特許 6983398 皮膚感作性物質評価方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6983398

(24)【登録日】2021年11月26日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】皮膚感作性物質評価方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20211206BHJP

   C12N 15/65 20060101ALI20211206BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20211206BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/10

   C12N15/65 Z

   C12Q1/02

【請求項の数】3

【全頁数】9

(21)【出願番号】特願2017-153098(P2017-153098)

(22)【出願日】2017年8月8日

(65)【公開番号】特開2019-30248(P2019-30248A)

(43)【公開日】2019年2月28日

【審査請求日】2020年6月8日

(73)【特許権者】

【識別番号】592262543

【氏名又は名称】日本メナード化粧品株式会社

(72)【発明者】

【氏名】田中 曜

【審査官】 大久保 智之

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０６２８２２２９（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開２０２０−０７４６９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 評価会議報告書 ARE-Nrf2 Luciferase Test Method（角化細胞株レポーターアッセイ），2015年04月30日，1-6頁，https://www.jacvam.jp/files/list/05/05_08_all.pdf参照

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ ５／００−２８

Ｃ１２Ｎ １５／００−９０

Ｃ１２Ｑ １／００−７０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

分泌型レポータータンパク質であって、レポーターがルシフェラーゼ（発光酵素）及び／又は蛍光物質である分泌型レポータータンパク質をコードする核酸配列の上流にプロモーター配列及びプロモーター配列の上流のエンハンサー領域にＡＲＥ配列を有するレポーターベクターを導入して形質転換することによって樹立されたケラチノサイトに皮膚感作性物質と被験物質を同時に暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性増強作用を評価する方法。

【請求項2】

請求項１記載のレポーター導入ケラチノサイトに皮膚感作性物質と被験物質を同時に暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性抑制作用を評価する方法。

【請求項3】

請求項１記載のレポーター導入ケラチノサイトを含む皮膚感作性増強作用又は皮膚感作性抑制作用の評価用キットであって、前記ケラチノサイトに皮膚感作性物質と被験物質を同時に暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行うための、皮膚感作性増強作用又は皮膚感作性抑制作用の評価用キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分泌型感作性物質応答性レポーターベクターを安定的に組み込み、形質転換した細胞と被験物質とをインキュベートし、インキュベート後の培地を用いた発光強度測定及び／又は蛍光強度測定を実施することを特徴とする、被験物質の皮膚感作性を評価する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体において、アレルギーを誘発する物質（感作性物質）を正当に評価及び検出することは、極めて重要である。これまでに、皮膚感作性物質を評価する方法としては、実験動物に被験物質を適用し、その皮膚等に生じる反応を観察する方法が知られている（非特許文献１、２、３）。しかしながら、これらの方法は、被験物質を評価する試験期間が長く、また、動物愛護等の見地からも短時間かつ動物を用いない皮膚感作性物質評価方法の開発が望まれている。

【0003】

化学物質等により皮膚感作が成立する過程は、複数の段階からなる（非特許文献４、５）。まず、最初の段階では、皮膚感作性物質が生体内のタンパク質と結合し、本来生体内に存在しない物質へと修飾される。次に、抗原提示細胞は、このような物質を抗原として認識すると、細胞内で様々なシグナルが伝達され、細胞膜表面タンパク質の発現変化等を経て、活性化する。活性化した抗原提示細胞は、所属リンパ節へと移動し、その細胞表面に抗原を結合したＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩタンパク質を発現し、共刺激分子と呼ばれるタンパク質を介してＴ細胞と結合し、抗原提示を行う。また、この際、ＩＬ−１、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γなどの多くのサイトカインやケモカインを産生する。このような抗原提示細胞としては、血液中の樹状細胞及び単球、皮膚中のランゲルハンス細胞等が知られている。活性化した抗原提示細胞により、抗原提示を受けたＴ細胞は、記憶Ｔ細胞となり、皮膚感作が成立する。さらに、皮膚におけるケラチノサイトのように、抗原提示に直接関わっていないが、感作性物質に反応して様々なサイトカインを分泌することで、皮膚感作の成立を促進する細胞も存在する。したがって、皮膚感作の成立過程は、複数の細胞が関与し、さらに多くのサイトカインが様々な効果を発揮することで成り立っており、極めて複雑な生体反応である。

