特許 6980230 新規な分岐鎖状両親媒性脂質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6980230

(24)【登録日】2021年11月19日

(45)【発行日】2021年12月15日

(54)【発明の名称】新規な分岐鎖状両親媒性脂質

(51)【国際特許分類】

   C07F 9/24 20060101AFI20211202BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 9/127 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20211202BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20211202BHJP

   C12N 15/88 20060101ALN20211202BHJP

【ＦＩ】

   C07F9/24 ZCSP

   A61K47/24

   A61K9/127

   A61K9/51

   !A61K48/00

   !C12N15/88 Z

【請求項の数】14

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2018-516039(P2018-516039)

(86)(22)【出願日】2016年9月23日

(65)【公表番号】特表2018-531239(P2018-531239A)

(43)【公表日】2018年10月25日

(86)【国際出願番号】FR2016052410

(87)【国際公開番号】WO2017051129

(87)【国際公開日】20170330

【審査請求日】2019年5月16日

(31)【優先権主張番号】1559066

(32)【優先日】2015年9月25日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】516133836

【氏名又は名称】ユニバーシテ デ ブルターニュ オキシデンタル

(73)【特許権者】

【識別番号】507002516

【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュート・ナシオナル・ドゥ・ラ・サンテ・エ・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・メディカル）

(73)【特許権者】

【識別番号】518098014

【氏名又は名称】ソントル オスピタリエ レジョナル エ ウニベルシテール ド ブレスト

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ジャフレース，ポール−アライン

(72)【発明者】

【氏名】コウソン−コウルヴェス，ヘレン

(72)【発明者】

【氏名】アフォンソ，ダミエン

(72)【発明者】

【氏名】モンティエール，トリスタン

(72)【発明者】

【氏名】レ ガル，トニー

【審査官】 伊佐地 公美

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第０４０５９７０５（ＵＳ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２００６／０１６５７６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 ESPINOSA, L. M. et al.，Green Chemistry，2014年，Vol. 16，pp. 1883-1896

【文献】 MORE, A. S. et al.，Polymer Chemistry，2012年，Vol. 3，pp. 1594-1605

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｆ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（ＩＩａ）：

【化1】

（式中、
Ｚはアルキルアンモニウム塩であり、
ｎ、ｎ’、ｑおよびｑ’はそれぞれ独立して１〜１５の整数であり、
ｍ、ｍ’、ｐおよびｐ’はそれぞれ独立して０〜４の整数であるが、但し、
- ｍおよびｐの少なくとも１つは０とは異なり、
- ｍ’およびｐ’の少なくとも１つは０とは異なり、
Ｒ_１およびＲ_２は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、Ｒ_３およびＲ_４は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、ここで
Ｌ_４は、単結合、アルキル、シクロアルキル、およびアルキルアリールから選択されるリンカーであり、
Ｒ_５は、水素原子またはＯＨであり、
Ｒ_６は水素またはアルキルであり、
ｒは１〜１０の整数である）
の両親媒性化合物。

【請求項2】

Ｘ⁻がその対イオンである以下の表の化合物を含む群から選択される、両親媒性化合物。

【表1】

【請求項3】

ヘキサゴナル相を有することを特徴とする請求項１または２に記載の少なくとも１種の化合物を含むリポソーム。

【請求項4】

ヘキサゴナル相を有することを特徴とする請求項１または２に記載の少なくとも１種の化合物を含むリポプレックス。

【請求項5】

式（ＩＩａ）の化合物：

【化2】

（式中、
Ｚはアルキルアンモニウム塩であり、
ｎ、ｎ’、ｑおよびｑ’はそれぞれ独立して１〜１５の整数であり、
ｍ、ｍ’、ｐおよびｐ’はそれぞれ独立して０〜４の整数であるが、但し、
− ｍおよびｐの少なくとも１つは０とは異なり、
− ｍ’およびｐ’の少なくとも１つは０とは異なり、
Ｒ_１およびＲ_２は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、Ｒ_３およびＲ_４は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、ここで、
Ｌ_４は、単結合、アルキル、シクロアルキル、およびアルキルアリールから選択されるリンカーであり、
Ｒ_５は、水素原子またはＯＨであり、
Ｒ_６は水素またはアルキルであり、
ｒは１〜１０の整数である）
の生成方法であって、
ｉ）式（Ｉａ）の化合物：

【化3】

（式中、Ｒ_６、ｒ、Ｚ、ｎ、ｎ’、ｍ、ｍ’、ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は上に定義されているとおりである）
を少なくとも１種のラジカル開始剤の存在下で化合物Ｒ_５−Ｌ_４−ＳＨ（式中、Ｌ_４およびＲ_５は上に定義されているとおりである）と反応させる工程
を含む方法。

【請求項6】

請求項１または２に記載の化合物または請求項３に記載のリポソームまたは請求項４に記載のリポプレックスおよび生理学的に許容される媒体を含む医薬組成物。

【請求項7】

請求項１または２に記載の化合物または請求項３に記載のリポソームまたは請求項４に記載のリポプレックスを含む薬。

【請求項8】

インビトロでのベクター化のための請求項１または２に記載の化合物または請求項３に記載のリポソームまたは請求項４に記載のリポプレックスの使用。

【請求項9】

インビトロでのトランスフェクションのための請求項１または２に記載の化合物または請求項３に記載のリポソームまたは請求項４に記載のリポプレックスの使用。

【請求項10】

インビボでのベクター化のためのその使用のための請求項１または２に記載の化合物。

【請求項11】

インビボでのベクター化のためのその使用のための請求項４に記載のリポプレックス。

【請求項12】

インビボでのトランスフェクションにおけるその使用のため、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のため、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための請求項１または２に記載の化合物。

【請求項13】

トランスフェクションにおけるその使用のため、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のため、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための請求項３に記載のリポソーム。

【請求項14】

トランスフェクションにおけるその使用のため、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のため、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための請求項４に記載のリポプレックス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規な分岐鎖状両親媒性脂質に関する。特に本発明は、一般式（ＩＩ）の新規な分岐鎖状両親媒性脂質に関する。本発明は、一般式（Ｉ）の不飽和両親媒性化合物からの前記式（ＩＩ）の化合物の合成法も提案する。本発明は融合特性の改善が望まれる用途、特にトランスフェクションのための一般式（ＩＩ）の化合物および一般式（ＩＩ）の化合物の製剤化によって得られるリポプレックスの使用にも関する。

【化1】

【背景技術】

【0002】

カチオン性両親媒性脂質は、インビトロまたはインビボにおいて核酸（ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ）のベクター化のためによく使用されているベクターの非常に大きなクラスを構成する。

【0003】

Ｆｅｌｇｎｅｒらの先駆的研究 (Felgner, P.L.G.; Gadek, T.R.; Holm, M.; Roman, R.; Chan, H.W.; Wenz, M.; Northrop, J.P.; Ringold, M.G.; Danielsen, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1987, 84, 7413−7417)以後、トランスフェクションの有効性を高め、かつトランスフェクション機構の知識を拡大させることができるカチオン性両親媒性脂質の新規な構造を提案するための努力がなされている。

【0004】

トランスフェクションは、カチオン性両親媒性脂質とＤＮＡとの会合によって形成される超分子凝集体（リポプレックス）のおかげで行われる。エンドサイトーシス経路によって生じるこれらのリポプレックスの細胞への取り込み後に、リソソーム内に充填された核酸物質の分解を防止するためにはエンドソームからサイトゾルへの核酸物質の放出が必要である。

【0005】

エンドソーム膜の不安定化を促進するかリポプレックスの細胞への取り込み後にその安定性に影響を与えるための分子手法を用いた異なる戦略が探究されている。

【0006】

従って、エンドソーム膜を不安定化させるために、エンドソームにおいてプロトン化することができる（プロトンスポンジ効果）か、サイトゾルにおいて酵素または酸化還元反応によって切断することができる新規なカチオン性両親媒性脂質が提案されている。

【0007】

トランスフェクション効率を高めるための別の戦略は、リポプレックスの安定性および融合特性を高めることにある(a) Ewert, K.; Slack, N.L.; Ahmad, A.; Evans, H.M.; Lin, A.J.; Samuel, C.E.; Safinya, C.R. Curr Med Chem., 2004, 11, 133-49; b) Dan, N.; Danino, D. Adv Colloid Interface Sci., 2014, 205, 230-9)。特に研究によって、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）をカチオン性両親媒性脂質と会合させることによってトランスフェクションにおける改善が得られている。この改善は、ラメラ相よりも融合性が高いことが知られている逆ヘキサゴナル相をなすＤＯＰＥの性向によるものである。

【0008】

非ラメラ相を生成するための別の戦略は、カチオン性両親媒性脂質の分子形態に影響を与えることにある。Ｅｗｅｒｔらは、樹枝状頭部基を有するカチオン性両親媒性脂質の合成を報告した(Ewert, K.K.; Evans, H.M.; Zidovska, A.; Bouxsein N.F.; Ahmad, A.; Safinya, C.R. J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3998-4006)。このカチオン性極性頭部の形状により、それらを二成分製剤に含めた際にヘキサゴナル相Ｈ_Ｉの形成が誘導された。トランスフェクトするのが難しいことが知られている細胞株に対して高いトランスフェクション効率が観察された。Ｌｉｎｄｂｅｒｇらは、２本のフィタニル鎖（メチル化Ｃ１６アルキル鎖）をカチオン性リポ−ホスホロアミデート（ｌｉｐｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）構造の中に組み込むことにより水中での製剤化後に逆ヘキサゴナル相が生成されることを証明した(Lindberg, M.; Carmoy, N.; Le Gall, T.; Fraix, A.; Berchel, M.; Lorilleux, C.; Couthon-Gourves, H.; Bellaud, P.; Fautrel, A.; Jaffres, P.A.; Lehn, P.; Montier, T. Biomaterials 2012, 33, 6240-6253)。このベクターにより良好なインビボでのトランスフェクション効率が得られた。

【0009】

これらの全ての研究にも関わらず新規なベクターの開発がなお必要とされている。

【0010】

また、これらの新規な両親媒性脂質はインビボ実験のために必要とされる大規模生成のために最適化された合成経路によって得ることが望ましい。但し、新規な分岐鎖状両親媒性脂質を既存の両親媒性脂質構造の単純な修飾により得ることができ、高いモジュラリティーを可能にし、かつデノボ合成を必要としない、すなわち所望の分子を完全に合成する必要のない新規な合成法の開発がなお必要とされている。

