特許 6982664 冬虫夏草ＣＳ−１００菌株及びそれを用いて神経細胞内の異常タンパク質に関連する疾患を治療又は予防する用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6982664

(24)【登録日】2021年11月24日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】冬虫夏草ＣＳ−１００菌株及びそれを用いて神経細胞内の異常タンパク質に関連する疾患を治療又は予防する用途

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/068 20060101AFI20211206BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20211206BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20211206BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20211206BHJP

   C12N 1/14 20060101ALI20211206BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/068ZNA

   A61P25/14

   A61P25/28

   A61P25/00

   C12N1/14 A

【請求項の数】6

【外国語出願】

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2020-125424(P2020-125424)

(22)【出願日】2020年7月22日

(65)【公開番号】特開2021-20895(P2021-20895A)

(43)【公開日】2021年2月18日

【審査請求日】2020年9月11日

(31)【優先権主張番号】108126441

(32)【優先日】2019年7月25日

(33)【優先権主張国】TW

【微生物の受託番号】CGMCC  CGMCC 14350

(73)【特許権者】

【識別番号】509013611

【氏名又は名称】生展生物科技股▲分▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ特許業務法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野 彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 寛之

(72)【発明者】

【氏名】陳威仁

(72)【発明者】

【氏名】曾明中

(72)【発明者】

【氏名】魏▲玉▼珊

【審査官】 藤井 美穂

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０４９２２１６４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２００５−００２８４０８（ＫＲ，Ａ）

【文献】 韓国公開特許第１０−２０１３−００１７９８２（ＫＲ，Ａ）

【文献】 Chem. Commun., 2015, Vol.51, No.41, pp.8652-8655のElectronic Supporting Information，<https://www.rsc.org/suppdata/c5/cc/c5cc00513b/c5cc00513b1.pdf>

【文献】 Biol. Pharm. Bull., 2004, Vol.27, No.7, pp.1126-1129

【文献】 CNS Neurosci. Ther., 2020, Vol.26, pp.90-100, Epub. 2019.7.18

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／０６８

Ｃ１２Ｎ １／００ − １／３８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４３５０として２０１７年７月７日に寄託された、新規冬虫夏草ＣＳ−１００菌株であって、
前記新規冬虫夏草ＣＳ−１００菌株は、神経細胞内でのＱＮ１タンパク質、ＴＤＰ−４３タンパク質、アミロイドβタンパク質、又はそれらの少なくとも任意の２つの組み合わせの蓄積を抑制する活性、並びにシナプスの成長を促進する活性を有し、
前記ＱＮ１タンパク質は、ＴＤＰ−４３タンパク質のＱＮ１ペプチドである新規冬虫夏草ＣＳ−１００菌株。

【請求項2】

前記新規冬虫夏草ＣＳ−１００菌株のｒＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示す配列を含む、請求項１に記載の新規冬虫夏草ＣＳ−１００菌株。

【請求項3】

冬虫夏草ＣＳ−１００菌株又はその菌糸体抽出液を含む筋萎縮性側索硬化症を治療又は予防するための組成物であって、そのうち、前記冬虫夏草ＣＳ−１００菌株は中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４３５０として２０１７年７月７日に寄託されたものである、組成物。

【請求項4】

前記冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体抽出液の濃度は少なくとも１．７ｐｐｍである、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

冬虫夏草ＣＳ−１００菌株又はその菌糸体抽出液を含む神経細胞内でのＱＮ１タンパク質、ＴＤＰ−４３タンパク質、アミロイドβタンパク質、又はそれらの少なくとも任意の２つの組み合わせの蓄積を抑制するための組成物であって、そのうち、
前記冬虫夏草ＣＳ−１００菌株は、中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４３５０として２０１７年７月７日に寄託されたものであり、
前記ＱＮ１タンパク質は、ＴＤＰ−４３タンパク質のＱＮ１ペプチドである、組成物。

【請求項6】

冬虫夏草ＣＳ−１００菌株又はその菌糸体抽出液を含むシナプスの成長を促進するための組成物であって、そのうち、前記冬虫夏草ＣＳ−１００菌株は中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４３５０として２０１７年７月７日に寄託されたものである、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は新規の冬虫夏草菌株及びその用途に関し、特に冬虫夏草ＣＳ−１００菌株及びそれを用いて神経細胞内の異常タンパク質に関連する疾患を治療又は予防する用途に関するものである。

