特許 6982452 遺伝的に操作された微生物による１，５−ペンタンジオールの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6982452

(24)【登録日】2021年11月24日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】遺伝的に操作された微生物による１，５−ペンタンジオールの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20211206BHJP

   C12P 13/00 20060101ALI20211206BHJP

   C12P 7/18 20060101ALI20211206BHJP

   C12N 15/52 20060101ALN20211206BHJP

   C12N 15/53 20060101ALN20211206BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12P13/00

   C12P7/18

   !C12N15/52 Z

   !C12N15/53

【請求項の数】7

【全頁数】21

(21)【出願番号】特願2017-190540(P2017-190540)

(22)【出願日】2017年9月29日

(65)【公開番号】特開2019-62788(P2019-62788A)

(43)【公開日】2019年4月25日

【審査請求日】2020年6月3日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000033

【氏名又は名称】旭化成株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕 琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100185959

【弁理士】

【氏名又は名称】今藤 敏和

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】宮武 令

(72)【発明者】

【氏名】井阪 光二

【審査官】 林 康子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５１１９１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／０３６１４６４（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｐ １／００〜４１／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

１，５−ペンタンジオール生産能を有する組換微生物であって、少なくともＬ−リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．１８）、プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．８２）及びアルデヒドレダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．２）の３種の酵素をコードする外来性遺伝子が導入され、且つ前記プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．８２）をコードする外来性遺伝子がｙｇｊＧ及びｓｐｕＣの２種であることを特徴とする、前記組換微生物。

【請求項2】

前記宿主微生物が、リジン産生能を向上させるための突然変異または遺伝子組換を更に有することを特徴とする、請求項１記載の組換微生物。

【請求項3】

前記突然変異または遺伝子組換により、アスパルトキナーゼＩＩＩ（ＥＣ：２．７．２．４）または４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．３．３．７）またはその両方に対するリジンによるフィードバック阻害が解除される、請求項２記載の組換微生物。

【請求項4】

前記宿主微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組換微生物。

【請求項5】

請求項１乃至３のいずれか１項に記載の組換微生物を用いることを特徴とする１，５−ペンタンジオールの製造方法。

【請求項6】

前記組換微生物の宿主微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である請求項５記載の製造方法。

【請求項7】

炭素構成成分となる原料の一部または全部に植物由来の炭素を含む化合物を用いることによる請求項５または６に記載の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、産業上有用な化合物である５−アミノ−１−ペンタノール及び１，５−ペンタンジオール生産能を発現し得るように人為的に改変された微生物、並びに当該微生物を利用した５−アミノ−１−ペンタノール及び１，５−ペンタンジオールの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

５−アミノ−１−ペンタノール（ＣＡＳ Ｎｏ．２５０８−２９−４）は有機合成用原料、医薬中間体原料として有用な化合物であるが、安価に、安定して製造する方法は確立されていない。

【0003】

１，５−ペンタンジオール（ＣＡＳ Ｎｏ．１１１−２９−５）はポリウレタン原料、ポリエステル原料、可塑剤原料、香料原料、合成潤滑油原料、分散染料原料、医薬中間体原料に使用される有用な化合物である。工業的には石化原料であるシクロヘキサンからのカプロラクタム生産時の副産物が利用されており、ポリウレタンの需要が高まると共に１，５−ペンタンジオールのみを安価に、安定に目的生産できる技術が求められている。

【0004】

微生物、あるいは遺伝的に操作された微生物を使用する１，５−ペンタンジオールを目的生産する技術として、特許文献１に記載されたものが知られているが、１，５−ペンタンジオールの原料には５−ヒドロキシ吉草酸を使用しており、より安価なバイオマス由来原料からの直接生産技術が求められている。また、微生物を使用する５−アミノペンタノールに関する直接生産技術の報告は無い。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特許第５７７００９９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、安価かつ安定な原料である糖、主にグルコースから、遺伝的に操作された微生物を使用し、５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオールを生産する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の課題を解決するために、本発明は、５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオールを生産できる、遺伝的に操作された微生物を利用する。すなわち、
（１）５−アミノ−１−ペンタノールまたは１，５−ペンタンジオール生産能を有する組換微生物。