【0011】

定義
本発明では、以下の用語は以下のように定義される。

【0012】

「造影剤」は解剖学的もしくは病理学的構造を可視化することができる化合物を指す。

【0013】

「アルケニル」とは、例えばエテニル、２−プロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニルおよびそれらの異性体、２−ヘキセニルおよびその異性体、２，４−ペンタジエニルなどの少なくとも１つの二重結合を有する炭素原子数２〜１２、好ましくは２〜６のあらゆる直鎖状もしくは分岐鎖状炭化水素鎖を指す。

【0014】

「アルキニル」とは、例えばエチニル、２−プロピニル、２−ブチニル、３−ブチニル、２−ペンチニルおよびそれらの異性体、２−ヘキシニルおよびその異性体などの少なくとも１つの三重結合を有する炭素原子数２〜１２、好ましくは２〜６のあらゆる分岐鎖状もしくは非分岐鎖状炭化水素鎖を指す。

【0015】

「アシルアミノ」とは、−ＮＲＣ（Ｏ）アルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）シクロアルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルキニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アリール、−ＮＲＣ（Ｏ）ヘテロアリールおよび−ＮＲＣ（Ｏ）複素環基（式中、Ｒは水素または以下に定義されているアルキルである）を指す。

【0016】

「アルキル」とは、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびそれらの異性体（例えばｎ−ペンチル、イソペンチル）、ヘキシルおよびその異性体（例えばｎ−ヘキシル、イソヘキシル）などの炭素原子数１〜１２、好ましくは１〜６、さらにより好ましくは、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルなどの炭素数１〜３のあらゆる飽和の直鎖状もしくは分岐鎖状炭化水素鎖を指す。

【0017】

「アルキルアミノ」とは、−ＮＨＲ基（式中、Ｒは上に定義されているアルキルである）を指す。

【0018】

「アルキルアリール」とは、上に定義され、かつアリール基によって結合されるアルキル基に共有結合的に結合された上に定義されているアリール基を含む基を指す。

【0019】

「アルキルオキシ」とは、あらゆる−Ｏ−アルキル基を指す。

【0020】

「アルキルオキシカルボニル」とは、あらゆる−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−アルキル基を指す。

【0021】

「アミン」とは−ＮＨ_２基を指す。

【0022】

「アミノカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリールおよび複素環を含む群から選択され、かつＲ’およびＲ’’は任意に複素環または例えば置換ピペラジンなどの置換複素環基を形成するためにそれらが結合する窒素によって互いに結合されている）を指す。

【0023】

「アミノチオカルボニル」とは、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ’’基（式中、Ｒ’およびＲ’’は独立して水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロアリールおよび複素環を含む群から選択され、かつＲ’およびＲ’’は任意に複素環または例えば置換ピペラジンなどの置換複素環基を形成するためにそれらが結合する窒素によって互いに結合されている）を指す。

【0024】

「両親媒性」とは、少なくとも１つの親水性基および少なくとも１つの疎水性基の両方を有する化学種を指す。トリグリセリドは両親媒性種ではなく、本発明の一実施形態によれば、式（ＩＩ）の化合物はトリグリセリドではない。

【0025】

「アリール」とは、１つまたはいくつかの芳香族環を有する炭素原子数５〜２０、好ましくは６〜１２の単環もしくは多環系を指し（２つのコアが存在する場合はビアリールと称す）、そのうち、フェニル基、ビフェニル基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、テトラヒドロナフチル基、インダニル基およびビナフチル基を挙げることができる。

【0026】

「アリールアルキル」とは、上に定義され、かつアルキル基によって結合されるアリール基に共有結合的に結合された上に定義されているアルキル基を含む基を指す。

【0027】

「対イオン」とは反対符号の可動性イオンを指す。これらの対イオンの非限定的な例としては、アルカリ金属、アルカリ土類金属、遷移金属、アンモニウム、ピリジニウム、塩化物、臭化物、ヨウ化物、トシラート、トリフラート、メチル硫酸のイオンが挙げられる。

【0028】

「シクロアルキル」とは、３〜８個の炭素原子を含む環式もしくは多環式のアルキル基、好ましくはシクロプロピル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル基を指す。

【0029】

「シクロアルケニル」とは、３〜８個の炭素原子を含む環式もしくは多環式のアルケニル基、好ましくはシクロプロペニル、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニル基を指す。

【0030】

「ジアルキルアミノ」とは、−ＮＲＲ’基（式中、ＲおよびＲ’は上に定義されているアルキルである）を指す。

【0031】

「複素環」とは、その炭素環の１つに少なくとも１個のヘテロ原子を有する完全飽和または部分不飽和の非芳香族基（例えば、３〜７個の原子を含む環式化合物、７〜１１個の炭素原子を含む二環式化合物）を指す。ヘテロ原子を含む複素環基の各環は窒素、酸素および／または硫黄から選択される１、２、３または４個のヘテロ原子を有することができ、その硫黄および窒素原子は任意に酸化されていてもよく、窒素原子は潜在的に四価である。複素環基は、結合価が許す場合にはその環のあらゆるヘテロ原子または炭素原子に結合されていてもよい。多環式複素環の環は１個またはいくつかのスピロ原子によって縮合、架橋および／または結合されていてもよい。これらの環の非限定的な例としては、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、ピペリジニル、アゼチジニル、２−イミダゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、イソオキサゾリニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、ピペリジニル、スクシンイミジル、３Ｈ−インドリル、インドリニル、イソインドリニル、２Ｈ−ピロリル、１−ピロリニル、２−ピロリニル、３−ピロリニル、ピロリジニル、４Ｈ−キノリジニル、２−オキソピペラジニル、ピペラジニル、ホモピペラジニル、２−ピラゾリニル、３−ピラゾリニル、テトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、オキセタニル、チエタニル、３−ジオキソラニル、１，４−ジオキサニル、２，５−ジオキソイミダゾリジニル、２−オキソピペリジニル、２−オキソピロロジニル、インドリニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリン−１−イル、テトラヒドロイソキノリン−２−イル、テトラヒドロイソキノリン−３−イル、テトラヒドロイソキノリン−４−イル、チオモルホリン−４−イル、チオモルホリン−４−イルスルホキシド、チオモルホリン−４−イルスルホン、１，３−ジオキソラニル、１，４−オキサチアニル、１，４−ジチアニル、１，３，５−トリオキサニル、１Ｈ−ピロリジニル、テトラヒドロ−１，１−ジオキソチオフェニル（ｄｉｏｘｏｔｈｉｏｐｈｅｎｙｌ）、Ｎ−ホルミルピペラジニルおよびモルホリン−４−イル基が挙げられる。

【0032】

「ヘテロアリール」とは、限定されるものではないが、典型的には５〜６個の原子を含む縮合されたか共有結合的に結合された炭素原子数５〜１２の芳香族環であって、その環の少なくとも１つの芳香族炭素の少なくとも１つが酸素、窒素または硫黄で置換されており、その窒素および硫黄は潜在的に酸化されていてもよく、その窒素は潜在的に四価の形態である芳香族環を指す。そのような環は、アリール、シクロアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルに縮合されていてもよい。これらの環の非限定的な例としては、ピロリル、フラニル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、オキサトリアゾリル、チアトリアゾリル、ピリジニル、ピリミジル、ピラジニル、ピリダジニル、オキサジニル、ジオキシニル、チアジニル、トリアジニル、イミダゾ［２，１−ｂ］［１，３］チアゾリル、チエノ［３，２−ｂ］フラニル、チエノ［３，２−ｂ］チオフェニル、チエノ［２，３−ｄ］［１，３］チアゾリル、チエノ［２，３−ｄ］イミダゾリル、テトラゾロ［１，５−ａ］ピリジニル、インドリル、インドリジニル、イソインドリル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、イソベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、１，３−ベンゾオキサゾリル、１，２−ベンゾイソオキサゾリル、２，１−ベンゾイソオキサゾリル、１，３−ベンゾチアゾリル、１，２−ベンゾイソチアゾリル、２，１−ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、１，２，３−ベンゾオキサジアゾリル、２，１，３−ベンゾオキサジアゾリル、１，２，３−ベンゾチアジアゾリル、２，１，３−ベンゾチアジアゾリル、チエノピリジニル、プリニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、６−オキソ−ピリダジン−１（６Ｈ）−イル、２−オキソ−ピリジン−１（２Ｈ）−イル、６−オキソ−ピリダジン−１（６Ｈ）−イル、２−オキソ−ピリジン−１（２Ｈ）−イル、１，３−ベンゾジオキソリル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル基が挙げられる。

【0033】

「プロトン化可能な中性複素環」とは、限定されるものではないが、典型的には５〜６個の原子を含む縮合されたか共有結合的に結合された炭素原子数５〜１２の芳香族環であって、その環の少なくとも１つの芳香族炭素の少なくとも１つは窒素で置換されており、かつプロトン化することができる芳香族環を指す。これらの環の非限定的な例としては、イミダゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、キノリン、キノキサリン、インドール基が挙げられる。

【0034】

「極性基」とは親水性基を指す。

【0035】

「反応基」とは、別の化学基と反応して共有結合を形成することができる基、すなわち好適な反応条件下で共有結合的に反応性である基を指し、一般に別の物質のための結合点である。反応基は、共有結合を形成するために異なる化合物上の官能基と化学的に反応することができる本発明の化合物上に存在する基である。反応基としては、一般に求核性基、求電子性基および光活性化基が挙げられる。

【0036】

「ハロ」とはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード基を指す。

【0037】

「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子を指し、好ましくは塩素、臭素およびヨウ素原子を指す。

