特許 6982001 ゲノム工学システムのカプシド形成のための粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6982001

(24)【登録日】2021年11月22日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】ゲノム工学システムのカプシド形成のための粒子

(51)【国際特許分類】

   C12N 7/01 20060101AFI20211206BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20211206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20211206BHJP

【ＦＩ】

   C12N7/01ZNA

   C12N15/867 Z

   C12N15/09 110

【請求項の数】17

【全頁数】84

(21)【出願番号】特願2018-559362(P2018-559362)

(86)(22)【出願日】2017年5月12日

(65)【公表番号】特表2019-514414(P2019-514414A)

(43)【公表日】2019年6月6日

(86)【国際出願番号】FR2017051164

(87)【国際公開番号】WO2017194902

(87)【国際公開日】20171116

【審査請求日】2020年3月4日

(31)【優先権主張番号】1654332

(32)【優先日】2016年5月13日

(33)【優先権主張国】FR

(31)【優先権主張番号】1660309

(32)【優先日】2016年10月24日

(33)【優先権主張国】FR

(31)【優先権主張番号】1752818

(32)【優先日】2017年3月31日

(33)【優先権主張国】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】514020666

【氏名又は名称】フラッシュ セラピューティクス

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100203828

【弁理士】

【氏名又は名称】喜多村 久美

(72)【発明者】

【氏名】パスカル ブイユ

(72)【発明者】

【氏名】レジ ガイヨン

(72)【発明者】

【氏名】ルシール ラムールー

(72)【発明者】

【氏名】アレクサンドラ イシェ

【審査官】 中山 基志

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／０４９２５８（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 国際公開第２００７／０７２０５６（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 MOLECULAR THERAPY - METHODS & CLINICAL DEVELOPMENT，２０１５年１０月２１日，VOL:2，PAGE(S):15039-1/15，http://dx.doi.org/10.1038/mtm.2015.39，& Supplementary Material

【文献】 PASCALE BOUILLE; ET AL，TRANSIENT NON-VIRAL RNA DELIVERY MEDIATED BY A LENTIVIRAL PARTICLE，MOLECULAR THERAPY，２０１６年 ５月 ４日，VOL:24, NR:S1，PAGE(S):S215，#538，http://dx.doi.org/10.1016/S1525-0016(16)33346-9

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ７／００−７／０８

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下：
・Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質；
・エンベロープタンパク質；
・任意によりインテグラーゼ；及び
・少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡ、
を含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された異種結合ドメインによって認識され、
ここで、前記少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、それらの目的の配列によって異なり、ここで、
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの前記目的の配列の少なくとも１つが、ヌクレアーゼをコードする部分を含み、前記ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステムに関連するヌクレアーゼからなる群から選択され、かつ
−他のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列が、ガイドＲＮＡの少なくとも１つの認識エレメントに対応する、
レトロウイルス粒子。

【請求項2】

前記ヌクレアーゼがＣａｓ９である、請求項１に記載の粒子。

【請求項3】

目的の配列を有する少なくとも１つの第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡをさらに含み、前記目的の配列が、ガイドＲＮＡの第２の認識エレメントに対応するか、又は付加的なガイドＲＮＡに対応する、請求項１又は２に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項4】

以下：
・ヌクレオカプシドタンパク質；
・エンベロープタンパク質；
・任意によりインテグラーゼ；及び
・少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡ、
を含むレトロウイルス粒子であって、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された異種結合ドメインによって認識される、請求項１から３のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項5】

前記異種結合ドメインが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ、第２の結合ドメインが、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入され得る、請求項４に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項6】

少なくとも１つのカプシド形成配列が、１２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフであり、このモチーフが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されたＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質によって認識される、請求項１から５のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項7】

カプシド形成配列として１２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを含むカプシド形成された非ウイルスＲＮＡが、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡであり、かつ、第２のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡが、ガイドＲＮＡの少なくとも１つの認識エレメントに対応するＲＮＡ、又はガイドをコードするＲＮＡであり、前記カプシド形成された非ウイルスＲＮＡが、カプシド形成配列として２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを含む、請求項６に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項8】

少なくとも１つのカプシド形成配列が、２回反復したＰＰ７バクテリオファージのステム−ループモチーフであり、このモチーフが、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されたＰＰ７バクテリオファージのコートタンパク質によって認識される、請求項１から７のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項9】

前記異種結合ドメインが、インテグラーゼに導入され、かつ、第２の異種結合ドメインが、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入され得る、請求項１から７のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項10】

レンチウイルス粒子である、請求項１から９のいずれか一項に記載のレトロウイルス粒子。

【請求項11】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の粒子を含有する組成物。

【請求項12】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の粒子を生産するためのキットであって、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列は目的の配列を含み、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、
第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されており、前記目的の配列の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲシステムに関連するヌクレアーゼによって構成される群から選択されたヌクレアーゼをコードし、他の目的の配列は、ガイドＲＮＡの少なくとも１つの認識エレメントに対応する、発現プラスミド、
（ｉｉ）Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、ここで、前記Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする異種結合ドメインを含む、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、キット。

【請求項13】

第２のカプシド形成プラスミドをさらに含む、請求項１２に記載の生産キットであって、前記第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は、
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする、
生産キット。

【請求項14】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の粒子の製造方法であって、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列は目的の配列を含み、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、
第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、この配列の上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されており、前記目的の配列の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲシステムに関連するヌクレアーゼによって構成される群から選択されたヌクレアーゼをコードし、他の目的の配列は、ガイドＲＮＡの少なくとも１つの認識エレメントに対応する、発現プラスミド、
（ｉｉ）Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、ここで、前記Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする異種結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド；
による、細胞のコトランスフェクション（co-transfection）のステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞からの上清の回収のステップ、
を含む、方法。

【請求項15】

前記コトランスフェクションのステップが、さらに、第２のカプシド形成プラスミドによって行われ、前記第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は、
−第１のカプシド形成プラスミドがキメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする、
請求項１４に記載の製造方法。

【請求項16】

インビトロ又はエクスビボでの細胞の形質導入のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の粒子、あるいは請求項１１に記載の組成物の使用。

【請求項17】

形質導入された細胞において、ＤＮＡ二本鎖切断、点突然変異、遺伝子ノックアウトを含む配列欠失、配列挿入又は遺伝子置換を生じるための、請求項１６に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、非ウイルスＲＮＡを標的細胞に導入するためのレトロウイルスシステムに関し、より具体的には、複数のＲＮＡを送達することができるレトロウイルス粒子に関する。本発明はまた、これらレトロウイルス粒子を含有する組成物、レトロウイルス粒子を生産するためのキット、関連する製造方法、並びに粒子及び組成物の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

標的細胞への複数のＲＮＡの導入は、研究開発及び遺伝子治療における主要な課題である。

【0003】

ウイルスに由来するベクターの使用は、遺伝子導入のための重要な方法となっている。現在、ウイルスベクターは以下の２つの主要なカテゴリーに分けることができる：
−受容者のゲノム中に組み込む、組み込みベクター、並びに
−通常、染色体外遺伝エレメントを形成する、非組み込みベクター。

【0004】

組み込みベクター、例えばガンマ−レトロウイルスベクター（ＲＶ）及びレンチウイルスベクター（ＬＶ）は安定に組み込まれる。非組み込みベクター、例えばアデノウイルスベクター（ＡＤＶ）及びアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）は、急速に分裂する細胞から迅速に排除される。特定のベクターの選択に影響を与える特定の要因は、そのカプシド形成（encapsidation）能力、その標的又は宿主細胞の範囲、その遺伝子発現プロファイル、その形質導入効率、及び、反復した形質導入が必要である場合に特に問題となるその免疫応答を誘導するための能力を含む。

【0005】

遺伝子治療又は多くのインビトロ、エクスビボ及びインビボ用途におけるような特定の用途は、非組み込みベクターの使用を必要とする。例として、以下のものが挙げられる：
・多能性細胞に特殊化した細胞の再プログラミングの誘導、並びに幹細胞又は多能性細胞の特殊化細胞への分化の誘導、
・標的細胞における同時の、抗原又はタンパク質（毒性又は非毒性）の発現、
・ゲノム工学システムの発現、例えばＣＲＥタンパク質、ＴＡＬＥＮシステム、Ｚｎ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ又はＣＲＩＳＰＲ、あるいはタンパク質又はＲＮＡの発現を必要とする任意の他のシステムの発現。

【0006】

標的細胞にＲＮＡを導入する１つの方法は、レトロウイルス科（Retroviridae）（レトロウイルスファミリー又はＲＮＡウイルスとも称される）に属するウイルスに基づくウイルスベクターを用いる。実際に、その複製サイクル中に、レトロウイルス科のウイルスは、ＲＮＡによって構成されたそのゲノムを二本鎖ＤＮＡへと変換する能力を有し、この二本鎖ＤＮＡは、標的細胞のゲノムに組み込まれることになる。このレトロウイルスのファミリーの具体例は、ガンマレトロウイルス及びレンチウイルスである。

【0007】

レトロウイルスの複製サイクルは、膜受容体への固定を介する標的（又は宿主）細胞の認識の第１フェーズを含む。この認識フェーズは、膜融合後に、宿主細胞へのレトロウイルスの侵入をもたらす。次に、レトロウイルスＲＮＡは、レトロウイルスによってコードされた逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡへとコピーされ、次に宿主細胞のゲノムに組み込まれる。次に、このウイルスゲノムは、細胞の他の全ての遺伝子と同様に、宿主細胞によって転写及び翻訳される。このゲノムは、他のウイルスの産生を可能にするタンパク質及び配列の全てをコードしている。

【0008】

より具体的には、３つの遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、がレトロウイルスの全てに共通している。

【0009】

Ｇａｇはポリタンパク質をコードする遺伝子であり、切断によってこのポリタンパク質に由来するタンパク質は、複製時にウイルスの構築に関与する構造タンパク質である。これら構造タンパク質は、より具体的には、マトリックス（ＭＡ）タンパク質、カプシド（ＣＡ）タンパク質及びヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質である。

【0010】

Ｐｏｌは、酵素のインテグラーゼ、逆転写酵素及びプロテアーゼをコードする遺伝子である。

【0011】

Ｅｎｖは、エンベロープ糖タンパク質をコードする遺伝子である。

【0012】

したがって、これら３つの遺伝子は、レトロウイルスＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへとコピーし、このＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込み、次に、新たに合成されたレトロウイルスの構造：エンベロープ、カプシド及びヌクレオカプシドタンパク質、を生成することを可能にする。しかしながら、新たに合成されたレトロウイルスが完全であるためには、これら構造のそれぞれにおいてレトロウイルスＲＮＡの２つのコピーをカプシド形成することが必要である。この構造におけるレトロウイルスＲＮＡの２つのコピーのカプシド形成は、レトロウイルスＲＮＡのコピーによって運ばれるＰｓｉ（パッケージングシグナル（Packaging Signal））と呼ばれるカプシド形成配列のヌクレオカプシドタンパク質による認識によって達成される。

【0013】

レトロウイルスに由来するウイルスベクターが遺伝子治療の目的で使用される場合、ｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖのコード領域の少なくとも１つの部分が、カプシド形成システムと目的の配列の発現システムとの間で解離する。ｇａｇ及びｐｏｌコード配列は、例えば、ウイルスベクターの産生に必要なタンパク質をｔｒａｎｓで供給するカプシド形成プラスミドによって運ばれる。カプシド形成配列及び目的の配列は、レトロウイルスを非複製にするために、独立したシステムによって運ばれる。

【0014】

しかしながら、特定の場合には、宿主細胞のゲノムへのランダムな目的のＲＮＡ配列の組み込みは、オープンリーディングフレームを阻害し、かつ重要な遺伝子の発現をブロックし得る。また、特定の用途、例えば細胞の再プログラミング又は幹細胞の分化のために、一過性の方法で目的の配列の発現を行うべきであることが推奨される。

【0015】

国際公開第２００７／０７２０５６号の出願はウイルスベクターシステムについて記載しており、斯かるウイルスベクターシステムは、ｅｎｖ、ｇａｇ、任意によりｇａｇ／ｐｏｌ、並びに、ｇａｇ又はｇａｇ／ｐｏｌに関連した対応するＲＮＡ結合ドメインによって認識される異種カプシド形成シグナルを含むＲＮＡ配列を含む。このシステムは、非組み込みであり、かつ一過性発現を可能にするものとして、当該出願に記載されている。

【0016】

しかしながら、そのようなシステムは依然として有効性が限定されている。特に、標的細胞がこれらシステムによって運ばれる目的のＲＮＡを発現するためには、一般に、細胞に目的のＲＮＡのいくつかのコピーを導入し、その結果、高い感染多重度（「感染多重度（multiplicity of infection）」、ＭＯＩ）を使用することが必要である。ＭＯＩは、導入されたベクターシステムの数と、感染される細胞の数との比に対応する。高いＭＯＩは実際に、細胞に目的のＲＮＡのいくつかのコピーを導入することを可能にし、１つの同じ細胞がいくつかの感染を受けることを可能にする。現在、運ばれる目的のＲＮＡの発現レベルを改善することは可能であるが、細胞が受ける複数の感染のために、高いＭＯＩの使用はいくらかの毒性も生じる。

【0017】

上述したように、このタイプのシステムはまた、ゲノム工学、特に遺伝子治療の用途に興味深い。

【0018】

現在、標的細胞へのゲノム工学システムの導入は、依然として複雑であり、かつ上述したゲノム工学システムの実施の成功のための主要な挑戦となる。

【0019】

実際に、ゲノム工学システムが機能するためには、少なくとも、ＤＮＡを切断することができる酵素、又はヌクレアーゼが、標的細胞に導入される必要がある。遺伝子治療における用途はさらに、望ましくない切断を引き起こすことなく、所与の遺伝子を正確に標的化するためのＤＮＡ切断の特異性を必要とする。したがって、ＴＡＬＥＮ、ＺｎＦｉｎｇｅｒ及びＣＲＩＳＰＲシステムの使用のために、一般に、ＤＮＡに認識エレメントを導入することが必要である。結果として、このようなシステムは、形質導入された細胞に導入されることになる、少なくとも１つのヌクレアーゼ、及び好ましくは問題の工学システムの２つの構成エレメントを必要とする。

【0020】

さらに、これらゲノム工学システムは、毒性を誘発することなくシステムの十分な効果を可能にするために、標的細胞に導入された遺伝物質の発現の持続時間及び強度などのパラメータを考慮しなければならない。

【0021】

これらゲノム工学システムの送達のための現在の方法は、主に、以下の通りである：
−ＤＮＡのトランスフェクション、
−ＲＮＡのエレクトロポレーション、及び
−ウイルスベクターの使用。

【0022】

しかしながら、これら方法の各々には重大な欠点がある。

【0023】

実際に、ＤＮＡのトランスフェクションは、初代細胞又は感受性細胞に対して非常に低い有効性を有する方法であり、それは、ＤＮＡの転移に関連した高い毒性、プラスミド中の細菌配列の存在、及び／又はトランスフェクトされた細胞のゲノムへのプラスミドのランダム組み込みのためである。

【0024】

その一部について、メッセンジャーＲＮＡのエレクトロポレーションは、初代細胞又は感受性細胞においてエクスビボで好ましくは使用される方法であるが、これもまた、標的細胞の膜の不安定化に起因する高い毒性のために、有効性に関して良好な結果をもたらさない。

【0025】

ウイルスベクターの使用は、細胞毒性を最小限に抑えながら送達の有効性を高めるために最も有望な方法であると思われる。しかしながら、レンチウイルスベクターは有効なツールであるが、それらは標的細胞のゲノムに組み込まれて、導入遺伝子の安定な発現をもたらし、これは制御不能な反応をもたらし得る。さらに、インテグラーゼ欠損型レンチウイルスベクター（integration deficient lentiviral vectors）（ＩＤＬＶ）は、ヌクレアーゼの発現の持続時間を制限するために使用することができるが、標的細胞のゲノムへの組み込みの完全な欠如を保証するものではない。

【0026】

他の選択肢は、インビボでの用途のためにＡＡＶアデノウイルスシステムを使用することであるが、アデノウイルスシステムのカプシド形成能は、ＣＲＩＳＰＲ又はＴＡＬＥＮシステムと不適合な４．８ｋｂ未満のサイズに制限されているため、このタイプのツールは減少したサイズのヌクレアーゼの使用を含む（Ｃｈｅｎ、２０１５）。

【0027】

従って、より効率的かつ低毒性であるウイルスベクターシステムが依然として必要とされている。

【0028】

本発明者らの研究は、単一の感染で同一の細胞にいくつかの目的のＲＮＡを送達することができるベクターシステムを考案することを可能にした。

【0029】

したがって、本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識され、かつ、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列の少なくとも１つが、ヌクレアーゼをコードする部分を含む、レトロウイルス粒子に関する。

【0030】

本発明に係るレトロウイルス粒子は、単一の感染により細胞に、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルスＲＮＡを導入することを可能にする。これら粒子は、インビボ、インビトロ又はエクスビボの方法によって、細胞に導入することができる。

【0031】

「Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質」とは、Ｇａｇポリタンパク質の切断により生じる任意のタンパク質を意味する。より具体的には、それは、ヌクレオカプシドタンパク質、マトリックスタンパク質（例えば、ＭｏＭｕＬＶタイプのマウスウイルスに由来するレトロウイルス粒子における）又はガンマレトロウイルスに特異的なタンパク質ｐ１２である。

【0032】

「エンベロープタンパク質」とは、シュードタイピング（pseudotyping）エンベロープタンパク質を含む、任意のエンベロープタンパク質を意味する。例として、両性（Ampho）エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス（Rous Sarcoma virus）（ＲＳＶ）のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス（ＭＶ）のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルス（Gibbon ape leukaemia virus）のエンベロープタンパク質（ＧＡＬＶ）、ネコ内在性ウイルス（feline endogenous virus）（ＲＤ１１４）のタンパク質、又は水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープタンパク質、が挙げられる。より具体的には、エンベロープタンパク質は、両性エンベロープタンパク質、同種指向性エンベロープタンパク質、モロニーマウス白血病ウイルスウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）のエンベロープタンパク質、ネコ免疫不全ウイルスウイルス（ＦＩＶ）のエンベロープタンパク質、ハーベイマウス肉腫ウイルスウイルス（ＨａＭｕＳＶ）のエンベロープタンパク質、マウス乳がんウイルス（ＭｕＭＴＶ）のエンベロープタンパク質、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のエンベロープタンパク質、麻疹ウイルス（ＭＶ）のエンベロープタンパク質、テナガザル白血病ウイルスのエンベロープタンパク質（ＧＡＬＶ）又は水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）のエンベロープタンパク質である。したがって、エンベロープタンパク質は、特定の細胞型又は特定の用途（エンベロープタンパク質としての表面受容体の使用）を標的とするために修飾されてもよい。

【0033】

特定の受容体及び／又は細胞型を標的化するために、抗体、糖脂質及び／又は特定のリガンドによりエンベロープタンパク質を修飾することもできる。

【0034】

好ましくは、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質である。

【0035】

「インテグラーゼ」とは、ｐｏｌ遺伝子によってコードされた酵素タンパク質を意味し、これは、当該レトロウイルスの複製時にレトロウイルスによって感染した細胞のＤＮＡにおけるレトロウイルスＤＮＡの組み込みを可能にする。

【0036】

「カプシド形成配列」とは、結合ドメインによって特異的に認識されるＲＮＡモチーフ（配列及び三次元構造）を意味する。好ましくは、カプシド形成配列は、ステム−ループモチーフである。さらにより好ましくは、レトロウイルス粒子のカプシド形成配列は、ＭＳ２バクテリオファージのＲＮＡ又はＰＰ７ファージのＲＮＡのステム−ループモチーフ、例えば、それぞれ、配列ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）又は（ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号２）から生じるステム−ループモチーフである。ステム−ループモチーフ、より具体的には、ＭＳ２バクテリオファージのＲＮＡのステム−ループモチーフ、又はＰＰ７ファージのＲＮＡのステム−ループモチーフは、単独で、又は数回、好ましくは２〜２５回、より好ましくは２〜１８回、例えば６〜１８回反復して使用され得る。

【0037】

「結合ドメイン」とは、目的のＲＮＡ配列に連結されたカプシド形成配列に特異的に結合するタンパク質の全て又は一部を意味する。より具体的には、それは、カプシド形成配列に特異的に結合する三次元構造で定義された、突然変異又は非突然変異タンパク質である。好ましくは、結合ドメインは異種ドメインである。より好ましくは、結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージ、ＰＰ７ファージ又はＱβファージのコートタンパク質、プロファージＨＫ０２２のＮｕｎタンパク質、Ｕ１Ａタンパク質、あるいはｈＰｕｍタンパク質である。

【0038】

より好ましくは、結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質又はＰＰ７ファージのコートタンパク質である。

【0039】

さらにより好ましくは、結合ドメインがＰＰ７ファージのコートタンパク質である場合、その配列は、アミノ酸６７から７５の欠失のために、自己構築に不十分である（ＰＣＰΔＦＧ）（Chaoら、2008）。好ましくは、ＰＰ７ファージのコートタンパク質の配列は、ヒト細胞のためにコドン最適化されており、すなわち、ＤＮＡの塩基が、好ましくはヒト種に存在するアミノ酸をコードするために選択されている。

【0040】

「各配列」とは、これらカプシド形成配列が、同一又は異なる結合ドメインによって認識されるかどうかに応じて、カプシド形成配列が同一又は異なってもよいことを意味する。実際に、本発明に係るレトロウイルス粒子は、１つ又は複数の結合ドメインを含み得る。いくつかの結合ドメインが導入される場合、それらは、Ｇａｇポリタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入され得る。

【0041】

結合ドメインは、カプシド形成配列の認識を可能にするだけでなく、粒子中にカプシド形成配列を運ぶＲＮＡの（又は本件の場合、カプシド形成配列に結合した非ウイルスＲＮＡの）カプシド形成も可能にする。

【0042】

「カプシド形成」とは、ウイルス粒子のウイルスカプシドにおけるＲＮＡのパッケージングを意味する。本発明においては、非ウイルスＲＮＡのカプシド形成は、特にＰｓｉ以外の、非ウイルスカプシド形成シグナルの認識によって行われることに留意すべきである。

