特許 6980196 ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6980196

(24)【登録日】2021年11月19日

(45)【発行日】2021年12月15日

(54)【発明の名称】ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20211202BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20211202BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20211202BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20211202BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20211202BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20211202BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20211202BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/62 ZZNA

   C12N5/10

   A61P35/00

   A61P37/02

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 V

   A61K45/00

   A61K48/00

   A61K35/12

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C07K14/435

   C12N7/01

【請求項の数】15

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2018-547384(P2018-547384)

(86)(22)【出願日】2017年3月7日

(65)【公表番号】特表2019-512231(P2019-512231A)

(43)【公表日】2019年5月16日

(86)【国際出願番号】EP2017055373

(87)【国際公開番号】WO2017153438

(87)【国際公開日】20170914

【審査請求日】2019年12月20日

(31)【優先権主張番号】16159099.7

(32)【優先日】2016年3月8日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】515098691

【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート チューリッヒ

(73)【特許権者】

【識別番号】515160921

【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート バーゼル

(74)【代理人】

【識別番号】100149032

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 敏明

(72)【発明者】

【氏名】マロクイン ベラウザラン，オシリス

(72)【発明者】

【氏名】レナー，クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ペトラウシュ，ウルフ

【審査官】 玉井 真人

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００７／０１１０４４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１５３９６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０３／０１８７４５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 特表２００５−５０３１５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００４／０２９０７１（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 中国特許出願公開第１０３１８４２９１（ＣＮ，Ａ）

【文献】 国際公開第９９／０５８５５７（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２０１６／１２４６６１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１８−５１２１１３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 TRENDS in Immunology, 2007, Vol.28, pp.115-123

【文献】 TRENDS in Immunology, 2005, Vol.26, pp.41-47

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体であって、前記オープンコンフォーマーの単量体はＨＬＡ−Ｂ５７重鎖、Ｆｃ（結晶化可能な断片）ポリペプチド及び前記ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖と前記Ｆｃポリペプチドとを連結するアミノ酸リンカーを含む、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体。

【請求項2】

ペプチドエピトープ断片をさらに含む、請求項１に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体。

【請求項3】

前記ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖がＨＬＡ−Ｂ５７アルファ１、２及び３ドメインのみからなる、請求項１又は２に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体。

【請求項4】

前記ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖が膜貫通ドメインを含み、かつ、細胞内ドメイン（細胞質尾部）を含まない、請求項１又は２に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体。

【請求項5】

前記ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖が、表１で特定される配列のいずれか一つと比較して、≧９０％の配列同一性を有する、請求項１又は２に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体。

【請求項6】

前記Ｆｃポリペプチドが、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）のいずれか１つから選択される重鎖定常領域Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体。

【請求項7】

前記アミノ酸リンカーが１〜５０個のアミノ酸を含み、前記ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖を１つの単一ポリペプチド鎖として前記Ｆｃポリペプチドに連結する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体を含む医薬用組成物。

【請求項9】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体を含む、癌の治療又は予防のための医薬用組成物。

【請求項10】

ａ．請求項１〜７のいずれか１項で特定されるＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー二量体、及び
ｂ．チェックポイント阻害剤及び／又はチェックポイントアゴニスト剤、
を含む併用薬剤。

【請求項11】

ａ．前記チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２との相互作用の阻害剤から選択され；又は
ｂ．前記チェックポイントアゴニスト剤は、４−１ＢＢへの結合を介して免疫応答を増強する抗体である、
請求項１０に記載の併用薬剤。

【請求項12】

請求項１〜７のいずれか１項に記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーの単量体をコードする、核酸分子。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。

【請求項14】

哺乳動物細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下で、請求項１２に記載の核酸分子を含むウイルス。

【請求項15】

請求項１２に記載の核酸分子を含むインビトロで遺伝子改変された宿主細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーの使用に関し、特に、癌の予防又は治療における使用、及び免疫調節剤としての使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、古典的な主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質ファミリーに属する。ＨＬＡ複合体は、免疫系が、ウイルスや細菌などの外来の侵入物質によって作られたタンパク質から身体のタンパク質を区別する働きがある。ヒトには、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃとして知られる３つの主要な古典的ＭＨＣクラスＩ遺伝子がある。古典的ＨＬＡ遺伝子は、多くの可能な変異を有し、各人の免疫系が広範囲の外来の侵入物質に反応することを可能にする。いくつかのＨＬＡ遺伝子には、数多くの同定された型（対立遺伝子）があり、それぞれに特定の番号が与えられている（ＨＬＡ−Ｂ５７など）。密接に関連する対立遺伝子は、共に分類され、例えば、少なくとも８２個の非常に類似した対立遺伝子が、ＨＬＡ−Ｂ５７のサブタイプである。これらのサブタイプは、ＨＬＡ−Ｂ^＊５７０１からＨＬＡ−Ｂ^＊５７８２と、密接に関連するＨＬＡ−Ｂ^＊５８０１と命名される。

【0003】

古典的ＭＨＣ−Ｉ分子（ヒトではＨＬＡ−Ｉと命名）は、β２−ミクログロブリン（β２ｍ）及び小ペプチドと非共有結合的に会合する３つの細胞外ドメイン（α１、α２及びα３）を有する膜結合重鎖を含む三量体構造である。ＨＬＡ−Ｉ重鎖は、β２−ミクログロブリン又はペプチドに結合しない形態で存在し得る。これらの形態は、オープンコンフォーマー（ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）と呼ばれる。

【0004】

他のすべてのＨＬＡ分子のように、ＨＬＡ−Ｂ５７の主な機能は、適応免疫応答の一部として、細胞由来ペプチドをＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示することである。正常な生理学的条件下では、ＨＬＡ−Ｂ５７分子は、Ｂ５７重鎖、β２−ミクログロブリン、及び自己タンパク質、ウイルス又は細菌に由来するペプチドからなるヘテロ三量体複合体を形成する。この点で、ＨＬＡ−Ｂ５７は他のすべてのクラスＩＨＬＡ対立遺伝子と似ている。しかし、ＨＬＡ分子は、β２ｍ−ミクログロブリン及びペプチドを欠く遊離重鎖として細胞中に存在することもでき、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーと呼ぶことができる（Ａｒｏｓａら、オープンコンフォーマー：ＭＨＣ−Ｉ分子の隠れた顔、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ ３月；２８（３）：１１５−２３）。

【0005】

癌は、制御されていない及び破壊的な成長を受けている身体の異常細胞によって特徴付けられる疾患群である。癌細胞は体の周りに広がり、転移して腫瘍を形成する；この成長パターンは悪性と呼ばれる。癌は、外科手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、標的療法及び免疫療法によって治療することができる。治療の選択は、癌の種類、癌の段階（その広がり具合）、年齢、健康状態、及び追加の個人的特徴に依存する。癌のための単独治療はなく、患者はしばしば療法と緩和ケアの併用を受ける。

【0006】

癌免疫療法は、患者自身の免疫系を誘導して腫瘍と戦うように設計された多様な治療戦略を指し、多様な突然変異の蓄積を含む癌の進行を免疫系によって監視するという見識に基づいている。免疫療法は、免疫系の特定の細胞成分の活性を刺激するか、又は癌細胞によって産生される免疫応答を抑制するシグナルを相殺する（Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１５ ８月；１４（８）：５６１−８４）。

【0007】

異なる型の免疫細胞が癌に対する免疫応答に関与している。白血球（免疫組織）の画分内で最も有名な細胞は：Ｔ細胞（細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ−細胞、ＴヘルパーＣＤ４^＋細胞−Ｔｈ１、Ｔｈ２及びＴｈ１７表現型）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、マクロファージ（炎症促進性Ｍ１型及び腫瘍促進性Ｍ２型）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）及び樹状細胞（ＤＣ）である。これらの免疫細胞は、腫瘍の中心、浸潤マージン（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍａｒｇｉｎ）又は隣接する三次リンパ様構造に位置し得る（Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１２、４月：１２、２９８−３０６）。

【0008】

免疫微小環境の密度及び組成は、患者と腫瘍の間で異質である。細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｔｈ１表現型細胞及びＭ１型マクロファージの浸潤は、多くの場合、免疫療法への良好な臨床的結果及び応答につながることが多いが、一般にＭ２表現型マクロファージ及び骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）による腫瘍浸潤は腫瘍進行を促進することが現在十分に確立されている。他のリンパ球及び骨髄系細胞集団の臨床的影響は一貫性が低く、腫瘍の種類及び段階に依存するようである。Ｔｈ１７及びＮＫ細胞の存在、及び腫瘍浸潤物におけるＴｒｅｇ細胞の不存在／減少は、いくつかの癌適応症における良好な結果と相関する（Ｇｉｒａｌｄｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１４，２７：８−１５）。白血球浸潤と臨床的結果の間の均衡の一般的概要を、図１に概説する（Ｂｅｃｈｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１６，３９：１７−１３）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ａｒｏｓａら、オープンコンフォーマー：ＭＨＣ−Ｉ分子の隠れた顔、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００７ ３月；２８（３）：１１５−２３

【非特許文献2】Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ ２０１５ ８月；１４（８）：５６１−８４

【非特許文献3】Ｆｒｉｄｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１２、４月：１２、２９８−３０６

【非特許文献4】Ｇｉｒａｌｄｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１４，２７：８−１５

【非特許文献5】Ｂｅｃｈｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１６，３９：１７−１３

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

全体として、Ｍ１型マクロファージ、細胞傷害性ＣＤ８Ｔ細胞、及びＴｈ１細胞の浸潤に有利な腫瘍の免疫系を調節し、及び／又はＭＤＳＣ及びＭ２型マクロファージの浸潤を減少させることは、ここで検討されるＢ５７_２−Ｆｃタンパク質の使用を伴う癌を治療するための壮大な治療手段となる。

【課題を解決するための手段】

【0011】

用語と定義
アミノ酸配列は、アミノ末端からカルボキシル末端へ与えられる。配列位置の大文字は、１文字コードのＬ−アミノ酸を指す（Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版 ｐ．２１）。