【0038】

「リンカー」または「結合基」とは、共有結合または一連の安定な共有結合を含む基を指し、その基はＣ、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＰを含む群から選択される１〜４０個の多価原子を含み、基、カップリング官能基またはベクター化基（vectoring group）を本発明のリガンドの残りに共有結合的に結合させる。リンカー内の多価原子の数は、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５または３０であってもよい。リンカーは直鎖状であっても直鎖状でなくてもよく、特定のリンカーは側鎖またはペンダント官能基（あるいは両方）を有する。そのような側鎖の例は親水性改質基、例えばスルホ（−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ３−）またはカルボン酸（−ＣＯＯ−）などの例えば可溶化基である。一実施形態では、リンカーは、炭素−炭素、炭素−窒素、窒素−窒素、炭素−酸素および炭素−硫黄の単結合、二重結合、三重結合または芳香族結合のあらゆる組み合わせからなる。リンカーは、例えば、アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）ｎ−基（式中、ｎは０、１または２に等しい）から選択される基の組み合わせ、単環式の５もしくは６員環および官能性側鎖（例えば、スルホ、ヒドロキシまたはカルボキシ）からなっていてもよい。さらに、リンカーがカップリング官能基を本発明のリガンドの残りに結合させる場合、前記カップリング官能基はベクター化官能基を有する反応性物質と反応することができ、これによりベクター化基をリガンドの残りと結合させるリガンドが得られる。この場合、リンカーは典型的には、カップリング官能基の残基（例えば、エステルのカルボニル基、アジドとアルキンとのクリック反応により生じるトリアゾロ基またはたイソチオシアネート官能基上のアミンのカップリングにより生じる−ＮＨＣ（＝Ｓ）ＮＨ−基など）を含む。一実施形態によれば、リンカーは単共有結合を指す。

【0039】

「脂質」とは、飽和、不飽和または多価不飽和の直鎖状もしくは分岐鎖状炭素鎖を指す。このパターンを官能基によって両親媒性物質の構造に結合させることができる。

【0040】

「リポプレックス」とは核酸とリポソームとの複合体を指し、前記核酸はＤＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍＲＮＡであってもよい。

【0041】

「リポソーム」とは、その間に水性区画を封じ込める同心の脂質二重層によって形成された人工小胞を指す。リポソームは両親媒性物質から得られる。

【0042】

「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の成分が互いに適合可能であり、かつ患者に有害でないことを意味する。

【0043】

「プロドラッグ」とは、例えば、インビボにおけるその生体内変換生成物が生物学的に活性な化合物を生じるアミドまたはエステルなどの薬学的に許容される誘導体を指す。プロドラッグは一般に生物学的利用能の増加を特徴とし、容易に代謝されてインビボにおいて生物学的に活性な化合物になる。

【0044】

「有機塩」とは、中性生成物を形成し、かつ正味荷電を形成しないカチオンおよびアニオンからなり、前記イオンの少なくとも１つが本質的に有機である、すなわち炭素化合物であるイオン性化合物を指し、これらの有機塩の非限定的な例としては、アンモニウム、ホスホニウムおよびイミダゾリウム塩が挙げられる。

【0045】

「トランスフェクション」とは、外来性遺伝物質を真核細胞の中に導入することを指す。トランスフェクションはインビトロまたはインビボで行ってもよい。

【0046】

「ＵＶ」とは約３００ｎｍ〜約４００ｎｍの電磁スペクトルの一部を指す。

【0047】

「媒体」とは組成物中の目的の生成物を運ぶ物質を指し、特にそれを溶解させることができる物質であってもよい。媒体は例えば水であってもよい。

【0048】

リンリンカーは、以下に定義されているリンカーである（式中、Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、Ｒ’’’’およびＲ’’’’’は上に定義されているアルキルまたはアルキレンである）。

【化2】

【発明を実施するための形態】

【0049】

化合物
本発明は一般式（ＩＩ）：

【化3】

（式中、
Ｌ_１およびＬ_２はそれぞれ独立してリンカーであり、好ましくはこのリンカーは単結合およびアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルオキシまたはアルキルオキシカルボニル基から選択され、
Ｌ_３はリンカーであり、好ましくはこのリンカーはアルキル、アルキルホスホロアミデート、アルキルチオホスホロアミデート、アルキルホスフェート、アルキルチオホスフェート、アルキルホスホニト、アルキルホスホネート、アルキルチオホスホネート、アルキルホスホラミド、アルキルチオホスホラミド、アルキルオキシまたはアミン基から選択され、
Ｚは極性官能基であり、前記基はカチオン性、アニオン性、双性イオン性または中性であり、
ａは０または１であり、
ｎ、ｎ’、ｑおよびｑ’はそれぞれ独立して１〜１５の整数であり、
ｍ、ｍ’、ｐおよびｐ’はそれぞれ独立して０〜４の整数であるが、但し、
− ｍおよびｐの少なくとも１つは０とは異なり、
− ｍ’およびｐ’の少なくとも１つは０とは異なり、
Ｒ_１およびＲ_２は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、Ｒ_３およびＲ_４は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、ここで
Ｌ_４はリンカーであり、好ましくはこのリンカーは単結合およびアミノカルボニル、アシルアミノ、アルキルアミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルオキシ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）基、ペプチドまたはそれらの組み合わせから選択され、任意に−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ_２−またはそれらの組み合わせによって中断または終端していてもよく、任意にＬ_４をＲ_５に結合させる反応基の残基をさらに含み、
Ｒ_５は水素原子であるか、あるいは
− アンモニウム、ホスホニウムおよびイミダゾリウム型の有機塩ならびにプロトン化可能な中性複素環の群から選択される極性基、
− Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、チオシアネート、イソチオシアネート、イソシアネート、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアネート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミン、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン、尿素、イソ尿素、セミカルバジド、カルボジイミドおよびカルバメート基を含む群から選択される反応基、または
− プロドラッグ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、酵素、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光体、発色団、放射性同位体、カルボランおよびそれらの組み合わせから選択される生理活性基
であるが、
但し、ａが０に等しい場合、Ｚは−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨおよび−Ｃ（Ｏ）ＯＭｅとは異なる）
の両親媒性化合物に関する。

【0050】

本発明の化合物は官能化されるか官能化可能であるという利点を有する。一実施形態によれば、Ｒ_５が反応基である場合にはＲ_５を用いて官能化を行う。一実施形態によれば、プロトン化可能な中性複素環はイミダゾールおよびピリジン基である。

【0051】

一実施形態によれば、Ｌ_１およびＬ_２はそれぞれ独立して単結合またはアルキルオキシ基である。

【0052】

一実施形態によれば、Ｌ_３は、アルキル、アルキルホスフェート、アルキルホスホネート、アルキルホスホロアミデート、アルキルチオホスホラミド、アルキルオキシまたはアミン基から選択されるリンカーである。好ましい実施形態によれば、Ｌ_３はアルキルホスホロアミデート基である。別の好ましい実施形態によれば、Ｌ_３はアルキルオキシ基である。

【0053】

一実施形態によれば、Ｌ_４はリンカーであり、好ましくはこのリンカーは単結合およびアルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）基から選択される。一実施形態によれば、Ｌ_４は単結合またはリンカーであり、好ましくはこのリンカーはアルキル、シクロアルキル、アリールアルキル基から選択される。これらの実施形態では、Ｌ_４は好ましくはＣ１〜Ｃ１２アルキル、シクロアルキルおよびアリールアルキル基から選択される。好ましくは、Ｌ_４はベンジル、シクロヘキシル、プロピル、ヘキシル、ヘプチル、ウンデシルおよびドデシル基から選択される。

【0054】

一実施形態によれば、Ｒ_５は水素原子、アンモニウム、ホスホニウムおよびイミダゾリウム型の有機塩ならびにプロトン化可能な中性複素環の群から選択される極性基またはＯＨ、カルボン酸、アミン、保護されたチオール官能基、アジド、アルデヒド基から選択される反応基、またはプロドラッグ、蛍光体、発色団、放射性同位体またはカルボランから選択される生理活性基である。Ｒ_５は好ましくは水素原子、ＯＨ基またはプロドラッグである。Ｒ_５はより好ましくは水素原子、ＯＨ基またはイブプロフェンのプロドラッグである。

【0055】

一実施形態によれば、Ｚは、そのアンモニウム基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む５員ヘテロアリール、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環、１もしくは２個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよい第四級アンモニウム基、第三級アンモニウム、第二級アンモニウム、そのホスホニウム基が脂肪族鎖に含まれていてもよいホスホニウム、そのアルソニウム基が脂肪族鎖、５員環、６員環に含まれていてもよいアルソニウムおよびそれらの組み合わせから選択されるカチオン性極性官能基である。好ましい実施形態によれば、Ｚは、そのアンモニウム基が脂肪族鎖、１もしくは２個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよい第四級アンモニウム基、そのホスホニウム基が脂肪族鎖に含まれていてもよいホスホニウムおよびそのアルソニウム基が脂肪族鎖に含まれていてもよいアルソニウムおよびそれらの組み合わせから選択されるカチオン性極性官能基である。これらの実施形態では、Ｚはより好ましくは第四級アンモニウム、ホスホニウムおよびアルソニウム基であり、より好ましくは、Ｚは第四級アンモニウムであり、さらにより好ましくは、Ｚは−Ｎ^＋Ｍｅ_３官能基である。

【0056】

別の実施形態によれば、Ｚは、そのアンモニウム基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいアミノカルボン酸、アミノスルホン酸、カルボキシベタイン基、そのアンモニウム基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいスルホベタイン官能基、そのアンモニウム基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいベタイン官能基、そのアンモニウム基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいホスホベタイン官能基、ホスホリルコリン、ホスホコリン官能基およびそれらの組み合わせから選択される双性イオン性極性官能基である。好ましい実施形態によれば、Ｚは、そのアンモニウム基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいスルホベタイン官能基、およびそのアンモニウム基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいホスホベタイン官能基から選択される双性イオン性極性官能基である。これらの実施形態では、Ｚは、より好ましくはそのアンモニウム基が脂肪族鎖に含まれているスルホベタイン官能基であり、より好ましくは、Ｚは−Ｎ^＋Ｍｅ_２−（ＣＨ_２）_３−ＳＯ_３⁻官能基である。

【0057】

別の実施形態によれば、Ｚは、アミノ、アルキルアミノ、そのジアルキルアミノ基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいジアルキルアミノ基、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびそれらの組み合わせから選択される中性の極性官能基である。好ましい実施形態によれば、Ｚは、そのジアルキルアミノ基が脂肪族鎖、５員環、１、２もしくは３個の窒素原子を含む５員複素環、６員環、１、２、３もしくは４個の窒素原子を含む６員複素環に含まれていてもよいジアルキルアミノ基およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択される中性の極性官能基である。これらの実施形態では、Ｚはより好ましくは脂肪族鎖に含まれているジアルキルアミノ基またはポリエチレングリコールであり、好ましくは、Ｚは−ＮＭｅ_２基である。