【0043】

「目的の配列」とは、ユーザーの目的の機能をコードするか又は有する配列を意味する。より具体的には、２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡのそれぞれによって運ばれる目的の配列は、同一又は異なっていてもよい。

【0044】

本発明に係る粒子を用いることで、同一又は異なる非ウイルスＲＮＡを標的細胞に転移させることができる。

【0045】

カプシド形成されたＲＮＡが非ウイルス性である場合、これらＲＮＡは、ｐｏｌ遺伝子によってコードされたタンパク質の認識部位を有さない。

【0046】

実際に、これら非ウイルスＲＮＡは、レトロウイルスの複製サイクルの初期段階に含まれない、すなわち、以下：
−逆転写酵素による二本鎖ＤＮＡへの一本鎖ウイルスＲＮＡのコピー；
−インテグラーゼによるＬＴＲ末端の認識による二本鎖ウイルスＤＮＡの成熟、及び、細胞質プレインテグレーション複合体（pre-integration complex）の核プレインテグレーション複合体への成熟、
に含まれない。

【0047】

したがって、ｐｏｌ遺伝子によってコードされたこれらウイルスタンパク質（逆転写酵素、インテグラーゼ）は、粒子において任意であり、したがってｐｏｌ遺伝子は、存在するか、あるいは部分的に又は完全に欠失しているかのいずれかであり得る。好ましくは、ｐｏｌ遺伝子は、存在するか、あるいは部分的に欠失しているかのいずれかである。

【0048】

本発明に係るレトロウイルス粒子は、ウイルス及び非ウイルスの両方の遺伝物質を含むことに留意すべきである：
−ｇａｇ遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。より具体的には、結合ドメイン又はドメイン（複数）が後者に導入される場合、ｇａｇ遺伝子はキメラである。
−任意により、ｐｏｌ遺伝子、これはウイルス性又はキメラであってもよい。ｐｏｌ遺伝子がいくつかの酵素をコードする場合、これら酵素に関連する配列は、完全に又は部分的に欠失しているか、存在しかつ非機能的であるか、あるいは存在しかつ機能的であり得る。より具体的には、結合ドメイン又はドメイン（複数）がインテグラーゼに導入される場合、ｐｏｌ遺伝子はキメラである。
−少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、各非ウイルスＲＮＡは、目的の配列及びカプシド形成配列を有する。より具体的には、これら非ウイルスＲＮＡはウイルス配列を欠いている。

【0049】

より具体的には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、標的細胞に、以下を誘導することができるＲＮＡを導入することを可能にする：
・標的細胞の目的の１つ又は複数の内因性又は外因性コーディング配列の転移、
・例えばｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡによる、遺伝子発現に対する影響を誘導することができるＲＮＡのような、１つ又は複数の非コーディングＲＮＡの転移。
・細胞ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡタイプ又はその他（ｍｉＲＮＡ等）、ＲＮＡウイルスのサブゲノムレプリコン（ＨＣＶ等）あるいはＲＮＡウイルスの完全なゲノムの転移、
・標的細胞の内因性又は外因性コーディング又は非コーディング配列の同時発現、
・ゲノム工学システム、例えばＣＲＩＳＰＲシステムによる、標的細胞ゲノムの修飾における関与。

【0050】

「ヌクレアーゼ」とは、ＤＮＡの１本鎖又は２本鎖を切断する能力を有する酵素を意味し、ヌクレアーゼは、２つのヌクレオチドの核酸のホスホジエステル結合の切断を開始する能力を有する。

【0051】

有利には、ヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼであり、すなわち、それはＤＮＡ鎖をその内部で切断する。

【0052】

さらに、ヌクレアーゼは、粘着末端（sticky ends）又は非粘着末端（non-sticky ends）を生じ得る。有利には、ヌクレアーゼは粘着末端を生じる。

【0053】

ヌクレアーゼは、その天然型（ＷＴ）、突然変異型、最適化型、短縮型、又はノックアウト型であり得る。実際に、天然ヌクレアーゼを突然変異させて、核酸のホスホジエステル結合を切断するその能力をノックアウトすることが可能である。

【0054】

カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列の少なくとも１つが、ヌクレアーゼをコードする部分を含む。すなわち、このＲＮＡ配列は、ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列のみを含むか、又は代替的に、ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ配列及び１つ又は複数の他のＲＮＡ配列を含んでもよく、かつ、これら他のＲＮＡ配列は、例えば、少なくとも１つのタンパク質、同一又は異なった、あるいは非コーディングＲＮＡ配列をコードし得る。

【0055】

より具体的には、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステムに関連するヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮシステムのヌクレアーゼ、Ｚｎ Ｆｉｎｇｅｒシステムのヌクレアーゼ、及びナトロノバクテリウム・グレゴリー・アルゴノート（ナトロノバクテリウム・グレゴリー・アルゴノート（ナトロノバクテリウム・グレゴリー・アルゴノート（Natronobacterium gregoryi Argonaute）））（ＮｇＡｇｏ）ヌクレアーゼによって構成される群から選択される。

【0056】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム工学システムは大きな可能性を秘めた遺伝子工学ツールとなった。それは、以下の２種類の構成要素を含む：
−ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）、これは、一般に単一の２０〜４０塩基対であるいわゆる「スペーサー」配列によって規則的に間隔が置かれた、（２１〜３７塩基対の）一連の短い直接反復を特徴とする；
−ＣＲＩＳＰＲシステムに関連するヌクレアーゼの１つ、好ましくはＣａｓ９ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）、すなわち、２つの活性切断ゾーン（二重らせんの各鎖につき１つ）でＤＮＡを切断するための特殊な酵素。例えば、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）は、バクテリオファージのＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡの侵入のような外来ＤＮＡを検出し、排除するためにツールＣａｓ９を使用する。Ｃａｓ９は、外来ＤＮＡを巻き戻して、ガイドＲＮＡの約２０塩基対の長いスペーサー領域との相補性を確認することによって、この検出を行う。ＤＮＡ配列がガイドＲＮＡに関連する場合、Ｃａｓ９は侵入ＤＮＡを切断する。

【0057】

このシステムは、動物及び植物細胞のゲノムを迅速かつ容易に改変するために使用される。ガイドＲＮＡ及びＤＮＡの相補性に由来するが、タンパク質それ自体の修飾（ＴＡＬＥＮ及びジンクフィンガーヌクレアーゼのような）には由来しないというＣａｓ９の標的の特異性のために、Ｃａｓ９ツールは新しいＤＮＡを非常に容易に標的化することができる。

【0058】

ＴＡＬＥＮゲノム工学システムは人工ヌクレアーゼを使用し、斯かる人工ヌクレアーゼは、ＴＡＬＥと呼ばれるＤＮＡ結合ドメインと、ＴＡＬＥＮと呼ばれるＤＮＡを切断する能力を有するドメインとの融合によって生成される。アミノ酸配列とＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ配列との単純な関係は、個別化タンパク質の合成を可能にする。これらシステムは、ＤＮＡ標的ＴＡＬＥの認識ドメインとＤＮＡ切断ドメインとを組み合わせることによって、標的ＤＮＡのほとんどの特異的配列を固定するために設計され得る。

【0059】

ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）は、細菌のキサントモナス属（Xanthomonas）によって天然に分泌されるタンパク質であり、非常に可変なアミノ酸１２及び１３を除いて、３３又は３４個の同一アミノ酸の繰り返しによって構成されるＤＮＡ結合ドメインを含み、この結合ドメインは特異的ヌクレオチドの認識を与える。アミノ酸配列とＤＮＡの認識とのこの単純な関係は、適切な可変残基を含む反復セグメントの集合体を選択することによって、配列の特異的ＤＮＡ結合ドメインを生成することを可能にする。配列のこれら特異的ＤＮＡ結合ドメインは、迅速にほとんどの所望のＤＮＡ配列を固定するために設計され得る。

【0060】

エンドヌクレアーゼＦｏｋ１の非特異的ＤＮＡ切断ドメインは、ハイブリッドヌクレアーゼを構築するために使用することができ、斯かるハイブリッドヌクレアーゼは、酵母における試験、植物細胞及び動物細胞で有効であることが判明している。ＴＡＬＥＮに関する最初の研究は、Ｆｏｋ１の元のドメイン、あるいは、ＤＮＡ切断のより高い特異性又は有効性を有するＦｏｋ１の変異体で行われた。

【0061】

Ｆｏｋ１ドメインは二量体の形態で機能し、これは、頭尾配向と正確な間隔とを有するゲノムの部位に対して指向されたＤＮＡ結合ドメインを有する２つのコンストラクトを必要とする。

【0062】

したがって、ＴＡＬＥドメインとＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断することになる）とを組み合わせることによって、任意のＤＮＡ配列のための特異的な制限酵素を作製することが可能である。

【0063】

Ｚｎ Ｆｉｎｇｅｒシステムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用し、かつ、２つのタンパク質の組み合わせからなり、斯かるタンパク質はそれぞれ、ＤＮＡ認識のために３つの特異的に選択されたジンクフィンガー、及びエンドヌクレアーゼＦｏｋ Ｉの触媒ドメインを含む。

【0064】

ジンクフィンガーを構成するアミノ酸の性質は、３つのヌクレオチドのＤＮＡの特異的配列の認識をもたらすことになる。したがって、３つの特異的ジンクフィンガーをそれぞれ含む２つのタンパク質を使用することによって、認識が１８ヌクレオチドの特異的配列に対して行われ、ゲノムに認識特異性を与えることになる。

【0065】

使用されるエンドヌクレアーゼは、酵素Ｆｏｋ Ｉのエンドヌクレアーゼドメインであり、かつ二量体形態で作用する。

【0066】

Ｆｏｋ１ドメインは二量体の形態で機能し、これは、頭尾配向と正確な間隔とを有するゲノムの部位に対して指向されたＤＮＡ結合ドメインを有する２つのコンストラクトを必要とする。

【0067】

有利には、数ヌクレオチド離れた配列を認識する３つのジンクフィンガー構造をそれぞれ含む２つのタンパク質が使用される。そのそれぞれの配列に対する２つのジンクフィンガータンパク質の結合は、それらに関連した２つのエンドヌクレアーゼを互いに近づける。この互いに近づくことにより、エンドヌクレアーゼの二量体化、次いでＤＮＡ二本鎖の切断を可能にする。

【0068】

好ましくは、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、及びＺｎ Ｆｉｎｇｅｒヌクレアーゼによって構成される群から選択される。

【0069】

「ＣＲＩＳＰＲシステムに関連するヌクレアーゼ」については、非限定的な例として、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの野生型バージョン（Ｃａｓ９ ＷＴ）、その２つの活性部位のうちの１つが突然変異したＣａｓ９ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９Ｎ又はＣａｓ９ Ｎｉｃｋａｓｅ）、又はその２つの活性部位が突然変異したＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｄＣａｓ９）、並びにＣｐｆ１ヌクレアーゼが挙げられる。

【0070】

Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）ヌクレアーゼは、２つの活性切断領域（二重らせんの各鎖に対して１つ）でＤＮＡを切断するための特殊な酵素である。例えば、化膿レンサ球菌は、バクテリオファージのＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡの侵入のような外来ＤＮＡを検出し排除するためにＣａｓ９ツールを使用する。

【0071】

ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（転写 activator-like effector nuclease））は、ＴＡＬＥと呼ばれるＤＮＡ結合ドメインと、例えばＦｏｋ１又はＦｏｋ１の変異体の触媒ドメインのようなＤＮＡを切断する能力を有する酵素ドメインとの融合によって生成される。

【0072】

「Ｆｏｋ１の変異体」とは、ＤＮＡ配列５′−ＧＧＡＴＧ（Ｎ）₉−３′を切断することを可能にする任意のタンパク質ドメインを意味する。

【0073】

Ｚｎ Ｆｉｎｇｅｒシステムのヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメイン、ジンクフィンガー型の、及びＤＮＡ切断触媒ドメインの、例えばＦｏｋ１又はＦｏｋ１の変異体の触媒ドメインの融合によって形成される、人工酵素である。

【0074】

本発明に係る第１のタイプのレトロウイルス粒子によれば、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列は、ヌクレアーゼをコードする部分を含み得る。

【0075】

これら粒子は、ＴＡＬＥＮ及びＺｎＦｉｎｇｅｒゲノム工学システムに特に興味深く、そのヌクレアーゼは二量体形態で作用する。また、好ましくは、目的の配列は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ又はジンクフィンガーヌクレアーゼ、より好ましくはＦｏｋ１又はＦｏｋ１の変異体の触媒ドメインをコードする部分を含む。

【0076】

第２のタイプのレトロウイルス粒子によれば、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、その目的の配列によって異なる。

【0077】

より具体的には、この第２のタイプにおいて：
−少なくとも１つのＲＮＡの目的の配列は、ヌクレアーゼをコードする部分及び３′でのＤＮＡ認識システムをコードする部分を含み、かつ
−少なくとも１つのＲＮＡの目的の配列は、ヌクレアーゼをコードする部分及び５′でのＤＮＡ認識システムをコードする部分を含む。

【0078】

目的の配列のＤＮＡ認識システムをコードする部分は、有利には、ＤＮＡの特異的配列を認識することができるタンパク質をコードするＲＮＡに対応する。

【0079】

有利には、この第２のタイプによるレトロウイルス粒子において、目的の配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼ、又はＦｏｋＩヌクレアーゼの変異体の触媒ドメインをコードする部分を含む。

【0080】

このＦｏｋＩヌクレアーゼの触媒ドメインは、有利には、それぞれＴＡＬＥＮ又はＺｎＦｉｎｇｅｒ ゲノム工学システムを実施するための、ＴＡＬＥＮ組み換えヌクレアーゼ及びジンクフィンガーヌクレアーゼを構築するために使用される。

【0081】

例として、本発明に係るレトロウイルス粒子は、異なる目的の配列を有する２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含んでもよく：
−第１の目的の配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする部分、及びＴＡＬＥ ３′をコードする部分を含み、並びに
−第２の目的の配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする部分、及びＴＡＬＥ ５′をコードする部分を含み；
あるいは、本発明に係るレトロウイルス粒子は、異なる目的の配列を有する２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含んでもよく：
−第１の目的の配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする部分、及び３′でのＤＮＡ配列の認識のための３つのジンクフィンガーをコードする部分を含み、並びに
−第２の目的の配列は、ＦｏｋＩヌクレアーゼをコードする部分、及び５′でのＤＮＡ配列の認識のための３つのジンクフィンガーをコードする部分を含む。

【0082】

特定の実施形態によれば、本発明に係るレトロウイルス粒子において、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも１つの目的の配列は、ヌクレアーゼをコードする。

【0083】

有利には、この特定の実施形態において、ヌクレアーゼはＣａｓ９である。

【0084】

より具体的には、この特定の実施形態に係るレトロウイルス粒子において、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、その目的の配列によって異なり、かつ他のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列は、ガイドＲＮＡの少なくとも１つの認識エレメントに対応する。

【0085】

ガイドＲＮＡは、２つの認識エレメントを一般に含むＲＮＡ配列に対応する：
−３〜４０塩基の範囲の非コーディングＲＮＡであって、ＤＮＡの特異的配列に塩基相補性によってハイブリダイズすることができるＲＮＡ、並びに
−「トランス活性化因子（transactivator）」（「足場」）と呼ばれる非コーディングＲＮＡ、これはヌクレアーゼをＤＮＡ上に固定させる。

【0086】

ＲＮＡ配列は、特異的ＤＮＡ切断部位の特異的標的化を可能にする。

【0087】

目的の配列は、同一又は異なる１つ又は複数のガイドＲＮＡに対応する１つ又は複数の部分（複数）を含み得る。

【0088】

有利には、第２のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡの目的の配列は、ガイドＲＮＡに対応する。ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ認識部分と、ヌクレアーゼの固定を可能にする部分との両方を含む。

【0089】

好ましくは、ガイドＲＮＡはｓｇＲＮＡである。さらにより好ましくは、ガイドＲＮＡは、カプシド形成配列の２つの反復を含むキメラｓｇＲＮＡである。

【0090】

好ましくは、粒子は、異なる目的の配列を有する２つのＲＮＡを含む：
−Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする第１の目的の配列、並びに
−ガイドＲＮＡに対応する第２の目的の配列。

【0091】

有利には、この特定の実施形態に係るレトロウイルス粒子は、少なくとも１つの第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡをさらに含み、斯かる第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、ガイドＲＮＡの第２の認識エレメントに又は付加的なガイドＲＮＡに対応する目的の配列を有する。

【0092】

有利には、粒子は、異なる目的の配列を有する３つのＲＮＡを含む：
−Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする第１の目的の配列、
−ガイドＲＮＡに対応する第２の目的の配列、並びに
−第２の目的の配列と同一又は異なるガイドＲＮＡに対応する第３の目的の配列。

【0093】

有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含み、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、ヌクレオカプシドタンパク質に及び／又はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される。

【0094】

「ヌクレオカプシドタンパク質」とは、ｇａｇ遺伝子によってコードされた構造ＮＣのタンパク質を意味する。結合ドメインがヌクレオカプシドタンパク質に導入される場合、このタンパク質は、キメラｇａｇ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。

【0095】

結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、インテグラーゼは、キメラｐｏｌ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。

【0096】

「キメラタンパク質」とは、いくつかの異なる融合タンパク質配列を含む組み換えタンパク質を意味する。

【0097】

第１の実施形態によれば、本発明に係るレトロウイルス粒子において、結合ドメインはヌクレオカプシドタンパク質に導入され、かつ、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡはそれらのＲＮＡ配列によって異なる。

【0098】

この第１の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のＲＮＡの早期の一過性発現を可能にする。

【0099】

実際に、この第１の実施形態に係る粒子を標的細胞と接触させると、レトロウイルス粒子の膜と標的細胞の膜とが融合することになり、粒子の内容物が標的細胞中に放出される。次に、ＲＮＡが細胞質内に放出され、細胞機構によってこれらＲＮＡが直接タンパク質（複数）に翻訳される、すなわち、逆転写、核内への移行、又は標的細胞のゲノムへの組み込みなどの付加的なステップ無しに翻訳される。

【0100】

より具体的には、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは同じカプシド形成配列を有する。この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡはそれらの目的のＲＮＡ配列によって異なる、すなわち、２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡに含まれる目的のＲＮＡ配列は異なっている。「異なる（different）」とは、同一ではないか、あるいは、自然突然変異から生じたものでないか、又は操作者によって意図的に選択されたものでない違いを有する、目的の配列を意味する。

【0101】

あるいは、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは２つの異なるカプシド形成配列を有する。次に、これら少なくとも２つのカプシド形成配列は、少なくとも２つの異なる結合ドメインによって認識され、これらドメインの少なくとも１つがヌクレオカプシドタンパク質に導入される。この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同一又は異なる目的の配列を含んでもよい。

【0102】

少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルスＲＮＡをカプシド形成することが可能である。

【0103】

第１の実施形態の特定の実施形態によれば、第２の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のヌクレオカプシドタンパク質に導入される。

【0104】

例として、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり得る、あるいは、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり得る。

【0105】

この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第１及び第２の結合ドメインにそれぞれ対応する。

【0106】

より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつそれらの目的のＲＮＡ配列によってのみ異なり、
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同一又は異なるカプシド形成配列を有する。カプシド形成配列が異なっている場合、後者はヌクレオカプシドタンパク質に導入された第２の結合ドメインに対応し得る。

【0107】

他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。

【0108】

ヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメイン又はドメイン（複数）に加えて、結合ドメインをインテグラーゼに導入することも可能である。

【0109】

次に、インテグラーゼは、キメラｐｏｌ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。

【0110】

好ましくは、結合ドメインがインテグラーゼに導入される場合、インテグラーゼの配列は、結合ドメインの配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。さらにより好ましくは、インテグラーゼの配列は、ＭＳ２バクテリオファージ又はＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を導入するように、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。

【0111】

この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列は、それぞれヌクレオカプシドタンパク質に及びインテグラーゼに導入された結合ドメインに対応する。

【0112】

より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつ、それらの目的のＲＮＡ配列によってのみ異なり、
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、斯かるカプシド形成配列は、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインに対応する。

【0113】

他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。

【0114】

有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。

【0115】

好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
−ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラのＧａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質であり、そのＮＣ配列は、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。

【0116】

有利には：
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
−カプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列の２〜２５回の反復を含み、好ましくは ステム−ループ配列の６〜１８回の反復、さらにより好ましくは１０〜１４回、例えば１２回の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は、以下のものである：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）。

【0117】

あるいは、好ましくは、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
−ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラのＧａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質であり、そのＮＣ配列は、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。

【0118】

有利には：
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
−カプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列の２〜２５回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８回の反復、さらにより好ましくは２〜１２回、例えば６回の反復を含む。好ましくは、ステム−ループ配列は以下のものである：ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）。

【0119】

有利には、配列番号２は、ステム−ループのフォールディングを促進するように最適化され得る。特に、配列番号２及び配列番号４を連続して挿入することが有利であり得ることが見出された。フォールディングを促進するためのこの配列番号２と配列番号４（ctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcaｇ）との交換は、コーディングＲＮＡの場合に特に有利である。他方で、非コーディングＲＮＡの場合、ＰＰ７の各ステム−ループモチーフは、有利には、ステム−ループ配列の配列番号５（ggagcagacgatatggcgtcgctcｃ）及びステム−ループ配列の配列番号６（ｃcagcagagcatatgggctcgctgg）を連続して挿入することによって得られる。

【0120】

任意により、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインはＰＰ７ファージのコートタンパク質であってもよく、あるいは、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインはＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質であってもよい。

【0121】

第２の実施形態によれば、本発明は、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、インテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含むレトロウイルス粒子であって、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡがそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、各カプシド形成配列が、インテグラーゼに導入された結合ドメインによって、及び任意により、Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質、好ましくはヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインによって認識される、レトロウイルス粒子に関する。

【0122】

この第２の実施形態は、標的細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに目的のＲＮＡの一過性発現を可能にする。

【0123】

好ましくは、この第２の実施形態において、インテグラーゼの配列は、結合ドメインの配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。