【0012】

本明細書中で使用される用語「オープンコンフォーマー（ｏｐｅｎ ｃｏｎｆｏｒｍｅｒ）」とは、単量体又は二量体（ホモ二量体又はヘテロ二量体）のいずれかとして、β２−ミクログロブリンに会合しない単離されたＨＬＡ重鎖分子をいう。本明細書中に開示されるオープンコンフォーマーの特定の実施形態は、ＨＬＡ重鎖が安定化ポリペプチド領域、特に結晶性断片免疫グロブリンドメインに共有結合される融合タンパク質単量体又は二量体である。

【0013】

本明細書中で使用される用語「配列同一性」及び「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの整列した配列を比較することによって決定される値を指す。比較のために配列のアラインメントを求める方法は当技術分野で周知である。比較のための配列のアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌｌ．Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）のグローバルアライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似検索法による検索によって、又はＣＬＵＳＴＡＬ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されないこれらアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって達成され得る。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、例えば、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に入手可能である。アミノ酸配列の比較の一例は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムであり：期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲での最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１；拡張：１；構成調整：条件付き構成スコアマトリクス調整；のデフォルト設定を使用する。このような核酸配列の比較の一例は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムであり：期待閾値：１０；ワードサイズ：２８；クエリ範囲での最大一致：０；一致／不一致スコア：１．−２；ギャップコスト：リニア；のデフォルト設定を使用する。特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性値は、それぞれタンパク質及び核酸の比較の上記既定のパラメーターを用いてＢＬＡＳＴプログラム群（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を使用して得られた値を指す。

【0014】

本明細書中で使用される用語「主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＭＨＣ）」は、細胞生物学及び生化学の分野で知られている意味で使用される；それはタンパク質のエピトープとも呼ばれる特定の断片（ペプチド）を提示する細胞表面分子を指す。ＭＨＣ分子の２つの主要クラス：クラスＩ及びクラスＩＩが存在する。

【0015】

ＭＨＣクラスＩ重鎖分子は、通常、非ＭＨＣ分子β２−ミクログロブリンのユニットに連結されたアルファ鎖として生じる（すなわち、オープン型ではない場合）。アルファ鎖は、Ｎ末端からＣ−末端への方向に、シグナルペプチド、３つの細胞外ドメイン（Ｎ末端にα１を有するα１〜３）、膜貫通ドメイン及びＣ末端細胞質尾部を含む。表示又は提示されるペプチドは、α１／α２ドメインの中央領域のペプチド結合溝によって保持される。

【0016】

本明細書中で使用される用語「β２−ミクログロブリンドメイン」は、細胞生物学及び生化学の分野で知られている意味で使用される；これは、ＭＨＣクラスＩヘテロ二量体分子の一部である非ＭＨＣ分子を指す。換言すれば、それはＭＨＣクラスＩヘテロ二量体のβ鎖を構成する。

【0017】

本明細書中で使用される用語「ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）」は、細胞生物学及び生化学の分野で知られている意味で使用される；それは、ヒトＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子座を指す。ＨＬＡにおける３つの主要なＭＨＣクラスＩ遺伝子は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−Ｃであり、これらの遺伝子の全ては様々な対立遺伝子数を有する。例えば、ＨＬＡ−Ｂは既知の対立遺伝子３５９０を有する。密接に関連する対立遺伝子は、特定の対立遺伝子のサブグループに群別される。例えば、ＨＬＡシステムの因子に関するＷＨＯ命名委員会によれば、対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ５７は、ＨＬＡ−Ｂ^＊５７：０１：０１〜ＨＬＡ−Ｂ^＊５７：８２と標識された１００以上の密接に関連する対立遺伝子を有する。すべての既知のＨＬＡ遺伝子及びそれらのそれぞれの対立遺伝子の完全配列又は部分配列は、ＩＭＧＴ／ＨＬＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｐｄ／ｉｍｇｔ／ｈｌａ／）のような専門データベースで当業者に利用可能であり、本明細書の表１に示される。

【0018】

本明細書中で使用される用語「チェックポイント阻害剤」又は「チェックポイント阻害抗体」は、当該分野において免疫チェックポイント機構として知られているものの一部にあるとおり、Ｔ細胞活性化後のＴ細胞阻害をもたらすシグナルカスケードを破壊することができる薬剤、特に抗体（又は抗体様分子）を包含することを意味する。チェックポイント阻害剤又はチェックポイント阻害抗体の非限定的な例には、ＣＴＬＡ−４（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１６４１０）、ＰＤ−１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ１５１１６）、ＰＤ−Ｌ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＮＺＱ７）、Ｂ７Ｈ３（ＣＤ２７６；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５ＺＰＲ３）、Ｔｉｍ−３、Ｇａｌ９、ＶＩＳＴＡ、Ｌａｇ３に対する抗体を含む。

【0019】

本明細書中で使用される用語「チェックポイントアゴニスト剤」又は「チェックポイントアゴニスト抗体」は、当該分野において免疫チェックポイント機構として知られているものの一部にあるとおり、Ｔ細胞活性化に至るシグナルカスケードに関与することができる、特に抗体（又は抗体様分子）であるが、これに限定されない薬剤を包含することを意味する。Ｔ細胞活性化を刺激することが知られている受容体の非限定的な例には、ＣＤ１２２及びＣＤ１３７（４−１ＢＢ；Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ０７０１１）が含まれる。「チェックポイントアゴニスト剤」又は「チェックポイントアゴニスト抗体」という用語は、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（Ｏ×４０）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８に対するアゴニスト抗体を包含する。

【0020】

本明細書中で使用される用語「抗体」は、細胞生物学及び免疫学の分野で知られている意味で使用される；それは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）のいずれかの抗原結合断片又はその一本鎖及び、関連又は誘導された構築物に限定されないが、これらを含むすべての抗体を指す。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）及び重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶ_Ｌと略す）及び軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣ_Ｌからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを構成する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0021】

本明細書中で使用される用語「抗体様分子」は、高い親和性／ｋｄ≦１０Ｅ−８ｍｏｌ／ｌで別の分子又は標的に特異的に結合することができる分子を指す。抗体様分子は、抗体の特異的結合と同様にその標的に結合する。用語「抗体様分子」は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（モレキュラーパートナーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ）、チューリッヒ）、アルマジロリピートタンパク質に由来するポリペプチド、ロイシンリッチリピートタンパク質に由来するポリペプチド、及びテトラリコペプチドリピートタンパク質に由来するポリペプチドのように、リピートタンパク質を包含する。

【0022】

用語「抗体様分子」は、プロテインＡドメインに由来するポリペプチド、フィブロネクチンドメインＦＮ３に由来するポリペプチド、コンセンサスフィブロネクチンドメインに由来するポリペプチド、リポカリンに由来するポリペプチド、ジンクフィンガーに由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）に由来するポリペプチド、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）に由来するポリペプチド、ＰＤＺドメインに由来するポリペプチド、γ−クリスタリンに由来するポリペプチド、ユビキチンに由来するポリペプチド、システインノットポリペプチドに由来するポリペプチド、及びノッティンに由来するポリペプチドをさらに包含する。

【0023】

用語「プロテインＡドメイン由来ポリペプチド」は、プロテインＡの誘導体であり、免疫グロブリンのＦｃドメイン及びＦａｂ領域に特異的に結合することができる分子を指す。

【0024】

用語「アルマジロリピートタンパク質」は、少なくとも１つのアルマジロリピートを含むポリペプチドを指し、アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成するαヘリックスの対によって特徴付けられる。

【0025】

本明細書中で使用される用語「結晶化可能断片（Ｆｃ）領域」は、細胞生物学及び免疫学の分野で知られている意味で使用される；それは、ジスルフィド結合によって共有結合されたＣ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３ドメインを含む２つの同一の重鎖断片を含む抗体の画分を指す。

【0026】

本明細書の文脈において、用語「二量体」は、２つのサブユニットからなるユニットを指す。

【0027】

本明細書中で使用される用語「ホモ二量体」は、同じクラスのサブユニットの同一又は非常に類似したメンバーである２つのサブユニットからなる二量体を意味する。ホモ二量体の一例は、ＨＬＡ−Ｂ５７対立遺伝子のリストから独立して選択された２つのサブユニットからなる二量体であろう。特定の実施形態では、ホモ二量体は、２つの同一のＨＬＡ−Ｂ５７対立遺伝子からなる。

【0028】

本明細書中で使用される用語「アミノ酸リンカー」は、一本鎖ポリペプチドを生成するために、２つのポリペプチドを連結するため使用される可変長のポリペプチドをいう。本明細書で特定される本発明の実施に有用なリンカーの例示的な実施形態は、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０又は５０個のアミノ酸からなるオリゴペプチド鎖である。アミノ酸リンカーの非限定的な例は、ＨＬＡ−Ｂ５７ポリペプチドをＦｃドメインと連結するポリペプチドＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１０９）である。

【0029】

本発明は、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】図１は、免疫細胞の浸潤に基づく腫瘍の３つの異なる分類を示す概略図である。「免疫原性」の腫瘍は、豊富な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）浸潤、Ｍ１型マクロファージ、三次リンパ系構造（ＴＬＳ）の存在及び低／中度の血管新生を特徴とするが、同時に患者の最も長い生存に関連する。「免疫無視」の腫瘍は、免疫細胞による浸潤の欠如、低／中度の血管新生及び中間的予後によって特徴付けられる。最後に、「炎症性」の腫瘍は、ＴＬＳの非存在下での豊富なＣＴＬ、Ｍ２マクロファージによる顕著な浸潤、重篤な血管新生及び予後不良を特徴とする（Ｂｅｃｈｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１６，３９：１７−１３）。

【図2AB】図２は、Ｂ５７_２−ＦｃがマウスＣＤ４^＋Ｔ細胞をｉＴｒｅｇに変換するのをブロックすることを示す。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞と用量依存的にＢ５７_２−Ｆｃをインキュベートすることにより、ｉＴｒｅｇへの変換が阻止される。Ａ）Ｂ５７_２−Ｆｃは、用量依存性（μｇ／２００μＬ）（Ｃ）においてＣＤ２５（Ｔｒｅｇの系統マーカー）の発現を遮断する。Ｂ）Ｂ５７_２−Ｆｃは、用量依存性（μｇ／２００μＬ）（Ｄ）においてＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇの分化マーカー）の発現を遮断する。対照Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、アイソタイプ、ＴＧＦβ及びＩＬ−２を補充した培地及び補充なしの培地は、ｉＴｒｅｇ変換におけるＢ５７_２−Ｆｃの特異的影響を実証する。

