特許 6983455 高純度ＲＮＡ組成物及びその調製のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6983455

(24)【登録日】2021年11月26日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】高純度ＲＮＡ組成物及びその調製のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20211206BHJP

   C12P 19/34 20060101ALI20211206BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/11 ZZNA

   C12P19/34 Z

【請求項の数】20

【全頁数】109

(21)【出願番号】特願2019-535224(P2019-535224)

(86)(22)【出願日】2017年9月14日

(65)【公表番号】特表2019-533476(P2019-533476A)

(43)【公表日】2019年11月21日

(86)【国際出願番号】US2017051674

(87)【国際公開番号】WO2018053209

(87)【国際公開日】20180322

【審査請求日】2020年9月9日

(31)【優先権主張番号】62/394,711

(32)【優先日】2016年9月14日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】516317171

【氏名又は名称】モデルナティーエックス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100188558

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100195796

【弁理士】

【氏名又は名称】塩尻 一尋

(72)【発明者】

【氏名】スティーヴン・ホグ

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアム・アイッサ

(72)【発明者】

【氏名】エドワード・ジェイ・ミラッコ

(72)【発明者】

【氏名】ジェニファー・ネルソン

(72)【発明者】

【氏名】エイミー・イー・ラビドー

(72)【発明者】

【氏名】ガボール・ブトラ

【審査官】 中村 勇介

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１０２２０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０２／０４８３１０（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 米国特許出願公開第２００３／０１６５８４９（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５３９９６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／１８８９３３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０５２５６５５５（ＵＳ，Ａ）

【文献】 BRENNAN, Sean M.，VIROLOGY，1984年，Vol. 135，pp. 555-560

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

オープンリーディングフレームを含むメッセンジャーＲＮＡを生成する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ鋳型と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を含むヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）と、緩衝液とを含む反応混合物を形成することと、
（ｂ）前記反応混合物をインキュベートし、メッセンジャーＲＮＡを含む組成物を生成することとを包含し、
ここで
ＧＴＰの濃度対ＡＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＣＴＰの濃度の比が２：１または４：１であり、ＧＴＰの濃度対ＵＴＰの濃度の比が４：１である、方法。

【請求項2】

ＧＴＰの濃度対ＡＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＣＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＵＴＰの濃度の比が４：１である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ＧＴＰの濃度対ＡＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＣＴＰの濃度の比が４：１であり、ＧＴＰの濃度対ＵＴＰの濃度の比が４：１である、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記反応混合物がグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記組成物が、逆相補体転写産物を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記メッセンジャーＲＮＡの質量の９０％超が一本鎖全長転写物を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記組成物が、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片を実質的に含まない、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記組成物がセンス配向の一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団を含み、かつ前記センス配向の一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団の８０％超が１００ヌクレオチド以下のヌクレオチド長を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記センス配向の一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団の９０％超が１００ヌクレオチド以下のヌクレオチド長を有する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記組成物中の前記ＲＮＡの質量の０．２５％未満がサイトカイン誘導性のＲＮＡ混入物である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記組成物がサイトカイン誘導性のＲＮＡ混入物を実質的に含まない、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記組成物中の前記ＲＮＡの質量の０．５％未満が逆相補体転写産物である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記逆相補体転写産物が、前記メッセンジャーＲＮＡの少なくとも一部の逆相補体である配列を含む鎖を含むｄｓＲＮＡであるか、またはポリＵ含有配列を含む鎖を含むｄｓＲＮＡである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記メッセンジャーＲＮＡの逆相補体である配列を含む前記鎖、または前記ポリＵ配列を含む前記鎖が、５’三リン酸（５’−ＰＰＰ）で開始する、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記逆相補体転写産物が、目的のポリペプチドをコードする、前記メッセンジャーＲＮＡの５’末端の逆相補体及び／または前記メッセンジャーＲＮＡの３’末端の逆相補体を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記メッセンジャーＲＮＡが目的のポリペプチドをコードするＲＮＡであり、前記目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡの逆相補体が、前記目的のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡのオープンリーディングフレームの全部または一部に相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

オープンリーディングフレームを含むメッセンジャーＲＮＡを生成する方法であって、
（ａ）ＤＮＡ鋳型と、Ｔ７もしくはＴ３ポリメラーゼと、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を含むヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）と、緩衝液とを含む反応混合物を形成することと、
（ｂ）前記反応混合物をインキュベートし、メッセンジャーＲＮＡを含む組成物を生成することとを包含し、
ここで
ＧＴＰの濃度対ＡＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＣＴＰの濃度の比が２：１または４：１であり、ＧＴＰの濃度対ＵＴＰの濃度の比が４：１である、方法。

