特許 6979950 部位特異的ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6979950

(24)【登録日】2021年11月18日

(45)【発行日】2021年12月15日

(54)【発明の名称】部位特異的ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20211202BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20211202BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 13/02 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20211202BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20211202BHJP

   C12N 1/15 20060101ALN20211202BHJP

   C12N 1/19 20060101ALN20211202BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20211202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20211202BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C07K16/32

   A61K47/68

   A61K39/395 L

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61P15/00

   A61P11/00

   A61P1/04

   A61P1/00

   A61P1/18

   A61P13/02

   A61P25/00

   !C12N15/63 Z

   !C12N1/15

   !C12N1/19

   !C12N1/21

   !C12N5/10

【請求項の数】9

【全頁数】135

(21)【出願番号】特願2018-527739(P2018-527739)

(86)(22)【出願日】2016年11月22日

(65)【公表番号】特表2018-537975(P2018-537975A)

(43)【公表日】2018年12月27日

(86)【国際出願番号】IB2016057017

(87)【国際公開番号】WO2017093844

(87)【国際公開日】20170608

【審査請求日】2019年11月21日

(31)【優先権主張番号】62/260,854

(32)【優先日】2015年11月30日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/289,744

(32)【優先日】2016年2月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/289,727

(32)【優先日】2016年2月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/409,105

(32)【優先日】2016年10月17日

(33)【優先権主張国】US

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-122673

【微生物の受託番号】ATCC  PTA-122672

(73)【特許権者】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(72)【発明者】

【氏名】ダングシェ マ

(72)【発明者】

【氏名】フランク ロガンゾ ジュニア

(72)【発明者】

【氏名】キンバリー アン マルケット

(72)【発明者】

【氏名】エドムンド イドリス グラシアーニ

(72)【発明者】

【氏名】プヤ サプラ

(72)【発明者】

【氏名】パーヴェル ストロップ

【審査官】 野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１２４３１６（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートであって、 （ａ）Ａｂが、ＨＥＲ２に結合し、配列番号１８のアミノ酸配列を含む重鎖と配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む抗体であり； （ｂ）Ｌ−Ｄがリンカー−薬物部分であり、Ｌがマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）のリンカーであり、Ｄが、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドまたはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、抗体薬物コンジュゲート。

【請求項2】

請求項１に記載の抗体薬物コンジュゲートと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。

【請求項3】

請求項１に記載の複数の抗体薬物コンジュゲートと、任意選択により薬学的担体とを含む組成物であって、４のＤＡＲを有する組成物。

【請求項4】

ＨＥＲ２発現がんを処置するための、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記がんが固形腫瘍である、請求項４に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記固形腫瘍が、乳がん、卵巣がん、肺がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、膵がん、唾液腺がんおよび脳腫瘍からなる群から選択される、請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートであって、 （ａ）Ａｂが、ＨＥＲ２に結合し、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７３で寄託された微生物株により産生される重鎖ポリペプチドとＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２２６７２で寄託された微生物株により産生される軽鎖ポリペプチドとを含む抗体であり； （ｂ）Ｌ−Ｄがリンカー−薬物部分であり、Ｌがマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）であり、Ｄが、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミドまたはその薬学的に許容できる塩もしくは溶媒和物である、抗体薬物コンジュゲート。

【請求項8】

請求項７に記載の抗体薬物コンジュゲートと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。

【請求項9】

請求項７に記載の複数の抗体薬物コンジュゲートと、任意選択により薬学的担体とを含む組成物であって、４のＤＡＲを有する組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、部位特異的ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートに関する。本発明はさらに、がんの処置のためにかかる抗体薬物コンジュゲートを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＥｒｂＢファミリーの膜貫通受容体チロシンキナーゼのメンバーは、細胞成長、細胞分化、細胞遊走およびアポトーシスの重要なメディエーターである。この受容体ファミリーは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２またはｐ１８５）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４またはｔｙｒｏ２）を含む、４つの別個のメンバーを含む。

【0003】

ＨＥＲ２は、化学的に処理されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として元々同定された。ＨＥＲ２の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（Ｄｉ Ｆｉｏｒｅら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７（４８１１）：１７８〜８２；Ｈｕｄｚｉａｋら、１９８７、ＰＮＡＳ ８４（２０）：７１５９〜６３；Ｃｈａｚｉｎら、１９９２、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ７（９）：１８５９〜６６）および動物モデル（Ｇｕｙら、１９９２、ＰＮＡＳ ８９（２２）：１０５７８〜８２）の両方において、腫瘍原性として立証されている。ＨＥＲ２をコードする遺伝子の増幅と、引き続く受容体の過剰発現とは、乳がんおよび卵巣がんにおいて生じ、予後不良と相関する（Ｓｌａｍｏｎら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５（４７８５）：１７７〜８２；Ｓｌａｍｏｎら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７〜１２；Ａｎｂａｚｈａｇａｎら、１９９１、Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２（１）：４７〜５３；Ａｎｄｒｕｌｉｓら、１９９８、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６（４）：１３４０〜９）。ＨＥＲ２の過剰発現（遺伝子増幅に起因する頻度が高いが、必ずしも遺伝子増幅に起因しない）は、胃、子宮内膜、非小細胞肺がん、結腸、膵、膀胱、腎臓、前立腺および子宮頚部を含む他の腫瘍型においても観察されてきた（Ｓｃｈｏｌｌら、２００１、Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １２（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ８１〜７；Ｍｅｎａｒｄら、２００１、Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ １２（Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ１５〜９；Ｍａｒｔｉｎら、２０１４、Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：１４６９〜８６）。

【0004】

Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合するヒト化モノクローナル抗体である（Ｃａｒｔｅｒら １９９２、ＰＮＡＳ ８９：４２８５〜９および米国特許第５，８２１，３３７号）。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、その腫瘍がＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳がんを有する患者の処置のために、１９９８年９月２５日に食品医薬品局（ｔｈｅ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）から販売承認を受けた。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、広範な以前の抗がん治療を受けた、ＨＥＲ２過剰発現乳がんを有する患者を処置することにおけるブレークスルーであるが、この集団中の患者の一部は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）処置に応答できない、かかる処置に対して不良に応答するにすぎない、またはかかる処置に対して抵抗性になる。

【0005】

Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）（トラスツズマブ−ＤＭ１またはＴ−ＤＭ１）は、安定なチオエーテルリンカーＭＣＣ（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）を介してマイタンシノイド剤ＤＭ１にコンジュゲートされたトラスツズマブからなる抗体薬物コンジュゲートである（Ｌｅｗｉｓら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８：９２８０〜９０；Ｋｒｏｐら、２０１０、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２８：２６９８〜２７０４；米国特許第８，３３７，８５６号）。Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびタキサン薬物によって以前に処置されており、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）不応性になった患者におけるＨＥＲ２陽性転移性乳がんの処置のために、２０１３年２月２２日に食品医薬品局から販売承認を受けた。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で見られたのと同様に、ＨＥＲ２過剰発現乳がん集団中の患者の一部は、Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）による首尾よい長期治療を経験していない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

従って、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）および／またはＫａｄｃｙｌａ（登録商標）処置に応答しない、かかる処置に対して不良に応答する、またはかかる処置に対して抵抗性になる、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍またはＨＥＲ２過剰発現と関連する他の疾患を有する患者のためのさらなるＨＥＲ２指向性のがん治療を開発する、重大な臨床的必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、部位特異的ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、およびＨＥＲ２発現がんの処置におけるそれらの使用を提供する。ＡＤＣは、がん細胞への治療薬の標的化送達を可能にし、既知のオフターゲット毒性を低減させながらより選択的な治療の可能性を提供する。

【0008】

本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは一般に、式：Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）のものであり、Ａｂは、ＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である。

【0009】

本発明のＡＤＣの抗体（Ａｂ）は、任意のＨＥＲ２結合性抗体であり得る。本発明の一部の態様では、Ａｂは、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））と同じ、ＨＥＲ２上のエピトープに結合する。本発明の他の態様では、Ａｂは、トラスツズマブと同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲを有する。本発明の具体的な態様では、Ａｂは、トラスツズマブと同じ重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および同じ軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を有する。

【0010】

本発明のＨＥＲ２ ＡＤＣは、部位特異的様式で薬物にコンジュゲートされる。この型のコンジュゲーションを提供するために、抗体は、１つもしくは複数の特異的部位において操作された反応性システイン残基、またはアシルドナーグルタミン残基（１つもしくは複数の特異的部位において操作された、または結合したペプチドタグ中のいずれか）のいずれかを提供するために誘導体化しなければならない。かかる改変は、抗体の抗原結合能を破壊しない部位においてであるべきである。好ましい実施形態では、１つまたは複数の改変が、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常領域においてなされる。

【0011】

本発明の一部の実施形態では、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、トラスツズマブの重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲ（配列番号２〜４のＶ_Ｈ ＣＤＲおよび配列番号８〜１０のＶ_Ｌ ＣＤＲ）、ならびに表１に開示される重鎖および軽鎖定常領域の任意の組み合わせを含む抗体を使用でき、ただし、重鎖定常領域が配列番号５である場合、軽鎖定常領域は配列番号１１ではないことを条件とする。かかる実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号１７、５、１３、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９のいずれかから選択され得、一方で軽鎖定常領域は、配列番号４１、１１または４３のいずれかから選択され得、ただし、この組み合わせは、配列番号５および配列番号１１ではない。

【0012】

具体的な実施形態では、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを作製するために使用される抗体は、配列番号１７の重鎖定常領域および配列番号４１の軽鎖定常領域に結合した、配列番号２〜４のＣＤＲを有するＶ_Ｈドメインおよび配列番号８〜１０のＣＤＲを有するＶ_Ｌドメインを含む。別の具体的な実施形態では、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを作製するために使用される抗体は、配列番号１３の重鎖定常領域および配列番号４３の軽鎖定常領域に結合した、配列番号２〜４のＣＤＲを有するＶ_Ｈドメインおよび配列番号８〜１０のＣＤＲを有するＶ_Ｌドメインを含む。

【0013】

他の実施形態では、本発明のＡＤＣは、表１に開示された重鎖および軽鎖の任意の組み合わせを含む抗体を使用でき、ただし、重鎖が配列番号６である場合、軽鎖は配列番号１２ではないことを条件とする。かかる実施形態では、重鎖は、配列番号１８、６、１４、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０のいずれかから選択され得、一方で軽鎖は、配列番号４２、１２または４４のいずれかから選択され得、ただし、この組み合わせは、配列番号６および配列番号１２ではない。

【0014】

具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、配列番号１８の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを含む抗体を使用できる。別の具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、配列番号１４の重鎖と配列番号４４の軽鎖とを含む抗体を使用できる。

【0015】

本明細書に開示される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣのいずれかは、がんを処置するのに有用な治療剤である薬物（Ｄ）を用いて調製され得る。具体的な実施形態では、治療剤は抗有糸分裂剤である。別の具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣ中の抗有糸分裂剤の薬物構成要素は、オーリスタチン（例えば、０１０１、８２６１、６１２１、８２５４、６７８０および０１３１）である。より具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣ中のオーリスタチン薬物構成要素は、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（０１０１としても公知）である。好ましくは、本発明のＡＤＣの薬物構成要素は、膜透過性である。

【0016】

本明細書に開示される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣのいずれかは、切断可能または切断不能であるリンカー（Ｌ）を用いて調製され得る。好ましくは、リンカーは切断可能である。切断可能リンカーには、ｖｃ、ＡｃＬｙｓｖｃおよびｍ（Ｈ２０）ｃ−ｖｃが含まれるがこれらに限定されない。より好ましくは、リンカーは、ｖｃまたはＡｃＬｙｓｖｃである。

【0017】

本発明の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号１８の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0018】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号１４の重鎖と配列番号４４の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはＡｃＬｙｓｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0019】

本発明の別の態様は、本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲート、ならびに本明細書に開示される抗体薬物コンジュゲートの調製、合成およびコンジュゲーションのための中間体を作製する方法、それらを調製する方法、それらの合成の方法、それらのコンジュゲーションの方法ならびにそれらの精製の方法を含む。

【0020】

本明細書に開示される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物がさらに提供される。

【0021】

部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの抗体部分をコードする核酸が、本発明によって企図される。この核酸を含むさらなるベクターおよび宿主細胞もまた、本発明によって企図される。

【0022】

本発明は、ＨＥＲ２発現がんの処置における部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの使用の方法もまた提供する。本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣで処置されるＨＥＲ２発現がんは、高い、中程度のまたは低いレベルでＨＥＲ２を発現し得る。一部の実施形態では、処置されるがんは、単独またはタキサンと組み合わせた、トラスツズマブおよび／またはトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１）のいずれかによる処置に対して抵抗性である、かかる処置に対して不応性であるおよび／またはかかる処置から再発したものである。処置されるがんには、乳がん、卵巣がん、肺がん、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん、膵がん、唾液腺がんおよび脳腫瘍、または上述のがんの転移が含まれるがこれらに限定されない。より具体的な実施形態では、乳がんは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陰性乳がんまたは三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）である。別の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。

【0023】

本発明のこれらおよび他の態様は、本出願を全体として検討することによって理解される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１ ＡＤＣおよび（Ｂ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１ ＡＤＣを描写する図である。それぞれの黒丸は、モノクローナル抗体にコンジュゲートされたリンカー／ペイロードを表す。１つのそのようなリンカー／ペイロードの構造をそれぞれのＡＤＣに関して示す。下線部は、それを通してコンジュゲーションが起こる抗体上のアミノ酸残基によってもたらされる。

【図2-1】、

【図2-2】、

【図2-3】異なるリンカーペイロードに対するトラスツズマブ誘導抗体のコンジュゲーション時の保持時間の変化を示す、選択されたＡＤＣの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のスペクトルを示す図である。

【図3】ＨＥＲ２に対するＡＤＣ結合のグラフを示す図である。（Ａ）ＨＥＲ２陽性ＢＴ４７４細胞に対する直接結合、および（Ｂ）ＢＴ４７４細胞に対するＰＥ標識トラスツズマブとの競合的結合。これらの結果は、これらのＡＤＣにおける抗体の結合特性がコンジュゲーションプロセスによって変化しなかったことを示している。

【図4】トラスツズマブ誘導ＡＤＣのＡＤＣＣ活性を示す図である。

【図5-1】、

【図5-2】異なるレベルのＨＥＲ２発現を有する多数の細胞株に対する、多数のトラスツズマブ誘導ＡＤＣのｎＭペイロード濃度で報告するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性データ（ＩＣ_５０）を示す図である。

【図6-1】、

【図6-2】異なるレベルのＨＥＲ２発現を有する多数の細胞株に対する、多数のトラスツズマブ誘導ＡＤＣのｎｇ／ｍＬ抗体濃度で報告するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性データ（ＩＣ_５０）を示す図である。

【図7-1】〜

【図7-5】腫瘍体積を経時的にプロットした、Ｎ８７異種移植片に対する９個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。

【図7-1】（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ）−ｖｃ０１０１；

【図7-2】（Ｃ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；

【図7-3】（Ｅ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｆ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；

【図7-4】（Ｇ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｈ）Ｔ−ｖｃ０１０１；

【図7-5】（Ｉ）Ｔ−ＤＭ１。Ｎ８７胃がん細胞は、高レベルのＨＥＲ２を発現する。

【図8-1】〜

【図8-3】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＨＣＣ１９５４異種移植片に対する６個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。

【図8-1】（Ａ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；

【図8-2】（Ｃ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；

【図8-3】（Ｅ）Ｔ−ＤＭ１。ＨＣＣ１９５４乳がん細胞は、高レベルのＨＥＲ２を発現する。

【図9-1】〜

【図9-4】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＪＩＭＴ−１異種移植片に対する７個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。

【図9-1】（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；

【図9-2】（Ｃ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；

【図9-3】（Ｅ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｆ）Ｔ−ｖｃ０１０１；

【図9-4】（Ｇ）Ｔ−ＤＭ１。ＪＩＭＴ−１乳がん細胞は、中等度／低レベルのＨＥＲ２を発現する。

【図10-1】、

【図10-2】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）異種移植片に対する５個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。

【図10-1】（Ａ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；

【図10-2】（Ｃ）Ｔ−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ−ＤＭ１。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）乳がん細胞は、中等度／低レベルのＨＥＲ２を発現する。

【図11-1】〜

【図11-3】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＰＤＸ−１４４５８０患者由来異種移植片に対する５個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。

【図11-1】（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；

【図11-2】（Ｃ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ−ｖｃ０１０１；

【図11-3】（Ｅ）Ｔ−ＤＭ１。ＰＤＸ−１４４５８０患者由来細胞はＴＮＢＣ ＰＤＸモデルである。

【図12-1】、

【図12-2】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＰＤＸ−３７６２２患者由来異種移植片に対する４個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。

【図12-1】（Ａ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｂ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；

【図12-2】（Ｃ）Ｔ（Ｋ２９７Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ−ＤＭ１。ＰＤＸ−３７６２２患者由来細胞は、中等度のレベルのＨＥＲ２を発現するＮＳＣＬＣＰＤＸモデルである。

【図13】（Ａ）Ｔ−ＤＭ１または（Ｂ）Ｔ−ｖｃ０１０１のいずれかによって処置し、ホスホヒストンＨ３およびＩｇＧ抗体に関して染色したＮ８７腫瘍異種移植片の免疫組織化学を示す図である。Ｔ−ｖｃ０１０１に関してバイスタンダー効果が観察される。

【図14-1】〜

【図14-3】Ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ−ＤＭ１に対して抵抗性にした細胞（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）またはＴ−ＤＭ１に対して感受性の親細胞（Ｎ８７細胞）に対する、多数のトラスツズマブ誘導ＡＤＣおよび遊離のペイロードをｎＭペイロード濃度およびｎｇ／ｍＬ抗体濃度で報告するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性データ（ＩＣ_５０）を示す図である。Ｎ８７胃がん細胞は、高レベルのＨＥＲ２を発現する。

【図15-1】、

【図15-2】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞に対する７個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。

【図15-1】（Ａ）Ｔ−ＤＭ１；（Ｂ）Ｔ−ｍｃ８２６１；（Ｃ）Ｔ（２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；

【図15-2】（Ｅ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｆ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；（Ｇ）Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１。

【図16】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞に対する（Ａ）ＭＲＰ１薬物排出ポンプおよび（Ｂ）ＭＤＲ１薬物排出ポンプのタンパク質発現を示すウェスタンブロットを示す図である。

【図17】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞のＨＥＲ２発現およびトラスツズマブに対する結合を示す図である。（Ａ）ＨＥＲ２タンパク質発現を示すウェスタンブロットおよび（Ｂ）細胞表面ＨＥＲ２に対するトラスツズマブの結合。

【図18-1】、

【図18-2】Ｔ−ＤＭ１感受性（Ｎ８７細胞）および抵抗性（Ｎ８７−ＴＭ１およびＮ８７−ＴＭ２）胃がん細胞におけるタンパク質発現レベルの特徴を示す図である。

【図18-1】（Ａ）５２３個のタンパク質におけるタンパク質発現レベルの変化；（Ｂ）ＩＧＦ２Ｒ、ＬＡＭＰ１、およびＣＴＳＢのタンパク質発現を示すウェスタンブロット；

【図18-2】（Ｃ）ＣＡＶ１のタンパク質発現を示すウェスタンブロット；（Ｄ）Ｎ８７細胞（左のパネル）およびＮ８７−ＴＭ２細胞（右のパネル）の移植によりｉｎ ｖｉｖｏで生成された腫瘍におけるＣＡＶ１タンパク質発現のＩＨＣ。

【図19-1】（Ａ）Ｔ−ＤＭ１感受性Ｎ８７親細胞；

【図19-2】（Ｂ）Ｔ−ＤＭ１抵抗性Ｎ８７−ＴＭ１細胞；

【図19-3】、

【図19-4】（Ｃ）Ｔ−ＤＭ１抵抗性Ｎ８７−ＴＭ２細胞の移植後ｉｎ ｖｉｖｏで生成された腫瘍のトラスツズマブおよび様々なトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対する感受性を示す図である。

【図20-1】〜

【図20-3】Ｔ−ＤＭ１感受性Ｎ８７親細胞およびＴ−ＤＭ１抵抗性Ｎ８７−ＴＭ２またはＮ８７−ＴＭ１細胞の移植によりｉｎ ｖｉｖｏで生成された腫瘍のトラスツズマブおよび様々なトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対する感受性を示す図である。

【図20-1】（Ａ）Ｎ８７腫瘍サイズを、トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下で経時的にプロットした；（Ｂ）Ｎ８７−ＴＭ２腫瘍サイズを、トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下で経時的にプロットした；

【図20-2】（Ｃ）トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下でのＮ８７細胞の腫瘍サイズ倍加時間；（Ｄ）トラスツズマブまたは２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下でのＮ８７−ＴＭ２細胞の腫瘍サイズ倍加時間；

【図20-3】（Ｅ）Ｎ８７−ＴＭ２腫瘍サイズを、７個の異なるトラスツズマブ誘導ＡＤＣの存在下で経時的にプロットした；（Ｆ）トラスツズマブ誘導ＡＤＣを１４日目に添加して、Ｎ８７−ＴＭ１腫瘍サイズを経時的にプロットした。

【図21-1】〜

【図21-3】ｉｎ ｖｉｖｏ生成Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞の生成および特徴付けを示す図である。

【図21-1】（Ａ）Ｎ８７胃がん細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで移植した当初はＴ−ＤＭ１に対して感受性であった。（Ｂ）時間と共に、移植したＮ８７細胞は、Ｔ−ＤＭ１に対して抵抗性となったが、

【図21-2】（Ｃ）Ｔ−ｖｃ０１０１、（Ｄ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、および

【図21-3】（Ｅ）Ｔ（ｋＫ１８３＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１に対しては感受性のままであった。

【図22-1】、

【図22-2】腫瘍体積を経時的にプロットした、Ｔ−ＤＭ１感受性親Ｎ８７細胞と比較したｉｎ ｖｉｖｏ生成Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞（Ｎ８７−ＴＤＭ）に対する４個のトラスツズマブ誘導ＡＤＣのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を示す図である。

【図22-1】（Ａ）Ｔ−ＤＭ１；（Ｂ）Ｔ（ｋＫ１８３＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１；

【図22-2】（Ｃ）Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１；（Ｄ）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１。

【図23】Ｔ−ＤＭ１感受性親Ｎ８７細胞と比較したｉｎ ｖｉｖｏ生成Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞（マウス２、１７、および１８からのＮ８７−ＴＤＭ１）のＨＥＲ２タンパク質発現レベルを示す図である。（Ａ）ＦＡＣＳ分析および（Ｂ）ウェスタンブロット分析。ＨＥＲ２タンパク質発現の有意差は観察されなかった。

【図24-1】、

【図24-2】Ｎ８７−ＴＤＭ１におけるＴ−ＤＭ１抵抗性（マウス２、７および１７）が薬物排出ポンプによるものではないことを示す図である。

【図24-1】（Ａ）ＭＤＲ１タンパク質発現を示すウェスタンブロット。遊離の薬物（Ｂ）０１０１、

【図24-2】（Ｃ）ドキソルビシン、（Ｄ）Ｔ−ＤＭ１の存在下でのＴ−ＤＭ１抵抗性細胞（Ｎ８７−ＴＤＭ１）およびＴ−ＤＭ１感受性Ｎ８７親細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性。

【図25】（Ａ）カニクイザルに用量を投与後の総ＡｂおよびトラスツズマブＡＤＣ（Ｔ−ｖｃ０１０１）またはＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）部位特異的ＡＤＣの、ならびに（Ｂ）カニクイザルに用量を投与後のトラスツズマブのＡＤＣ検体（Ｔ−ｖｃ０１０１）または様々な部位特異的ＡＤＣの、濃度対時間プロファイルおよび薬物動態／毒性動態を示す図である。

【図26】疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）による相対的保持の値とラットにおける曝露（ＡＵＣ）との比較を示す図である。Ｘ軸は、ＨＩＣによる相対的保持時間を表し、Ｙ軸は、ラットにおける薬物動態の用量標準化曝露（０〜３３６時間までの抗体の「曲線下面積」、ＡＵＣを１０ｍｇ／ｋｇの薬物用量で除算したもの）を表す。記号はおおよその薬物担持（ＤＡＲ）を指し：菱形＝ＤＡＲ２；丸＝ＤＡＲ４である。矢印は、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を示す。

【図27】Ｔ−ｖｃ０１０１の従来のコンジュゲートＡＤＣおよびＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１部位特異的ＡＤＣを使用した毒性試験を示す図である。Ｔ−ｖｃ０１０１は、５ｍｇ／ｋｇで重度の好中球減少症を惹起したが、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、９ｍｇ／ｋｇで好中球数の軽微な減少を引き起こした。

【図28-1】（Ａ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１；

【図28-2】（Ｂ）Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１；および

【図28-3】（Ｃ）Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１の結晶構造を示す図である。

【図29】Ｎ８７細胞株を使用した異種移植片モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ有効性を示す図である。試験した全てのＡＤＣが３ｍｐｋで有効性を示した。

【図30】腫瘍体積を経時的にプロットした、ＰＤＸ−ＧＡ００４４患者由来異種移植片に対するトラスツズマブおよび２つのトラスツズマブ誘導ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す図である。動物をビヒクル（中抜きの菱形）、トラスツズマブ（中抜きの三角）、Ｔ−ＤＭ１（中抜きの丸）、またはＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１（黒丸および黒四角）によって処置した。ＰＤＸ−ＧＡ００４４患者由来細胞は、中等度のレベルのＨＥＲ２を発現する胃ＰＤＸモデルである。

【発明を実施するための形態】

【0025】

本発明は、部位特異的ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ＨＥＲ２抗体、リンカーおよび薬物ペイロードを使用してコンジュゲートを調製するためのプロセス、ならびにＡＤＣを作製する際に使用される抗体をコードする核酸を提供する。本発明のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現がんの処置において使用され得る医薬などの組成物の調製および製造に有用である。