【図2CD】図２は、Ｂ５７_２−ＦｃがマウスＣＤ４^＋Ｔ細胞をｉＴｒｅｇに変換するのをブロックすることを示す。ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞と用量依存的にＢ５７_２−Ｆｃをインキュベートすることにより、ｉＴｒｅｇへの変換が阻止される。Ａ）Ｂ５７_２−Ｆｃは、用量依存性（μｇ／２００μＬ）（Ｃ）においてＣＤ２５（Ｔｒｅｇの系統マーカー）の発現を遮断する。Ｂ）Ｂ５７_２−Ｆｃは、用量依存性（μｇ／２００μＬ）（Ｄ）においてＦｏｘＰ３（Ｔｒｅｇの分化マーカー）の発現を遮断する。対照Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、アイソタイプ、ＴＧＦβ及びＩＬ−２を補充した培地及び補充なしの培地は、ｉＴｒｅｇ変換におけるＢ５７_２−Ｆｃの特異的影響を実証する。

【図3AB】図３は、Ｂ５７_２−Ｆｃが用量依存性においてネズミＴｒｅｇの抑制を損なうことを示す。Ａ）ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇからの増殖のヒストグラムであり、Ｂ５７_２−ＦｃがマウスＴｒｅｇの抑制を阻止し、かつＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を可能にすることを示す。対照Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ及びアイソタイプは、マウスＴｒｅｇの抑制機能を変化させない。Ｂ）異なる濃度のＢ５７_２−Ｆｃ（μｇ／２００μＬ）におけるネズミＣＤ８^＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇ抑制％である。

【図4ABC】図４は、Ｂ５７_２−Ｆｃがリンパ腫Ｔ細胞を抑制することを示す。Ａ−Ｃ）は、（Ａ）対照アイソタイプ、（Ｂ）対照Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、及び（Ｃ）Ｂ５７_２−Ｆｃの存在下で細胞の増殖を測定する抑制アッセイである。Ｂ５７_２−Ｆｃは、対照細胞株と比較して、用量依存性（μｇ／２００μＬ）において、ヒト（Ｊｕｒｋａｔ）及びマウス（ＥＧ．７）リンパ腫細胞株を抑制する。

【図5ABCDEF】図５は、白血球集団の異なる免疫調節受容体に対するＢ５７_２−Ｆｃの相互作用を示す。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）による、Ａ）ＫＩＲ３ＤＬ１（ＮＫ細胞及びＴ細胞のサブセットで発現される）；Ｂ）ＫＩＲ３ＤＬ２（ＮＫ細胞及びＴ細胞のサブセットで発現される）；Ｃ）ＫＩＲ３ＤＬ３（ＮＫ細胞及びＴ細胞のサブセットで発現される）；Ｄ）ＬＩＬＲＢ１（ＮＫ細胞、Ｔ細胞、単球及びマクロファージの集団で発現）；Ｅ）ＬＩＬＲＢ２（大部分はマクロファージ及びＭＤＳＣで発現される）、及びＦ）ＰｉｒＢ（ネズミ相同体対ＬＩＬＲＢ２）である。

【図6AB】図６は、Ｂ５７−Ｆｃ及びβ２ｍＤＮＡカセットの概略図及びＣＨＯ細胞からのＢ５７−β２ｍ−Ｆｃ分子の発現を示す。Ａ）ヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクターカセットに挿入されたＨＬＡ−Ｂ５７重鎖のα１、２及び３ドメイン；及び別のベクターカセットに挿入されたヒトβ２マイクログロブリン。Ｂ）チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞でのトランスフェクションは、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃタンパク質の細胞外生産のために、１：１の比率でＢ５７−Ｆｃベクター＋β２ｍベクターの両方を使用して行う。標準的な抗体精製の手順を用いて上清を回収し、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃを精製した。β２ｍをＢ５７−β２ｍ−Ｆｃ複合体から除去し、その後のＢ５７−Ｆｃ単量体をリフォールディングしてＢ５７_２−Ｆｃホモ二量体を形成する。

【図7ABC】図７は、Ｂ５７_２−ＦｃとＰＤ−１抗体との併用が、Ｃ３８マウス同系結腸癌モデルにおける腫瘍のサイズを縮小することを示す。Ａ）結腸癌細胞（Ｃ３８）の注射時点及び化合物注射の実験設計。Ｂ）処置群（ｎ＝６）の平均腫瘍体積ｍｍ^３。Ｃ）アイソタイプと比較したＢ５７_２−Ｆｃ及びＰＤ−１処置群の腫瘍阻害のパーセンテージ（％）。物質注射の実験設計は以下の通りであった：ビヒクルＰＢＳ Ｑ３Ｄ×７、アイソタイプ（１０ｍｇ／Ｋｇ）Ｑ３Ｄ×７；Ｂ５７_２−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）Ｑ３Ｄ×７；ＰＤ−１ｂｉｗｋ×２（２００μｇ）；及びＢ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄ×７及びｂｉｗｋ×２）。腫瘍体積を、平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）により解析し、続いてボンフェローニポストホック（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ）分析、^＊＊ｐ＜０．０１を行った。Ｑ＝注射間日数。Ｄ×＝注射回数、ｂｉｗｋ＝週に２回。

【図8AB】図８は、Ｂ５７_２−ＦｃとＰＤ−１抗体との併用が、膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスモデルにおける腫瘍のサイズを縮小することを示す。Ａ）膵臓癌細胞（Ｐａｎ０２）の注射時点及び化合物注射の実験設計。Ｂ）Ｂ５７_２−Ｆｃ及び／又はＰＤ−１での処置群（ｎ＝８）の平均腫瘍体積ｍｍ^３。物質注射の実験設計は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；Ｂ５７_２−Ｆｃ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；ＰＤ−１（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；及びＢ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（ｂｉｗｋ×３）。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析により解析し、続いてボンフェローニポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を行った。ｂｉｗｋ＝週に２回。

【図9AB】図９は、Ｂ５７_２−ＦｃとＰＤ−Ｌ１抗体との併用が、膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスモデルにおける腫瘍のサイズを縮小することを示す。Ａ）Ｂ５７_２−Ｆｃ及び／又はＰＤ−Ｌ１での処置群（ｎ＝８）の平均腫瘍体積ｍｍ^３。Ｂ）アイソタイプと比較したＢ５７_２−Ｆｃ、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１処置群の腫瘍阻害のパーセンテージ。物質注射の実験設計は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；Ｂ５７_２−Ｆｃ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；ＰＤ−Ｌ１（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；及びＢ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−Ｌ１（ｂｉｗｋ×３）。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析により解析し、続いてボンフェローニポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を行った。ｂｉｗｋ＝週に２回。

【図10ABC】図１０は、フローサイトメトリーによるＢ５７_２−Ｆｃ及びＰＤ−１を処置した膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスの腫瘍における浸潤した白血球の免疫組織解析を示す。腫瘍に浸潤した関連する白血球を分析した：Ａ）ＮＫ細胞；Ｂ）ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比；及びＣ）骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）；白血球数を平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析により解析し、続いてトルコポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５を行った。

【図11AB】図１１は、フローサイトメトリーによるＢ５７_２−Ｆｃ及びＰＤ−１を処置した膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスの腫瘍における浸潤した白血球の免疫組織解析（図１０からの続き）を示す。腫瘍に浸潤した関連する白血球を分析した：Ａ）マクロファージ、及びＢ）マクロファージＭ１／Ｍ２の比。白血球数を、平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析により解析し、続いてトルコポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１を行った。

【図12ABC】図１２は、フローサイトメトリーによるＢ５７_２−Ｆｃ及びＰＤ−Ｌ１を処置した膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスの腫瘍における浸潤した白血球の免疫組織解析を示す。腫瘍に浸潤した関連する白血球を分析した：Ａ）ＮＫ細胞；Ｂ）ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比；及びＣ）骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。白血球数を平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析により解析し、続いてトルコポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５を行った。

【図13AB】図１３は、フローサイトメトリーによるＢ５７_２−Ｆｃ及びＰＤ−Ｌ１を処置した膵臓（Ｐａｎ０２）癌マウスの腫瘍における浸潤した白血球の免疫組織解析（図１２からの続き）を示す。腫瘍に浸潤した関連する白血球を分析した：Ａ）マクロファージ、及びＢ）マクロファージＭ１／Ｍ２の比。白血球数を、平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析により解析し、続いてトルコポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１を行った。

【図14AB】図１４は、Ｂ５７_２−Ｆｃと４−１ＢＢチェックポイントアゴニスト抗体との併用がメラノーマ（悪性黒色腫）（Ｂ１６Ｆ１０）癌マウスモデルにおける腫瘍のサイズを縮小することを示す。Ａ）メラノーマ癌細胞（Ｂ１６Ｆ１０）の注入時点と化合物の注入との実験設計。Ｂ）Ｂ５７_２−Ｆｃ及び４−１ＢＢ抗体での処置群（ｎ＝８）の平均腫瘍体積ｍｍ^３。物質注射の実験設計は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／ｋｇ）のｂｉｗｋ×３回注射；Ｂ５７_２−Ｆｃ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３回注射；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３回注射；及びＢ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ ｂｉｗｋ×３回注射。腫瘍体積を平均±ＳＥＭとして表し、二元配置分散分析により解析し、続いてボンフェローニポストホック分析、^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を行った。ｂｉｗｋ＝週２回。

【図15AB】図１５は、Ｂ５７_２−Ｆｃと４−１ＢＢチェックポイントアゴニスト抗体との併用及びＰＤ−１アンタゴニスト抗体との併用がメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）癌マウスモデル（図１４実験からの継続）における腫瘍のサイズを縮小することを示す。Ａ）Ｂ５７_２−Ｆｃ、ＰＤ−１及び４−１ＢＢ抗体を用いた処置群（ｎ＝８）の平均腫瘍体積ｍｍ^３。Ｂ）アイソタイプと比較したＢ５７_２−Ｆｃ、４−１ＢＢ及びＰＤ−１処置群の腫瘍阻害のパーセンテージ（％）。物質注射の実験設計は以下の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３回注射；Ｂ５７_２−Ｆｃ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３回注射；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３回注射；ＰＤ−１ ｂｉｗｋ×３回注射（５ｍｇ／ｋｇ）；及びＢ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ ｂｉｗｋ×３回注射、Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１ ｂｉｗｋ×３回注射、ＰＤ−１＋４−１ＢＢ ｂｉｗｋ×３回注射、及びＢ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ＋ＰＤ−１ ｂｉｗｋ×３回注射。腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして表される。ｂｉｗｋ＝週に２回。