【請求項18】

ＧＴＰの濃度対ＡＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＣＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＵＴＰの濃度の比が４：１である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ＧＴＰの濃度対ＡＴＰの濃度の比が２：１であり、ＧＴＰの濃度対ＣＴＰの濃度の比が４：１であり、ＧＴＰの濃度対ＵＴＰの濃度の比が４：１である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記反応混合物がグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）をさらに含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項に基づき、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１６年９月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／３９４，７１１号の利益を請求する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
細胞内の核酸、例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を設計、合成及び送達する能力は、治療、診断、試薬の分野及び生物学的アッセイにおける進歩をもたらした。核酸の細胞内翻訳、及び少なくとも１つの目的のコードされたペプチドまたはポリペプチドの産生のプロセスにおいて多くの進歩がなされている。

【0003】

ｍＲＮＡは、ウイルス及びＤＮＡベースの核酸送達アプローチの悪影響を回避しながら、ｍＲＮＡ治療薬が本質的に任意の所望のタンパク質を一過性に発現し得るという点で、大きな治療的可能性を有する。しかしながら、哺乳動物細胞、特にヒト細胞は、自然免疫系の一部としてＲＮＡを含む核酸のセンサーを含み、そしてｍＲＮＡ治療薬を開発するときにはそのような感知及び免疫応答を避けることが望ましい。

【0004】

理論的には、化学合成によって産生されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ治療薬として有望であるが、今日までのこの重要な治療分野における研究の大部分は、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡに焦点を合わせている。なぜならこの酵素的プロセスは、ほとんどのｍＲＮＡ分子の標準的な長さである、約１〜２またはそれ以上のｋＢの、長いＲＮＡの生成を容易にするからである。

【0005】

初期の研究によって、修飾ヌクレオシド、特にシュードウリジンの組み込みが先天性免疫活性化を減少させ、ｍＲＮＡの翻訳を増加させたが、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）及び炎症誘発性サイトカインの残留誘導が残ったことが示された（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３（２）：１６５〜７５）。先天的免疫活性化に少なくとも部分的に関与するものとして、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を同定するヌクレオシド修飾ＩＶＴ ＲＮＡ中の混入物の同定にむかった進歩があった。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるそのような混入物の除去は、ＩＦＮ及び炎症性サイトカインレベルの低下、ひいては初代細胞におけるより高い発現レベルをもたらした（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：ｅ１４２）。注目すべきことに、未修飾のｍＲＮＡは、ＨＰＬＣ精製後により良く翻訳されたが、依然として高レベルのサイトカイン分泌を誘導した。

【0006】

ＷＯ２０１３／１０２２０３号は、ヒトまたは動物細胞への反復または連続的なトランスフェクションのため、特に、ある分化状態から別の分化状態への細胞の再プログラミングのために、ＩＶＴ ｍＲＮＡからｄｓＲＮＡを除去するために使用されるＲＮＡｓｅ ＩＩＩ処理方法を記載する。この方法は、高レベルの再プログラミング因子及び細胞に対するより低い毒性によって証明されるように、減少したレベルのｄｓＲＮＡ及び増大したレベルのインタクトなｓｓＲＮＡを有する調製物をもたらすことを目的としている。しかしながら、そのような方法は、治療用途、特に、ヒトの治療用途のためのｍＲＮＡの調製における使用には適合しない。ＲＮＡｓｅ ＩＩＩは、ｄｓＲＮＡと同様にｓｓＲＮＡを消化することが知られており、そしてｄｓＲＮＡ混入物を除去しようと試みる際に、所望のｓｓＲＮＡ生成物の完全性は必然的に危険にさらされる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】ＷＯ２０１３／１０２２０３号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２３（２）：１６５〜７５

【非特許文献2】Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：ｅ１４２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

したがって、ＩＶＴ調製物中の混入物のレベル及び性質をより良く制御するために、ＩＶＴ生成ｍＲＮＡ調製物中の混入物の性質をより良く理解する必要がある。さらに、治療用途のためのｍＲＮＡの改良された調製方法及びそのような方法に従って製造された高純度組成物に対する必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、少なくとも部分的には、インビトロＲＮＡ合成のための新規方法及び関連生成物の発見を含む。本明細書に記載の方法によって産生されたＲＮＡ転写物は、上記ＲＮＡ転写物を含む定性的及び定量的に優れた組成物をもたらす増強された特性を有する。本明細書に記載の方法によって産生されたＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ならびに改善された免疫サイレンシング及びより良好な安全性プロフィールなどの他の治療的及び診断的ＲＮＡ用途に特に重要な増強された特性を有する。

【0011】

特に、本発明のＩＶＴ ＲＮＡ組成物は、ＩＶＴプロセスと日常的に関連する特定の望ましくない混入物を実質的に含まない。しかしながら、特に、本発明の方法は、ＩＶＴ反応において生成される混入物の性質及びレベルを制御することによって、治療用途に適したｍＲＮＡ組成物に到達し、すなわち、混入物は、その混入物が生成されればそれを除去しようと試みる、当該分野で記載された方法とは対照的に、初期反応において生成されない。理論に拘束されないが、最初からＩＶＴ反応における望ましくない混入物の生成を防止することは、例えば、組成物中の全長インタクトなｍＲＮＡからの翻訳の増大に関して測定可能な、より高い純度及び効力を有する改良された組成物を提供すると考えられる。