【0058】

別の実施形態によれば、Ｚは、カルボン酸、スルホン酸、硫酸またはリン酸基およびそれらの組み合わせから選択されるアニオン性極性官能基である。好ましい実施形態によれば、Ｚは、カルボン酸、硫酸またはリン酸基から選択されるアニオン性極性官能基である。

【0059】

一実施形態によれば、本発明の化合物はカチオン性である。別の実施形態によれば、本化合物は中性である。別の実施形態によれば、本化合物は双性イオン性である。別の実施形態によれば、本化合物はアニオン性である。

【0060】

一実施形態によれば、ａは１に等しい。一実施形態によれば、ａは０に等しい。

【0061】

一実施形態によれば、ｎはｎ’に等しく、ｍはｍ’に等しく、ｐはｐ’に等しく、ｑはｑ’に等しい。

【0062】

一実施形態によれば、ｍおよびｐの合計は２に等しい。別の実施形態によれば、ｍおよびｐの合計は１に等しい。一実施形態によれば、ｍ’およびｐ’の合計は２に等しい。別の実施形態によれば、ｍ’およびｐ’の合計は１に等しい。

【0063】

一実施形態によれば、ｎ、ｎ’、ｑおよびｑ’はそれぞれ独立して４〜１０、好ましくは６〜９の整数である。特定の実施形態によれば、ｎおよびｎ’は７に等しく、ｑおよびｑ’は８に等しい。

【0064】

好ましい実施形態によれば、本発明の化合物は式（ＩＩａ）：

【化4】

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｚ、ｎ、ｎ’、ｍ、ｍ’、ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は上に定義されているとおりであり、Ｒ_６は水素またはアルキルであり、ｒは１〜１０の整数である）
の化合物ある。

【0065】

一実施形態によれば、ｒは１〜７の整数、好ましくは１〜４の整数である。

【0066】

別の好ましい実施形態によれば、本発明の化合物は式（ＩＩｂ）：

【化5】

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｚ、ｎ、ｎ’、ｍ、ｍ’、ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は上に定義されているとおりであり、ｓは１〜１０の整数である）
の化合物である。

【0067】

一実施形態によれば、ｓは１〜７の整数、好ましくは１〜４の整数である。

【0068】

一実施形態によれば、本発明の化合物は、Ｘ⁻がその対イオンである以下の表の化合物を含む群から選択される。

【表1】

【0069】

一実施形態では、対イオンは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、トシラート、トリフラート、メチル硫酸アニオンから選択されるアニオンであり、好ましくは、対イオンは、塩化物、臭化物、ヨウ化物アニオンから選択されるアニオンである。

【0070】

一実施形態によれば、化合物ＩＩ−１は、化合物ＩＩ−１ａ、ＩＩ−１ｂおよびＩＩ−１ｃの混合物である。同じように、化合物ＩＩ−Ｘは、化合物ＩＩ−Ｘａ、ＩＩ−ＸｂおよびＩＩ−Ｘｃの混合物である。

【0071】

本発明は、本明細書の上に記載されているような少なくとも１種の本発明の化合物を含むリポソームにも関する。特に本発明は、ヘキサゴナル相を有し、かつ式（ＩＩ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の化合物のうちの少なくとも１種を含むリポソームに関する。好ましい実施形態によれば、当該リポソームはヘキサゴナル相を有し、かつ少なくとも１種の式（ＩＩａ）の化合物を含む。別の好ましい実施形態によれば、当該リポソームはヘキサゴナル相を有し、かつ少なくとも１種の式（ＩＩｂ）の化合物を含む。

【0072】

一実施形態によれば、当該リポソームは、カチオン性である化合物、すなわちＺが式（ＩＩ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）のカチオン性極性官能基である化合物のみを含む。好ましい実施形態によれば、当該リポソームは式（ＩＩａ）のカチオン性化合物のみを含む。別の好ましい実施形態によれば、当該リポソームは式（ＩＩｂ）のカチオン性化合物のみを含む。

【0073】

一実施形態によれば、当該リポソームは、少なくとも１種の非分岐鎖状カチオン性両親媒性脂質と会合した式（ＩＩ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の少なくとも１種の中性化合物から形成されている。好ましい実施形態によれば、当該リポソームは少なくとも１種の非分岐鎖状カチオン性両親媒性脂質と会合した少なくとも１種の式（ＩＩａ）の中性化合物から形成されている。一実施形態によれば、非分岐鎖状カチオン性脂質は、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）または本発明の化合物Ｉ−１であってもよい。

【0074】

一実施形態によれば、当該リポソームはヘキサゴナル相を有する。一実施形態によれば、当該リポソームは直接ヘキサゴナル相を有する。一実施形態によれば、当該リポソームは逆ヘキサゴナル相を有する。

【0075】

本発明のリポソームは当業者によって知られている方法に従って得ることができる。

【0076】

一実施形態によれば、当該リポソームは、本発明の両親媒性脂質を溶解させる有機溶媒を蒸発させ、次いでそれらを浮遊状態で水性溶媒の中に入れることによって調製することができる。この操作は本発明の脂質の相転移温度よりも高い温度で行わなければならない。

【0077】

本発明は、本明細書の上に記載されているような少なくとも１種の本発明の化合物を含むリポプレックスにも関する。特に本発明は、ヘキサゴナル相を有し、かつ式（ＩＩ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の化合物のうちの少なくとも１種を含むリポプレックスに関する。一実施形態によれば、当該リポプレックスは、カチオン性である化合物、すなわちＺが式（ＩＩ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）のカチオン性極性官能基である化合物のみを含む。好ましい実施形態によれば、当該リポプレックスは式（ＩＩａ）のカチオン性化合物のみを含む。別の好ましい実施形態によれば、当該リポプレックスは式（ＩＩｂ）のカチオン性化合物のみを含む。

【0078】

一実施形態によれば、当該リポプレックスは、少なくとも１種の式（Ｉ）の非分岐鎖状カチオン性両親媒性脂質と会合した式（ＩＩ）、（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）の少なくとも１種の中性化合物から形成されている。好ましい実施形態によれば、当該リポプレックスは、少なくとも１種の式（ＩＩａ）の中性化合物ならびに少なくとも１種の式（Ｉ）の非分岐鎖状カチオン性両親媒性脂質を含む。一実施形態によれば、当該非分岐鎖状カチオン性脂質はＤＯＴＭＡまたは本化合物Ｉ−１であってもよい。

【0079】

一実施形態によれば、当該リポプレックスはヘキサゴナル相を有する。一実施形態によれば、当該リポプレックスは直接ヘキサゴナル相を有する。一実施形態によれば、当該リポプレックスは逆ヘキサゴナル相を有する。

【0080】

本発明のリポプレックスは当業者によって知られている方法に従って得ることができる。当該リポプレックスは所与の量のＤＮＡを本発明の両親媒性脂質と混合することによって調製する。一実施形態によれば、当該リポプレックスの電荷比は０．３〜１５．０、好ましくは０．５〜８．０であってもよい。

【0081】

方法
本発明の化合物は当業者によって知られている反応に従って得ることができる。

【0082】

本発明は、本発明の化合物の製造方法にも関する。特に本発明は、チオール−エン型の反応によってそれらの脂質部分において既存の両親媒性脂質の構造を容易かつ迅速に調節することを可能にする化学合成法に関する。

【0083】

本発明は、式（ＩＩ）の化合物：

【化6】

（式中、
Ｌ_１およびＬ_２はそれぞれ独立してリンカーであり、好ましくはこのリンカーは単結合およびアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルオキシまたはアルキルオキシカルボニル基から選択され、
Ｌ_３はリンカーであり、好ましくはこのリンカーはアルキル、アルキルホスホロアミデート、アルキルチオホスホロアミデート、アルキルホスフェート、アルキルチオホスフェート、アルキルホスホニト、アルキルホスホネート、アルキルチオホスホネート、アルキルホスホラミド、アルキルチオホスホラミド、アルキルオキシまたはアミン基から選択され、
Ｚは極性官能基であり、前記基はカチオン性、アニオン性、双性イオン性または中性であり、
ａは０または１であり、
ｎ、ｎ’、ｑおよびｑ’はそれぞれ独立して１〜１５の整数であり、
ｍ、ｍ’、ｐおよびｐ’はそれぞれ独立して０〜４の整数であるが、但し、
− ｍおよびｐの少なくとも１つは０とは異なり、
− ｍ’およびｐ’の少なくとも１つは０とは異なり、
Ｒ_１およびＲ_２は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、Ｒ_３およびＲ_４は一方は水素であり、かつ他方は式−Ｓ−Ｌ_４−Ｒ_５のチオエーテル基であり、ここで
Ｌ_４はリンカーであり、好ましくはこのリンカーは単結合およびアミノカルボニル、アシルアミノ、アルキルアミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキル、アリール、シクロアルキル、アルキルアリール、アリールアルキル、アルキルオキシ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）基、ペプチドまたはそれらの組み合わせから選択され、任意に−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ_２−またはそれらの組み合わせによって中断または終端していてもよく、任意にＬ_４をＲ_５に結合させる反応基の残基をさらに含み、
Ｒ_５は水素原子であるか、あるいは
− アンモニウム、ホスホニウムおよびイミダゾリウム型の有機塩ならびにプロトン化可能な中性複素環の群から選択される極性基、
− Ｎ３、アミノ、アルキルアミノ、ＣＯＯＨ、アミド、マレイミド、アルキン、ＳＨ、ＯＨ、エステル、活性化エステル、活性化カルボン酸、ハロ、ニトロ、ニトリル、イソニトリル、アクリルアミド、アルデヒド、ケトン、アセタール、ケタール、無水物、チオシアネート、イソチオシアネート、イソシアネート、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、エーテル、オキシド、シアネート、ジアゾ、ジアゾニウム、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸、スルフェン酸、アミジン、イミド、イミン、イミデート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン、尿素、イソ尿素、セミカルバジド、カルボジイミドおよびカルバメート基を含む群から選択される反応基、または
− プロドラッグ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、酵素、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光体、発色団、放射性同位体、カルボランおよびそれらの組み合わせから選択される生理活性基である）
の生成方法であって、
ｉ）式（Ｉ）の化合物：