【0026】

ＡＤＣは、リンカーの使用を介して薬物ペイロードにコンジュゲートされた抗体構成要素からなる。ＡＤＣのための従来のコンジュゲーション戦略は、抗体の重鎖および／または軽鎖上に内因性に存在するリジンまたはシステインを介して、薬物ペイロードを抗体にランダムにコンジュゲートすることに依存する。従って、かかるＡＤＣは、異なる薬物：抗体比（ＤＡＲ）を示す分子種の不均質な混合物である。対照的に、本明細書に開示されるＡＤＣは、抗体の重鎖および／または軽鎖上の特定の操作された残基において薬物ペイロードを抗体にコンジュゲートする部位特異的ＡＤＣである。このように、部位特異的ＡＤＣは、規定された薬物：抗体比（ＤＡＲ）を有する分子種から構成されるＡＤＣの均一な集団である。従って、部位特異的ＡＤＣは、コンジュゲートの改善された薬物動態、体内分布および安全性プロファイルを生じる、一様な化学量論を示す。本発明のＡＤＣは、１つまたは複数のリンカー／ペイロード部分にコンジュゲートされた本発明の抗体を含む。

【0027】

本発明は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートを提供し、（ａ）Ａｂは、ＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である。

【0028】

式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）_ｐの抗体薬物コンジュゲートもまた本発明によって包含され、（ａ）Ａｂは、ＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、（ｃ）ｐは、抗体に結合されるリンカー／薬物部分の数である。部位特異的ＡＤＣについて、ｐは、ＡＤＣの均一な性質に起因する整数である。一部の実施形態では、ｐは４である。他の実施形態では、ｐは３である。他の実施形態では、ｐは２である。他の実施形態では、ｐは１である。他の実施形態では、ｐは４よりも大きい。

【0029】

本明細書で使用する場合、用語「ＨＥＲ２」とは、ＥＧＦＲファミリーに属する膜貫通チロシンキナーゼ受容体を指す。ＨＥＲ２は、ＥｒｂＢ２、ｐ１８５およびＣＤ３４０としても公知である。このファミリーの受容体は、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲ経路などの増殖因子シグナル伝達経路を刺激することによって機能する４つのメンバー（ＥＧＦＲ／ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４）を含む。ＨＥＲ２の増幅および／または過剰発現は、複数のヒト悪性腫瘍と関連する。野生型ヒトＨＥＲ２タンパク質は、例えば、Ｓｅｍｂａら、１９８５、ＰＮＡＳ ８２：６４９７〜６５０１およびＹａｍａｍｏｔｏら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０〜４およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３３６３に記載されている。

【0030】

本明細書で使用する場合、用語「抗体（Ａｂ）」とは、免疫グロブリン分子の可変領域中に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して、ポリペプチドなどの特異的標的または抗原を認識しそれに結合することが可能な免疫グロブリン分子を指す。この用語は、モノクローナル抗体、所与の抗原に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の抗原結合性断片（即ち、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｃなど）およびそれらの変異体が含まれるがこれらに限定されない、任意の型の抗体を包含し得る。

【0031】

ネイティブのまたは天然に存在する抗体、およびネイティブの免疫グロブリンは、典型的には、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変動する。各重鎖および軽鎖は、一定の間隔をあけた鎖内ジスルフィド架橋もまた有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、その後にいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、その他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインとアラインされ、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアラインされる。用語「可変」とは、可変ドメインのある特定の部分が、抗体間で配列が広範に異なるという事実を指す。

【0032】

本発明で使用される抗体は、ＨＥＲ２に特異的に結合する。具体的な実施形態では、ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））と同じ、ＨＥＲ２上のエピトープに結合する。より具体的な実施形態では、ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））と同じ可変領域ＣＤＲを有する。さらにより具体的な実施形態では、ＨＥＲ２抗体は、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））と同じ可変領域（即ち、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ）を有する。

【0033】

本明細書で使用する場合、用語「リンカー（Ｌ）」は、薬物ペイロードへの抗体の直接的または間接的な連結を記述する。抗体へのリンカーの結合は、表面リジン、酸化型炭水化物への還元的カップリング、鎖間ジスルフィド連結を還元することによって遊離したシステイン残基、特異的部位において操作された反応性システイン残基、ならびにトランスグルタミナーゼおよびアミンの存在下でのポリペプチド操作によって反応性にされたアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンを介するものなどの、種々の方法で達成され得る。本発明は、抗体を薬物ペイロードに連結するために、部位特異的方法を使用する。一実施形態では、コンジュゲーションは、抗体定常領域中に操作されたシステイン残基を介して生じる。別の実施形態では、コンジュゲーションは、ａ）ペプチドタグを介して抗体定常領域に付加された、ｂ）抗体定常領域中に操作された、またはｃ）周囲の残基を操作することによってアクセス可能／反応性にされた、アシルドナーグルタミン残基を介して生じる。リンカーは、切断可能（即ち、細胞内条件下での切断に対して感受性）または切断不能であり得る。一部の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカーである。

【0034】

本明細書で使用する場合、用語「薬物（Ｄ）」とは、がんを処置する際に有用な任意の治療剤を指す。薬物は、細胞傷害剤、化学療法剤、細胞分裂停止剤および免疫調節剤など、生物学的または検出可能な活性を有する。好ましい実施形態では、治療剤は、腫瘍細胞の枯渇、排除および／または死滅を含む、腫瘍に対する細胞傷害効果を有する。用語、薬物、ペイロードおよび薬物ペイロードは、相互交換可能に使用される。具体的な実施形態では、薬物は抗有糸分裂剤である。より具体的な実施形態では、薬物はオーリスタチンである。さらにより具体的な実施形態では、薬物は、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（０１０１としても公知）である。一部の実施形態では、薬物は、好ましくは膜透過性である。

【0035】

本明細書で使用する場合、用語「Ｌ−Ｄ」とは、リンカー（Ｌ）に連結された薬物（Ｄ）から生じるリンカー−薬物部分を指す。

【0036】

本発明と併せて使用されるさらなる科学技術用語は、本明細書で特記しない限り、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈が他を要求しない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションと併せて使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当該分野で周知であり、一般に使用される。

【0037】

Ｉ．ＨＥＲ２抗体
本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの調製のために、抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに特異的に結合する任意の抗体であり得る。一実施形態では、ＡＤＣを作製するために使用される抗体は、トラスツズマブと同じ、ＨＥＲ２のエピトープに結合し、および／またはＨＥＲ２結合についてトラスツズマブと競合する。別の実施形態では、ＡＤＣを作製するために使用される抗体は、トラスツズマブと同じ重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲを有する。さらに別の実施形態では、ＡＤＣを作製するために使用される抗体は、トラスツズマブと同じ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する。

【0038】

用語「競合する」とは、抗体に関して本明細書で使用する場合、第１の抗体のその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能に減少するように、第１の抗体またはその抗原結合性断片が、第２の抗体またはその抗原結合性断片の結合と十分に類似した様式でエピトープに結合することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合もまた第１の抗体の存在下で検出可能に減少する代替的な状況があり得るが、必ずしもそうである必要はない。即ち、第１の抗体は、第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を第２の抗体が阻害することなしに、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害できる。しかし、同じ程度までであれ、より高い程度までであれ、より低い程度までであれ、各抗体が他方の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を検出可能に阻害する場合、それらの抗体は、そのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合について互いと「交差競合する」と言われる。競合性および交差競合性の抗体は共に、本発明によって包含される。かかる競合または交差競合が生じる機構（例えば、立体障害、コンフォメーション変化、または共通エピトープもしくはそれらの部分への結合）に関わらず、当業者は、かかる競合性および／または交差競合性の抗体が包含され、本明細書に開示される方法に有用であり得ることを、本明細書に提供される教示に基づいて理解する。

【0039】

トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインに結合するヒト化モノクローナル抗体である。その可変ドメインのアミノ酸配列は、米国特許第５，８２１，３３７号（Ｖ_Ｈは、米国特許第５，８２１，３３７号の配列番号４２であり、Ｖ_Ｌは配列番号４１である）ならびに以下の表１（それぞれ、配列番号１および７）に開示されている。重鎖可変領域ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号２〜４であり、一方で軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列は、配列番号６〜１０である（以下の表１）。完全重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号６および１２である（以下の表１）。

【0040】

Ｔ−ＤＭ１（商品名Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））は、安定なチオエーテルリンカーＭＣＣ（４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート）を介してマイタンシノイド剤ＤＭ１にコンジュゲートされたトラスツズマブからなる抗体薬物コンジュゲートである（米国特許第８，３３７，８５６号）。このＡＤＣの抗体構成要素は、トラスツズマブと同一である。ＡＤＣが、各自にコンジュゲートされた異なる量のＤＭ１を有する分子種の不均質な集団であるように、トラスツズマブへのペイロードコンジュゲーションは、従来のコンジュゲーション（部位特異的ではなく）技術を使用して達成される。ＤＭ１ペイロードは、チューブリン重合の阻害を介して有糸分裂の間に微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら、１９７５、Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２〜５）。Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）およびタキサン薬物で以前に処置されており、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）不応性になった患者におけるＨＥＲ２陽性転移性乳がんの処置のために承認されている。実施例のセクションに記載される実験において使用されるＴ−ＤＭ１は、公に入手可能な情報を使用して内部で作製した。

【0041】

本発明のＡＤＣは、部位特異的様式でペイロードにコンジュゲートされる。この型のコンジュゲーションを提供するために、抗体は、１つまたは複数の特異的部位において操作された反応性システイン残基、トランスグルタミナーゼおよびアミンの存在下でのポリペプチド操作によって反応性にされたアシルドナーグルタミン含有タグまたは内因性グルタミンのいずれかを提供するために誘導体化しなければならない。アミノ酸改変は、当該分野で公知の任意の方法によってなされ得、多くのかかる方法は、当業者に周知であり、慣用的である。例えば、限定するものではないが、アミノ酸の置換、欠失および挿入は、任意の周知のＰＣＲベースの技術を使用して達成され得る。アミノ酸置換は、部位指定変異誘発によってなされ得る（例えば、ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、１９８２、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００；ならびにＫｕｎｋｅｌ、１９８５、ＰＮＡＳ ８２：４８８を参照のこと）。

【0042】

抗原結合の保持が必要とされる適用では、かかる改変は、抗体の抗原結合能を破壊しない部位においてであるべきである。好ましい実施形態では、１つまたは複数の改変が、重鎖および／または軽鎖の定常領域においてなされる。

【0043】

本明細書で使用する場合、抗体の用語「定常領域」とは、単独または組み合わせてのいずれかの、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。本発明のＡＤＣを作製するために使用される抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはそれらの任意のアイソタイプのいずれか１つの定常領域、ならびにそれらのサブクラスおよび変異バージョンに由来し得る。

【0044】

定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能、例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、オプソニン化、補体依存性細胞傷害の開始および肥満細胞脱顆粒における抗体の関与を示す。当該分野で公知のように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。「Ｆｃ領域」は、ネイティブ配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基からまたはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで及ぶと規定される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版 Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１）。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常領域ＣＨ２およびＣＨ３を有する。

【0045】

抗体における使用のための２つの異なる軽鎖定常領域、ＣＬκおよびＣＬλが存在する。ＣＬκは、公知の多型遺伝子座ＣＬκ−Ｖ／Ａ^４５およびＣＬκ−Ｌ／Ｖ^８３（Ｋａｂａｔら（１９９１、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１〜３２４２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＡ）に示されるＫａｂａｔ番号付けシステムを使用し、従って、全てのカッパおよびラムダ位置は、Ｋａｂａｔシステムに従って番号付けされる）を有し、従って、多型Ｋｍ（１）：ＣＬκ−Ｖ^４５／Ｌ^８３；Ｋｍ（１，２）：ＣＬκ−Ａ^４５／Ｌ^８３；およびＫｍ（３）：ＣＬκ−Ａ^４５／Ｖ^８３を可能にする。本発明のポリペプチド、抗体およびＡＤＣは、これらの軽鎖定常領域のいずれかを有する抗体構成要素を有し得る。

【0046】

明確さのために、特記しない限り、抗体のヒトＩｇＧ重鎖定常ドメイン中のアミノ酸残基は、「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」と本明細書で呼ばれる、Ｋａｂａｔら、１９９１に記載されるように、Ｅｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３（１）：７８〜８５のＥＵインデックスに従って番号付けされる。典型的には、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１定常ドメインの約アミノ酸残基２３６から約４４７までを含む。Ｃ番号付け間の対応は、例えば、ＩＧＭＴデータベースにおいて見出すことができる。軽鎖定常ドメインのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔら、１９９１に従って番号付けされる。抗体定常ドメインアミノ酸残基の番号付けは、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１３／０９３８０９にも示される。ＩｇＧ重鎖定常ドメインにおけるＫａｂａｔのＥＵインデックスの使用に対する唯一の例外は、実施例に記載される残基Ａ１１４である。Ａ１１４とは、Ｋａｂａｔ番号付けを指し、対応するＥＵインデックス番号は１１８である。これは、この部位における部位特異的コンジュゲーションの初期の刊行物が、Ｋａｂａｔ番号付けを使用し、この部位をＡ１１４Ｃと呼び、それ以降当該分野で「１１４」部位として広く使用されてきたからである。Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６、９２５〜９３２（２００８）を参照のこと。当該分野におけるこの部位の一般的な用法と一致するように、「Ａ１１４」、「Ａ１１４Ｃ」、「Ｃ１１４」または「１１４Ｃ」が、実施例において使用される。

【0047】

本発明のＡＤＣを作製するために使用される抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、発現または伝播のためにベクター中にクローニングされ得る。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞においてベクター中に維持され得、次いで、宿主細胞は拡大増殖され得、将来の使用のために凍結され得る。

【0048】

本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、目的の１つまたは複数の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達すること、好ましくは、宿主細胞においてそれを発現させることが可能な構築物を指す。ベクターの例には、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドもしくはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連したＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、およびある特定の真核生物細胞、例えば、産生細胞が含まれるがこれらに限定されない。

【0049】

本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入物の取り込みのためのベクター（複数可）のレシピエントであり得る、またはかかるレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、個々の宿主細胞の子孫を含み、この子孫は、天然の、偶発的なまたは計画的な変異に起因して、元の親細胞と必ずしも（形態学的に、またはゲノムＤＮＡ相補体で）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本発明の核酸またはベクターをｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。

【0050】

表１は、本発明の部位特異的ＡＤＣを構築する際に使用されるヒト化ＨＥＲ２抗体のアミノ酸（タンパク質）配列および関連する核酸（ＤＮＡ）配列を提供する。示されるＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって規定される。

【0051】

表１に示される抗体の重鎖および軽鎖は、トラスツズマブの重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）を有する。重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、トラスツズマブから誘導体化され、本発明のＡＤＣを作製する場合の部位特異的コンジュゲーションを可能にするための１つまたは複数の改変を含む。

【0052】

部位特異的コンジュゲーションを可能にするための抗体定常領域中のアミノ酸配列に対する改変は、下線かつ太字である。トラスツズマブから誘導体化された抗体についての命名法は、Ｔ（トラスツズマブの代わり）、ならびに次いで、括弧中に、野生型残基の一文字アミノ酸コードが隣接する改変のアミノ酸の位置、および誘導体化された抗体中のその位置に今ある残基の一文字アミノ酸コードである。この命名法に対する２つの例外は、軽（カッパ）鎖上の１８３位がリジンからシステインに改変されたことを示す「ｋＫ１８３Ｃ」と、８つのアミノ酸グルタミン含有タグが軽鎖定常領域のＣ末端に結合されていることを示す「ＬＣＱ０５」である。

【0053】

表１に示される改変の１つは、コンジュゲーションには使用されない。重鎖上の２２２位の残基（Ｋａｂａｔ番号付けスキームのＥＵインデックスを使用する）は、より均質な抗体およびペイロードコンジュゲート、抗体とペイロードとの間のより良好な分子間架橋、および／または鎖間架橋における顕著な減少を生じるように変更され得る。

【0054】

【表1-1】

【0055】

【表1-2】

【0056】

【表1-3】

【0057】

【表1-4】

【0058】

【表1-5】

【0059】

【表1-6】

【0060】

【表1-7】

【0061】

【表1-8】

【0062】

【表1-9】

【0063】

【表1-10】

【0064】

【表1-11】

【0065】

【表1-12】

【0066】

【表1-13】

【0067】

【表1-14】

【0068】

【表1-15】

【0069】

【表1-16】

【0070】

【表1-17】

【0071】

【表1-18】

【0072】

【表1-19】

【0073】

【表1-20】

【0074】

【表1-21】

【0075】

【表1-22】

【0076】

【表1-23】

【0077】

【表1-24】

【0078】

【表1-25】

【0079】

【表1-26】

【0080】

【表1-27】

【0081】

【表1-28】

【0082】

【表1-29】

【0083】

【表1-30】

【0084】

【表1-31】

【0085】

【表1-32】

【0086】

【表1-33】

【0087】

【表1-34】

【0088】

【表1-35】

【0089】

【表1-36】

【0090】

【表1-37】

【0091】

一部の実施形態では、本発明のＡＤＣは、トラスツズマブの重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲ（配列番号２〜４のＶ_Ｈ ＣＤＲおよび配列番号８〜１０のＶ_Ｌ ＣＤＲ）、ならびに表１に開示される重鎖および軽鎖定常領域の任意の組み合わせを含む抗体を使用でき、ただし、重鎖定常領域が配列番号５である場合、軽鎖定常領域は配列番号１１ではない（この組み合わせが、野生型トラスツズマブを再創出し、従って、部位特異的コンジュゲーションを可能にしないという事実に起因する）ことを条件とする。かかる実施形態では、重鎖定常領域は、配列番号１７、５、１３、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７または３９のいずれかから選択され得、一方で軽鎖定常領域は、配列番号４１、１１または４３のいずれかから選択され得、ただし、この組み合わせは、上で議論したように、配列番号５および配列番号１１ではない。

【0092】

より具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、トラスツズマブの重鎖可変領域ＣＤＲおよび軽鎖可変領域ＣＤＲ（配列番号２〜４のＶ_Ｈ ＣＤＲおよび配列番号８〜１０のＶ_Ｌ ＣＤＲ）、ならびに以下から選択される重鎖および軽鎖定常領域の組み合わせを含む抗体を使用できる：
（ａ）配列番号１７の重鎖定常領域および配列番号４１の軽鎖定常領域；
（ｂ）配列番号５の重鎖定常領域および配列番号４１の軽鎖定常領域；
（ｃ）配列番号１７の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｄ）配列番号２１の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｅ）配列番号２３の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｆ）配列番号２５の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｇ）配列番号２７の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｈ）配列番号２３の重鎖定常領域および配列番号４１の軽鎖定常領域；
（ｉ）配列番号２５の重鎖定常領域および配列番号４１の軽鎖定常領域；
（ｊ）配列番号２７の重鎖定常領域および配列番号４１の軽鎖定常領域；
（ｋ）配列番号２９の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｌ）配列番号３１の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｍ）配列番号３３の重鎖定常領域および配列番号４３の軽鎖定常領域；
（ｎ）配列番号３５の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｏ）配列番号３７の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；
（ｐ）配列番号３９の重鎖定常領域および配列番号１１の軽鎖定常領域；または
（ｑ）配列番号１３の重鎖定常領域および配列番号４３の軽鎖定常領域。

【0093】

さらにより具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、配列番号２〜４のＶ_Ｈ ＣＤＲおよび配列番号８〜１０のＶ_Ｌ ＣＤＲならびに配列番号１７の重鎖定常領域および配列番号４１の軽鎖定常領域を有する抗体を含む。

【0094】

別のより具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、配列番号２〜４のＶ_Ｈ ＣＤＲおよび配列番号８〜１０のＶ_Ｌ ＣＤＲならびに配列番号１３の重鎖定常領域および配列番号４３の軽鎖定常領域を有する抗体を含む。

【0095】

他の実施形態では、本発明のＡＤＣは、表１に開示される重鎖および軽鎖の任意の組み合わせを含む抗体を使用でき、ただし、重鎖が配列番号６である場合、軽鎖は配列番号１２ではない（この組み合わせが、野生型トラスツズマブを再創出し、従って、部位特異的コンジュゲーションを可能にしないという事実に起因する）ことを条件とする。かかる実施形態では、重鎖は、配列番号１８、６、１４、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８または４０のいずれかから選択され得、一方で軽鎖は、配列番号４２、１２または４４のいずれかから選択され得、ただし、この組み合わせは、上で議論したように、配列番号６および配列番号１２ではない。

【0096】

より具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、以下から選択される重鎖および軽鎖の組み合わせを含む抗体を使用できる：
（ａ）配列番号１８の重鎖および配列番号４２の軽鎖；
（ｂ）配列番号６の重鎖および配列番号４２の軽鎖；
（ｃ）配列番号１８の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｄ）配列番号２２の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｅ）配列番号２４の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｆ）配列番号２６の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｇ）配列番号２８の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｈ）配列番号２４の重鎖および配列番号４２の軽鎖；
（ｉ）配列番号２６の重鎖および配列番号４２の軽鎖；
（ｊ）配列番号２８の重鎖および配列番号４２の軽鎖；
（ｋ）配列番号３０の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｌ）配列番号３２の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｍ）配列番号３４の重鎖および配列番号４４の軽鎖；
（ｎ）配列番号３６の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｏ）配列番号３８の重鎖および配列番号１２の軽鎖；
（ｐ）配列番号４０の重鎖および配列番号１２の軽鎖；または
（ｑ）配列番号１４の重鎖および配列番号４４の軽鎖。

【0097】

さらにより具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、配列番号１８の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを有する抗体を含む。配列番号１８の重鎖および配列番号４２の軽鎖をコードする核酸を含むプラスミドは、２０１５年１１月１７日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託されており、それぞれ、受託番号ＰＴＡ−１２２６７２およびＰＴＡ−１２２６７３を与えられている。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびその規則（ブダペスト条約）の規定の下でなされた。これは、寄託の日から３０年間にわたる寄託物の生存可能な培養物の維持を保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項の下でＡＴＣＣによって入手可能にされ、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間での同意の制約下にあり、この同意は、関連する米国特許の発行の際または任意の米国もしくは外国特許出願が公衆の閲覧に付された際のいずれか早い方の、公衆に対する、寄託物の培養物の子孫の恒久的かつ無制限の入手可能性を保証し、米国特許法第１２２条およびそれに準ずる長官規則（８８６ ＯＧ ６３８への特定の言及を伴う米国特許法施行規則第１．１４条を含む）に従って権利付与されると米国特許商標庁長官によって決定された者への子孫の入手可能性を保証する。

【0098】

本出願の譲受人は、万一、寄託にかかる材料の培養物が適切な条件下でカルチベートした場合に死んだまたは失われたまたは破壊された場合、それらの材料が、通知により、別の同一物で遅滞なく置き換えられることに同意している。寄託された材料の入手可能性は、その特許法に従って任意の政府の権限の下で付与された権利に違反して発明を実施するための許可と解釈すべきではない。

【0099】

別のより具体的な実施形態では、本発明のＡＤＣは、配列番号１４の重鎖と配列番号４４の軽鎖とを有する抗体を含む。

【0100】

本発明の一部の態様では、本発明のＡＤＣは、上に開示された重鎖または軽鎖のいずれかに対して少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖を有する抗体を含む。変更された残基は、抗体の可変領域中または定常領域中にあり得る。一部の実施形態では、上に開示された重鎖または軽鎖のいずれかと比較して、１、２、３、４または５以下の残基が変更されている。他の実施形態では、可変領域ＣＤＲのいずれにも、変更された残基は存在しない。

【0101】

用語「パーセント同一」（または「％同一」）とは、アミノ酸配列に関して、最大限の対応のためにアラインされた場合に同じである、２つの配列中の残基の数を意味する。アミノ酸パーセント同一性を測定するために使用され得る当該分野で公知のいくつかの異なるアルゴリズムが存在する（即ち、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ＴｏｏｌまたはＢＬＡＳＴ（登録商標））。特記しない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズムのためのデフォルトパラメーターが使用される。

【0102】

ＡＤＣの調製における使用のために、本明細書に記載されるＨＥＲ２抗体は、実質的に純粋、即ち、少なくとも５０％純粋（即ち、混入物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、なおより好ましくは、少なくとも９８％純粋、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋であり得る。

【0103】

ＩＩ．薬物
本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの調製において有用な薬物には、細胞傷害剤、細胞分裂停止剤、免疫調節性剤および化学療法剤が含まれるがこれらに限定されない、がんの処置において有用な任意の治療剤が含まれる。細胞傷害効果とは、標的細胞（即ち、腫瘍細胞）の枯渇、排除および／または死滅を指す。細胞傷害剤とは、細胞に対して細胞傷害効果を有する薬剤を指す。細胞分裂停止効果とは、細胞増殖の阻害を指す。細胞分裂停止剤とは、細胞に対して細胞分裂停止効果を有し、それによって、細胞（即ち、腫瘍細胞）の特定のサブセットの成長および／または拡大増殖を阻害する薬剤を指す。免疫調節性剤とは、サイトカインおよび／もしくは抗体の産生ならびに／またはＴ細胞機能をモジュレートすることを介して免疫応答を刺激し、それによって、直接的、または別の薬剤をより効果的にすることによって間接的のいずれかで、細胞（即ち、腫瘍細胞）のサブセットの成長を阻害するまたは低減させる薬剤を指す。化学療法剤とは、がんの処置において有用な化学化合物である薬剤を指す。薬物は、薬物誘導体であってもよく、薬物は、本発明の抗体とのコンジュゲーションを可能にするために官能化されている。

【0104】

一部の実施形態では、薬物は膜透過性薬物である。かかる実施形態では、ペイロード（即ち、薬物）は、バイスタンダー効果を惹起し得、最初にＡＤＣを内在化した細胞の周囲の細胞は、ペイロードによって死滅される。これは、ペイロードが（即ち、切断可能リンカーの切断によって）抗体から放出され、細胞膜を横切り、拡散の際に、周囲の細胞の死滅を誘導する場合に生じる。