【0012】

インビトロ転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であって、逆相補体転写産物を実質的に含まない組成物は、本発明のいくつかの態様において提供される。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの総質量の約５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、または０．５５％未満が、逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約１．０％未満が、逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．５％未満が、逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．２５％未満が、逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．１％未満が、逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．０５％未満が逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．０１％未満が、逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．００５％未満が、逆相補体転写産物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．００１％未満が逆相補体転写産物である。例示的な実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量は、ＬＣ、Ｊ２ Ｅｌｉｓａ、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ、放射標識ＮＴＰを用いたゲル電気泳動、ＬＣＭＳ＋／−ヌクレアーゼまたは化学消化、標識ＮＴＰ、化学的／同位体的／放射活性などで標識されたＮＴＰを用いたＮＭＲ、細胞、生化学的手段、ＲＩＧ−Ｉ ＡＴＰアーゼ活性もしくはＭＳもしくはゲル電気泳動、またはＲＮＡ含有組成物中のＲＮＡの検出及び／または定量に適していることが当技術分野において公知の他の方法によって決定される。

【0013】

いくつかの実施形態では、逆相補体転写産物は、所望のまたは意図するＩＶＴ転写産物であるＲＮＡの領域（例えば、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、または治療用途を意図する長さが５０ヌクレオチドを超える他のＲＮＡ）と完全に相補的である。ＲＮＡ転写物と完全に相補的な産物は、１００％の相補性を有すると考えられる（例えば、逆相補体転写産物の長さにわたって）。他の実施形態では、逆相補体転写産物は、ＲＮＡ転写物の領域と部分的に相補的である。いくつかの実施形態では、逆相補体転写産物は、ＲＮＡ転写産物の領域と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相補性である。さらに他の実施形態では、逆相補体生成物は、ＲＮＡ転写産物の領域と７０％〜９０％、７５％〜９０％、８０％〜９０％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９１％〜９５％、９２％〜９５％、９３％〜９５％、９４％〜９５％、９５％〜９９％、９６％〜９９％、９７％〜９９％、または９８％〜９９％相補性である。

【0014】

当業者は、ＩＶＴ反応において生成される意図しないかまたは望ましくない逆相補体転写産物が、ＩＶＴ反応の意図されるかまたは望まれる産物であるＲＮＡ転写物（例えば、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、または治療用途を意図した長さで５０ヌクレオチドより大きな他のＲＮＡ）に対してのみ相補性を有し得るのではなく、意図または所望のＲＮＡ転写物が生成されるＤＮＡ鋳型の鎖に対する相補性も有し得ることを理解する。理論に拘束されるものではないが、本発明の新規プロセスに従って減少または排除されるＩＶＴ ＲＮＡ組成物を汚染する、特定の意図しないまたは望ましくない転写産物は、意図されるかまたは所望のＲＮＡ転写産物から転写され、ＩＶＴ ＲＮＡ組成物を汚染する、特定の意図されないかまたは望ましくない転写産物は、ＩＶＴ反応に使用されるＤＮＡ鋳型から転写され得る可能性が存在すると考えられる。後者の推定は、可能ではあるが、逆相補体転写産物がｍＲＮＡ転写産物の５’ＵＴＲ及び／またはポリＡテールに主に相補的であることを示し、転写されたｍＲＮＡ中に存在しないＤＮＡ鋳型の一部（例えば、配列エレメント）に相補性である逆相補体転写産物が有意に減少し、そしてある場合には検出不可能であることを示す、本明細書に提示されたデータによって証明されないようである。

【0015】

他の態様において、本発明は、目的のポリペプチドをコードするインビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であり、ここでこの組成物は実質的にサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物を含まない。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．５％未満がサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．２５％未満が、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．１％未満が、サイトカイン誘導性のＲＮＡ混入物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．０５％未満が、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．０１％未満が、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．００５％未満が、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．００１％未満がサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物である。いくつかの実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量は、ＬＣもしくはＭＳもしくはゲル電気泳動、または当該分野で公知の他の方法によって決定される。

【0016】

いくつかの実施形態では、本発明は、目的のポリペプチドをコードするインビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡと薬学的に許容される賦形剤とを含む組成物を特徴とし、ここでこの組成物は低減されたレベルのサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物及び／または逆相補体転写産物を有する。

【0017】

本明細書に記載の本発明の組成物のいくつかの実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物及び／または逆相補体転写産物の合計の質量は、組成物中のＲＮＡの全質量の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、または０．５５％、０．５％、０．４５％、０．４％、０．３５％、０．３％、０．０．２５％、０．２％、０．１５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、または０．００１％未満である。いくつかの実施形態では、組成物中のサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物対ＲＮＡ転写産物（例えば、意図されたまたは所望のＲＮＡ転写物）の比は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、または１：９９である。他の実施形態では、組成物中の逆相補体転写産物対ＲＮＡ転写産物（例えば、意図されたまたは所望のＲＮＡ転写産物）の比は、９９：１、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、７５：２５、７０：３０、６５：３５、６０：４０、５５：４５、５０：５０、４５：５５、４０：６０、３５：６５、３０：７０、２５：７５、２０：８０、１５：８５、１０：９０、５：９５、または１：９９である。