【0124】

有利には、結合ドメインは異種ドメインである。より具体的には、結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージ、ＰＰ７ファージ又はＱβファージのコートタンパク質、プロファージＨＫ０２２のＮｕｎタンパク質、Ｕ１Ａタンパク質、あるいはｈＰｕｍタンパク質である。

【0125】

好ましくは、インテグラーゼの配列は、ＭＳ２バクテリオファージ又はＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を導入するように、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。

【0126】

少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは、同じカプシド形成配列を有しても又は有さなくてもよい。

【0127】

同様に、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同じ目的のＲＮＡ配列を有しても又は有さなくてもよい。

【0128】

好ましくは、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、それらの目的のＲＮＡ配列によって異なり、すなわち２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡに含まれる目的のＲＮＡ配列は、異なっている。

【0129】

より具体的には、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡは同じカプシド形成配列を有し、後者はインテグラーゼに導入された結合ドメインによって認識される。

【0130】

少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ、好ましくは３つの非ウイルスＲＮＡをカプシド形成することが可能である。

【0131】

第２の実施形態の特定の実施形態によれば、第２の結合ドメインは、本発明に係るレトロウイルス粒子のインテグラーゼに導入される。

【0132】

例として、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり得る、あるいは、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質である場合、第２の結合ドメインはＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり得る。

【0133】

この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、各カプシド形成配列は、インテグラーゼに導入された第１及び第２の結合ドメインにそれぞれ対応する。

【0134】

より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つが、第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、これら２つの非ウイルスＲＮＡは、任意により、それらの目的のＲＮＡ配列によって異なり得る、
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、同一又は異なるカプシド形成配列を有し得る。カプシド形成配列が異なっている場合、後者はインテグラーゼに導入された第２の結合ドメインに対応し得る。

【0135】

他の結合ドメインがまた、インテグラーゼに導入されてもよい。

【0136】

インテグラーゼに導入された結合ドメイン又はドメイン（複数）に加えて、ヌクレオカプシドタンパク質に結合ドメインを導入することも可能である。

【0137】

次に、ヌクレオカプシドタンパク質は、キメラｇａｇ遺伝子に由来するキメラタンパク質である。

【0138】

この場合、少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有してもよく、各カプシド形成配列は、それぞれインテグラーゼに及びヌクレオカプシドタンパク質に導入された結合ドメインに対応する。

【0139】

より具体的には、３つの非ウイルスＲＮＡがカプシド形成される場合：
−カプシド形成された非ウイルスＲＮＡの少なくとも２つは、インテグラーゼに導入された第１の結合ドメインに対応する同じカプシド形成配列を有し、かつ、これら非ウイルスＲＮＡは、任意により、それらの目的のＲＮＡ配列によって異なり得る、
−第３のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、異なるカプシド形成配列を有し、斯かるカプシド形成配列は、ヌクレオカプシドタンパク質に導入された第２の結合ドメインに対応する。

【0140】

他の結合ドメインがまた、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよい。

【0141】

有利には、本発明に係る粒子がヌクレオカプシドタンパク質を含む場合、結合ドメインは、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されてもよく、かつ第２の結合ドメインは、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入されてもよい。

【0142】

好ましくは、次に、本発明に係るレトロウイルス粒子は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含み、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡはそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、少なくとも１つのカプシド形成配列は、１２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフ（又はステム−ループ配列）であり、このモチーフは、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されたＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質によって認識される。

【0143】

ステム−ループモチーフは有利には、配列番号１の配列である。

【0144】

例として、本発明に係るそのような粒子は、以下の実施例に記載される、粒子ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘである。

【0145】

このレトロウイルス粒子において、カプシド形成配列として、１２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを含むカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、有利には、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡであり、かつ、第２のカプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、ガイドＲＮＡの少なくとも１つの認識エレメントに対応するＲＮＡ、又はガイドをコードするＲＮＡであり、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、カプシド形成配列として、２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを含む。

【0146】

例として、本発明に係るそのような粒子は、以下の実施例に記載される、粒子ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘである。

【0147】

代替的に又は併せて、本発明に係るレトロウイルス粒子は、ヌクレオカプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、任意によりインテグラーゼ及び少なくとも２つのカプシド形成された非ウイルスＲＮＡを含み、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡはそれぞれ、カプシド形成配列に連結された目的のＲＮＡ配列を含み、少なくとも１つのカプシド形成配列は、２回反復したＰＰ７バクテリオファージのステム−ループモチーフであり、このモチーフは、ヌクレオカプシドタンパク質に導入されたＰＰ７バクテリオファージのコートタンパク質によって認識される。

【0148】

有利には、ステム−ループモチーフは、配列番号２の配列である。あるいは、ステム−ループモチーフは、特にコーディングＲＮＡについて、配列番号２と配列番号４との交換、又は特に非コーディングＲＮＡについて、配列番号５と配列番号６との交換である。

【0149】

例として、本発明に係る粒子が、カプシド形成配列として、２回反復したＰＰ７バクテリオファージのステム−ループモチーフのみを含む場合、そのような本発明に係る粒子は、以下の実施例に記載される、粒子ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘである。

【0150】

例として、本発明に係る粒子が併せて、カプシド形成配列として、１２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフ及び２回反復したＰＰ７バクテリオファージのステム−ループモチーフを含む場合、そのような本発明に係る粒子は、以下の実施例に記載される、粒子ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）− ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘである。

【0151】

あるいは、本発明に係るレトロウイルス粒子において、結合ドメインは、インテグラーゼに導入されてもよく、かつ第２の結合ドメインは、ヌクレオカプシドに及び／又はインテグラーゼに導入されてもよい。

【0152】

有利には、本発明に係るレトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。

【0153】

レトロウイルス粒子がレンチウイルス粒子である場合、標的細胞、特に静止細胞のゲノムにおける関連した組み込みイベントなしに、目的のＲＮＡを一過的に発現することが可能である。

【0154】

実際に、組み込み反応それ自体のその役割に加えて、インテグラーゼ（ＩＮ）は、レトロウイルスの複製サイクルの様々な段階、例えばウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体（ＰＩＣ）の核内輸送に関与する。

【0155】

より具体的には、レンチウイルスにおいて、インテグラーゼは、ＰＩＣによって核内にその局在を可能にする核局在配列（ＮＬＳ）を含む。結果として、非ウイルスＲＮＡのカプシド形成が、レンチウイルスのインテグラーゼによって運ばれた結合ドメインによって行われる場合、カプシド形成された非ウイルスＲＮＡは、標的細胞の核内に輸送されることになる。実際に、第２の実施形態に係るレンチウイルス粒子を標的細胞と接触させると、粒子の膜と標的細胞の膜とが融合することになり、標的細胞におけるカプシドの内容物の放出を可能にする。次に、インテグラーゼはＲＮＡを引き受けて、ＰＩＣを介して、核内へのＲＮＡの取り込みを可能にすることになる。この引き受けは特に特定の用途、例えば静止細胞における発現に有利である。レンチウイルス以外のレトロウイルス粒子の場合、インテグラーゼはこれらＮＬＳを含まず、従って細胞質に局在する。しかしながら、インテグラーゼの核局在、結果としてこのインテグラーゼによって引き受けられるＲＮＡの核局在を誘導するために、このタイプのインテグラーゼにＮＬＳ配列を追加することが可能である。

【0156】

この引き受けはまた、標的細胞のゲノムに特異的にハイブリダイズすることになるガイドＲＮＡを用いる、ＣＲＩＳＰＲシステムに特に有用である。一度ハイブリダイズすると、これらガイドＲＮＡは、エンドヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）をガイドし、それは標的細胞のゲノムの特定の遺伝子座の改変を可能にすることになる。より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列であり、
−インテグラーゼは、キメラ酵素タンパク質であり、その配列は、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するためにＣ−末端ドメインのレベルで突然変異している。

【0157】

ここで、より具体的には、そのようなレンチウイルス粒子において：
−結合ドメインは、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質であり、
−非ウイルスＲＮＡのカプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列であり、
−インテグラーゼは、キメラ酵素タンパク質であり、その配列は、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、Ｃ−末端ドメインのレベルで突然変異している。

【0158】

任意により、第１の結合ドメインがＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質である場合、ヌクレオカプシドに導入された第２の結合ドメインは、ＰＰ７ファージのコートタンパク質であり得る、あるいは、第１の結合ドメインがＰＰ７ファージのコートタンパク質である場合、インテグラーゼに導入された第２の結合ドメインは、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質であり得る。

【0159】

実際に、インテグラーゼ（ＩＮ）は、３つの別々の機能ドメインから構成され、それぞれが完全な組み込み反応を確実にするために不可欠である。Ｎ−末端ドメインは、ジンクフィンガー型のモチーフを含み、これはＩＮのフォールディング構造を安定化し、かつ酵素の触媒活性を増加させる。ＩＮの中央ドメインはアミノ酸モチーフＤＤＥを含み、酵素の触媒活性はこれに起因する。この中央ドメインはまた、レトロウイルスＤＮＡの各末端で保存されたヌクレオチド配列の認識にも関与する。Ｃ−末端ドメインは、レトロウイルスのファミリーの中で最も保存されていない。それは、ＤＮＡ結合活性を有し、かつ鎖転移の３′末端の成熟反応に不可欠である。組み込み反応それ自体におけるその役割に加えて、ＩＮは、レトロウイルスの複製サイクルの様々な段階、例えばウイルス粒子の形態形成、逆転写及びプレインテグレーション複合体（ＰＩＣ）の核内輸送に関与する。

【0160】

Petitらによって記載されたように（1999; J. Virol. P5079-5088）、ＩＮのＣ−末端における外因性配列の挿入は、標的細胞の産生及び形質導入のステップを妨げないが、Ｎ−末端における同じ挿入は、形質導入イベントの検出を可能にしない。

【0161】

従って、レトロウイルス粒子は、インテグラーゼのタンパク質と融合したＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質（図Ｉ参照）又はＰＰ７ファージの「コート」タンパク質（図ＸＸＸＶＩＩ参照）を含むように改変された。ｐ８．７４カプシド形成プラスミドは、インテグラーゼのタンパク質をコードするｐｏｌ遺伝子を有し、斯かるプラスミドは、アセンブリＰＣＲによってインテグラーゼのＣ−末端にコートタンパク質をコードする配列を挿入するために改変される。ｐ８．７４プラスミドはＰＣＲによって線状化され、次に、ＰＣＲによって先に増幅されたＣｏａｔ配列が、末端から末端に直接、又はリンカーに加えてのいずれかで、インテグラーゼのＣ−末端レベルにクローニングされる。

【0162】

有利には：
−エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。

【0163】

−カプシド形成配列は、導入される結合ドメインに応じて、ＭＳ２の及び／又はＰＰ７のステム−ループ配列の２〜２５回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８回の反復、より好ましくは２〜１８回の反復、例えば６〜１８回の反復、さらにより好ましくはＭＳ２のステム−ループ配列について、１０〜１４回、例えば１２回の反復を含む。

【0164】

−好ましくは、結合ドメインがＭＳ２のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）であり、及び／又は、結合ドメインがＰＰ７のコートタンパク質である場合、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）である。

【0165】

本発明に係るレンチウイルス粒子のいくつかの例を、以下に記載し、そのうちのいくつかについては続く実施例でより詳細に記載する：
−ＭＳ２ＲＬＰ又はＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ又はＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有する少なくとも１つの第１のＲＮＡと、２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有する少なくとも１つの第２のＲＮＡとのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ６Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ ６Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７ＲＬＰ又はＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ６Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７ＲＬＰ又はＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ ６Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、６回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子であり、
−ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子は、インテグラーゼへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復した、ＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子である。
−ＭＳ２／ＰＰ７ＲＬＰ又はＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子は、ヌクレオカプシドへのＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入によって、１２回反復したＭＳ２バクテリオファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡと、ヌクレオカプシドへのＰＰ７ファージのコートタンパク質の挿入によって、２回反復したＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有するＲＮＡとのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子である。

【0166】

好ましくは、ＲＮＡのカプシド形成によって形成されたレンチウイルス粒子は、２〜２５回、より好ましくは２、６又は１２回反復したＭＳ２バクテリオファージ又はＰＰ７ファージのステム−ループモチーフを有する。

【0167】

さらにより好ましくは、本発明に係る粒子は、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ６Ｘ、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ、ＭＳ２（ＩＮ）−ＲＬＰ １２Ｘ、ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ ６Ｘ及びＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ ２Ｘ、ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘから選択される。

【0168】

本発明はまた、本発明に係る粒子を含有する組成物に関する。

【0169】

より具体的には、本発明に係る組成物は、濃縮された組成物である。有利には、組成物はまた、精製される。これら組成物は、国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載の方法によって濃縮及び精製されてもよい。

【0170】

典型的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び４５％未満のタンパク質夾雑物を含有する。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び２％未満のタンパク質夾雑物を含有する。

【0171】

「粗上清」とは、清澄化後の、本発明に係るレトロウイルス粒子を含む細胞培養物（複数）の上清を意味する。そのような清澄化ステップは、より具体的には、以下の本発明に係る粒子を製造するための方法に記載される。上清の回収が数回行われる場合、粗上清は、回収され、合わされ（又は「プールされ」）、次に清澄化された上清の全てに対応する。

【0172】

任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。

【0173】

本発明はまた、本発明に係る粒子を生産するためのキット、及びそれらキットの製造方法に関する。

【0174】

より具体的には、本発明は、本発明に係る粒子を生産するためのキットであって、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、ここで、当該Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む、キットに関する。

【0175】

そのようなキットはまた、キットに含まれるプラスミドの使用のための指示書を含んでもよい。

【0176】

より具体的には、キットが、第１の実施形態に係る粒子を生産するためのキットである場合、このキットは、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列は目的の配列を含み、この目的の配列の上流、下流又は配列内にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）キメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、ここで、斯かるキメラヌクレオカプシドタンパク質は、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。

【0177】

目的の配列が異なる、及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列は異なっている。

【0178】

プラスミドはＤＮＡ構造であるので、「少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミド」とは、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列をコードする発現プラスミドを意味することがよく知られている。

【0179】

実際に、キットの発現プラスミドは、転写によって少なくとも１つの非ウイルスＲＮＡを得るのに必要な全てのＤＮＡ配列を含む。発現プラスミドは、少なくとも１つのプロモーター、次いで、ＤＮＡ目的の配列（非ウイルスＲＮＡに転写されることになるｃＤＮＡ又はＤＮＡ）、及びカプシド形成配列（ＭＳ２又はＰＰ７反復モチーフについてのＤＮＡコーディング例）、及び任意によりＲＮＡ安定化配列、を含む。

【0180】

好ましくは、第１の実施形態に係る粒子を生産するためのキットは、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流、下流又は配列内にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
当該目的の配列は異なっており、かつ当該カプシド形成配列は同一である、
（ｉｉ）キメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、ここで、斯かるキメラヌクレオカプシドタンパク質は、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。

【0181】

有利には、キットは、レンチウイルス粒子を生産する。

【0182】

好ましくは：
−発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、ＭＳ２のステム−ループ配列の２〜２５回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の６〜１８回の反復、さらにより好ましくは１０〜１４回、例えば１２回の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag（配列番号１）である。
−カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質であり、当該ＮＣは、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
−エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。

【0183】

あるいは、好ましくは：
−発現プラスミドにおいて、カプシド形成配列は、ＰＰ７のステム−ループ配列の２〜２５回の反復を含み、好ましくはステム−ループ配列の２〜１８回の反復、さらにより好ましくは２〜１２回、例えば６回の反復を含む。有利には、ステム−ループ配列は、以下：ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag（配列番号２）である。
−あるいは、ステム−ループ配列は、特にコーディングＲＮＡについて、配列番号２と配列番号４との交換、又は特に非コーディングＲＮＡについて、配列番号５と配列番号６との交換である。
−カプシド形成プラスミドにおいて、ヌクレオカプシドタンパク質は、Ｇａｇポリタンパク質に属するＨＩＶのヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質であり、当該ＮＣは、ＰＰ７ファージの「コート」タンパク質の配列を挿入するために、第２のジンクフィンガーのレベルで突然変異している。
−エンベローププラスミドにおいて、エンベロープタンパク質は、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇタンパク質である。

【0184】

任意により、キットは、キメラインテグラーゼをコードする第２のカプシド形成プラスミドを含み、斯かるキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む。第２の結合ドメインは、キメラヌクレオカプシドタンパク質の結合ドメインと同一又は異なってもよい。

【0185】

種々の結合ドメインの例として：
−ヌクレオカプシドに導入された結合ドメインは、ＭＳ２のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入された結合ドメインは、ＰＰ７のコートタンパク質であってもよい、あるいは
−ヌクレオカプシドに導入された結合ドメインは、ＰＰ７のコートタンパク質であってもよく、かつインテグラーゼに導入された結合ドメインは、ＭＳ２のコートタンパク質であってもよい。

【0186】

いくつかの結合ドメインが、キメラタンパク質のそれぞれに導入されてもよい。

【0187】

あるいは、キットが、第２の実施形態に係る粒子を生産するためのキットである場合、このキットは、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）キメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、ここで、斯かるキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
を含む。

【0188】

有利には、本発明に係るキットの発現プラスミドに用いられるプロモーターは、ＥＦ１であり、特に目的の配列がヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９、及びＵ６である場合、特に目的の配列が、ガイドＲＮＡの少なくとも１つの認識エレメントであるか又はガイドＲＮＡである場合。

【0189】

有利には、本発明に係る生産キットは、第２のカプシド形成プラスミドをさらに含んでもよく、斯かる第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドが、キメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合には、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は
−第１のカプシド形成プラスミドがキメラインテグラーゼをコードする場合には、野生型インテグラーゼをコードする。

【0190】

本発明に係るキットのための製造方法も提案される。典型的には、本発明に係るキットを製造するための方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し、
（ｉｉ）Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、ここで、当該Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。

【0191】

より具体的には、方法が、第１の実施形態に係る粒子を生産するためのキットに関する場合、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミド、各ＲＮＡ配列は目的の配列を含み、この目的の配列の上流、下流又は配列内にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドあるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、を調製し、
（ｉｉ）キメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、ここで、斯かるキメラヌクレオカプシドタンパク質は、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。

【0192】

目的の配列が異なる及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列は異なっている。

【0193】

好ましくは、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流、下流又は配列内にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、を調製し
当該目的の配列は異なっており、かつ当該カプシド形成配列は同一である、
（ｉｉ）キメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミドを調製し、ここで、斯かるキメラヌクレオカプシドタンパク質は、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド
を調製すること、
を含む。

【0194】

あるいは、方法が、第２の実施形態に係る粒子を生産するためのキットに関する場合、当該方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミドを調製し
（ｉｉ）キメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミドを調製し、ここで、斯かるキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミドを調製すること、
を含む。

【0195】

本発明はまた、本発明に係る粒子のための製造方法に関する。

【0196】

そのような方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、ここで、斯かるＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質及び／又はキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞からの上清の回収のステップ、
を含む。

【0197】

本発明に係る粒子のための製造方法に利用される細胞は、プロデューサー細胞であり、すなわち、レトロウイルス粒子の形成に必要な遺伝物質を有するプラスミドで一度トランスフェクトされた細胞が、当該粒子の形成を可能にする。プロデューサー細胞の例として、ＨＥＫ２９３Ｔが挙げられる。

【0198】

「コトランスフェクションのステップ」とは、粒子を製造するための方法のプラスミドの全てとプロデューサー細胞とを接触させることによってトランスフェクションが行われる、トランスフェクションのステップを意味する。

【0199】

より具体的には、製造方法の目的が第１の実施形態に係る粒子を生産することである場合、それは、以下：
（ｉ）少なくとも２つの異なる非ウイルスＲＮＡ配列を含む発現プラスミドであって、各ＲＮＡ配列が目的の配列を含み、この目的の配列の上流、下流又は配列内にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）キメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、ここで、斯かるキメラヌクレオカプシドタンパク質は、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞からの上清の回収のステップ、
を含む。

【0200】

目的の配列が異なる及び／又はカプシド形成配列が異なるために、少なくとも２つの非ウイルスＲＮＡ配列は異なっている。

【0201】

好ましくは、この粒子を製造するための方法は、以下：
（ｉ）少なくとも２つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、これら配列のそれぞれの上流、下流又は配列内にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、あるいは代替的に、第１及び第２の発現プラスミドであって、それぞれ目的の配列を含み、その上流又は下流にカプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
当該目的の配列は異なっており、かつ当該カプシド形成配列は同一である、
（ｉｉ）キメラヌクレオカプシドタンパク質をコードするカプシド形成プラスミド、ここで、斯かるキメラヌクレオカプシドタンパク質は、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに、
粒子を含むトランスフェクトされた細胞からの上清の回収のステップ、
を含む。

【0202】

あるいは、製造方法の目的が、第２の実施形態に係る粒子を生産することである場合、この方法は、以下：
（ｉ）少なくとも１つの目的の配列を含む発現プラスミドであって、この配列の上流、下流、又は配列内に、カプシド形成配列が挿入されている、発現プラスミド、
（ｉｉ）キメラインテグラーゼをコードするカプシド形成プラスミド、ここで、斯かるキメラインテグラーゼは、カプシド形成配列の認識を可能にする結合ドメインを含む、並びに、
（ｉｉｉ）エンベロープタンパク質をコードするエンベローププラスミド、
による細胞のコトランスフェクションのステップ、並びに
粒子を含むトランスフェクトされた細胞からの上清の回収のステップ、
を含む。

【0203】

有利には、本発明に係る製造方法において、発現プラスミドは、コトランスフェクションに利用される全プラスミド数の少なくとも５０％を表す。

【0204】

本発明に係る製造方法において、コトランスフェクションのステップは、さらに第２のカプシド形成プラスミドによって行われてもよく、斯かる第２のカプシド形成プラスミドは：
−第１のカプシド形成プラスミドがキメラＧａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードする場合、野生型Ｇａｇポリタンパク質に由来するタンパク質をコードし、及び／又は、
−第１のカプシド形成プラスミドがキメラインテグラーゼをコードする場合、野生型インテグラーゼをコードする。

