特許 6980250 アトピー性皮膚炎治療薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6980250

(24)【登録日】2021年11月19日

(45)【発行日】2021年12月15日

(54)【発明の名称】アトピー性皮膚炎治療薬

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20211202BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20211202BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211202BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 D

   A61P17/00

   A61P37/08

   A61P43/00 111

【請求項の数】1

【全頁数】10

(21)【出願番号】特願2017-114978(P2017-114978)

(22)【出願日】2017年6月12日

(65)【公開番号】特開2019-1721(P2019-1721A)

(43)【公開日】2019年1月10日

【審査請求日】2020年6月4日

(73)【特許権者】

【識別番号】502285457

【氏名又は名称】学校法人順天堂

(74)【代理人】

【識別番号】110000084

【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】▲高▼森 建二

(72)【発明者】

【氏名】冨永 光俊

(72)【発明者】

【氏名】幸坂 涼平

【審査官】 石井 裕美子

(56)【参考文献】

【文献】 Nature Medicine，2015年，Vol.21, No.8, pp.927-931

【文献】 生化学，2016年，Vol.88, No.5,pp.654-656

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００−３９／４４

Ａ６１Ｋ ４５／００−４５／０８

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

リポカリン−２中和抗体を有効成分とするアトピー性皮膚炎の皮疹症状改善薬。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、アトピー性皮膚炎の症状を改善するアトピー性皮膚炎治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

アトピー性皮膚炎は、増悪・寛解を繰り返す、掻痒のある湿疹を主病変とする疾患であり、患者の多くはアトピー素因を持つ。アトピー素因とは、家族歴、既往歴（気管支喘息、アレルギー性鼻炎・結膜炎、アトピー性皮膚炎のうちいずれか、あるいは複数の疾患）があること、またはＩｇＥ抗体を産生しやすい素因をさす。アトピー性皮膚炎の患者は、近年さらに増加している。

【0003】

アトピー性皮膚炎の治療手段としては、ステロイド、免疫抑制剤、保湿剤、非ステロイド系抗炎症剤等の薬物療法、アレルゲンの除去、食事制限、皮膚や環境を清潔に保つ等の生活指導等が行なわれている（非特許文献１）。しかしながら、ステロイドや免疫抑制剤等は副作用の問題があり、また非ステロイド系抗炎症剤等では十分な効果が得られない。

【0004】

かかる状況において、アトピー性皮膚炎の痒みや皮疹の発生に関与する因子に関する研究がされている。好中球の分泌顆粒中のIV型コラーゲンの分解酵素であるＭＭＰ−９と共有結合しているタンパクとして同定されたリポカリン−２（ＬＣＮ２、ＮＧＡＬ）は、マウスの髄腔内に投与すると痛覚過敏を引き起こすことが報告されている（非特許文献２）。また、アトピー性皮膚炎モデルマウス（ＮＣ／Ｎｇａ、自然発症モデル）の脊髄後角でリポカリン−２の発現量が増加し、リポカリン−２は脊髄のアストロサイトに局在すること、さらにマウスに髄腔内投与すると、リポカリン−２のみでは掻破行動をおこさないが、ＧＲＰ誘発の掻破行動を増強することが報告されている（非特許文献３）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】アトピー性皮膚炎診療ガイドライン２０１６年版

【非特許文献2】JBC. 2013 Aug; 288(3): 24116-24127

【非特許文献3】Nat. Med. 2015 Aug; 21(8): 927-931

【非特許文献4】Acta Derm. Venereol. 2016 Jun 15; 96(5): 624-629

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

しかしながら、本発明者の研究によれば、アトピー性皮膚炎においては、脊髄後角のアストロサイトよりむしろ、脊髄後根神経節（ＤＲＧ）細胞とそれを取り囲むサテライトグリア細胞（ＳＧＣ）からなる脊髄後根神経節が炎症や痒みに深く関与していることを見出している（非特許文献４）。
従って、本発明の課題は、アトピー性皮膚炎の主症状である皮疹の症状を改善する新たな医薬を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

そこで本発明者は、アトピー性皮膚炎モデルの脊髄後根神経節（ＤＲＧ）で発現している因子をスクリーニングしたところ、リポカリン−２がＤＲＧにおけるサテライトグリア細胞に強く発現しており、アトピー性皮膚炎モデルにおいてはリポカリン−２陽性サテライトグリア細胞の割合が正常マウスに比べて有意に増加しており、またリポカリン−２受容体は脊髄後根神経節で発現しており、リポカリン−２遺伝子発現量は、アトピー性皮膚炎では脊髄よりも脊髄後根神経節において初期から有意に持続的に発現していることを見出した。そしてさらに検討を続けたところ、リポカリン−２阻害剤の代表例であるリポカリン−２中和抗体がアトピー性皮膚炎の痒みよりも皮疹を有意に抑制することを見出し、本発明を完成した。