【背景技術】

【0002】

疫学的な統計研究によれば、将来的には神経変性疾患が癌に取って代わり主な死因になるとされている。神経変性疾患の大多数は発生の初期に顕著な症状がみられず、徐々に悪化する上、神経に対して引き起こす破壊の多くが不可逆的な損傷であるため、現状では臨床において神経変性疾患の治療に使用される薬品の数は少なく、治療効果も限られている。

【0003】

さらに、神経変性疾患は、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、多系統萎縮症、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病など種類が多く、各病気の発生はいずれも神経変性と関係しているものの、各病気の発病機序が異なるため、使用する薬品又は治療手段が異なる。例えばパーキンソン病患者は、脳内のアセチルコリン含有量が減少するか又はドーパミンの分泌が不足するため、アセチルコリンの阻害剤を投与することでパーキンソン病患者の症状を効果的に改善することができる。しかし、アセチルコリン含有量の低下に起因しない神経変性疾患に対してアセチルコリンの阻害剤を投与しても、治療効果は発揮されない。

【0004】

従って、現在の臨床では、特定の神経変性疾患に対する特異性を備えた有効な治療手段が極度に不足していることが分かる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明は、新規の冬虫夏草を提供することを主な目的としており、それは冬虫夏草ＣＳ−１００菌株であって、台湾・財団法人食品工業発展研究所に寄託番号ＢＣＲＣ９３０１９６として２０１８年９月２１日に寄託され、さらに中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４３５０として２０１７年７月７日に寄託されたものである。

【0006】

本発明の別の目的は、冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の用途を提供することであり、それを用いて神経細胞内にＱＮ１タンパク質、ＴＤＰ−４３タンパク質などの原因タンパク質が蓄積するのを効果的且つ特異的に抑制することができ、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）などの神経細胞内の異常タンパク質に関連する疾患を治療又は改善する効果を達成することができる。

【0007】

本発明のさらに別の目的は、冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の用途を提供することであり、シナプスの再生を促進又は刺激することができ、シナプス伝達に関連する疾患を治療又は改善する効果を達成することができる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

上述の目的を達成するために、本発明は新規冬虫夏草ＣＳ−１００菌株を開示するが、そのｒＤＮＡ配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１に示す配列が含まれており、ＮＣＢＩでのＢＬＡＳＴによる照合では、その冬虫夏草菌株と１００％同じものはデータベース中に発見されなかった。

【0009】

本発明の実施例中、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株を培養した後、その菌糸体で実験を行ったところ、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体にＱＮ１タンパク質及び／又はＴＤＰ−４３タンパク質の凝集を抑制する機能が見いだされた。筋萎縮性側索硬化症などの特定の神経変性疾患はＱＮ１タンパク質及びＴＤＰ−４３タンパク質の異常と関連があるため、有効量の本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体、その抽出物又は上述の物質を含む組成物を個体に投与することで、当該個体の神経細胞内にＱＮ１タンパク質及び／又はＴＤＰ−４３タンパク質の異常又は蓄積の特徴がある場合に、ＱＮ１タンパク質及び／又はＴＤＰ−４３タンパク質が神経細胞内に蓄積するのを当該組成物が効果的に抑制することができ、これにより、ＱＮ１タンパク質及び／又はＴＤＰ−４３タンパク質の異常が惹起する疾患を治療又は改善する効果が達成される。

【0010】

本発明の実施例中、冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体は、濃度が少なくとも１．７ｐｐｍの菌糸体抽出液に調製される。

【0011】

本発明の別の実施例中、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体は、シナプスの成長を促進する機能を有するため、冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体又はその抽出液はシナプス成長促進剤を調製するのに用いることができる。具体的には、有効量の冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体、その抽出物又は上述の任意の物質を含む組成物を神経変性疾患罹患者に投与することで、シナプスの再生を効果的に促すことができ、シナプスの成長異常又は変性に関連する疾患を治療する効果が達成される。

【0012】

また、本発明のさらに別の実施例中、冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体は、神経細胞内のアミロイドβタンパク質の蓄積を抑制する機能を有するため、有効量の冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体、その抽出物又は上述の任意の物質を含む組成物をアミロイドβタンパク質の蓄積に関連する疾患に罹患した患者へ投与することで、神経細胞内のアミロイドβタンパク質が蓄積する徴候を改善することができ、アミロイドβタンパク質の蓄積に関連する疾患を治療する効果を達成することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】冬虫夏草ＣＳ−１００菌株のｒＤＮＡ ＩＴＳ１／ＩＴＳ２配列である。