【0205】

有利には、第２のカプシド形成プラスミドと第１のカプシド形成プラスミドとの比は、［１０：９０］〜［６０：４０］の範囲、好ましくは［２０：８０］〜［５０：５０］の範囲である。

【0206】

第２のカプシド形成プラスミドの使用に関連する利点、より具体的には上記で定義した比に関連する利点は、実施例１３でより十分に記載する。

【0207】

好ましくは、本発明に係る粒子のための全ての製造方法は、国際公開第２０１３／０１４５３７号に記載の方法によって行われる。

【0208】

より具体的には、粒子のためのこれら製造方法は、血清を含まない培地で培養されたプロデューサー細胞に対して行われ、かつ酪酸ナトリウムによる誘導は行われない。

【0209】

有利には、上清は数回、例えば３〜６回、特定の時間間隔で、例えばレトロウイルス粒子の半減期のオーダーの次間隔で、回収される。典型的には、上清の回収は、４〜５回、６〜１８時間、好ましくは８〜１６時間、例えば８時間、１２時間及び／又は１６時間のオーダーの時間間隔で行われる。好ましくは、当該回収は、細胞の培養培地の交換後に行われ、この交換は好ましくは、トランスフェクション後２４時間で行われる。

【0210】

本発明に係る粒子のための製造方法はまた、上清が清澄化されるステップを含む。

【0211】

好ましくは、上清は、遠心分離によって清澄化される。

【0212】

さらにより好ましくは、本発明に係る粒子のためのこれら製造方法はさらに、上清が濃縮及び／又は精製されるステップを含む。

【0213】

好ましくは、濃縮及び精製は、遠心分離ユニットでの正面（frontal）限外濾過によって行われる。

【0214】

有利には、上清は、１つ又は複数の付加的な精製ステップを受ける。これら精製ステップは好ましくは、接線（tangential）限外濾過及び／又は透析濾過によって行われる。さらにより好ましくは、上清は、接線限外濾過のステップに次いで、透析濾過のステップを受ける。

【0215】

接線限外濾過は有利には、ポリスルホン中空繊維カートリッジで行われる。

【0216】

任意により、組成物は次に、イオン交換クロマトグラフィー、特に陰イオン交換クロマトグラフィーのステップを受けてもよい。このクロマトグラフィーステップからの溶出液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。当該方法から得られる組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。

【0217】

本発明はまた、本発明に係る粒子のための製造方法のいずれか一つによって得られる組成物に関する。

【0218】

典型的には、これら組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び４５％未満のタンパク質夾雑物を含有する。より具体的には、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、３０％未満のＤＮＡ夾雑物及び２％未満のタンパク質夾雑物を含有する。

【0219】

任意により、本発明に係る組成物は、粗上清に対して、１％未満のＤＮＡ夾雑物及び１％未満のタンパク質夾雑物を含有する。

【0220】

最後に、本発明は、細胞の形質導入のための、本発明に係る粒子、又は本発明に係る組成物の使用に関する。

【0221】

本発明に係る粒子及び組成物の使用は、それらを一過的に改変するために、初代細胞及び不死化株の形質導入に特に有利である。細胞は、哺乳動物細胞であるか又は他の真核生物由来であってもよい。特に、これら細胞の形質導入は、インビボ、インビトロ又はエクスビボで行われ得る。

【0222】

細胞は、本発明に係る粒子による１回又は２回の連続した形質導入を受けてもよい。

【0223】

細胞の形質導入のための本発明に係る粒子の使用は、ＤＮＡ修復のメカニズムによって細胞が応答するＤＮＡの二本鎖の切断を誘導するその能力のために、ゲノムに突然変異を導入することを可能にする。例えば、修復は、二本鎖切断から生じるＤＮＡ、この目的のために導入されたか又は細胞内で利用可能なＲＮＡの、２つの末端を再連結するための非ホモログ末端の挿入によって行われ得る。

【0224】

これらゲノム工学システムはまた、遺伝子ノックアウト、すなわち遺伝子発現のノックアウトを行うために用いられてもよく、又はさらに、標的遺伝子に応じて細胞死を誘導してもよい。

【0225】

本発明に係る粒子が細胞に導入された後、次にそれらは、インビボ、インビトロ又はエクスビボで、ゲノムを改変するために使用することができる。

【0226】

本発明は、以下にそれぞれ示す図面を参照して、例示により後に示される実施例から、よりよく理解されるであろう：

【図面の簡単な説明】

【0227】

【図1】図Ｉは、その野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）における、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘ発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図2a】図ＩＩａは、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔを構築するための構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを改変するための戦略を示す；

【図2b】図ＩＩｂは、図ＩＩａに提示された戦略により得られた、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質によって置換された第２のジンクフィンガーを有するｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図3】図ＩＩＩは、エンベロープｐＥＮＶプラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図4】図ＩＶは、その野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）における、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲＮＡ配列をコードするＤＮＡを含むｐＩＬＶ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＷＰＲＥ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図5a】図Ｖａは、ＧＦＰのＲＮＡをコードするＤＮＡを含むｐＩＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図5b】図Ｖｂは、ＧＦＰの配列を標的化する２つの非コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡを含むｐＩＬＶ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１−ＷＰＲＥ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である（この場合、ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ＝Ｇｕｉｄｅ Ｕ３及びＧｕｉｄｅ Ｄ１）；

【図5c】図Ｖｃは、ＧＦＰの配列を標的化する非コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡを含むｐＩＬＶ−Ｈ１／Ｕ６−Ｇｕｉｄｅ−ＷＰＲＥ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ＝Ｇｕｉｄｅ）；

【図6】図ＶＩは、構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図7】図ＶＩＩは、ＧＦＰの配列を標的化する、足場を含む、非コーディングガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１−ＭＳ２ ２Ｘ発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ）、ここでは、ＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（配列番号３）が、ガイドＲＮＡの下流の発現カセットに挿入された；

【図8】図ＶＩＩＩは、プロモーター−目的の配列−Ｔｅｒｍ発現カセットの、ＧＦＰの配列を標的化する非コーディングガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を有するｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ）、ここでは、ＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（配列番号３）が、キメラガイドの「足場」部分に含まれる；

【図9】図ＩＸは、ＨＣＴ１１９−ＧＦＰ細胞の形質導入中のＣａｓ９ヌクレアーゼＮｉｃｋａｓｅをコードするＲＮＡを送達する際の、本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子の有効性を示す；

【図10】図Ｘは、ＨＣＴ１１９−ＧＦＰ Ｃａｓ９細胞の形質導入後の、本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子におけるガイドＲＮＡのカプシド形成のためのＭＳ２反復モチーフの位置の影響を示す；

【図11】図ＸＩは、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ−Ｃａｓ９細胞の形質導入のためのガイドＲＮＡを有する発現プラスミドの単量又は倍量を用いて生産されるかに応じた、ガイドＲＮＡを送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産の有効性を示す；

【図12】図ＸＩＩは、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ細胞における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達する際の、本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子の有効性を示す（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ ９をコードするＲＮＡ）；

【図13a】図ＸＩＩＩａは、ＤＮＡの５′鎖を認識する、ＤＮＡ結合ドメインのＴＡＬＥと融合したＦｏｋＩヌクレアーゼによって構成されたＴＡＬＥＮヌクレアーゼのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＰＰＲＶ．ＴＡＬＥＮ ５′．ＷＰＲＥ ＭＳ２（１２Ｘ）発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図13b】図ＸＩＩＩｂは、ＤＮＡの３′鎖を認識する、ＤＮＡ結合ドメインのＴＡＬＥと融合したＦｏｋＩヌクレアーゼによって構成されたＴＡＬＥＮヌクレアーゼのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＰＰＲＶ．ＴＡＬＥＮ ３′．ＷＰＲＥ ＭＳ２（１２Ｘ）発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図14a】図ＸＩＶａは、ＤＮＡの５′鎖を認識する、ＤＮＡ結合ドメインのＴＡＬＥと融合したＦｏｋＩヌクレアーゼによって構成されたＴＡＬＥＮヌクレアーゼのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＴＡＬＥＮ ５′発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図14b】図ＸＩＶｂは、ＤＮＡの３′鎖を認識する、ＤＮＡ結合ドメインのＴＡＬＥと融合したＦｏｋＩヌクレアーゼによって構成されたＴＡＬＥＮヌクレアーゼのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＴＡＬＥＮ ３′発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図15a】図ＸＶａは、ＤＮＡの５′鎖の認識のためのＦｏｋＩヌクレアーゼによるキメラジンクフィンガー型のＤＮＡ 認識ドメインを有する、発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＰＰＲＶ．ＺＦＰ ５′．ＷＰＲＥ．ＭＳ２（１２Ｘ）に由来する発現カセットを示す模式図である；

【図15b】図ＸＶｂは、ＤＮＡの３′鎖の認識のためのＦｏｋＩヌクレアーゼによるキメラジンクフィンガー型のＤＮＡ 認識ドメインを有する、ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＰＰＲＶ．ＺＦＰ ３′．ＷＰＲＥ．ＭＳ２（１２Ｘ）発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図16a】図ＸＶＩａは、ＤＮＡの５′鎖の認識のためのＦｏｋＩヌクレアーゼによるキメラジンクフィンガー型のＤＮＡ認識ドメインを有する、ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＺＦＰ ５′発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図16b】図ＸＶＩｂは、ＤＮＡの３′鎖の認識のためのＦｏｋＩヌクレアーゼによるキメラジンクフィンガー型のＤＮＡ認識ドメインを有する、ｐＩＬＶ．ＥＦ１．ＺＦＰ ３′発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図17】図ＸＶＩＩは、本発明に係る、１２回反復したステム−ループモチーフＰＰ７を含む、レンチウイルス粒子ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘを生産するために使用された目的のＲＮＡ配列として、ルシフェラーゼを有する発現プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す、；

【図18】図ＸＶＩＩＩは、インテグラーゼの配列に結合ドメインを挿入するためのレンチウイルスｐ８．７４カプシド形成プラスミドの改変の模式図を示す；

【図19】図ＸＩＸは、図ＶＩに示されたレンチウイルスｐ８．７４カプシド形成プラスミドを改変することによって得られた、本発明に係るレンチウイルス粒子ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰを生産するために使用された、カプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの模式図を示す；

【図20】図ＸＸは、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達する際の本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子の有効性を示す（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ ９をコードするＲＮＡ）；

【図21】図ＸＸＩは、Ｕ６プロモーターに応じて、ＧＦＰの配列を標的化する非コーディングＲＮＡをコードするＲＮＡを含む、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ−Ｔｅｒｍ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である（この場合ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ＝Ｇｕｉｄｅ Ｄ１）；

【図22】図ＸＸＩＩは、プロデューサー細胞におけるガイドＲＮＡの転写を可能にするプロモーターの機能として、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ細胞における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性を示す；

【図23】図ＸＸＩＩＩは、Ｕ６プロモーターに応じて、ＰＤ１遺伝子を標的化する非コーディングＲＮＡをコードするＲＮＡを含む、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−Ｇｕｉｄｅ＿ａｎｔｉＰＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ−Ｔｅｒｍ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ＝Ｇｕｉｄｅ）；

【図24】図ＸＸＩＶは、ＰＤ１遺伝子のノックアウトのために、活性化初代Ｔリンパ球にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性を示す；

【図25】図ＸＸＶは、ＰＤ１遺伝子のノックアウトのために、活性化初代Ｔリンパ球にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＩＬＶ粒子の有効性を示す；

【図26】図ＸＸＶＩは、活性化リンパ球の生存率に対する、ＰＤ１遺伝子のノックアウトのためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の影響を示す；

【図27】図ＸＸＶＩＩは、ＰＤ１遺伝子のノックアウトのためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子による形質導入後の活性化リンパ球の表現型の分析を示す；

【図28】図ＸＸＶＩＩＩは、Ｕ６プロモーターに応じて、ＣＸＣＲ４遺伝子を標的化する非コーディングＲＮＡをコードするＲＮＡを含む、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−Ｇｕｉｄｅ＿ａｎｔｉＣＸＣＲ４Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ＝Ｇｕｉｄｅ）；

【図29】図ＸＸＩＸは、ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトのために、活性化初代Ｔリンパ球における、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性を示す（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ ９をコードするＲＮＡ）；

【図30】図ＸＸＸは、活性化初代Ｔリンパ球の生存率に対する、ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトのためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子の影響を示す（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ ９をコードするＲＮＡ）；並びに

【図31】図ＸＸＸＩは、ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトのためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子による形質導入後の、活性化Ｔリンパ球表現型の分析を示す（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ ９をコードするＲＮＡ）。

【図32】図ＸＸＸＩＩは、ＰＤ１遺伝子を標的化する非コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む、ｐＩＬＶ−Ｈ１／Ｕ６−ＧｕｉｄｅａｎｔｉＰＤ１−ＷＰＲＥプラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ＝Ｇｕｉｄｅ）；

【図33】図ＸＸＸＩＩＩは、ＨＣＴ１１６ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞におけるＧＦＰ遺伝子のノックアウトのためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子の用量の効果を示す（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ ９をコードするＲＮＡ）；

【図34】図ＸＸＸＩＶは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含むｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＰＰ７ ２Ｘプラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図35】図ＸＸＸＶは、Ｕ６プロモーターに応じてプロモーター−目的の配列−Ｔｅｒｍ 発現カセット（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ＝Ｇｕｉｄｅ）の、ＧＦＰの配列を標的化する非コーディングＲＮＡをコードするＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＰＰ７ ２Ｘプラスミドに由来する発現カセット（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ）の構築の模式図である、ここでは、ＰＰ７ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（それぞれ配列番号２及び配列番号４）が、キメラガイドの「足場」部分に含まれている；

【図36a】図ＸＸＸＶＩａは、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔプラスミドを構築するための、構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを改変するための戦略を示す；

【図36b】図ＸＸＸＶＩｂは、図ＸＸＸＶＩａに示された戦略によって得られた、ＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質により置換された第２のジンクフィンガーを有する、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図37】図ＸＸＸＶＩＩは、ＨＣＴ１１６ ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞におけるＧＦＰ遺伝子のノックアウトのために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達するＰＰ７ＲＬＰ粒子の用量の影響を示す；

【図38】図ＸＸＸＶＩＩＩは、蛍光レポーターのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、続いてＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（配列番号１）を含む、ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＲｅｐｏｒｔｅｒ．ＭＳ２ １２Ｘ発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図39】図ＸＸＸＩＸは、蛍光レポーターのＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、続いてＰＰ７ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（配列番号２）を含む、ｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＲｅｐｏｒｔｅｒ．ＰＰ７ ２Ｘ発現プラスミドに由来する発現カセットを示す模式図である；

【図40】図ＸＸＸＸは、ＺｓＧｒｅｅｎＩのＲＮＡをコードするＤＮＡを含む、ｐＩＬＶ−ＥＦ１−ＺｓＧｒｅｅｎＩ−ＷＰＲＥ発現プラスミドに由来する発現カセットの構築の模式図である；

【図41】図ＸＸＸＸＩは、２ｐｇ ｐ２４／細胞の用量でのＪｕｒｋａｔ細胞におけるＲＮＡの転移に対する、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子を生産するための野生型ＧＡＧ−ＰＯＬ前駆体の影響を示す；

【図42】図ＸＸＸＸＩＩは、２ｐｇ ｐ２４／細胞の用量でのＪｕｒｋａｔ細胞におけるＲＮＡの転移に対する、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子を生産するための野生型ＧＡＧ−ＰＯＬ前駆体の影響を示す；

【図43a】図ＸＸＸＸＩＩＩａ及びｂは、１５秒後（ＸＸＸＸＩＩＩｂ）及び１分後（ＸＸＸＸＩＩＩａ）の抗ｐ２４ウェスタンブロットによるＭＳ２ＲＬＰウイルス粒子の成熟の分析を示す；並びに

【図43b】図ＸＸＸＸＩＩＩａ及びｂは、１５秒後（ＸＸＸＸＩＩＩｂ）及び１分後（ＸＸＸＸＩＩＩａ）の抗ｐ２４ウェスタンブロットによるＭＳ２ＲＬＰウイルス粒子の成熟の分析を示す；並びに

【図44】図ＸＸＸＸＩＶは、ＨＣＴ１１６標的細胞におけるＭＳ２及びＰＰ７カプシド形成配列によってカプシド形成されたＲＮＡの転移のためのＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の有効性を示す。

【実施例】

【0228】

実施例１：ＩＬＶ又は本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ粒子によるＨＣＴ１１６細胞の特定のクローンの形質導入後のＣａｓ９をコードするＲＮＡの転移の比較
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
この例でのみ、使用されるＣａｓ９はＣａｓ９ Ｎｉｃｋａｓｅ（突然変異型）である。以下の実施例では、特に記載がない限り、その野生型のＣａｓ９（ＷＴ）が使用され、プロトコルは変更されないままである。

【0229】

１．１ 本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない発現カセット（図Ｉ）を有する。レンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、Ｃａｓ９ 酵素の配列の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターは、ＥＦ１プロモーター（図Ｉ）であるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的のプラスミド配列は、Ｃａｓ９タンパク質であって、その野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）の、例えばＮｉｃｋａｓｅのＲＮＡをコードするＤＮＡ（図Ｉ）である。

【0230】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産のために使用された、構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＩＩａに示した戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質により置換されて、プラスミドｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。

【0231】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0232】

これらプラスミドは、本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0233】

１．２ 組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを生産するためのプラスミド
１．２．１． 対照組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶＣａｓ９を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、発現カセットを有する（図ＩＶ）。このプラスミドは他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。使用されるプロモーターはＥＦ１プロモーターであるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的のプラスミド配列は、その野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）の、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡをコードするＤＮＡである（図ＩＶ）。

【0234】

・カプシド形成プラスミド：
構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターの生産のために使用される（図ＶＩ）。

【0235】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するために使用されるエンベローププラスミドと同一である（図ＩＩＩ）。

【0236】

１．２．２． ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞を生成するためのＩＬＶ−ＧＦＰ組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、発現カセットを有する（図Ｖａ）。このプラスミドは他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。使用されるプロモーターはＥＦ１プロモーターであるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、ＧＦＰ蛍光タンパク質である（図Ｖａ）。

【0237】

・カプシド形成プラスミド：
構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターの生産のために使用される（図ＶＩ）。

【0238】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するために使用されるエンベローププラスミドと同一である（図ＩＩＩ）。

【0239】

１．２．３． 標的細胞ＨＴＣ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１を生成するための組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、図Ｖｂに記載の発現カセットを有する。このプラスミドは他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。使用されるプロモーターはＨ１及びＵ６であるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、ＧＦＰの配列を標的化する２つの非コーディングＲＮＡ、以後、ガイドＵ３及びガイドＤ１と呼ぶ（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ）（図Ｖｂ）。

【0240】

・カプシド形成プラスミド：
構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターの生産のために使用される（図ＶＩ）。

【0241】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するために使用されるエンベローププラスミドと同一である（図ＩＩＩ）

【0242】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、又は国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された以下に述べる方法の１つに従って濃縮／精製して使用した。

【0243】

２．１ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。各バッチ（ＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ及びＩＬＶ）について、トランスフェクション混合物は、以下の３つのプラスミドからなる：
−粒子（ＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ）又はベクター（ＩＬＶ）が形成されているかに応じて、上述の発現プラスミドの１つ、
−ｐ８．７４ΔＺＦ Ｃｏａｔ（ＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ）又はｐ８．７４（ＩＬＶ）
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。

【0244】

より具体的には、バッチＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘについて、トランスフェクション混合物は、以下の３つのプラスミドからなる：
−ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘ発現プラスミド（その発現カセットを図Ｉに示す）
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２ Ｃｏａｔプラスミド（その発現カセットを図ＩＩｂに示す）
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶプラスミド（その発現カセットを図ＩＩＩに示す）。

【0245】

より具体的には、バッチＩＬＶ−ＧＦＰ、ＩＬＶ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１又はＩＬＶ−Ｃａｓ９について、トランスフェクション混合物は、以下の３つのプラスミドからなる：
−それぞれ、発現プラスミドｐＩＬＶ−ＥＦ１−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ（その発現カセットを図Ｖａに示す）又はｐＩＬＶ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１−ＷＰＲＥ（その発現カセットを図Ｖｂに示す）又はｐＩＬＶ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＷＰＲＥ（その発現カセットを図ＩＶに示す）、
−ｐ８．７４プラスミド（その発現カセットを図ＶＩに示す）
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶプラスミド（その発現カセットを図ＩＩＩに示す）。

【0246】

プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである：４０％の発現プラスミド、３０％のｐ８．７４プラスミド（又はｐ８．７４ΔＺＦ）、３０％のｐＥＮＶプラスミド。

【0247】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0248】

２．２ レンチウイルスベクター及びレンチウイルス粒子の濃縮及び精製
ベクター及び粒子を以下の２つの方法の１つにより濃縮及び精製する：
・方法Ｐ１は、中央遠心分離ユニットでの上清の正面限外濾過を想定する。
・方法Ｐ２は、上清の接線限外濾過、次いで透析濾過を想定する。粗上清を、ポリスルホン中空繊維カートリッジを用いた接線限外濾過によって、濃縮及び精製する。上清を、ＤＭＥＭ又はＴＳＳＭ緩衝液に対して連続モードで２０ダイアボリューム（diavolumes）での透析濾過によって処理する。透析濾過後に、保持液を回収し、次に中央遠心分離ユニットでの正面限外濾過によって再度濃縮する。

【0249】

実施例１について、上清は、回収され、方法Ｐ１に従って濃縮／精製されて使用される。

【0250】

３．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの滴定
３．１ ｑＰＣＲによる機能性粒子の滴定
ＨＣＴ１１６滴定細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び２ｍＭのＬ−Ｇｌｎ（Ｌ−グルタミン）で補充した、１００μＬのＤＭＥＭ中の９６−ウェルプレートに播種し、次に、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。各ベクター並びに内部標準について６連希釈を行う。滴定細胞を、Polybrene（登録商標）８μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）の存在下でこれらの連続希釈液により形質導入し、次に、３７℃／５％ＣＯ₂で３日間インキュベートする。一連の試料のそれぞれについて、形質導入されていない細胞のウェルを対象として加える。次に、滴定細胞をトリプシン処理し、ｇＤＮＡ抽出キット（Macherey-Nagel）を用いてゲノムＤＮＡの抽出後に、力価（形質導入ユニット（Transduction Unit）／ｍＬ）を、ｑＰＣＲによって決定する。ｑＰＣＲによって得られた力価（ＴＵ／ｍＬ）を、その力価がＦＡＣＳによって予め決定された内部標準によって正規化する。