【図16ABC】図１６は、フローサイトメトリーによるメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）処理マウスの腫瘍における浸潤した白血球の免疫組織解析を示す。腫瘍に浸潤する関連する白血球を分析した：Ａ）ＮＫ細胞；Ｂ）ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比；及びＣ）骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）。白血球数を、平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析により解析し、続いてトルコポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１を行った。

【図17AB】図１７は、フローサイトメトリーによるメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）処理マウスの腫瘍における浸潤した白血球の免疫組織解析（図１６からの続き）を示す。腫瘍に浸潤する関連する白血球を分析した：Ａ）マクロファージ；及びＢ）マクロファージＭ１／Ｍ２比。白血球数を、平均±ＳＥＭとして表し、一元配置分散分析、続いてトルコポストホック分析、^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１を行った。

【発明を実施するための形態】

【0031】

一態様によれば、本発明は、薬剤としての使用のためのＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーを提供する。

【0032】

別の態様によれば、本発明は、癌の予防又は治療における使用のための、又は免疫調節物質としての使用のためのＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーを提供する。

【0033】

本発明の別の態様によれば、単離されたＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマータンパク質は、特に薬剤として、さらに特に癌の予防又は治療における使用のための、又は免疫調節剤として提供される。

【0034】

本発明の別の態様によれば、単離されたＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマータンパク質は、癌及び感染症（ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒら、同書）のような、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が防御免疫の発達を損なうヒト疾患における使用のために、免疫調節剤として、又は制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のネガティブモジュレーターとしての使用のために提供される。

【0035】

特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーは、２つの同一のＨＬＡ−Ｂ５７ポリペプチド鎖を含む。特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーは、２つの異なるＨＬＡ−Ｂ５７ポリペプチド鎖を含む。

【0036】

本発明のこの第１の態様の代替によれば、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーは、癌の治療又は予防のために、又は感染症の治療のための免疫調節剤としての使用のために、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型Ｂ型Ｃ型肝炎ウイルス（それぞれ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス及び／又は黄熱病ウイルスの予防又は治療における使用のために提供される。この態様によるオープンコンフォーマーは、２つの単量体の二量体として存在する融合タンパク質であり、各単量体は他の単量体とは独立して、ＨＬＡ−Ｂ５７鎖及びインビボでポリペプチドを代謝的に安定化することが知られているポリペプチドドメインを含む。そのような安定化ドメインの一例は、免疫グロブリンのＦｃ（結晶化可能断片）ドメイン、特にγ免疫グロブリンのＦｃポリペプチドドメインである。ＨＬＡ−Ｂ５７鎖及び安定化ドメインは、任意にアミノ酸リンカーによって連結されていてもよい。ＨＬＡ−Ｂ５７鎖及び免疫グロブリンＦｃ断片を含むオープンコンフォーマー融合タンパク質は、以後、ＨＬＡ−Ｂ５７Ｆｃオープンコンフォーマー又はＢ５７_２−Ｆｃと称する。

【0037】

融合タンパク質中のＦｃドメインの存在は、哺乳動物系（プロテインＡ又はＧ精製）における溶解性、安定性、結合活性、半減期及び技術的観点からの費用効果の高い産生及び精製の促進を容易にする。

【0038】

特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーホモ二量体は、さらに、ペプチドエピトープ断片を含む。

【0039】

本発明の第２の態様によれば、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー単量体（すなわち、第２のＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチドに結合しておらず、β２−ミクログロブリンに結合していないＨＬＡ−Ｂ５７）は、癌の治療又は予防における使用のために、又は免疫調節剤としての使用のために提供される。この態様の特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ５７単量体は、ペプチドエピトープ断片をさらに含む。

【0040】

この態様は、以下の項目で要約することができる：

【0041】

項目１：薬剤として使用するための、特に癌の治療又は予防に使用するため又は免疫調節剤としての使用のための、結合するβ２−ミクログロブリンを本質的に含まない単離された単一ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチド単量体。

【0042】

項目２：単量体がペプチドエピトープ断片をさらに含む、項目１に記載の癌の治療又は予防、又は免疫調節剤として使用するために単離された単一ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチド単量体。

【0043】

項目３：ＨＬＡ−Ｂ５７鎖がＨＬＡ−Ｂ５７アルファ１、２及び３ドメインのみからなる、項目１又は２に記載の癌の治療又は予防、又は免疫調節剤として使用するために単離された単一ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチド単量体。

【0044】

項目４：ＨＬＡ−Ｂ５７鎖が膜貫通ドメインを含み、かつ細胞内ドメイン（細胞質尾部）を含まない、前記項目のいずれか１項に記載の癌の治療又は予防、又は免疫調節剤として使用するために単離された単一ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチド単量体。

【0045】

項目５：ＨＬＡ−Ｂ５７鎖は、表１に示す配列のいずれか一つと比較し７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上又は９８％以上、又は１００％の配列同一性を有する、前記項目のいずれか１項に記載の癌の治療又は予防、又は免疫調節剤として使用するために単離された単一ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチド単量体。

【0046】

項目６： ａ．項目１〜５のいずれか１項に特定されるとおり、単離された単一ＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチド単量体と、
ｂ．チェックポイント阻害剤、特にチェックポイント阻害抗体及び／又はチェックポイントアゴニスト剤、特にチェックポイントアゴニスト抗体、
とを含む併用薬剤。

【0047】

項目７：前記チェックポイント阻害剤が、ＣＤ８０又はＣＤ８６とのＣＴＬＡ４相互作用の阻害剤、及びＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害剤、特にＣＴＬＡ４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１のいずれか一つに対する抗体、さらに特にヒトＣＴＬＡ４、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体から選択される、項目６に記載の併用薬剤であって、及び／又は前記チェックポイントアゴニスト剤はアゴニスト抗体又は４−１ＢＢ及び／又は４−１ＢＢＬ（ＣＤ１３７Ｌ、Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ４１２７３）に対するリガンドから選択される。

【0048】

上記記載の本発明の態様のいずれか一つの特定の実施形態において、ペプチドエピトープ断片は、ＨＬＡ−Ｂ５７ペプチド鎖の抗原提示ドメイン内のポリペプチドに非共有結合性に結合される。

【0049】

上記記載の本発明の態様のいずれか一つの特定の実施形態において、ＨＬＡ−Ｂ５７鎖は、細胞外ＨＬＡ−Ｂ５７α１、２及び３ドメインのみを含む。これらの実施形態において、ＨＬＡ−Ｂ５７鎖の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインは、組換え細胞におけるその細胞外発現を可能にするために、本発明の治療用ポリペプチドに含まれない。当業者であれば、注釈付きのＨＬＡ−Ｂ５７配列とのペアワイズ配列アライメントにより、以前に未知のＨＬＡ−Ｂ５７配列であっても、それぞれのドメインを容易に同定することができる。

【0050】

上記記載の本発明の態様のいずれか一つの特定の実施形態において、ホモ二量体のＨＬＡ−Ｂ５７鎖は、ＨＬＡ−Ｂ^＊５７：０１〜ＨＬＡ−Ｂ^＊５７：８２から選択される。

【0051】

上記記載の本発明の態様のいずれか一つの特定の実施形態において、ＨＬＡ−Ｂ５７鎖は、ＨＬＡ−Ｂ５７α１、２及び３ドメインのみを含むが、表１から選択される配列の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含まない。

【0052】

上記記載の本発明の態様のいずれか一つの特定の実施形態において、ＨＬＡ−Ｂ５７鎖は、表１に示す配列のいずれか一つと比較し７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上又は９８％以上、又は１００％の配列同一性を有する。

【0053】

特定の実施形態において、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーは、上記のＨＬＡ−Ｂ５７対立遺伝子から独立して選択される２つのサブユニットからなる。特定の実施形態では、ホモ二量体は、２つの同一のＨＬＡ−Ｂ５７対立遺伝子からなる。

【0054】

特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーはＦｃドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）、Ａ型（ＩｇＡ）、Ｄ型（ＩｇＤ）、Ｅ型（ＩｇＥ）又はＭ型（ＩｇＭ）の重鎖定常領域Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む。

【0055】

特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーは、安定化ドメイン、特にＦｃドメインをＨＬＡポリペプチドに連結するアミノ酸リンカーを含む。特に特定の実施形態では、アミノ酸リンカーは、単一ポリペプチド鎖としてＨＬＡ−Ｂ５７鎖をＦｃドメインに連結する１〜５０個のアミノ酸、特に５〜４０個のアミノ酸、さらに特に１０〜３０個のアミノ酸、なおさらに特に１５〜２５個のアミノ酸を含む。

【0056】

本発明の第３の態様によれば、本発明の上記態様に記載の、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー単量体、特にＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードする核酸分子が、癌の治療又は療法における使用のために提供される。核酸分子からのインビボでのオープンコンフォーマーの発現は、二量体化の後に、本発明の融合タンパク質ポリペプチドをもたらす。患者の体内でそれらをコードする核酸から薬学的に活性なポリペプチドを発現させるという概念は周知であり、患者に大きな利益を与えることができる。

【0057】

特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー単量体、特にペプチドエピトープ断片を含むＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー単量体、特に、細胞外ＨＬＡ−Ｂ５７アルファ１、２及び３ドメインのみを含むＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードする。特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー単量体、特に細胞外ＨＬＡ−Ｂ５７アルファ１、２及び３ドメインのみを含むＦｃオープンコンフォーマー単量体及びペプチドエピトープ断片をコードする。

【0058】

特定の実施形態では、核酸分子は、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー単量体、特にアミノ酸リンカー及び／又はＦｃ（結晶化可能な断片）ドメインを含むＦｃオープンコンフォーマー単量体をコードし、癌の治療又は療法において使用される。

【0059】

本発明の第４の態様によれば、本発明の第３の態様に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターは、癌の治療又は療法における使用のために提供される。