【図2】様々な菌株に実施したＡβ_１−４０抑制試験の結果である。

【図3】様々な菌株の神権細胞を保護する有効濃度の測定結果である。

【図4】本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体の神経細胞シナプスに対する再生機能の検出結果である。

【図5A】ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションした細胞を異なる濃度の本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００の菌糸体液で処理した後の細胞生存率の測定結果である。

【図5B】ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションしていない細胞を異なる濃度の本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００の菌糸体液で処理した後の細胞生存率の測定結果である。

【図6A】トランスフェクションしておらず、冬虫夏草の菌糸体液を投入していないＮ２ａ細胞を分化誘導して２日間培養した後の観察結果である。

【図6B】ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションし、冬虫夏草の菌糸体液を投入していないＮ２ａ細胞を分化誘導して２日間培養した後の観察結果である。

【図6C】ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションし、本発明が開示する冬虫夏草の菌糸体液を投入したＮ２ａ細胞を分化誘導して２日間培養した後の観察結果である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株のｒＤＮＡ ＩＴＳ１／ＩＴＳ２配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１及び図１に示す通りであり、ＮＣＢＩでのＢＬＡＳＴによる照合では、冬虫夏草ＣＳ−１００菌株のｒＤＮＡ ＩＴＳ１／ＩＴＳ２配列は、従来の冬虫夏草菌株と異なる新規の菌株であり、台湾・財団法人食品工業発展研究所に寄託番号ＢＣＲＣ９３０１９６として２０１８年９月２１日に寄託され、さらに中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センターに寄託番号ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４３５０として２０１７年７月７日に寄託されたものである。

【0015】

冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の培養方法は以下の通りである。冬虫夏草ＣＳ−１００菌株を平板培地に接種し、１５〜２０℃で３０日間培養すると、平板培地上のコロニーの直径平均は約１２〜１５ｍｍであり、乳白色又は淡黄色を呈しており、コロニーの成長は遅く、ほぼ拡大せず、気生菌糸は短く緻密であり、平板の背面は褐色を呈していた。

【0016】

本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株はＱＮ１タンパク質、ＴＤＰ−４３タンパク質又はアミロイドβタンパク質の細胞内における蓄積を抑制し、シナプスの成長を促進する機能を有しており、医薬組成物、ＱＮ１タンパク質、ＴＤＰ−４３タンパク質又はアミロイドβタンパク質の阻害剤の有効成分として用いることができ、神経変性疾患を治療又は予防する効果を達成するのに用いられる。

【0017】

具体的には、ＱＮ１タンパク質、ＴＤＰ−４３タンパク質の神経細胞内における異常な蓄積は、筋萎縮性側索硬化症の徴候の一つである。

【0018】

本発明で述べる「筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」は、ＡＬＳとも呼ばれている。

【0019】

研究によれば、筋萎縮性側索硬化症罹患者の脳部には、大量の高度リン酸化及びユビキチン化されたＴＤＰ−４３フラグメントが細胞質中に蓄積され、脳神経細胞の機能不全又は線維化、脳神経細胞死の促進、神経細胞シナプスの成長抑制などを引き起こすことが分かっている。現在の研究では、全長ＴＤＰ−４３は４１４個のアミノ酸であり、Ｃ末端はｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｑ）及びａｓｐａｒａｇｉｎｅ（Ｎ）に富み、筋萎縮性側索硬化症の発症のキータンパク質であるとされている。

【0020】

本発明の実施例では、神経芽細胞腫Ｎ２ａ（以下はＮ２ａ細胞と略称）にＴＤＰ−４３をトランスフェクションすることにより、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株がＴＤＰ−４３蓄積及びその毒性を抑制し、筋萎縮性側索硬化症を治療又は予防する効果を達成可能であることを検証した。