【0105】

開示された方法によれば、薬物は、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の抗体薬物コンジュゲートを調製するために使用され、（ａ）Ａｂは、ＨＥＲ２に結合する抗体であり；（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物である。

【0106】

薬物対抗体比（ＤＡＲ）または薬物担持量は、抗体１つ当たりのコンジュゲートされている薬物（Ｄ）分子の数を示す。本発明の抗体薬物コンジュゲートは、ＡＤＣの組成物中に、１のＤＡＲを有するＡＤＣの均一な集団が本質的に存在するように、部位特異的コンジュゲーションを使用する。一部の実施形態では、ＤＡＲは１である。一部の実施形態では、ＤＡＲは２である。他の実施形態では、ＤＡＲは３である。他の実施形態では、ＤＡＲは４である。他の実施形態では、ＤＡＲは４よりも大きい。

【0107】

従来のコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションではなく）を使用することは、その各々が異なる個々のＤＡＲを有する、異なる分子種のＡＤＣの不均質な集団を生じる。この方法で調製されるＡＤＣの組成物は、複数の抗体を含み、各抗体は、特定の数の薬物分子にコンジュゲートされる。このように、組成物は平均ＤＡＲを有する。Ｔ−ＤＭ１（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））は、リジン残基上での従来のコンジュゲーションを使用し、０、１、２、３、４、５、６、７または８個の薬物分子が担持されたＡＤＣを含む広い分布を伴って、およそ４の平均ＤＡＲを有する（Ｋｉｍら、２０１４、Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ ２５（７）：１２２３〜３２）。

【0108】

複数のＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。ＤＡＲおよび平均ＤＡＲは、種々の従来の手段、例えば、ＵＶ分光法、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、放射測定法、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、電気泳動およびＨＰＬＣによって決定され得る。

【0109】

本発明の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣは、１のＤＡＲ、２のＤＡＲ、３のＤＡＲ、４のＤＡＲ、５のＤＡＲ、６のＤＡＲ、７のＤＡＲ、８のＤＡＲ、９のＤＡＲ、１０のＤＡＲ、１１のＤＡＲ、１２のＤＡＲ、または１２よりも大きいＤＡＲを有し得る。本発明の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣは、１個の薬物分子、または２個の薬物分子、または３個の薬物分子、または４個の薬物分子、または５個の薬物分子、または６個の薬物分子、または７個の薬物分子、または８個の薬物分子、または９個の薬物分子、または１０個の薬物分子、または１１個の薬物分子、または１２個の薬物分子、または１２個よりも多い分子を有し得る。

【0110】

本発明の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣは、約２〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約６の範囲の平均ＤＡＲ、または約５〜約７の範囲の平均ＤＡＲ、または約６〜約８の範囲の平均ＤＡＲ、または約７〜約９の範囲の平均ＤＡＲ、または約８〜約１０の範囲の平均ＤＡＲ、または約９〜約１１の範囲の平均ＤＡＲ、または約１０〜約１２の範囲の平均ＤＡＲなどを有し得る。一部の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約１の平均ＤＡＲ、または約２の平均ＤＡＲ、約３の平均ＤＡＲ、または約４の平均ＤＡＲ、または約５の平均ＤＡＲ、または約６の平均ＤＡＲ、または約７の平均ＤＡＲ、または約８の平均ＤＡＲ、または約９の平均ＤＡＲ、または約１０の平均ＤＡＲ、または約１１の平均ＤＡＲ、または約１２の平均ＤＡＲ、または１２よりも大きい平均ＤＡＲを有し得る。平均ＤＡＲの上述の範囲において使用する場合、用語「約」は、＋／−０．５％を意味する。

【0111】

ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば、約３〜約５の範囲の平均ＤＡＲ、約３〜約４の範囲の平均ＤＡＲ、または約４〜約５の範囲の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。さらに、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、好ましい範囲の平均ＤＡＲ、例えば、３〜５の範囲の平均ＤＡＲ、３〜４の範囲の平均ＤＡＲ、または４〜５の範囲の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0112】

本発明の一部の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約１．０の平均ＤＡＲ、または１．０の平均ＤＡＲ、または１．１の平均ＤＡＲ、または１．２の平均ＤＡＲ、または１．３の平均ＤＡＲ、または１．４の平均ＤＡＲ、または１．５の平均ＤＡＲ、または１．６の平均ＤＡＲ、または１．７の平均ＤＡＲ、または１．８の平均ＤＡＲ、または１．９の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。別の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約２．０の平均ＤＡＲ、または２．０の平均ＤＡＲ、または２．１の平均ＤＡＲ、または２．２の平均ＤＡＲ、または２．３の平均ＤＡＲ、または２．４の平均ＤＡＲ、または２．５の平均ＤＡＲ、または２．６の平均ＤＡＲ、または２．７の平均ＤＡＲ、または２．８の平均ＤＡＲ、または２．９の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。別の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約３．０の平均ＤＡＲ、または３．０の平均ＤＡＲ、または３．１の平均ＤＡＲ、または３．２の平均ＤＡＲ、または３．３の平均ＤＡＲ、または３．４の平均ＤＡＲ、または３．５の平均ＤＡＲ、または３．６の平均ＤＡＲ、または３．７の平均ＤＡＲ、または３．８の平均ＤＡＲ、または３．９の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。別の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、約４．０の平均ＤＡＲ、または４．０の平均ＤＡＲ、または４．１の平均ＤＡＲ、または４．２の平均ＤＡＲ、または４．３の平均ＤＡＲ、または４．４の平均ＤＡＲ、または４．５の平均ＤＡＲ、または４．６の平均ＤＡＲ、または４．７の平均ＤＡＲ、または４．８の平均ＤＡＲ、または４．９の平均ＤＡＲ、または５．０の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0113】

別の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、１２以下の平均ＤＡＲ、１１以下の平均ＤＡＲ、１０以下の平均ＤＡＲ、９以下の平均ＤＡＲ、８以下の平均ＤＡＲ、７以下の平均ＤＡＲ、６以下の平均ＤＡＲ、５以下の平均ＤＡＲ、４以下の平均ＤＡＲ、３以下の平均ＤＡＲ、２以下の平均ＤＡＲ、または１以下の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0114】

他の態様では、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤は、１１．５以下の平均ＤＡＲ、１０．５以下の平均ＤＡＲ、９．５以下の平均ＤＡＲ、８．５以下の平均ＤＡＲ、７．５以下の平均ＤＡＲ、６．５以下の平均ＤＡＲ、５．５以下の平均ＤＡＲ、４．５以下の平均ＤＡＲ、３．５以下の平均ＤＡＲ、２．５以下の平均ＤＡＲ、１．５以下の平均ＤＡＲによって特徴付けられ得る。

【0115】

本発明の一部の態様では、システイン残基を介した従来のコンジュゲーションのための方法および本明細書に開示される精製条件は、約３〜５の範囲の、好ましくは約４の最適化された平均ＤＡＲを有する、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤を提供する。

【0116】

本発明の一部の態様では、操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのための方法および本明細書に開示される精製条件は、約３〜５の範囲の、好ましくは約４の最適化された平均ＤＡＲを有する、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤を提供する。

【0117】

本発明の一部の態様では、トランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーションを介した部位特異的コンジュゲーションのための方法および本明細書に開示される精製条件は、約１〜３の範囲の、好ましくは約２の最適化された平均ＤＡＲを有する、ＨＥＲ２ ＡＤＣの組成物、バッチおよび／または製剤を提供する。

【0118】

式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐの抗体薬物コンジュゲートもまた本発明によって包含され、（ａ）Ａｂは、ＨＥＲ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり、（ｂ）Ｌ−Ｄはリンカー−薬物部分であり、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、（ｃ）ｐは、抗体に結合されるリンカー／薬物部分の数である。部位特異的ＡＤＣについて、ｐは、ＡＤＣの均一な性質に起因する整数である。一部の実施形態では、ｐは４である。他の実施形態では、ｐは３である。他の実施形態では、ｐは２である。他の実施形態では、ｐは１である。他の実施形態では、ｐは４よりも大きい。

【0119】

一実施形態では、本発明のＡＤＣの薬物構成要素は、抗有糸分裂薬物である。具体的な実施形態では、抗有糸分裂薬物は、オーリスタチン（例えば、０１０１、８２６１、６１２１、８２５４、６７８０および０１３１；以下の表２を参照のこと）である。より具体的な実施形態では、オーリスタチン薬物は、２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（０１０１としても公知）である。

【0120】

オーリスタチンは、チューブリン重合の阻害を介して有糸分裂の間に微小管の形成を阻害することによって、細胞増殖を阻害する。その全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１３／０７２８１３は、本発明のＡＤＣの製造において有用なオーリスタチンを開示しており、それらのオーリスタチンを産生する方法を提供している。

【0121】

【表2-1】

【0122】

【表2-2】

【0123】

本発明の一部の態様では、細胞傷害剤は、リポソームまたは生体適合性ポリマーを使用して作製され得る。本明細書に記載されるＨＥＲ２抗体は、血清半減期および生物活性を増加させるため、ならびに／またはｉｎ ｖｉｖｏ半減期を延長させるために、生体適合性ポリマーにコンジュゲートされ得る。生体適合性ポリマーの例には、水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはその誘導体、および双性イオン含有生体適合性ポリマー（例えば、ホスホリルコリン含有ポリマー）が含まれる。

【0124】

ＩＩＩ．リンカー
本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、薬物をＨＥＲ２抗体に連結またはコンジュゲートするためのリンカーを使用して調製される。リンカーは、薬物と抗体とを連結して抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するために使用され得る二官能性化合物である。かかるコンジュゲートは、薬物の腫瘍細胞への選択的送達を可能にする。適切なリンカーには、例えば、切断可能および切断不能リンカーが含まれる。切断可能リンカーは、典型的には、細胞内条件下での切断に対して感受性である。コンジュゲートされた薬物が抗体から切断される主要な機構には、リソソームの酸性ｐＨ中での加水分解（ヒドラゾン、アセタールおよびｃｉｓ−アコニテート様アミド）、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド切断、およびジスルフィドの還元が含まれる。切断のためのこれらの機構が様々であることの結果として、薬物を抗体に連結する機構もまた非常に様々であり、任意の適切なリンカーが使用され得る。

【0125】

適切な切断可能リンカーには、細胞内プロテアーゼ、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカー、例えば、マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）、Ｎ〜２〜−アセチル−Ｌ−リジル−Ｌ−バリル−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノエチル−ＣＯ−（ＡｃＬｙｓｖｃ）およびｍ（Ｈ２０）ｃ−ｖｃ（以下の表３）が含まれるがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、リンカーが切断されたときにペイロードがバイスタンダー効果を誘導できるように、リンカーは切断可能リンカーである。バイスタンダー効果は、膜透過性薬物が（即ち、切断可能リンカーの切断によって）抗体から放出され、細胞膜を横切り、拡散の際に、最初にＡＤＣを内在化した細胞の周囲の細胞の死滅を誘導する場合に生ずる。

【0126】

適切な切断不能リンカーには、マレイミドカプロイル（ｍｃ）、マレイミド−（ポリエチレングリコール）_６（ＭａｌＰｅｇ６）、Ｍａｌ−ＰＥＧ２Ｃ２、Ｍａｌ−ＰＥＧ３Ｃ２およびｍ（Ｈ２０）ｃ（以下の表３）が含まれるがこれらに限定されない。

【0127】

他の適切なリンカーには、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解可能なリンカー、例えば、ヒドラゾンリンカーが含まれる。さらなる適切な切断可能リンカーには、ジスルフィドリンカーが含まれる。リンカーは、例えば、ｍｃリンカーなど、薬物が放出されるために抗体が細胞内で分解されるような程度まで、抗体に共有結合され得る。

【0128】

本発明の特定の態様では、本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣ中のリンカーは、切断可能であり、ｖｃまたはＡｃＬｙｓｖｃであり得る。

【0129】

抗体にコンジュゲートされる治療剤（薬物）の多くは、水中での可溶性が、あったとしてもほとんどなく、コンジュゲートの凝集に起因して、コンジュゲート上の薬物担持量を制限し得る。これを克服するための１つのアプローチは、リンカーに可溶化基を付加することである。抗体に結合したＰＥＧ二酸（di-acid）、チオール酸（thiol-acid）またはマレイミド酸（maleimide-acid）、ジペプチドスペーサー、およびアントラサイクリンまたはデュオカルマイシンアナログのアミンへのアミド結合を有するものを含む、ＰＥＧおよびジペプチドからなるリンカーを用いて作製されたコンジュゲートが使用され得る。別の例は、細胞傷害剤に結合したＰＥＧ含有リンカージスルフィドおよび抗体に結合したアミドを用いて調製されたコンジュゲートである。ＰＥＧ基を取り込むアプローチは、凝集、および薬物担持量における制限を克服するのに有益であり得る。

【0130】

【表3】

【0131】

リンカーは、表３に示されるように、分子の左側を介してモノクローナル抗体に結合され、分子の右側を介して薬物に結合される。

【0132】

ＩＶ．部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを調製する方法
本発明の抗体薬物コンジュゲートを調製するための方法もまた提供される。例えば、本明細書に開示される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを産生するためのプロセスは、（ａ）リンカーを薬物に連結するステップ；（ｂ）リンカー−薬物部分を抗体にコンジュゲートするステップ；および（ｃ）抗体薬物コンジュゲートを精製するステップを含み得る。

【0133】

本発明のＨＥＲ２ ＡＤＣは、ＨＥＲ２抗体を薬物ペイロードにコンジュゲートするために、部位特異的方法を使用する。

【0134】

一実施形態では、部位特異的コンジュゲーションは、抗体定常領域中に操作された１つまたは複数のシステイン残基を介して生じる。システイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのためにＨＥＲ２抗体を調製する方法は、その全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３／０９３８０９に記載されるように実施され得る。以下の位置のうち１つまたは複数（ＩｇＧ１定常領域についてはＫａｂａｔ番号付けのＥＵインデックスを使用し、カッパ鎖定常領域についてはＫａｂａｔ番号付けを使用する）が、システインに変更され得、従って、コンジュゲーションのための部位として機能し得る：ａ）重鎖定常領域上の、残基１１４、２４６、２４９、２６５、２６７、２７０、２７６、２７８、２８３、２９０、２９２、２９３、２９４、３００、３０２、３０３、３１４、３１５、３１８、３２０、３２７、３３２、３３３、３３４、３３６、３４５、３４７、３５４、３５５、３５８、３６０、３６２、３７０、３７３、３７５、３７６、３７８、３８０、３８２、３８６、３８８、３９０、３９２、３９３、４０１、４０４、４１１、４１３、４１４、４１６、４１８、４１９、４２１、４２８、４３１、４３２、４３７、４３８、４３９、４４３および４４４であり、ならびに／またはｂ）カッパ鎖定常領域上の、残基１１１、１４９、１８３、１８８、２０７および２１０。

【0135】

具体的な実施形態では、システインに変更され得る１つまたは複数の位置（Ｋａｂａｔ番号付けのＥＵインデックスを使用する）は、ａ）重鎖定常領域上では２９０、３３４、３９２および／もしくは４４３、ならびに／またはｂ）軽鎖定常領域上では１８３（Ｋａｂａｔ番号付け）である。

【0136】

より具体的な実施形態では、重鎖定常領域上の２９０位および軽鎖定常領域上の１８３位が、コンジュゲーションのためにシステインに変更される。

【0137】

別の実施形態では、部位特異的コンジュゲーションは、抗体定常領域中に操作された１つまたは複数のアシルドナーグルタミン残基を介して生じる。グルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションのためにＨＥＲ２抗体を調製する方法は、その全体が参照によって組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／０５９８８２に記載されるように実施され得る。抗体は、３つの異なる方法で、部位特異的コンジュゲーションに使用されるグルタミン残基を発現するように操作され得る。

【0138】

グルタミン残基を含む短いペプチドタグは、軽鎖および／または重鎖のいくつかの異なる位置中に（即ち、Ｎ末端で、Ｃ末端で、内部で）取り込まれ得る。第１の実施形態では、グルタミン残基を含む短いペプチドタグは、重鎖および／または軽鎖のＣ末端に結合され得る。以下のグルタミン含有タグのうち１つまたは複数が、薬物コンジュゲーションのためのアシルドナーとして機能するために結合され得る：ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号８１）、ＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号８２）、ＬＬＱＧＡ（配列番号８３）、ＧＧＬＬＱＧＡ（配列番号８４）、ＬＬＱＧ（配列番号８５）、ＬＬＱＧＰＧ（配列番号８６）、ＬＬＱＧＰＡ（配列番号８７）、ＬＬＱＧＰ（配列番号８８）、ＬＬＱＰ（配列番号８９）、ＬＬＱＰＧＫ（配列番号９０）、ＬＬＱＧＡＰＧＫ（配列番号９１）、ＬＬＱＧＡＰＧ（配列番号９２）、ＬＬＱＧＡＰ（配列番号９３）、ＬＬＱＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５、式中、Ｘ_１は、ＧもしくはＰであり、Ｘ_２は、Ａ、Ｇ、Ｐであるもしくは存在しない、Ｘ_３は、Ａ、Ｇ、Ｋ、Ｐであるもしくは存在しない、Ｘ_４は、Ｇ、Ｋであるもしくは存在しない、Ｘ_５は、Ｋであるもしくは存在しない（配列番号９４）、またはＬＬＱＸ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５、式中、Ｘ_１は、任意の天然に存在するアミノ酸であり、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４およびＸ_５は、任意の天然に存在するアミノ酸であるもしくは存在しない（配列番号９５）。

【0139】

具体的な実施形態では、ＧＧＬＬＱＧＰＰ（配列番号８１）は、軽鎖のＣ末端に結合される。

【0140】

第２の実施形態では、重鎖および／または軽鎖上の残基は、部位指定変異誘発によってグルタミン残基に変更され得る。具体的な実施形態では、重鎖上の２９７位の残基（Ｋａｂａｔ番号付けのＥＵインデックスを使用する）は、グルタミン（Ｑ）になるように変更され得、従って、コンジュゲーションのための部位として機能し得る。

【0141】

第３の実施形態では、重鎖または軽鎖上の残基が変更されて、１つまたは複数の内因性グルタミンが、コンジュゲーションのためにアクセス可能／反応性になるような位置で、脱グリコシル化（aglycosylation）を生じ得る。具体的な実施形態では、重鎖上の２９７位の残基（Ｋａｂａｔ番号付けのＥＵインデックスを使用する）は、アラニン（Ａ）に変更される。かかる場合、重鎖上の２９５位のグルタミン（Ｑ）は、コンジュゲーションにおける使用が可能になる。

【0142】

コンジュゲートの形成のための最適な反応条件は、温度、ｐＨ、リンカー−ペイロード部分のインプット、および添加剤濃度などの反応変数の変動によって経験的に決定され得る。他の薬物のコンジュゲーションに適切な条件は、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。操作されたシステイン残基を介した部位特異的コンジュゲーションは、以下の実施例５Ａに例示される。グルタミン残基を介した部位特異的コンジュゲーションは、以下の実施例５Ｂに例示される。

【0143】

抗体薬物コンジュゲート１つ当たりの薬物分子の数をさらに増加させるために、薬物は、直鎖または分岐鎖ポリエチレングリコールポリマーおよびモノマーを含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得る。ＰＥＧモノマーは、式：−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）−のものである。薬物および／またはペプチドアナログは、直接的に、または間接的に、即ち、糖などの適切なスペーサー基を介して、ＰＥＧに結合され得る。ＰＥＧ−抗体薬物組成物は、薬物安定性および標的部位へのｉｎ ｖｉｖｏ送達を促進するために、さらなる親油性および／または親水性部分もまた含み得る。ＰＥＧ含有組成物を調製するための代表的な方法は、例えば、米国特許第６，４６１，６０３号；同第６，３０９，６３３号；および同第５，６４８，０９５号に見出すことができる。

【0144】

コンジュゲーション後、コンジュゲートは、従来の方法によって、コンジュゲートされていない反応物および／または凝集形態のコンジュゲートから分離および精製され得る。これは、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外濾過／ダイアフィルトレーション、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）、等電点電気泳動（ＣＦ）、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ、またはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００クロマトグラフィーなどのプロセスを含み得る。分離は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によっても達成され得る。適切なＨＩＣ媒体には、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ媒体またはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−Ｂｕｔｙｌ ＨＩＣ媒体が含まれる。

【0145】

以下の表４は、本明細書に示される実施例のセクションにおいてデータを生成するために使用したＨＥＲ２ ＡＤＣを示す。表４に示される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣ（列１〜１７中）は、本発明の部位特異的ＡＤＣの例である。

【0146】

本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを作製するために、上のセクションＩに開示される任意のＨＥＲ２抗体は、上のセクションＩＩＩに開示される任意のリンカーを介して、上のセクションＩＩに開示される任意の薬物に、部位特異的技術を使用してコンジュゲートされ得る。好ましい実施形態では、リンカーは、切断可能（例えば、ｖｃまたはＡｃＬｙｓｖｃ）である。他の好ましい実施形態では、薬物は、オーリスタチン（例えば、０１０１）である。

【0147】

本発明の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号１８の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。かかるＡＤＣの模式図は、図１Ａに示される。

【0148】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号１４の重鎖と配列番号４４の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはＡｃＬｙｓｖｃであり、薬物は０１０１である。かかるＡＤＣの模式図は、図１Ｂに示される。

【0149】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号２４の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0150】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号２６の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0151】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号２８の重鎖と配列番号４２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0152】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号３０の重鎖と配列番号１２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0153】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号３２の重鎖と配列番号１２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0154】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号３４の重鎖と配列番号４４の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはＡｃＬｙｓｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0155】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号３６の重鎖と配列番号１２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはＡｃＬｙｓｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0156】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号３８の重鎖と配列番号１２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0157】

本発明の別の特定の態様では、式Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、（ａ）配列番号４０の重鎖と配列番号１２の軽鎖とを含む抗体Ａｂ；および（ｂ）リンカー−薬物部分Ｌ−Ｄを含み、Ｌはリンカーであり、Ｄは薬物であり、リンカーはｖｃであり、薬物は０１０１である。

【0158】

【表4-1】

【0159】

【表4-2】

【0160】

Ｖ．部位特異的ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートの使用
本発明の抗体薬物コンジュゲートは、ＨＥＲ２発現がんを処置するための治療方法において有用である。本発明の一部の態様では、ＨＥＲ２発現腫瘍を有する対象において腫瘍の成長または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、本明細書に記載される１つまたは複数のＡＤＣを有する組成物（即ち、医薬組成物）を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の他の態様では、対象においてＨＥＲ２発現がん細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、本明細書に記載される１つまたは複数のＡＤＣを有する組成物（即ち、医薬組成物）を投与するステップを含む方法が提供される。本発明の他の態様では、対象においてＨＥＲ２発現腫瘍の退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、有効量の、本明細書に記載される１つまたは複数のＡＤＣを有する組成物（即ち、医薬組成物）を投与するステップを含む方法が提供される。他の態様では、本発明は、上記方法における使用のための、本明細書に記載される１つまたは複数のＡＤＣを含む医薬組成物を提供する。他の態様では、本発明は、上記方法における使用のための医薬の製造における、本明細書に記載される１つもしくは複数のＡＤＣまたは本明細書に記載されるＡＤＣを含む医薬組成物の使用を提供する。

【0161】

開示された治療方法の所望の転帰は、一般に、対照またはベースライン測定値と比較して定量化可能な尺度である。本明細書で使用する場合、相対的な用語、例えば、「改善する」、「増加する」または「低減させる」は、対照と比較した値、例えば、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下での対照個体（または複数の対照個体）における測定値を示す。代表的な対照個体は、処置されている個体とほぼ同じ年齢の、処置されている対象と同じ形態のがんに罹患した個体である（処置される個体および対照個体において障害の段階が比較できることを確実にするため）。

【0162】

治療に対する応答における変化または改善は一般に、統計的に有意である。本明細書で使用する場合、用語「有意性」または「有意」は、２つ以上の実体間の非ランダムな関連が存在する確率の統計的分析に関する。関係性が「有意」であるまたは「有意性」を有するかどうかを決定するために、データの統計的操作は、「ｐ値」であり得る。ユーザーが定義したカットオフポイントの下に入るｐ値は、有意とみなされる。０．１以下、０．０５未満、０．０１未満、０．００５未満、または０．００１未満のｐ値は、有意とみなされ得る。

【0163】

Ｖ．Ａ．がん
本発明のＡＤＣは、ＨＥＲ２発現がんを処置する際に有用である。一実施形態では、ＨＥＲ２発現がんは、固形腫瘍である。より具体的な実施形態では、ＨＥＲ２発現固形腫瘍には、乳がん（例えば、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体陰性乳がん、三重陰性乳がん）、卵巣がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん（腺癌、扁平上皮癌および大細胞癌を含む）および小細胞肺がん）、胃がん、食道がん、結腸直腸がん、尿路上皮がん（例えば、微小乳頭型尿路上皮がん（micropapillary urothelial cancer）および定型尿路上皮がん）、膵がん、唾液腺がん（例えば、粘表皮癌、腺様嚢胞癌および終末導管腺癌（terminal duct adenocarcinoma））および脳腫瘍、または上述のがんの転移（即ち、ＨＥＲ２＋乳がんからの肺転移）が含まれるがこれらに限定されない（Ｍａｒｔｉｎら、２０１４、Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．１０（８）：１４６９〜８６）。

【0164】

さらにより具体的な実施形態では、ＨＥＲ２発現固形腫瘍には、乳がん、卵巣がん、肺がんおよび胃がんが含まれるがこれらに限定されない。

【0165】

別の実施形態では、乳がんは、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体陰性である。より具体的な実施形態では、乳がんは、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）である。

