５．ＥＤＴＡインキュベーション中に、ビトロネクチン溶液を６ウェルプレートから除去して、Ｅ８培地１．５ｍＬを各ウェルに迅速に添加した後、表面を乾燥させる。

【0085】

６．解離した細胞を、Ｅ８培地６ｍＬへ収集する。重要：培地を激しく粉砕して、細胞クラスターをプレートから除去する必要がある場合がある。細胞をオーバーピペッティングして（over pipet）はならない。これは、アポトーシスを引き起こすためである。気泡を培地へ導入しないように注意を払うべきである。

【0086】

７．細胞を、調製した６ウェルプレート（ステップ５からの）上に蒔く。次に細胞を分割したい場合に基づいて、プレーティング密度を選択する。本発明者らは通常、細胞懸濁液５００ｍＬ（２〜３日で継代培養）または２５０μＬ（４〜５日で継代培養）を、各ウェルに添加する。細胞を、継代培養または実験における使用の準備が整うまで、３７℃にて５．０％ＣＯ_２中でインキュベートする。

【0087】

ｈＥＳ細胞分化（−２日目〜０日目まで）；凝集：
８．バイオセーフティキャビネットにおいて、Ｅ８培地とノルモシンとを２２ｍＬおよび１０ｍＬを含有するコニカルチューブを調製する。Ｙ−２７６３２ ４４μＬを、２２ｍＬのチューブに（最終濃度２０μＭ、これ以降、Ｅ８−Ｙ２０）、およびＹ−２７６３２ １０μＬを、１０ｍＬのチューブに（最終濃度１０μＭ、これ以降、Ｅ８−Ｙ１０）添加する。

【0088】

９．細胞が、７０〜８０％コンフルエントである場合、Ｅ８培地を１つのウェルから吸引して、ＲＴにてＤＰＢＳで三度洗浄する。

【0089】

１０．ＴｒｙｐＬＥ ３５０μＬを添加して、３７℃で２〜４分間インキュベートする。インキュベーション後、プレートを水平方向に振とうして、細胞をばらばらにする。顕微鏡下で、細胞が、円形であり、プレートの表面から剥離されることを確認する。

【0090】

１１．解離した細胞を、Ｅ８−Ｙ１０培地５ｍＬへ収集して、それらを１５ｍＬのコニカルチューブに移動する。

【0091】

１２．細胞クランプを、Ｐ１０００チップを用いてピペッティングすることによって単一細胞へと崩壊する。細胞を、２００ｇで５分間の遠心分離によってペレット化する。

【0092】

１３．上清を完全に除去して、細胞ペレットを、Ｅ８−Ｙ１０培地１ｍＬ中に再懸濁する。

【0093】

１４．Ｅ８−Ｙ１０培地１ｍＬを、細胞濾過器最上部の試験管に通して力強くピペッティングして、濾過器を準備する。ｈＥＳ細胞懸濁液１ｍＬを、ピペッティングにより細胞濾過器上へ滴下する。次に、Ｅ８−Ｙ１０培地１ｍＬを、ピペッティングにより細胞濾過器上へ滴下する。試験管中に３ｍＬが存在すべきである。このステップは、細胞が完全に単一細胞に解離されることを保証するのに重要である。

【0094】

１５．Ｐ１０００チップを用いてピペッティングすることによって細胞懸濁液を混合して、血球計数器または自動細胞計数器を使用して、細胞の濃度を確定する。

【0095】

１６．適切な容量の細胞懸濁液を、Ｅ８−Ｙ２０培地２２ｍＬ中に希釈して、１ｍＬ当たり５０，０００個の細胞の最終濃度（即ち、１．１×１０^６個の総細胞）を獲得する。例えば、細胞懸濁液が、１ｍＬ当たり１×１０^６個の細胞を含有する場合、細胞懸濁液１．１ｍＬ（１．１×１０^６個を１×１０^６個で割る）は、Ｅ８−Ｙ２０培地２０．９ｍＬ中に希釈する。数回反転させて、混合する。

【0096】

１７．細胞懸濁液を容器に注ぎ、マルチチャネルピペットを使用して、細胞懸濁液１００μｌを、２つの９６ウェルＶ底プレートの各ウェルに分取する。

【0097】

１８．ＲＴにて１２０ｇで５分間、プレートを遠心沈殿させる。

【0098】

１９．プレートを、５．０％ＣＯ２を有する３７℃のインキュベーター中で、４８時間インキュベートする。２４時間後、新鮮なＥ８培地（Ｙ−２７６３２を含有しない）５０μｌを、各ウェルに添加する。

【0099】

分化０日目：分化ＣＤＭへの移動
２０．Ｇｅｌｔｒｅｘ、ＦＧＦ−２およびＳＢ−４３１５４２を含有する分化ＣＤＭ３０ｍｌを調製する。培地をＲＴに平衡化させる。

【0100】

２１． １２５μｌ（即ち、各ウェルの容量よりも２５μｌ少ない）に設定したマルチチャネルピペットを用いて、ステップ１８からの９６ウェルプレートの各ウェルから凝集体を慎重に。細菌皿中に凝集体を堆積させ、続いてそれらを２ｍｌのチューブに移動する。

【0101】

２２．凝集体を、ＣＤＭで少なくとも三度洗浄して、微量のＥ８培地を完全に除去する。

【0102】

２３．凝集体を分化ＣＤＭ中に再懸濁させて、それらを新たな細菌皿に移動する。

【0103】

２４．Ｐ２００ピペットを使用して、各凝集体を、培地１００μｌにおいて、２つの９６ウェルＵ底プレートの各ウェルに個々に移動する。この段階で凝集体を確認することが困難である場合がある。本発明者らは通常、無反射白色表面（例えば、キムワイプ）上に細菌皿に配置して、凝集体のコントラストを増強する。