【0251】

３．２ ＥＬＩＳＡ ｐ２４アッセイによる物理的粒子の定量化
ｐ２４カプシド タンパク質は、HIV-1 p24 ELISA kit（Perkin Elmer）を用いて、その推奨に従って、ウイルス上清で直接検出される。捕捉されたｐ２４ タンパク質は、ビオチン化ポリクローナル抗体と複合体化され、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出される。得られた複合体は、捕捉されたｐ２４タンパク質の量に正比例する黄色の着色を生じるオルトフェニレンジアミン−ＨＣｌ基質（ＯＰＤ）とのインキュベーション後に分光光度法によって検出される。各ウェルの吸光度を、Synergy H1 Hybridプレートリーダー（Biotek）で定量化し、標準範囲のｐ２４タンパク質の吸光度に対して較正する。１ｍｌあたりの物理的粒子として表されるウイルス力価は、得られたｐ２４タンパク質の濃度から計算され、１ｐｇのｐ２４タンパク質は、１０⁴個の物理的粒子に対応することがわかる。

【0252】

４．標的細胞の生成、及び本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
この例は、非組み込みＭＳ２ＲＬＰ粒子を介してＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするＲＮＡを転移させることが可能であること、及びこのＲＮＡ転移の終わりに、標的遺伝子のノックアウトを可能にする二本鎖ＤＮＡ切断を生じることを示すことを目的とする。

【0253】

４．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞は、ＧＦＰを発現する組み込みレンチウイルスベクター（ＩＬＶ）による、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、ＭＯＩ２０でのＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ ２４７）の形質導入によって得られる。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的モノクローナル株は、ＧＦＰをコードするＤＮＡの単一コピーのみを含み、斯かる株は、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰポリクローナル株（図Ｖａにおける発現プラスミドから調製された）の限界希釈（limit dilution）、並びに定量的ＰＣＲによるＧＦＰ配列の統合されたコピーの数の定量によるクローンのスクリーニングによって得られた。

【0254】

４．２ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１標的細胞、及び本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞を、２４ウェルプレートに２５０００細胞／ｃｍ²で播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。最初に、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、ＩＬＶ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１ベクター（図Ｖｂにおける発現プラスミドから調製した）によりＭＯＩ４０で、細胞を形質導入する。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。

【0255】

ＩＬＶ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１による形質導入の１週間後、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ２標的細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、ＭＯＩ４０でのＩＬＶ−ＥＦ１−Ｃａｓ９ ベクター（図ＩＶにおける発現プラスミドから調製した）又は１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量でのＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ 粒子によって、形質導入する。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の場合には、細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。形質導入後Ｄ１４で、細胞を回収し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0256】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、ＩＬＶ−Ｃａｓ９ベクター又はＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ粒子によるＨＣＴ１１６−ＧＦＰ−ＣｌｏｎｅＤ２−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１標的細胞の形質導入によって、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡの転移の有効性を比較することである。最初に、図ＩＸに提示された結果は、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞は蛍光性ではないが（＜０．４％のＧＦＰ陽性細胞）、一方で、９９％のＨＣＴ１１６−ＧＦＰ−ＣｌｏｎｅＤ２−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１標的細胞が蛍光性であることを示している。ＩＬＶ−Ｃａｓ９ベクターによって形質導入されたＨＣＴ１１６−ＧＦＰ−ＣｌｏｎｅＤ２−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１標的細胞の１３％のみが、依然として蛍光性である。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ−ＣｌｏｎｅＤ２−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＵ３−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１標的細胞が、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ粒子によって形質導入される場合、５７％ほどの蛍光細胞数の減少が観察される。これは、５７％の細胞がそれらのゲノム中のＧＦＰ配列のノックアウトを受けたことを示す。従って、ステム−ループ配列の１２回の反復を含むＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ粒子は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡの転移に有効であり、従ってゲノムの編集を行うのに有効である。

【0257】

実施例２：ＨＣＴ１１６細胞の第２の特定のクローンの形質導入後のＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子におけるガイドＲＮＡのカプシド形成のためのＭＳ２反復モチーフの位置の比較
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、イントロン配列又はＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まずに、図ＶＩＩ又はＶＩＩＩに記載の発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、従来のガイドＤ１についての配列番号１、ggccaacatgaggatcacccatgtctgcagggccキメラガイドＤ１についての配列番号３）を、ガイドＲＮＡの下流の発現カセットに挿入するか（従来のガイドＤ１、図ＶＩＩ）、又はガイドの足場の部分に含めた（キメラガイドＤ１、図ＶＩＩＩ）。使用されたプロモーターはＨ１プロモーターであるが、他のプロモーター、例えばＵ６プロモーターが使用されてもよい。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ依存型のプロモーター、例えばＨ１又はＵ６の使用は、転写末終結シグナル（Ｔｅｒｍ）の存在を必要とする。目的の配列は、ＧＦＰの配列を標的化する非コーディングＲＮＡである（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ）。

【0258】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドは、図ＩＩａに示された戦略に従って改変される：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質により置換されて、プラスミドｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、例えばＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘの機能を変更することなく逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異されてもよい。

【0259】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0260】

これらプラスミドは、本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。より具体的には、これらプラスミドは、レンチウイルス粒子ＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ２Ｘ及びＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘの生産のために使用される。

【0261】

１．２ 組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを生産するためのプラスミド
１．２．１． 対照組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶ−ＧｕｉｄｅＤ１を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、図Ｖｃに記載の発現カセットを有する。このプラスミドは他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Post-transcriptional Regulatory Element）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。使用されるプロモーターはＨ１及びＵ６であるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列はガイドである（図Ｖｃ）。

【0262】

・カプシド形成プラスミド：
構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターの生産のために使用される（図ＶＩ）。

【0263】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、 ＭＳ２ＲＬＰ レンチウイルス粒子を生産するために使用されるエンベローププラスミドと同一である（図ＩＩＩ）。

【0264】

１．２．２． ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞を生成するためのＩＬＶ−ＧＦＰ組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0265】

１．２．３ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２−ＥＦ１−Ｃａｓ９ＷＴ標的細胞を調製するためのＩＬＶ−Ｃａｓ９組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0266】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを実施例１に記載のように生産し、そして、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0267】

より具体的には、バッチＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ２Ｘ及びＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘについて、トランスフェクション混合物は、以下の３つのプラスミドからなる：
−ｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１−ＭＳ２ ２Ｘ発現プラスミド（その発現カセットを図ＶＩＩに示す）又はｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘプラスミド（その発現カセットを図ＶＩＩＩに示す）
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２ Ｃｏａｔプラスミド（その発現カセットを図ＩＩｂに示す）
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶプラスミド（その発現カセットを図ＩＩＩに示す）。

【0268】

使用したプラスミドの割合は実施例１と同じである。

【0269】

３．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの滴定
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。

【0270】

４．標的細胞の生成及び本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
本実施例の目的は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子におけるガイドＲＮＡのカプシド形成のためのＭＳ２反復ステム−ループモチーフの位置が、標的遺伝子のノックアウトのための粒子の有効性に影響を与えるかを決定することである。

【0271】

４．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞
このクローンは実施例１と同一の方法によって調製される。

【0272】

４．２ 本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子によるＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２−Ｃａｓ９標的細胞及び形質導入
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２細胞を、２４ウェルプレートに２５０００細胞／ｃｍ²で播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。最初に、細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、ＩＬＶ−Ｃａｓ９ベクターによりＭＯＩ４０で形質導入する。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。ＩＬＶ−Ｃａｓ９ベクターによる形質導入の１週間後、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２ −Ｃａｓ９標的細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量での抗ＧＦＰガイドＲＮＡ（古典的又はキメラ）を送達するＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子によって、あるいは、ＭＯＩ４０でのＩＬＶ−ＧｕｉｄｅＤ１ベクターによって、形質導入する。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の場合には、細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。ＭＳ２ＲＬＰ−ｇｕｉｄｅｓ−ＭＳ２ ２Ｘによる形質導入後Ｄ１４で、細胞を回収し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0273】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、形質導入後のＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子におけるガイドＲＮＡのカプシド形成のためのＭＳ２反復モチーフの位置を比較することである。最初に、図Ｘに提示された結果は、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞が蛍光性でなく（＜０．１６％のＧＦＰ陽性細胞）、一方で、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞の９９％超が蛍光性であることを示している。ＩＬＶ−ＧｕｉｄｅＤ１ベクターによって形質導入されたＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２−Ｃａｓ９標的細胞のわずか１３％が、依然として蛍光性である。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２−Ｃａｓ９標的細胞がＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ −Ｇｕｉｄｅ粒子によって形質導入される場合、２％の蛍光細胞数のごくわずかな減少が、古典的ガイドを輸送するＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ２Ｘについて観察され、かつ１０％程のより多くの減少が、キメラガイドを輸送するＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘについて観察される。従って、ＭＳ２反復モチーフの位置は、ＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子の有効性に影響を与える。消失のパーセンテージは中程度であるが、この結果は、ＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子が、ガイドＲＮＡの転移、従ってゲノム編集を可能にすることを示している。

【0274】

実施例３：ＨＣＴ１１６細胞の第２のクローンの形質導入のためのＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子におけるガイドＲＮＡを有する発現プラスミドの単量又は倍量の影響
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶを生産するためのプラスミド
１．１．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２−ＥＦ１−Ｃａｓ９標的細胞の調製用のＩＬＶ−Ｃａｓ９組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0275】

１．１．２ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞の生成用のＩＬＶ−ＧＦＰ組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0276】

１．１．３ ガイドのための対照組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶ（ＩＬＶ−ＧｕｉｄｅＤ１）を生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例２と同一の方法によって調製される。

【0277】

１．２ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。より具体的には、ＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために用いられるプラスミドを使用する。

【0278】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
２．１ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。ＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子を、以下の３つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の発現プラスミドの１つ、これは、粒子が形成されているか（ＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ）に応じて単量又は倍量で、あるいは組み込みベクター（ＩＬＶ）については単量で、使用する、
−ｐ８．７４ΔＺＦ Ｃｏａｔ（ＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ）又はｐ８．７４（ＩＬＶ）；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。

【0279】

より具体的には、ＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を、以下の３つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−ｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ発現プラスミド（その発現カセットを図ＶＩＩＩに示す）、これは、単量又は倍量で使用される、
−ｐ８．７４ΔＺＦ Ｃｏａｔ−ＭＳ２ Ｃｏａｔ（その発現カセットを図ＩＩｂに示す）
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ（その発現カセットを図ＩＩＩに示す）。

【0280】

プラスミドの割合は以下の通りである：４０％の発現プラスミド、３０％のｐ８．７４又はｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド、６０％の発現プラスミド、２０％のｐ８．７４又はｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、２０％のｐＥＮＶプラスミド、生産が単一の発現プラスミドを含む場合、この量は二倍になる。

【0281】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／ ５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0282】

ＩＬＶ−Ｃａｓ９レンチウイルスベクターは、実施例１に記載したように生産される。

【0283】

ＩＬＶ−ＧＦＰレンチウイルスベクターは、実施例１に記載したように生産される。

【0284】

ＩＬＶ−ＧｕｉｄｅＤ１レンチウイルスベクターは、実施例２に記載したように生産される。

【0285】

２．２ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの濃縮及び精製
ベクター及び粒子を、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0286】

３．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの滴定
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。

【0287】

４．本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子による標的細胞の生成及び形質導入
本実施例の目的は、Ｃａｓ９酵素を構成的に発現するＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２−ＥＦ１−Ｃａｓ９細胞に含まれるＧＦＰをコードする配列を標的化するｇｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＲＮＡを有する発現プラスミドの単量又は倍量を用いて生産された粒子による、標的遺伝子のノックアウトのためのＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子の有効性を比較することである。

【0288】

４．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞
このクローンは実施例１と同一の方法によって調製される。

【0289】

４．２ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２− Ｃａｓ９標的細胞及び本発明に係るＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２細胞を、２４ウェルプレートに２５０００細胞／ｃｍ²で播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。最初に、細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、ＭＯＩ４０でのＩＬＶ−Ｃａｓ９ベクターにより形質導入する。このベクターは実施例２で調製したものである。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。ＩＬＶ−Ｃａｓ９による形質導入の１週間後、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２− Ｃａｓ９細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、キメラガイドＤ１を送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子によって（発現プラスミドの単用量又は倍用量で生産された）又は１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量でのベクターＩＬＶ−ＧｕｉｄｅＤ１によって形質導入する。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子の場合に６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。形質導入後Ｄ１４で、細胞を回収し、及びＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージ並びに蛍光強度をサイトメトリー（Macs Quant VYB（登録商標）、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0290】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、発現プラスミドの単量又は倍量を用いて生産されたガイドＲＮＡを送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産を比較することである。最初に、図ＸＩに提示された結果は、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞が蛍光性でなく（＜０．２％のＧＦＰ陽性細胞）、一方で、９９％超のＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞が蛍光性であることを示している。ベクターＩＬＶ−ＧｕｉｄｅＤ１によって形質導入されたＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２− Ｃａｓ９標的細胞の９％未満が、依然として蛍光性である。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２− Ｃａｓ９標的細胞が、ＭＳ２ＲＬＰ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘによって形質導入される場合、蛍光細胞の数の６％の減少が、発現プラスミドの単用量で生産されたキメラガイドを輸送するＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子について観察される。発現プラスミドの倍用量により生産されたキメラガイドを輸送するＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子について、この減少は二倍になる（１３％のＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２− Ｃａｓ９陰性標的細胞）。従って、ＭＳ２ＲＬＰ ２Ｘ粒子の生産のために使用される発現プラスミドの倍用量は、ｇｕｉｄｅＤ１ ＲＮＡのカプシド形成の程度を改善し、それゆえ、ＧＦＰ配列のノックアウトにおけるより良好な有効性につながる可能性がある。

【0291】

実施例４：ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
その発現カセットが実施例１（図Ｉ、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘ）及び実施例２（図ＶＩＩＩ、ｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ）に記載されている発現プラスミドを、標的細胞（ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２）のゲノムに組み込まれたＣａｓ９をコードするＲＮＡとＧＦＰの配列を標的化するガイドＲＮＡとの両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ１２Ｘ−２Ｘ粒子において、同時カプシド形成（co-encapsidating）に使用した。

【0292】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＩＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質により置換されて、プラスミドｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。

【0293】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0294】

これらプラスミドは、本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ及び２Ｘ（又はＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ）レンチウイルス粒子を生産するために使用される。より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ −ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0295】

１．２． ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞の生成用のＩＬＶ−ＧＦＰ組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0296】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された前述の方法Ｐ１又はＰ２の１つに従って濃縮／精製して使用した。

【0297】

２．１ レンチウイルス粒子の生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。

【0298】

ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子を、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の２つの発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘプラスミド（図ＶＩＩＩ）が、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２１２Ｘプラスミドの二倍の量で使用される；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。

【0299】

より具体的には、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ −ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の２つの発現プラスミド、プラスミドｐｃＤＮＡ−Ｈ１−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ（その発現カセットを図ＶＩＩＩに示す）が、プラスミドｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２１２Ｘ（その発現カセットを図Ｉに示す）の二倍の量で使用される；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ（その発現カセットを図ＩＩｂに示す）；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ（その発現カセットを図ＩＩＩに示す）。

【0300】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0301】

従って、この生産は、２つの発現プラスミド、カプシド形成プラスミド及びエンベローププラスミドを含む。使用されるプラスミドの割合は以下の通りである：
−３３％のガイドをコードする発現プラスミド、
−１７％のＣａｓ９をコードする発現プラスミド（ガイドをコードする発現プラスミドの量は、 Ｃａｓ９をコードする発現プラスミドの量に対して二倍である）、
−２５％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、並びに
−２５％のｐＥＮＶプラスミド。

【0302】

ＩＬＶ−ＧＦＰレンチウイルスベクターは、実施例１に記載したように生産される。

【0303】

２．２ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの濃縮及び精製
粒子及びベクターを、実施例１に記載された方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0304】

３．ＥＬＩＳＡ ｐ２４アッセイによる物理的粒子の滴定
ｐ２４カプシドタンパク質は、HIV-1 p24 ELISA kit（Perkin Elmer）を用いて、その推奨に従って、ウイルス上清で直接検出される。捕捉されたｐ２４タンパク質は、ビオチン化ポリクローナル抗体と複合体化され、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出される。得られた複合体は、捕捉されたｐ２４タンパク質の量に正比例する黄色の着色を生じるオルトフェニレンジアミン−ＨＣｌ基質（ＯＰＤ）とのインキュベーション後に分光光度法によって検出される。各ウェルの吸光度を、Synergy H1 Hybrid（登録商標）プレートリーダー（Biotek）で定量し、ｐ２４タンパク質の標準範囲の吸光度に対して較正する。ｐ２４タンパク質の１ｐｇが１０⁴個の物理的粒子に対応することを知ることによって、１ｍｌ当たりの物理的粒子として表されたウイルス力価を、得られたｐ２４タンパク質の濃度から計算する。

【0305】

レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。

【0306】

４．標的細胞の生成及び本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
この例は、標的細胞のゲノムに組み込まれた、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ及びＧＦＰの配列を標的化するガイドＲＮＡの両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子において、同時カプシド形成し、次いで、これら異なるＲＮＡを、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘ粒子を介して標的細胞のＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２へと転移させることが可能であることを示すことを目的とする。このＲＮＡの転移の最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは機能的であり、かつ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの２つの構成要素の転移のための１つの同じツールを用いて、標的遺伝子のノックアウトを可能にする二本鎖ＤＮＡの切断を生じ、及び結果として、ＧＦＰ＋細胞をＧＦＰ−細胞へと変換すべきである。

【0307】

４．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞
このクローンは実施例１と同一の方法によって調製される。

【0308】

４．２ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子によるＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞の形質導入
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２細胞を、２４ウェルプレートに２５０００細胞／ｃｍ²で播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量でのＣａｓ９及びキメラガイドＤ１の両方を送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子によって形質導入する。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。第１の形質導入の６日後に、第２の形質導入を同じ条件下で行った（図ＸＸ）。最後に、第１の形質導入の１２日後に、第３の形質導入を同じ条件下で行った（図ＸＩＩ）。最後の形質導入の１４日後に、細胞を回収し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0309】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、標的細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの機能性を測定することによって、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子を介してＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡを同時に転移させる可能性を研究することである。最初に、図ＸＩＩに提示された結果は、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞が蛍光性でなく（＜０．２％のＧＦＰ＋細胞）、一方で、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞は９６％超が蛍光性であることを示している。標的細胞が、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子で形質導入される場合、細胞の第３の形質導入の１４日後に、蛍光細胞の数に３８％の減少が見られる。従って、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び抗ＧＦＰガイドの両方を送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子による３８％程のＧＦＰ遺伝子のノックアウトが存在する。従って、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによる標的遺伝子の消失は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲＮＡ及びガイドＲＮＡをそれぞれ輸送する粒子の２つのバッチが形質導入の際に加えられる場合よりも、標的細胞が、ヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡをそれぞれ発現する２種の発現プラスミドのコトランスフェクションによって産生されたＭＳ２ＲＬＰ粒子の単一バッチによって形質導入される場合に、３倍効果的である（図ＸＩＩ及び図ＸＩ）。従って、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９システムは、それぞれ複数のＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡを輸送する粒子でより効果的である。

【0310】

図ＸＸに提示された結果は、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞が蛍光性でなく（＜０．２％のＧＦＰ＋細胞）、一方で、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞は９９％超が蛍光性であることを示している。標的細胞が、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子で形質導入される場合、細胞の第２の形質導入の１４日後に、蛍光細胞の数に５７％の減少が見られる。従って、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及び抗ＧＦＰガイドの両方をコードするＲＮＡを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子により、５７％程のＧＦＰ遺伝子のノックアウトが存在する。確認として、Ｃａｓ９が構成的に発現され、かつガイドＲＮＡがＭＳ２ＲＬＰ粒子によって供給される場合、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージは１２．８％減少することが分かる（図ＸＩ）。従って、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージは、ＭＳ２ＲＬＰ粒子が、２回の形質導入後にＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡの両方を送達する場合に、５倍低い（図ＸＸ）。ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘ粒子による３回の形質導入に対して２回の形質導入後に依然としてＧＦＰを発現する細胞の分析は、ＣＲＩＳＰＲシステムが、３回の形質導入後（３８％の有効性、図ＸＩＩ）よりも、２回の形質導入後（５７％の有効性、図ＸＸ）により有効であるようにみえることを示している。この差異は、ＣＲＩＳＰＲシステムが標的細胞（ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２）内に送達される場合、当該システムが、標的配列、すなわちタンパク質ＧＦＰをコードする配列のレベルでだけでなく、非特異的に他の配列に対しても二本鎖ＤＮＡの切断を生じることになるという事実によって説明され得る。実際に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、「オフターゲット効果」と呼ばれる特定のレベルの非特異的切断を有し、ＤＮＡ修復システム（非相同末端結合（Non Homologous End Joining）についてのＮＨＥＪシステム）も受ける二本鎖ＤＮＡ切断の発生を可能にし、これは特異的に生じた二本鎖ＤＮＡ切断と同様である。より多くのＣＲＩＳＰＲシステムが標的細胞に送達されるほど、それは「オフターゲット効果」をより多く示すことになり、同じ標的細胞で生じた二本鎖ＤＮＡ切断が存在することになる。このシステムは、ＮＨＥＪシステムが飽和し、かつＤＮＡがもはや修復されない限界に達する。この場合、ゲノムＤＮＡの非修復は、形質導入細胞の死を誘導する。これは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘ粒子によって３回形質導入された細胞で観察されるものである。実際に、３回形質導入された細胞は培養フラスコ内で最終的に死滅する。