【0004】

皮膚感作の成立過程の複雑さから、動物を用いない感作性評価方法の開発は困難であった。しかし近年、皮膚感作の成立過程における３つの主要なメカニズムである（１）皮膚に浸透した皮膚感作性物質の生体タンパク質との結合、（２）生体タンパク質と結合した感作性物質に対する角化細胞の防御反応、（３）樹状細胞（ランゲルハンス細胞）の活性化のそれぞれの生体反応に基づいた評価法がそれぞれ開発されている。それら評価法の代表的なものとしてはそれぞれ、Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ （ＤＰＲＡ）：ペプチド結合性試験（非特許文献６）、ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄ：角化細胞株レポーターアッセイ（非特許文献７）、ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ （ｈ−ＣＬＡＴ）（非特許文献８）が知られている。

【0005】

ＤＰＲＡは、皮膚感作性成立の初期段階の反応であるハプテンとタンパク質の結合性を調べることにより、皮膚感作性の有無を予測する試験法である。皮膚内のタンパク質の代わりに７個のアミノ酸からなる合成ペプチドのシステイン含有ペプチドとリジン含有ペプチドの２種類を使用する。化学物質とそれぞれのペプチドを混合することにより反応させ、混合２４時間後における未反応のペプチド量をＨＰＬＣで分離定量する。化学物質の反応性は、測定ごとのペプチド減少率から平均値を算出し、皮膚感作性を予測評価する（非特許文献６）。

【0006】

ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄは、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ ｐａｔｈｗａｙを利用し、ケラチノサイト由来ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いたレポーターアッセイである。Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ ｐａｔｈｗａｙは、転写因子Ｎｒｆ２、Ｎｒｆ２の抑制因子Ｋｅａｐ１およびＡＲＥが関係する遺伝子発現経路である。Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１と結合し、ＡＲＥに依存して発現する遺伝子群の発現量を制御している。Ｋｅａｐ１のシステイン残基に求電子性の化学物質が結合すると、Ｎｒｆ２はＫｅａｐ１から解離し、核内に移行してＤＮＡ上のＡＲＥに結合する。その結果、下流の遺伝子群の発現が誘導され、化学物質による障害から細胞を保護するために機能する。皮膚感作性を有する多くの化学物質がＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ ｐａｔｈｗａｙを活性化することが知られていることから、皮膚感作性評価法として利用されている。ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄでは、ＡＫＲ１Ｃ２遺伝子（樹状細胞において皮膚感作性物質により発現誘導される遺伝子の１つ）のＡＲＥを融合させたＳＶ４０プロモーターを有するルシフェラーゼ遺伝子のプラスミドを安定的に導入したＨａＣａＴ細胞（ヒトケラチノサイト由来培養細胞株）を用いる。化学物質によりＮｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ ｐａｔｈｗａｙが活性化されるとルシフェラーゼ遺伝子が発現する。基質を添加してルシフェラーゼが触媒する反応の発光強度を測定することにより、化学物質の皮膚感作性を評価する（非特許文献７）。

【0007】

ｈ−ＣＬＡＴでは、樹状細胞のモデルとしてヒト単球系培養細胞であるＴＨＰ-１細胞を用い、被験物質がＴＨＰ-１細胞を活性化する能力を評価する。ＴＨＰ-１細胞に被験物質を添加して２４時間培養した後、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）で蛍光標識したＣＤ８６及びＣＤ５４の特異抗体、およびｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）を用いて細胞を染色し、フローサイトメトリーにより細胞表面分子ＣＤ８６及びＣＤ５４の発現量、並びに細胞生存率を測定する。被験物質で処理した時のＣＤ８６及びＣＤ５４それぞれの平均蛍光強度を、溶媒のみを添加したコントロールと比較し、相対蛍光強度を算出する（非特許文献８）。