【0008】

（２）前記組換微生物が、Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．１８）、プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．８２）及びアルデヒドレダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．２）からなる群から選択される少なくとも１つの酵素の過剰生産を誘導するための１つ以上の遺伝子的操作であって、宿主微生物に該酵素をコードする外来性遺伝子を導入すること、宿主微生物内の該酵素の内因性遺伝子のコピー数を増加させること、宿主微生物内の該酵素の内因性遺伝子の発現調整領域に変異を導入すること、宿主微生物内の該酵素の内因性遺伝子の発現調整領域を高発現可能な外来調整領域で置換すること及び宿主微生物内の該酵素の内因性遺伝子の調整領域を欠失させることからなる群から選択される遺伝子的操作を有することを特徴とする、上記（１）の組換微生物。
(２−１）前記操作の対象となる酵素の遺伝子が、Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、１又は２個のプトレシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子及び１又は２個のアルデヒドレダクターゼ遺伝子である、上記（２）の組換微生物。
(２−２）前記操作の対象となる酵素の遺伝子が、Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、１個のプトレシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子及び１個のアルデヒドレダクターゼ遺伝子である、上記（２）の組換微生物。
(２−３）前記操作の対象となる酵素の遺伝子が、Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、２個のプトレシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子及び１個のアルデヒドレダクターゼ遺伝子である、上記（２）の組換微生物。
(２−４）主に、５−アミノ−１−ペンタノールを生産する、上記(２−２）の組換微生物。
(２−５）主に、１，５−ペンタンジオールを生産するする、上記(２−３）の組換微生物。
(２−６）前記遺伝子的操作が、宿主微生物にＬ−リジンデカルボキシラーゼ、１又は２種類のプトレシンアミノトランスフェラーゼ及び１又は２種類のアルデヒドレダクターゼ遺伝子をコードする外来性遺伝子を導入することである、上記（２−１）の組換微生物。
(２−７）前記遺伝子的操作が、宿主微生物にＬ−リジンデカルボキシラーゼ、１種類のプトレシンアミノトランスフェラーゼ及び１種類のアルデヒドレダクターゼ遺伝子をコードする外来性遺伝子を導入することである、上記（２−２）の組換微生物。
(２−８）前記遺伝子的操作が、宿主微生物にＬ−リジンデカルボキシラーゼ、２種類のプトレシンアミノトランスフェラーゼ及び１種類のアルデヒドレダクターゼ遺伝子をコードする外来性遺伝子を導入することである、上記（２−３）の組換微生物。
(２−９）主に、５−アミノ−１−ペンタノールを生産する、上記(２−７）の組換微生物。
(２−１０）主に、１，５−ペンタンジオールを生産するする、上記(２−８）の組換微生物。

【0009】

（３）前記宿主微生物が、リジン産生能を向上させるための突然変異または遺伝子組換を更に有することを特徴とする、上記（２）及び(２−１）乃至(２−１０）のいずれかの組換微生物。
（４）前記突然変異または遺伝子組換により、アスパルトキナーゼＩＩＩ（ＥＣ：２．７．２．４）または４−ヒドロキシ−テトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＥＣ：４．３．３．７）またはその両方に対するリジンによるフィードバック阻害が解除される、上記（３）の組換微生物。
(４−１）更に、内因性のＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子が破壊されていることを特徴とする、上記（２）、(２−１）乃至(２−１０）、（３）及び（４）のいずれかの組換微生物。
（５）前記宿主微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である上記（１）、（２）、(２−１)乃至(２−１０）、(３）、（４）及び(４−１）のいずれかの組換微生物。

【0010】

（６）上記（１）、（２）、(２−１）乃至(２−１０）、(３)、(４)、(４−１）及び（５）のいずれかの組換微生物を用いることを特徴とする５−アミノ−１−ペンタノールまたは１，５−ペンタンジオールの製造方法。
（６−１）前記組換微生物を、糖（好ましくはグルコース）及び／または糖を含有するバイオマスとともに、該組換微生物の生育に適した条件下で培養し、得られた培養物から５−アミノ−１−ペンタノールまたは１，５−ペンタンジオール或いはその双方を分離することを特徴とする上記（６）の製造方法。
（７）前記組換微生物の宿主微生物が、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）である上記（６）または（６−１）の製造方法。
（８）炭素構成成分となる原料の一部または全部に植物由来の炭素を含む化合物を用いることによる５−アミノ−１−ペンタノール、または１，５−ペンタンジオールの製造方法。
（９）炭素構成成分となる原料の一部または全部に植物由来の炭素を含む５−アミノ−１−ペンタノール、または１，５−ペンタンジオール。
（９−１）上記（８）の方法により製造される５−アミノ−１−ペンタノール、または１，５−ペンタンジオール。

【発明の効果】

【0011】

本発明により、安価かつ安定な原料である糖、特にグルコースなどから、５−アミノペンタノールや１，５−ペンタンジオールを生産する方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、本発明によってグルコースから５−アミノペンタノール及び/または１，５−ペンタンジオールを合成するための、本発明の組換微生物細胞内での代謝経路を示す。図１中の反応（１）はＬ−リジンデカルボキシラーゼにより触媒される。反応(２)及び（２’）はプトレシンアミノトランスフェラーゼにより触媒される。反応（３）及び（３’）はアルデヒドレダクターゼにより触媒される。

【図2】図２は、大腸菌Ｗ３１１０株由来のＣａｄＡ酵素のアミノ酸配列を示す（配列番号１）。

【図3】図３は、大腸菌Ｗ３１１０株由来のＹｇｊＧ酵素のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。

【図4】図４は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ Ｆ−１２６株由来のＳｐｕＣ酵素のアミノ酸配列を示す（配列番号３）。