【0311】

したがって、形質導入されておらず、従ってタンパク質ＧＦＰの消失を可能にするＣＲＩＳＰＲシステムによって影響を受けていない細胞は、３回形質導入された細胞に対して増殖上の利点を有し、ＧＦＰを発現する細胞のレベルが、２回の形質導入後よりもＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘ粒子による３回の形質導入後に高い理由を説明する。

【0312】

結論として、これらＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子は、ゲノム編集の有効性に従って、かつ細胞タイプにも同様に従って、１回又は２回の形質導入後に、粒子のただ１つのバッチを用いて、それら自身をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを同時送達するための最良のツールにする。

【0313】

実施例５：ＴＡＬＥＮシステムのための本発明に係るレンチウイルス粒子
ゲノム編集戦略におけるＴＡＬＥＮシステムの使用は、生成した二本鎖ＤＮＡの切断部位の上流に固定されている第１のＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥＮ ５′）、並びに生成した二本鎖ＤＮＡの切断部位の下流に固定されている第２のＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥＮ ３′）の使用を必要とする。

【0314】

図ＸＩＩＩａは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の上流（５′側）に固定されているＴＡＬＥＮを発現するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0315】

図ＸＩＩＩｂは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の下流（３′側）に固定されているＴＡＬＥＮを発現するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0316】

図ＸＩＶａは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の上流（５′側）に固定されているＴＡＬＥＮを発現する組み込み粒子ＩＬＶの産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0317】

図ＸＩＶｂは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の下流（３′側）に固定されているＴＡＬＥＮを発現する組み込み粒子ＩＬＶの産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0318】

実施例６：Ｚｎ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅシステムのための本発明に係るレンチウイルス粒子
ゲノム編集戦略におけるＺｎ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅシステムの使用は、生成した二本鎖ＤＮＡの切断部位の上流に固定されている第１のＺｎ Ｆｉｎｇｅｒ（ＺＦＰ ５′）、並びに生成した二本鎖ＤＮＡの切断部位の下流に固定されている第２のＺｎ Ｆｉｎｇｅｒ（ＺＦＰ ３′）の使用を必要とする。

【0319】

図ＸＶａは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の上流（５′側）に固定されているＺｎ Ｆｉｎｇｅｒを発現するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0320】

図ＸＶｂは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の下流（３′側）に固定されているＺｎ Ｆｉｎｇｅｒを発現するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0321】

図ＸＶＩａは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の上流（５′側）に固定されているＺｎ Ｆｉｎｇｅｒを発現する組み込み粒子ＩＬＶの産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0322】

図ＸＶＩｂは、生成した二本鎖ＤＮＡの切断の下流（３′側）に固定されているＺｎ Ｆｉｎｇｅｒを発現する組み込み粒子ＩＬＶの産生を可能にする発現プラスミドを示す。

【0323】

実施例７：インテグラーゼの改変によるＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰレンチウイルス粒子の構築
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない発現カセットを有する（図ＸＶＩＩ参照）。ｍＲＮＡをレンチウイルス粒子に輸送するために、ＰＰ７ ＲＮＡ（ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号２）のステム−ループモチーフの１２回の反復を、レポーター遺伝子の下流の発現カセットに挿入した（図ＸＶＩＩ）。

【0324】

使用されたプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１プロモーターであってもよいが（図ＸＶＩＩ）、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、レポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ（図ＸＶＩＩ）、緑色（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色（ｍＣｈｅｒｒｙ）若しくは青色（ｍｔＢＦＰ）蛍光タンパク質をコードするＤＮＡ、又はタンパク質、例えばＣＲＥタンパク質をコードするｃＤＮＡであり得る。目的の配列はまた、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ＬｎｃＲＮＡ又はｃｉｒｃＲＮＡの配列であり得る。

【0325】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、インテグラーゼ内にバクテリオファージＰＰ７の「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＸＶＩＩＩに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ＰＰ７ファージのタンパク質ＣｏａｔがインテグラーゼのＣ末端ドメインと融合しているプラスミドを生成するために使用される。ＨｐａＩクローニングによって得られるこの融合は、Ｐ８．７４− ＰＯＬ−ＰＰ７ Ｃｏａｔプラスミドの生成を可能にする。これは、図ＸＩＸに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、特定の機能的エレメント、例えば逆転写酵素（ＲＴ）をコードする配列において欠失又は突然変異されてもよい。

【0326】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0327】

２．レンチウイルス粒子の生産、濃縮／精製及び滴定
レンチウイルス粒子は、実施例１に記載したように、方法Ｐ１に従って生産される。

【0328】

３．ルシフェラーゼ発現動態
ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を、９６−ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。方法Ｐ１に従って生産されたＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ−Ｌｕｃ １２Ｘ粒子による形質導入を、８μｇ／ｍＬのPolybreneの存在下で、２．８ｐｇ ｐ２４／細胞の用量で行う。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。形質導入後４時間、８時間、２４、３２、及び４８時間に、細胞を回収し、ルシフェラーゼ発現を、供給業者の推奨に従ってOneGlo Luciferaseアッセイキット（Promega）を用いて、及びSynergy H1 Hybridプレートリーダー（Biotek）を用いて、分析する。このアッセイは三連で行う。形質導入されていないＨＣＴ１１６細胞を対照として使用する。

【0329】

ＩＩ．結果
インテグラーゼ内にＰＰ７−Ｃｏａｔを有するレンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送することが可能である。最大ルシフェラーゼ発現は８時間で達成される。８時間後に、ルシフェラーゼ活性は低下する。従って、ＰＰ７（ＩＮ）−ＲＬＰ 粒子はＲＮＡの送達を可能にする。

【0330】

実施例８：プロデューサー細胞におけるガイドＲＮＡの転写を可能にするプロモーターの機能としての、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ細胞にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ及び２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
実施例１（図Ｉ、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘ）及び図ＸＸＩ、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘに記載された発現プラスミドを、標的細胞（ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２）のゲノム中に組み込まれるＧＦＰの配列を標的化する、Ｕ６プロモーターの制御下でＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡのＤ１の両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子において、同時カプシド形成するために使用した。

【0331】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＩＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによりＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質によって置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。

【0332】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0333】

より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0334】

１．２． ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞の生成用のＩＬＶ−ＧＦＰ組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0335】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された前述の方法Ｐ１又はＰ２に従って濃縮／精製して使用した。

【0336】

２．１ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。

【0337】

ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子を、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の２つの発現プラスミド、ｐｃＣＤＮＡ−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘプラスミド（その発現カセットを図ＸＸＩに示す）が、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘプラスミド（その発現カセットを図Ｉに示す）の二倍の量で使用される；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。

【0338】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0339】

ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例４に記載したように生産される。

【0340】

ＩＬＶ−ＧＦＰレンチウイルスベクターは、実施例１に記載したように生産される。

【0341】

２．２ レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
粒子を、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0342】

３．ＥＬＩＳＡ ｐ２４アッセイによる物理的粒子の滴定
ｐ２４カプシドタンパク質は、HIV-1 p24 ELISA kit（Perkin Elmer）を用いて、その推奨に従って、ウイルス上清で直接検出される。捕捉されたｐ２４タンパク質は、ビオチン化ポリクローナル抗体と複合体化され、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出される。得られた複合体は、捕捉されたｐ２４タンパク質の量に正比例する黄色の着色を生じるオルトフェニレンジアミン−ＨＣｌ基質（ＯＰＤ）とのインキュベーション後に分光光度法によって検出される。各ウェルの吸光度を、Synergy H1 Hybrid（登録商標）プレートリーダー（Biotek）で定量し、ｐ２４タンパク質の標準範囲の吸光度に対して較正する。ｐ２４タンパク質の１ｐｇが１０⁴個の物理的粒子に対応することを知ることによって、１ｍｌ当たりの物理的粒子として表されたウイルス力価を、得られたｐ２４タンパク質の濃度から計算する。

【0343】

レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。

【0344】

４．標的細胞の生成及び本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
この例は、標的細胞のゲノムに組み込まれたＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びＧＦＰの配列を標的化するｇｕｉｄｅＤ１のＲＮＡの両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子において、同時カプシド形成し、次いでこれら異なるＲＮＡをＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子を介して標的細胞のＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２へと転移させることが可能であることを示すことを目的とする。このＲＮＡの転移の最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、機能的であり、かつ標的遺伝子のノックアウトを可能にする二本鎖ＤＮＡの切断を生じ、及び結果として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの２つの構成要素の転移のための１つの同じツールを用いて、ＧＦＰ＋細胞をＧＦＰ−細胞へと変換すべきである。

【0345】

４．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞
このクローンは実施例１と同一の方法によって調製される。

【0346】

４．２ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子によるＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞の形質導入
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２細胞を、２４ウェルプレートに２５０００細胞／ｃｍ²で播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量での、Ｃａｓ９及びガイドＤ１の両方を送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子によって形質導入する。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。形質導入後Ｄ１４で、細胞を回収し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0347】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡを同時に送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子を生成するためのガイドＲＮＡの発現を可能にするプロモーターの影響を評価することである。

【0348】

本実施例において、２つのプロモーター：Ｈ１及びＵ６、を試験する。

【0349】

最初に、図ＸＸＩＩに提示された結果は、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞が蛍光性でなく（＜０．１％のＧＦＰ＋細胞）、一方で、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞は９９％超が蛍光性であることを示している。標的細胞が、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子で形質導入される場合、細胞の第２の形質導入の１４日後に、Ｈ１プロモーターを有するプラスミドから開始して生成された粒子の場合、４６．２％の蛍光細胞数の減少が見られ、Ｕ６プロモーターを有するプラスミドから開始して生成された粒子の場合、８１．９％の減少が見られる。したがって、８１．９％程のＧＦＰ遺伝子の最も強いノックアウトが、２回の形質導入後のＵ６プロモーターを有するプラスミドから開始して生成されたＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子により観察される。従って、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージは、Ｕ６プロモーターを有するプラスミドから開始して生成された粒子の場合に、Ｈ１プロモーターを有するプラスミドから開始して生成された粒子よりも、ほぼ２倍低い。結論として、ＭＳ２ＲＬＰ粒子にカプシド形成されることになるガイドＲＮＡを生成するために使用されるプロモーターの性質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性に影響を及ぼす。

【0350】

実施例９：ＰＤ１遺伝子のノックアウトのために、活性化初代Ｔリンパ球にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ ＋ Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
実施例１に記載の発現プラスミド（その発現カセットを図Ｉ、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘに示す）及び発現カセットが図ＸＸＩＩＩに示された発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−Ｇｕｉｄｅ＿ａｎｔｉＰＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘを、初代Ｔリンパ球のゲノム中に組み込まれたＰＤ１遺伝子の配列を標的化する、Ｕ６プロモーターの制御下でＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡの両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子において、同時カプシド形成するために使用した。

【0351】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＩＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによりＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質によって置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。

【0352】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0353】

これらプラスミドは、本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅａｎｔｉＰＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0354】

１．２ 本発明に係る対照ＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。より具体的には、これらプラスミドは、実施例１の段落１．１に記載されたように、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0355】

１．３ 対照ＩＬＶＣａｓ９＋ｇｕｉｄｅａｎｔｉＰＤ１組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、図ＩＶに記載の発現カセット及び図ＸＸＸＩＩに記載の発現カセットを有する。これらプラスミドは、他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含み得る。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。第１のプラスミドについて、使用されるプロモーターはＥＦ１プロモーターであるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的のプラスミド配列は、その野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）の、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡをコードするＤＮＡである（図ＩＶ）。

【0356】

第２のプラスミドについて、使用されるプロモーターはＵ６又はＨ１であるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的の配列は、抗ＰＤ１ガイドである（図ＸＸＸＩＩ）。

【0357】

・カプシド形成プラスミド：
構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドが、組み込みレンチウイルスベクターの生産のために使用される（図ＶＩ）。

【0358】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するために使用されるエンベローププラスミドと同一である（図ＩＩＩ）。

【0359】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された前述の方法Ｐ１又はＰ２に従って濃縮／精製して使用した。

【0360】

２．１ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。

【0361】

ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子を、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の２つの発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−Ｇｕｉｄｅ＿ａｎｔｉＰＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘプラスミド（その発現カセットを図ＸＸＩＩＩに示す）が、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘプラスミド（その発現カセットを図Ｉに示す）の二倍の量で使用される；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。

【0362】

ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子は、実施例４に記載の方法によって生産される。

【0363】

より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅａｎｔｉＰＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0364】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0365】

対照ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例４に記載したように生産される。

【0366】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９）を発現する対照レンチウイルスベクターＩＬＶの生産、精製及び滴定を、方法Ｐ２に従って実施例１と同じ条件下で行う。

【0367】

２．２ レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
粒子を、実施例１に記載の方法Ｐ２に従って濃縮及び精製する。

【0368】

３．ＥＬＩＳＡ ｐ２４アッセイによる物理的粒子の滴定
ｐ２４カプシドタンパク質は、HIV-1 p24 ELISA kit（Perkin Elmer）を用いて、その推奨に従って、ウイルス上清で直接検出される。捕捉されたｐ２４タンパク質は、ビオチン化ポリクローナル抗体と複合体化され、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出される。得られた複合体は、捕捉されたｐ２４タンパク質の量に正比例する黄色の着色を生じるオルトフェニレンジアミン−ＨＣｌ基質（ＯＰＤ）とのインキュベーション後に分光光度法によって検出される。各ウェルの吸光度を、Synergy H1 Hybrid（登録商標）プレートリーダー（Biotek）で定量し、ｐ２４タンパク質の標準範囲の吸光度に対して較正する。ｐ２４タンパク質の１ｐｇが１０⁴個の物理的粒子に対応することを知ることによって、１ｍｌ当たりの物理的粒子として表されたウイルス力価を、得られたｐ２４タンパク質の濃度から計算する。

【0369】

レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。

【0370】

４．標的細胞の調製及び本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
この例は、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ及びＰＤ１遺伝子の配列を標的化するガイドＲＮＡの両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子において、同時カプシド形成し、次いでこれら異なるＲＮＡを、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子を介して標的細胞である活性化初代Ｔリンパ球に転移させることが可能であることを示すことを目的とする。このＲＮＡの転移の最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、機能的であり、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの２つの構成要素の転移のための１つの同じツールを用いて、標的ＰＤ１遺伝子のノックアウトを可能にする二本鎖ＤＮＡの切断を生じるべきである。

【0371】

４．１ 標的細胞の活性化初代Ｔリンパ球の調製
標的細胞であるＴリンパ球を、末梢血試料から調製する。末梢血からの単核細胞を、Ficoll勾配遠心分離によって単離し、次いで、Ｔ７５フラスコ中で３７℃／５％ＣＯ₂で２時間接着させる。懸濁液中の細胞を回収し、Ｔリンパ球を、磁性ビーズ（Pan T細胞単離キット、Miltenyi Biotec）を用いたネガティブセレクションによって精製する。精製したＴリンパ球を、（Dynabeads（登録商標） Human T-Activator CD3/CD28、ThermoFisher）３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間活性化する。

【0372】

４．２ 標的細胞である活性化初代Ｔリンパ球の形質導入
標的細胞である活性化初代Ｔリンパ球を、１００００００細胞／ｍＬで９６−ウェルプレートに播種し、そして、Ｃａｓ９及びガイドの両方を送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子によって、又はＣａｓ９のみを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子（陰性対照）によって、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、異なる用量（０．１；０．５；１又は５ｐｇ ｐ２４／細胞）で、あるいは、Ｃａｓ９及びガイドを送達するＩＬＶ粒子（陽性対照）によって、異なる用量（ＭＯＩ ５、１０、２５、５０）で、形質導入する。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ及びＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。

【0373】

形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。４８時間後、第２の形質導入を、第１の形質導入と同じ条件下で行う。第２の形質導入から４日後に、細胞を回収し、ＰＤ１を発現する細胞のパーセンテージを、抗ＰＤ１抗体（Miltenyi Biotec）による細胞の免疫標識後にサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0374】

細胞のＦＡＣＳ分析の直前にViobility(商標)Fixable Dyes（Miltenyi Biotec）を添加することによって生存率を分析し、リンパ球の表現型決定を、抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２５抗体（Miltenyi Biotec）による細胞の免疫標識によって行う。

【0375】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、初代細胞の内因性遺伝子、例えば活性化初代Ｔリンパ球におけるＰＤ１遺伝子のノックアウトのために、ＭＳ２ＲＬＰ粒子によって送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの有効性を評価することである（図ＸＸＩＶ）。

【0376】

ＰＤ１の発現の消失は免疫システムによる腫瘍細胞の認識を可能にするので、ＰＤ１遺伝子は腫瘍の状況で特に注目を集めている。

【0377】

細胞が、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子により形質導入される場合、第２の形質導入から４日後に、第１の用量（０．１ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合３１％、第２の用量（０．５ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合６０％、第３の用量（１ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合７５％、及び第４の用量（５ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合８６％の、タンパク質ＰＤ１を発現する細胞数の減少が見られる。並行して、Ｃａｓ９のみを発現するＭＳ２ＲＬＰを、ＰＤ１遺伝子のノックアウトの陰性対照として使用する。結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子のどの用量が使用されても、ＰＤ１タンパク質を発現する細胞のパーセンテージが安定であることを示している。

【0378】

図ＸＸＶは、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子を用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するために使用される条件と同等の条件下での、ＰＤ１遺伝子のノックアウトのためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達する際のＩＬＶ粒子の有効性を示す。使用された最も高いＭＯＩでは（ＭＯＩ ５０）、４２％の細胞がＰＤ１遺伝子を発現するが、最高用量のＭＳ２ＲＬＰ（５ｐｇ ｐ２４／細胞）では、ＰＤ１遺伝子を発現する細胞は１４％しか残らない。従って、ＭＳ２ＲＬＰ粒子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達し、内因性標的の効果的なノックアウトを可能にする最良のツールである。

【0379】

図ＸＸＩＶ及びＸＸＶは、初代細胞であり、従って任意の操作に敏感かつ繊細である活性化ヒトＴリンパ球の形質導入から得られた。図ＸＸＶＩは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子による第１及び第２の形質導入後の、Ｔリンパ球の生存率の測定を示す。図ＸＸＶＩは、活性化Ｔリンパ球の生存率に影響を与えることなく効果的なＰＤ１遺伝子のノックアウト（図ＸＸＩＶ、７５％のＰＤ１遺伝子のノックアウト）を得るための、１ｐｇ ｐ２４／細胞に対応するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の最適用量の決定を可能にする。

【0380】

図ＸＸＶＩＩは、ＴＣＲ及びＣＤ２５活性化マーカーの発現を測定することによる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子による第２の形質導入後の、Ｔリンパ球の表現型の分析を示す。結果は、どの用量のＭＳ２ＲＬＰ粒子が使用されても、ＴＣＲ及びＣＤ２５を発現する細胞のパーセンテージが安定であることを示している。

【0381】

結論として、図ＸＸＩＶ、ＸＸＶＩ及びＸＸＶＩＩは、ＭＳ２ＲＬＰ粒子が、形質導入されたＴリンパ球の生存率及び表現型を保存しながらＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達するための最良のツールであることを示している。

【0382】

実施例１０：ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトのために、活性化初代Ｔリンパ球にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達する際のＭＳ２ＲＬＰ粒子の有効性
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
実施例１（その発現カセットを図Ｉ、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘに示す）及び図ＸＸＶＩＩＩ、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−Ｇｕｉｄｅ＿ａｎｔｉＣＸＣＲ４Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘ、に記載の発現プラスミドを、初代Ｔリンパ球のゲノム中に組み込まれたＣＸＣＲ４遺伝子の配列を標的化する、Ｕ６プロモーターの制御下で、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡの両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子において、同時カプシド形成するために使用した。

【0383】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＩＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによりＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質によって置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような、特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異していてもよい。

【0384】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0385】

これらプラスミドは、本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅａｎｔｉＣＸＣＲ４Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0386】

１．２ 本発明に係る対照ＭＳ２−（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。より具体的には、これらプラスミドは、実施例１の段落１．１に記載されたように、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0387】

２．レンチウイルス粒子のバッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは、国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された前述の方法Ｐ１又はＰ２の１つに従って濃縮／精製して使用した。

【0388】

２．１ レンチウイルス粒子の生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。

【0389】

ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子を、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の２つの発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−Ｇｕｉｄｅ＿ａｎｔｉＣＸＣＲ４Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＭＳ２ ２Ｘプラスミド（その発現カセットを図ＸＸＶＩＩＩに示す）が、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＭＳ２ １２Ｘプラスミド（その発現カセットを図Ｉに示す）の二倍の量で使用される；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ。

【0390】

使用されるプラスミドの割合は、実施例４における割合と同一である。

【0391】

より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅａｎｔｉＣＸＣＲ４Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0392】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0393】

対照ＭＳ２−（ＮＣ）ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例１に記載したように生産される。

【0394】

２．２ レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
粒子を、実施例１に記載の方法Ｐ２に従って濃縮及び精製する。

【0395】

３．ＥＬＩＳＡ ｐ２４アッセイによる物理的粒子の滴定
ｐ２４カプシドタンパク質は、ＨＩＶ−１ ｐ２４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Perkin Elmer）を用いて、その推奨に従って、ウイルス上清で直接検出される。捕捉されたｐ２４タンパク質は、ビオチン化ポリクローナル抗体と複合体化され、次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたストレプトアビジンによって検出される。得られた複合体は、捕捉されたｐ２４タンパク質の量に正比例する黄色の着色を生じるオルトフェニレンジアミン−ＨＣｌ基質（ＯＰＤ）とのインキュベーション後に分光光度法によって検出される。各ウェルの吸光度を、Synergy H1 Hybrid（登録商標）プレートリーダー（Biotek）で定量し、ｐ２４タンパク質の標準範囲の吸光度に対して較正する。ｐ２４タンパク質の１ｐｇが１０⁴個の物理的粒子に対応することを知ることによって、１ｍｌ当たりの物理的粒子として表されたウイルス力価を、得られたｐ２４タンパク質の濃度から計算する。

【0396】

４．標的細胞の調製及び本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
この例は、Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ及びＣＸＣＲ４遺伝子の配列を標的化するガイドＲＮＡの両方を、同じＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子において、同時カプシド形成し、次いでこれら異なるＲＮＡを、ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子を介して標的細胞である活性化初代Ｔリンパ球に転移させることが可能であることを示すことを目的とする。このＲＮＡの転移の最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、機能的であり、かつＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの２つの構成要素の転移のための１つの同じツールを用いて、標的ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトを可能にする二本鎖ＤＮＡの切断を生じるべきである。