【化7】

（式中、Ｌ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｚ、ａ、ｎ、ｎ’、ｍ、ｍ’、ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は上に定義されているとおりである）
をチオールＲ_５−Ｌ_４−ＳＨ（式中、Ｌ_４およびＲ_５は上に定義されているとおりである）と少なくとも１種のラジカル開始剤の存在下で反応させる工程と、
ｉｉ）任意に、反応（ｉ）の生成物をプロドラッグ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、酵素、多糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光体、発色団、放射性同位体およびカルボランおよびそれらの組み合わせから選択される生物活性分子と反応させる工程と
を含む方法にも関する。

【0084】

化合物（ＩＩ）について上に定義されているＬ_１、Ｌ_２、Ｌ_３、Ｌ_４、Ｚ、ａ、ｎ、ｎ’、ｍ、ｍ’、ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４の好ましい実施形態は、本方法および試薬、すなわち化合物（Ｉ）および化合物Ｒ_５−Ｌ_４−ＳＨにも当てはまる。

【0085】

一実施形態によれば、工程（ｉ）は一般に過剰なチオールの存在下で行う。一実施形態によれば、工程（ｉ）を１．１当量〜５０当量、好ましくは１．１〜５当量、より好ましくは１．１〜４当量の量のチオールの存在下で行う。一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物が不飽和を含む場合、工程（ｉ）を１．１当量以上の量のチオールの存在下で行う。一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物が２個の不飽和を含む場合、工程（ｉ）を２．１当量以上の量のチオールの存在下で行う。一実施形態によれば、式（Ｉ）の化合物がｘ個の不飽和を含む場合、工程（ｉ）を（ｘ＋０．１）当量以上の量のチオールの存在下で行う。

【0086】

一実施形態によれば、工程（ｉ）を一般に少なくとも１種のラジカル開始剤の存在下で行う。一実施形態によれば、ラジカル開始剤を熱活性化または光活性化させることができ、より好ましくは、熱活性化されたラジカル開始剤はアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン］二塩酸塩、アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（ＡＢＡＨ）またはアゾビス−シアノペンタン酸などのジアゾ化合物を含む群から選択され、光活性化ラジカル開始剤は、カンファーキノン、ベンゾフェノン、ベンゾフェノン誘導体、アセトフェノン、アセトフェノン誘導体、例えばα−ヒドロキシシクロアルキルフェニルケトンまたは２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニルプロパノン、ジアルコキシアセトフェノン、例えば２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、α−ヒドロキシ−もしくはα−アミノ−アセトフェノン、例えば（４−メチルチオベンゾイル）−１−メチル−１−モルホリノエタン、好ましくはアセトフェノンおよびアセトフェノン誘導体、より好ましくは２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンを含む群から選択される。

【0087】

一実施形態によれば、工程（ｉ）は一般に少なくとも１種の熱活性化されたラジカル開始剤の存在下で行う。別の実施形態によれば、工程（ｉ）は一般に少なくとも１種の光活性化ラジカル開始剤の存在下で行う。好ましい実施形態によれば、工程（ｉ）を２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンの存在下で行う。好ましい実施形態によれば、工程（ｉ）を光活性化ラジカル開始剤の存在下で行う。好ましい実施形態によれば、工程（ｉ）を２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンの存在下でのみ行う。

【0088】

一実施形態によれば、工程（ｉ）を式（Ｉ）の非分岐鎖状両親媒性脂質に対して０．１モル％〜５０モル％の含有量、好ましくは式（Ｉ）の非分岐鎖状両親媒性脂質に対して０．１モル％〜２５モル％の含有量、さらにより好ましくは式（Ｉ）の非分岐鎖状両親媒性脂質に対して０．５モル％〜１５モル％の含有量のラジカル開始剤の存在下で行う。

【0089】

一実施形態によれば、工程（ｉ）を溶媒の非存在下で行う。一実施形態によれば、工程（ｉ）を周囲温度で行う。一実施形態によれば、工程（ｉ）を紫外線下で行う。一実施形態によれば、工程（ｉ）を不活性雰囲気下で行う。一実施形態によれば、得られた化合物を当業者によって知られているクロマトグラフ法を用いて精製する。

【0090】

使用
本発明は、本発明に係る式ＩＩの化合物、リポソームおよび／またはリポプレックスと生理学的に許容される媒体とを含む組成物に関する。一実施形態によれば、本発明の組成物は薬学的に許容される媒体と組み合わせた式ＩＩの化合物を含む医薬組成物である。一実施形態によれば、式ＩＩの化合物は式ＩＩａの化合物である。別の実施形態によれば、式ＩＩの化合物は式ＩＩｂの化合物である。

【0091】

本発明は、本発明に係る式ＩＩの化合物、リポソームおよび／またはリポプレックスを含む薬に関する。本発明は式ＩＩの化合物を含む薬に関する。一実施形態によれば、式ＩＩの化合物は式ＩＩａの化合物である。別の実施形態によれば、式ＩＩの化合物は式ＩＩｂの化合物である。

【0092】

以下に記載されている使用は、本発明に係る式ＩＩの化合物、医薬組成物または薬の使用に関する。

【0093】

本発明は、融合特性の改善が望まれる用途のための本発明の式ＩＩの化合物または本発明のリポソームまたは本発明のリポプレックスの使用にも関する。

【0094】

本発明は、インビトロまたはインビボでのベクター化、すなわち目的の分子の膜貫通移動のためのその使用のための本発明に係るリポソームまたはリポプレックスにも関する。従って本発明は、インビトロまたはインビボでのベクター化、すなわち目的の分子の膜貫通移動のための本発明に係るリポソームまたはリポプレックスの使用にも関する。

【0095】

一実施形態によれば、本発明は、インビボでのトランスフェクションにおけるその使用のため、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のため、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための本発明の式ＩＩの化合物または本発明の化合物の製剤化によって得られるリポプレックスに関する。

【0096】

一実施形態によれば、本発明は、インビボでの細胞のトランスフェクションのためのその使用のための本発明の式ＩＩの化合物に関する。一実施形態によれば、本発明は、インビボでの細胞のトランスフェクションのためのその使用のための本発明の式ＩＩの化合物の製剤化によって得られるリポプレックスに関する。一実施形態によれば、本発明はインビトロでの細胞のトランスフェクションのための本発明の式ＩＩの化合物または本発明の化合物の製剤化によって得られるリポプレックスの使用に関する。

【0097】

一実施形態によれば、本発明はプロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のためのその使用のための本発明の式ＩＩの化合物に関する。一実施形態によれば、本発明は、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のためのその使用のための本発明に係るリポソームまたはリポプレックスに関する。一実施形態によれば、本発明はプロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のための本発明の化合物または本発明の化合物の製剤化によって得られるリポプレックスの使用に関する。

【0098】

一実施形態によれば、本発明は、トランスフェクションにおけるその治療的使用のため、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のため、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための本発明の式ＩＩの化合物に関する。一実施形態によれば、本発明は、トランスフェクションにおけるその治療的使用のため、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のため、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための本発明のリポソームに関する。一実施形態によれば、本発明は、トランスフェクションにおけるその治療的使用のため、プロドラッグ、増感剤または造影剤の送達のため、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための本発明のリポプレックスに関する。一実施形態によれば、本発明は、遺伝子治療、局所治療（皮膚科、眼科）、美容または殺菌作用のための本発明の化合物、リポソームまたは本発明の化合物の製剤化によって得られるリポプレックスの使用に関する。一実施形態によれば、本発明は、遺伝子治療、局所治療または殺菌作用のための本発明の化合物、リポソームまたは本発明の化合物の製剤化によって得られるリポプレックスの治療的使用に関する。

【0099】

一実施形態によれば、本発明は、美容治療のための本発明の化合物、リポソームまたは本発明の化合物の製剤化によって得られるリポプレックスの使用に関する。

【0100】

一実施形態によれば、式ＩＩの化合物は式ＩＩａの化合物である。別の実施形態によれば、式ＩＩの化合物は式ＩＩｂの化合物である。

【0101】

式ＩＩにおいてＲ_５がプロドラッグである場合、本発明は、対応する薬物によって標的化される疾患の治療および／または予防のための式ＩＩの化合物の使用に関する。式ＩＩにおいてＲ_５がプロドラッグである場合、本発明は、前記疾患を改善および／または予防するのに有効な量での本発明に係る式ＩＩの化合物またはリポソームまたはリポプレックスの対象への投与を含む、対応する薬物によって標的化される疾患の治療および／または予防方法にも関する。式ＩＩにおいてＲ_５がプロドラッグである場合、本発明は対応する薬物によって標的化される疾患の治療および／または予防のための薬の調製のための式ＩＩの化合物の使用にも関する。

【0102】

一実施形態によれば、当該対象は動物、より好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。

【0103】

一実施形態によれば、式ＩＩの化合物、本発明のリポソームおよびリポプレックスを注射に適した形態で製剤化する。この注射は、皮内、筋肉内、腹膜内または皮下であってもよい。一実施形態では、式ＩＩの化合物、リポソームおよびリポプレックスを例えば無菌水溶液、分散液、乳濁液、懸濁液などの溶液の形態で製剤化する。微生物によるあらゆる汚染を防止するために、抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサールおよび他の同様の薬剤などの１種または幾種かの防腐剤を本医薬組成物に添加することができる。また、注射によって引き起こされる痛みを減らすために糖類または塩化ナトリウムなどの１種以上の等張剤を本医薬組成物に添加することが好ましい。

【図面の簡単な説明】

【0104】

【図1】周囲温度で行った化合物Ｉ−１、ＩＩ−１、ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４およびＩＩ−８（１／１の比で化合物Ｉ−１を含む混合物）の³¹P NMRスペクトル（ハーンエコー法）のセットである。

【図2】単独（−）またはＤＯＰＥと共に製剤化した（＋）本発明の各種化合物によるＤＮＡ凝縮の評価に関する。Ａは泳動後の１％アガロースゲルであり（１ウェル当たり０．１μｇのＤＮＡ）、Ｂは電荷比に対するＤＮＡの低いバンドの蛍光を示すグラフである。ＤＮＡの低いバンドの蛍光を定量化し、次いで複合体化されていない裸のＤＮＡについて測定した最大蛍光に対する割合として表した。

【図3】本発明の化合物および対照、すなわち化合物Ｉ−１およびＤＯＴＭＡによる細胞Ｃ２Ｃ１２のインビトロでのトランスフェクションの有効性を示す棒グラフである。非トランスフェクト細胞（複合化されていない裸のＤＮＡ「ＤＮＡ」に対して曝露）を用いて陽性の閾値（破線）を決定する。ＣＲ：電荷比。