【図5】図５は、大腸菌Ｗ３１１０株由来のＹｊｇＢ酵素のアミノ酸配列を示す（配列番号４）。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明においては、５−アミノ−１−ペンタノールまたは１，５−ペンタンジオール生産能を有する遺伝子組換微生物により、それらの化合物が発酵生産される。当該組換微生物の宿主として利用できる細胞株は、通常の意味での野生型であってよく、或いは、栄養要求性変異株、抗生物質耐性変異株であってもよい。更に、本発明の宿主細胞として利用できる細胞株は、上記のような変異に関する各種マーカー遺伝子を有するように既に形質転換されていてもよい。これらの変異や遺伝子は、本発明の組換微生物の作製・維持・管理に有益な性質を提供できる。

【0014】

特に本発明で使用され得る宿主は、Ｌ−リジン生産能を持つ微生物であることが好ましい。そのような微生物について、下記の通り例示する。

【0015】

（１）培養条件を最適化することで、変異処理、遺伝的操作を施さずとも、元来Ｌ−リジンを生産できる微生物。
（２）人為的な変異処理、例えばＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）やエタンスルホン酸メチル（ＥＭＳ）などの化合物による変異処理、高熱処理、ＵＶ照射処理などにより人為的な方法で突然変異を誘発し、Ｌ−リジン生産能を付与された微生物。このような微生物のスクリーニング方法としては、リジンの構造アナログである、Ｓ−（２−アミノエチル）システイン（ＡＥＣ）に対し耐性を示す変異株を取得する方法などが挙げられる。
（３）遺伝子組換操作により、Ｌ−リジン生産能を付与された微生物。例えば、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除された変異型アスパルトキバーゼ、変異型ジヒドロジピコリン酸シンターゼを細胞内で発現させた微生物、及び／またはＬ−リジン代謝経路に関わる各酵素、例えばアスパルトキナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ、スクシニル−アミノ−ケトピメレートトランスアミナーゼ、スクシニル−ジアミノ−ピメレートデスクシニラーゼ、ジアミノピメレートエピメラーゼ、ジアミノピメレートデヒドロゲナーゼ、アルギニル−ｔＲＮＡシンテターゼ、ジアミノピメレートデカルボキシラーゼなどを高発現させた微生物等が挙げられる。それらの酵素高発現は、自身の染色体上に存在する内在性の遺伝子上流のプロモーターを発現量が最適化されるように置換することや、該当遺伝子を最適に発現できるプラスミドを細胞内に導入することで達成され得る。

【0016】

なお、本明細書において、「内因性」ないし「内在性」という用語は、形質転換前の宿主微生物が、言及された遺伝子を、それによりコードされるタンパク質（典型的には酵素）が当該宿細胞内で有意な生化学的反応を進行させ得る程度に機能的に発現しているかどうかに関わらず、有していることを意味する。

【0017】

一方、本明細書において、「外来」ないし「外来性」という用語は、形質転換前の宿主微生物が、言及された遺伝子を有していない場合、またはその遺伝子によりコードされる酵素を実質的に発現しない場合、または異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子配列を宿主に導入することを意味する。例えば、本発明に必要なＬ−リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．１８）、プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．８２）、またはアルデヒドレダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．２）遺伝子のうちの少なくとも１つを有していない場合、またはその遺伝子によりコードされる酵素を実質的に発現しない場合、または異なる遺伝子により当該酵素のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に匹敵する内因性酵素活性を発現しない場合において、当該酵素の遺伝子配列を宿主に導入することを意味する。

【0018】

本発明の宿主微生物には、細菌、酵母、真菌などの、発酵プロセスに使用できる様々な微生物が含まれるが、その非限定的な例としては、大腸菌、バチルス属、コリネバクテリウム属、クレブシエラ属、クロストリジウム属、グルコノバクター属、ザイモモナス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、シュードモナス属、ストレプトマイセス属の細菌等が挙げられる。本発明の宿主微生物は、好ましくは、コリネバクテリウム属の細菌であり、更に好ましくは、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）であり得る。

【0019】

本発明の好ましい態様では、宿主細胞において新たな５−アミノペンタノールまたは１，５−ペンタンジオール生合成経路を構築するために、Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．１８）、１つ以上のプトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．８２）、及びアルデヒドレダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．２）酵素遺伝子の少なくとも１つを上記宿主微生物の細胞に導入する。典型的には、それら３種類の酵素をコードする遺伝子が宿主微生物細胞内に導入される。

【0020】

Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ（ＥＣ：４．１．１．１８）は、Ｌ−リジンを脱炭酸し、１，５−ペンタンジアミンを生成する反応を触媒する。遺伝子配列として代表的なものは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｃａｄＡ、ｌｄｃＣが挙げられる。大腸菌ＣａｄＡ酵素のアミノ酸配列を図２（配列番号１）に示した。また、大腸菌ｃａｄＡの塩基配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋ（ＧｅｎｅＩＤ：９４８６４３）からも利用可能である。