【0018】

混入物の大きさは変化し得る。いくつかの実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物及び／またはＲＮＡ転写産物の長さは、２ヌクレオチド超から最大で全長転写産物（例えば、意図されたまたは所望の転写産物、例えばｍＲＮＡ転写産物）の長さまでである。他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物及び／またはＲＮＡ転写産物の長さは、それぞれ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドを超える長さであり、最大で全長転写産物の長さまでである。他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物及び／またはＲＮＡ転写産物の長さは、２〜５００ヌクレオチド長、１０〜５００ヌクレオチド長、１５〜５００ヌクレオチド長、２０〜５００ヌクレオチド長、３０〜５００ヌクレオチド長、４０〜５００ヌクレオチド長、５０〜５００ヌクレオチド長、１００〜５００ヌクレオチド長、２００〜５００ヌクレオチド長、３００〜５００ヌクレオチド長、４００〜５００ヌクレオチド長、２〜２００ヌクレオチド長、１０〜２００ヌクレオチド長、１５〜２００ヌクレオチド長、２０〜２００ヌクレオチド長、３０〜２００ヌクレオチド長、４０〜２００ヌクレオチド長、５０〜２００ヌクレオチド長、１００〜２００ヌクレオチド長、２００〜３００ヌクレオチド長、３００〜４００ヌクレオチド長、２〜１００ヌクレオチド長、１０〜１００ヌクレオチド長、１５〜１００ヌクレオチド長、２０〜１００ヌクレオチド長、３０〜１００ヌクレオチド長、４０〜１００ヌクレオチド長、または５０〜１００ヌクレオチド長である。

【0019】

当業者は、特定の構造及び／または長さのＲＮＡ混入物が、例えば、少なくとも１５または少なくとも２０または少なくとも２５ヌクレオチド長のＲＮＡ混入物、特に、天然では二本鎖であるＲＮＡ混入物（ｄｓＲＮＡ）が所望されないかまたは望ましくない免疫応答を刺激する傾向が極めて高いことを理解するであろう。そのような混入物の除去は、当技術分野で認識されている特定の方法（例えば、酵素的及び／または精製プロセスまたは方法ステップ）を使用して可能である。しかしながら、例えば、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、または治療用途を目的とした、長さが５０ヌクレオチドを超える他のＲＮＡの生成におけるそのような追加の精製プロセスまたはステップのそれぞれは、例えば、直接ＩＶＴ反応生成物を、混入物を分解または除去しようとするプロセスでのＲＮＡ産物の品質を損ない得る、（１）酵素的条件（例えばＲＮＡの断片を生成するＲＮＡｓｅ処理）及び／または（２）高温非生理学的溶媒条件（例えば、ＨＰＬＣまたはＲＰクロマトグラフィー条件）にさらすことによって、意図する生成物の忠実度の低下の可能性を誘導する。

【0020】

本発明の特定の態様では、所望されないかまたは望ましくない混入物は、例えば、特定の範囲内のサイズ及び質量の分布を有するＲＮＡ種の集団である。例えば、特定の種類の混入物は、任意の個々の種の混入物（すなわち、同じ配列、同じ長さなどのＲＮＡ種）を５％未満有してもよい。他の実施形態では、混入物は、４．５％、４．０％、３．５％、３．０％、２．５％、２．０％、１．５％、１．０％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．００１％、０．０００５％、または０．０００１％未満の任意の個々の種を有し得る。

【0021】

いくつかの実施形態では、逆相補体転写産物は、ＩＶＴ ＲＮＡまたはＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡまたはｄｓ−ｓｓＲＮＡ）の逆相補体である配列を含む鎖を含むＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡまたはｄｓ部分及びｓｓ部分を有するｄｓ−ｓｓＲＮＡハイブリッド）である。ポリＡテールがＤＮＡ鋳型内のポリＡ：Ｔトラクト内にコードされているいくつかの実施形態では、逆相補体産物は、ポリＵ配列を含む鎖、またはＲＮＡ中にポリＡテールを挿入するために当該分野で一般的に使用される他の方法を含む。ポリＵ配列は、例えば、ｎが１以上であるｐｐｐＵ（Ｕ）ｎである。いくつかの実施形態では、（標的ＲＮＡが１００ｎｔのポリＡテールを有するコードされたポリＡテールについては）ｎは１〜１００である。他の実施形態では、ｎは３０または３０〜２００より大きい。例示的な実施形態では、逆相補体産物は５’三リン酸（５’−ＰＰＰ）で開始する。他の実施形態では、逆相補体産物は、５’二リン酸（５’−ＰＰ）または５’一リン酸（５’−Ｐ）で開始する。