【0008】

すなわち、本発明は、次の〔１〕及び〔２〕を提供するものである。

【0009】

〔１〕リポカリン−２阻害剤を有効成分とするアトピー性皮膚炎治療薬。
〔２〕アトピー性皮膚炎治療薬が、アトピー性皮膚炎の皮疹症状改善薬である〔１〕記載のアトピー性皮膚炎治療薬。

【発明の効果】

【0010】

本発明によれば、アトピー性皮膚炎の主症状である皮疹症状を改善することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】ＡＤモデルマウスのＤＲＧにおけるＬＣＮ２の発現部位の検討結果を示す。ＧＬＡＳＴは、抗ＧＬＡＳＴ抗体染色像を、ＬＣＮ２は抗リポカリン−２抗体染色像を、Ｍｅｒｇｅは二重染色像を示す。

【図2】マウスＤＲＧにおけるＬＣＮ２陽性ＳＧＣの割合（％）を示す。Ｃｏｎｔｒｏｌはコントロールマウスを、ＡＤはアトピー性皮膚炎モデルマウスを示す。

【図3】Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ−２受容体のＡＤ発症ＮＣ／ＮｇａマウスＤＲＧにおける発現検討結果を示す。ＳＬＣ２２Ａ１７は抗ＳＬＣ２２Ａ１７抗体染色像を、ＮｅｕＮは抗ＮｅｕＮ抗体染色像を、Ｍｅｒｇｅは二重染色像を示す。

【図4】ＬＣＮ２遺伝子発現量の経時的変化を示す。ＤＲＧと脊髄の比較を示す。

【図5】皮膚炎スコア及び掻破行動を示す。

【発明を実施するための形態】

【0012】

本発明のアトピー性皮膚炎治療薬の有効成分は、リポカリン−２阻害剤である。
リポカリン−２は、前述のように、好中球の分泌顆粒中のIV型コラーゲンの分解酵素であるＭＭＰ−９と共有結合しているタンパクとして同定された因子であり、マウスの髄腔内に投与すると痛覚過敏を引き起こすことが報告されている。また、アトピー性皮膚炎モデルマウスの脊髄後角でリポカリン−２の発現量が増加し、リポカリン−２は脊髄のアストロサイトに局在すること、さらにマウスに髄腔内投与すると、リポカリン−２のみでは掻破行動をおこさないが、ＧＲＰ誘発の掻破行動を増強することが報告されている。しかし、リポカリン−２が、アトピー性皮膚炎モデルの脊髄後根神経節（ＤＲＧ）のサテライトグリア細胞で発現していること、及び脊髄よりもＤＲＧにおいて初期から強く発現していることは全く知られていない。

【0013】

リポカリン−２阻害剤としては、リポカリン−２拮抗剤、リポカリン−２中和抗体、リポカリン−２受容体拮抗剤、リポカリン−２受容体中和抗体等が挙げられる。リポカリン−２中和抗体等の抗体は、既に知られており市販品を用いることもできる。また、これらの抗体は、マウス抗体等の非ヒト動物抗体でもよいし、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体であってもよい。

【0014】

リポカリン−２阻害剤は、後記実施例に示すように、アトピー性皮膚炎モデルマウスに投与すると皮膚炎の主症状である皮疹を有意に抑制する。この作用は、痒みに対する作用よりも強いものであった。
従って、リポカリン−２阻害剤は、アトピー性皮膚炎の症状、特に皮疹症状の改善用治療薬として有用である。ここで、皮疹としては、紅斑、急性期の丘疹、湿潤・痂皮、慢性期の丘疹、結節・苔癬化が挙げられる。

【0015】

本発明のアトピー性皮膚炎治療薬は、注射、経口及び外用のいずれの投与形態でも使用することができる。従って、これらの作用を目的とする医薬、医薬部外品、化粧料、機能性食品、特定保健用食品等として有用である。

【0016】

本発明のアトピー性皮膚炎治療薬の経口投与用の形態としては、錠剤、顆粒、粉末、カプセル等の固形剤、ゲル剤、液剤、シロップ剤等の液剤等が挙げられる。また外用の形態としては、クリーム、軟膏、乳液、ローション、オイル、パックなどの形態が挙げられる。また注射剤としては静注、皮下注が挙げられる。