【0060】

特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において作動可能なプロモーターを含むプラスミドである。プロモーターは、本発明の核酸分子に作動可能に連結されている。

【0061】

本発明の別の態様によれば、本発明の第３の態様に記載の核酸分子を含むウイルスは、癌の治療又は療法における使用のために提供される。核酸分子は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下にある。特定の実施形態では、ウイルスは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス又はレンチウイルスである。

【0062】

本発明のさらに別の態様によれば、本発明の第３の態様に記載の核酸分子を含むインビトロで遺伝子改変された宿主細胞が提供される。

【0063】

本発明の別の態様は、癌の治療又は予防のための薬剤の製造において、本発明の第１及び第２の態様に記載のＨＬＡ−Ｂ５７Ｆｃオープンコンフォーマーホモ二量体又は融合タンパク質ホモ二量体の使用を提供する。

【0064】

さらに別の態様によれば、本発明は、本発明の第１及び第２の態様に記載のＨＬＡ−Ｂ５７Ｆｃオープンコンフォーマーを、それを必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。

【0065】

本発明の別の態様によれば、併用薬剤が提供され、併用薬剤は：
−本発明の上記態様又は実施形態のいずれか一つに記載のＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー、特にＨＬＡ−Ｂ５７Ｆｃオープンコンフォーマー、
及び、
−ＣＤ８０又はＣＤ８６と相互作用する細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４；ＣＤ１５２としても知られている）の阻害剤、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１；ＣＤ２７９としても知られている）とそのリガンドＰＤ−Ｌ１の相互作用の阻害剤、及びＴ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有３（ＴＩＭ−３）のリガンドから選択されるチェックポイント阻害剤、
−チェックポイントアゴニスト剤、特に、腫瘍壊死因子受容体４−１ＢＢ（ＣＤ１３７又はＴＮＦＲＳＦ９としても知られている）に結合してこれを活性化するように選択されたチェックポイントアゴニスト抗体、
を含む。

【0066】

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ４とＣＤ８０又はＣＤ８６との相互作用の阻害剤である。

【0067】

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤はイピリムマブ（ヤーボイ（Ｙｅｒｖｏｙ）；ＣＡＳ番号４７７２０２−００−９）である。

【0068】

特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）とその受容体ＰＤ−Ｌ１との相互作用の阻害剤である。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、臨床的に利用可能な抗体薬であるニボルマブ（ブリストル・マイヤーズ スクイブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＣＡＳ番号９４６４１４−９４−４）、ペンブロリズマブ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｃ．）；ＣＡＳ番号１３７４８５３−９１−４）、ピジリズマブ（ＣＡＳ番号１０３６７３０−４２−３）、アテゾリズマブ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ ＡＧ）；ＣＡＳ番号１３８０７２３−４４−３）、及びアベルマブ（メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）；ＣＡＳ番号１５３７０３２−８２−８）から選択される。

【0069】

特定の実施形態では、免疫チェックポイントアゴニスト剤は、現在臨床試験中の４−１ＢＢに対する完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であるウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）である。

【0070】

特定の実施形態において、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー、特にＨＬＡ−Ｂ５７ Ｆｃオープンコンフォーマーは、非経口剤形として、特に注射用に調製され提供される。特定の実施形態では、チェックポイント阻害剤及び／又はチェックポイントアゴニスト剤は、非経口剤形として、特に注射用に調製され提供される。特定の実施形態では、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー及びチェックポイント阻害剤及び／又はチェックポイントアゴニスト剤の両方が同じ投与形態で存在する。

【0071】

さらに別の態様において、本発明は、組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドを産生するための方法に関する。この方法を以下の項目に概要する：

【0072】

項目Ａ：組換えバイオテクノロジーの方法により、ヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドを産生するための方法であって、前記方法は以下の工程を含む：
ａ．発現段階：
ｉ．細胞、特に真核細胞、さらに特に哺乳類細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下でＨＬＡ重鎖の少なくともα１鎖、α２鎖及びα３鎖をコードするＨＬＡコード核酸配列、及び
ｉｉ．前記細胞（項目１のａと同じ細胞）において作動可能なプロモーター配列の制御下で、ヒトＨＬＡβ２ミクログロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６１７６９）をコードするβ２−ミクログロブリンコード核酸配列を、哺乳動物細胞（「産生細胞株」）において同時発現させる；
ｂ．精製工程：得られたＨＬＡ−重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を哺乳動物細胞（産生細胞株）から精製し；
ｃ．解離工程：精製されたＨＬＡ−重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を適切な条件下で解離させ、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをβ２−ミクログロブリンポリペプチドから分離し；
ｄ．リフォールディング段階：分離されたＨＬＡ重鎖ポリペプチドを、リフォールディング（生理的に活性なＨＬＡオープンコンフォーマー分子に見られるそれらの天然の三次タンパク質構造へ）することを誘導する条件下でインキュベートする。

【0073】

項目Ｂ：項目Ａに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡコード核酸配列が、コードされたポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ、α１鎖、α２鎖、α３鎖と安定化配列とを含む。

【0074】

項目Ｃ：項目Ｂに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、安定化配列が、ウシ血清アルブミン及び免疫グロブリン定常断片（Ｆｃ）、特に免疫グロブリンＧ定常断片、さらに特にＩｇＧ４Ｆｃから選択される。

【0075】

項目Ｄ：上記項目のいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡコード核酸配列及びβ２ミクログロブリンコード核酸配列が、同一の核酸ベクター分子（特に、ＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。

【0076】

項目Ｅ：上記項目Ａ〜Ｃのいずれかに記載のヒトＨＬＡ重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡコード核酸配列及びβ２ミクログロブリンコード核酸配列が異なる核酸ベクター分子（特に、異なるＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。

【0077】

項目Ｆ：項目Ｅの方法であって、ＨＬＡコード核酸配列を含む核酸ベクターが、β２−ミクログロブリンコード核酸配列、特に約３重過剰に含む核酸ベクターに対して、約１〜５重過剰、特に１．５〜５重過剰に存在する。

【0078】

項目Ｇ：前記項目のいずれかに記載の方法であって、ＨＬＡコード核酸配列が安定化配列としての免疫グロブリンＦｃ断片を含み、精製工程は、プロテインＡへ連結された表面に組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドを吸着させることによって行われる。

【0079】

項目Ｈ：上記項目のいずれかに記載の方法であって、解離工程は、酸性条件下、特に約ｐＨ２での処理により、かつ還元条件下での透析により行われる。

【0080】

項目Ｉ：前記項目のいずれかに記載の方法であって、リフォールディング工程が、中性条件下での処理により行われる。

【0081】

本明細書で特定されるＢ５７オープンコンフォーマーをより具体的に指摘すると、その方法は以下の項目に要約することができる：

【0082】

項目Ａ’：組換えバイオテクノロジーの方法により、ヒトＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチドを製造する方法であって、前記方法は以下の工程を含む：
ａ．発現段階：
ｉ．細胞、特に真核細胞、さらに特に哺乳動物細胞において作動可能なプロモーター配列の制御下でＨＬＡ−Ｂ５７重鎖の少なくともα１鎖、α２鎖及びα３鎖をコードするＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列、及び
ｉｉ．前記細胞（項目１のａと同じ細胞）において作動可能なプロモーター配列の制御下で、ヒトＨＬＡβ２ミクログロブリン（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ６１７６９）をコードするβ２−ミクログロブリンコード核酸配列を、哺乳動物細胞（「産生細胞株」）において同時発現させる；
ｂ．精製工程：得られたＨＬＡ−Ｂ５７重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を哺乳動物細胞（産生細胞株）から精製し；
ｃ．解離工程：精製されたＨＬＡ−Ｂ５７−重鎖／β２−ミクログロブリン複合体を適切な条件下で解離させ、ＨＬＡ重鎖ポリペプチドをβ２−ミクログロブリンポリペプチドから分離し；
ｄ．リフォールディング段階：分離されたＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチドは、リフォールディング（生理学的に活性なＨＬＡオープンコンフォーマー分子に見られるそれらの天然の三次タンパク質構造へ）することを誘導する条件下でインキュベートする。

【0083】

項目Ｂ’：項目Ａ’に記載のヒトＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列が、コードされたポリペプチドのＮ末端からＣ末端へ、α１鎖、α２鎖、α３鎖と安定化配列とを含む。

【0084】

項目Ｃ’：項目Ｂ’に記載のヒトＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチドの製造方法であって、安定化配列が、ウシ血清アルブミン及び免疫グロブリン定常断片（Ｆｃ）、特に免疫グロブリンＧ定常断片、さらに特にＩｇＧ４Ｆｃから選択される。

【0085】

項目Ｄ’：上記項目のいずれかに記載のヒトＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列及びβ２ミクログロブリンコード核酸配列が同一の核酸ベクター分子（特に、ＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。

【0086】

項目Ｅ’：上記項目Ａ’〜Ｃ’のいずれかに記載のヒトＨＬＡ−Ｂ５７重鎖ポリペプチドの製造方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列及びβ２−ミクログロブリンコード核酸配列が異なる核酸ベクター分子（特に、異なるＤＮＡ発現プラスミド）上に存在する。

【0087】

項目Ｆ’：項目Ｅ’の方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列を含む核酸ベクターが、β２−ミクログロブリンコード核酸配列、特に約３重過剰に含む核酸ベクターに対して、約１〜５重過剰、特に１．５〜５倍過剰に存在する。

【0088】

項目Ｇ’：前記項目のいずれかに記載の方法であって、ＨＬＡ−Ｂ５７コード核酸配列が安定化配列として免疫グロブリンＦｃ断片を含み、精製工程は、プロテインＡへ連結された表面に組換えＨＬＡ重鎖ポリペプチドを吸着させることによって行われる。

【0089】

項目Ｈ’：前記項目のいずれかに記載の方法であって、解離工程は、酸性条件下、特に約ｐＨ２での処理により、かつ還元条件下での透析により行われる。

【0090】

項目Ｉ’：前記項目のいずれかに記載の方法であって、リフォールディング工程が、中性条件下での処理により行われる。

【0091】

単一の分離可能な特徴の代替物、例えば、対立遺伝子又はコード配列などは、本明細書において「実施形態」として示される箇所すべてにおいて、そのような代替物は、本明細書に開示される発明の別個の実施形態を形成するために自由に組み合わせられ得る。