【図4】本発明の化合物および対照、すなわち化合物Ｉ−１およびＤＯＴＭＡによるインビトロでのトランスフェクション後のＣ２Ｃ１２細胞の生存率を示す棒グラフである。基準（値１００％、破線）として非トランスフェクト細胞（複合化されていない裸のＤＮＡ「ＤＮＡ」に対して曝露）の生存率を使用する。ＣＲ：電荷比。

【図5】直鎖状脂肪鎖を含む化合物によって得られる細胞に対して表される分岐鎖状脂肪鎖を含む化合物のトランスフェクションの有効性および細胞生存率を示す棒グラフである。各化合物について検討した値は有効性がピークに達した電荷比において得られた値であった。

【実施例】

【0105】

本発明を非限定的に示す以下の実施例を読めば本発明についてさらに深く理解するであろう。

【0106】

合成

【0107】

略語
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＲＮＡ：リボ核酸
ｓｉＲＮＡ：低分子干渉ＲＮＡ
ｍＲＮＡ：メッセンジャーＲＮＡ
℃：摂氏
ＤＯＴＭＡ：Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地
ｅｑ．：当量
ＥＧＦＰ−Ｌｕｃ：高感度緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼ
μｓ：マイクロ秒
Ｐｐｍ：１００万分の１
ＣＲ：電荷比
ＮＭＲ：核磁気共鳴
ＴＭＳ：テトラメチルシラン
ＵＶ：紫外線

【0108】

材料
通常の方法に従って、使用する溶媒を精製した。

【0109】

開始基質はＡｌｄｒｉｃｈ社、ＴＣＩ社またはAlfa Aesar社によって供給されたものであり、どんなさらなる精製も行わずに使用した。２−（（ビス（Ｅ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ）ホスホリル）アミノ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルエタナミニウムヨージド（試薬Ｉ−１）を、文献(Le Corre, S.S.; Berchel, M.; Belmadi, N.; Denis, C.; Haelters, J.P.; Le Gall, T.; Lehn, P.; Montier, T.; Jaffres, P.A. Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 1463-1474)に従って合成した。

【化8】

【0110】

全ての化合物を核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）^１Ｈ（５００．１３または４００．１３３または３００．１３５ＭＨｚ）、^１３Ｃ（１２５．７７３または７５．４８０ＭＨｚ）および^３１Ｐ（１６１．９７０または１２１．４９８ＭＨｚ）（Bruker AC 300、Avance DRX 400 およびAvance DRX 500分光計）によって特性評価した。Ｊカップリング定数はヘルツで示されている。以下の略語が使用されている（ｓ：一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｑ：四重線、ｑｔ：五重線、ｍ：多重線、ｄｄ：二重線の二重線、ｄｔ：三重線の二重線）。

【0111】

当該化合物を質量分析(Bruker Autoflex MALDI TOF-TOF III LRF200 CID)によっても特性評価した。

【0112】

結果

【0113】

１）双性イオン性試薬の合成

【化9】

【0114】

ジオレイルホスホラミド（１当量）のクロロホルム溶液にプロパンスルホン（１．２当量）を添加する。反応媒体を周囲温度で７２時間撹拌する。次いで、得られた粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。

【0115】

本明細書の上に記載されている方法に従って以下の化合物を合成した。

【0116】

化合物Ｉ−２：収率：４４％， ³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO₄: CDCl₃中0 ppm): 9.4; ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 0.85-0.89 (t, ³J_H-H= 6.8 Hz, 6 H, CH₃-CH₃), 1.21-1.29 (m, 46 H, CH₂ 脂肪鎖), 1.62-1.65 (m, 4 H, CH₂-CH₂-O-P), 1.96-2.01 (m, 8 H, CH₂-CH=CH-CH₂), 2.19-2.26 (m, 2 H, ⁺N-CH₂-CH₂-CH₂-S), 2.89-2.91 (m, 2 H, ⁺N-CH₂-CH₂-CH₂-S), 3.24 (s, 6 H, (CH₃)₂N⁺), 3.41-3.47 (m, 2 H, ⁺N-CH₂-CH₂), 3.51-3.61 (m, 2 H, N-CH₂-CH₂-⁺N-CH₂), 3.67-3.72 (m, 2 H, N-CH₂-CH₂-⁺N-CH₂), 3.90-3.96 (m, 4 H, CH₂-O-P), 4.82-5.00 (m, 1 H, P-NH), 5.29-5.37 (m, 4 H, CH=CH); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 14.2 (CH₃-CH₂), 25.5 (CH₂ 脂肪鎖), 27.2 (CH₂ 脂肪鎖), 28.9-30.5 (CH₂ 脂肪鎖), 31.9 (CH₂ 脂肪鎖), 51.3 ((CH₃)₂N⁺), 67.0 (CH₂-O-P), 129.9-130.2 (CH=CH)

【0117】

２）本発明の化合物の合成

【0118】

２．１）両親媒性脂質を用いたクリックケミストリー

【化10】

【0119】

式（Ｉ）の化合物（１当量）およびチオール（３．５当量）をガラス管の中で混合し、これを式（Ｉ）の化合物が完全に溶解するまで超音波浴に入れる（１０〜２０分）。この混合物をアルゴンで脱気した後、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（１０重量％）を添加する。この溶液を周囲温度でＵＶ下に４時間置く。次いで、得られた粗生成物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。

【0120】

本明細書の上に記載されている方法に従って以下の化合物を合成した。

【0121】

化合物ＩＩ−１：収率：４２％（１２０ｍｇ）； ³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO₄: CHCl₃中0 ppm) = 8.6; ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 0.84-0.91 (m, 12H, CH₃-CH₂), 1.30-1.66 (m, 76H, CH₂ 脂肪鎖), 2.43-2.47 (t, ³J_H-H = 8.0Hz, 4H, CH₂-S), 2.50-2.56 (qt, ³J_H-H = 6Hz, 2H, (CH₂)₂CH-S), 3.45 (s, 9H, ⁺N(CH₃)₃), 3.55-3.63 (m, 2H, CH₂-NH), 3.85-3.88 (m, 2H, CH₂-⁺N(CH₃)₃), 3.95-3.99 (m, 4H, CH₂-O-P), 4.40-4.53 (m, 1H, NH); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 13.8 (CH₃-CH₂), 22.3-31.6 (CH₂ 脂肪鎖), 34.6 (CH₂-CH-CH₂), 35.9 (CH₂-NH), 45.6 (CH-S), 54.5 (⁺N(CH₃)₃), 66.4 (CH₂-⁺N(CH₃)₃), 66.8 (d, ²J_C-P = 5.2Hz, CH₂-O-P); MALDI-TOF: C₅₃H₁₁₂N₂O₃PS₂についての[M]⁺計算値 = 919.785, [M]⁺実測値 = 919.775

【0122】

化合物ＩＩ−２：収率：６５％（１５０ｍｇ）； ³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO_4: CHCl₃中0 ppm) = 8.6; NMR ¹H: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 0.85-0.88 (t, ³J_H-H = 6.4 Hz, 12H, CH₃-CH₂), 1.24-1.66 (m, 76H, 脂肪鎖), 2.43-2.47 (t, ³J_H-H = 8.0Hz, 4H, CH₂-S), 2.51-2.55 (qt, ³J_H-H = 8.0Hz, 2H, (CH₂)₂CH-S), 3.45 (s, 9H, ⁺N(CH₃)₃), 3.50-3.61 (m, 2H, CH₂-NH), 3.83-3.86 (m, 2H, CH₂-⁺N(CH₃)₃), 3.95-4.00 (m, 4H, CH₂-O-P), 4.30-4.43 (m, 1H, NH); NMR ¹³C: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 13.9 (CH₃-CH₂), 22.5 ppm-31.8 (CH₂ 脂肪鎖), 34.8 (CH₂-CH-CH₂), 36.0 (CH₂-NH), 45.8 (CH-S), 54.7 (⁺N(CH₃)₃), 66.6 (CH₂-⁺N(CH₃)₃), 66.9 (d, ²J_C-P = 5.3Hz, CH₂-O-P); MALDI-TOF: C₆₅H₁₃₆N₂O₃PS₂についての[M]⁺計算値 = 1087.975; [M]⁺実測値 = 1087.972

【0123】

化合物ＩＩ−３：収率：５８％（１５０ｍｇ）； ³¹P NMR: δ(ppm, 基準 85% H₃PO₄: CHCl₃中0 ppm) = 8.7; ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 0.83-0.91 (m, 6H, CH₃-CH₂), 1.25-1.68 (m, 60H, 脂肪鎖), 2.45-2.51 (qt, J_H-H = 6.4Hz, 2H, (CH₂)₂CH-S), 3.43 (s, 9H, ⁺N(CH₃)₃), 3.48-3.52 (m, 2H, CH₂-NH), 3.68 (s, 4H, CH₂-Ph), 3.83-3.86 (m, 2H, CH₂-⁺N(CH₃)₃), 3.96-4.01 (m, 4H, CH₂-O-P), 4.30-4.45 (m, 1H, NH), 7.19-7.33 (m, 10H, CH 芳香族); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 14.1 (CH₃-CH₂), 22.6-31.8 (CH₂ 脂肪鎖), 34.5 ((CH₂)₂-CH-S), 35.0 (CH₂-Ph), 45.3 ((CH₂)₂-CH-S), 54.8 ((CH₃)₃N+), 66.6 (CH₂-⁺N(CH₃)₃), 67.1 (d, ²J_P-C= 5.3ppm, CH₂-O-P), 126.7 (CH 芳香族), 128.3-129.0 (CH 芳香族), 138.9 (第四級 C); MALDI-TOF: C₅₅H₁₀₀N₂O₃PS₂についての[M]⁺計算値 = 931.691; [M]⁺実測値 = 931.686