【0017】

本発明のアトピー性皮膚炎治療薬中のリポカリン−２阻害剤の含有量は特に制限されないが、０．００１〜１００質量％、さらに０．１〜５０質量％、特に０．１〜３０質量％が好ましい。その投与量は１日あたり、１ｍｇ〜５００ｍｇ、特に１ｍｇ〜３００ｍｇとするのが好ましい。

【実施例】

【0018】

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

【0019】

実施例１
（アトピー性皮膚炎モデルマウスのＤＲＧにおけるリポカリン−２の発現部位の検討）
（方法）
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルの作製及びＤＲＧ病理スライドの作製
アトピー性皮膚炎モデルマウスは、コナヒョウダニ由来アレルゲンを含む軟膏であるビオスタＡＤ（株式会社ビオスタ）塗布を週２回、３週間、計６回繰り返すことにより作製した。初回のビオスタ塗布時は、マウスの頸背部をバリカンで剃毛し、除毛クリームで完全に除毛後、ビオスタＡＤ（７５ｍｇ）を頸背部の除毛した部位に塗布した。ビオスタＡＤの２〜６回目の塗布時は、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液（１５０μＬ）を頸背部に塗布して２時間後に、ビオスタＡＤ（７５ｍｇ）を塗布することにより皮膚炎を誘発した。６回目のビオスタＡＤ塗布から３日後に、ＤＲＧを摘出した。摘出したＤＲＧは、４％パラホルムアルデヒドに浸漬して、４℃で４時間静置した後、２０％スクロース溶液に浸漬し、４℃で１６時間静置した。その後、Ｏ．Ｃ．Ｔ ｃｏｍｐｏｕｎｄ（サクラファインテックジャパン）に浸漬して、ドライアイスを用いて、凍結包埋した。凍結包埋したＤＲＧをクライオスタット（ライカ）を用いて１０μｍの厚さに薄切し、スライドガラスに貼付した。
（２）免疫組織化学及び顕微鏡観察
作製したＤＲＧ病理スライドは、６０分間室温で風乾後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に浸漬した。５％ 正常ロバ血清、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ（ブロッキング液）中で１時間室温にてインキュベートした後、２００倍希釈したラット抗リポカリン−２抗体（Ｎｏｖｕｓ）及び２００倍希釈したウサギ抗ＧＬＡＳＴ抗体（Ｎｏｖｕｓ）を含有するブロッキング液中で１６時間４℃インキュベートした。病理スライドを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄後、１０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートロバ抗ウサギ抗体及び１０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４コンジュゲートロバ抗ラット抗体を含有するブロッキング液中で１時間室温にてインキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを用いて、封入した。共焦点顕微鏡観察をＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２顕微鏡（ライカ）を用いて実施した。Ｚスタック画像（厚さ１０μｍ）を０．９μｍ毎に収集し、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ライカ）を使用して３次元画像を構築した。

【0020】

（結果）
図１に示すように、リポカリン−２（ＬＣＮ２）は、脊髄後根神経節（ＤＲＧ）におけるサテライトグリア細胞（ＳＧＣ）において強く発現していることがわかった。

【0021】

実施例２
（マウスＤＲＧにおけるＬＣＮ２陽性ＳＧＣの割合）
（方法）
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルの作製
実施例１と同様の方法でＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルの作製を行った。なお、本検討では、毛刈り、除毛及び４％ＳＤＳの塗布を行うが、ビオスタＡＤを塗布しないコントロールマウスも併せて作製した。
（２）ＤＲＧ病理標本の作製
実施例１と同様の方法でアトピー性皮膚炎マウス及びコントロールマウスのＤＲＧ病理標本を作製した。
（３）免疫組織化学及び顕微鏡観察
ＤＲＧ病理スライドは、６０分間室温で風乾後、ＰＢＳに浸漬した。５％正常ロバ血清、２％ ＢＳＡ及び０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ（ブロッキング液）中で室温で１時間インキュベートした後、２００倍希釈したラット抗リポカリン−２抗体（Ｎｏｖｕｓ）及び２００倍希釈したウサギ抗ＧＬＡＳＴ抗体（Ｎｏｖｕｓ）を含有するブロッキング液中で１６時間４℃インキュベートした。病理スライドを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄後、１０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートロバ抗ウサギ抗体及び１０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４コンジュゲートロバ抗ラット抗体を含有するブロッキング液中で１時間室温にてインキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを用いて、封入した。共焦点顕微鏡観察をＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２顕微鏡（ライカ）を用いて実施した。Ｚスタック画像（厚さ１０μｍ）を０．９μｍ毎に収集し、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ライカ社製）を使用して３次元画像を構築した。
（４）リポカリン−２（ＬＣＮ２）陽性サテライトグリア細胞（ＳＧＣ）の計測
前項（３）で取得した画像について、ＤＡＰＩ（核）及びＧＬＡＳＴ（サテライトグリア細胞）が共染色される細胞の数を視覚的にカウントした。カウントした細胞のうち、さらにリポカリン−２にも共染色される細胞数をカウントした。各個体のリポカリン−２、ＧＬＡＳＴ及びＤＡＰＩ陽性細胞数をＧＬＡＳＴ及びＤＡＰＩ陽性細胞数で除して１００倍した値を、リポカリン−２陽性ＳＧＣの比率（％）とした。