【0092】

本発明は、以下の実施例及び図によりさらに説明され、これにより、さらなる実施形態及び利点を引き出すことができる。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しているが、その範囲を限定するものではない。

【実施例】

【0093】

驚くべきことに、本発明者らは、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーが、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、骨髄由来細胞（マクロファージ及びＭＤＳＣ）に存在する種々の免疫調節表面受容体と相互作用し、インビトロでＴｒｅｇの分化及び抑制機能を調節することを見出した。

【0094】

本発明者らは、驚くべきことに、特にＦｃ免疫グロブリン断片を含む融合タンパク質として存在する場合、ＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーが癌治療において有用であり得ることを見出した。ＨＬＡ−Ｂ５７−Ｆｃ分子は、単独で、又は他の癌治療剤と併用して使用することができる。

【0095】

さらに、彼らは、チェックポイント阻害剤又はアゴニスト抗体を用いた単独療法的又は併用的アプローチとしてＢ５７_２−Ｆｃの注射による新規のインビボ作用様式を発見した。Ｂ５７_２−Ｆｃ単独又は併用治療は、Ｍ１／Ｍ２細胞の増加の割合、ＮＫ細胞の浸潤の増加、ＣＤ８^＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ比の増加、及びＭＤＳＣ浸潤の減少により特定されたとおり、腫瘍への多様な白血球の集合の浸潤を調節することができる。全体的に、Ｂ５７_２−Ｆｃの単独又はアンタゴニスト／アゴニスト抗体を用いた併用的アプローチの作用様式は、癌の治療に関連することは疑いがなく、癌免疫療法における現在の臨床的必要性と相関する。

【0096】

ＨＬＡ−Ｂ５７Ｆｃオープンコンフォーマーは、癌及び感染性疾患の場合のように、免疫調節が治療的アプローチである疾患を標的とするための治療剤として使用することができる。

【0097】

インビトロ試験
Ｂ５７_２−Ｆｃ分子は、ｉＴｒｅｇ分化をブロックし、Ｔｒｅｇ抑制に負の影響を及ぼすことによって免疫応答を調節することができる（図２〜３）

【0098】

Ｂ５７_２−ＦｃはネズミＣＤ４^＋Ｔ細胞のｉＴｒｅｇへの変換をブロックする
ｉＴｒｅｇ変換のためのナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞に対するＨＬＡ分子の影響に関し、ｉＴｒｅｇ変換のための最適培養条件において、ナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞と共にインキュベートしたＢ５７_２−Ｆｃ、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、アイソタイプ及ＰＢＳの用量依存性（μｇ／ｍＬ）を分析した。Ｂ５７_２−Ｆｃは、ＣＤ２５（図２Ａ、Ｃ）及びＦｏｘＰ３（図２Ｂ、Ｄ）の誘導をダウンモジュレーションすることを実証した。

【0099】

Ｂ５７_２−Ｆｃは、ＴｒｅｇによるマウスＣＤ８^＋Ｔ細胞の抑制を損なう
応答細胞としてバイオレット標識されたナイーブＣＤ８^＋Ｔ細胞を用いてネズミＴｒｅｇの抑制機能を測定した（図３）。ＴｒｅｇをＢ５７_２−Ｆｃ及び対照Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、及びアイソタイプ抗体と共培養し、そして９６時間後にＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を測定した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞単独が強力な増殖を示し、予想通り、Ｔｒｅｇ細胞は、対照（Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ及びアイソタイプ）と共にインキュベートした場合、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を抑制した。驚くべきことに、Ｔｒｅｇの抑制機能は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の強い増殖により示されるＢ５７_２−Ｆｃの存在下で大きく損なわれた（図３Ａ）。Ｂ５７_２−Ｆｃの効果は用量依存的であった（図３Ｂ）。

【0100】

Ｂ５７_２−Ｆｃは、白血病Ｔ細胞の増殖を阻害する
異なる癌細胞株におけるＢ５７_２−Ｆｃ増殖効果の効果を測定した（図４）。結果は、Ｂ５７_２−Ｆｃが対照対応物Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ又はアイソタイプＩｇＧ４と比較してリンパ腫Ｔ細胞株の増殖を調節し、標的治療としてのリンパ腫の治療への潜在的適用を示していることが実証された。

【0101】

Ｂ５７_２−Ｆｃは、白血球の様々な型で発現される免疫調節受容体に結合する
本発明者らは、Ｂ５７_２−Ｆｃが酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により特定の免疫調節受容体と相互作用するかどうかを測定した。結果は、Ｂ５７_２−Ｆｃが、そのＢ５７−β２ｍ−Ｆｃ対照対応物とは異なり、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＬＩＬＲＢ１、ＬＩＬＲＢ２及びＰｉｒｂ受容体と相互作用することを実証した（図５Ａ〜Ｄ）。さらに、類似のＨＬＡオープンコンフォーマー分子が同じ受容体と相互作用するが、異なる親和性を有するかを実証するために、Ｂ２７_２−Ｆｃ及びＢ２７−β２ｍ−Ｆｃもまた比較した。

【0102】

ＣＨＯ細胞におけるヒトＦｃ融合タンパク質としてのＢ５７オープンコンフォーマーの産生
治療上の観点からの有効な戦略とは、溶解性、安定性、結合活性、半減期の増加、及び哺乳動物系での技術的観点、費用対効果の高い生産及び精製のために安定な型（Ｆｃ融合）においてＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマー分子を産生することである。Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ複合体は、ＨＬＡ−Ｂ５７のα１，２及び３ドメインを、ヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクターカセット（図６Ａ）に、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃタンパク質の細胞外産生に必要なヒト−β２ｍベクターと共に挿入することにより産生される（図６Ａ、Ｂ）。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞におけるトランスフェクションは、Ｂ５７−Ｆｃベクター＋β２ｍベクターの両方を１：１の比率で用いて行った。上清を回収し、標準的な抗体精製手順（組換えタンパク質精製ハンドブック（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）、原則及び方法、２００９．ＧＥヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、１８−１１４２−７５）を用いてＢ５７−β２ｍ−Ｆｃを精製した（図６Ｂ）。Ｂ５７−Ｆｃ遊離重鎖からのβ２ｍの分離は、ＳＥＣ又は透析法を用いて変性状態を利用し行った。リフォールディング緩衝液において希釈法を用いてＢ５７_２−Ｆｃのリフォールディングを評価し、ウエスタンブロットにより分析した（データは示さず）。

【0103】

多様な同系結腸癌マウスモデルにおけるＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１及び４−１ＢＢ抗体を用いたＢ５７_２−Ｆｃの前臨床併用療法試験
免疫調節治療分子としてのＢ５７_２−Ｆｃのインビボでの概念実証試験（ｐｒｏｏｆ ｏｆ ｃｏｎｃｅｐｔ ｓｔｕｄｙ）は、単剤として及びＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢ抗体との併用療法としてネズミ結腸癌（Ｃ３８）、膵臓癌（Ｐａｎ０２）及びメラノーマ（Ｂ１６−Ｆ１０）同系マウスモデルにおいて実証された。

【0104】

結腸癌モデルについては、確立された手順に従って、同系マウスの脇腹にＣ３８断片腫瘍を皮下注射した。腫瘍が約８０ｍｍ^３（腫瘍の移植後１〜２週間）に達すると、マウスを腫瘍体積に従って統計的に区分した。Ｂ５７_２−Ｆｃを３日ごとに７回（Ｑ３Ｄ×７）腹腔内注射し、ＰＤ−１は週２回（ｂｉｗｋ×２回）、４回注射した（図７Ａ）。

【0105】

結腸癌（Ｃ３８）においてＢ５７_２−ＦｃとＰＤ−１抗体の併用が腫瘍を有意に減少させることをデータにより実証した（図７Ｂ）。併用療法Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１は、アイソタイプ対照抗体に対し、腫瘍体積を著しく減少させた（３３３ｍｍ^３対２１２０ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０１）。さらに、併用療法Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１は、ＰＤ−１単独療法に対し、有意な腫瘍サイズの減少を示した（３３３ｍｍ^３対１４２３ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０１）（図７Ｂ）。Ｂ５７_２−Ｆｃ単独療法又はＰＤ−１単独療法は、実験終了時のアイソタイプ対照との差異を示さなかったが、２４日目に、ＰＤ−１対アイソタイプ（１５１ｍｍ^３対６５２ｍｍ^３、ｐ＜０．０１）と同様に、Ｂ５７_２−Ｆｃ処置マウスはアイソタイプと有意に異なり（３８４ｍｍ^３対６５２ｍｍ^３、ｐ＜０．０５）（図７Ｂ）、これはＢ５７_２−Ｆｃ単独療法も結腸癌マウスの腫瘍進行において免疫調節効果も有することを示す。

【0106】

膵臓（Ｐａｎ０２）及びメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）マウスモデルについては、確立された手順に従って、同系マウスの右脇腹にそれぞれ１×１０^５の細胞を注射した。腫瘍が約８０ｍｍ^３（細胞注入後１〜２週間）に達すると、マウスを腫瘍体積に従って統計的に区分した（図８Ａ、１４Ａ）

【0107】

膵臓（Ｐａｎ０２）においてＢ５７_２−Ｆｃ単独療法及びＰＤ−１抗体との併用が腫瘍を有意に低減し得ることをデータにより実証した（図８Ｂ、９Ｂ）。併用療法Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１はアイソタイプ対照抗体に対し、腫瘍容積の著しい有意な減少を示した（２１６ｍｍ^３対７９９ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０００１）（図８Ｂ）。さらに、併用療法Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１はＰＤ−１単独療法に対しても有意な腫瘍サイズの減少を示した（２１６ｍｍ^３対４４５ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０１）（図８Ｂ）。Ｂ５７_２−Ｆｃ単独療法は、アイソタイプと比較して有意に異なっていた（５４５ｍｍ^３対７９９ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０５）。ＰＤ−１単独療法は、アイソタイプと比較して有意に異なっていた（４４５ｍｍ^３対７９９ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０００１）（図８Ｂ）。