【0166】

別の実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。

【0167】

本発明の一態様では、本明細書に開示されるＡＤＣは、治療剤で以前に処置されていないＨＥＲ２発現がんを処置するために使用され得る（即ち、第１選択処置として）。

【0168】

本発明の別の態様では、本明細書に開示されるＡＤＣは、別の治療剤による処置に対して抵抗性である、かかる処置に対して不応性であるおよび／またはかかる処置から再発したものであるＨＥＲ２発現がんを処置するために使用され得る（即ち、第２選択処置として）。一実施形態では、以前の処置は、単独またはさらなる治療剤（即ち、タキサン、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセルなど）と組み合わせてのいずれかのトラスツズマブ（トラスツズマブまたはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））であった。別の実施形態では、以前の処置は、単独またはさらなる治療剤（即ち、タキサン、例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセルなど）と組み合わせてのいずれかのトラスツズマブエムタンシン（Ｔ−ＤＭ１またはＫａｄｃｙｌａ（登録商標））であった。

【0169】

本発明の別の態様では、本明細書に開示されるＡＤＣは、１つよりも多い他の治療剤による処置に対して抵抗性である、かかる処置に対して不応性であるおよび／またはかかる処置から再発したものであるＨＥＲ２発現がんを処置するために使用され得る（即ち、第３選択処置または第４選択処置などとして）。

【0170】

本発明のＡＤＣは、高いレベルのＨＥＲ２（即ち、ＩＨＣ ３＋）、中程度のレベルのＨＥＲ２（即ち、２＋のＩＨＣまたは２＋／３＋のＩＨＣ）または低いレベルのＨＥＲ２（即ち、ＩＨＣ １＋、ＩＨＣ ２＋またはＩＨＣ １＋／２＋）（ＨＥＲ２検出の方法についてのセクションＩＶＢを参照のこと）を発現するがんを処置するために使用され得る。これは、低いまたは中程度のＨＥＲ２発現がんでは効果的でないトラスツズマブおよびＴ−ＤＭ１とは対照的である（Ｂｕｒｒｉｓら、２０１１、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２９（４）：３９８〜４０５）。

【0171】

本発明のＡＤＣは、腫瘍細胞の大部分が類似の量のＨＥＲ２を発現する、性質が均一ながんを処置するために使用され得る。代替的に、本発明のＡＤＣは、異なるレベルのＨＥＲ２を発現する異なる腫瘍細胞集団が存在する、性質が不均質ながんを処置するために使用され得る。

【0172】

Ｖ．Ｂ．ＨＥＲ２検出法
腫瘍上のＨＥＲ２発現レベルを評価するための最良の方法に関する態様は議論されており、臨床的意義は概説されている（Ｓａｕｔｅｒら、２００９、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２７：１３２３〜３３；Ｗｏｌｆｆら、２００７、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２５：１１８〜４５；Ｗｏｌｆｆら、２０１３、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３１：３９９７〜４０１４）。現在、ＨＥＲ２状態は、免疫組織化学（ＩＨＣ）、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および発色性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）によって評価され得る。

【0173】

ＩＨＣは、細胞膜上のＨＥＲ２タンパク質発現を同定する。結果は通常、０＋（発現なし）から３＋（高い発現）までの範囲の半定量的スコアリングシステムを使用して表現される。なし（０＋）または低いレベル（１＋）の発現を示す腫瘍は、ＨＥＲ２陰性とみなされる；逆もまた同様であり、高いレベル（３＋）の発現を示す腫瘍は、ＨＥＲ２陽性とみなすべきである。この方法は、経済的に有利であり、容易に利用可能であるが、低い感度および高い観察者間変動に悩まされている（Ｇａｎｃｂｅｒｇら、２００２、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．７４：１１３〜２０）。

【0174】

ＩＨＣを使用したＨＥＲ２検出のための４つのＦＤＡ承認された市販のキットが入手可能である：ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（商標）（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａ／Ｓによる）；Ｐａｔｈｗａｙ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．による）；Ｉｎｓｉｔｅ ＨＥＲ２／ＮＥＵキット（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．による）およびＢｏｎｄ Ｏｒａｃｌｅ ＨＥＲ２ ＩＨＣ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによる）。これらは、ＨＥＲ２発現レベルを以下へと層別化する、高度に標準化された半定量的アッセイである；０（細胞１つ当たり＜２０，０００の受容体、視認できる発現なし）、１＋（細胞１つ当たり約１００，０００の受容体、部分的な膜染色、ＨＥＲ−２を過剰発現する細胞＜１０％）、２＋（細胞１つ当たり約５００，０００の受容体、薄い〜中程度の完全な膜染色、ＨＥＲ−２を過剰発現する細胞＞１０％）、および３＋（細胞１つ当たり約２，０００，０００の受容体、強い完全な膜染色、ＨＥＲ−２を過剰発現する細胞＞１０％）。細胞質発現の存在は無視される。

【0175】

ＦＩＳＨは、ＤＮＡプローブを用いてＨＥＲ２遺伝子増幅を検出し、ＩＨＣよりも特異的かつ高感度である（Ｏｗｅｎｓら、２００４、Ｃｌｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．５：６３〜６９；Ｐｒｅｓｓら、２００５、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１１：６５９８〜６６０７；Ｖｏｇｅｌら、２００２、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０（３）：７１９〜７２６）。ＦＩＳＨは、第１７染色体セントロメア１つ当たりのＨＥＲ２遺伝子コピーの数についての定量的結果を提供する。結果は、ＨＥＲ２シグナル対第１７染色体セントロメアシグナルの数の比として報告される。１．８未満の比は、正常範囲内とみなされる。１．８〜２．０の比は曖昧であり、さらなる試験を必要とする。２．０よりも大きい比は、ＨＥＲ２遺伝子配列の増幅と一致する。

【0176】

ＦＩＳＨを使用したＨＥＲ２検出のための４つのＦＤＡ承認された市販のキットが入手可能である：ＨＥＲ２ ＦＩＳＨ Ｐｈａｒｍ Ｄｘ（商標）キット（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａ／Ｓによる）；Ｐａｔｈｖｙｓｉｏｎ ＨＥＲ２ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｋｉｔ（Ａｂｂｏｔｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｃ．による）；Ｉｎｆｏｒｍ ＨＥＲ２／ＮＥＵおよびＩｎｆｏｒｍ ＨＥＲ２ Ｄｕａｌ ＩＳＨ ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（共にＶｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．による）。

【0177】

ＨＥＲ２遺伝子増幅を評価するための別の方法は、ＣＩＳＨである。ＣＩＳＨは、標準的な明視野顕微鏡下で可視化される従来のペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ反応を利用すること以外、ＦＩＳＨと非常に類似している。ＣＩＳＨを使用したＨＥＲ２検出のための２つのＦＤＡ承認された市販のキットが入手可能である：ＨＥＲ２ ＣＩＳＨ ＰｈａｒｍＤｘ Ｋｉｔ（Ｄａｋｏ Ｄｅｎｍａｒｋ Ａ／Ｓによる）およびＳｐｏｔ−Ｌｉｇｈｔ ＨＥＲ２ ＣＩＳＨ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．による）。

【0178】

ＦＩＳＨまたはＣＩＳＨによって検出される遺伝子増幅およびＩＨＣによるタンパク質発現は共に、ＨＥＲ２状態を評価するための最初の試験として一般に使用されている。これら２つの方法間には良好な相関が存在する（Ｊａｃｏｂｓら、１９９９、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １７（７）：１９７４〜８２）。しかし、腫瘍が曖昧としてスコアされる場合（即ち、ＩＨＣ ２＋、または１．８〜２．２のＦＩＳＨ／ＣＩＳＨ比、または核１つ当たり４〜６シグナルの平均ＨＥＲ２遺伝子コピー数）、共通のアプローチは、代替的な方法を用いて腫瘍を試験することである（Ｗｏｌｆｆら、２００７、Ｊ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２５：１１８〜４５）。

【0179】

従って、ＨＥＲ２発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定される３＋のレベルおよび／または≧２．０の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）増幅比で、腫瘍において高いとみなされる。ＨＥＲ２発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定される２＋のレベルおよび／または＜２．０の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）増幅比で、腫瘍において中程度とみなされる。ＨＥＲ２発現は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって決定される１＋のレベルおよび／または＜２．０の蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）増幅比で、腫瘍において低いとみなされる。

【0180】

一実施形態では、ＨＥＲ２レベルは、ＩＨＣによって決定される。より具体的な実施形態では、ＩＨＣは、Ｄａｋｏ Ｈｅｒｃｐｔｅｓｔ（商標）アッセイを使用して実施される。

【0181】

別の実施形態では、ＨＥＲ２レベルは、ＦＩＳＨによって決定される。より具体的な実施形態では、ＦＩＳＨは、Ｄａｋｏ ＨＥＲ２ ＦＩＳＨ Ｐｈａｒｍ Ｄｘ（商標）アッセイを使用して実施される。

【0182】

代表的な腫瘍サンプルには、腫瘍細胞を含む任意の生物学的または臨床的サンプル、例えば、組織サンプル、生検、血液サンプル、血漿サンプル、唾液サンプル、尿サンプルなどが含まれる。

【0183】

ＶＩ．製剤
本発明は、本明細書に開示される部位特異的ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲートのいずれかと薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。さらに、組成物は、本明細書に開示される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣのうち１つよりも多くを含み得る。

【0184】

本発明において使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２１版、２００５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）をさらに含み得る。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、それには、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストランを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ得る。「薬学的に許容できる塩」とは、本明細書で使用する場合、分子または高分子の薬学的に許容できる有機または無機塩を指す。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書にさらに記載される。

【0185】

１つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤を含む製剤が含まれるがこれらに限定されない、１つまたは複数の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの種々の製剤が、投与のために使用され得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当該分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を促進する比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは堅牢性を与え得、または希釈剤として作用し得る。適切な賦形剤には、安定化剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変動させるための塩、カプセル化剤、バッファーおよび皮膚浸透増強剤が含まれるがこれらに限定されない。非経口および経口（nonparenteral）薬物送達のための賦形剤ならびに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２０版 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に示されている。

【0186】

本発明の一部の態様では、これらの薬剤は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化される。従って、これらの薬剤は、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などと組み合わされ得る。特定の投薬レジメン、即ち、用量、タイミングおよび反復は、特定の個体およびその個体の病歴に依存する。

【0187】

本発明に従って使用される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの治療的製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有するＡＤＣを、任意選択による薬学的に許容できる担体、賦形剤または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２１版 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５）と混合することによって、貯蔵のために調製される。許容できる担体、賦形剤または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントにとって非毒性であり、それには、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸；塩、例えば、塩化ナトリウム；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む、単糖、二糖および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール；塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれ得る。

【0188】

部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを含むリポソームは、例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５、ＰＮＡＳ ８２：３６８８〜９２；Ｈｗａｎｇら、１９０８、ＰＮＡＳ ７７：４０３０〜４；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号に記載される、当該分野で公知の方法によって調製され得る。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために、規定された孔サイズのフィルターを介して押し出される。

【0189】

活性成分はまた、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中、またはマクロエマルジョン中に捕捉され得る。かかる技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第２１版 Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２００５に開示されている。

【0190】

徐放性調製物が調製され得る。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、イソ酪酸酢酸スクロース、ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。

【0191】

ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過メンブレンを介した濾過によって容易に達成される。治療的な部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣ組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に配置される。

【0192】

適切な表面活性剤には、特に、非イオン性薬剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）が含まれる。表面活性剤を含む組成物は、０．０５％と５％との間の表面活性剤を簡便には含み、０．１％と２．５％との間であり得る。必要に応じて、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルが添加され得ることが理解される。

【0193】

適切なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、ＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）、ＬＩＰＯＳＹＮ（商標）、ＩＮＦＯＮＵＴＲＯＬ（商標）、ＬＩＰＯＦＵＮＤＩＮ（商標）およびＬＩＰＩＰＨＹＳＡＮ（商標）を使用して調製され得る。活性成分は、予め混合されたエマルジョン組成物中に溶解され得る、または代替的に、油（例えば、ダイズ油、ベニバナ油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油またはアーモンド油）、ならびにリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質またはダイズレシチン）および水との混合の際に形成されるエマルジョン中に溶解され得る。エマルジョンの浸透圧を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースが添加され得ることが理解される。適切なエマルジョンは、典型的には、最大で２０％の油、例えば、５％と２０％との間の油を含む。脂肪エマルジョンは、０．１μｍと１．０μｍとの間、特に、０．１μｍと０．５μｍとの間の脂肪滴を含み得、５．５〜８．０の範囲のｐＨを有し得る。エマルジョン組成物は、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣをＩＮＴＲＡＬＩＰＩＤ（商標）またはその構成要素（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されたものであり得る。

【0194】

本発明は、本方法における使用のためのキットもまた提供する。本発明のキットは、本明細書に記載される１つまたは複数の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを含む１つまたは複数の容器と、本明細書に記載される本発明の方法のいずれかに従う使用についての指示とを含む。一般に、これらの指示は、上記治療的処置のための部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの投与の説明を含む。

【0195】

本明細書に記載される部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの使用に関する指示は、一般に、意図した処置のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、多用量パッケージ）またはサブ単位用量であり得る。本発明のキット中に提供される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例えば、キット中に含まれる紙シート）上の書面による指示であるが、機械可読指示（例えば、磁気または光学記憶ディスク上に保持される指示）もまた許容できる。

【0196】

本発明のキットは、適切な包装中にある。適切な包装には、バイアル、ビン、ジャー、可撓性包装（例えば、密封Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが含まれるがこれらに限定されない。特定のデバイス、例えば、ミニポンプなどの注入デバイスと組み合わせた使用のためのパッケージもまた企図される。キットは、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器もまた、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣである。容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。

【0197】

キットは、さらなる構成要素、例えば、バッファーおよび説明情報を、任意選択により提供し得る。通常、キットは、容器、および容器上のまたは容器と関連するラベルまたは添付文書（複数可）を含む。

【0198】

ＶＩＩ．用量および投与
ｉｎ ｖｉｖｏ適用のために、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、有効投薬量で提供または投与される。語句「有効投薬量」または「有効量」とは、本明細書で使用する場合、直接的または間接的のいずれかで任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の治療結果を達成するために必要な薬物、化合物または医薬組成物の量を指す。例えば、がん保有対象に投与する場合、有効投薬量は、がん細胞細胞溶解、がん細胞増殖の阻害、がん細胞アポトーシスの誘導、がん細胞抗原の低減、遅延された腫瘍成長および／または転移の阻害を含む抗がん活性を惹起するのに十分な量を含む。腫瘍の縮小は、有効性についての臨床的な代用マーカーとして十分に受容されている。有効性についての別の十分に受容されたマーカーは、無増悪生存期間である。

【0199】

有効投薬量は、１回または複数の投与で投与され得る。薬物、化合物または医薬組成物の有効投薬量は、別の薬物、化合物または医薬組成物と併せて達成されてもされなくてもよい。従って、有効投薬量は、１つまたは複数の治療剤を投与するという観点から検討され得、単一の薬剤は、１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて所望の結果が達成され得るまたは達成される場合、有効量で与えられているとみなされ得る。

【0200】

部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、任意の適切な経路を介して個体に投与され得る。本明細書に記載される例は、利用可能な技術の限定ではなく例示であることを意図することが、当業者に理解されるはずである。従って、本発明の一部の態様では、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、例えば、静脈内投与、例えば、ボーラスとして、または一定期間にわたる継続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液包内（intrasynovial）、送気（insufflation）を介して、くも膜下腔内、経口、吸入もしくは外用経路によって、公知の方法に従って個体に投与される。投与は、全身性、例えば、静脈内投与、または限局性であり得る。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む、液体製剤のための市販のネブライザーが、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧され得、凍結乾燥粉末は、復元後に噴霧され得る。代替的に、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、フルオロカーボン製剤および定量噴霧式吸入器を使用してエアロゾル化され得、または凍結乾燥および製粉された粉末として吸入され得る。

【0201】

本発明の一部の態様では、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、部位特異的または標的化局所送達技術を介して投与される。部位特異的または標的化局所送達技術の例には、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの種々の移植可能なデポー供給源、または局所送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテルもしくはニードルカテーテル、合成グラフト、外膜ラップ（adventitial wrap）、シャントおよびステントもしくは他の移植可能なデバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用が含まれる。例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照のこと。

【0202】

本発明の目的のために、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの適切な投薬量は、使用される特定のＡＤＣ（またはその組成物）、処置される症状の型および重症度、治療目的で薬剤が投与されるかどうか、以前の治療、患者の臨床歴および薬剤に対する応答、投与された薬剤に対する患者のクリアランス速度、ならびに担当医の裁量に依存する。臨床医は、所望の結果を達成する投薬量に達するまでおよびそれを超えて、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを投与してもよい。用量および／または頻度は、処置の過程にわたって変動し得るが、一定であってもよい。経験的考慮事項、例えば半減期は、一般に、投薬量の決定に寄与する。例えば、ヒト免疫系と適合性の抗体、例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体は、抗体の半減期を延長させるため、および抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防止するために使用され得る。投与の頻度は、治療の過程にわたって決定および調整され得、症状の処置および／または抑制および／または改善、例えば、腫瘍成長の阻害または遅延などに一般に基づくが、必ず基づくわけではない。代替的に、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの継続徐放製剤が適切であり得る。徐放を達成するための種々の製剤およびデバイスが当該分野で公知である。

【0203】

一般に、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの投与のために、初回候補投薬量は、約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本発明の目的のために、典型的な一日投薬量は、約３μｇ／ｋｇから３０μｇ／ｋｇから３００μｇ／ｋｇから３ｍｇ／ｋｇまで、３０ｍｇ／ｋｇまで、１００ｍｇ／ｋｇまでまたはそれよりも多くまでのいずれかの範囲であり得る。例えば、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇおよび約２５ｍｇ／ｋｇの投薬量が使用され得る。数日間またはより長きにわたる反復投与のために、障害に依存して、処置は、症状の所望の抑制が生じるまで、または十分な治療的レベルに達するまで、例えば、腫瘍成長／進行またはがん細胞の転移を阻害または遅延させるまで、持続される。例示的な投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初回用量と、その後の約１ｍｇ／ｋｇの部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣの１週間に１回の維持用量、またはその後の２週間に１回の約１ｍｇ／ｋｇの維持用量とを投与することを含む。他の例示的な投薬レジメンは、漸増用量（例えば、１ｍｇ／ｋｇの初回用量、および１週間またはより長い期間に１回の１つまたは複数のより高い用量までの漸進的増加）を投与することを含む。他の投薬量レジメンもまた、実施者が達成したいと望む薬物動態学的減衰のパターンに依存して、有用であり得る。例えば、本発明の一部の態様では、１週間に１回〜４回の投薬が企図される。他の態様では、１カ月に１回または２カ月に１回、または３カ月に１回の投薬、ならびに１週間に１回、２週間に１回および３週間に１回の投薬が企図される。この治療の進展は、従来の技術およびアッセイによって容易にモニターされ得る。投薬レジメン（使用される特定の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣを含む）は、経時的に変動し得る。

【0204】

ＶＩＩＩ．併用療法
本発明の一部の態様では、本明細書に記載される方法は、さらなる形態の治療で対象を処置するステップをさらに含む。一部の態様では、さらなる形態の治療は、化学療法、放射線照射、手術、ホルモン治療、および／またはさらなる免疫療法が含まれるがこれらに限定されないさらなる抗がん治療である。

【0205】

開示された部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、初回処置として、または従来の治療に対して応答性でないがんの処置のために、投与され得る。さらに、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、それによって付加的もしくは強化された治療効果を惹起するため、および／または一部の抗がん剤の細胞傷害性を低減させるために、他の治療（例えば、外科的切除、放射線照射、さらなる抗がん薬物など）と組み合わせて使用され得る。本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、さらなる薬剤と共投与もしくは共製剤化され得る、または任意の順序でのさらなる薬剤との連続投与のために製剤化され得る。

【0206】

本発明の部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣは、治療的抗体、ＡＤＣ、免疫調節性剤、細胞傷害剤および細胞分裂停止剤が含まれるがこれらに限定されない他の治療剤と組み合わせて使用され得る。細胞傷害効果とは、標的細胞（即ち、腫瘍細胞）の枯渇、排除および／または死滅を指す。細胞傷害剤とは、細胞に対して細胞傷害および／または細胞分裂停止効果を有する薬剤を指す。細胞分裂停止効果とは、細胞増殖の阻害を指す。細胞分裂停止剤とは、細胞に対して細胞分裂停止効果を有し、それによって、細胞（即ち、腫瘍細胞）の特定のサブセットの成長および／または拡大増殖を阻害する薬剤を指す。免疫調節性剤とは、サイトカインおよび／もしくは抗体の産生ならびに／またはＴ細胞機能をモジュレートすることを介して免疫応答を刺激し、それによって、直接的、または別の薬剤をより効果的にすることによって間接的のいずれかで、細胞（即ち、腫瘍細胞）のサブセットの成長を阻害するまたは低減させる薬剤を指す。

【0207】

併用療法のために、部位特異的ＨＥＲ２ ＡＤＣおよび／または１つもしくは複数のさらなる治療剤は、意図した治療の実施に適切な任意の時間枠内で投与される。従って、単一の薬剤は、実質的に同時に（即ち、単一の製剤として、または数分もしくは数時間以内）、または任意の順序で連続的に投与され得る。例えば、単一薬剤処置は、互いに約１年以内、例えば、約１０、８、６、４もしくは２カ月以内、または４、３、２もしくは１週間（複数可）以内、または約５、４、３、２もしくは１日（複数可）以内に投与され得る。

【0208】

開示された併用療法は、相乗的治療効果、即ち、それらの個々の効果もしくは治療転帰の合計よりも大きい効果を惹起し得る。例えば、相乗的治療効果は、単一の薬剤によって惹起される治療効果、または所与の組み合わせの単一の薬剤によって惹起される治療効果の合計よりも、少なくとも約２倍大きい、または少なくとも約５倍大きい、もしくは少なくとも約１０倍大きい、もしくは少なくとも約２０倍大きい、もしくは少なくとも約５０倍大きい、もしくは少なくとも約１００倍大きい効果であり得る。相乗的治療効果は、単一の薬剤によって惹起される治療効果、または所与の組み合わせの単一の薬剤によって惹起される治療効果の合計と比較して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、もしくは少なくとも３０％、もしくは少なくとも４０％、もしくは少なくとも５０％、もしくは少なくとも６０％、もしくは少なくとも７０％、もしくは少なくとも８０％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも１００％もしくはそれより大きい、治療効果における増加としても観察され得る。相乗効果はまた、組み合わせて使用される場合のそれらの治療剤の低減された投薬を可能にする効果である。

【実施例】

【0209】

以下の実施例は、例示的目的に限って提供され、本発明の範囲を決して制限しないことが意図される。実際に、本明細書に示され、および記載される実施形態に加えて本発明の様々な修飾は、以下の説明から当業者には明らかであり、それらは添付の特許請求の範囲に含まれる。

【0210】

（実施例１）
部位特異的コンジュゲーションのためのトラスツズマブ誘導抗体の調製
Ａ．システインを介したコンジュゲーション
システイン残基を通しての部位特異的コンジュゲーションのためのトラスツズマブ誘導体を調製する方法は、一般的にＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０９３８０９号（全体が本明細書に組み込まれている）に記載されるように実施した。軽鎖（Ｋａｂａｔ番号付けスキームを使用して１８３位）または重鎖（Ｋａｂａｔ番号付けスキームのＥＵインデックスを使用して２９０、３３４、３９２、および／または４４３位）のいずれかの１つまたは複数の残基を、部位指定変異誘発によってシステイン（Ｃ）残基に変更した。

【0211】

Ｂ．トランスグルタミナーゼを介したコンジュゲーション
グルタミン残基を通しての部位特異的コンジュゲーションのためのトラスツズマブ誘導体を調製する方法は、一般的にＰＣＴ出願国際公開第２０１２／０５９８８２号全体が本明細書に組み込まれている）に記載されるように実施した。トラスツズマブを、３つの異なる方法で、コンジュゲーションのために使用されるグルタミン残基を発現するように操作した。

【0212】

第一の方法に関して、グルタミン残基を含む８アミノ酸残基のタグ（ＬＣＱ０５）を軽鎖（即ち、配列番号８１）のＣ末端に結合させた。

【0213】

第二の方法に関して、重鎖上の残基（Ｋａｂａｔ番号付けスキームのＥＵインデックスを使用して２９７位）を、部位指定変異誘発によって、アスパラギン（Ｎ）からグルタミン（Ｑ）残基に変更した。

【0214】

第三の方法に関して、重鎖上の残基（Ｋａｂａｔ番号付けシステムのＥＵインデックスを使用して２９７位）を、アスパラギン（Ｎ）からアラニン（Ａ）残基に変更した。これによって、２９７位での脱グリコシル化が起こり、２９５位でアクセス可能な／反応性の内因性グルタミンが得られる。

【0215】

加えて、トラスツズマブ誘導体のいくつかは、コンジュゲーションのために使用されない変更を有する。重鎖の２２２位（Ｋａｂａｔ番号付けスキームのＥＵインデックスを使用する）での残基をリジン（Ｋ）からアルギニン（Ｒ）残基に変更した。Ｋ２２２Ｒ置換によって、より均質な抗体およびペイロードコンジュゲート、抗体とペイロードとの間のより良好な分子間架橋、および／または抗体軽鎖のＣ末端でのグルタミンタグとの鎖間架橋の有意な減少が得られることが見出された。