【0008】

上記の３試験法は、すでにＯＥＣＤテストガイドラインとして承認されており、皮膚感作性試験代替法として妥当であることが認められている。しかし、いずれの方法にも課題は残されており、ＡＲＥ−Ｎｒｆ２ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｔｅｓｔ Ｍｅｔｈｏｄに関しては、発光強度を測定する際に細胞を溶解する必要があることから、細胞を溶解することなく、生きたままの状態で発光強度を測定し、皮膚感作性を評価することが望まれていた。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１９６９，５２，２６８−２７６

【非特許文献2】Ｓａｔｏ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔａｃｔ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ，１９８１，７，２５５−２５７

【非特許文献3】Ｂｕｅｈｌｅｒ Ｅ．Ｖ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．， １９６５，９１，１７１−１７７

【非特許文献4】多田富雄，免疫学イラストレイテッド 原書第５版，南江堂

【非特許文献5】Ｊａｃｑｕｅｓ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９２，２４５−２５２

【非特許文献6】ＪａＣＶＡＭ 新規試験法提案書 皮膚感作性試験代替法 Ｄｉｒｅｃｔ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ （ＤＰＲＡ）：ペプチド結合性試験 平成２７年３月 国立医薬品食品衛生研究所

【非特許文献7】ＪａＣＶＡＭ 新規試験法提案書 皮膚感作性試験代替法 角化細胞株レポーターアッセイに関する提案 平成２７年８月 国立医薬品食品衛生研究所

【非特許文献8】ＪａＣＶＡＭ 新規試験法提案書 皮膚感作性試験代替法 ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（ｈ−ＣＬＡＴ） 平成２９年３月 国立医薬品食品衛生研究所

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

従って、本発明は、上述した実情に鑑み、被験物質の皮膚感作性の有無及び強弱を、細胞を溶解することなく、生きたままの状態で評価することができる系及び細胞を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、分泌型ＡＲＥ応答性レポーターを導入したケラチノサイトを作製し、このケラチノサイトに被験物質を暴露した後の培地を基質と反応させて発光強度及び／又は蛍光強度を測定することにより、細胞を溶解せずに生きたままの状態で皮膚感作性を評価できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【0012】

すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
[１] 分泌型レポータータンパク質をコードする核酸配列の上流にプロモーター配列及びプロモーター配列の上流のエンハンサー領域にＡＲＥ配列を有するレポーターベクターを導入して形質転換することによって樹立された細胞株。
[２] 前記レポーターがルシフェラーゼ（発光酵素）である、[１]記載の細胞株。
[３] 前記レポーターが蛍光物質である、[１]記載の細胞株。
[４] 前記細胞がケラチノサイトである、[１]〜[３]のいずれか一項記載の細胞株。
[５] 以下の工程を含む、細胞株の製造方法。
（１） エンハンサー領域にＡＲＥ配列を有することを特徴とする分泌型レポータープラスミドを編集、構築する工程。
（２） 工程（１）で得られたレポータープラスミドベクターを細胞に導入する工程。
[６] [１]〜[４]のいずれか一項記載のレポーター導入細胞に被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性を評価する方法。
[７] [１]〜[４]のいずれか一項記載のレポーター導入細胞に被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性増強作用を評価する方法。
[８] [１]〜[４]のいずれか一項記載のレポーター導入細胞に被験物質を暴露し、一定時間培養後の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度測定を行い、その測定結果に基づいて該被験物質の皮膚感作性抑制作用を評価する方法。
[９] [１]〜[４]のいずれか一項記載のレポーター導入細胞を含む、皮膚感作性評価用キット。