【0021】

プトレシンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ：２．６．１．８２）は、ドナー化合物とアクセプター化合物間のアミノ基転移反応を触媒する。本酵素は、基質としてドナー化合物：１，５−ペンタンジアミン、アクセプター化合物：α−ケトグルタル酸またはピルビン酸を使用し、生成物として５−アミノペンタナール、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−アラニンを生成する。また、本酵素は本発明の代謝経路の後段反応も触媒する。即ち、基質としてドナー化合物：５−アミノペンタノール、アクセプター化合物：α−ケトグルタル酸またはピルビン酸を使用し、生成物として１，５−ペンタンジオールセミアルデヒド、Ｌ−グルタミン酸またはＬ−アラニンを生成する。遺伝子配列として代表的なものは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｙｇｊＧや、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）のｓｐｕＣが挙げられる。大腸菌ＹｇｊＧ酵素のアミノ酸配列を図３（配列番号２）に、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ ＳｐｕＣ酵素のアミノ酸配列を図４（配列番号３）に示した。また、大腸菌ｙｇｊＧの塩基配列情報は、例えばＫｅｇｇ（Ｎｏ：ＪＷ５５１０）からも利用可能である。シュードモナス・プチダｓｐｕＣの塩基配列は、後記実施例に示す。

【0022】

アルデヒドレダクターゼ（ＥＣ：１．１．１．２）は、アルデヒドを還元してアルコールを生成する反応を触媒する。本発明においては、５−アミノペンタナールを還元して５−アミノペンタノールを、および１，５−ペンタンジオールセミアルデヒドを還元して１，５−ペンタンジオールを生成する。遺伝子配列として代表的なものは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のｙｊｇＢやｙｑｈＤが挙げられる。大腸菌ＹｊｇＢ酵素のアミノ酸配列を図５（配列番号４）に示した。また、大腸菌ｙｊｇＢの塩基配列情報は、例えばＫｅｇｇ（Ｎｏ：ＪＷ５７６１）からも利用可能である。

【0023】

但し、本発明に利用できる上記の酵素をコードする遺伝子は、例示された微生物以外に由来するものであっても、または人工的に合成したものであってもよく、前記宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであればよい。

【0024】

また、本発明の目的に利用できる上記酵素遺伝子は、前記宿主微生物細胞内で実質的な酵素活性を発現できるものであれば、自然界で発生し得るすべての変異や、人工的に導入された変異及び修飾を有していてもよい。例えば、特定のアミノ酸をコードする種々のコドンには余分のコドンが存在することが知られている。そのため本発明においても同一のアミノ酸に最終的に翻訳されることになる代替コドンを利用してよい。つまり、遺伝子コードは縮重しているので、ある特定のアミノ酸をコードするのに複数のコドンを使用でき、そのためアミノ酸配列は任意の１セットの類似のＤＮＡオリゴヌクレオチドでコードされ得る。そのセットの唯一のメンバーだけが天然型酵素の遺伝子配列に同一であるが、ミスマッチのあるＤＮＡオリゴヌクレオチドでさえ適切な緊縮条件下（例えば、３ｘＳＳＣ、６８℃でハイブリダイズし、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ及び６８℃で洗浄）で天然型配列にハイブリダイズでき、天然型配列をコードするＤＮＡを同定、単離でき、更にそのような遺伝子も本発明において利用できる。特に、ほとんどの生物は特定のコドン（最適コドン）のサブセットを優先的に用いることが知られているので（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０５、ｐｐ．６１−７２、１９９１等）、宿主微生物に応じて「コドン最適化」を行うことは本発明においても有用であり得る。

【0025】

本発明において、上記の５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオール合成酵素遺伝子群が「発現カセット」として宿主微生物細胞内に導入されることで、より安定的で高レベルの酵素活性を得ることができる。本明細書において、「発現カセット」とは、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子に機能的に結合された転写および翻訳をレギュレートする核酸配列を含むヌクレオチドを意味する。典型的に、本発明の発現カセットは、コード配列から５’上流にプロモーター配列、３’下流にターミネーター配列、場合により更なる通常の調節エレメントを機能的に結合された状態で含み、そのような場合に、発現対象の核酸または発現対象の遺伝子が宿主微生物に導入される。

【0026】

プロモーターとは、構成発現型プロモーターであるか誘導発現型プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、本発明においても好適に使用される。大腸菌ではｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃまたはｔｒｃ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が利用可能である。コリネバクテリウム・グルタミクムではＨＣＥ（ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）プロモーター、ｃｓｐＢプロモーター、ｓｏｄＡプロモーター、伸長因子（ＥＦ−Ｔｕ）プロモーターなどが利用可能である。ターミネーターとしては、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２ターミネーター、ｌａｃターミネーターなどが利用可能である。プロモーターおよびターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントの例として挙げられ得るのは、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などである。好適な調節配列については、例えば、”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９０）に記載されている。