【0216】

（実施例２）
トラスツズマブ誘導抗体を発現する安定にトランスフェクトされた細胞の産生
Ａ．システイン変異体
一重および二重システイン操作トラスツズマブ誘導抗体バリアントが、細胞において安定に発現され、大規模に産生され得ることを決定するために、ＣＨＯ細胞に、９個のトラスツズマブ誘導抗体バリアント（Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ）、Ｔ（Ｋ３９２Ｃ）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）およびＴ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ））をコードするＤＮＡをトランスフェクトして、安定な高い産生プールを、当技術分野で周知の標準的な手順を使用して単離した。コンジュゲーション試験のためにＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）を産生するために、ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）に、標準的な方法を使用してこの二重システイン操作抗体バリアントをコードする重鎖および軽鎖ＤＮＡを一過性に同時トランスフェクトした。２カラムプロセス、即ち、プロテインＡ親和性による捕捉の後にＴＭＡＥカラム、または３カラムプロセス、即ちプロテインＡ親和性による捕捉の後にＴＭＡＥカラム、次いでＣＨＡ−ＴＩカラムを使用して、濃縮ＣＨＯプール出発材料からこれらのトラスツズマブバリアントを単離した。これらの精製プロセスを使用すると、全てのシステイン操作トラスツズマブ誘導抗体バリアント調製物は、分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって決定した場合に＞９７％の目的のピーク（ＰＯＩ）を含んだ（表５）。表５に示すこれらの結果は、１０個全てのトラスツズマブ誘導システインバリアントに関して、プロテインＡ樹脂からの溶出後に許容可能なレベルの高分子量（ＨＭＷ）凝集種が検出されたこと、およびこの望ましくないＨＭＷ種を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去することができることを証明する。加えて、データは、ヒトＩｇＧ１定常領域におけるプロテインＡ結合部位が、システイン操作残基の存在によって変更されないことを証明した。

【0217】

【表5】

【0218】

（実施例３）
トラスツズマブ誘導抗体の完全性
トラスツズマブ野生型抗体と比較して重要な生物物理的特性を評価するため、およびバリアントが標準的な抗体製造プラットフォームプロセスに従うことを確実にするために、システイン操作およびトランスグルタミナーゼバリアントの分子評価を実施した。

【0219】

Ａ．システイン変異体
安定なＣＨＯ発現を介して産生された精製システイン操作抗体バリアント調製物の完全性を決定するために、非還元キャピラリーゲル電気泳動（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してピークのパーセント純度を計算した。結果から、システイン操作抗体バリアントＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）およびＴ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）が、トラスツズマブ野生型抗体と類似のように、断片および高分子量種（ＨＭＭＳ）の両方を低レベルで含むことが示される。これに対し、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）は、評価した他の二重操作システインバリアントと比較して高レベルの断片化抗体ピークを含んだ（表６）。これらの結果は、操作されるシステインの特定の組合せが、部位特異的コンジュゲーションに関して意図される抗体の完全性に影響を及ぼし得ることを示唆している。

【0220】

【表6】

【0221】

（実施例４）
ペイロード薬物化合物の生成
オーリスタチン薬物化合物０１０１、０１３１、８２６１、６１２１、８２５４および６７８０を、ＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０７２８１３号（全体が本明細書に組み込まれている）に記載の方法に従って作製した。公開された出願において、オーリスタチン化合物は、表７に示される番号付けシステムによって示される。

【0222】

【表7】

【0223】

ＰＣＴ出願国際公開第２０１３／０７２８１３号に従って、薬物化合物０１０１を以下の手順に従って作製した。

【0224】

【化1】

【0225】

ステップ１．Ｎ−［（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシ）カルボニル］−２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５３）の合成。一般手順Ｄに従って、ジクロロメタン（２０ｍＬ、０．１Ｍ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍＬ）中の＃３２（２．０５ｇ、２．８３ｍｍｏｌ、１当量）、アミン＃１９（２．５ｇ、３．４ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＨＡＴＵ（１．２９ｇ、３．３８ｍｍｏｌ、１．２当量）、ならびにトリエチルアミン（１．５７ｍＬ、１１．３ｍｍｏｌ、４当量）から、粗製の所望の材料を合成し、これをシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ヘプタン中の０％〜５５％アセトン）によって精製し、＃５３（２．４２ｇ、７４％）を固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ９６５．７［Ｍ＋Ｈ^＋］、９８７．６［Ｍ＋Ｎａ^＋］、保持時間＝１．０４分；ＨＰＬＣ（プロトコールＡ）：ｍ／ｚ９６５．４［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝１１．３４４分（純度＞９７％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）、回転異性体の混合物と思われる、特徴的シグナル：δ 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.79 (d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.67-7.74 (m, 2H),
[7.63 (d, J=3.2 Hz)および7.65 (d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39
(ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz)および5.52 (ddd, J=11.7, 8.8,
4.2 Hz), 計1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz)および4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), 計1H], 3.13, 3.17,
3.18および3.24 (4 s, 計6H), 2.90および3.00 (2 br s, 計3H), 1.31および1.36 (2 br s, 計6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.09 (d, J=6.7 Hz), 計3H].

【0226】

ステップ２．２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド（＃５４または０１０１）の合成。一般手順Ａに従って、ジクロロメタン（１０ｍＬ、０．０７Ｍ）中の＃５３（７０１ｍｇ、０．７２６ｍｍｏｌ）から、粗製の所望の材料を合成し、これをシリカゲルクロマトグラフィー（勾配：ジクロロメタン中の０％〜１０％メタノール）によって精製した。残基をジエチルエーテルおよびヘプタンで希釈し、減圧下で濃縮して＃５４（または０１０１）（４０６ｍｇ、７５％）を白色固体として得た。ＬＣ−ＭＳ：ｍ／ｚ７４３．６［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝０．７０分；ＨＰＬＣ（プロトコールＡ）：ｍ／ｚ７４３．４［Ｍ＋Ｈ^＋］、保持時間＝６．９０３分（純度＞９７％）；^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ_６）、回転異性体の混合物と思われる、特徴的シグナル：δ [8.64 (br d, J=8.5 Hz)および8.86 (br d, J=8.7 Hz), 計1H], [8.04 (br d,
J=9.3 Hz)および8.08 (br d, J=9.3 Hz), 計1H], [7.77 (d, J=3.3 Hz)および7.80 (d, J=3.2
Hz), 計1H], [7.63 (d, J=3.3 Hz)および7.66 (d, J=3.2 Hz), 計1H], 7.13-7.31 (m, 5H),
[5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz)および5.53 (ddd, J=12, 9, 4
Hz), 計1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz)および4.60 (dd, J=9, 7 Hz), 計1H], 3.16, 3.20, 3.21および3.25 (4 s, 計6H), 2.93および3.02 (2 br s, 計3H), 1.21 (s, 3H), 1.13および1.13 (2 s, 計3H), [1.05 (d, J=6.7 Hz)および1.10 (d, J=6.7 Hz), 計3H], 0.73-0.80 (m, 3H).

【0227】

薬物化合物ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦは、ＰＣＴ公開国際公開第２０１３／０７２８１３号に開示の方法に従って、組織内で作製した。

【0228】

薬物化合物ＤＭ１は、米国特許第５，２０８，０２０号に概要される手順を介して、購入したメイタンシノールから組織内で作製した。

【0229】

（実施例５）
トラスツズマブ誘導抗体のバイオコンジュゲーション
本発明のトラスツズマブ誘導抗体を、リンカーを介してペイロードにコンジュゲートし、ＡＤＣを生成した。使用したコンジュゲーション法は、部位特異的（即ち、特定のシステイン残基または特定のグルタミン残基を介して）であるか、または従来のコンジュゲーションのいずれかであった。

【0230】

Ａ．システイン部位特異的
表８のＡＤＣを、以下に記載のシステイン部位特異的方法を介してコンジュゲートした。

【0231】

【表8】

【0232】

５００ｍＭトリス(２-カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）溶液（５０〜１００モル当量）を、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で最終抗体濃度が５〜１５ｍｇ／ｍＬとなるように、抗体（５ｍｇ）に添加した。反応を３７℃で２．５時間静置した後、抗体を、ゲル濾過カラム（ＰＤ−１０脱塩カラム、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに緩衝液交換した。５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中の得られた抗体（５〜１０ｍｇ／ｍＬ）を、１：１ ＰＢＳ／ＥｔＯＨ（ＤＨＡの最終濃度＝１ｍＭ〜４ｍＭ）中で新たに調製した５０ｍＭ ＤＨＡ溶液によって処置し、４℃で一晩静置した。

【0233】

抗体／ＤＨＡ混合物を、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（平衡緩衝液のｐＨを、リン酸を使用して約７．０に調節した）に緩衝液交換し、分子量５０ｋＤカットオフの遠心濃縮装置を使用して濃縮した。５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（抗体濃度約５〜１０ｍｇ／ｍＬ）中の得られた抗体を、ＤＭＡ中の１０ｍＭマレイミドペイロードの５〜７モル当量によって処置した。１．５〜２．５時間静置した後、材料を緩衝液交換した（ＰＤ−１０）。ＳＥＣによる精製を実施して（必要に応じて）、いかなる凝集材料および残っている遊離のペイロードを除去した。

【0234】

Ｂ．トランスグルタミナーゼ部位特異的
表９のＡＤＣを、以下に記載のトランスグルタミナーゼ部位特異的方法を介してコンジュゲートした。

【0235】

【表9】

【0236】

トランスアミド化反応において、抗体上のグルタミンはアシルドナーとして作用し、アミン含有化合物はアシルアクセプター（アミンドナー）として作用した。濃度３３μＭの精製ＨＥＲ２抗体を、特記しない限り、０．３１ｍＭ還元グルタチオンと共に１５０ｍＭ塩化ナトリウムおよびｐＨ範囲７．５〜８のＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝液中で２重量体積％ストレプトベルチシリウム・モバラエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍｏｂａｒａｅｎｓｅ）トランスグルタミナーゼ（ＡＣＴＩＶＡ（商標）、味の素、日本）の存在下、１０〜２５Ｍ過剰量のアシルアクセプター、３３〜８３．３μＭの範囲のＡｃＬｙｓｖｃ−０１０１と共にインキュベートした。反応条件を個々のアシルドナーに関して調整し、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）は、還元グルタチオンを含まない１０Ｍ過剰量のアシルアクセプターｐＨ８．０を使用し、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）およびＴ（Ｎ２９７Ｑ）は、２０Ｍ過剰量のアシルアクセプターｐＨ７．５を使用し、ならびにＴ（Ｎ２９７Ａ＋Ｋ２２２Ｒ＋ＬＣＱ０５）は、２５Ｍ過剰量のアシルアクセプターｐＨ７．５を使用した。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、抗体を、市販のアフィニティクロマトグラフィーおよびＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製疎水性相互作用クロマトグラフィーなどの、当業者に公知の標準的なクロマトグラフィー方法を使用して、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅO樹脂または高性能ブチルセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）において精製した。

【0237】

Ｃ．従来のコンジュゲーション
表１０および１１のＡＤＣを、以下に記載の従来のコンジュゲーション方法を介してコンジュゲートした。

【0238】

【表10】

【0239】

【表11】

【0240】

抗体をダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）中で透析した。透析した抗体を５ｍＭ ２，２’，２’’，２’’’−（エタン−１，２−ジイルジニトリロ）四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ７を含むＰＢＳによって１５ｍｇ／ｍＬに希釈した。得られた抗体を、２〜３当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ、蒸留水中で５ｍＭ）によって処置し、３７℃で１〜２時間静置した。室温に冷却後、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）を添加して１０体積％の総有機相を得た。混合物を、ＤＭＡ中の１０ｍＭ保存溶液として８〜１０当量の適切なリンカーペイロードによって処置した。反応を室温で１〜２時間静置した後、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５緩衝液交換カラムを使用して製造元の指示に従って、ＤＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換した。

【0241】

閉環状態で残すべき材料（表１０のＡＤＣ）を、ＧＥ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを備えるＧＥ ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステムおよび溶出液としてのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。最終試料を約５ｍｇ／ｍＬタンパク質となるように濃縮し、濾過滅菌して、以下に概要する質量分析条件を使用して担持をチェックした。

【0242】

スクシンイミド環加水分解のために使用した材料（表１１のＡＤＣ）を、限外濾過装置（５０ｋＤ分子量カットオフ）を使用して５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．２）に直ちに緩衝液交換した。得られた溶液を４５℃に４８時間加熱した。得られた溶液を冷却し、ＰＢＳに緩衝液交換し、いかなる凝集材料も除去するためにＳＥＣ（以下に記載）によって精製した。最終試料を約５ｍｇ／ｍＬタンパク質となるように濃縮し、濾過滅菌して、以下に概要される質量分析条件を使用して担持をチェックした。

【0243】

Ｄ．Ｔ−ＤＭ１コンジュゲーション
トラスツズマブ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ｔ−ＤＭ１）は、トラスツズマブ−エムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））と構造的に類似である。Ｔ−ＤＭ１は、二機能性リンカーであるスルホスクシンイミジル ４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を通してＤＭ１メンタンシノイドに共有結合したトラスツズマブ抗体で構成される。スルホ−ＳＭＣＣを最初に、５０ｍＭリン酸カリウム、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８中、１０：１の反応化学量論で抗体上の遊離のアミンに２５℃で１時間コンジュゲートし、次に非結合リンカーをコンジュゲート抗体から脱塩する。次に、この抗体−ＭＣＣ中間体を、５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８中、１０：１の反応化学量論でＭＣＣリンカー抗体上の遊離のマレイミド末端でＤＭ１スルフィドに２５℃で一晩コンジュゲートする。次に、残っている未反応のマレイミドを、Ｌ−システインでキャッピングし、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを通してＡＤＣを分画し、非モノマー種を除去する（Ｃｈａｒｉら、１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２：１２７〜３１）。

【0244】

（実施例６）
ＡＤＣの精製
ＡＤＣを以下に記載のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して一般的に精製および特徴付けした。意図されるコンジュゲーションの部位への薬物の担持を、以下により詳しく記載するように、質量分析（ＭＳ）、逆相ＨＰＬＣ、および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を含む多様な方法を使用して決定した。これら３つの分析方法の組合せは、抗体上のペイロードの担持を確認および定量する多様な方法を提供し、それによってそれぞれのコンジュゲートに関してＤＡＲの正確な決定を提供する。

【0245】

Ａ．分取用ＳＥＣ
タンパク質凝集体を除去するため、および反応混合物に残っている微量のペイロード−リンカーを除去するために、Ａｋｔａ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ＦＰＬＣシステムにおいてＷａｔｅｒｓ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １０／３００ＧＬカラムを使用するＳＥＣクロマトグラフィーを使用して、ＡＤＣを一般的に精製した。場合により、ＡＤＣは、ＳＥＣ精製前に凝集体および低分子を含まず、したがって分取用ＳＥＣに供しなかった。使用した溶出液は、流速１ｍＬ／分のＰＢＳであった。これらの条件下で、凝集材料（室温で約１０分で溶出）は、非凝集材料（室温で約１５分で溶出）から容易に分離された。疎水性ペイロード−リンカーの組合せによりしばしば、ＳＥＣピークの「右シフト」が起こった。いかなる特定の理論にも拘束されたくはないが、このＳＥＣピークシフトは、リンカー−ペイロードと静止相との疎水性相互作用によるものであり得る。いくつかの例において、この右シフトにより、コンジュゲートタンパク質を非コンジュゲートタンパク質から部分的に分離することができた。

【0246】

Ｂ．分析的ＳＥＣ
分析的ＳＥＣを、溶出液としてＰＢＳを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣで実施し、ＡＤＣの純度およびモノマー状態を評価した。溶出液を、２２０および２８０ｎｍでモニターした。カラムがＴＳＫＧｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラム（７．８×３００ｍｍ、カタログ番号Ｒ８７４８０３Ｐ）である場合、使用した移動相は、流速０．９ｍＬ／分のＰＢＳで３０分間であった。カラムがＢｉｏｓｅｐＳＥＣ３０００カラム（７．８×３００ｍｍ）である場合、使用した移動相は、流速１．０ｍＬ／分のＰＢＳで２５分間であった。

【0247】

（実施例７）
ＡＤＣの特徴付け
Ａ．質量分析（ＭＳ）
試料およそ２０μｌ（ＰＢＳ中でおよそ１ｍｇ／ｍＬ ＡＤＣ）を２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）２０μｌと混合することによって、ＬＣＭＳ分析のための試料を調製した。混合物を室温で５分間静置した後、試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ３００ＳＢ−Ｃ８（２．１×７５ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１０ ＨＰＬＣシステムに注入した。システムの温度を６０℃に設定した。２０％〜４５％アセトニトリル水溶液（０．１％ギ酸修飾剤を含む）の５分間の勾配を利用した。溶出液を、ＵＶ（２２０ｎｍ）およびＷａｔｅｒｓ Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＺＱ質量分析計（ＥＳＩイオン化、コーン電圧：２０Ｖ、イオン源温度：１２０℃；脱溶媒和温度：３５０℃）によってモニターした。多重荷電種を含む粗製スペクトルを、ＭａｓｓＬｙｎｘ４．１ソフトウェアパッケージ内のＭａｘＥｎｔ１を製造元の指示に従って使用して逆畳み込みした。

【0248】

Ｂ．抗体あたりの担持のＭＳ定量
ＡＤＣを作製するための抗体へのペイロードの総担持を、薬物抗体比またはＤＡＲと呼ぶ。作製したＡＤＣのそれぞれに関して、ＤＡＲを計算した（表１２）。

【0249】

完全な溶出ウィンドウ（通常、５分）のスペクトルを、単一の合計スペクトル（即ち、試料全体のＭＳを表す質量スペクトル）にまとめた。ＡＤＣ試料のＭＳ結果を、同一の非担持対照抗体の対応するＭＳと直接比較した。これによって、担持／非担持重鎖（ＨＣ）ピークおよび担持／非担持軽鎖（ＬＣ）ピークが同定された。様々なピークの比率を使用して、以下の等式（等式１）に基づいて担持を確立することができる。計算は、一般的に有効な仮定であると決定されている、担持および非担持鎖が等しくイオン化するという仮定に基づいている。

【0250】

ＤＡＲを確立するために以下の計算を実施した：
等式１：
担持＝２^＊［ＬＣ１／（ＬＣ１＋ＬＣ０）］＋２^＊［ＨＣ１／（ＨＣ０＋ＨＣ１＋ＨＣ２）］＋４^＊［ＨＣ２／（ＨＣ０＋ＨＣ１＋ＨＣ２）］
式中、表記の変数は以下の相対量である：ＬＣ０＝非担持軽鎖、ＬＣ１＝一重担持軽鎖、ＨＣ０＝非担持重鎖、ＨＣ１＝一重担持重鎖、およびＨＣ２＝二重担持重鎖。当業者は、本発明が、ＬＣ２、ＬＣ３、ＨＣ３、ＨＣ４、ＨＣ５などのより高担持種を包含するためにこの計算の拡大を包含することを認識するであろう。

【0251】

以下の等式２を使用して、非操作システイン残基への担持量を推定する。操作されたＦｃ変異体に関して、軽鎖（ＬＣ）への担持は、定義により非特異的担持であると考えられた。その上、ＬＣのみの担持は、ＨＣ−ＬＣジスルフィド架橋の意図されない還元の結果である（即ち、抗体は「過剰還元」された）と仮定した。大過剰量のマレイミド求電子剤をコンジュゲーション反応に使用したことを考慮して（一般的に、一重変異体に関しておよそ５当量および二重変異体に関して１０当量）、軽鎖へのいかなる非特異的担持も、重鎖（即ち、切断されたＨＣ−ＬＣジスルフィドの他の「半分」）への対応する量の非特異的担持を伴うと仮定した。これらの仮定を考慮に入れて、以下の等式（等式２）を使用してタンパク質への非特異的担持量を推定した。
等式２
非特異的担持＝４^＊［ＬＣ１／（ＬＣ１＋ＬＣ０）］
式中、表記の変数は以下の相対量である：ＬＣ０＝非担持軽鎖、ＬＣ１＝単一担持軽鎖。

【0252】

【表12-1】

【0253】

【表12-2】

【0254】

Ｃ．担持部位を確立するためのＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）によるタンパク質分解
システイン変異体ＡＤＣに関して、抗体への求電子ペイロードのいかなる非特異的担持も、「内部」システイン残基（即ち、典型的に、ＨＣ−ＨＣまたはＨＣ−ＬＣジスルフィド架橋の一部である残基）とも呼ばれる「鎖間」で起こると想定される。Ｆｃドメインにおける操作されたシステインへの求電子剤の担持と、内部システイン残基への担持（そうでなければ典型的にＨＣ−ＨＣまたはＨＣ−ＬＣ間でＳ−Ｓ結合を形成する）とを区別するために、コンジュゲートを、抗体のＦａｂドメインとＦｃドメインの間を切断することが知られているプロテアーゼによって処置した。そのような１つのプロテアーゼは、システインプロテアーゼＩｄｅＳであり、Ｇｅｎｏｖｉｓ社によって「ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）」として販売され、ｖｏｎ Ｐａｗｅｌ−Ｒａｍｍｉｎｇｅｎら、２００２，ＥＭＢＯ Ｊ．２１：１６０７に記載されている。

【0255】

簡単に説明すると、製造元が提案する条件に従って、ＡＤＣをＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）プロテアーゼによって処置し、試料を３７℃で３０分間インキュベートした。試料およそ２０μｌ（ＰＢＳ中でおよそ１ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）２０μｌと混合して、混合物を室温で５分間静置することによって、試料をＬＣＭＳ分析のために調製した。ヒトＩｇＧ１のこの処置によって、全て約２３〜２６ｋＤの範囲のサイズである３つの抗体断片、即ち典型的にＬＣ−ＨＣ鎖間ジスルフィド結合を形成する内部システインを含むＬＣ断片、３つの内部システイン（このうち１つは典型的にＬＣ−ＨＣジスルフィド結合を形成し、他の２つのシステインは抗体のヒンジ領域に見出され、典型的に抗体の２つの重鎖の間にＨＣ−ＨＣジスルフィド結合を形成する）を含むＮ末端ＨＣ断片、および本明細書に開示の構築物において変異によって導入されているもの以外の反応性システインを含まないＣ末端ＨＣ断片、が得られた。試料を上記のようにＭＳによって分析した。ＬＣ、Ｎ末端ＨＣ、およびＣ末端ＨＣの担持を定量するために、既に記載した（上記の）方法と同じ様式で担持の計算を実施した。Ｃ末端ＨＣの担持は、「特異的」担持であると考えられるが、ＬＣおよびＮ末端ＨＣへの担持は、「非特異的」担持であると考えられる。

【0256】

担持の計算を交差チェックするために、ＡＤＣのサブセットを、以下の節により詳しく説明する代替方法（逆相高速液体クロマトグラフィー［ｒｐＨＰＬＣ］に基づくおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー［ＨＩＣ］に基づく方法）を使用して担持に関しても評価した。

【0257】

Ｄ．逆相ＨＰＬＣ分析
試料およそ２０μｌ（ＰＢＳ中でおよそ１ｍｇ／ｍＬ）を２０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）２０μｌと混合することによって、試料を逆相ＨＰＬＣ分析のために調製した。混合物を室温で５分間静置した後、試料を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ３００ＳＢ−Ｃ８（２．１×７５ｍｍ）カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムに注入した。システムの温度を６０℃に設定して、溶出液をＵＶ（２２０ｎｍおよび２８０ｎｍ)によってモニターした。２０％〜４５％のアセトニトリル水溶液（０．１％ＴＦＡ修飾剤を含む）による２０分間の勾配を利用した：Ｔ＝０分、２５％アセトニトリル；Ｔ＝２分、２５％アセトニトリル；Ｔ＝１９分、４５％アセトニトリル；およびＴ＝２０分、２５％アセトニトリル。これらの条件を使用して、抗体のＨＣおよびＬＣをベースラインで分離した。この分析の結果は、ＬＣがほとんど修飾されないままであるが（Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ）およびＴ（ＬＣＱ０５）含有抗体を除く）、ＨＣは修飾される（データは示していない）ことを示している。

【0258】

Ｅ．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
試料をＰＢＳでおよそ１ｍｇ／ｍＬに希釈することによって、化合物をＨＩＣ分析のために調製した。試料を、ＴＳＫ−ＧＥＬブチルＮＰＲカラム（４．６×３．５ｍｍ、孔径２．５μｍ；Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、部品番号１４９４７）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣへの１５μｌの自動注入により分析した。システムは、サーモスタットを備えた自動サンプラー、カラムヒーター、およびＵＶ検出器を含む。

【0259】

以下のような勾配方法を使用した：
移動相Ａ：１．５Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭリン酸水素二カリウム（ｐＨ７）；移動相Ｂ：２０％イソプロピルアルコール、５０ｍＭリン酸水素二カリウム（ｐＨ７）；Ｔ＝０分、１００％Ａ；Ｔ＝１２分、０％Ａ。

【0260】

保持時間を表１３に示す。選択したスペクトルを図２Ａ〜２Ｅに示す。部位特異的コンジュゲーションを使用したＡＤＣ（Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、およびＴ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１）（図１Ａ〜１Ｃ）は、主に１つのピークを示したが、従来のコンジュゲーションを使用したＡＤＣ（Ｔ−ｖｃ０１０１およびＴ−ＤＭ１）（図２Ｄ〜２Ｅ）は、異なる形で担持されたコンジュゲートの混合物を示した。

【0261】

【表13】

【0262】

Ｆ．熱安定性
示差走査熱量測定（ＤＣＳ）を使用して、操作されたシステインおよびトランスグルタミナーゼ抗体バリアント、ならびに対応するＡｕｒ−０６３８０１０１部位特異的コンジュゲートの熱安定性を決定した。この分析に関して、ＰＢＳ−ＣＭＦ ｐＨ７．２中で調合した試料を、オートサンプラーを備えたＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の試料トレイに分配し、１０℃で５分間平衡にした後、１００℃／時間の速度で１１０℃まで走査した。１６秒間のフィルタリング期間を選択した。生データをベースラインで補正して、タンパク質濃度を標準化した。Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用して適切な転移回数でデータをＭＮ２−Ｓｔａｔｅモデルに適合させた。

【0263】

全ての一重システインおよび二重システイン操作抗体バリアントならびに操作されたＬＣＱ０５アシルドナーグルタミン含有タグ抗体は、第一の融解転移（Ｔｍ１）が６５℃より高いことによって決定すると、優れた熱安定性を示した（表１４）。

【0264】

部位特異的コンジュゲーション方法を使用して０１０１にコンジュゲートしたトラスツズマブ誘導モノクローナル抗体も評価して、優れた熱安定性を同様に有することが示された（表１５）。しかし、Ｔ（Ｋ３９２Ｃ＋Ｌ４４３Ｃ）−ｖｃ０１０１ ＡＤＣのＴｍ１は、非コンジュゲート抗体と比較して−４．３５℃であったことから、ペイロードのコンジュゲーションによって最も影響を受けた。