【0124】

化合物ＩＩ−４：収率：５１％（１３３ｍｇ）； ³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO₄: CHCl₃中0 ppm) = 8.6; ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 0.81-0.87 (t,³J_H-H = 8 Hz, 6H, CH₃-CH₂), 1.24-1.90 (m, 80H, 脂肪鎖), 2.58-2.62 (m, 4H, CH-S-CH), 3.53 (s, 9H, ⁺N(CH₃)₃), 3.50-3.60 (m, 2H, CH₂-NH), 3.83-3.85 (m, 2H, CH₂-⁺N(CH₃)₃), 3.93-3.98 (m, 4H, CH₂-O-P), 4.30-4.40 (m, 1H, NH); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CHCl₃中0 ppm) = 14.1 (CH₃-CH₂), 22.6-31.9 (CH₂ 脂肪鎖), 34.3 (CH₂ シクロヘキシル), 35.5 ((CH₂)₂-CH-S), 36.2 (CH₂-NH), 42.6 (CH シクロヘキシル), 44.2 ((CH₂)₂-CH-S), 54.9 (⁺N(CH₃)₃), 66.7 (CH₂-⁺N(CH₃)₃), 67.1 (P-O-CH₂); MALDI-TOF: C₅₃H₁₀₈N₂O₃PS₂についての[M]⁺計算値 = 915.753; [M]⁺実測値 = 915.741

【0125】

化合物ＩＩ−５：収率：６１％（１９９ｍｇ）； ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm) = 0.83-0.87 (t, ³J_H-H = 6.6 Hz, 12H), 1.23-1.24 (m, 73H, CH₂ 脂肪鎖), 1.35-1.37 (m, 12H, CH₂ 脂肪鎖), 1.46-1.54 (m, 16H, CH₂-CH₂-S, CH₂-CH-S および CH₂ 脂肪鎖), 2.41-2.45 (t, ³J_H-H = 7.4 Hz, 4H, CH₂-S), 2.48-2.55 (qt, ³J_H-H = 7.3 Hz, 2H, (CH₂)-CH-S), 3.37-3.56 (m, 15H, OCH₂および⁺N(CH₃)₃), 3.65-3.69 (m, 1H, OCH), 3.95-3.99 (m, 2H, OCH₂); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm) = 14.1 (CH₃-CH₂), 22.7 (CH₂ 脂肪鎖), 26.0 (CH₂ 脂肪鎖), 26.2 (CH₂ 脂肪鎖), 26.8 (CH₂ 脂肪鎖), 29.0-29.9 (CH₂ 脂肪鎖), 30.35 (CH₂-S-CH), 31.90 (CH₂ 脂肪鎖), 34.91 (CH₂ 脂肪鎖), 46.88 ((CH₂)₂-CH-S), 54.79 (⁺N(CH₃)₃), 67.93 (OCH₂), 68.38 (OCH₂), 69.31 (OCH₂), 72.01 (OCH₂), 73.63 (OCH)

【0126】

化合物ＩＩ−６：収率：４８％（１４０ｍｇ）； ³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO_4: CDCl₃中0 ppm): 8.3; ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 0.85-0.89 (t, ³J_H-H = 8 Hz, 6 H, CH₃-CH₂), 1.24-1.56 (m, 75 H, CH₂ 脂肪鎖), 1.49-1.56 (m, 12 H, CH₂ 脂肪鎖), 1.63-1.66 (m, 4 H, CH₂-CH₂-O), 1.95-2.06 (m, 4 H, CH₂-CH₂-OH), 2.43-2.47 (t, ³J_H-H= 7.2 Hz, 4 H, CH₂-S), 2.51-2.54 (m, 2 H, CH-S), 3.44 (s, 9 H, (CH₃)₃N⁺), 3.48-3.58 (m, 2 H, ⁺N-CH₂-CH₂), 3.59-3.63 (t, ³J_H-H= 6.8 Hz, 4 H, CH₂-OH), 3.85-3.88 (m, 2 H, CH₂-O-P), 3.96-4.01 (m, 4 H, CH₂-O-P), 4.51-4.62 (m, 1 H, NH-P); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 14.1 (CH₃-CH₂), 22.6-36.0 (CH₂ 脂肪鎖), CH₂-S), 39.2 (CH₂-NH-P), 45.9 ((CH₂)₂-CH-S), 54.8 (⁺N(CH₃)₃), 62.8 (CH₂-CH₂-OH), 66.5 (CH₂-⁺N(CH₃)₃), 67.2-67.3 (d, ²J_H-H= 22 Hz, CH₂-O-P)

【0127】

化合物ＩＩ−７：収率：２３％（６５ｍｇ）； ³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO_4: CDCl₃中0 ppm): 8.2; ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 0.86-0.89 (t, ³J_H-H= 6.4 Hz, 6 H, CH₃-CH₂), 1.24-1.37 (m, 68 H, CH₂ 脂肪鎖), 1.46-1.66 (m, 16 H, CH₂ 脂肪鎖), 2.29-2.40 (m, 4 H, CH₂-CH₂-OH), 2.44-2.47 (t, ³J_H-H = 7.2 Hz, 4 H, CH₂-S), 2.51-2.53 (m, 2 H, CH-S), 3.45 (s, 9 H, (CH₃)₃N⁺), 3.47-3.54 (m, 2 H, ⁺N-CH₂-CH₂), 3.59-3.63 (t, ³J_H-H = 6.8 Hz, 4 H, CH₂-OH), 3.86-3.88 (m, 2 H, CH₂-NH-P), 3.97-4.02 (m, 4 H, CH₂-O-P), 4.51-4.62 (m, 1 H, NH-P); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 14.1 (CH₃-CH₂), 22.7-36.1 (CH₂ 脂肪鎖 および CH₂-S および CH₂-CH₂-OH), 45.9 (CH-S), 54.9 ((CH₃)₃N⁺), 62.8 (CH₂-OH), 66.5 (CH₂-NH-P), 67.4-67.5 (d, ²J_P-C = 21 Hz, CH₂-O-P)

【0128】

化合物ＩＩ−８：収率：５１％； ³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO₄: CDCl₃中0 ppm): 9.5, ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 0.86-0.88 (t, ³J_H-H= 6.8 Hz, 12 H, CH₃-CH₂), 1.24-1.57 (m, 89 H, CH₂ 脂肪鎖), 1.63-1.64 (m, 4 H, CH₂-CH₂-O-P), 2.18-2.26 (m, 2 H, ⁺N-CH₂-CH₂-CH₂-S), 2.42-2.46 (t, ³J_H-H = 7.4 Hz, 4 H,CH₂-S-CH(CH₂)₂), 2.49-2.54 (st, ³J_H-H = 6.2 Hz, 2 H, CH₂-S-CH(CH₂)₂), 2.88-2.90 (m, 2 H, CH₂-S-O), 3.22 (s, 6 H, (CH₃)₂N⁺), 3.42-3.47 (m, 2 H, CH₂-NH), 3.50-3.60 (m, 2 H, P-NH-CH₂), 3.66-3.69 (m, 2 H, ⁺N-CH₂-CH₂-CH₂-S), 3.91-3.95 (m, 4H, CH₂-CH₂-O-P), 4.81-4.91 (m, 1 H, P-NH); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 14.1 (CH₃-CH₂), 22.7 (CH₂ 脂肪鎖), 25.7 (CH₂ 脂肪鎖), 26.8 (CH₂ 脂肪鎖), 27.0 (CH₂ 脂肪鎖), 29.1-30.0 (CH₂ 脂肪鎖), 30.4 (CH₂-S-CH(CH₂)₂), 31.9 (CH₂ 脂肪鎖), 34.9-35.1 (CH₂ 脂肪鎖), 46.0 (CH₂-S-CH(CH₂)₂), 51.5 ((CH₃)₂N⁺), 66.9 (CH₂-O-P)

【0129】

化合物ＩＩ−９：³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO₄: CDCl₃中0 ppm): 10.1, ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 0.85-0.88 (t, ³J_H-H = 6 Hz, 6 H, CH₃-CH₂), 1.27-1.55 (m, 56 H, CH₂ 脂肪鎖), 1.62-1.37 (m, 4 H, CH₂-CH₂-O-P), 1.79-1.85 (m, 4 H, CH₂-S-CH-(CH₂)₂), 1.99-2.14 (m, 2 H, HO-CH₂-CH₂-CH₂-S), 2.21 (s, 6 H, (CH₂)₂-N), 2.36-2.39 (t, ³J_H-H= 5.8 Hz, 2 H, CH₂-S-CH-(CH₂)₂), 2.55-2.61 (m, 6 H, HO-CH₂-CH₂-CH₂-S および CH₂-CH₂-N), 2.92-2.98 (m, 2 H, P-NH-CH₂), 3.20-3.31 (m, 1H, P-NH-CH₂), 3.71-3.76 (m, 4 H, HO-CH₂-CH₂-CH₂-S), 3.93-3.99 (m, 4 H, CH₂-O-P)

【0130】

２．２）生理活性基による官能化

【化11】

【0131】

エステルＲＣ（Ｏ）ＯＨ（２当量）および分岐鎖状化合物ＩＩ（１当量）を無水ジクロロメタン中で混合する。ＤＣＣ（２．２当量）を添加した後、反応媒体を一晩撹拌する。得られた化合物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製する。

【0132】

方法Ｃに従って以下の化合物を合成した。

【0133】

化合物ＩＩ−１０：収率：１５％；³¹P NMR: δ (ppm, 基準 85% H₃PO₄: CDCl₃中0 ppm): 10.1; ¹H NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 0.85-0.89 (m, 18 H, CH₃-CH₂ および (CH₃)₂-CH), 1.26-1.48 (m, 68 H, CH₂ 脂肪鎖 および CH₃-CH-Ph), 1.63-1.66 (m, 4 H, CH₂-CH₂-O), 1.79-1.84 (m, 4 H, S-CH₂-CH₂-CH₂-O), 2.24 (s, 6 H, (CH₃)₂-N), 2.38-2.45 (m, 12 H, CH₂-C(O)-O-CH₂, CH₂-S および CH-S および CH₂-N(CH₃)₂), 3.89-3.02 (m, 4 H, CH₂-NH-P), 3.34-3.42 (m, 1 H, NH-P), 3.66-3.68 (m, 2 H, CH₃-CH-Ph), 3.94-3.96 (m, 4 H, CH₂-O-P), 4.12-4.15 (t, ³J_H-H = 6.3 Hz, 4 H, CH₂-O-C(O)-CH₂), 7.06-7.08 (d, ³J_H-H = 8 Hz, 4 H, H² H⁶ / H^2' H^6'), 7.17-7.19 (d, ³J_H-H = 8 Hz, 4 H, H³ H⁵ / H^3' H^5'); ¹³C NMR: δ (ppm, 基準 TMS: CDCl₃中0 ppm): 13.4 (CH₃-CH₂), 17.5 (CH₃-CH-Ph), 22.4 ((CH₃)₂-CH), 22.65 (CH₂ 脂肪鎖), 25.6 (CH₂ 脂肪鎖), 26.5-26.7 (CH₂ 脂肪鎖 および CH₂-S), 29.0-31.9 (CH₂ 脂肪鎖), 34.8 (CH₂ 脂肪鎖), 38.4 (CH₂-NH-P), 44.8-46.0 (CH₂-N(CH₃)₂ および CH₂-N(CH₃)₂ および CH-CH₃), 59.5 (CH-S), 63.3 (CH₂-O-C(O)-CH₂), 66.3 (CH₂-O-P), 127.1 (C³ C⁵ / C^3' C^5'), 129.3 (C² C⁶ / C^2' C^6'), 137.7 (C⁴ / C^4'), 140.4 (C¹ / C^1'), 174.6 (CH₂-C(O)-O-CH₂)