【0397】

４．１ 標的細胞の活性化初代Ｔリンパ球の調製
Ｔリンパ球標的細胞を末梢血試料から調製する。末梢血の単核細胞を、Ficoll勾配遠心分離によって単離し、次いで、Ｔ７５フラスコ中で３７℃／５％ＣＯ₂で２時間接着させる。懸濁液中の細胞を回収し、Ｔリンパ球を、磁性ビーズ（Pan T細胞単離キット、Miltenyi Biotec）を用いたネガティブセレクションによって精製する。精製したＴリンパ球を、（Dynabeads（登録商標） Human T-Activator CD3/CD28、ThermoFisher）３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間活性化する。

【0398】

４．２ 標的細胞である活性化初代Ｔリンパ球の形質導入
標的細胞である活性化初代Ｔリンパ球を、１００００００細胞／ｍＬで９６−ウェルプレートに播種し、そして、異なる用量（０．１；０．５；１又は５ｐｇ ｐ２４／細胞）で、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、Ｃａｓ９及びガイドの両方を送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子によって、あるいはＣａｓ９のみを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子（陰性対照）によって、形質導入する。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）、を、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ及びＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。

【0399】

形質導入上清を４時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。４８時間後、第２の形質導入を、第１の形質導入と同じ条件下で行う。第２の形質導入から４日後に、細胞を回収し、ＣＸＣＲ４を発現する細胞のパーセンテージを、抗ＣＸＣＲ４抗体（Miltenyi Biotec）による細胞の免疫標識後に、サイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0400】

細胞のＦＡＣＳ分析の直後にViobility（商標）Fixable Dyes（Miltenyi Biotec）を添加することによって生存率を分析し、リンパ球の表現型決定を、抗ＴＣＲ及び抗ＣＤ２５抗体（Miltenyi Biotec）による免疫標識によって行う。

【0401】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、初代細胞の内因性遺伝子、例えば活性化初代Ｔリンパ球におけるＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトのために、ＭＳ２ＲＬＰ粒子によって送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの有効性を評価することである（図ＸＸＩＸ）。

【0402】

ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるその発現の消失はＨＩＶ−１ウイルスによる感染の阻止を可能にするため、ＣＸＣＲ４遺伝子は興味深い標的である。

【0403】

細胞が、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子により形質導入される場合、第２の形質導入から４日後に、第１の用量（０．１ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合９２％、第２の用量（０．５ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合９７％、第３の用量（１ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合９８％、及び第４の用量（５ｐｇ ｐ２４／細胞）の場合９９％の、ＣＸＣＲ４タンパク質を発現する細胞数の減少が見られる。

【0404】

並行して、Ｃａｓ９のみを発現するＭＳ２ＲＬＰを、ＣＸＣＲ４遺伝子ノックアウトの陰性対照として使用する。結果は、Ｃａｓ９タンパク質のみを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子のどの用量が使用されても、ＣＸＣＲ４タンパク質を発現する細胞のパーセンテージが安定であることを示している。

【0405】

図ＸＸＸ及びＸＸＸＩは、初代細胞であり、従って任意の操作に敏感かつ繊細である活性化ヒトＴリンパ球の形質導入から得られた。図ＸＸＸは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ−２Ｘ粒子による第１及び第２の形質導入後の、Ｔリンパ球の生存率の測定を示す。Ｔリンパ球の生存率は、どの用量が使用されてもＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子での形質導入（複数）によって変更されないことが観察される。

【0406】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の最適用量は、５ｐｇ ｐ２４／細胞に相当し、活性化Ｔリンパ球の生存率に影響を及ぼすことなく、ＣＸＣＲ４遺伝子の効果的なノックアウトを得ることを可能にする（図ＸＸＩＸ、ＣＸＣＲ４遺伝子の９９％のノックアウト）。

【0407】

図ＸＸＸＩは、ＴＣＲ及びＣＤ２５活性化マーカーの発現を測定することによる、ＣＸＣＲ４遺伝子のノックアウトのためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子による第２の形質導入後の、Ｔリンパ球の表現型の分析を示す。結果は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子のどの用量が使用されても、ＴＣＲ及びＣＤ２５を発現する細胞のパーセンテージが安定であることを示している。

【0408】

結論として、図ＸＸＩＸ、ＸＸＸ及びＸＸＸＩは、ＭＳ２ＲＬＰ粒子が、形質導入されたＴリンパ球の生存率及び表現型を保存しながらＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達するための最良のツールであることを示している。

【0409】

実施例１１：ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達するＭＳ２ＲＬＰ粒子の用量効果
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例８と同一の方法によって調製される。より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ −ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0410】

１．２ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞の生成用のＩＬＶ−ＧＦＰ組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0411】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは、国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された前述の方法Ｐ１又はＰ２の１つに従って濃縮／精製して使用した。

【0412】

２．１ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの生産
ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例４に記載の方法により生産される。

【0413】

ＩＬＶ−ＧＦＰレンチウイルスベクターは、実施例１に記載したように生産される。

【0414】

２．２ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの濃縮及び精製
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0415】

３．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの滴定
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載の方法によって滴定する。

【0416】

４．標的細胞の生成及び本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
本実施例の目的は、標的細胞においてＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子が、ゲノム編集の有効性に対して用量効果を有することを示すことである。このＲＮＡの転移の最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、機能的であり、かつ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの２つの構成要素の転移のための１つの同じツールを用いて、標的遺伝子のノックアウトを可能にする二本鎖ＤＮＡの切断を生じ、従ってＧＦＰ＋細胞をＧＦＰ−細胞へと変換すべきである。

【0417】

４．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞
このクローンは実施例１と同一の方法によって調製される。

【0418】

４．２ 本発明に係るＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子によるＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞の形質導入
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞を、２４ウェルプレートに２５０００細胞／ｃｍ²で播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、異なる用量（０．５；１；５又は１０ｐｇ ｐ２４／細胞）で、Ｃａｓ９及びキメラガイドＤ１の両方を送達するＭＳ２ＲＬＰ−Ｃａｓ９ １２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘ粒子によって形質導入する。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）を、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を５時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。第１の形質導入の６日後に、第２の形質導入を同じ条件下で行った（図ＸＸＸＩＩＩ）。最後の形質導入から７日後に、細胞を回収し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0419】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、ゲノム編集に対する用量効果を誘導する、本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の能力を研究することであり、これは、様々な濃度でＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びガイドＲＮＡを同時に転移させ、第１の形質導入（図ＸＸＸＩＩＩ、Ｔ１陽性細胞の％）及び第２の形質導入（図ＸＸＸＩＩＩ、Ｔ２陽性細胞の％）でのＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２のものにおけるＧＦＰの消失を測定することによって行われる。

【0420】

最初に、図ＸＸＸＩＩＩに提示された結果は、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞は１００％蛍光性であるが、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞は蛍光性でないことを示している。細胞が、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子で形質導入される場合、細胞の第２の形質導入から７日後（図ＸＸＸＩＩＩ、Ｔ２陽性細胞の％）、用量効果に従った蛍光細胞数の減少が見られる。ｐｇ ｐ２４／細胞のどの用量（０．５、１、５又は１０）であっても、第１の形質導入後よりも第２の形質導入後にＧＦＰのより強い消失が観察される。

【0421】

第２の形質導入後に、０．５ｐｇ ｐ２４／細胞の用量について３３％程のＧＦＰ遺伝子ノックアウト、１ｐｇ ｐ２４／細胞について３９％程のＧＦＰ遺伝子のノックアウト、５ｐｇ ｐ２４／細胞について５８％程のＧＦＰ遺伝子のノックアウト、及び最終的に１０ｐｇ ｐ２４／細胞で６５％程のＧＦＰ遺伝子のノックアウトが見られる。従って、第２の形質導入は、ＧＦＰのノックアウトの有効性を、第１の形質導入に対して増加させる。ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の用量が高くなるほど、ＧＦＰのノックアウトが大きくなる。

【0422】

実施例１２：ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）を送達するＰＰ７ＲＬＰ粒子の有効性
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
本実施例では、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ粒子は、ＰＰ７ステム−ループモチーフの２つの異なるシリーズ（第１シリーズのモチーフ：配列番号２に続いて配列番号４、及び第２シリーズのモチーフ：配列番号５に続いて配列番号６）を含むため、ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘと呼ばれることになる。

【0423】

・目的の配列のための発現プラスミド：
第１の発現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない図ＸＸＸＩＶに記載された発現カセットを有する（ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＰＰ７ ２Ｘ）。レンチウイルス粒子内にｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号２及びctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag 配列番号４）を、Ｃａｓ９酵素の配列の下流の発現カセットに挿入した（図ＸＸＸＩＶ）。使用されたプロモーターはＥＦ１プロモーターであるが（図ＸＸＸＩＶ）、他のプロモーターが使用されてもよい。目的のプラスミド配列は、その野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）における、Ｃａｓ９タンパク質のＲＮＡをコードするＤＮＡである（図ＸＸＸＩＶ）。

【0424】

第２の発現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない図ＸＸＸＶに記載された発現カセットを有する（ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＰＰ７ ２Ｘ）。レンチウイルス粒子内にガイドＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（ｇgagcagacgatatggcgtcgctcc 配列番号５及びccagcagagcatatgggctcgctgg 配列番号６）を、ガイドの足場の部分における発現カセットに挿入した（キメラガイド、図ＸＸＸＶ）。使用されたプロモーターはＵ６であるが、他のプロモーターが使用されてもよい、例えばプロモーターＨ１。ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ依存型のプロモーター、例えばＨ１又はＵ６の使用は、転写末終結シグナル（Ｔｅｒｍ）の存在を必要とする。目的の配列は、ＧＦＰの配列を標的化する非コーディングＲＮＡである（ｓｇＲＮＡ＝ガイドＲＮＡ）。

【0425】

これら発現プラスミドは、標的細胞（ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２）のゲノム内に組み込まれたＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びＧＦＰの配列を標的化するガイドＲＮＡの両方を、同じＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ粒子において、同時カプシドするために使用された。

【0426】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、ヌクレオカプシドタンパク質内に、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、バクテリオファージＰＰ７の「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＸＸＸＶＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質により置換されて、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＸＸＸＶＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異されてもよい。

【0427】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0428】

より具体的には、これらプラスミドは、ＰＰ７ＲＬＰ Ｃａｓ９ ２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0429】

１．２ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ Ｃｌｏｎｅ Ｄ２標的細胞の生成用のＩＬＶ−ＧＦＰ組み込みレンチウイルスベクターを生産するためのプラスミド
これらプラスミドは、実施例１と同一の方法によって調製される。

【0430】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは、国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された前述の方法Ｐ１又はＰ２の１つに従って濃縮／精製して使用した。

【0431】

２．１ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。

【0432】

ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘ粒子、好ましくはＰＰ７ＲＬＰ−Ｃａｓ９ ２Ｘ−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ２Ｘを、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の２つの発現プラスミド、ｐｃＤＮＡ−Ｕ６−ＧｕｉｄｅＤ１Ｃｈｉｍｅｒｉｃ−ＰＰ７ ２Ｘプラスミド（その発現カセットを図ＸＸＸＶに示す）が、ｐｃＤＮＡ−ＥＦ１−Ｃａｓ９−ＰＰ７ ２Ｘプラスミド（その発現カセットを図ＸＸＸＩＶに示す）の二倍の量で使用される；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔ（その発現カセットを図ＸＸＸＶＩｂに示す）；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ（その発現カセットを図ＩＩＩに示す）。

【0433】

ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘ粒子は、実施例４に記載の方法により生産される。リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0434】

ＩＬＶ−ＧＦＰレンチウイルスベクターは、実施例１に記載したように生産される。

【0435】

２．２ レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターの濃縮及び精製
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0436】

３．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの滴定
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。

【0437】

４．標的細胞の生成及び本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
本実施例の目的は、標的細胞へとＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９システムを送達するＰＰ７ＲＬＰ粒子が、ゲノム編集の有効性に対する用量効果を有することを示すことである。このＲＮＡの転移の最後に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、機能的であり、かつ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの２つの構成要素の転移のための１つの同じツールを用いて、標的遺伝子のノックアウトを可能にする二本鎖ＤＮＡの切断を生じ、従ってＧＦＰ＋細胞をＧＦＰ−細胞へと変換すべきである。

【0438】

４．１ ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞
このクローンは実施例１と同一の方法によって調製される。

【0439】

４．２ 本発明に係るＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子によるＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞の形質導入
ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞を、２４ウェルプレートに２５０００細胞／ｃｍ²で播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートする。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２標的細胞を、８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、異なる用量で（０．５；１；５又は１０ｐｇ ｐ２４／細胞）、Ｃａｓ９及びガイドＤ１キメラの両方を送達するＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘ粒子によって形質導入する。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）、を、ＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ ２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を１７時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。第１の形質導入の６日後に第２の形質導入を同じ条件下で行った（図ＸＸＸＶＩＩ）。最後の形質導入から７日後に、標的細胞を回収し、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージをサイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0440】

ＩＩ．結果
本実験の目的は、ゲノム編集に対する用量効果を誘導するＰＰ７ＲＬＰ粒子の能力を研究することであり、これは、様々な濃度でＣａｓ９をコードするＲＮＡ及びタンパク質ＧＦＰをコードする配列を標的化するガイドＲＮＡを同時に転移させることによって、そして第１の形質導入（図ＸＸＸＶＩＩ、Ｔ１陽性細胞の％）及び第２の形質導入（図ＸＸＸＶＩＩ、Ｔ２陽性細胞の％）でのサイトメトリーによってＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ＣｌｏｎｅＤ２におけるＧＦＰの消失を測定することによって行われる。

【0441】

最初に、図ＸＸＸＶＩＩに提示された結果は、非形質導入（ＮＴ）ＨＣＴ１１６細胞は蛍光性でないが、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞が１００％蛍光性であることを示している。ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２細胞が、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達するＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ粒子で形質導入される場合、標的細胞の第１及び第２の形質導入から７日後に（図ＸＸＸＶＩＩ、Ｔ２陽性細胞の％）、用量効果に従った蛍光細胞数の減少が見られる。ＭＳ２ＲＬＰ粒子の場合と同様に、どのｐｇ ｐ２４／細胞数（０．５、１、５又は１０）であっても、第２の形質導入後に、第１の形質導入後よりもＧＦＰの強い消失が観察される。

【0442】

第２の形質導入後に、０．５ｐｇ ｐ２４／細胞の用量について３３％程のＧＦＰ遺伝子ノックアウト、１ｐｇ ｐ２４／細胞について５４％程の、５ｐｇ ｐ２４／細胞について８５％程の、最後に１０ｐｇ ｐ２４／細胞で７５％程のＧＦＰ遺伝子ノックアウトが見られる。従って、第２の形質導入は、ＧＦＰのノックアウトの有効性を、第１の形質導入に対して増加させる。ＰＰ７ＲＬＰ粒子の用量が高くなるほど、ＧＦＰのノックアウトは大きくなり、５ｐｇ ｐ２４／細胞の用量で最大の消失有効性に達する。また、ＰＰ７ＲＬＰ粒子は、ＰＰ７ＲＬＰ粒子の５ｐｇ ｐ２４／細胞及び１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量間で、実施例４に記載された「オフターゲット効果」を有する。従って、使用される形質導入の用量及び数は、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを送達する際のＰＰ７ＲＬＰ粒子の有効性について考慮されるべき重要な因子である。

【0443】

ＰＰ７ＲＬＰ粒子は、ＨＣＴ１１６−ＧＦＰ ｃｌｏｎｅＤ２標的細胞においてＭＳ２ＲＬＰ粒子よりも高いＧＦＰのパーセンテージ消失を与える（それぞれ図ＸＸＸＶＩＩ及び図ＸＸＩＩ）。各粒子の最適用量で、ＰＰ７ＲＬＰ粒子の５ｐｇ ｐ２４／細胞について８５％程のＧＦＰ遺伝子のノックアウトに対し、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の１０ｐｇ ｐ２４／細胞について８２％であることが注目され、又はＰＰ７ＲＬＰ粒子よりも２倍多い用量である。ＰＰ７ＲＬＰ粒子の有効性は、特に、いくつかの形質導入に感受性であり得る繊細な初代細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡ転移を最適化することができる。結論として、これらＰＰ７ＲＬＰ粒子は、単一タイプの粒子の使用により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを同時送達するための最良のツールであることを明らかにする。

【0444】

実施例１３：有効なＭＳ２ＲＬＰ−ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９粒子（ガイドＲＮＡ＋Ｃａｓ９をコードするＲＮＡ）の最適化の観点からＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１ １２Ｘ粒子の生産のための野生型ＧＡＧ−ＰＯＬ前駆体の影響
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない発現カセット（図ＸＸＸＶＩＩＩに記載）を有する。レンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、ＺｓＧｒｅｅｎＩタンパク質の配列の下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターはＥＦ１プロモーターであるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的のプラスミド配列は、ＺｓＧｒｅｅｎＩタンパク質のＲＮＡをコードするＤＮＡである。

【0445】

・カプシド形成プラスミド：第１のカプシド形成プラスミドは、発現カセットが図ＩＩｂに記載されているｐ８．７４ΔＺＦプラスミドであり、これは、図ＩＩａに示された戦略に従って、かつ実施例１に記載されたように、ヌクレオカプシドタンパク質内に、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインに代えて、ＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように、ｐ８．７４カプシド形成プラスミドを改変することによって得られた。

【0446】

第２のカプシド形成プラスミドは、図ＶＩに示されたように野生型構造的及び機能的タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）をコードする遺伝子を有するｐ８．７４プラスミドである。

【0447】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶＧであり得る（図ＩＩＩ）。

【0448】

より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ１２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0449】

１．２ 対照組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶ−ＺｓＧｒｅｅｎＩを生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、図ＸＸＸＸＩに記載の発現カセットを有する。このプラスミドは他のエレメント、例えば天然配列ＷＰＲＥ（Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element）又はｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列を含んでもよい。ウイルスの病原性は、導入遺伝子によるレトロウイルス複製に必要とされるウイルスゲノムの領域の置換によって排除されている。使用されるプロモーターはＥＦ１プロモーターであるが、他のプロモーターが使用されてもよい。目的のプラスミド配列は、ＺｓＧｒｅｅｎＩタンパク質のＲＮＡをコードするＤＮＡである。

【0450】

・カプシド形成プラスミド：
構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、組み込みレンチウイルスベクターの生産のために使用する（図ＶＩ）。

【0451】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：
このプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰレンチウイルス粒子を生産するために使用されるエンベローププラスミドと同一である（図ＩＩＩ）。

【0452】

２．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの生産
２．１ レンチウイルス粒子の生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。

【0453】

ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子を、以下の４つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述した発現プラスミド、発現カセットが図ＸＸＸＶＩＩＩに示されている；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ（その発現カセットを図ＩＩｂに示す）及びｐ８．７４プラスミド（その発現カセットを図ＶＩに示す）、２つのカプシド形成プラスミドの４つの異なる比を用いる、それぞれ［１００％−０％］；［９０％−１０％］；［８０％−２０％］及び［５０％−５０％］；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ（その発現カセットを図ＩＩＩに示す）。

【0454】

ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例１に記載したように、すなわち以下のプラスミドのそれぞれの割合で生産される：４０％の発現プラスミド、３０％のｐ８．７４プラスミド（又はｐ８．７４ΔＺＦ）、３０％のｐＥＮＶプラスミド（比［１００％−０％］）。

【0455】

より具体的には、プラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである：
−比［９０％−１０％］：４０％の発現プラスミド、２７％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、３％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド；
−比［８０％−２０％］：４０％の発現プラスミド、２４％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、６％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド；
−比［５０％−５０％］：４０％の発現プラスミド、１５％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、１５％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。

【0456】

完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを転移させるためのＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の生産の場合、粒子は、実施例８に記載された方法によって生産される。より具体的には、プラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである：３３％のガイドをコードする発現プラスミド、１７％のＣａｓ９をコードする発現プラスミド（ガイドをコードする発現プラスミドの量は、Ｃａｓ９をコードする発現プラスミドの量に対して二倍である）、２５％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミドにおいて、２５％のｐＥＮＶプラスミド（比［１００％−０％］）。

【0457】

より具体的には、プラスミドのそれぞれの割合は、以下の通りである：
−比［９０％−１０％］：４０％の発現プラスミド、２２．５％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、２．５％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド；
−比［８０％−２０％］：４０％の発現プラスミド、２０％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、５％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド
−比［５０％−５０％］：４０％の発現プラスミド、１２．５％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、１２．５％のｐ８．７４プラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。
より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0458】

ＥＦ１−ＺｓＧｒｅｅｎＩ発現カセットを含む組み込みレンチウイルスベクターＩＬＶ−ＺｓＧｒｅｅｎＩを、対照として生産する。

【0459】

ＩＬＶ−ＺｓＧｒｅｅｎＩのバッチについて、トランスフェクション混合物は、以下の３つのプラスミドからなる：
−その発現カセットが図ＸＸＸＸに示されている発現プラスミド
−ｐ８．７４プラスミド（その発現カセットが図ＶＩに示されている）
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶプラスミド（その発現カセットが図ＩＩＩに示されている）。

【0460】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0461】

２．２ レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0462】

３．レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターのバッチの滴定
レンチウイルス粒子及びレンチウイルスベクターを、実施例１に記載のように滴定する。

【0463】

４．標的細胞の調製及び本発明に係るＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
Ｊｕｒｋａｔ標的細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ−１５２）を、９６ウェルプレートに２０００００細胞／ｍＬで播種し、４μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下で、２つの用量（２及び１０ｐｇ ｐ２４／細胞）でのＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子によって、又はＭＯＩ４０での対照ＩＬＶ−ＺｓＧｒｅｅｎＩレンチウイルスベクターによって形質導入し、次いで３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）、を、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。形質導入上清を５時間後に除去し、新鮮な補充培地と交換する。形質導入後２４時間に、標的細胞を回収し、ＺｓＧｒｅｅｎＩを発現する細胞のパーセンテージを、サイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0464】