【0265】

まとめると、これらの結果は、操作されたシステインおよびアシルドナーグルタミンを含むタグ抗体バリアントがいずれも熱安定であること、およびｖｃリンカーを介しての０１０１の部位特異的コンジュゲーションが、優れた熱安定性を有するコンジュゲートを生成することを証明した。さらに、非コンジュゲート抗体と比較してＴ（Ｋ３９２Ｃ＋Ｌ４４３Ｃ）−ｖｃ０１０１に関して観察されたより低い熱安定性は、ｖｃリンカーを介しての操作されたシステイン残基の特定の組合せへの０１０１のコンジュゲーションがＡＤＣの安定性に影響を及ぼし得ることを示した。

【0266】

【表14】

【0267】

【表15】

【0268】

（実施例８）
ＨＥＲ２に対するＡＤＣの結合
Ａ．直接結合
ＢＴ４７４細胞（ＨＴＢ−２０）をトリプシン処理して、遠心沈降させ、新しい培地に再懸濁した。次に、細胞を、出発濃度１μｇ／ｍＬのＡＤＣまたは非コンジュゲートトラスツズマブのいずれかの連続希釈液と共に４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を氷冷ＰＢＳによって２回洗浄し、抗ヒトＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８二次抗体（カタログ番号Ａ−１１０１３、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３０分間インキュベートした。次に、細胞を２回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁した。平均蛍光強度を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して読み取った。

【0269】

【表16】

【0270】

図３Ａおよび表１６に示すように、ＡＤＣ Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１は、直接結合によってＴ−ＤＭ１およびトラスツズマブと類似の結合親和性を有した。このことは、本発明のＡＤＣにおける抗体への修飾およびリンカー−ペイロードの付加が結合に有意な影響を及ぼさなかったことを示している。

【0271】

Ｂ．ＦＡＣＳによる競合的結合
ＢＴ４７４細胞をトリプシン処理して、遠心沈降させ、新しい培地に再懸濁した。次に、細胞を、１μｇ／ｍＬトラスツズマブ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によりカスタム合成された１：１ ＰＥ標識トラスツズマブ）と混合した、ＡＤＣまたは非コンジュゲートトラスツズマブのいずれかの連続希釈液と共に４℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を２回洗浄した後、ＰＢＳに再懸濁した。平均蛍光強度を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して読み取った。

【0272】

図３Ｂに示すように、ＡＤＣ Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１は、ＰＥ標識トラスツズマブに対する競合結合によって、Ｔ−ＤＭ１およびトラスツズマブと類似の結合親和性を有した。このことは、本発明のＡＤＣにおける抗体への修飾およびリンカー−ペイロードの付加が結合に有意な影響を及ぼさなかったことを示している。

【0273】

（実施例９）
ヒトＦｃＲｎに対するＡＤＣの結合
当技術分野において、ＦｃＲｎはサブタイプによらず、ＩｇＧとｐＨ依存的に相互作用し、それが分解されるリソソーム区画に入るのを防止することによって抗体を分解から保護すると考えられている。したがって、反応性システインを野生型ＩｇＧ１−Ｆｃ領域に導入する位置の選択に関して検討したのは、操作されたシステインを含む抗体のＦｃＲｎ結合特性および半減期が変化するのを回避することであった。

【0274】

ＢｉＡｃｏｒｅ（登録商標）分析を行って、ヒトＦｃＲｎに対する結合に関してトラスツズマブ誘導モノクローナル抗体およびそのそれぞれのＡＤＣの定常状態親和性（ＫＤ）を決定した。ＢｉＡｃｏｒｅ（登録商標）技術は、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣが、層の上に固定されたヒトＦｃＲｎタンパク質に結合する際のセンサーの表面層での屈折指数の変化を利用する。結合を、表面から屈折するレーザー光の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出した。ヒトＦｃＲｎを、ＢｉｒＡ試薬（カタログ番号：ＢＩＲＡ５００，Ａｖｉｄｉｔｙ，ＬＬＣ，Ａｕｒｏｒａ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）を使用して、操作されたＡｖｉ−タグを通して特異的にビオチン化し、センサー上でのＦｃＲｎタンパク質の均一な方向が可能となるように、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップ上に固定した。次に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、０．５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０を含む２０ｍＭ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸ｐＨ６．０（ＭＥＳ−ＳＰ）中の様々な濃度のトラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣをチップ表面に注入した。注入サイクルの間に、ＨＢＳ−ＥＰ＋０．０５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）ｐＨ７．４を使用して、表面を再生した。定常状態結合親和性を、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣに関して決定し、これらを野生型トラスツズマブ抗体（ＩｇＧ１ Ｆｃ領域にシステイン変異を含まず、ＴＧアーゼ操作タグまたはペイロードの部位特異的コンジュゲーションを含まない）と比較した。

【0275】

これらのデータは、本発明の表記の位置での操作されたシステイン残基のＩｇＧ１−Ｆｃ領域への取り込みがＦｃＲｎに対する親和性を変更しないことを証明した（表１７）。

【0276】

【表17-1】

【0277】

【表17-2】

【0278】

（実施例１０）
Ｆｃγ受容体に対するＡＤＣの結合
ヒトＦｃγ受容体に対する部位特異的コンジュゲーションを使用したＡＤＣの結合を、ペイロードに対するコンジュゲーションが抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）などの抗体関連機能性特性に影響を及ぼし得る結合を変更するか否かを理解するために評価した。ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６）はＮＫ細胞およびマクロファージ上で発現し、抗体結合を介してのこの受容体と標的発現細胞との同時会合がＡＤＣＣを惹起する。ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析を使用して、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体およびそのそれぞれのＡＤＣの、Ｆｃγ受容体ＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＩＩＩａ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）に対する結合を調べた。

【0279】

この表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイに関して、組換え型ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）細胞外ドメインタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）をＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上に固定し、トラスツズマブ誘導モノクローナル抗体またはそのそれぞれのＡＤＣのいずれかの約３００〜４００応答ユニット（ＲＵ）を捕捉した。Ｔ−ＤＭ１は、非コンジュゲートトラスツズマブ抗体と同等のＦｃγ受容体に対する結合特性をコンジュゲーション後も保持することが示されていることから、陽性対照としてこの評価に含めた。次に、様々な濃度のＦｃγ受容体、ＦｃγＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）を表面上に注入して、結合を決定した。

【0280】

ＦｃγＲ ＩＩａ、ＩＩｂ、およびＩＩＩａは、急速なｏｎ／ｏｆｆレートを示し、したがってセンソグラムを定常状態モデルに適合させてＫｄ値を得た。ＦｃγＲＩは、より遅いｏｎ／ｏｆｆレートを示し、このためデータをカイネティックモデルに適合させてＫｄ値を得た。

【0281】

操作されたシステイン位置２９０および３３４位でのペイロードのコンジュゲーションにより、その非コンジュゲート相対物の抗体およびＴ−ＤＭ１と比較して、特にＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、およびＣＤ６４に対するＦｃγＲ親和性の中等度の喪失が示された（表１８）。しかし、部位２９０、３３４、および３９２位での同時コンジュゲーションによって、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１およびＴ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１に関して観察されたように、ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、およびＣＤ３２ｂに対する親和性は実質的に失われたが、ＣＤ６４に対する親和性は失われなかった（表１８）。興味深いことに、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、Ｋ２９０Ｃ位で薬物ペイロードを有するにもかかわらず、この試験において評価した全てのＦｃγＲに対して同等の結合を示した（表１８）。予想されたように、トランスグルタミナーゼ媒介コンジュゲートＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、アシルドナーグルタミン含有タグの位置がＮ−結合グリコシル化を除去することから、評価したＦｃγ受容体のいずれにも結合しなかった。逆に、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、グルタミン含有タグがヒトκ軽鎖定常領域内で操作されていることから、Ｆｃγ受容体に対する完全な結合を保持した。

【0282】

まとめると、これらの結果は、コンジュゲートされたペイロードの位置が、ＦｃγＲに対するＡＤＣの結合に影響を及ぼし得ること、およびコンジュゲートの抗体機能性に影響を及ぼし得ることを示唆した。

【0283】

【表18】

【0284】

（実施例１１）
ＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣアッセイにおいて、Ｈｅｒ２発現細胞株ＢＴ４７４およびＳＫＢＲ３を標的細胞として使用し、ＮＫ−９２細胞（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ社によって５０歳の白人男性の末梢血単核球細胞から誘導されたインターロイキン−２依存的ナチュラルキラー細胞株）または健康なドナー（＃１７９）から新たに採取した血液から単離したヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、エフェクター細胞として使用した。

【0285】

標的細胞（ＢＴ４７４またはＳＫＢＲ３）１×１０^４個／１００μｌ／ウェルを９６ウェルプレートに入れて、ＲＰＭＩ１６４０培地中、３７℃／５％ＣＯ_２で一晩培養した。翌日、培地を除去して、アッセイ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地）６０μｌに交換し、１μｇ／ｍｌ抗体またはＡＤＣ ２０μｌを添加し、その後１×１０^５個（ＳＫＢＲ３に関して）または５×１０^５個（ＢＴ４７４に関して）のＰＢＭＣ浮遊液２０μｌ、または両方の細胞株に関して２．５×１０^５個のＮＫ９２細胞を各ウェルに添加して、ＰＢＭＣの場合はＢＴ４７４に関してエフェクター対標的比５０：１もしくはＳＫＢＲ３に関して２５：１、またはＮＫ９２の場合は１０：１を得た。試料は全て３回の反復実験で行った。

【0286】

アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ_２で６時間インキュベートした後、室温で平衡にした。細胞溶解によるＬＤＨ放出を、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｏｎｅ（商標）試薬を使用して、励起波長５６０ｎｍおよび放射波長５９０ｎｍで測定した。陽性対照として、Ｔｒｉｔｏｎ ８μＬを添加して、対照ウェルにおいて最大のＬＤＨ放出を生成した。図４に示す特異的細胞傷害性は、以下の式を使用して計算した。

【0287】

【数1】

「実験」は、上記の条件の１つで測定したシグナルに対応する。
「エフェクター自然放出」は、ＰＢＭＣ単独の存在下で測定したシグナルに対応する。
「標的自然放出」は、標的細胞単独の存在下で測定したシグナルに対応する。
「標的最大」は、洗浄剤溶解標的細胞単独の存在下で測定したシグナルに対応する。

【0288】

図４は、トラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、およびｖｃ０１０１ ＡＤＣコンジュゲートに関して試験したＡＤＣＣ活性を示す。データは、トラスツズマブおよびＴ−ＤＭ１に関して報告されたＡＤＣＣ活性と一致する。Ｎ２９７Ｑの変異はグリコシル化部位に存在することから、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、ＡＤＣＣ活性を有しないと予想され、これもまたアッセイにおいて確認された。一重変異体（Ｋ１８３Ｃ、Ｋ２９０Ｃ、Ｋ３３４Ｃ、ＬＣＱ０５を含むＫ３９２Ｃ）ＡＤＣに関しては、ＡＤＣＣ活性が維持された。意外にも、二重変異体（Ｋ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ、Ｋ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ、Ｋ１８３Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ、Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）ＡＤＣに関して、ＡＤＣＣ活性は、Ｋ３３４Ｃ部位に関連する２つの二重変異体ＡＤＣ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４ＣおよびＫ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）を除き、全て維持された。

【0289】

（実施例１２）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイ
抗体−薬物コンジュゲートを実施例３に記載のように調製した。細胞を９６ウェルプレートに低密度で播種し、翌日にＡＤＣおよび非コンジュゲートペイロードを１０濃度の連続３倍希釈液によって２回の反復実験で処置した。細胞を湿潤３７℃／５％ＣＯ_２インキュベータ内で４日間インキュベートした。プレートをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６ ＡＱｕｅｃｕｓ Ｏｎｅ ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に１．５時間インキュベートすることによって採取し、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ_５０値を、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）による４パラメータロジスティックモデルを使用して計算し、図５にｎＭペイロード濃度で、および図６にｎｇ／ｍＬ抗体濃度で報告した。ＩＣ_５０値は、括弧内に独立した測定回数と共に±標準偏差で示す。

【0290】

ｖｃ−０１０１またはＡｃＬｙｓｖ−０１０１リンカーペイロードを含むＡＤＣは、基準ＡＤＣであるＴ−ＤＭ１（Ｋａｄｃｙｌａ）と比較して、Ｈｅｒ２陽性細胞モデルに対して非常に強力であり、Ｈｅｒ２陰性細胞に対して選択的であった。

【0291】

トラスツズマブに対する部位特異的コンジュゲーションによって合成したＡＤＣは、Ｈｅｒ２細胞モデルに対して高レベルの効力および選択性を示した。特に、いくつかのトラスツズマブ−ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、中等度または低いＨｅｒ２発現細胞モデルにおいてＴ−ＤＭ１より強力である。例えば、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞（１＋のＨｅｒ２発現を有する）におけるＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害のＩＣ_５０は、３５１ｎｇ／ｍｌであり、これに対しＴ−ＤＭ１では３６２６ｎｇ／ｍｌ（約１０倍低い）である。ＭＤＡ−ＭＢ−３６１−ＤＹＴ２およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞などの２＋＋レベルのＨｅｒ２発現を有する細胞に関して、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１のＩＣ_５０は１２〜２０ｎｇ／ｍｌであり、これに対しＴ−ＤＭ１では３８〜４０ｎｇ／ｍｌである。

【0292】

（実施例１３）
異種移植片モデル
本発明のトラスツズマブ誘導ＡＤＣを、Ｎ８７胃がん異種移植片モデル、３７６２２肺がん異種移植片モデル、および多数の乳がん異種移植片モデル（即ち、ＨＣＣ １９５４、ＪＩＭＴ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）、および１４４５８０（ＰＤＸ）モデル）で試験した。以下に記載のそれぞれのモデルに関して、最初の用量を１日目に与えた。腫瘍を少なくとも週に１回測定し、その体積を式：腫瘍体積（ｍｍ^３）＝０．５×（腫瘍の幅^２）（腫瘍の長さ）によって計算した。最大で８〜１０匹、最少で６〜８匹の動物を含む各処置群の平均腫瘍体積（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）を計算した。

【0293】

Ａ．Ｎ８７胃がん異種移植片
トラスツズマブ誘導ＡＤＣの効果を、免疫欠損マウスにおいて、高レベルのＨＥＲ２発現を有するＮ８７細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５８２２）から確立したヒト腫瘍異種移植片のｉｎ ｖｉｖｏ成長に関して調べた。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）マウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で７．５×１０^６個のＮ８７細胞を皮下移植した。腫瘍の体積が２５０〜４５０ｍｍ^３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。Ｎ８７胃がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、トラスツズマブＡＤＣ（０．３、１、および３ｍｇ／ｋｇ）またはＴ−ＤＭ１（１、３、および１０ｍｇ／ｋｇ）を４日間離して４回（Ｑ４ｄ×４）静脈内投与した（図７）。

【0294】

データは、トラスツズマブ誘導ＡＤＣがＮ８７胃がん異種移植片の成長を用量依存的に阻害したことを証明する（図７Ａ〜７Ｈ）。

【0295】

図７Ｉに示すように、Ｔ−ＤＭ１は、１および３ｍｇ／ｋｇで腫瘍成長を遅らせ、１０ｍｇ／ｋｇでは腫瘍の完全な縮小を示した。しかし、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、１および３ｍｇ／ｋｇで完全な縮小をもたらし、０．３ｍｇ／ｋｇで部分的縮小をもたらした（図７Ａ）。データは、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１が、このモデルにおいてＴ−ＤＭ１より有意に強力（約１０倍）であることを示している。

【0296】

ＤＡＲ４を有するＡＤＣ（図６Ｅ、６Ｆ、および６Ｇ）について、１８３＋２９０（図７Ａ）と比較して類似のｉｎ ｖｉｖｏ有効性が得られた。加えて、ＤＡＲ２ ＡＤＣである一重変異体を評価した（図７Ｂ、７Ｃ、および７Ｄ）。一般的に、これらのＡＤＣは、ＤＡＲ４ ＡＤＣと比較してあまり有効ではないが、Ｔ−ＤＭ１よりは有効である。ＤＡＲ２ ＡＤＣにおいて、ＬＣＱ０５は、ｉｎ ｖｉｖｏ有効性データに基づくと最も強力なＡＤＣであるように思われる。

【0297】

Ｂ．ＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片
ＨＣＣ１９５４（ＡＴＣＣ＃ ＣＲＬ−２３３８）は、高ＨＥＲ２発現乳がん細胞株である。異種移植片を生成するために、雌性ＳＨＯマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）に、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で５×１０^６個のＨＣＣ１９５４細胞を皮下移植した。腫瘍の体積が２００〜２５０ｍｍ^３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。ＨＣＣ１９５４乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、トラスツズマブ誘導ＡＤＣ、および陰性対照ＡＤＣをＱ４ｄ×４で静脈内投与した（図８Ａ〜８Ｅ）。

【0298】

データは、トラスツズマブＡＤＣがＨＣＣ１９５４乳がん異種移植片の成長を用量依存的に阻害したことを証明している。１ｍｇ／ｋｇ用量の比較では、ｖｃ０１０１コンジュゲートは、Ｔ−ＤＭ１より有効であった。０．３ｍｇ／ｋｇ用量の比較では、ＤＡＲ４担持ＡＤＣ（図８Ｂ、８Ｃ、および８Ｄ）は、ＤＡＲ２担持ＡＤＣより有効である（図８Ａ）。さらに、陰性対照ＡＤＣの１ｍｇ／ｋｇは、ビヒクル対照と比較して腫瘍成長に対する影響は非常にわずかであった（図８Ｄ）。しかし、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１は、腫瘍を完全に縮小させ、標的特異性を示している。

【0299】

Ｃ．ＪＩＭＴ−１乳がん異種移植片
ＪＩＭＴ−１は、中等度／低いＨｅｒ２を発現し、トラスツズマブに対して本質的に抵抗性である乳がん細胞株である。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で５×１０^６個のＪＩＭＴ−１細胞（ＤＳＭＺ＃ＡＣＣ−５８９）を皮下移植した。腫瘍の体積が２００〜２５０ｍｍ^３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。ＪＩＭＴ−１乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、Ｔ−ＤＭ１（図９Ｇ）、部位特異的コンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ（図９Ａ〜９Ｅ）、従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ（図９Ｆ）、および陰性対照ｈｕＮｅｇ−８．８ＡＤＣをＱ４ｄ×４で静脈内投与した。

【0300】

データは、試験した全てのｖｃ０１０１コンジュゲートが腫瘍の縮小を用量依存的に引き起こすことを証明している。これらのＡＤＣは、１ｍｇ／ｋｇで腫瘍の縮小を引き起こすことができる。しかし、Ｔ−ＤＭ１はこの中等度／低いＨｅｒ２発現モデルでは６ｍｇ／ｋｇでも不活性である。

【0301】

Ｄ．ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）乳がん異種移植片
ＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）は、中等度／低Ｈｅｒ２発現乳がん細胞株である。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスに１００ｃＧｙ／分を４分間照射し、３日後に５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で１．０×１０^７個のＭＤＡ−ＭＢ−３６１（ＤＹＴ２）細胞（ＡＴＣＣ＃ ＨＴＢ−２７）を皮下移植した。腫瘍の体積が３００〜４００ｍｍ^３に達すると、様々な処置群における腫瘍量の均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。ＤＹＴ２乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、部位特異的コンジュゲーションおよび従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ、Ｔ−ＤＭ１、および陰性対照ＡＤＣをＱ４ｄ×４で静脈内投与した（図１０Ａ〜１０Ｄ）。

【0302】

データは、トラスツズマブＡＤＣがＤＹＴ２乳がん異種移植片の成長を用量依存的に阻害したことを証明している。ＤＹＴ２は中等度／低Ｈｅｒ２発現細胞株であるが、他のＨｅｒ２低／中等度発現細胞株より微小管阻害剤に対して感受性である。

【0303】

Ｅ．１４４５８０患者由来乳がん異種移植片
トラスツズマブ誘導ＡＤＣの効果を、免疫欠損マウスにおいて、適切な同意手順に従って得た新たに切除した１４４５８０乳房腫瘍の断片から確立したヒト腫瘍異種移植片のｉｎ ｖｉｖｏ成長に関して調べた。新しい生検を採取した際の１４４５８０の腫瘍特徴付けは、トリプルネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−、およびＨＥＲ２−）乳がん腫瘍であった、１４４５８０乳がん患者由来異種移植片を、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて動物から動物への断片としてｉｎ ｖｉｖｏで皮下に継代した。腫瘍の体積が１５０〜３００ｍｍ^３に達すると、様々な処置群における腫瘍サイズの均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。１４４５８０乳がんモデルに、ＰＢＳビヒクル、部位特異的コンジュゲーションを使用したトラスツズマブＡＤＣ、および従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ、および陰性対照ＡＤＣを４日毎に４回（Ｑ４ｄ×４）静脈内投与した（図１１Ａ〜１１Ｅ）。

【0304】

このＨＥＲ２−（臨床での定義により）ＰＤＸモデルにおいて、Ｔ−ＤＭ１は、調べた全ての用量（１．５、３、および６ｍｇ）で無効であった（図１０Ｅ）。ＤＡＲ４ ｖｃ０１０１ ＡＤＣ（図１１Ａ、１１Ｃ、および１１Ｄ）に関して、３ｍｇ／ｋｇは、腫瘍の縮小を引き起こすことができる（図１１Ｃにおいて１ｍｇ／ｋｇであっても）。ＤＡＲ２ ｖｃ０１０１ ＡＤＣ（図１１Ｂ）は、３ｍｇ／ｋｇでＤＡＲ４ ＡＤＣより無効である。しかし、ＤＡＲ２ ｖｃ０１０１ ＡＤＣはＴ−ＤＭ１とは異なり、６ｍｇ／ｋｇで有効である。

【0305】

Ｆ．３７６２２患者由来非小細胞肺がん異種移植片
適切な同意手順に従って得た３７６２２の患者由来非小細胞肺がん異種移植片モデルにおいていくつかのＡＤＣを試験した。３７６２２患者由来異種移植片を、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて動物から動物への断片としてｉｎ ｖｉｖｏで皮下に継代した。腫瘍の体積が１５０〜３００ｍｍ^３に達すると、様々な処置群における腫瘍サイズの均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。３７６２２ＰＤＸモデルに、ＰＢＳビヒクル、部位特異的コンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣ、Ｔ−ＤＭ１、および陰性対照ＡＤＣを、４日毎に４回（Ｑ４ｄ×４）静脈内投与した（図１２Ａ〜１２Ｄ）。

【0306】

Ｈｅｒ２の発現を、修飾したＨｅｒｃｅｐｔ試験によってプロファイリングしたところ、細胞株において認められるより多くの不均質性を有する２＋であると分類された。リンカーペイロードとしてｖｃ０１０１をコンジュゲートしたＡＤＣ（図１２Ａ〜１２Ｃ）は、１および３ｍｇ／ｋｇで腫瘍の縮小を引き起こし、有効であった。しかし、Ｔ−ＤＭ１は、１０ｍｇ／ｋｇでいくらかの治療利益を提供したに過ぎなかった（図１２Ｄ）。Ｔ−ＤＭ１の１０ｍｇ／ｋｇでの結果をｖｃ０１０１ ＡＤＣの１ｍｇ／ｋｇと比較すると、ｖｃ０１０１ ＡＤＣは、Ｔ−ＤＭ１より１０倍強力であるように思われる。バイスタンダー効果は、不均質な腫瘍における有効性にとって重要である可能性がある。

【0307】

Ｇ．ＧＡ００４４患者由来胃がん異種移植片
トラスツズマブおよび抗ＨＥＲ２ ＡＤＣを、適切な同意手順に従って得た患者由来胃がん異種移植片モデル（ＧＡ００４４）において試験した。ＧＡ００４４患者由来異種移植片を、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスにおいて動物から動物への断片としてｉｎ ｖｉｖｏで皮下に継代した。腫瘍の体積が１５０〜３００ｍｍ^３に達すると、様々な処置群における腫瘍サイズの均一性を確保するために、腫瘍を病期分類した。ＧＡ００４４ＰＤＸモデルに、ＰＢＳビヒクル、トラスツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、またはｖｃ０１０１に対する部位特異的コンジュゲーションを使用したトラスツズマブ誘導ＡＤＣを、４日毎に４回（Ｑ４ｄ×４）静脈内投与した（図３０）。

【0308】

ＧＡ００４４におけるＨＥＲ２の発現を、変更したＨｅｒｃｅｐｔ試験によってプロファイリングしたところ、不均質な分布を有する２＋であると分類された。ペイロードとしてｖｃ０１０１をコンジュゲートしたＡＤＣ（即ち、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１）は、有効であり、１および３ｍｇ／ｋｇ用量で腫瘍の完全な縮小が起こった。トラスツズマブおよびＴ−ＤＭ１は、ビヒクル処置腫瘍と比較して腫瘍成長に認識可能な差を示さなかった。バイスタンダー効果は、不均質な標的（即ち、ＨＥＲ２）発現を有するこの腫瘍における有効性にとって重要である可能性がある。