【0022】

（結果）
図２に示すように、アトピー性皮膚炎モデルマウスでは、リポカリン−２（ＬＣＮ２）陽性サテライトグリア細胞（ＳＧＣ）の割合が、正常マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて有意に増加していた。

【0023】

実施例３
（リポカリン−２受容体のアトピー性皮膚炎モデルマウスのＤＲＧにおける発現検討）
（方法）
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルの作製
実施例１と同様の方法でＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルを作製した。
（２）ＤＲＧ病理標本の作製
実施例１と同様の方法でアトピー性皮膚炎マウスのＤＲＧ病理標本を作製した。
（３）免疫組織化学及び顕微鏡観察
ＤＲＧ病理スライドは、６０分間室温で風乾後、ＰＢＳに浸漬した。５％正常ロバ血清、２％ＢＳＡ及び０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有するＰＢＳ（ブロッキング液）中で１時間室温にてインキュベートした後、１０００倍希釈したモルモット抗ＮｅｕＮ抗体（Ｎｏｖｕｓ）及び１００倍希釈したウサギ抗ＳＬＣ２２Ａ１７抗体（Ｎｏｖｕｓ）を含有するブロッキング液中にて４℃で１６時間インキュベートした。病理スライドを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄後、１０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲートロバ抗ウサギ抗体及び１０００倍希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４コンジュゲートロバ抗モルモット抗体を含有するブロッキング液中で１時間室温でインキュベートした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩを用いて、封入した。共焦点顕微鏡観察をＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ２顕微鏡（ライカ）を用いて実施した。Ｚスタック画像（厚さ１０μｍ）を０．９μｍ毎に収集し、Ｌｅｉｃａ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ライカ社製）を使用して３次元画像を構築した。

【0024】

（結果）
図３に示すように、リポカリン−２受容体の一つであるＳＬＣ２２Ａ１７は、ＤＲＧの神経細胞に強く発現していることがわかった。

【0025】

実施例４
（リポカリン−２のＤＲＧ及び脊髄での発現）
（方法）
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルの作製
アトピー性皮膚炎モデルマウスは、ビオスタＡＤ塗布を週２回、３週間、計６回繰り返すことにより作製した。初回のビオスタ塗布時は、マウスの頸背部をバリカンで剃毛し、除毛クリームで完全に除毛後、ビオスタＡＤ（７５ｍｇ）を頸背部の除毛した部位に塗布した。ビオスタＡＤの２〜６回目の塗布時は、４％ ＳＤＳ溶液（１５０μＬ）を頸背部に塗布して２時間後に、ビオスタＡＤ（７５ｍｇ）を塗布することにより皮膚炎を誘発した（アトピー性皮膚炎モデルマウス）。なお、毛刈り、除毛及び４％ ＳＤＳの塗布を行うが、ビオスタＡＤを塗布しないコントロールマウスとして作製した。２、４及び６回目のビオスタＡＤ塗布から３日後に、ＤＲＧ及び脊髄を摘出した。
（２）遺伝子発現解析
各遺伝子の転写レベルを、定量リアルタイムＰＣＲによって分析した。全ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＤＲＧ及び脊髄から抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて、ｃＤＮＡに逆転写した。定量リアルタイムＰＣＲは製造業者の取扱説明書に従って、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により実施した。使用したプライマーに関する情報を下に示す。リボソームタンパク質Ｓ１８（ＲＰＳ１８）を内部標準遺伝子として使用した。各ｍＲＮＡの量を、ＲＰＳ１８のｍＲＮＡ量に対して標準化した。