【0108】

膵臓（Ｐａｎ０２）において、ＰＤ−Ｌ１抗体と併用のＢ５７_２−Ｆｃ研究は、腫瘍を有意に減少させた（図９Ａ〜Ｂ）。併用Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−Ｌ１はアイソタイプに対し、有意な腫瘍サイズの減少を示した（それぞれ３９７ｍｍ^３対７９９ｍｍ^３、ｐ＜０．０００１）（図９Ａ）。ＰＤ−Ｌ１単独療法は、アイソタイプと比較して有意に異なっていた（５３１ｍｍ^３対７９９ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０１）（図９Ａ）。

【0109】

膵臓（Ｐａｎ０２）マウスの腫瘍免疫組織は、Ｂ５７_２−Ｆｃ療法が腫瘍浸潤白血球の多様な集団に及ぼす影響を示した（図１０〜１３）。Ｂ５７_２−Ｆｃ単独療法は、対照アイソタイプと比較し、ＮＫ細胞の浸潤を増加させ（ｐ＜０．０５）（図１０Ａ）、腫瘍中のＭ１型マクロファージの存在が助けとなりマクロファージＭ１／Ｍ２細胞比を有意に改良した（ｐ＜０．０５）（図１１Ｂ）。ＰＤ−１単独療法と比較して、ＰＤ−１とのＢ５７_２−Ｆｃ併用療法は、腫瘍におけるＭＤＳＣ細胞の浸潤を有意に減少させ（ｐ＜０．０５）（図１０Ｃ）、マクロファージの浸潤を減少させ（ｐ＜０．０５）（図１１Ａ）、アイソタイプ及びＰＤ−１単独療法と比較した場合にマクロファージＭ１／Ｍ２比を有意に改良した（ｐ＜０．００１）（図１１Ｂ）。ＰＤ−Ｌ１とＢ５７_２−Ｆｃ併用療法（図１２〜１３）は、アイソタイプ（ｐ＜０．０１）及びＰＤ−Ｌ１（ｐ＜０．０５）と比較してマクロファージＭ１／Ｍ２細胞比を有意に改良した（図１３Ｅ）。

【0110】

メラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）において、４−１ＢＢアゴニスト抗体とのＢ５７_２−Ｆｃ併用が腫瘍を有意に減少させることをデータにより実証した（図１４〜１５）。併用療法Ｂ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢはアイソタイプ対照抗体に対し腫瘍体積の減少において顕著な差を示した（７５６ｍｍ^３対１４２４ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０００１）（図１４Ｂ）。さらに、併用療法Ｂ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢは４−１ＢＢ単独療法に対しても、有意な腫瘍サイズの減少を示した（７５６ｍｍ^３対１１９９ｍｍ^３、それぞれｐ＜０．０１）（図１４Ｂ）。４−１ＢＢ単独療法は、アイソタイプと比較して有意に異ならなかった（１１９９ｍｍ^３対１４２４ｍｍ^３）。ＰＤ−１単独及び併用療法は、群間で有意性を示さなかった（図１５Ａ）。しかしながら、三剤併用治療（Ｂ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ＋ＰＤ−１）はアイソタイプと比較して有意差が高かったが（ｐ＜０．０００１）、併用療法Ｂ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢよりも優れてはいなかった（図１５Ａ〜Ｂ）。

【0111】

メラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）処置動物の腫瘍免疫組織は、Ｂ５７_２−Ｆｃ治療の腫瘍浸潤白血球の多様な集団による影響を実証した（図１６〜１７）。Ｂ５７_２−Ｆｃ単独療法は、アイソタイプと比較した場合、腫瘍内部のＭＤＳＣ細胞の存在を有意に減少させた（ｐ＜０．０５）（図１６Ｃ）。４−１ＢＢ抗体を用いたＢ５７_２−Ｆｃ併用療法は、アイソタイプ及び４−１ＢＢ単独療法と比較して、ＣＤ８^＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇの比（ｐ＜０．０５）で測定したとおりＣＤ８^＋Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞の存在を有意に改良し（図１６Ｂ）、ＭＤＳＣの存在を有意に減少させ（ｐ＜０．０５）（図１６Ｃ）、マクロファージＭ１／Ｍ２細胞比を有意に改良した（ｐ＜０．０５）（図１７Ｂ）。４−１ＢＢ及びＰＤ−１抗体を用いたＢ５７_２−Ｆｃ三剤併用療法は、ＮＫ細胞の腫瘍への浸潤を有意に誘導し（ｐ＜０．０５）（図１６Ａ）、アイソタイプと比較してＣＤ８^＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ比を著しく改良し（１５８％対２３％、それぞれｐ＜０．０００１）、そして他のすべての群とも比較し改良した（図１６Ｂ）。さらに、腫瘍内のＭＤＳＣ細胞の存在を有意に減少させ（図１６Ｃ）、他のすべての群と比較してマクロファージＭ１／Ｍ２細胞比を有意に改良した（図１７Ｂ）。

【0112】

結論
結腸、膵臓及びメラノーマの前臨床同系マウスモデルを用いて、癌と戦うためのＢ５７_２−Ｆｃ分子を使用する原理証明が実証された。本データは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又は４−１ＢＢ抗体のようなチェックポイント阻害剤及び／又はチェックポイントアゴニスト剤のセットとの併用療法及び／又は単独療法のいずれかとしてのＢ５７_２−Ｆｃの治療的可能性を実証する。

【0113】

Ｂ５７_２−Ｆｃの作用様式もまた、インビボにおいて白血球の腫瘍浸潤を立証することにより、膵臓及びメラノーママウスモデルを評価した。Ｂ５７_２−Ｆｃ治療は、マクロファージＭ１／Ｍ２細胞比の増加、ＭＤＳＣの浸潤の減少、ＣＤ８^＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ比の浸潤率の増加、及びＮＫ細胞の浸潤の増加により測定されるとおり、マウスの腫瘍への多様な白血球の集団の浸潤を調節することができる。全体的に、Ｂ５７_２−Ｆｃの単独又はアンタゴニスト／アゴニスト抗体を用いた併用アプローチの作用様式は、癌の治療に関連することは疑いがなく、かつ癌免疫療法における現在の臨床的必要性と相関する。

【0114】

Ｂ５７_２−Ｆｃは免疫調節薬の新規クラスとして出現する。インビトロ及びインビボのデータは、Ｂ５７_２−Ｆｃ分子が抗腫瘍免疫の活性化のためのスイッチオン機構として作用するメカニズムを示す。本発明者らは、理論に縛られることなく、骨髄細胞（マクロファージ、ＭＤＳＣ）、Ｔ細胞及びＮＫ細胞に存在する多様な免疫調節受容体に結合するＨＬＡ−Ｂ５７オープンコンフォーマーの相互作用が相乗的に関与し、免疫応答を悪化させると仮定する。

【0115】

材料及び方法
動物及び細胞株
インビボ実験は、マウス由来結腸癌Ｃ３８細胞株、膵管腺癌Ｐａｎ０２マウス細胞株、及びメラノーマＢ１６Ｆ１０マウス細胞株を用いてＣ５７Ｂｌ／６マウスで実施した。

【0116】

インビトロ実験細胞株：ＥＧ．７、マウスＴ細胞リンパ腫；Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＴ細胞リンパ腫；Ｌ４２８、ヒトホジキンリンパ腫；Ｌ５４０、ヒトホジキンリンパ腫；Ｌ１２３６、ヒトホジキンリンパ腫；Ｄａｕｄｉ、Ｂ細胞リンパ腫；ＩＭＲ−５、神経芽細胞腫；ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、神経芽細胞腫；Ｍ１３０４２８、メラノーマ。

【0117】

インビボ治療
Ｃ３８腫瘍断片を６週目に同系雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下注射した。Ｐａｎ０２及びＢ１６Ｆ１０細胞株を６週目に同系マウスの右側腹部に１×１０^５で注射した。結腸（Ｃ３８）、膵臓（Ｐａｎ０２）及びメラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）において腫瘍が結腸で±８０ｍｍ^３に達したら、個々の腫瘍体積の大きさに従って動物を区分し、それらの間に統計的差異を示さない群に分けた。腫瘍直径はカリパスを用いて測定し、Ｄ／２×ｄ^２式に従って体積を計算した。ここで、Ｄ及びｄはそれぞれ腫瘍の最長及び最短直径（ｍｍ）である。

【0118】

結腸（Ｃ３８）については、細胞の注入時点及び物質の注射の実験設計は次の通り確立した：ビヒクル（ＰＢＳ２００μＬ）；アイソタイプ（１０ｍｇ／ｋｇ）Ｑ３Ｄ×７；Ｂ５７_２−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）；ＰＤ−１ ｂｉｗｋ×２（２００μｇ）；Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄ×７及びｂｉｗｋ×２）；Ｂ２７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（それぞれＱ３Ｄ×７及びｂｉｗｋ×２）。膵臓（Ｐａｎ０２）については、物質の注射の実験設計は次の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；Ｂ５７_２−Ｆｃ（５ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ×３；ＰＤ−１ ｂｉｗｋ×３（５ｍｇ／Ｋｇ）；ＰＤ−Ｌ１ ｂｉｗｋ×３（５ｍｇ／Ｋｇ）；Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１（ｂｉｗｋ×３）及びＢ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−Ｌ１（ｂｉｗｋ×３）。メラノーマ（Ｂ１６Ｆ１０）について、物質の注射の実験設計は次の通りであった：アイソタイプ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ３回注射；Ｂ５７_２−Ｆｃ（５ｍｇ／Ｋｇ）ｂｉｗｋ３回注射；４−１ＢＢ抗体（１ｍｇ／ｋｇ）ｂｉｗｋ３回注射；ＰＤ−１ ｂｉｗｋ３回注射（５ｍｇ／ｋｇ）；Ｂ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ ｂｉｗｋ３回注射、Ｂ５７_２−Ｆｃ＋ＰＤ−１ ｂｉｗｋ３回注射、ＰＤ−１＋４−１ＢＢ ｂｉｗｋ３回注射、及びＢ５７_２−Ｆｃ＋４−１ＢＢ＋ＰＤ−１ ｂｉｗｋ３回注射。

【0119】

フローサイトメトリーのための腫瘍試料の調製は、イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により記載された手順を用いて行った（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ／ｍｅｄｉａ／ｐｄｆ／ｂｅｓｔ−ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｃｅｌｌ−ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ−ｆｏｒ−ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ｐｄｆ、２０１７年２月２１日にアクセスした）。