【0134】

リポソームおよびリポプレックスの物理化学的特性の研究

【0135】

１）構造的構成−³¹P NMRによる研究

【0136】

− 試料の調製
カチオン性脂質の原液をクロロホルム中で調製する。５０ｍｇ〜１００ｍｇの脂質重量に対応する体積の原液を溶血管の中にピペットで移し、脂質膜を得るようにクロロホルムをＮ_２流下で蒸発させる。次いで、５００μＬの水を添加し、この混合物を脂質膜が完全に分散するまで超音波にかける。この混合物を一晩溶解する。次いで、１００ｍｇ．ｍＬ^−１の濃度を有する溶液を得るためにある体積の蒸留水を添加する。試料を確実に平衡させるために、３回のサイクル（−１９８℃／５０℃）を行い、この試料を−１９８℃（液体窒素）で５分間置き、次いでこの試料を５０℃の水浴中に３０分間置き、ボルテックスで撹拌する。

【0137】

− 取得のための条件
ハーンエコー法（９０°−τ−１８０°−τ−取得）を用いて³¹P NMRスペクトルを取得した。取得パラメータは、「２００ＫＨｚのスペクトルウィンドウ、４．８８μｓの持続期間でのパルスπ／２、５ｓの再循環期間および４０μｓのエコー期間」であった。取得回数は試料の体積および取得温度によって決まり、１２８〜１７００回のスキャンである。試料の温度を３０分間平衡させた後、取得を開始する。スペクトルウィンドウ全体にわたってローレンツ型ノイズを濾過した後、エコーの頂点に対してフーリエ変換を行う。ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）小胞は³¹P NMRにおいて外部基準として機能する。ＴＯＰＳＰＩＮソフトウェアおよびｄｍｆｉｔ−２００９を用いてスペクトルのデコンボリューションを行った(Massiot D, Fayon F, Capron M, King I, Le Calve S, Alonso B,ら, Magn. Reson. Chem., 2002, 40, 70-76)。

【0138】

− 結果
図1は、周囲温度での³¹P NMR（ハーンエコー法）により、非分岐鎖状化合物（Ｉ−１）が水和された媒体の中に自己組織化されてラメラ形態をなすが、本発明の非分岐鎖状化合物（チオール−エン型の反応によって得られる分岐、化合物ＩＩ−１、ＩＩ−２、ＩＩ−３、ＩＩ−４）がヘキサゴナル構造をなす超分子凝集体を生じることを非常に明確に示している。同じ条件で記録した非分岐鎖状カチオン性化合物Ｉ−１と双性イオン性かつ分岐鎖状共脂質ＩＩ−８との１／１（モル比）共製剤化の³¹P NMRスペクトルから、共脂質によりヘキサゴナル構造の超分子凝集体の形成が生じることが分かる。従ってこの構造化は、チオール−エン反応によって分岐された中性脂質（双性イオン性）の共製剤化中のその存在によって誘導することができる。

【0139】

２）サイズおよびゼータ電位の測定

【0140】

− 試料の調製
カチオン性脂質を、脂質膜の水和方法によってリポソーム溶液中で製剤化した。最初に、カチオン性脂質の濃縮溶液の画分をガラス管の中に入れ、蒸発させて薄い脂質膜を得る。次いで、１ｍＬの水をこの膜に添加し、この膜を４℃で３日間水和させる。次いで、この溶液をボルテックス撹拌し（１分間）、４５ｋＨｚの超音波下に置く（３０〜６０分）。次いで、１５０μＬのリポソーム溶液を１．５ｍＬの滅菌水で希釈する。このリポソーム溶液の濾過（２００μｍ）後に、リポソームおよびリポプレックスのサイズおよびゼータ電位を測定する。

【0141】

− 取得のための条件
リポソームおよびリポプレックスのサイズおよびゼータ電位（ξ）を製剤の好適な希釈後にZetasizer Nano ZS (Malvern Instruments社）を用いて２５℃で測定した。リポプレックスの測定のために、各試験では、０．５〜８．０の範囲の電荷比を有するリポプレックスを形成するために必要な量の研究対象のカチオン性脂質を含む４０ｍｇのプラスミドＤＮＡ水溶液を使用した。リポソームの測定のために、水中で１．０の電荷比を有する混合物と当量の脂質量を使用した。

【0142】

− 結果

【表2】

【0143】

このサイズデータは、脂質膜の水和方法およびその後の超音波処理工程に従って形成される超分子凝集体が９０〜２３０ｎｍの非常に普通のサイズを有することを示している。多分散性指数（Ｐｄｌ）は試料中のこれらのサイズの比較的均質な性質を反映している。常に陽性であるこれらの試料のゼータ電位は、カチオン性両親媒性物質または少なくとも１種のカチオン性両親媒性物質を含む共製剤の通常の値に一致している。

【0144】

生物学的研究

【0145】

材料
細胞および培養条件。不死化マウス筋芽細胞であるＣ２Ｃ１２細胞株を一例として使用する。これらの細胞を補体除去した血清（１０％）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）およびペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｌｏｎｚａ社）で培養する。これらの細胞を３７℃のインキュベーター中、湿雰囲気および５％ＣＯ_２下に維持する。

【0146】

プラスミドＤＮＡ。これらの試験ではルシフェラーゼプラスミドレポーターｐＥＧＦＰ−Ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用する。

【0147】

方法
リポプレックスの形成。０．５〜８．０の電荷比（＋／−）を特徴とするリポプレックス［脂質／ＤＮＡ］を形成するために、異なる量の所与の本発明の化合物を５μｇのＤＮＡと混合することによりリポプレックスをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中で調製する。

【0148】

ＤＮＡ凝縮。臭化エチジウムをＤＮＡの中に挿入した後、試験対象の化合物と混合する。次いで、ＤＮＡ凝縮をアガロースゲル電気泳動で評価する。ＤＮＡのみ（複合体化されていない）を基準として使用する。

【0149】

インビトロでのトランスフェクション。本化合物をインビトロでの培養細胞の一過性のトランスフェクションについて試験する。使用する手順は、いくつかの科学文献に以前に記載されたものである(Felgner P.L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1987, 84, 7413−7417; Le Gall T.ら, J. Med. Chem. 2010, 53, 1496−1508)。簡単に言うと、実際のトランスフェクションの２４時間前に、これらの細胞を１ウェル当たり１２，５００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種する。この複合体［脂質／ＤＮＡ］を１ウェル当たり０．２５μｇのＤＮＡの割合で細胞培地に直接塗布する。約３６時間のインキュベーション後に、培地を除去し、細胞を１ウェル当たり７５μＬの受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（０．５×）で溶解する。−２０℃での２４時間の貯蔵後に、各溶解物を使用して総タンパク質をアッセイし、ルシフェラーゼ活性を測定し、細胞生存率試験を行う。

【0150】

トランスフェクション効率。ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼアッセイシステムキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて決定する。総タンパク質をＢＣＡアッセイ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ社）比色定量試験を用いて定量化する。ルシフェラーゼ活性を総タンパク質量で割ってトランスフェクション効率を計算し、これを１ｍｇのタンパク質当たりの相対的光単位（ＲＬＵ／ｍｇ）として表す。

【0151】

細胞生存率。細胞生存率を、Ｖｉａｌｉｇｈｔキット（Ｌｏｎｚａ社）を用いて評価する。対照細胞（未処理）を基準（１００％生存率）として使用する。

【0152】

結果
ＤＮＡを凝縮する化合物の能力を、臭化エチジウムの存在下でインキュベートした場合の臭化エチジウムの蛍光特性を用いて評価する。ＤＮＡ凝縮は挿入した臭化エチジウムの排除を伴う。従って生じる蛍光の減少により、所与の化合物のおかげで得られるＤＮＡのコンパクションの程度に関する情報が得られる。

【0153】

図２は、本発明の分岐鎖状化合物はＤＮＡを圧縮するが非分岐鎖状化合物（Ｉ−１）よりも完全性が低いことを示している。

【0154】

次いで、リポプレックスをインビトロでの細胞トランスフェクションにおいて使用した。図３は、本発明に係る異なる分岐鎖状カチオン性両親媒性脂質（ＩＩ−２、ＩＩ−４およびＩＩ−５）またはＩ−１またはＤＯＴＭＡなどの非分岐鎖状カチオン性両親媒性脂質から形成されるリポプレックスを用いて、Ｃ２Ｃ１２細胞のインビトロでのトランスフェクションによって得られる結果を示す。

【0155】

試験対象の化合物は全て、プラスミドＤＮＡをトランスフェクションが比較的難しいことが知られている細胞であるＣ２Ｃ１２細胞内部に送達させるのに有効である。しかし、本化合物を直鎖状脂肪鎖Ｉ−１と比較した場合、基準よりも最大４０倍の増加で分岐鎖状脂肪鎖ＩＩ−２およびＩＩ−４を含む化合物により有意により高いトランスフェクション効率を得ることが可能となる（図３）。さらに、図４に示す良好な細胞生存率を維持しながらも、これらのより高い効率が得られる。

【0156】

ＤＯＴＭＡと比較した場合、分岐鎖状脂肪鎖ＩＩ−５を含む誘導体はより低いトランスフェクション効率しか達成しないが、高い電荷比であっても良好な細胞生存率を維持することが可能となる（図５）。

【0157】

これらの結果は、カチオン性脂質の脂肪鎖の分岐により開始カチオン性脂質および導入される分岐に従ってトランスフェクション力を高め、かつ／または生体適合性を高める、すなわちその毒性を下げることが可能になり得ることを示している。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】