【0022】

いくつかの実施形態では、逆相補体転写産物は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体及び／またはＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体を含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’ＵＴＲの全部または一部に相補的な配列を含む。他の実施形態では、ＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡのポリＡテールの全部または一部に相補的な配列を含む。さらに他の実施形態では、３’末端の逆相補体は、テールなしのＲＮＡの逆相補体である。さらに他の実施形態では、逆相補体転写産物は、ＲＮＡの５’末端、３’末端、オープンリーディングフレーム及び／またはポリＡテールの全部もしくは一部、あるいはそれらの任意の組み合わせに相補的な配列を含む。

【0023】

本発明の例示的な態様では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡまたはｄｓ−ｓｓＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、サイトカイン誘発性ＲＮＡ混入物は、ポリＵ配列を含む鎖を含むＩＶＴ ＲＮＡまたはｄｓＲＮＡまたはｓｓＲＮＡの逆相補体である逆配列をいくつかの実施形態では含む鎖である。

【0024】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ ＲＮＡの逆相補体である配列を含む鎖、またはポリＵ配列を含む鎖は、５’三リン酸（５’−ＰＰＰ）で開始する。いくつかの実施形態では、このポリＵ配列は、２０ヌクレオチド長を超える。いくつかの実施形態では、ポリＵ配列は、３０ヌクレオチド長を超える。他の実施形態では、ポリＵ配列は一本鎖である。さらに他の実施形態では、ポリＵ配列は二本鎖である。

【0025】

いくつかの実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体及び／またはＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体を含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’ＵＴＲの全部または一部に相補的な配列を含む。他の実施形態では、ＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡのポリＡテールの全部または一部に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、逆相補体は、５’ＵＴＲの最初の１０〜１５ヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、逆相補体は、５’ＵＴＲの最初の１０〜２０ヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、逆相補体は、５’ＵＴＲの最初の１０〜３０ヌクレオチドに相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、この逆相補体は、５’ＵＴＲの最初の１０〜４０ヌクレオチドに相補的な配列を含む。さらに他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、ＲＮＡの５’末端、３’末端、オープンリーディングフレーム及び／またはポリＡテールの全部または一部、あるいはそれらの任意の組み合わせに相補的な配列を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、２０ヌクレオチド以上の一本鎖三リン酸逆相補体である。他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、２５ヌクレオチド以上の一本鎖三リン酸逆相補体である。他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、３０ヌクレオチド以上の一本鎖三リン酸逆相補体である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、２０〜２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、２０〜１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、２０〜５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、２５〜２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、２５〜１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、２５〜５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、３０〜２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、３０〜１００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、一本鎖三リン酸逆相補体は、３０〜５０ヌクレオチド長である。

【0027】

他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、末端三リン酸−Ａ、三リン酸−Ｃ、または三リン酸−Ｕを有する一本鎖逆相補体である。

【0028】

他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、２０ヌクレオチド以上の二本鎖三リン酸逆相補体である。いくつかの実施形態では、この二本鎖三リン酸逆相補体は、２０〜２００ヌクレオチドを有する。さらに他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、完全な二重鎖である（一本鎖領域ではない）二本鎖三リン酸逆相補体である。他の実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、一本鎖オーバーハングを含む二本鎖三リン酸逆相補体である。

【0029】

本発明のいくつかの態様では、ｄｓＲＮＡは、２０〜１００ヌクレオチド長の鎖を、いくつかの実施形態では含む。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、長さが約２０〜約５０ｂｐの間の二重鎖である。さらに他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１〜１，０００、５〜１，０００、１０〜１，０００、１００〜１，０００、５００〜１，０００、１〜１０、１〜２０、１〜５０、１〜１００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜５０、５〜１００、５〜２００、５〜３００、５〜４００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜１００、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、２０〜２５、２０〜３０、２０〜１００、２０〜２００、２０〜３００、２０〜４００、２０〜５００、３０〜３５、３０〜４０、３０〜１００、３０〜２００、３０〜３００、３０〜４００、または３０〜５００ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１ヌクレオチドから全長転写産物長までの鎖を含む。

【0030】

他の実施形態では、組成物中のＲＮＡの質量の約０．５％未満が、４０塩基対を超えるサイズのｄｓＲＮＡである。

【0031】

産物の純度は、既知の分析方法及びアッセイを用いて評価され得る。本発明の例示的な態様において、逆相補体転写産物またはサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物の量は、高速液体クロマトグラフィー（例えば、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒチップベースの電気泳動システム、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、アクリルアミドゲル、再構成または代替型アッセイによって決定される。このアッセイは、ＲＮＡ調製物のヌクレアーゼ処理（Ｐ１、ＲＮａｓｅＩＩＩ、ＲＮａｓｅＨなど）を用いて実施しても、または用いずに実施してもよい。ヌクレアーゼ消化産物の電気泳動／クロマトグラフィー／質量分析もまた行ってもよい。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡの質量は、ＬＣ−ＭＳ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間）などの質量分析法によって決定される。