【0104】

２５．プレートをインキュベーターに４日間戻す。凝集体の形態を毎日観察する。

【0105】

分化４日目：ＦＧＦ−２およびＬＤＮ−１９３１８９（ＦＧＦ／ＬＤＮ）の添加
２６． １５ｍｌのコニカルチューブにおいて、ＦＧＦ−２およびＬＤＮ−１９３１８９を、５倍濃度でＣＤＭに添加する。例えば、本発明者らは、２００ｎｇ／μｌ ＦＧＦ−２ ６．２５μｌおよび１０ｍＭ ＬＤＮ−１９３１８９ ０．５μＬを、ＣＤＭ ５ｍｌに添加する。

【0106】

２７．ＦＧＦ／ＬＤＮを含有するＣＤＭ ２５μｌを、ステップ２４からのプレートの各ウェルに添加する。各ウェルはここで、５０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ−２および２００ｎＭ ＬＤＮ−１９３１８９の最終濃度を有する培地１２５μｌを含有する。細胞をさらに４日間インキュベートする。

【0107】

２８．１５ｍｌのコニカルチューブにおいて、ＣＨＩＲ９９０２１を、６倍濃度でＣＤＭに添加する。例えば、本発明者らは、１０ｍＭ ＣＨＩＲ９９０２１ ９μｌを、ＣＤＭ ５ｍｌに添加する。

【0108】

２９．ＣＨＩＲを含有するＣＤＭ ２５μｌを、ステップ２６からのプレートの各ウェルに添加する。各ウェルはここで、３μＭ ＣＨＩＲの最終濃度を有する培地１２５μｌを含有する。細胞をさらに４日間インキュベートする。

【0109】

分化１２日目：静置ＥＣＭ培養への移行
３０．下記ステップを実施する約２時間前に、Ｇｅｌｔｒｅｘ １ｍｌ分取量を冷凍庫から取り出し、それを氷上でまたは冷蔵庫内で、完全に融解させる。

【0110】

３１．５０ｍｌのコニカルチューブにおいて、オルガノイド培地５０ｍｌを調製する。

【0111】

３２．カットしたＰ１０００ピペットチップを使用して、凝集体を、ステップ２８におけるプレートの各ウェルから、２ｍｌのチューブに移動する。

【0112】

３３．凝集体をチューブの底部で定着させて、続いて、培地を慎重に吸引する。

【0113】

３４．凝集体を、ＲＴオルガノイド培地１〜２ｍｌで少なくとも三度洗浄する。最終洗浄後に、できる限り多くの培地を除去する。

【0114】

３５．凝集体を氷冷Ｇｅｌｔｒｅｘ中に再懸濁させる。ピペットを２０μｌに設定して、凝集体を１００ｍｍの細菌皿に個々に移動する。本発明者らは通常、２０〜３０液滴を各プレートに添加する。種々の方向でプレートを穏やかに振とうすることは、液滴を、平らにして、プレートの表面に接着させるのに役立つ。Ｇｅｌｔｒｅｘは、ＲＴで１０〜１５分後に、重合し始める。凝集体／Ｇｅｌｔｒｅｘ混合物が、ピペッティングステップ間で配置され得る場合、バイオセーフティキャビネットにおいて氷の小さな容器を保持することが推奨される。

【0115】

３６．培地を有さないプレートを、３７℃で３０分間インキュベートする。

【0116】

３７．ＣＨＩＲを含有するオルガノイド培地１０〜１２ｍｌを添加する。液滴がプレートから剥離しないように、オルガノイド培地をゆっくりと添加する。幾つかの液滴が剥離されてもかまわない。

【0117】

３８．細胞をさらに６日間インキュベートする。培地半分の交換を３日後に実施する。

【0118】

分化１８日目：スピナーフラスコへの移行
３９．広口Ｐ１０００チップを使用して、各凝集体を、細菌皿の表面から掻把して、ピペットで吸い上げる。凝集体を２ｍｌのチューブに移動する。

【0119】

４０．凝集体をオルガノイド培地で三度洗浄する。

【0120】

４１．オルガノイド培地５０〜７５ｍｌを、１２５ｍｌのスピナーフラスコへ注ぐ。

【0121】

４２．凝集体をスピナーフラスコへ添加する。側面ポートが１／４回転で開放されることを確認し、スピナーフラスコを、インキュベーターにおいて、攪拌機プレート上に配置させる。攪拌機制御器を６０〜６５ｒｐｍで設定する。

【0122】

４３．細胞をさらに２２〜４２日間インキュベートする。培地は毎週完全に交換する。より長期の実験に関しては、凝集体は、スピナーフラスコ中で無制限に保持することができる。発生をモニタリングするために、本発明者らは、広口Ｐ１０００を使用して、凝集体を細菌皿に定期的に移動して、倒立顕微鏡を使用して画像化する。

【0123】

タイミング
ステップ１〜ステップ７、ｈＥＳ細胞の維持および継代培養：３０分
ステップ８〜ステップ１９、ｈＥＳ細胞分化：凝集：４０分
ステップ２０〜ステップ２５、分化０日目：分化ＣＤＭへの移動：１時間
ステップ２６〜ステップ２７、分化４日目：ＦＧＦ−２およびＬＤＮ−１９３１８９の添加：２０分
ステップ２８〜ステップ２９、分化８日目：ＣＨＩＲ９９０２１の添加：２０分
ステップ３０〜ステップ３８、分化１２日目：静置ＥＣＭ培養への移行：４５分
ステップ３９〜ステップ４３、分化１８日目：バイオリアクターへの移行：３０分
ステップ１〜ステップ４３、内耳オルガノイドを生成するための総時間：４５〜６０日から１年超。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19-1】

【図19-2】

【図20】