【0021】

以下、本発明の効果について説明するため、幾つかの実施例を図表とともに挙げてさらに説明する。

【0022】

以下の実施例中で使用したＮ２ａ細胞は、中央研究院生物医学所（台湾）から得たものである。

【実施例1】

【0023】

冬虫夏草菌糸体液の調製

【0024】

培養した冬虫夏草ＣＳ−１００菌株を脱イオン水で再懸濁し（１．０ｇ／５０．０ｍＬ）、高圧による菌体破壊工程を行い、菌体の破壊後に 不溶物質を取り除いてから、孔径０．２μｍのメンブレンフィルタで濾過し、得られた濾液を乾燥して、本発明が開示する冬虫夏草菌糸体とした。さらに、冬虫夏草菌糸体を冬虫夏草菌糸体液に調製（１．０ｍｇ／ｍＬ）して、下記の実施例で使用した。

【実施例2】

【0025】

Ａβ_１−４０抑制試験

【0026】

様々な菌株を使用し、それぞれは本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株、カワラタケ、ヒメマツタケ、ヤマブシタケであり、実施例１の方式を参考に抽出物を得てから、それぞれリン酸塩緩衝液で濃度５０ｐｐｍの測定対象試料に調製した。それらの測定対象試料１ｍＬを濃度３０μＭに調製したＡβ_１〜４０ペプチドフラグメントと室温下でそれぞれ混合し、２４時間共培養した。培養後に円二色性分散計でＡβ_１〜４０が繊維状集合体を形成しているか否か判定する測定を行ったが、そのうち、基準は２００ｎｍとした。抑制率（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ％）の解析計算においては、全てのデータはバックグラウンド値を先に差し引くものとし、ＣＤ分散計における基準は２００ｎｍとし、且つＡβ_１〜４０の培養前及び培養後をそれぞれ抑制１００％及び０％と定義して、抑制率の計算を行った。試験結果は図２及び下記表１に示す通りである。

【0027】

表１：様々な菌株のＡβ_１〜４０に対する抑制率

【0028】

図２及び表１の結果から、本発明が開示する冬虫夏草菌糸体が確かにアミロイドβタンパク質の集合を効果的に抑制可能であることが分かる。

【実施例3】

【0029】

ＱＮ１抑制試験

【0030】

様々な菌株を使用し、それぞれは本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株、冬虫夏草ＣＳ−３００菌株、ヒメマツタケ、マイタケであり、そのうち、冬虫夏草ＣＳ−３００菌株は、本案出願者が自身でスクリーニングした別の冬虫夏草である。実施例１の方式を参考に上述の菌株それぞれの抽出物を得てから、それぞれリン酸塩緩衝液で濃度５０ｐｐｍに調製し、且つＱＮ１（３０μＭ）ペプチドフラグメントと室温下で７日間共培養を行った。培養完了後、円二色性分散計でＱＮ１ペプチドが繊維状集合体を形成しているか否か判定する測定を行った（基準は２００ｎｍとした）。抑制率の計算においては、全てのデータはバックグラウンド値を先に差し引くものとし、ＣＤ分散計における基準は２００ｎｍとし、且つＱＮ１ペプチドの培養前後をそれぞれ抑制１００％及び０％と定義して、抑制率の計算を行った。試験結果は下記表２に示す通りである。

【0031】

表２の結果から、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体が確かにＱＮ１タンパク質の神経細胞中における蓄積を抑制することができ、ＱＮ１タンパク質病変又は蓄積が惹起する疾患を治療又は改善する有効成分とし得ることが分かる。

【0032】

表２：様々な菌株のＱＮ１に対する抑制率

【0033】

表１及び表２の結果を総合すると、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体又はその抽出物は、神経細胞に対して有害なタンパク質の集合を効果的に抑制することができ、抑制率は５０％超に到達できることが分かる。ＱＮ１タンパク質と筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＡＬＳ）の発病は正の相関関係にあることが先行文献から分かるため、上述の結果は、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体が確かにＱＮ１の抑制機能を有しており、筋萎縮性側索硬化症などのＱＮ１集合に関連する疾患の治療又は予防に用い得ることをはっきりと示している。