【発明の効果】

【0013】

本発明によれば、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐ１−ＡＲＥ ｐａｔｈｗａｙを利用して皮膚感作性を評価することのできる、分泌型ＡＲＥ応答性レポーターを安定的に導入した細胞株及びその製造方法が提供される。本発明の分泌型レポーター安定発現細胞株は、従来のレポーター安定発現細胞株のように、被験物質の皮膚感作性を評価する場合に、細胞溶解といった煩雑な作業を行うことなく、生きたままの状態で測定でき、同じ細胞を用いて細胞生存率などの情報を取得できる。また、本発明の分泌型レポーター安定発現細胞株では、細胞を溶解することなく測定を行うことが可能であるため、一定間隔をおいた連続した測定により、被験物質に対する細胞の時間経過に伴う反応を測定することも可能である。また、被験物質を組み合わせることによって、皮膚感作性増強作用や皮膚感作性抑制作用を評価することもできる。よって、本発明の分泌型レポーター安定発現細胞株は、被験物質の皮膚感作性評価のほか、皮膚感作性増強作用、皮膚感作性抑制作用等の有効性評価などに有用である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

１．分泌型レポーター安定発現細胞株
本発明の分泌型レポーター安定発現細胞株は、ＡＲＥ応答性レポーターを培地中に分泌することを特徴とする。
本発明の分泌型レポーター安定発現細胞株作製方法は、（１）ＡＲＥ応答性分泌型レポータープラスミドを構築する工程と、（２）工程（１）で得られた分泌型レポータープラスミドをケラチノサイトに導入する工程を含む。

【0015】

まず、工程（１）では、ＡＲＥ応答性分泌型レポータープラスミドを構築する。レポーターとしては、蛍光発光、化学発光または比色反応のいずれか１種類以上の測定系で検出できれば特に限定はされないが、例えば、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ等が挙げられる。ルシフェラーゼとしては、生細胞に対して毒性がなく、定量性に優れたものであれば特に限定はされないが、例えば、ＮａｎｏＬｕｃ（ＮａｎｏＬｕｃ；登録商標）などが挙げられる。蛍光タンパク質としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ)、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）等が挙げられる。これらのレポーターは、１種を用いてもよく、２種以上を用いてもよい。プロモーターとしては、例えば、ｍｉｎＰ（ｍｉｎｉｍａｌ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｉｍｉａｎ Ｖｉｒｕｓ ４０ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＣＭＶ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＨＳＶ−ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｈｅｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）等でもよいが、ｍｉｎＰが望ましい。

【0016】

ＡＲＥとは、遺伝子上流に存在する抗酸化剤応答配列（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）または親電子性物質応答配列ＥｐＲＥ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）のことであり、感作性物質応答遺伝子の上流に存在することが知られている。ＡＲＥはレポータープラスミド内に１つ用いてもよく、２つ以上を用いてもよい。

【0017】

分泌型レポーターには分泌シグナル配列が付加されおり、発現したルシフェラーゼ及び／又は蛍光タンパク質は細胞外に分泌される。分泌シグナル配列としては、細胞外への分泌を誘導するものであれば特に限定はされないが、例えば、ＩＬ−６ 分泌シグナル配列などが挙げられる。

【0018】

次に、工程（２）では、ケラチノサイトにレポーターベクターを導入する。ケラチノサイトは、不死化ケラチノサイトでも正常ケラチノサイトでもよいが、不死化ケラチノサイトが好ましい。不死化ケラチノサイトは購入しても作製してもよい。不死化方法については、ケラチノサイトなどの上皮細胞の培養細胞を不死化させ、かつ細胞死を誘導しない方法であれば限定はされないが、例えば、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、ウイルス遺伝子（ＳＶ４０Ｔ、ＨＰＶ Ｅ６−Ｅ７、ＥＢＶ等）による方法などが挙げられる。細胞の由来は哺乳動物であれば特に限定はされず、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ等が挙げられるが、ヒトであることが好ましい。

【0019】

レポーターの種類は、前述のとおりである。レポータープラスミドのケラチノサイトへの導入は、工程（１）で構築したレポーターベクター（ＡＲＥ応答性分泌型レポータープラスミド）をエレクトロポレーション法、トランスフェクション法、マイクロインジェクション法等を用いてケラチノサイトに導入することにより行うことができる。