【0026】

プライマー配列
リポカリン−２； 5’- TCC CCT GAA CTG AAG GAA CG -3’ (forward)（配列番号１） and 5’- AGC CAC ACT CAC CAC CCA TT -3’ (reverse) （配列番号２）
RPS18； 5’-TTT GCG AGT ACT CAA CAC CAA CAT C-3’ (forward) （配列番号３） and 5’-GAG CAT ATC TTC GGC CCA CAC-3’ (reverse) （配列番号４）

【0027】

（結果）
図４に示すように、リポカリン−２（ＬＣＮ２）は、ＤＲＧにおいては１週目から、脊髄においては３週目でやっと有意に遺伝子発現量が増加した。すなわち、リポカリン−２は、脊髄よりもＤＲＧで初期から持続的に発現していることがわかる。

【0028】

実施例５
（リポカリン−２中和抗体の作用）
（方法）
（１）ＮＣ／Ｎｇａマウスを用いたアトピー性皮膚炎モデルの作製
実施例１に記載と同様の方法でアトピー性皮膚炎モデルを作製した。
（２）アトピー性皮膚炎モデルに対するリポカリン−２中和抗体の投与
アトピー性皮膚炎モデルの皮膚炎誘発日の４％ ＳＤＳ塗布の直前に、ラット抗リポカリン−２中和抗体（Ｒ＆Ｄ）あるいはラットＩｇＧ２Ａ（アイソタイプコントロール抗体）（Ｒ＆Ｄ）を１匹あたり１μｇ髄腔内投与した。各抗体投与液は、滅菌したＰＢＳで０．２μｇ／μＬの濃度に希釈し、１匹あたり５μＬ投与した。
（３）掻破行動解析
ＳＣＬＡＢＡ（登録商標）−Ｒｅａｌ（株式会社ノベルテック）を用いて掻破行動の測定及び解析を行った。掻破行動は、１回目（０週目）、３回目（１週目）及び５回目（２週目）のビオスタＡＤによる皮膚炎誘発日、６回目のビオスタＡＤによる皮膚炎誘発から３日後（３週目）の１あるいは２日前に、各マウス１２時間の掻破行動の測定を行った。
（４）皮膚炎スコア
皮膚炎スコアは、１回目（０週目）、３回目（１週目）及び５回目（２週目）のビオスタＡＤによる皮膚炎誘発日、６回目のビオスタＡＤによる皮膚炎誘発から３日後（３週目）に評価した。なお、皮膚炎スコアは下記の皮膚炎スコア表にしたがって、（ｉ）発赤・出血、（ii）痂皮形成・乾燥、（iii）浮腫、（iv）擦傷の４項目（各０−３点）を評価し、合計点（０−１２点）を算出した。

【0029】

皮膚炎スコア表
（ｉ）発赤・出血
０：無症状 ；背中に発赤および出血症状が認められない状態
１：軽度 ；背中に発赤が局所的に認められ，連続的な擦傷に伴う出血が認められない状態
２：中等度 ；背中に発赤が散在的に認められるか，連続的な擦傷に伴う出血が認められない状態
３：重度 ；背中に発赤が全体的に認められるか，連続的な擦傷に伴う出血が認められる状態
（ii）痂皮形成・乾燥
０：無症状 ；背中に痂皮形成および乾燥症状なし
１：軽度 ；背中に局所的に認められ，皮膚がわずかに白色化し，角質の剥離がわずかに認められる状態
２：中等度 ；背中に散在的に認められるか，明らかに角質の剥離が認められる状態
３：重度 ；背中に痂皮が全体的に認められるか，明らかに角質の剥離が認められる状態
（iii）浮腫
０：無症状 ；背中に厚みが認められない状態
１：軽度 ；背中にわずかに厚みが認められる状態
２：中等度 ；背中に明らかな厚みやしわが認められる状態
３：重度 ；背中に明らかな厚みがあり，指で触れた時に硬さが感じられる状態
（iv）擦傷
０：無症状 ；背中に擦傷が認められない状態
１：軽度 ；背中に連続的でない擦傷が認められる状態
２：中等度 ；背中に小規模に連続的な擦傷が認められる状態
３：重度 ；背中に連続的な擦傷が認められる状態

【0030】

（結果）
図５に示すように、リポカリン−２中和抗体は、アトピー性皮膚炎を３週目において有意に抑制した。一方、掻破回数は、低値を示したが有意差はなかった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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