【実施例4】

【0034】

有効濃度試験

【0035】

Ａβ_１〜４０を有機溶媒で分散させた後、３０μＭで遠沈管に分注し、且つ凍結乾燥により有機溶媒を除去した。有機溶媒を取り除いた後、それぞれに異なる濃度の試料を加えて、超音波発振器で１０分間振動させて均一に混合した。９６ウェルプレート中、Ｎ２ａ細胞（１０^４ｃｅｌｌ／ｐｅｒ ｗｅｌｌ）をＤＭＥＭ培地（２００μＬ）で１日培養した後、調製済みのＡβ_１〜４０と試料抽出物の混合物２０μＬを加え、培養ウェル毎の総体積は２００μＬとした。そのうち、試料抽出物は実施例１に示す工程を参考に行ったものである。１６時間培養した後、ＤＭＥＭ培地で洗い流して表面上のＡβ_１〜４０と試料を除去してから、引き続き３日間培養した。３日後にＤＭＥＭ培地を交換してからＸＴＴ試薬を２５μＬ加えて、培養器中で２時間培養し、２時間後にＵＶ／Ｖｉｓ分光器で解析を行った。そのうち、Ａβ_１〜４０を添加していない細胞をコントロール群（Ａ_０、生存率は１００％と定義）とし、ＸＴＴ試薬をバックグラウンド値（Ａ_ＸＴＴ、生存率は０％と定義）として、それぞれ各試料の吸収度に対する統計解析を行った。試験結果は図３及び下記表３に示す通りである。

【0036】

【0037】

図３及び表３の結果から、本発明が開示する冬虫夏草菌糸体の濃度が少なくとも１．７７ｐｐｍである場合に、５０％以上の神経細胞をアミロイドβタンパク質などの毒性タンパク質の蓄積・破壊から保護することができ、神経損傷に関連する疾患を改善又は予防する効果が達成されることが分かる。

【実施例5】

【0038】

細胞毒性試験

【0039】

Ａβ_１〜４０を有機溶媒で分散させた後、３０μＭで遠沈管に分注し、且つ凍結乾燥により有機溶媒を除去した。有機溶媒を取り除いた後、それぞれに異なる試料抽出物（５０ｐｐｍ）を加えてから、超音波発振器で混合した。９６ウェルプレート中、Ｎ２ａ細胞（１０^４ｃｅｌｌ／ｐｅｒ ｗｅｌｌ）をＤＭＥＭ培地（２００μＬ）で１日培養した後、調製済みのＡβ_１〜４０と試料の混合物を加えた（２０μＬ、各培養ウェル中の総体積は２００μＬ、各培養ウェル中の最終濃度はＡβ_１〜４０ ３μＭ、試料５ｐｐｍとした）。１６時間培養した後、ＤＭＥＭ培地で洗い流して表面上のＡβ_１〜４０と試料を除去してから、さらに３日間培養した後にＤＭＥＭ培地を交換し、ＸＴＴ試薬を２５μＬ加えて２時間培養してから、ＵＶ／Ｖｉｓ分光器で解析を行った。Ａβ_１〜４０を添加していない細胞をコントロール群（Ａ_０、生存率は１００％と定義）とし、ＸＴＴ試薬をバックグラウンド値（Ａ_ＸＴＴ、生存率は０％と定義）として、それぞれ各試料の吸収度に対する統計解析を行った。試験結果は下記表４に示す通りである。

【0040】

表４：様々な菌株の細胞毒性

【実施例6】

【0041】

シナプスの成長促進試験（１）

【0042】

１２ウェルの細胞培養トレイ表面をＰｏｌｙ−Ｌｙｓｉｎｅでコーティングをした後、培養液を加えて１日間培養した。１日後、Ｎ２ａ細胞（１０^５ｃｅｌｌ／ｐｅｒ ｗｅｌｌ）を、表面修飾を有する１２ウェルの細胞培養トレイ中に入れ、１日間培養した。１日後、測定対象試料（抽出物５０ｐｐｍ及びＡβ_１〜４０ ３０μＭ）を培養液中に加えて１０倍に希釈してから２４時間培養した。２４時間培養した後、培養液を取り除き、ビタミンＡ酸を含む培養液を加えてから再び２４時間培養し、２４時間後に固定細胞を免疫染色してから、蛍光顕微鏡で観察した。結果は図４に示す通りである。

【0043】

図４の結果から、リン酸緩衝液と共培養した神経細胞は、シナプスの平均長さは１７．１±５．５μｍしかないが、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体と共培養した神経細胞は、シナプスの平均長さが３５．３±５μｍであることが分かる。この結果により、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株の菌糸体は神経細胞シナプスの再生を促進する機能を有しており、神経変性関連疾患を効果的に治療又は改善する効果を達成し得ることが示された。