【0309】

Ｈ．Ｎ８７胃がん異種移植片におけるＴ−ｖｃ０１０１ ＡＤＣのバイスタンダー効果の証明
Ｔ−ＤＭ１ ＡＤＣの放出された代謝物は、膜不透過性化合物であるリジンキャップｍｃｃ−ＤＭ１リンカーペイロード（即ち、Ｌｙｓ−ｍｃｃ−ＤＭ１）であることが示されている（Ｋｏｖｔｕｎら、２００６，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６６：３２１４〜２１；Ｘｉｅら、２００４，Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ ３１０：８４４）。しかし、Ｔ−ｖｃ０１０１ ＡＤＣから放出された代謝物は、オーリスタチン０１０１であり、Ｌｙｓ−ｍｃｃ−ＤＭ１より膜透過性が高い化合物である。放出されたＡＤＣペイロードが隣接する細胞を死滅させる能力は、バイスタンダー効果として知られている。膜透過性のペイロードの放出により、Ｔ−ｖｃ０１０１は、強いバイスタンダー効果を惹起することができるが、Ｔ−ＤＭ１は惹起することができない。図１３は、Ｔ−ＤＭ１の６ｍｇ／ｋｇ（図１３Ａ）またはＴ−ｖｃ０１０１の３ｍｇ／ｋｇ（図１３Ｂ）のいずれかを１回投与した後、採取し、後に９６時間のホルマリン固定で処理したＮ８７細胞株異種移植片腫瘍の免疫組織化学を示す。腫瘍の切片を、両方のＡＤＣのペイロードについて提唱される作用機序の読み出しとして、腫瘍細胞に結合したＡＤＣを検出するためにヒトＩｇＧに関して染色し、分裂細胞を検出するためにホスホ−ヒストンＨ３（ｐＨＨ３）に関して染色した。

【0310】

ＡＤＣは、いずれの場合も腫瘍の辺縁部で検出される。Ｔ−ＤＭ１処置腫瘍（図１３Ａ）において、ｐＨＨ３陽性腫瘍細胞の大部分は、ＡＤＣの近くに存在する。しかし、Ｔ−ｖｃ０１０１処置腫瘍（図１３Ｂ）では、ｐＨＨ３陽性腫瘍細胞の大部分は、ＡＤＣの位置を超えて広がっており（黒色の矢印はいくつかの例を強調する）、腫瘍の内部に存在する。これらのデータは、切断可能リンカーおよび膜透過性のペイロードを有するＡＤＣが、ｉｎ ｖｉｖｏで強いバイスタンダー効果を惹起できることを示唆している。

【0311】

（実施例１４）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏＴ−ＤＭ１抵抗性モデル
Ａ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ−ＤＭ１抵抗性細胞の生成
Ｎ８７細胞を２つの個別のフラスコに継代し、生物学的複製実験を可能にするために、それぞれのフラスコを抵抗性生成プロトコールに関して同一に処置した。細胞を、Ｔ−ＤＭ１コンジュゲートのおよそＩＣ_８０濃度（１０ｎＭペイロード濃度）に３日間曝露した後、およそ４〜１１日間処置を行わずに回復させることを５サイクル行った。Ｔ−ＤＭ１コンジュゲートの１０ｎＭで５サイクル後、細胞を、１００ｎＭ Ｔ−ＤＭ１のさらに６回サイクルに同様に曝露した。手順は、診療所で細胞傷害性治療薬に関して典型的に使用される、最大忍容量の後に回復期間を設ける長期的なマルチサイクル（ｏｎ／ｏｆｆ）投与を模倣することを意図した。Ｎ８７から誘導した親細胞をＮ８７と呼び、Ｔ−ＤＭ１に長期的に曝露した細胞をＮ８７−ＴＭと呼ぶ。中等度から高レベルの薬物抵抗性が、Ｎ８７−ＴＭ細胞に関して４カ月以内に発生した。抵抗性レベルが持続的な薬物曝露後にもはや増加しなくなるサイクル処置の３〜４カ月後に、薬物の選択圧を除去した。応答および表現型は、その後およそ３〜６カ月間、培養細胞株において安定なままであった。その後、細胞傷害アッセイによって測定した抵抗性表現型の大きさの低減が時に観察され、この場合には、継代初期に凍結保存したＴ−ＤＭ１抵抗性細胞を追加の試験のために融解した。細胞の安定化を確実にするために、Ｔ−ＤＭ１選択圧の除去後少なくとも２〜８週間の間に、報告された全ての特徴付けを実施した。結果の一貫性を確実に得るためにモデルの作製後およそ１〜２年の間に、１回の選択に由来する融解した様々な凍結保存集団からデータを収集した。胃がん細胞株Ｎ８７を、それぞれの細胞株に関しておよそＩＣ_８０（約１０ｎＭペイロード濃度）である用量での処置サイクルによって、トラスツズマブ−メイタンシノイド抗体−薬物コンジュゲート（Ｔ−ＤＭ１）に対する抵抗性に関して選択した。親Ｎ８７細胞は、コンジュゲートに対して本質的に感受性であった（ＩＣ_５０＝１．７ｎＭペイロード濃度、６２ｎｇ／ｍＬ抗体濃度）（図１４）。親Ｎ８７細胞の２つの集団を処置サイクルに曝露して、１００ｎＭ Ｔ−ＤＭ１でのおよそ４カ月間の曝露サイクル後、これらの２つの集団（以降、Ｎ８７−ＴＭ−１およびＮ８７−ＴＭ−２と呼ぶ）はそれぞれ、親細胞と比較してＡＤＣに対して１１４倍および１４６倍の不応性となった（図１４および図１５Ａ）。興味深いことに、対応する非コンジュゲートメイタンシノイド遊離薬に対して最小の交差抵抗性（約２．２〜２．５倍）が観察された（図１４）。

【0312】

Ｂ．細胞傷害性試験
ＡＤＣを実施例３に記載のように調製した。非コンジュゲートメイタンシンアナログ（ＤＭ１）およびオーリスタチンアナログは、Ｐｆｉｚｅｒ Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｇｒｏｔｏｎ，ＣＴ）が調製した。他の標準治療化学療法剤は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。細胞を９６ウェルプレートに低密度で播種した後、翌日、ＡＤＣおよび非コンジュゲートペイロードの１０濃度の３倍連続希釈液によって２回の反復実験で処置した。細胞を湿潤３７℃／５％ＣＯ_２インキュベータ内で４日間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ（登録商標）９６ＡＱｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ ＭＴＳ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａｍ Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と共に１．５時間インキュベートすることによってプレートを採取し、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ_５０値を、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）による４パラメータロジスティックモデルを使用して計算した。

【0313】

他のトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対する交差抵抗性プロファイルを決定した。切断不能リンカーおよび送達ペイロードで構成される多くのトラスツズマブ誘導ＡＤＣに対して、抗チューブリン作用機序により有意な交差抵抗性が観察された（図１４）。例えば、Ｎ８７−ＴＭをＮ８７親細胞と比較すると、切断不能マレイミドカプロイルまたはＭａｌ−ＰＥＧリンカーを介してそれぞれトラスツズマブに連結されたオーリスタチンベースのペイロードを表すＴ−ｍｃ８２６１（図１４および図１５Ｂ）およびＴ−ＭａｌＰｅｇ８２６１（図１４）に対して、＞３３０および＞２７２倍の効力の低減が観察された。Ｎ８７−ＴＭ細胞において、モノメチルドラスタチン（ＭＭＡＤ）を送達する異なる切断不能リンカーを有する別のトラスツズマブＡＤＣであるＴ−ｍｃＭａｌＰｅｇＭＭＡＤに対して、２３５倍を超える抵抗性が観察された（図１４）。

【0314】

注目すべきことに、これらの薬物は類似の標的を機能的に阻害する（即ち、微小管の脱重合化）が、Ｎ８７−ＴＭ細胞株は切断可能リンカーを介して送達されるペイロードに対しては感受性を保持することが観察された。抵抗性を克服するＡＤＣの例には、限定されないが、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｃ）、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｄ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１（図１０および図１１Ｅ）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｆ）ならびにＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１（図１４および図１５Ｇ）が挙げられる。これらは、オーリスタチンアナログ０１０１を送達するがｖｃリンカーのタンパク質分解切断によってペイロードが細胞内に放出される、トラスツズマブベースのＡＤＣを表す。

【0315】

これらのＡＤＣ抵抗性がん細胞が他の治療に対して広く抵抗性であるか否かを決定するために、Ｎ８７−ＴＭ細胞モデルを、様々な作用機序を有する標準治療化学療法剤のパネルによって処置した。一般的に、微小管およびＤＮＡ機能の低分子阻害剤は、Ｎ８７−ＴＭ抵抗性細胞株に対して有効なままであった（図１４）。これらの細胞は、微小管脱重合剤であるメイタンシンのアナログを送達するＡＤＣに対して抵抗性となったが、いくつかのチューブリン脱重合化または重合化剤に対しては交差抵抗性が最小であるかまたは交差抵抗性が認められなかった。同様に、両方の細胞株は、トポイソメラーゼ阻害剤、抗代謝剤、およびアルキル化剤／架橋剤を含む、ＤＮＡ機能を妨害する薬剤に対する感受性を保持した。一般的に、Ｎ８７−ＴＭ細胞は、広範囲の細胞障害剤に対して不応性ではないことから、薬物抵抗性を模倣する一般的な成長または細胞周期の欠損は除外される。

【0316】

両方のＮ８７−ＴＭ集団は、対応する非コンジュゲート薬（即ち、ＤＭ１および０１０１；図１４）に対しても感受性を保持した。したがって、トラスツズマブ−メイタンシノイドコンジュゲートに対して不応性となったＮ８７−ＴＭ細胞は、切断不能リンカーを介して送達した場合に、他の微小管ベースのＡＤＣに対して交差抵抗性を示したが、非コンジュゲート微小管阻害剤および他の化学療法剤に対しては感受性のままであった。

【0317】

Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１に対する抵抗性の分子メカニズムを決定するために、ＭＤＲ１およびＭＲＰ１薬物排出ポンプのタンパク質発現レベルを決定した。これは。低分子チューブリン阻害剤がＭＤＲ１およびＭＲＰ１薬物排出ポンプの公知の基質であるためであった（Ｔｈｏｍａｓ ａｎｄ Ｃｏｌｅｙ，２００３，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ １０（２）：１５９〜１６５）。親Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ抵抗性細胞の総細胞溶解物から、これらの２つのタンパク質のタンパク質発現レベルを決定した（図１６）。イムノブロット分析から、Ｎ８７−ＴＭ抵抗性細胞がＭＲＰ１（図１６Ａ）またはＭＤＲ１（図１６Ｂ）タンパク質を有意に過剰発現しないことが示された。まとめると、これらのデータを、Ｎ８７−ＴＭ細胞において薬物排出ポンプの公知の基質（例えば、パクリタキセル、ドキソルビシン）に対する交差抵抗性がないことと組み合わせると、薬物排出ポンプの過剰発現は、Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１抵抗性の分子メカニズムではないことを示唆している。

【0318】

ＡＤＣの作用機序が、特異的抗原に対する結合を必要としていることから、抗原の枯渇または抗体結合の低減は、Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１抵抗性を説明し得る。Ｔ−ＤＭ１に関する抗原がＮ８７−ＴＭ細胞において有意に枯渇されているか否かを決定するために、親Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ抵抗性細胞の総細胞溶解物からのＨＥＲ２発現レベルを比較した（図１７Ａ）。イムノブロット分析から、Ｎ８７−ＴＭ１細胞が、親Ｎ８７細胞と比較して顕著に低減された量のＨＥＲ２タンパク質発現を有しないことが示された。

【0319】

Ｎ８７−ＴＭ細胞の細胞表面ＨＥＲ２抗原に対する抗体結合量を決定した。蛍光活性化細胞ソーティングを使用する細胞表面結合試験において、Ｎ８７−ＴＭ細胞は、細胞表面抗原に対するトラスツズマブ結合が約５０％減少した（図１７Ｂ）。Ｎ８７細胞は、がん細胞株の中でもＨＥＲ２タンパク質の高い発現体であることから（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ−Ｏｕｃｈｉら、２００７，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５９（６）：７９５〜８０５）、これらの細胞におけるＨＥＲ２抗体結合の約５０％低減はおそらく、Ｎ８７−ＴＭ細胞におけるＴ−ＤＭ１に対する抵抗性の促進メカニズムを表すものではない。この解釈を支持する証拠は、Ｎ８７−ＴＭ抵抗性細胞が、異なるリンカーおよびペイロードを有する他のＨＥＲ２結合トラスツズマブ誘導ＡＤＣに対して感受性のままであることである（図１４）。

【0320】

偏りのないアプローチでＴ−ＤＭ１抵抗性の潜在的メカニズムを決定するために、親Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ抵抗性細胞モデルを、Ｔ−ＤＭ１抵抗性の原因であり得る膜タンパク質発現レベルの変化を全体的に同定するために、プロテオミックアプローチを介してプロファイルを調べた。両方の細胞株モデルの間で５２３個のタンパク質の有意な発現レベルの変化が観察された（図１８Ａ）。これらの予想されるタンパク質変化の選択をバリデートするために、Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ全細胞溶解物のイムノブロットを、Ｎ８７細胞と比較してＮ８７−ＴＭ細胞において過小発現すると予想されるタンパク質（ＩＧＦ２Ｒ、ＬＡＭＰ１、ＣＴＳＢ）（図１８Ｂ）および過剰発現すると予想されるタンパク質（ＣＡＶ１）（図１８Ｃ）に関して実施した。Ｉｎ ｖｉｖｏで観察されたタンパク質の変化がｉｎ ｖｉｖｏで認められる変化を模倣するか否かを評価するために、Ｎ８７およびＮ８７−ＴＭ−２細胞をＮＳＧマウスに皮下移植することによって、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍を生成した。Ｎ８７−ＴＭ−２腫瘍は、Ｎ８７腫瘍と比較してＣＡＶ１タンパク質の過剰発現を保持した（図１８Ｄ）。両方のモデルにおいてマウス間質でのＣＡＶ染色が予想されるが、上皮ＣＡＶ１染色はＮ８７−ＴＭ−２モデルのみに認められた。

【0321】

Ｃ．Ｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験
細胞培養において観察された抵抗性がｉｎ ｖｉｖｏで再現されるか否かを決定するために、親Ｎ８７細胞およびＮ８７−ＴＭ−２細胞を拡大増殖させて、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から得た雌性ＮＯＤ ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）免疫欠損マウス（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）の脇腹に注射した。
マウスにＮ８７またはＮ８７−ＴＭ細胞（７．５×１０^６個／注射、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ中）のいずれかの浮遊液を右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約０．３ｇ（約２５０ｍｍ^３）に達すると、マウスを試験群に無作為化した。Ｔ−ＤＭ１コンジュゲートまたはビヒクルを０日目に食塩水中で静脈内投与し、全体で４用量を４日間離して繰り返した（Ｑ４Ｄ×４）。腫瘍を毎週測定して、量を体積＝（幅×幅×長さ）／２として計算した。ｔｉｍｅ ｔｏ ｅｖｅｎｔ分析（腫瘍の倍加）を実施して、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定によって有意性を評価した。これらの試験の全ての処置群のマウスにおいて、体重減少は観察されなかった。

【0322】

マウスを以下の薬剤で処置した：（１）ビヒクル対照ＰＢＳ、（２）トラスツズマブ抗体の１３ｍｇ／ｋｇの後に４．５ｍｇ／ｋｇ；（３）Ｔ−ＤＭ１の６ｍｇ／ｋｇ；（４）Ｔ−ＤＭ１の１０ｍｇ／ｋｇ；（５）Ｔ−ＤＭ１の１０ｍｇ／ｋｇ、次いでＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１の３ｍｇ／ｋｇ；（６）Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１の３ｍｇ／ｋｇ。腫瘍サイズをモニターして、結果を図２０に示す。Ｎ８７（図１９および図２０Ａ）およびＮ８７−ＴＭ−２（図１９および図２０Ｂ）腫瘍は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害アッセイで認められたプロファイルと類似のＡＤＣ有効性プロファイルを示し（図１９および２０Ｂ）、Ｎ８７−ＴＭ薬物抵抗性細胞は、Ｔ−ＤＭ１に対して不応性であったが、なおも切断可能リンカーを有するトラスツズマブ誘導ＡＤＣには応答した。実際に、Ｔ−ＤＭ１に対して不応性であり、約１ｇまで成長した腫瘍を、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１による処置に切り替えると、腫瘍は有効に縮小した（図２０Ｂ）。この試験のｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ分析において、Ｔ−ＤＭ１の６および１０ｍｇ／ｋｇは、Ｎ８７モデルにおけるマウスの＞５０％において少なくとも６０日間腫瘍の倍加を防止したが、Ｎ８７−ＴＭ−２モデルでは、Ｔ−ＤＭ１は防止することができなかった（図２０Ｃおよび２０Ｄ）。Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１を３ｍｇ／ｋｇで投与すると、試験期間の間（約８０日）、マウスにおけるＮ８７およびＮ８７−ＴＭ腫瘍の両方のいかなる腫瘍倍加も防止した（図２０Ｃおよび２０Ｄ）。

【0323】

別の試験において、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ−ＤＭ１抵抗性を克服した切断可能に連結されたＡＤＣは全て、Ｔ−ＤＭ１に対して非応答性であったこのＮ８７−ＴＭ２腫瘍モデルにおいて有効なままであった（図１９および図２０Ｅ）。

【0324】

次に、Ｔ（ｋＫ１８３＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１ ＡＤＣがＴＤＭ１に対して不応性である腫瘍成長を阻害できるか否かを評価した。ビヒクルまたはＴ−ＤＭ１のいずれかによって処置したＮ８７−ＴＭ腫瘍は、これらの処置下で成長したが、１４日目にＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１治療に切り替えた腫瘍は直ちに縮小した（図２０Ｆ）。

【0325】

（実施例１５）
Ｉｎ ｖｉｖｏＴ−ＤＭ１抵抗性モデル
Ａ．Ｉｎ ｖｉｖｏでのＴ−ＤＭ１抵抗性細胞の生成
全ての動物試験は、確立されたガイドラインに従って、Ｐｆｉｚｅｒ Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。異種移植片を生成するために、雌性ヌード（Ｎｕ／Ｎｕ）マウスに、５０％Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で７．５×１０^６個のＮ８７細胞を皮下移植した。平均腫瘍体積が約３００ｍｍ^３に達すると、動物を２つの群に無作為化した：１）ビヒクル対照（ｎ＝１０）および２）Ｔ−ＤＭ１処置（ｎ＝２０）。Ｔ−ＤＭ１ ＡＤＣ（６．５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（ＰＢＳ）を食塩水中で０日目に静脈内投与した後、動物に６．５ｍｇ／ｋｇを３０週まで毎週投与した。腫瘍を週に２回または週に１回測定して、量を体積＝（幅×幅×長さ）／２として計算した。これらの試験において全ての処置群のマウスにおいて、体重減少は観察されなかった。

【0326】

個々の腫瘍体積が約６００ｍｍ^３に達すると（無作為化時の腫瘍の当初のサイズの倍加）、動物はＴ−ＤＭ１処置に不応性であるかまたは処置下で再発したと考えられた。図２１Ａに示すように、対照群と比較して、ほとんどの腫瘍は当初Ｔ−ＤＭ１処置に応答した。より具体的には、マウス２０匹中１７匹が初回Ｔ−ＤＭ１処置に応答したが、有意な数の腫瘍（２０例中１３例）が、Ｔ−ＤＭ１処置下で再発した。時間と共に、移植したＮ８７細胞はＴ−ＤＭ１に対して抵抗性となった（図２１Ｂ）。Ｔ−ＤＭ１処置に当初反応しなかった３例の腫瘍を、ＩＨＣによるＨｅｒ２発現決定のために採取したところ、ＨＥＲ２発現の変化がないことが示された。残りの１０例の再発腫瘍を以下に説明する。

【0327】

Ｔ−ＤＭ１処置に当初反応し、その後再発した４例の腫瘍を、７７日目（マウス１および１６）、９１日目（マウス１９）、１４０日目（マウス６）にＴ−ｖｃ０１０１の２．６ｍｇ／ｋｇの毎週処置に切り替えた。図１９Ｃに示すように、ｉｎ ｖｉｖｏで生成したＴ−ＤＭ１抵抗性腫瘍はＴ−ｖｃ０１０１に応答し、Ｔ−ＤＭ１抵抗性を獲得した腫瘍がｖｃ０１０１ＡＤＣ処置に対して感受性であることを示した。

【0328】

当初Ｔ−ＤＭ１処置に応答した後、再発した別の３例の腫瘍を、１１０日目（マウス４、１３、および１８）にＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１の２．６ｍｇ／ｋｇの毎週処置に切り替えた。図２１Ｄに示すように、ｉｎ ｖｉｖｏで生成したＴ−ＤＭ１抵抗性細胞もまた、Ｔ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１に応答した。Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を評価するために追加の実験を行ったところ、類似の結果が得られ、ｉｎ ｖｉｖｏで生成したＴ−ＤＭ１抵抗性腫瘍が、図２１Ｅに示すように、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１処置に対して感受性であることが示された。

【0329】

要約すると、追加の処置を行った全てのＴ−ＤＭ１不応性腫瘍は、ｖｃ０１０１ ＡＤＣ処置に対して感受性（７例中７例）であり、ｉｎ ｖｉｖｏ抵抗性Ｔ−ＤＭ１腫瘍を、切断可能なｖｃ０１０１コンジュゲートによって処置することができることが示された。

【0330】

当初Ｔ−ＤＭ１に応答したがその後再発したさらに３例の腫瘍（図２１Ｂに示すマウス７、１７、および２）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ特徴付けのために切除した。切除した腫瘍をｉｎ ｖｉｔｒｏで２〜５カ月間培養後、これらの細胞をＴ−ＤＭ１に対する抵抗性に関して評価し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで特徴付けした（本実施例において以下の節ＢおよびＣを参照されたい）。

【0331】

Ｂ．細胞傷害性試験
Ｔ−ＤＭ１処置から再発し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した（本実施例の節Ａに記載のように）細胞を９６ウェルプレートに播種して、翌日にＡＤＣまたは非コンジュゲートペイロードの４倍連続希釈液を投与した。細胞を湿潤３７℃／５％ＣＯ_２インキュベータ内で９６時間インキュベートした。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）をプレートに添加して、Ｖｉｃｔｏｒプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）において波長４９０ｎｍで吸光度を測定した。ＩＣ_５０値を、ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）による４パラメータロジスティックモデルを使用して計算した。

【0332】

細胞傷害性スクリーニングの結果を、表１９および２０に要約する。細胞は、親細胞と比較してＴ−ＤＭ１（図２２Ａ）に対して抵抗性であったが、切断可能なｖｃ０１０１コンジュゲートＴ−ｖｃ０１０１（データは示していない）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１（図２２Ｂ）、Ｔ（ＬＣＱ０５＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図２２Ｃ）、およびＴ（Ｎ２９７Ｑ＋Ｋ２２２Ｒ）−ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１（図２２Ｄ）に対して感受性であった（表１９）。Ｔ−ＤＭ１抵抗性細胞は、意外にも親ペイロードＤＭ１ならびに０１０１ペイロードに対して感受性であった（表２０）。

【0333】

【表19】

【0334】

【表20】

【0335】

Ｃ．ＦＡＣＳおよびウェスタンブロットによるＨｅｒ２発現
Ｔ−ＤＭ１処置から再発し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した（本実施例の節Ａに記載のように）細胞において、Ｈｅｒ２発現を特徴付けした。ＦＡＣＳ分析に関して、細胞をトリプシン処理して遠心沈降させ、新しい培地に再懸濁した。次に細胞を、５μｇ／ｍＬトラスツズマブ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によりカスタム合成された１：１ＰＥ標識トラスツズマブ）と共に４℃で１時間インキュベートした。Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して平均蛍光強度を読み取った。

【0336】

ウェスタンブロット分析に関して、細胞をＲＩＰＡ溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含む）を使用して氷中で１５分間溶解した後、ボルテックスミキサーで攪拌し、微量遠心分離機の最高速度で、４℃で遠心沈降させた。上清を採取して、４×試料緩衝液および還元剤を試料に添加し、各試料中の総タンパク質に関して標準化した。試料を４〜１２％ビストリスゲル上で分離して、ニトロセルロースメンブレンに転写した。メンブレンを１時間ブロックし、ＨＥＲ２抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，１：１０００）と共に４℃で一晩インキュベートした。次に、メンブレンを１×ＴＢＳＴで３回洗浄し、抗マウスＨＲＰ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，１：５０００）と共に１時間インキュベートし、３回洗浄後プロービングした。

【0337】

Ｔ−ＤＭ１再発腫瘍のＨＥＲ２発現レベルは、ＦＡＣＳ（図２３Ａ）およびウェスタンブロット（図２３Ｂ）によって評価すると、対照腫瘍（Ｔ−ＤＭ１処置を行わない）と類似であった。

【0338】

Ｄ．Ｔ−ＤＭ１抵抗性は薬物排出ポンプの発現によるものではない
細胞株は、ウェスタンブロットによりＭＤＲ１を発現せず（図２４Ａ）、細胞は、ＭＤＲ−１基質である遊離の薬物０１０１に対して抵抗性ではない（図２４Ｂ）。ドキソルビシンに対する抵抗性は観察されず（図２４Ｃ）、抵抗性機構がＭＲＰ１を通して起こるのではないことが示された。しかし、細胞はなおも遊離のＤＭ１に対して抵抗性である（図２４Ｄ）。

【0339】

（実施例１６）
薬物動態（ＰＫ）
従来のまたは部位特異的ｖｃ０１０１抗体薬物コンジュゲートに対する曝露を、５または６ｍｇ／ｋｇのいずれかの用量をカニクイザルにＩＶボーラス投与後に決定した。総抗体（総Ａｂ；コンジュゲートｍＡｂおよび非コンジュゲートｍＡｂの両方の測定）およびＡＤＣ（少なくとも１つの薬物分子にコンジュゲートされたｍＡｂ）濃度を、リガンド結合アッセイ（ＬＢＡ）を使用して測定した。ＡＤＣは、ＡｃＬｙｓｖｃ０１０１を使用したＴ（ＬＣＱ０５）を除き、全ての例においてｖｃ０１０１を使用して作製した。従来のコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションではない）を使用してトラスツズマブからＡＤＣを作製した。

【0340】

カニクイザルに用量を投与後の総ＡｂおよびトラスツズマブＡＤＣ（Ｔ−ｖｃ０１０１）（５ｍｇ／ｋｇ）またはＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）部位特異的ＡＤＣ（６ｍｇ／ｋｇ）の濃度対時間プロファイルおよび薬物動態／毒性動態（図２５Ａおよび表２１）。Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）部位特異的ＡＤＣの曝露は、従来のコンジュゲートと比較して曝露および安定性の両方を増加させた。