【0120】

抗体
インビトロ試験のための白血球マウス集団を以下のもので染色した：ＣＤ３（ＰＥ−Ｃｙ７−イーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＣＤ４（ＦＩＴＣ−ＢＤ バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））、ＦｏｘＰ３＋（ｅｆｌｕｏｒ４５０−イーバイオサイエンス）、ＣＤ４５（ＰｅｒＣＰ−イーバイオサイエンス）、ＣＤ３（ＰＥ−イーバイオサイエンス）、ＮＫ１．１（ＢＶ４２１−イーバイオサイエンス）、ＣＤ１１ｂ（ＦＩＴＣ−イーバイオサイエンス）、ＣＤ１１ｃ（ＦＩＴＣ−イーバイオサイエンス）、ＣＤ２５（ＰＥ−Ｃｙ７−バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））。

【0121】

ＨＬＡ−Ｂ及び−Ｃ対立遺伝子のβ２ｍ遊離重鎖及びＢ５７_２に結合するＨＣ１０ｍＡｂ（ＩｇＧ２ａ）は、Ｈｉｄｄｅ Ｐｌｏｅｇｈ博士（マサチューセッツ工科大学（ＭＩＴ）、マサチューセッツ州）からの贈与であった。

【0122】

腫瘍サンプル由来のフローサイトメトリー抗体を以下のもので染色した：ＣＤ４５（ＦＩＴＣ；クローン３０−Ｆ１１；バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））、ＣＤ３（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５；クローン１７Ａ２；バイオレジェンド）、ＣＤ４（ＢＶ５１０；クローンＧＫ１．５；バイオレジェンド）、ＣＤ８（ＡＰＣ−Ｈ７；クローン５３−６．７；ＢＤ）、ＦｏｘＰ３（ＰＥ；クローンＦＪＫ−１６Ｓ；イーバイオサイエンス）、ＣＤ１１ｂ（ＢＶ６５０；クローンＭ１／７０；バイオレジェンド）、Ｆ４／８０（ＰＥ／Ｃｙ７；クローンＢＭ８；バイオレジェンド）、Ｇｒ−１（ＡＰＣ−Ｒ７００；クローンＲＢ６−８Ｃ５；ＢＤ）、ＮＫ１．１（ＢＶ６０５；クローンＰＫ１３６；バイオレジェンド）、ＣＤ２０６（ＡＰＣ；クローンＣ０６８Ｃ２；バイオレジェンド）、ＣＤ８６（ＢＶ４２１；クローンＧＬ−１；バイオレジェンド）、Ｌ／Ｄ染色（ＢＵＶ３９５；インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。

【0123】

チェックポイント阻害剤抗体抗マウスＰＤ−１クローンＲＭＰ１−１４はＢｉｏ×Ｃｅｌｌから得た。チェックポイント阻害剤抗体抗マウスＰＤ−Ｌ１クローン：１０Ｆ．９Ｇ２をＢｉｏ×Ｃｅｌｌから得た。アゴニスト抗体抗マウス４−１ＢＢクローン３Ｈ３はＢｉｏ×Ｃｅｌｌから得た。

【0124】

白血球のフローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析はＦＡＣＳｃａｎｔｏＩＩ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて行い、データはＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．４を用いて分析した。

【0125】

Ｔｒｅｇの生成
ネズミＣＤ４^＋Ｔ細胞におけるＦｏｘＰ３の発現を誘導するために、Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞からの脾臓細胞を採取し、精製（マウスナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット−ＥａｓｙＳｅｐ）したＣＤ４^＋Ｔナイーブ細胞を得た。次いで、細胞を、５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ３ｍＡｂ（イーバイオサイエンス）、可溶性２μｇ／ｍＬ抗ＣＤ２８ｍＡｂ（バイオレジェンド）、１０μｇ／ｍＬのＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄシステムズ）及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄシステム）で被覆した９６ウェルプレートにおいて、１０^５細胞／２００μＬ／ウェルで９６時間培養した。

【0126】

Ｂ５７_２−Ｆｃの存在下でのｉＴｒｅｇ変換
ｉＴｒｅｇ変換のための最適培養条件におけるマウスナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞を、Ｂ５７_２−Ｆｃ、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ２７−β２ｍ−Ｆｃ、アイソタイプＩｇＧ４及びＰＢＳの異なる用量濃度（μｇ／２００μＬ）の存在下で７２時間インキュベートした。ｉＴｒｅｇ変換をフローサイトメトリーにより測定した。

【0127】

抑制アッセイ
ＣＤ４^＋又はＣＤ８^＋Ｔ−エフェクター細胞は、マウス又はヒト（マウスナイーブＣＤ４^＋Ｔ細胞単離キット−ＥａｓｙＳｅｐ；ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）ＦｌｏｗＣｏｍｐ^ＴＭマウスＣＤ８−ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ダイナビーズ（登録商標）ＣＤ８ヒト−ライフテクノロジーズ）のいずれかから精製し、１０μＭ細胞トレースバイオレット増殖染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でラベル付けした。ＣＤ３（イーバイオサイエンス）（３μｇ／ｍＬ）及び可溶性ＣＤ２８（イーバイオサイエンス）（１μｇ／ｍＬ）を被覆した９６ウェルＵ底プレートにおいて、Ｔｒｅｇｓ（２．５×１０^４）細胞及びＴ−エフェクター細胞（２．５×１０^４）を９６時間インキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎｔｏＩＩを用いてＴ−エフェクター細胞の増殖を測定し、ＦｌｏｗＪｏバージョン７．６．４の増殖分析ソフトウェアを用いてデータを分析した。

【0128】

増殖アッセイ
細胞を５×１０^５細胞／ウェルの密度で円形９６ウェルプレートに播種し、続いて異なる濃度（１０、５、及び２μｇ／ウェル）の薬物を１日間添加した。ＸＴＴ増殖アッセイをマニュアルの指示（細胞増殖キットＩＩ、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））に従って実施した。マイクロタイタプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでのウェルの吸光度の結果を得た。

【0129】

ＥＬＩＳＡアッセイ
競合ＥＬＩＳＡアッセイは、１０μｇ／ｍＬの選択された組換え白血球受容体（ヒトＫＩＲ３ＤＬ１、ヒトＫＩＲ３ＤＬ２、ヒトＫＩＲ３ＤＬ３、ヒトＬＩＬＲＢ１、ヒトＬＩＬＲＢ２、及びマウスＰｉｒｂ）で被覆したＭａｘｉｓｏｒｐ（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、スイス）９６ウェルプレートを用いて行った。受容体を終夜４℃でインキュベートし、５％粉乳−ＰＢＳで２時間ブロックした。Ｂ５７_２−Ｆｃ、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ、Ｂ２７_２−Ｆｃ、Ｂ２７−β２ｍ−Ｆｃ、及びアイソタイプＩｇＧ４を２μｇ／ｍＬで２時間室温にて添加した。ヒトＦｃに対するＨＲＰ結合抗体を検出器として使用した。

【0130】

Ｂ５７_２−Ｆｃの産生、精製及びリフォールディング
Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃの組換え産生は、ＨＬＡ−Ｂ５７のα１、２及び３ドメインをヒトＩｇＧ４−Ｆｃベクターに挿入し、ヒトβ２−ミクログロブリン（β２ｍ）を別個のベクターに挿入することによって達成された。組換えＢ５７−β２ｍ−Ｆｃの産生は、Ｂ５７−Ｆｃベクターとβ２ｍベクターとをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞への同時トランスフェクションすることにより行った。Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃの産生は、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧに外注した。

【0131】

Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃの精製は、抗体精製のための従来の手順を用いて行った。Ｂ５７_２−Ｆｃの産生は、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ複合体からβ２ｍを除去するために変性工程を加えて行った。

【0132】

簡潔には、Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃの捕捉ステップは、プロテインＧカラム（アマシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を介して上清（５ｍＬ／分）を流した後に行った。中間精製工程は、溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．０）を用いてプロテインＧ−カラムからＢ５７−β２ｍ−Ｆｃを溶出し、８Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０において画分を回収することにより実施した。第一の洗練工程は、ＡＫＴＡシステム（ＧＥ ライフサイエンス）を有するスーパーデックス２００プレップグレード又はセファクリルＳ−１００ＨＲ（ＧＥ ライフサイエンス（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ））を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、又は３０ＫＤａ又は５０ＫＤａの細孔サイズ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））の膜を使用した透析によりＢ５７−Ｆｃ単量体画分をβ２ｍから分離することであった。両方の手順から回収したＢ５７−Ｆｃ単量体を、１００倍体積のリフォールディング緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．５、５００ｍＭのＬ−アルギニン、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１５ｍＭのＮａＣｌ、１％スクロース、０．０１％のＴｗｅｅｎ−２０）中、８時間間隔で３回、Ｂ５７−Ｆｃ単量体を振動させた後、希釈法によりリフォールディングした。ＳＥＣによる第二の洗練工程では、さらなる不純物を除去し、Ｂ５７_２−Ｆｃ分子の新たに回収された画分を希釈緩衝液（ＰＢＳ、１％シスクロース及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）に交換することを行った。Ｂ５７_２−Ｆｃの精製溶液を、０．２μｍ膜（ミリポア）を用いて濾過滅菌した。

【0133】

画分Ｂ５７−β２ｍ−Ｆｃ複合体及びＢ５７_２−Ｆｃを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及びＨＣ１０（ＨＬＡ遊離重鎖に特異的）抗体を用いたウエスタンブロットによって分析した。β２ｍウエスタンブロットを、変性条件（１０ｍＭ ＤＴＴ）の有無にかかわらず実施した（データは示さず）。

【0134】

ＨＬＡ−Ｂ５７対立遺伝子の完全及び部分配列
Ｎ末端からＣ末端までの全長ＨＬＡ−Ｂ５７α鎖の機能的ドメインは、シグナルペプチド、α１、α２、α３、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部である。

【0135】

【図1】

【図2AB】

【図2CD】

【図3AB】

【図4ABC】

【図5ABCDEF】

【図6AB】

【図7ABC】

【図8AB】

【図9AB】

【図10ABC】

【図11AB】

【図12ABC】

【図13AB】

【図14AB】

【図15AB】

【図16ABC】

【図17AB】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]