【0020】

２．皮膚感作性物質の評価方法
本発明の皮膚感作性物質の評価方法は、（１） 分泌型レポーター導入ケラチノサイトに被験物質を暴露する工程と、（２）工程（１）で被験物質を暴露した細胞の培地を用いて発光強度及び／又は蛍光強度を測定する工程を含む。

【0021】

まず、工程（１）では、培地中の分泌型レポーター導入ケラチノサイトに被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下にて、６〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間培養する。また、皮膚感作性物質を活性化又は抑制する物質の評価においては、培地中の分泌型レポーター導入ケラチノサイトに既知の感作性物質と被験物質を添加し、３７℃、５％ＣＯ_２下にて、６〜７２時間、好ましくは２４〜４８時間培養する。

【0022】

次に、工程（２）では、培養終了後、分泌型レポーター導入ケラチノサイトによって培地中に分泌されたルシフェラーゼ及び／又は蛍光タンパク質の発現量を測定する方法として、プレートリーダーを用いたルシフェラーゼアッセイ等を用いることができる。

【0023】

ルシフェラーゼアッセイに用いる基質としては、ライセンスプログラムに基づき、ルシフェラーゼレポーターベクターに適した、購入元指定の試薬キットを用いることができる。

【0024】

本発明の上記分泌型レポーター導入ケラチノサイトは、キット化してもよく、当該キットには、例えば、分泌型レポーター導入ケラチノサイトの培養に適した培地や容器、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることができる。

【0025】

３．分泌型レポーター導入ケラチノサイトの使用方法
本発明の分泌型レポーター導入ケラチノサイトは、動物実験の代替法として、化粧品や皮膚外用剤、化学物質（洗剤、衣服用染料等）の有効性や安全性の評価に用いることができる。例えば、安全性の評価には、皮膚感作性の有無等が挙げられ、有効性の評価としては、皮膚感作性増強作用、皮膚感作性抑制作用の有無等が挙げられる。

【0026】

本発明において、化粧品や医薬品の有効性や安全性の評価、及びスクリーニングは、本発明の分泌型レポーター導入ケラチノサイトに被験物質を暴露し、該細胞の被験物質への応答性を発光または蛍光イメージングによって観察することによって行うことができ、発光強度及び／又は蛍光強度の変化が評価の指標となる。この際、被験物質と暴露しない本発明の分泌型レポーター導入ケラチノサイトを対照とし、その観察結果と比較することで正確な評価が可能となる。また、被験物質の皮膚感作性増強作用、皮膚感作性抑制作用の有無を調べる際には、被験物質を既知の感作性物質と混合して暴露し、一定時間後に発光強度及び／又は蛍光強度を測定し、既知の感作性物質のみを暴露した際のものと比較することによって評価することができる。被験物質は、培地内に溶解させ、細胞に暴露する。

【0027】

被験物質は、主に化粧品及び／又は医薬品に利用できる成分を対象とし、例えば、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品；天然に生じる分子(例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体(例えば、ペプチド擬態物など)；及び天然に生じない分子(例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物)；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどが挙げられる。

【0028】

発光の測定は、発光プレートリーダー等を用いて行うことができる。発光プレートリーダーは、発光測定用に市販されている発光測定装置であれば特に限定はされない。ある一定の時間でのみ測定してもよいが、一定の時間間隔で経時的にレポーターが分泌された培地を採取し測定することにより、細胞によるレポーター発現の変化を観察することができる。

【0029】

蛍光イメージングによる細胞の観察及び測定は、蛍光を可視化できる顕微鏡または蛍光プレートリーダー等を用いて行うことができる。蛍光顕微鏡は、光学顕微鏡本体、及び検出器を備え、生細胞観察用に市販されている蛍光イメージング装置であれば特に限定はされない。観察は、蛍光を直接肉眼で行ってもよく、又は写真撮影をして画像を取得し、該画像に基づいて行ってもよい。写真撮影により得られた画像に基づいて観察する場合、ある一定の時間でのみ撮影して画像を取得してもよいが、一定の時間間隔で経時的に連続撮影（タイムラプス撮影）を行って画像を取得することにより、細胞の変化の動的可視化を行うことができる。