【0027】

上記で説明した発現カセットは、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ファスミド、コスミド、または線状もしくは環状のＤＮＡ等から成るベクターに組み入れて、宿主微生物中に挿入される。本発明ではプラスミドおよびファージが好ましい。これらのベクターは、宿主微生物中で自律複製されるものでもよいし、また染色体に挿入され複製されてもよい。好適なプラスミドは、例えば、大腸菌ではｐＬＧ３３８、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９８、ｐＫＣ３０、ｐＲｅｐ４、ｐＨＳ１、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＨＥ１９．２、ｐＨＳ２、ｐＰＬｃ２３６、ｐＭＢＬ２４、ｐＬＧ２００、ｐＵＲ２９０、ｐＩＮ−ＩＩＩ１１３−Ｂ１、λｇｔ１１またはｐＢｄＣＩなどが挙げられる。バチルス属などの桿菌ではｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４またはｐＢＤ２１４などが挙げられる。コリネバクテリウム属ではｐＳＡ７７またはｐＡＪ６６７などが挙げられる。これらの他にも使用可能なプラスミド等は、”Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。ベクターへの発現カセットの導入は、ＰＣＲによる断片増幅、適当な制限酵素による切り出し、クローニング、及び種々のライゲーションを含む慣用の方法によって可能である。

【0028】

上記ようにして本発明の発現カセットを有するベクターが構築された後、該ベクターを宿主微生物に導入する際に適用できる手法として、例えば、共沈、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、レトロウイルストランスフェクションなどの慣用のクローニング法およびトランスフェクション法が使用される。それらの例は、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｐｕｂｌ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９７、またはＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載されている。

【0029】

上記のようにして得られる形質転換体、例えば、外来Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ、プトレシンアミノトランスフェラーゼ、及びアルデヒドレダクターゼ遺伝子の発現カセットを有するベクター（各々の発現カセットは、別個のまたは同じベクター上に配置されてよい。）により形質転換された遺伝子組換体は、本発明の５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオール生産のために、前記形質転換体の生育及び／または維持に適した条件下で培養及び維持される。各種の宿主微生物細胞に由来する形質転換体のための好適な培地組成、培養条件、培養時間は当業者により容易に設定できる。

【0030】

培地は、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、及び場合により微量元素ないしビタミン等の微量成分を含む天然、半合成、合成培地であってよい。しかし、使用する培地は、培養すべき形質転換体の栄養要求を適切に満たさなければならないことは言うまでもない。

【0031】

炭素源は、Ｄ−グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、オリゴ糖、多糖、でんぷん、セルロース、米ぬか、廃糖密、油脂（例えば大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、ヤシ油など）、脂肪酸（例えばパルミチン酸、リノール酸、リノレン酸など）、アルコール（例えばグリセロール、エタノールなど）有機酸（例えば酢酸、乳酸、コハク酸など）が挙げられる。更にＤ−グルコースを含有するバイオマスであり得る。好適なバイオマスとしては、トウモロコシ分解液やセルロース分解液を例示できる。これらの炭素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。

【0032】

バイオマス由来の原料を用いた場合、製品である５−アミノ−１−ペンタノール、または１，５−ペンタンジオールについて、ＩＳＯ１６６２０−２またはＡＳＴＭ Ｄ６８６６に規定される１４Ｃ法によるバイオベース炭素含有率の測定により他の原料と明確に区別できる。ここで言う他の原料とは、例えば石油、天然ガス、石炭などが挙げられる。

【0033】

窒素源は、含窒素有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、コーンスティープリカー、大豆粉および尿素など）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウムなど）が挙げられる。これらの窒素源は、個別にあるいは混合物として使用することが出来る。

【0034】

また、培地は、形質転換体が有用な付加的形質を発現する場合、例えば抗生物質への耐性マーカーを有する場合、対応する抗生物質を含んでいてよい。それにより、発酵中の雑菌による汚染リスクが低減される。抗生物質としては、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、エリスロマイシン、ストレプトマイシン、スペクチノマイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0035】

上記、セルロースや多糖類などの炭素源を宿主微生物が資化できない場合は、当該宿主微生物に外来遺伝子を導入するなどの公知の遺伝子工学的手法を施すことで、これら炭素源を使用した５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオール生産に適応させることができる。外来遺伝子としては、例えば、セルラーゼ遺伝子やアミラーゼ遺伝子などを挙げることができる。

【0036】

培養は、バッチ式であっても連続式であってもよい。また、いずれの場合にも、培養の適切な時点で追加の前記炭素源等を補給する形式であってもよい。更に、培養は、好適な温度、酸素濃度、ｐＨ等を維持しながら継続されるべきである。一般的な微生物宿主細胞に由来する形質転換体の好適な培養温度は、通常１５℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜３７℃の範囲である。宿主微生物が好気性の場合、発酵中の適切な酸素濃度を確保するために振盪（フラスコ培養等）、攪拌／通気（ジャー・ファーメンター培養等）を行う必要がある。それらの培養条件は、当業者にとって容易に設定可能である。