【0033】

いくつかの実施形態では、組成物は、例えば全長よりも少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド少ないなど、全長転写物よりも短い長さを有する混入転写物を含む。混入転写物は、全長よりも例えば少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、または９００ヌクレオチド少ないなど、全長転写物よりも短い長さを有するリバース転写産物またはフォワード転写産物（転写産物）を含んでもよい。例示的なフォワード転写物は、例えば、アボーティブ転写物を含む。特定の実施形態では、この組成物は、３０ヌクレオチド未満の三リン酸ポリＵ逆相補体を含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、全長転写物にハイブリダイズした任意の長さの三リン酸ポリＵ逆相補体を含む。他の実施形態では、この組成物は、一本鎖三リン酸フォワード転写物を含む。他の実施形態では、この組成物は、末端三リン酸−Ｇを有する一本鎖ＲＮＡを含む。他の実施形態では、この組成物は、１２未満のヌクレオチドまたは塩基対（フォワードまたはリバース相補体転写物を含む）の一本鎖または二本鎖ＲＮＡを含む。これらの実施形態のいずれにおいても、この組成物は、これらの全長未満の転写産物のうちのいずれか１つまたはそれらの組み合わせの５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％未満を含み得る。

【0034】

他の実施形態では、ＲＮＡは、あるプロセスによって生成されるか、または、
（ａ）ＤＮＡ鋳型と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、及び任意選択的にグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）を含むＮＴＰと、（Ｔ７補因子、例えばマグネシウムを含む緩衝液）とを含む、反応混合物を形成することと、
（ｂ）ＲＮＡが転写されるような条件下で反応混合物をインキュベートすることと、
を包含するプロセスによって調製可能であり、
ここで、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＡＴＰ、及びＵＴＰのうちの少なくとも１つの濃度は、ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのうちのいずれか１つ以上の濃度より少なくとも２倍高いか、またはこの反応物は、ヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）またはヌクレオチド類似体をさらに含み、ここでＮＤＰまたはヌクレオチド類似体の濃度は、ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのうちのいずれか１つ以上の濃度の少なくとも２倍大きい。いくつかの実施形態では、ＧＴＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのいずれか１つの濃度の比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１または少なくとも６：１である。

【0035】

ＧＴＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの濃度の比は、いくつかの実施形態では、それぞれ２：１、４：１及び４：１である。他の実施形態では、ＧＴＰの濃度対、ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの濃度の比は、それぞれ３：１、６：１及び６：１である。この反応混合物は、ＧＴＰ及びＧＤＰを含んでもよく、そしてＧＴＰ＋ＧＤＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのいずれか１つの濃度の比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１または少なくとも６：１である。いくつかの実施形態では、ＧＴＰ＋ＧＤＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの濃度の比は、それぞれ３：１、６：１及び６：１である。

【0036】

さらに他の実施形態では、ＲＮＡは、あるプロセスによって産生されるか、または、
（ａ）ＤＮＡ鋳型と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び任意選択的にグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）と、緩衝液マグネシウム含有緩衝液とを含む反応混合物を形成すること、
（ｂ）ＲＮＡが転写されるような条件下で反応混合物をインキュベートすること、
を包含するプロセスによって調製可能であり、
ここで、反応物中のリン酸塩の有効濃度は、少なくとも１５０ｍＭのリン酸塩、少なくとも１６０ｍＭ、少なくとも１７０ｍＭ、少なくとも１８０ｍＭ、少なくとも１９０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２１０ｍＭまたは少なくとも２２０ｍＭである。この反応物中のリン酸塩の有効濃度は１８０ｍＭであってもよい。いくつかの実施形態における反応物中のリン酸塩の有効濃度は、１９５ｍＭである。他の実施形態では、この反応物中のリン酸塩の有効濃度は２２５ｍＭである。

【0037】

他の実施形態では、ＲＮＡは、あるプロセスによって生成されるか、または、
（ａ）ＤＮＡ鋳型と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、及び任意選択的にグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）と、マグネシウム含有緩衝液とを含む反応混合物を形成すること、
（ｂ）ＲＮＡが転写されるような条件下で反応混合物をインキュベートすること、
を包含するプロセスによって調製可能であり、
ここで、このマグネシウム含有緩衝液は、Ｍｇ２＋を含み、そしてＭｇ２＋の濃度に対するＡＴＰ＋ＣＴＰ＋ＵＴＰ＋ＧＴＰ及び任意選択的にＧＤＰの濃度のモル比は、少なくとも１．０、少なくとも１．２５、少なくとも１．５、少なくとも１．７５、少なくとも１．８５、少なくとも３以上である。Ｍｇ２＋の濃度に対するＡＴＰ＋ＣＴＰ＋ＵＴＰ＋ＧＴＰ及び任意選択的にＧＤＰの濃度のモル比は１．５であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋の濃度に対するＡＴＰ＋ＣＴＰ＋ＵＴＰ＋ＧＴＰ及び任意選択的にＧＤＰの濃度のモル比は１．８８である。いくつかの実施形態では、Ｍｇ２＋の濃度に対するＡＴＰ＋ＣＴＰ＋ＵＴＰ＋ＧＴＰ及び任意選択的にＧＤＰの濃度のモル比は３である。