【0341】

カニクイザルに用量を投与後のトラスツズマブ（Ｔ−ｖｃ０１０１）（５ｍｇ／ｋｇ）またはＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（ＬＣＱ０５）、Ｔ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、およびＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）部位特異的ＡＤＣ（６ｍｇ／ｋｇ）の濃度対時間プロファイルおよび薬物動態／毒性動態（図２５Ｂおよび表２１）。いくつかの部位特異的ＡＤＣ（Ｔ（ＬＣＱ０５）、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）、およびＴ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）の曝露は、従来のコンジュゲーションを使用したトラスツズマブＡＤＣと比較して高い。しかし、他の２つの部位特異的ＡＤＣ（Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）およびＴ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ））の曝露は、トラスツズマブＡＤＣより高い曝露を有さず、必ずしも全ての部位特異的ＡＤＣが、従来のコンジュゲーションを使用して作製したトラスツズマブＡＤＣより良好な薬物動態特性を有するわけではないことを示している。

【0342】

【表21】

【0343】

（実施例１７）
疎水性相互作用クロマトグラフィーによる相対的保持の値とラットにおける曝露（ＡＵＣ）との比較
疎水性は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって評価することができるタンパク質の物理特性であり、タンパク質試料の保持時間は、その相対的疎水性に基づいて異なる。ＡＤＣのＨＩＣ保持時間をそれぞれの抗体のＨＩＣ保持時間によって除算した比率である相対的保持時間（ＲＲＴ）を計算することによって、ＡＤＣをそのそれぞれの抗体と比較することができる。非常に疎水性が高いＡＤＣは、より高いＲＲＴを有し、これらのＡＤＣはまた、より多くの薬物動態不安定性、特に小さい曲線下面積（ＡＵＣ、または曝露）を有する可能性がある。様々な部位変異を有するＡＤＣのＨＩＣ値を、ラットにおける測定されたＡＵＣと比較すると、図２６の分布が観察された。

【0344】

ＲＲＴ≧１．９のＡＤＣは、より低いＡＵＣ値を示したが、より低いＲＲＴを有するＡＤＣは、より高いＡＵＣを有する傾向があり、関係は直接的ではなかった。ＡＤＣ Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１は、比較的高いＲＲＴ（平均値１．７７）を有することが観察され、したがって比較的低いＡＵＣを有すると予想された。意外にも、観察されたＡＵＣは比較的高く、したがって、疎水性データからこのＡＤＣの曝露を予測することは明白ではなかった。

【0345】

（実施例１８）
毒性試験
２つの独立した探索的毒性試験において、全体で１０匹の雄性および雌性カニクイザルを５つの用量群（１／性別／用量）に分類し、３週間毎に１回（試験日１、２２、および４３日）ＩＶ投与した。試験４６日目（３回の用量投与後３日目）に、動物を安楽死させ、プロトコールに明記された血液および組織試料を採取した。臨床所見、臨床病理学、肉眼的および顕微鏡病理評価を、生存時および剖検後に実施した。解剖学的病理評価に関して、組織病理学所見の重症度を主観的、相対的、試験特異的に基づいて記録した。

【0346】

カニクイザルにおける３および５ｍｇ／ｋｇでの探索的毒性試験において、Ｔ−ｖｃ０１０１は、初回投与後１１日目に一過性の、しかし顕著（３９０個／μｌ）から重度の（４０個／μｌから検出不能まで）好中球減少症を引き起こした。これに対し、９ｍｇ／ｋｇでは、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を投与した全てのカニクイザルが、試験したいずれの時点においても５００個／μｌを十分に超える好中球数を有し、好中球減少症は認められないかまたは最小であった（図２７）。実際に、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１を投与した動物は、ビヒクル対照と比較して１１および１４日目で平均的な好中球数（＞１０００個／μＬ）を示した。

【0347】

３および５ｍｇ／ｋｇでの骨髄において顕微鏡で調べると、Ｔ−ｖｃ０１０１を投与したカニクイザルは、化合物に関連するＭ／Ｅ比の増加を有した。骨髄／赤芽球（Ｍ／Ｅ）比の増加は、主に成熟顆粒球の増加と組み合わせた赤芽球前駆体の減少からなった。これに対し、６および９ｍｇ／ｋｇでは、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０１の６ｍｇ／ｋｇ／用量を投与した雄性動物のみが、最小から軽度の成熟顆粒球の細胞性の増加を有した（データは示していない）。

【0348】

したがって、血液学および顕微鏡データは、部位特異的変異技術に基づくＡＤＣコンジュゲート、Ｔ（ｋＫ１８３Ｃ＋Ｋ２９０Ｃ）−ｖｃ０１０がＴ−ｖｃ０１０によって惹起される骨髄毒性および好中球減少症を明らかに改善することを明白に示した。

【0349】

（実施例１９）
ＡＤＣ結晶構造
結晶構造を、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１、Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１、およびＴ（Ｋ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１に関して得た。これらの特定のＡＤＣは、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４ＣおよびＫ３３４Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ二重システインバリアントとのコンジュゲーションがＡＤＣＣ活性を消失させるが、Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃとのコンジュゲーションは活性を消失させなかったことから、結晶学のために選択した。

【0350】

コンジュゲートしたＦｃ領域を、ＡＤＣのパパイン切断を使用して結晶学のために調製した。同じ条件を使用して３つのコンジュゲートＩｇＧ１−Ｆｃ領域に関して、同じ形態の結晶を得た：１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ ５．０＋１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２＋１５％ ＰＥＧ ４Ｋ。

【0351】

ＰＤＢに寄託された野生型ヒトＩｇＧ１−Ｆｃ構造は、比較的類似であり、ＣＨ２−ＣＨ２ドメインがＡｓｎ２９７結合グリカン（炭水化物またはグリカンアンテナ）を通して互いに接すること、およびＣＨ３−ＣＨ３ドメインが、構造間で比較的一定である安定な界面を形成することを示している。Ｆｃ構造は、「閉構造」または「開構造」コンフォメーションのいずれかで存在し、脱グリコシル化Ｆｃ構造は「開構造」コンフォメーションをとり、このように、グリカンアンテナがＣＨ２領域を共に保持することを証明している。さらに、非コンジュゲートＰｈｅ２４１Ａｌａ−ＩｇＧ１ Ｆｃ変異体に関して公表された構造（Ｙｕら、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｏ ｆｉｎｅ−ｔｕｎｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、ＪＡＣＳ ２０１３）は、芳香族Ｐｈｅ残基が炭水化物を安定化することができないために、この変異によってＣＨ２グリカン界面およびＣＨ２−ＣＨ２界面の不安定化が起こることから、１つの部分的に乱れたＣＨ２ドメインを示す。

【0352】

ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」（「Ｃγ２」ドメインとも呼ばれる）は通常、約２３１位のアミノ酸から約３４０位のアミノ酸まで達している。ＣＨ２ドメインは、それが別のドメインと厳密に対を形成しないという点において独自である。むしろ、２つのＮ−結合分岐炭水化物鎖が、インタクトのネイティブＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に存在する。炭水化物は、ドメイン−ドメイン対形成の代替を提供して、ＣＨ２ドメインを安定化するために役立ち得ると推測されている（Ｂｕｒｔｏｎら、１９８５，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１〜２０６）。

【0353】

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣＨ２ドメインに対してＣ末端の一連の残基を含む（即ち、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７位のアミノ酸残基まで）。

【0354】

Ｔ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３３４Ｃ）−ｖｃ０１０１およびＴ（Ｋ２９０Ｃ＋Ｋ３９２Ｃ）−ｖｃ０１０１ Ｆｃ領域の両方の構造の解析により、それらが類似であり、Ｆｃ二量体が、１つのＣＨ２と、高度に秩序化されている両方のＣＨ３を含むことを示した（野生型Ｆｃのように）。しかし、それらはまた、グリカンが結合した乱れたＣＨ２も含む（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。１つのＣＨ２ドメインのより高度の不安定化は、グリカンアンテナに対してコンジュゲーション部位が非常に近位であることが原因であった。０１０１ペイロードの幾何学を考慮すると、Ｋ２９０、Ｋ３３４、Ｋ３９２部位のいずれかでのコンジュゲーションはＣＨ２表面から離れたグリカンの全体的な軌道を乱し、グリカンおよびＣＨ２構造そのもの、および結果としてＣＨ２−ＣＨ２界面を不安定化し得る（図２８Ｃ）。ＷＴ−Ｆｃ、Ｐｈｅ２４１Ａｌａ−Ｆｃ、または脱グリコシル化Ｆｃと比較して、これらの０１０１部位特異的にコンジュゲートした二重システイン−Ｆｃバリアントでは、より高度の不均質性が利用可能である。操作されたシステインバリアント位置を、ＦｃγＲタイプＩＩｂと複合体を形成したＷＴ−Ｆｃの構造にマップすると、Ｃ３３４でのコンジュゲーションが、ＦｃγＲＩＩｂに対する結合を直接妨害し得ることが示された（図２８Ｃ）。変異またはコンジュゲーションによって引き起こされたＣＨ２位置のこの不均質性によって、ＦｃＲＩＩｂ結合の有意な減少が起こり得る。したがって、これらの結果は、ＩｇＧ１−Ｆｃ内でのコンフォメーション不均質性、または操作されたシステインの特定の組合せに対する０１０１のコンジュゲーションのいずれか、おそらくは両方が、Ｋ３３４Ｃ部位を含む二重システインバリアントのＡＤＣＣ活性に影響を及ぼし得ることを示唆した。

【0355】

（実施例２０）
異なるコンジュゲーション部位により異なるＡＤＣ特性が起こる
Ａ．システイン変異体ＡＤＣの合成のための一般的手順
１つまたは複数の操作されたシステイン残基（表２２に示す）を組み入れるトラスツズマブ溶液を、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で調製した。ＰＢＳ、ＥＤＴＡ（０．５Ｍ保存溶液）、およびＴＣＥＰ（０．５Ｍ保存溶液）を、タンパク質の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬ、ＥＤＴＡの最終濃度が２０ｍＭ、およびＴＣＥＰの最終濃度がおよそ６．６ｍＭ（１００モル当量）となるように添加した。反応を室温で４８時間静置した後、ＧＥ ＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを使用して、製造元の指示に従ってＰＢＳに緩衝液交換した。得られた溶液をおよそ５０当量のデヒドロアスコルビン酸塩（１：１ＥｔＯＨ／水中の５０ｍＭ保存溶液）によって処置した。抗体を４℃で一晩静置した後、ＧＥ ＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムを使用して、製造元の指示に従ってＰＢＳに緩衝液交換した。いくつかの変異体について、上記の手順をわずかに変更したものを使用した。

【0356】

このように調製した抗体を、１０体積％ＤＭＡを含むＰＢＳ中で約２．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＤＭＡ中の１０ｍＭ保存溶液としてｖｃ０１０１（１０モル当量）によって処置した。室温で２時間後、混合物をＰＢＳ（上記の通り）に緩衝液交換して、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムによるサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。モノマー分画を濃縮して、濾過滅菌し、最終ＡＤＣを得た。産物の特徴に関しては以下の表２２を参照されたい。

【0357】

【表22】

【0358】

Ｂ．コンジュゲーション実施例の一般的分析方法
ＬＣＭＳ：カラム＝Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００−Ｃ４、２．１×１００ｍｍ（Ｐ／Ｎ＝１８６００４４９６）；機器＝ＳＱＤ２質量分析検出器を備えたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ；流速＝０．７ｍＬ／分；温度＝８０℃；緩衝液Ａ＝水＋０．１％ギ酸；緩衝液Ｂ＝アセトニトリル＋０．１％ギ酸。勾配は、３％Ｂから９５％Ｂを２分間、９５％Ｂで０．７５分間保持した後、３％Ｂで再度平衡にした。試料を注入直前にＴＣＥＰまたはＤＴＴによって還元した。溶出液をＬＣＭＳ（４００〜２０００ダルトン）によってモニターし、タンパク質ピークを、ＭａｘＥｎｔ１を使用して逆畳み込みした。ＤＡＲを重量平均担持として報告した。

【0359】

ＳＥＣ：カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（５／１５０ ＧＬ）；移動相：２％アセトニトリルを含むリン酸緩衝溶液、ｐＨ７．４；流速＝０．２５ｍＬ／分；温度＝周囲温度；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ。

【0360】

ＨＩＣ：カラム：ＴＳＫＧｅｌブチルＮＰＲ、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ（Ｐ／Ｎ＝Ｓ０５５７−８３５）；緩衝液Ａ＝１０ｍＭリン酸塩を含む１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ ７；緩衝液Ｂ＝１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ ７＋２０％イソプロピルアルコール；流速＝０．８ｍＬ／分；温度＝周囲温度；勾配＝０％Ｂから１００％Ｂを１２分間、１００％Ｂで２分間保持した後、１００％Ａで再度平衡にする；機器：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣ。

【0361】

Ｃ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートの疎水性の決定
表２２のＡＤＣを、様々なコンジュゲートの相対的疎水性を決定するために、疎水性相互作用クロマトグラフィー（上記の方法）によって評価した。ＡＤＣの疎水性は、総抗体曝露と相関することが報告されている。

【0362】

部位３３４、３７５、および３９２に対するコンジュゲートは、変更されていない抗体と比較して保持時間の最小のシフトを示したが、部位４２１、４４３、および３４７位に対するコンジュゲートは、保持時間の最大のシフトを示した。それぞれのＡＤＣの相対的疎水性を、ＡＤＣの保持時間を変更されていない抗体の保持時間で除算することによって計算し、このようにして「相対的保持時間」または「ＲＲＴ」を得た。約１のＲＲＴは、ＡＤＣが変更されていない抗体とほぼ同じ疎水性を有することを示している。それぞれのＡＤＣのＲＲＴを表２２に示す。

【0363】

Ｄ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートのＡＤＣ血漿安定性
ＡＤＣ試料（約１．５ｍｇ／ｍＬ）を、マウス、ラット、またはヒト血漿で希釈して、血漿中で５０μｇ／ｍＬ ＡＤＣの最終溶液を得た。試料を３７℃、５％ＣＯ_２下でインキュベートし、アリコートを３回の時点（０、２４時間、および７２時間）で採取した。血漿のインキュベーション（２５μＬ）からのそれぞれの時点のＡＤＣ試料を、ＩｇＧ０によって３７℃で１時間脱グリコシル化した。脱グリコシル化後、捕捉抗体（マウスおよびラット血漿に対して特異的な１ｍｇ／ｍＬのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃγ断片、またはヒト血漿に関して１ｍｇ／ｍＬのビオチン化抗トラスツズマブ抗体）を添加して、混合物を３７℃で１時間加熱した後、室温でさらに１時間軽く振とうさせた。Ｄｙｎａｂｅａｄ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１磁性ビーズを試料に添加して、室温で軽く振とうさせながら１時間インキュベートした。次に、試料プレートをＰＢＳ ２００μＬ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ ２００μＬ、およびＨＰＬＣ等級の水で洗浄した。結合したＡＤＣを、２体積％ギ酸（ＦＡ）５５μＬによって溶出した。各試料の５０μＬアリコートを、新しいプレートに移した後、２００ｍＭ ＴＣＥＰをさらに５μＬ添加した。

【0364】

インタクトタンパク質の分析を、ＢＥＨ３００ Ｃ４、１．７μｍ、０．３×１００ｍｍ ｉＫｅｙカラムを使用して、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）に結合させたＸｅｖｏ Ｇ２ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計によって実施した。移動相Ａ（ＭＰＡ）は、０．１体積％ＦＡの水溶液からなり、移動相Ｂ（ＭＰＢ）は、０．１体積％ＦＡのアセトニトリル溶液からなった。クロマトグラフィーによる分離を、ＭＰＢの５％〜９０％で７分間の直線勾配を使用して０．３μＬ／分の流速で行った。ＬＣカラム温度を８５℃に設定した。データ獲得は、ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアバージョン４．１によって実施した。質量獲得範囲は、７００Ｄａから２４００Ｄａであった。逆畳み込みを含むデータ分析を、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｌｙｎｘバージョン１．３３を使用して実施した。

【0365】

担持およびスクシンイミド開環（＋１８ダルトンのピーク）を経時的にモニターした。担持データを、０時間のＤＡＲと比較した％ＤＡＲ喪失として報告する。開環データを、７２時間で存在する全分子種と比較した開環種の％として報告する。いくつかの部位変異体によって、非常に安定なＡＤＣ（３３４Ｃ、４２１Ｃ、および４４３Ｃ）が得られ、いくつかの部位は、リンカー−ペイロードの有意な量を失った（３８０Ｃおよび１１４Ｃ）。開環の速度は、部位によってかなり変動した。３９２Ｃ、１８３Ｃ、および３３４Ｃなどのいくつかの部位では、非常にわずかな開環が起こったが、４２１Ｃ、３８８Ｃ、および３４７Ｃなどの他の部位では、迅速で自然発生の開環が起こった。

【0366】

迅速で自然発生の開環が起こる部位は、疎水性が低減した、および／またはＰＫ曝露が増加したコンジュゲートを生成するために有用であり得る。この知見は、環の安定性が血漿での安定性と相関するという一般的な理解とは反対である。したがって、一部の態様において、部位４２１Ｃ、３８８Ｃ、および３４７Ｃの１つまたは複数でのコンジュゲーションは、高い疎水性を有するリンカー−ペイロードを使用する場合、特に有利であり得る。一部の態様において、高い疎水性は、相対的保持時間（ＲＲＴ）の値（ＨＩＣによって測定）が１．５またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が１．７またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が１．８またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が１．９またはそれ超である。一部の態様において、高い疎水性はＲＲＴ値が２．０またはそれ超である。

【0367】

【表23】

【0368】

Ｅ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートのグルタチオン安定性
ＡＤＣ試料を、グルタチオン水溶液で希釈して、リン酸緩衝液、ｐＨ７．４中で最終ＧＳＨ濃度０．５ｍＭおよび最終タンパク質濃度約０．１ｍｇ／ｍＬを得た。次に、試料を３７℃でインキュベートし、ＤＡＲ（Ｔ−０、Ｔ−３日、Ｔ−６日）を決定するために、アリコートを３つの時点で除去した。それぞれの時点のアリコートをＴＣＥＰで処理し、実施例２０Ａに記載の方法に従ってＬＣ−ＭＳによって分析した。

【0369】

担持およびスクシンイミド開環（＋１８ダルトンのピーク）を経時的にモニターした。担持データを、０時間のＤＡＲと比較した％ＤＡＲ喪失として報告する（表２４）。開環データを、７２時間で存在する全分子種と比較した開環種の％として報告する。いくつかの部位変異体によって、非常に安定なＡＤＣ（３３４Ｃ、４２１Ｃ、および４４３Ｃ）が得られたが、いくつかの部位は、リンカー−ペイロードの有意な量を失った（３８０Ｃおよび１１４Ｃ）。開環速度は、部位によってかなり変動した。３９２Ｃ、１８３Ｃ、および３３４Ｃなどのいくつかの部位では、非常にわずかな開環が起こったが、４２１Ｃ、３８８Ｃ、および３４７Ｃなどの他の部位ではかなりの開環が起こった。このアッセイの結果は、血漿での安定性結果と非常に良好に相関し（実施例２０．Ｄ）、チオールによって媒介される脱コンジュゲーションが血漿中でのペイロード喪失の主要な経路であることを示唆している。まとめると、これらの結果は、チオールによって媒介される脱コンジュゲーションを通して容易に失われる、３３４、４４３、２９０、および３９２などの特定の部位が、ペイロード−リンカーのコンジュゲーションにとって特に有用であり得ることを示唆している。そのようなペイロード−リンカーは、共通のｍｃおよびｖｃ連結を利用するリンカーを含む（例えば、ｖｃ−１０１、ｖｃ−ＭＭＡＥ、ｍｃ−ＭＭＡＦなど）。

【0370】

【表24】

【0371】

Ｆ．マウスにおける選択した部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートの薬物動態評価
非担癌無胸腺雌性ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウス（６〜８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た。マウスを使用する手順は全て、確立されたガイドラインに従って施設内動物飼育使用委員会の承認を受けた。マウス（ｎ＝３または４）に、抗体構成要素に基づいてＡＤＣの３ｍｇ／ｋｇ用量を１回静脈内投与した。血液試料を各マウスの尾静脈を介して、投与後０．０８３、６、２４、４８、９６、１６８、および３３６時間に採取した。ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体を捕捉のために使用し、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＴ_ａｂの検出のために使用し、または抗ペイロード抗体をＡＤＣの検出のために使用するＬＢＡによって、総抗体（Ｔ_ａｂ）およびＡＤＣ濃度を決定した。各動物の血漿中濃度データを、Ｗａｔｓｏｎ ＬＩＭＳバージョン７．４（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して分析した。曝露は部位に基づいて変化した。２９０Ｃおよび４４３Ｃ変異体から作製したＡＤＣは、最低の曝露を示したが、１８３Ｃおよび３９２Ｃ部位から作製したＡＤＣは、最高の曝露を示した。多くの応用に関して、治療剤の持続の増加に至ることから、高い曝露を有する部位が好ましい場合があり得る。しかし、ある特定の応用に関して、より低い曝露を有するコンジュゲート（２９０Ｃおよび４４３Ｃなど）を使用することが好ましい場合があり得る。特に、より低い曝露（即ち、より低いＰＫ）の応用は、限定されないが脳、ＣＮＳ、および眼での使用を含み得る。適応は、がん、特に脳、ＣＮＳ、および／または眼のがんを含む。

【0372】

【表25】

【0373】

Ｇ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートのカテプシン切断
カテプシンＢを、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２中で６ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を使用して３７℃で１５分間活性化した。次に活性化カテプシンＢ ５０ｎｇを１ｍｇ／ｍＬ ＡＤＣ ２０μＬと、２ｍＭ ＤＴＴの最終濃度、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２で混合した。反応を、２５０ｍＭホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５中での１０μＭ Ｅ−６４システインプロテアーゼ阻害剤を使用して３７℃で２０分間、１時間、２時間、および４時間インキュベートすることによってクエンチした。アッセイ後、ＴＣＥＰを使用して試料を還元し、実施例２１Ａに記載の条件を使用してＬＣ／ＭＳによって分析した。データは、リンカー切断速度がコンジュゲーションの部位に大きく依存することを示した。４４３Ｃ、３８８Ｃ、および２９０Ｃなどの特定の部位は非常に速やかに切断されるが、３３４Ｃ、３７５Ｃ、および３９２Ｃなどの他の部位は、非常にゆっくりと切断される。一部の態様において、遅い切断を受ける部位にコンジュゲートすることが有利であり得る。他の態様において、急速な切断が好ましい。例えば、エンドソームで費やされる時間を低減させるためにペイロードを急速に放出することが好ましくなり得る。さらなる態様において、急速なペイロード切断によって、特定の固形腫瘍などのように、コンジュゲートした分子が侵入することができない場所で、ペイロードが有利に侵入することが可能となる。さらなる態様において、急速な切断によって、ペイロードを抗体の抗原を発現しない隣接する細胞に送達することができ、このように例えば不均質な腫瘍の処置を可能にする。

【0374】

【表26】

【0375】

Ｈ．部位特異的ｖｃ０１０１コンジュゲートの熱安定性
ＡＤＣを、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＡＤＣを密封バイアルに入れて、４５℃に加熱した。経時的に形成される高分子量種（ＨＭＷＳ）および低分子量種（ＬＭＷＳ）のレベルをサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって評価するために、アリコート（１０μＬ）を１週間毎に除去した。ＳＥＣ条件を実施例２１Ａに概要する。これらの条件下で、モノマーは、およそ３．６分で溶出した。モノマーピークの左に溶出するいかなるタンパク質材料もＨＭＷＳとして計数され、モノマーピークの右に溶出するいかなるタンパク質材料もＬＭＷＳとして計数された。結果を以下の表２７に示す。１８３Ｃ、３７５Ｃ、および３３４Ｃなどの選択されたＡＤＣは、優れた熱安定性を示したが、４４３Ｃおよび３９２Ｃ＋４４３Ｃなどの他のＡＤＣは、有意な分解を示した。

【0376】

【表27】

【0377】

Ｉ．様々なｖｃ０１０１部位変異体の有効性
抗体−薬物コンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ有効性試験を、Ｎ８７細胞株を使用する標的発現異種移植片モデルにおいて実施した。５０％ｍａｔｒｉｇｅｌ中でおよそ７．５百万個の腫瘍細胞を６〜８週齢のヌードマウスの皮下に移植し、腫瘍サイズを２５０〜３５０ｍｍ^３に達成させる。薬物を、尾静脈注射によりボーラス投与した。動物に１０、３、または１ｍｇ／ｋｇ抗体薬物コンジュゲートを、４日毎に１回、全体で４回（１、５、９および１３日目）注射した。全ての実験動物を体重変化に関して毎週モニターする。腫瘍の体積をキャリパー装置によって最初の５０日間、週に２回測定し、その後は週に１回測定し、以下の式：腫瘍体積＝（長さ×幅^２）／２によって計算する。腫瘍体積が２５００ｍｍ^３に達すると、動物を人道的に屠殺した。腫瘍サイズは、一般的に処置の最初の１週間後に減少することが観察される。処置の中止後（処置後１００日まで）、腫瘍の再成長に関して動物を継続的にモニターした。３ｍｐｋ投与群からのデータを図２９に示す。３８８Ｃおよび３４７Ｃ変異体から生成したＡＤＣは、３３４Ｃ、１８３Ｃ、３９２Ｃ、および４４３Ｃ変異体からのＡＤＣよりわずかに低い効力を示した。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図7-4】

【図7-5】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図10-1】

【図10-2】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図15-1】

【図15-2】

【図16】

【図17】

【図18-1】

【図18-2】

【図19-1】

【図19-2】

【図19-3】

【図19-4】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22-1】

【図22-2】

【図23】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28-1】

【図28-2】

【図28-3】

【図29】

【図30】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]