【実施例】

【0030】

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）分泌型レポーター導入ケラチノサイトを用いた被験物質の皮膚感作性評価
まず、ｐＮＬ２．３［ｓｅｃＮｌｕｃ／Ｈｙｇｒｏ］（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のマルチクローニングサイトにｍｉｎＰを、さらにｍｉｎＰの上流にＡＫＲ１Ｃ２遺伝子のＡＲＥを挿入してＡＲＥ応答性分泌型レポーターベクターを構築した。構築したＡＲＥ応答性分泌型レポーターベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ® ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製)を用いてヒト不死化表皮細胞ＨａＣａＴにトランスフェクション法により遺伝子導入した。ＨａＣａＴは、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ｎａｃａｌａｉ社製）を用いて培養した。薬剤選択により安定発現株を樹立し、皮膚感作性物質に反応すると分泌型レポーターの発現が増強する細胞を樹立した。

【0031】

次に、当該細胞を９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１ウェルあたり１万個ずつ播種し、１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭにて２４時間培養後（培養液量はウェル内に１００μＬ）、ウェル内の培地を除き、皮膚感作性陽性物質としてシンナムアルデヒド（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）を最終濃度０、０．９８、１．９５、３．９１、７．８１、１５．６、３１．３、６２．５、１２５μＭ、皮膚感作性陰性物質としてグリセロール（和光純薬工業株式会社製）を最終濃度０、０．９８、１．９５、３．９１、７．８１、１５．６、３１．３、６２．５、１２５μＭとなるように培地中に溶解させて細胞に暴露した。４８時間培養後（培養液量はウェル内に２００μＬ）、それぞれ培地を５０μＬずつ採取し同量の発光基質であるＮａｎｏ Ｌｕｃ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加え、５分間インキュベート後、プレートリーダーにて発光強度を測定した。測定結果を解析した結果、シンナムアルデヒド暴露群では、コントロール群と比較して、発光強度の濃度依存的な増強が認められた（表１）。一方、グリセロール暴露群では、コントロール群と比較して、発光強度の増強は見られなかった（表１）。

【0032】

【表1】

【0033】

以上の結果から、当該細胞を用いれば、皮膚感作性物質であるか否かの評価が非常に詳細にかつ簡便にできることが明らかとなった。また、本評価法は、細胞が生きたまま測定できるので、例えば本評価の後に細胞生存率の測定などを同一サンプルを用いて行うことができる。これに対し、従来法では、発光強度の測定には、細胞溶解処理が必要であり、経時的な観察を行うためには、各日数ごとにサンプルを用意しなければならず、また同一サンプルの経時的な観察を行うことはできなかった。

【0034】

表２に、従来法の皮膚感作性評価方法と本発明の皮膚感作性評価方法の比較を示す。

【0035】

【表2】

【0036】

表２に示した通り、本発明のＡＲＥ応答性分泌型レポーター導入ケラチノサイトによる皮膚感作性評価法は、従来法の皮膚感作性評価法に比較して非常に優れた利点を多数有する。

【産業上の利用可能性】

【0037】

本発明のＡＲＥ応答性分泌型レポーター導入ケラチノサイトを用いた皮膚感作性評価法は、細胞を溶解することなく皮膚感作性の指標となる発光強度を測定し、皮膚感作性の有無を判定することができる。従って、本発明のＡＲＥ応答性分泌型レポーター導入ケラチノサイトを用いた皮膚感作性評価法によれば、動物実験を行わずに医薬品や化粧品原料の安全性や有効性の評価試験を行うことでき、当該細胞は、化粧品や医薬品の製造分野、皮膚科学研究分野などに利用できる。