【0038】

いくつかの実施形態では、この組成物は、ｄｓＲＮａｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ）処理ステップを含まないプロセスによって生成される。他の実施形態では、この組成物は、逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー精製ステップを含まないプロセスによって生成される。さらに他の実施形態では、この組成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製ステップを含まないプロセスによって生成される。

【0039】

ＲＮＡは、いくつかの実施形態では、修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態では、ＲＮＡは未修飾ＲＮＡである。他の実施形態では、ＲＮＡは、ｌｎｃＲＮＡである。さらに他の実施形態では、５０ヌクレオチド長を超えるＲＮＡである。ＲＮＡは、ＵＴＰを含んでもよく、ＵＴＰは修飾ＵＴＰである。

【0040】

いくつかの実施形態では、逆相補体転写産物またはサイトカイン誘導種の量は、
（ａ）ＩＶＴ ＲＮＡを生成するために使用されたのと同一のＩＶＴ条件下でモデルＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型からモデルＲＮＡを含む組成物を生成すること、及び
（ｂ）モデルＲＮＡを含む組成物中の逆相補体転写産物またはサイトカイン誘導種の量をＬＣ−ＭＳによって決定すること、
を包含するプロセスによって間接的に決定され、
ここで、モデルＲＮＡを含む組成物中のＬＣ−ＭＳによる逆相補体転写産物またはサイトカイン誘導種の量は、ＩＶＴ ＲＮＡを含む組成物中の逆相補体転写産物またはサイトカイン誘導種の量を示す。

【0041】

他の態様では、本発明は、ＲＮＡがＲＮａｓｅＩＩＩ処理を受けないか、及び／またはＲＰ精製を受けない、インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡ組成物である。

【0042】

さらに他の態様において、本発明は、目的のポリペプチドをコードするインビトロ転写（ＩＶＴ）一本鎖ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であり、ここでＲＮＡの９８％超が一本鎖であり、この一本鎖のＲＮＡは、異なる長さの転写物を含む。いくつかの実施形態では、異なる長さの転写物を含む一本鎖ＲＮＡは、全長転写物及びアボーティブ転写物を含む。いくつかの実施形態では、一本鎖非全長転写物の８０〜９８％は、アボーティブ転写物を含む。さらに他の実施形態では、一本鎖非全長転写物の９５〜９８％がアボーティブ転写物を含む。

【0043】

使用組成物の単位は、本発明の他の態様において提供される。使用組成物の単位は、目的のポリペプチド及び薬学的に許容される賦形剤をコードするインビトロ転写（ＩＶＴ）一本鎖ＲＮＡであり、ここでこの組成物は、残留有機溶媒を含まない。

【0044】

他の態様において、本発明は、目的のポリペプチドをコードするインビトロ転写（ＩＶＴ）一本鎖ＲＮＡ及び薬学的に許容される賦形剤を含む組成物であり、ここでこの組成物は非免疫原性であり、この一本鎖ＲＮＡは異なる長さの転写物を含む。いくつかの実施形態では、異なる長さの転写物を含む一本鎖ＲＮＡは、全長転写物及びアボーティブ転写物などの断片転写物を含む。断片転写物としては、例えば、非全長センスＲＮＡ、切断型または時期尚早に終結した転写物、ならびに典型的には転写産物の最初の２５ヌクレオチド未満であるアボーティブ転写物が挙げられる。

【0045】

他の態様では、本発明は、ＲＮＡを調製する方法であり、この方法は、
（ａ）ＤＮＡ鋳型と、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び任意選択的にグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）を含むＮＴＰと、緩衝剤、例えば、マグネシウム含有緩衝液とを含む反応混合物を形成すること、及び
（ｂ）ＲＮＡが転写されるような条件下で反応混合物をインキュベートすること、を包含し、
ここで、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＡＴＰ、及びＵＴＰのうちの少なくとも１つの濃度は、ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのうちのいずれか１つ以上の濃度より少なくとも２倍高いか、またはこの反応物は、ヌクレオチド二リン酸（ＮＤＰ）またはヌクレオチド類似体をさらに含み、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体の濃度は、ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのいずれか１つ以上の濃度より少なくとも２倍大きい。いくつかの実施形態では、ＧＴＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのいずれか１つの濃度の比は、ＲＮＡを生成するために、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１または少なくとも６：１である。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＧＴＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの濃度の比は、それぞれ２：１、４：１及び４：１である。他の実施形態では、ＧＴＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの濃度の比は、それぞれ３：１、６：１及び６：１である。さらに他の実施形態では、この反応混合物はＧＴＰ及びＧＤＰを含み、ＧＴＰ＋ＧＤＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰまたはＵＴＰのいずれか１つの濃度の比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１または少なくとも６：１である。他の実施形態では、ＧＴＰ＋ＧＤＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰ及びＵＴＰの濃度の比は、それぞれ３：１、６：１及び６：１である。