【実施例7】

【0044】

細胞生存率試験

【0045】

Ｎ２ａ細胞を９６ウェルプレートに撒いた後、ＴＤＰ−４３タンパク質をＮ２ａ細胞内にトランスフェクションし、且つそれぞれに異なる濃度の冬虫夏草菌糸体液（実施例１で調製したもの）を加えた。結果は図５に示す通りである。そのうち、細胞生存率の計算方法は以下の通りである。

【0046】

細胞生存率＝（Ａｂｓ_{ｓａｍｐｌｅ}−Ａｂｓ_ＤＭＳＯ）／（Ａｂｓ_{ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ}−Ａｂｓ_ＤＭＳＯ）

【0047】

Ａｂｓ_ＤＭＳＯは、バックグラウンド値である。

【0048】

Ａｂｓ_{ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ}は、菌糸体液で処理していない正常細胞で測定した吸光度である。

【0049】

Ａｂｓ_{ｓａｍｐｌｅ}は、菌糸体液で処理し、トランスフェクションを経た細胞で測定した吸光度である。

【0050】

図５Ａの結果から、ＴＤＰ−４３タンパク質を細胞にトランスフェクションしてから１日後、細胞に対して毒性を生じ、生存率が５２．５％まで低下したが、本発明が開示する冬虫夏草の菌糸体液を投与したことで細胞生存率が上昇したことが分かる。具体的には、本発明が開示する冬虫夏草の菌糸体液を投与していない細胞と比較すると、本発明が開示する冬虫夏草の菌糸体液の濃度が１０、２５及び５０ｐｐｍまで増加すると、細胞生存率が５９．０、６０．４及び６５．９％まで顕著に上昇し、ＴＤＰ−４３タンパク質の集合及び毒性を効果的に抑制することができた。また図５Ｂの結果から、ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションしていないＮ２ａ細胞は、異なる濃度の冬虫夏草菌糸体液の添加の有無に関わらず、細胞生存率に顕著な下降はなかったことが分かる。

【0051】

このことから、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００菌株及びその菌糸体液は、神経細胞内のＴＤＰ−４３タンパク質の蓄積又は集合を確かに変化又は抑制することができ、これにより、筋萎縮性側索硬化症を治療又は予防する効果を効果的に達成し得ることが分かる。

【実施例8】

【0052】

シナプスの成長促進試験（２）

【0053】

実施例１で調製した冬虫夏草の菌糸体液５０ｐｐｍを取り、ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションしたＮ２ａ細胞に投入し、１０μＭのビタミンＡ酸で２日間分化誘導した後、顕微鏡（２０Ｘ）で観察した。また、トランスフェクションしておらず、冬虫夏草の菌糸体液を投入していないＮ２ａ細胞、及び、ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションし、冬虫夏草の菌糸体液を投入していないＮ２ａ細胞を取り、それぞれ１０μＭのビタミンＡ酸で２日間分化誘導した後、顕微鏡（２０Ｘ）で観察した。結果は図６に示す通りである。

【0054】

図６Ａの結果から、ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションしていない正常なＮ２ａ細胞を分化誘導して培養するとシナプスが形成されることが分かる。Ｎ２ａ細胞がＴＤＰ−４３タンパク質のトランスフェクションを経た場合には、そのシナプスの成長が抑制された（図６Ｂ）。一方、図６Ｃに示す通り、ＴＤＰ−４３タンパク質をトランスフェクションしたＮ２ａ細胞に５０ｐｐｍの冬虫夏草ＣＳ−１００菌糸体液を加えた場合、シナプスが再生した。上述の結果により、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００又はその菌糸体液は、神経細胞シナプスの再生を刺激し得るだけでなく、原因タンパク質を伴う神経細胞に対してもそのシナプスを再生させる効果があることが示された。

【0055】

このことから、本発明が開示する冬虫夏草ＣＳ−１００又はその菌糸体を筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患罹患者又は高リスク群へ投与することで、神経細胞のシナプス再生を効果的に刺激し、神経細胞の損傷及びそれに関連する症状の発生を改善又は緩和し得ることが分かる。

【受託番号】

【0056】

ＴＷ中華民国 台湾・財団法人食品工業発展研究所 ２０１８／０９／２１ ＢＣＲＣ ９３０１９６

【0057】

ＣＮ中国大陸 中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター ２０１７／０７／０７ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１４３５０

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【配列表】

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