５．抗ｐ２４ウェスタンブロットによるＭＳ２ＲＬＰウイルス粒子の成熟の分析
ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子を生産するためのプラスミドによるプロデューサー細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）のトランスフェクションから４８時間後に、培養上清を回収し、次いで実施例１に記載された方法Ｐ１に従って濃縮し、実施例１に記載されたｐ２４タンパク質の定量化によって滴定する。ｐ２４の１５ｎｇの当量を、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ／ｐ８．７４プラスミドの比の各条件についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ ４／１２％変性ゲル上にロードし、次いでＭＯＰＳ１Ｘ緩衝液中で２００Ｖで１時間移動させる。ナイロンメンブレンに移した後、タンパク質を抗ｐ２４抗体［ｃｌｏｎｅ ３９／５．４Ａ、Abcam）でハイブリダイズする。ウェスタンブロットをPierce（商標）Fast Western Blot Kit、ECL Substrate（Pierce）を用いて展開する。バンドはオートラジオグラフィーフィルム上での化学発光によって可視化される。

【0465】

ＩＩ．結果
この例は、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の生産に関する概念の証明によって実証された、粒子の生産中のＧＡＧ前駆体の成熟を改善することによってＭＳ２ＲＬＰ粒子の機能性を改善することが可能であることを示すことを目的とする。ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２プラスミドは、ヌクレオカプシドタンパク質第２のジンクフィンガーの代わりにバクテリオファージコートタンパク質を含むＧＡＧ前駆体の発現を可能にする。このコートタンパク質は、以下の３つのタンパク質に切断される際に、ＧＡＧ前駆体の成熟を妨害する可能性が高い：マトリックスタンパク質、カプシドタンパク質及びヌクレオカプシドタンパク質。これら３つのタンパク質は、ウイルス粒子の構造に不可欠である。

【0466】

ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎ１ １２Ｘ粒子の生産中のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドに加えてｐ８．７４プラスミドによる野生型ＧＡＧ前駆体の供給は、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２プラスミドに起因して発現されるＧＡＧ前駆体の成熟の増強を可能にし、従ってＭＳ２ＲＬＰ粒子の機能性を増大し得る。

【0467】

本実験の目的は、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子のプロデューサー細胞において、それがコトランスフェクトされた場合のｐ８．７４プラスミドの影響、同時にＧＡＧ前駆体の成熟を改善することを可能にするｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドとしての影響を評価すること、並びに従って最終粒子を標的細胞の形質導入のためにより機能的にすることである。

【0468】

本実施例では、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ／ｐ８．７４カプシド形成プラスミドの４つの比：１００／０；９０／１０；８０／２０及び５０／５０、を試験する。ＺｓＧｒｅｅｎＩを発現する組み込みベクターＩＬＶを対照として使用する。細胞を、ｐ２４／ｍｌ：２ｐｇ ｐ２４／細胞（図ＸＸＸＸＩ）及び１０ｐｇ ｐ２４／細胞（図ＸＸＸＸＩＩ）の２つの量で形質導入する。

【0469】

最初に、図ＸＸＸＸＩに提示された結果は、形質導入されなかった細胞について、蛍光細胞のパーセンテージが０に非常に近く、一方でＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子によって形質導入された細胞は、カプシド形成プラスミドのどの比が使用されても９９％超が蛍光性であることを示している。ＺｓＧｒｅｅｎＩの蛍光強度は、 ｐ８．７４プラスミドの量の増加の関数として増加することに注意することが重要である。５０％のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミド及び５０％のｐ８．７４プラスミドで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子によって形質導入された細胞は、７．７６の蛍光強度を有するが、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドのみで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子によって形質導入された細胞の蛍光強度は、３．５である。

【0470】

図ＸＸＸＸＩＩは形質導入された細胞のパーセンテージに関して同じ結果を示す。蛍光強度に関して、ｐ８．７４プラスミドの量が増加すると、図ＸＸＸＸＩに示されたように蛍光強度が増大する。５０％のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミド及び５０％のｐ８．７４プラスミドで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子によって形質導入された細胞は、６０．６７の蛍光強度を有するが、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミドのみで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子によって形質導入された細胞の蛍光強度は、１１．４８である。

【0471】

これは、２ｐｇ及び１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量で、粒子が５０％のｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔカプシド形成プラスミド及び５０％のｐ８．７４プラスミドで生産される場合に、粒子がｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドのみで生産されるよりも、得られた蛍光はそれぞれ２倍及び５倍大きいことを意味する。

【0472】

従って、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産におけるｐ８．７４プラスミドの使用は、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドでのコトランスフェクションにおいて、ＭＳ２ＲＬＰ粒子の最適化を目的とするＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子の機能性の改善に関する利益をもたらした。

【0473】

図ＸＸＸＸＩＩＩは、粒子を含む生産上清においてｐ２４タンパク質を検出することによって、ＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子の生化学的な成熟を示す。オートラジオグラフィーフィルムの２つの暴露時間、１分（図ＸＸＸＸＩＩＩａ）及び１５秒（図ＸＸＸＸＩＩＩｂ）での、抗ｐ２４ウェスタンブロットによるウイルス上清の分析に対応する。

【0474】

カプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４プラスミドのみで生産されたＨＩＶに由来する組み込みレンチウイルス粒子の場合、ｐ２４タンパク質は、以下の４つのレベルで検出可能である：
−ｐ１６０タンパク質前駆体（ＧＡＧ−ＰＯＬ）において
−ｐ５５タンパク質前駆体（ＧＡＧ）において
−成熟タンパク質状態（ｐ２４）において
−成熟の過程における他の中間タンパク質前駆体（ｐ１６０とｐ５５との間、及びｐ５５とｐ２４との間）において。

【0475】

成熟が正常に起こる場合、ｐ２４タンパク質は、タンパク質前駆体の状態（ｐ１６０、ｐ５５）又は中間タンパク質前駆体の状態よりも、成熟状態（ｐ２４）において多量に検出されるべきである。実際に、ウイルス粒子の成熟は、プロデューサー細胞による粒子の放出後に起こる。換言すれば、それらの産生中に、粒子はプロデューサー細胞の表面で出芽し、次いで未成熟粒子の状態で細胞から放出される。ＧＡＧ−ＰＯＬ及びＧＡＧタンパク質前駆体が最終タンパク質に成熟するのは、上清中への粒子の放出後のみである。

【0476】

カプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドのみで生産されたＨＩＶに由来するＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の場合、ｐ２４タンパク質は、以下の４つのレベルで検出可能である：
−ｐ１７２タンパク質前駆体（ＧＡＧΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ−ＰＯＬ）において
−ｐ６７タンパク質前駆体（ＧＡＧΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ）において、
−成熟タンパク質状態（ｐ２４）において
−成熟の過程における他の中間タンパク質前駆体（ｐ１７２とｐ６７との間、及びｐ６７とｐ２４との間）において。

【0477】

このＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子において、各前駆体は１２ｋＤａよりも重く、これはヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーに挿入されたＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質のサイズに対応する。

【0478】

図ＸＸＸＸＩＩＩは、トラックＩＬＶ上に、タンパク質前駆体の異なる形態、ｐ１６０（ＧＡＧ−ＰＯＬ）、ｐ５５（ＧＡＧ）並びに完全な成熟ｐ２４タンパク質を示す。タンパク質前駆体形態と比較して、成熟ｐ２４タンパク質が大部分を占める。カプシド形成プラスミドとしてｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドのみで生産されたＭＳ２ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ １２Ｘ粒子に対応する、トラック１００／０上には、前駆体／成熟ｐ２４タンパク質の割合がＩＬＶに対して増加し、ＭＳ２バクテリオファージのコートタンパク質の挿入がウイルス粒子の成熟を減少させることを示している。トラック９０／１０、８０／２０及び５０／５０上には、タンパク質前駆体ｐ１７２及びｐ６７の割合がタンパク質前駆体ｐ１６０及びｐ５５それぞれの利益に減少し、トラック５０／５０についての１つの同じ発現レベルに達する。粒子を生産するためのカプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドへのｐ８．７４プラスミドの添加は、成熟ｐ２４タンパク質の割合の増加をもたらす（図ＸＸＸＸＩＩＩｂ、１５秒の曝露）。この結果は、ＭＳ２ＲＬＰ粒子におけるタンパク質前駆体の成熟を促進することが、粒子を生産するためのカプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドに加えて、少なくとも１０％のｐ８．７４プラスミドを添加することが必要であることを示している。

【0479】

結論として、カプシド形成プラスミドとしてのｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドに加えて少なくとも１０％のｐ８．７４プラスミドを用いるＭＳ２ＲＬＰ粒子の生産は、成熟タンパク質への前駆体の成熟を増大することを可能にするだけでなく、さらに、標的細胞の形質導入後の粒子の機能性を増大することも可能にする。

【0480】

実施例１４：ＲＬＰ粒子によるＣＲＩＳＰＲシステムの転移の最適化の観点からの２つの異なるカプシド形成配列（ＭＳ２及びＰＰ７）によって指向された非ウイルスＲＮＡの採用（カプシド形成されたＲＮＡのタイプの調節）
Ｉ．材料及び方法
１．プラスミド構築
１．１ 本発明に係るＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発１の現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない図ＸＸＸＶＩＩＩに記載された発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、図ＸＸＸＶＩＩＩに記載された、天然ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）のような、レポータータンパク質をコードするＲＮＡ、あるいは、タンパク質、例えばその野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）におけるＣａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼをコードするｃＤＮＡの、下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１プロモーター（図ＸＸＸＶＩＩＩ）であり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。

【0481】

第２の発現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない図ＸＸＸＩＸに記載された、発現カセットを有する。レンチウイルス粒子へとｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号２及びctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag 配列番号４）を、図ＸＸＸＩＸに記載された、天然ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）のような、レポータータンパク質をコードするＲＮＡ、あるいは、タンパク質、例えばその野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）におけるＣａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼをコードするｃＤＮＡの、下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１プロモーター（図ＸＸＸＩＸ）であり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。

【0482】

・カプシド形成プラスミド：
レンチウイルス粒子を、ヌクレオカプシドタンパク質内に、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ＭＳ２又はＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＩＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによりＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質によって置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異されてもよい。

【0483】

ＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＸＸＸＶＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質により置換されて、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＸＸＸＶＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異されてもよい。

【0484】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0485】

より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２／ＰＰ７−ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘ− ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0486】

１．２ 本発明に係る対照ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない図ＸＸＸＶＩＩＩに記載の発現カセットを有する。レンチウイルス粒子にＲＮＡを輸送するために、ＭＳ２ ＲＮＡのステム−ループモチーフの１２回の反復（ctagaaaacatgaggatcacccatgtctgcag、配列番号１）を、図ＸＸＸＶＩＩＩに記載されたレポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）のＲＮＡ、あるいは、タンパク質、例えばその野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）におけるＣａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼをコードするｃＤＮＡの、下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１プロモーター（図ＸＸＸＶＩＩＩ）であり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。

【0487】

・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＩＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによりＭＳ２バクテリオファージの「コート」タンパク質によって置換され、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＩＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＭＳ２ＲＬＰ １２Ｘの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異されてもよい。

【0488】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0489】

より具体的には、これらプラスミドは、ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0490】

１．３ 本発明に係る対照ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するためのプラスミド
・目的の配列のための発現プラスミド：
発現プラスミドは、イントロン配列若しくはＲＮＡ安定化配列を含むか又は含まない、図ＸＸＸＩＸに記載の発現カセットを有する。レンチウイルス粒子へとｍＲＮＡを輸送するために、ＰＰ７ ＲＮＡのステム−ループモチーフの２回の反復（ctagaaaggagcagacgatatggcgtcgctccctgcag 配列番号２及びctagaaaccagcagagcatatgggctcgctggctgcag 配列番号４）を、図ＸＸＸＩＸに記載されたレポータータンパク質、例えば天然ホタルルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）をコードするＲＮＡ、あるいは、タンパク質、例えばその野生型（ＷＴ）又はその突然変異型（Ｎ）におけるＣａｓ９タンパク質などのヌクレアーゼをコードするｃＤＮＡの、下流の発現カセットに挿入した。使用されたプロモーターはＣＭＶ又はＥＦ１プロモーター（図ＸＸＸＩＸ）であり得るが、他のプロモーターが使用されてもよい。

【0491】

・カプシド形成プラスミド：レンチウイルス粒子を、第２のＺｎ ｆｉｎｇｅｒドメインの代わりに、ヌクレオカプシドタンパク質内にＰＰ７バクテリオファージ「コート」タンパク質の配列を含むように改変した。ＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘ粒子の生産のために使用される構造的及び機能的タンパク質をコードする遺伝子（Ｇａｇ、Ｐｏｌ）を有するｐ８．７４カプシド形成プラスミドを、図ＸＸＸＶＩａに示された戦略に従って改変する：このｐ８．７４プラスミドは、アセンブリＰＣＲによって、ｐ８．７４ΔＺＦヌクレオカプシドタンパク質の第２のジンクフィンガーを欠いたプラスミドを生成するために使用される。第２のジンクフィンガーは、ＨｐａＩクローニングによってＰＰ７バクテリオファージの「コート」タンパク質により置換されて、ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔプラスミドを生成する。これは、図ＸＸＸＶＩｂに示されたコンストラクトを与える。Ｐｏｌコーディング配列は、ＰＰ７ＲＬＰ ２Ｘの機能を変更することなく、例えば逆転写酵素（ＲＴ）又はインテグラーゼ（ＩＮ）をコードする配列のような特定の機能的エレメントにおいて欠失又は突然変異されてもよい。

【0492】

・エンベローププラスミド（ｐＥＮＶ）：このプラスミドは、エンベロープタンパク質をコードする遺伝子を有し、これは、水胞性口炎ウイルスのエンベロープタンパク質をコードするＶＳＶ−Ｇであり得る（図ＩＩＩ）。

【0493】

より具体的には、これらプラスミドは、ＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘレンチウイルス粒子を生産するために使用される。

【0494】

２．レンチウイルス粒子のバッチの生産
プロデューサー細胞に対するプラスミドのトランスフェクション後に、上清を採取し、粗生成物で使用するか、あるいは、国際公開第２０１３／０１４５３７号の出願に記載された前述の方法Ｐ１又はＰ２の１つに従って濃縮／精製して使用した。

【0495】

２．１ レンチウイルス粒子の生産
５％のＣＯ₂で湿潤雰囲気下、３７℃で、１％のペニシリン／ストレプトマイシン及び１％のウルトラグルタミン（ＰＡＡ）で補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco、Paisley、UK）で培養した、ＨＥＫ２９３Ｔプロデューサー細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１１２６８）を用いて１０−スタックの細胞ＴＡＣＫ（６３６０ｃｍ²、Corning）で、生産を行う。

【0496】

ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ、好ましくはＭＳ２／ＰＰ７−ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘ− ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘ、レンチウイルス粒子を、以下の５つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述の２つの発現プラスミド、これは、単一量で使用されるｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ｍＣｈｅｒｒｙ．ＭＳ２ １２Ｘプラスミド（その発現カセットは図ＸＸＸＶＩＩＩに示されている）（５０％）及びｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎＩ．ＰＰ７ ２Ｘプラスミド（その発現カセットは図ＸＸＸＩＸに示されている）（５０％）を含む；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔ（５０％）、その発現カセットは図ＸＸＸＶＩｂに示されている、及びｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ（５０％）、その発現カセットは図ＩＩｂに示されている；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ、その発現カセットは図ＩＩＩに示されている。

【0497】

ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例１に記載したように、すなわち以下のプラスミドのそれぞれの割合で生産される：４０％の発現プラスミド、３０％のｐ８．７４プラスミド（又はｐ８．７４ΔＺＦ）、３０％のｐＥＮＶプラスミド。より具体的には、プラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである：２０％のｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ｍＣｈｅｒｒｙ．ＭＳ２ １２Ｘ発現プラスミド、２０％のｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎＩ．ＰＰ７ ２Ｘ発現プラスミド、３０％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド、３０％のｐＥＮＶプラスミド。

【0498】

完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを転移させるためのＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の生産の場合、粒子は、実施例８に記載された方法によって生産される。より具体的には、プラスミドのそれぞれの割合は以下の通りである：３３％のガイドをコードする発現プラスミド、１７％のＣａｓ９をコードする発現プラスミド（ガイドをコードする発現プラスミドの量は、Ｃａｓ９をコードする発現プラスミドの量に対して二倍である）、２５％のｐ８．７４ΔＺＦプラスミド及び２５％のｐＥＮＶプラスミド。

【0499】

対照ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子、好ましくはＭＳ２−ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘを、以下の３つのプラスミドのトランスフェクションにより生産する：
−上述した発現プラスミドｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ｍＣｈｅｒｒｙ．ＭＳ２ １２Ｘ（その発現カセットはＸＸＸＶＩＩＩに示されている）；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＭＳ２−Ｃｏａｔ、その発現カセットは図ＩＩｂに示されている；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ、その発現カセットは図ＩＩＩに示されている。

【0500】

ＭＳ２（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例１に記載したように生産される。

【0501】

対照ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子、好ましくはＰＰ７−ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘを、以下の３つのプラスミドのトランスフェクションによって生産する：
−上述した発現プラスミドｐｃＤＮＡ．ＥＦ１．ＺｓＧｒｅｅｎＩ．ＰＰ７ ２Ｘ（その発現カセットは図ＸＸＸＩＸに示されている）；
−ｐ８．７４ΔＺＦ−ＰＰ７−Ｃｏａｔ、その発現カセットは図ＸＸＸＶＩｂに示されている；
−エンベロープＶＳＶ−Ｇを有するｐＥＮＶ、その発現カセットは図ＩＩＩに示されている。

【0502】

ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ ２Ｘレンチウイルス粒子は、実施例１に記載したように生産される。

【0503】

リン酸カルシウムによる標準的なトランスフェクションから２４時間後に、培養上清を新鮮な未補充ＤＭＥＭ培地で交換する。プロデューサー細胞を、３７℃／５％ＣＯ₂でインキュベートする。培地の交換後に、上清を４回採取する（トランスフェクション後３２時間、４８時間、５６時間及び７２時間）。各回収物を、５分間の３０００ｇでの遠心分離によって清澄化した後に、０．４５μｍのフィルター（Stericup（登録商標）、Millipore）で精密ろ過する。次に全ての回収物をプールして、粗上清を構成する。

【0504】

２．２ レンチウイルス粒子の濃縮及び精製
レンチウイルス粒子を、実施例１に記載の方法Ｐ１に従って濃縮及び精製する。

【0505】

３．レンチウイルス粒子のバッチの滴定
レンチウイルス粒子を実施例１に記載したように滴定する。

【0506】

４．本発明に係るＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入
本実施例は、ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子を用いて行われ、斯かる粒子は、ＲＮＡのいくつかのタイプの転移、従っていくつかの異なるタンパク質（ＺｓＧｒｅｅｎＩ＋ｍＣｈｅｒｒｙ）の発現を可能にする。

【0507】

ＨＣＴ１１６標的細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）を２４ウェルプレートに播種し、３７℃／５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートし、１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量でのＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子によって形質導入した。

【0508】

実施した対照は、以下の通りである：
−それぞれ１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量での、ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘ及びＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘレンチウイルス粒子による形質導入；
−１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量での、ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘレンチウイルス粒子単独による形質導入；
−１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量での、ＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘレンチウイルス粒子単独による形質導入。

【0509】

８μｇ／ｍＬのPolybrene（登録商標）の存在下でレンチウイルス粒子による形質導入を行う。細胞防御機構阻害剤ＢＸ７９５（Invivogen）、を、ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ、ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘ及びＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘ粒子の場合には６μＭの濃度で使用する。標的細胞を形質導入後４８時間で回収し、ＺｓＧｒｅｅｎＩ及びｍＣｈｅｒｒｙを発現する細胞のパーセンテージを、サイトメトリー（Macs Quant VYB、Miltenyi Biotec）によって定量化する。

【0510】

ＩＩ．結果
図ＸＸＸＸＩＶは、ＨＣＴ１１６標的細胞内にバクテリオファージＭＳ２及びＰＰ７に由来するカプシド形成配列によってカプシド形成されたＲＮＡの転移のためのＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の有効性を示す。図は、二重蛍光細胞の割合が、１０ｐｇ ｐ２４／細胞の用量でのＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子の形質導入後に９７％であり、かつ２０ｐｇ ｐ２４／細胞でのＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘ及びＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘ粒子の形質導入後に９８％であることを示している。従って、同程度の形質導入有効性が、ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘの半分の用量について、ＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子で観察される。

【0511】

ＭＳ２ＲＬＰ−ｍＣｈｅｒｒｙ １２Ｘ粒子単独又はＰＰ７ＲＬＰ−ＺｓＧｒｅｅｎＩ ２Ｘ粒子単独によって標的形質導入された細胞は、単一蛍光タンパク質のためのＭＳ２／ＰＰ７（ＮＣ）−ＲＬＰ １２Ｘ ２Ｘ粒子によって標的細胞の形質導入後に得られたパーセンテージと同様の、形質導入有効性のパーセンテージを有する。従って、結果は、ＲＬＰ粒子が、標的細胞の単一形質導入における２つの異なるシステム（ＰＰ７及びＭＳ２）によってカプシド形成された少なくとも２種のＲＮＡを輸送及び転移させることができることを示している。

【0512】

ＲＬＰの１つの同じバッチの単一形質導入における、２つの異なるカプシド形成配列、ＭＳ２及びＰＰ７によって指向された異なるタイプのＲＮＡを転移させる能力の実証は、特にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの有効な転移のための、カプシド形成されたＲＮＡのタイプの調節に関する有意な利益を表す。蛍光レポーターをコードするＲＮＡを、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするＲＮＡ及び非コーディングガイドＲＮＡで置換することによって、この調節は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いたゲノム編集用途の多様化を可能にし得る。

【図1】

【図2a】

【図2b】

【図3】

【図4】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13a】

【図13b】

【図14a】

【図14b】

【図15a】

【図15b】

【図16a】

【図16b】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36a】

【図36b】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43a】

【図43b】

【図44】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]