【0037】

上記の培養物から５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオールを精製する方法は当業者に公知である。原核微生物宿主細胞の形質転換体の場合、５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオールは培養上清中または菌体内に存在するが、必要であれば培養菌体から抽出してもよい。培養菌体から抽出する場合、例えば、培養物を遠心分離して上清と菌体を分離し、ホモジナイザーを利用しつつ、界面活性剤、有機溶媒、酵素等により菌体を破壊し得る。培養上清、及び場合により菌体抽出液から精製する方法としては、ｐＨ調整等によるタンパク質沈澱を利用した除タンパク処理、活性炭を利用した不純物の吸着による除去、イオン交換樹脂等を利用したイオン性物質の吸着による除去を実施した後に、公知の溶媒を使用した抽出、蒸留等で精製される。勿論、製品により目的とされる純度に応じて一部の工程を削除したり、或いはクロマトグラフィーなどの追加の精製工程を実施したりしてもよいことは言うまでもない。

【0038】

以上の説明を与えられた当業者は、本発明を十分に実施できる。以下、更なる説明の目的として実施例を与え、従って、本発明は当該実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において特に断りのない限りヌクレオチド配列は５’から３’方向に向けて記載される。

【実施例】

【0039】

本実施例に示す全てのＰＣＲは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（製品名、タカラバイオ製）を用いて実施した。コリネバクテリウム・グルタミクムの形質転換は、エレクトロポレーション法を用いた。エレクトロポレーション法では、２μｌのプラスミドＤＮＡを６０μｌのコンピテントセルと共に入れた幅０．２ｃｍのキュベットをｇｅｎｅ ｐｕｌｓａｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に装着して、電圧２．５ｋＶ・抵抗２００Ω・キャパシタンス２５μＦのパルスをキュベットに負荷した。

【0040】

１．コリネバクテリウム・グルタミクム用発現用ベクターの構築
コリネバクテリウム・グルタミクム株（ＮＢＲＣ１２１６８）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３０℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ（製品名、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ社製）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。コリネバクテリウム・グルタミクムの伸長因子プロモーター（ＥＦ−ｔｕｆ）領域を、配列番号５、配列番号６記載のプライマーセットによりＰＣＲ増幅した。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。大腸菌とコリネバクテリウム・グルタミクムのシャトルベクターであるｐＣＨのＨＣＥプロモーター配列を削除するために、配列番号７、配列番号８記載のプライマーセットによりインバースＰＣＲした。ｐＣＨのＰＣＲ増幅断片をベクター断片、ＥＦ−ｔｕｆプロモーター増幅断片をインサート断片とし、ｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（製品名、タカラバイオ製）にてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、コリネバクテリウム・グルタミクム用発現用ベクターとしてｐＣＨＰ（ｔｕｆ）を取得した。

【化1】

【0041】

２．Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、プトレシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、及びアルデヒドレダクターゼ遺伝子のクローニング
大腸菌株Ｗ３１１０（ＮＢＲＣ１２７１３）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３７℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅを使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅した。ｃａｄＡ遺伝子増幅のためには配列番号９、１０記載のプライマーセットを使用した。ｙｇｊＧ遺伝子増幅のためには配列番号１１、１２記載のプライマーセットを使用した。ｙｊｇＢ遺伝子増幅のためには配列番号１３、１４記載のプライマーセットを使用した。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。以上より、ｃａｄＡ、ｙｇｊＧ、ｙｇｊＢ遺伝子断片を取得した。ｐＣＨを配列番号１５、配列番号１６記載のプライマーセットによりインバースＰＣＲした。ｐＣＨのＰＣＲ増幅断片をベクター断片、各遺伝子配列をインサート断片とし、ｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｙｇｊＧ発現プラスミドとしてｐＣＣＤ０１、ｃａｄＡ発現プラスミドとしてｐＣＣＤ０２、ｙｊｇＢ発現プラスミドとしてｐＣＣＤ０３を取得した。

【化2】

【0042】

シュードモナス・プチダＦ−１２６株（ＮＢＲＣ１４７９６）をＬＢ培地中（２ｍｌ）で３７℃にて振盪培養した。培養終了後、培養液から菌体を回収し、Ｎｕｃｌｅｏ Ｓｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅを使用してゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型に用い、配列番号１７、配列番号１８記載のプライマーセットによりＰＣＲ増幅した。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。以上より、ｓｐｕＣ遺伝子断片を取得した。ｐＣＨＰ（ｔｕｆ）を配列番号１９、配列番号２０記載のプライマーセットによりインバースＰＣＲした。ｐＣＨＰ（ｔｕｆ）のＰＣＲ増幅断片をベクター断片、ｓｐｕＣ遺伝子配列をインサート断片とし、ｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｓｐｕＣ発現プラスミドとしてｐＣＣＤ０４を取得した。

【化3】

【0043】

３．Ｌ−リジンデカルボキシラーゼ遺伝子、プトレシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、及びアルデヒドレダクターゼ遺伝子共発現プラスミドの作製
ｙｇｊＧ遺伝子とｃａｄＡ遺伝子を同時に発現させるための共発現プラスミドを構築した。即ち、ｐＣＣＤ０２プラスミドを鋳型とし、構造遺伝子の２０ｂｐ上流領域を含む断片を配列番号２１、配列番号２２記載のプライマーセットによりＰＣＲ増幅した。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐＣＣＤ０１プラスミドを鋳型とし、配列番号２３、配列番号２４記載のプライマーセットによりインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つの断片をｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｙｇｊＧ−ｃａｄＡ発現プラスミドとしてｐＣＣＤ０５を取得した。

【化4】

【0044】

ｙｇｊＧ遺伝子、ｃａｄＡ遺伝子とｙｊｇＢ遺伝子を同時に発現させるための共発現プラスミドを構築した。即ち、ｐＣＣＤ０３プラスミドを鋳型とし、構造遺伝子の２０ｂｐ上流領域を含む断片を配列番号２５、配列番号２６記載のプライマーセットによりＰＣＲ増幅した。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐＣＣＤ０５プラスミドを鋳型とし、配列番号２７、配列番号２８記載のプライマーセットによりインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つの断片をｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｙｇｊＧ−ｃａｄＡ−ｙｊｇＢ発現プラスミドとしてｐＣＣＤ０６を取得した。

【化5】

【0045】

ｙｇｊＧ遺伝子、ｃａｄＡ遺伝子、ｙｊｇＢ遺伝子とｓｐｕＣ遺伝子を同時に発現させるための共発現プラスミドを構築した。即ち、ｐＣＣＤ０４プラスミドを鋳型とし、構造遺伝子の２０ｂｐ上流領域を含む断片を配列番号２９、配列番号３０記載のプライマーセットによりＰＣＲ増幅した。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐＣＣＤ０６プラスミドを鋳型とし、配列番号３１、配列番号３２記載のプライマーセットによりインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つの断片をｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｙｇｊＧ−ｃａｄＡ−ｙｊｇＢ−ｓｐｕＣ発現プラスミドとしてｐＣＣＤ０７を取得した。

【化6】

【0046】

４．リジン生産能を持つコリネバクテリウム・グルタミクム株の構築
コリネバクテリウム・グルタミクム株（ＮＢＲＣ１２１６８）からリジン生産株を構築するため、染色体ＤＮＡ上のアスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）への点変異Ｔ３１１Ｉの導入を薬剤耐性マーカー遺伝子とカウンターマーカー（ｓａｃＢ遺伝子）を使用して実施した。すなわち、ｐＣＨプラスミドを鋳型とし、配列番号３３、３４記載のプライマーセットにてインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ），３０ｃｙｃｌｅとした。得られたＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔ（Ｔａｋａｒａ社製）にてリン酸化、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、温度感受性プラスミドとしてｐＣＨＴＳを取得した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｃｉｌｉｓ由来染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３５、３６記載のプライマーセットにてＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐＣＨＴＳプラスミドを鋳型とし、配列番号３７、３８記載のプライマーセットにてＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つの断片をｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｐＣＨＴＳｓａｃＢを取得した。コリネバクテリウム・グルタミクム株（ＮＢＲＣ１２１６８）染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３９、４０記載のプライマーセットにてＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐＣＨＴＳｓａｃＢプラスミドを鋳型とし、配列番号４１、４２記載のプライマーセットにてインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つの断片をｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｐＣＨＤ０１を取得した。ｐＣＨＤ０１プラスミドを鋳型とし、配列番号４３、４４記載のプライマーセットにてインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ），３０ｃｙｃｌｅとした。得られたＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔにてリン酸化、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｐＣＨＤ０２を取得した。ＮＢＲＣ１２１６８株にｐＣＨＤ０２を形質転換し、カナマイシンを含む平板培地にて３０℃培養しコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、４４℃にて一晩培養した。培養液を１０％スクロースを含む平板培地に塗布して３０℃培養し、複数のコロニーを取得した。複数のコロニーのｌｙｓＣ遺伝子配列を解析し、ｌｙｓＣ遺伝子上に正しく変異が導入された株としてＡＫＣ１０２株を取得した。ＬｙｓＣアミノ酸配列の３１１番目のスレオニンがイソロイシンに置換された変異型ＬｙｓＣはリジンによるフィードバック阻害が解除されている。

【化7】

【0047】

５．カダベリン生産能を持つコリネバクテリウム・グルタミクム株の構築
ＡＫＣ１０２株からカダベリン生産株を構築するため、染色体ＤＮＡ上のＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を破壊しつつ、ｐＣＣＤ０２由来のｃａｄＡ発現カセットを挿入した株を構築した。すなわち、コリネバクテリウム・グルタミクム株（ＮＢＲＣ１２１６８）染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号４５、４６記載のプライマーセットにてＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。ｐＣＨＴＳｓａｃＢプラスミドを鋳型とし、配列番号４１、４２記載のプライマーセットにてインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つの断片をｉｎｆｕｉｏｎ ＨＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔにてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｐＣＨＤ０３を取得した。ｐＣＨＤ０３プラスミドを鋳型とし、配列番号４７、４８記載のプライマーセットにてインバースＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（１ｍｉｎ），３０ｃｙｃｌｅとした。一方、ｐＣＣＤ０２プラスミドを鋳型とし、配列番号４９、５０記載のプライマーセットにてＰＣＲした。反応条件は９８℃（１０ｓｅｃ），５５℃（５ｓｅｃ），７２℃（３０ｓｅｃ），３０ｃｙｃｌｅとした。上記２つのＰＣＲ断片をＭｉｇｈｔｙ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｓｅｔにてリン酸化、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。出現コロニーからプラスミドを抽出し、ｐＣＨＤ０４を取得した。ＡＫＣ１０２株にｐＣＨＤ０４を形質転換し、カナマイシンを含む平板培地にて３０℃培養しコロニーを取得した。得られたコロニーを液体培地に稙菌し、４４℃にて一晩培養した。培養液を１０％スクロースを含む平板培地に塗布して３０℃培養し、複数のコロニーを取得した。複数のコロニーのＮ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子周辺配列を解析し、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を分断する形で、ｐＣＣＤ０２に由来するｃａｄＡ遺伝子発現カセット配列が正しく変異が導入された株としてＡＫＣ１０３株を取得した。

【化8】

【0048】

６．５−１アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオール生産能を持つコリネバクテリウム・グルタミクム株の構築
上記ＡＫＣ１０３株にｙｇｊＧ−ｃａｄＡ−ｙｊｇＢ発現プラスミドであるｐＣＣＤ０６を形質転換し、ＡＫＣ１０３／ｐＣＣＤ０６株を取得した。また、ＡＫＣ１０３株にｙｇｊＧ−ｃａｄＡ−ｙｊｇＢ−ｓｐｕＣ発現プラスミドであるｐＣＣＤ０７を形質転換し、ＡＫＣ１０３／ｐＣＣＤ０７株を取得した。なお、ｓｐｕＣのコード化領域の塩基配列を以下に示す。

【化9】

【0049】

７．本発明株による５−アミノペンタノール、１，５−ペンタンジオール生産の確認
前培養として、形質転換体から１コロニーを９０ｍＬの改変ＬＳＳ１培地（５００ｍＬ容三角フラスコ）に植菌し、３０℃、振とう速度１８０ｒｐｍで２４時間培養した。改変ＬＳＳ１培地組成を表１に示す。

【表1】

【0050】

本培養として、前培養液９０ｍＬを３Ｌの改変ＧＭＭＹＥ培地（１０Ｌ容ジャー）に植菌し、３０℃、撹拌速度７００ｒｐｍ、通気速度３Ｌ／ｍｉｎで所定時間培養した。改変ＧＭＭＹＥ培地組成を表２に示す。７０％グルコース水溶液を速度１０ｇ／Ｌ／ｈとなるように連続フィードした。２８％アンモニア水により、ｐＨ７．０になるようにコントロールした。

【表2】

【0051】

所定時間経過後に培養液をサンプリングし、濁度（ＯＤ６００値）を測定した。また、サンプリングした培養液を遠心分離し、培養上清を取得した。培養上清に含まれるリジン、カダベリン、５−アミノペンタノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定した。分析条件は下記の通りである。

【表3】

【0052】

培養上清に含まれる１，５−ペンタンジオールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて測定した。分析条件は下記の通りである。

【表4】

【0053】

分析結果を表５に示す。対照株（１）であるＡＫＣ１０２株ではＬ−リジンのみを、対照株（２）であるＡＫＣ１０３株ではカダベリン（Ｃａｄ）のみを生産するのに対し、発明株（１）であるＡＫＣ１０３／ｐＣＣＤ０６株では５−アミノペンタノール（５ＡＰ）を２．９ｇ／Ｌ生産することを確認した。また、発明株（２）であるＡＫＣ１０３／ｐＣＣＤ０７株では５−アミノペンタノールを４．３ｇ／Ｌ生産し、かつ１，５−ペンタンジオール（１，５ＰＤＯ）を０．１ｇ／Ｌ生産することを確認した。

【表5】

【産業上の利用可能性】

【0054】

本発明は、例えば有機合成用原料又は医薬中間体原料として有用な５−アミノ−１−ペンタノール、及び例えばポリウレタン原料、ポリエステル原料、可塑剤原料、香料原料、合成潤滑油原料、分散染料原料又は医薬中間体原料として有用な１，５−ペンタンジオールの製造技術に利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]