【0047】

本明細書に記載の任意の組成物は、反応混合物、例えばＲＰクロマトグラフィーなどの他の方法によって精製されていないＩＶＴ反応の混合物であってもよい。他の態様では、この組成物は対象への治療的投与の準備ができている最終生成物である。

【0048】

本発明の各制限は、本発明の様々な実施形態を包含し得る。したがって、いずれか１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の各制限は、本発明の各態様に含まれ得ることが予想される。本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される構成の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行され得る。

【0049】

添付の図面は一定の縮尺で描かれることを意図していない。図面では、様々な図に示されているそれぞれの同一またはほぼ同一の構成要素は、同様の数字で表されている。明確にするために、あらゆる構成要素があらゆる図面で表示されているとは限らない。図面では以下である。

【図面の簡単な説明】

【0050】

【図1】ｈＥＰＯ化学変異体、ｎＬｕｃ及びビヒクル対照、ならびにＢＪ線維芽細胞におけるショートモデルＲＮＡ−１をスクリーニングするＩＦＮ−βアッセイの結果を示すグラフである。

【図2】ショートモデル転写物のＬＣＭＳ分析の結果を示す。このモデルによって、アボーティブ種が３つの化学物質全てに存在することが示される。上のトレースは、未修飾のショートモデルＲＮＡ−１を示し、中央のトレースは、全てのウリジンをシュードウリジンに修飾し、全てのシチジンを５’Ｏ−メチルで修飾したショートモデルＲＮＡを示し、下のトレースはいくつかのウリジン及びシチジン残基が修飾されたショートモデルＲＮＡ１を示す。

【図3】モデル転写物のＬＣＭＳ分析の結果を示す。このモデルは、ＩＶＴによって調製されたモデルＲＮＡ−４及びｈＥＰＯの不純物プロファイルを示している。

【図4】処理時に免疫刺激生成物を付与するＤＮＡ鋳型の非存在下でＴ７を用いてＲＮＡ鋳型ＲＮＡ転写が行われ得ることが示される。

【図5A】図５Ａ及び図５Ｂは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質の量に対する、過剰のＧＴＰを用いる逆相（ＲＰ）及びＩＶＴの影響を示す。アルファプロセスとＲＰ精製の両方とも、ＲＩＩＩ基質を減少させる。両者を組み合わせることによる相加効果が示されている。図５Ａは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理ｈＥＰＯ Ｇ５材料のキャピラリー電気泳動分析を示す。

【図5B】図５Ｂは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理ｈＥＰＯ Ｇ０材料のキャピラリー電気泳動分析を示す。

【図6】ｈＥＰＯタンパク質発現及びＩＦＮ−βからのトランスフェクションデータを示す。

【図7】異なるプロセスを使用して転写され、ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理された短い転写物のキャピラリー電気泳動分析である。このデータは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理したモデルＲＮＡの効果を示す。

【図8A】ＲＰ−ＩＰ純度法の結果を示す。図８Ａは、等モル方法を用いたＩＶＴ後のＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理を受けたモデルＲＮＡ−４を示す。

【図8B】ＲＰ−ＩＰ純度法の結果を示す。図８Ｂは、過剰のＧＴＰを用いたＩＶＴ後にＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理を受けたモデルＲＮＡ−４を示す。

【図9】ＲＮＡｓｅＩＩＩ処理があったｈＥＰＯのＲＰ分画と、ＲＮＡｓｅＩＩＩ処理がなかったｈＥＰＯのＲＰ分画である。

【図10A】図１０Ａ〜図１０Ｄは、等モル（図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃ）反応後のｈＥＰＯ画分ＲＮａｓｅＩＩＩフラグメントアナライザーデータを示す。ｈＥＰＯは、そのウリジン塩基が１−メチルシュードウリジンとなるように修飾した。ＲＮａｓｅＩＩＩによる処理は、過剰のＧＴＰを用いる方法を用いても感知できるほどの純度の相違を示さなかった。等モルではかなりの基質がある。

【図10B】図１０Ｂは、図１０Ａの続きである。

【図10C】図１０Ｃは、図１０Ａの続きである。

【図10D】図１０Ｄは、未処理の、または等モル条件下でのＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理後のｈＥＰＯ ＥＱ Ｇ５のインビトロＩＦＮβ分析を示す。

【図11A】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＲＰ分画ｈＥＰＯアルファ＋／−ＲＩＩＩ処理のキャピラリー電気泳動分析を示す。図１１Ａ、１１Ｂ及び１１Ｃは、反応において過剰のＧＴＰを用いたＩＶＴの効果を示す。

【図11B】図１１Ｂは、図１１Ａの続きである。

【図11C】図１１Ｃは、図１１Ａの続きである。

【図11D】図１１Ｄは、過剰のＧＴＰを伴うＩＶＴを示し、これはＩＦＮ応答をもたらさなかった。

【図12】Ｊ２抗ｄｓＲＮＡ ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。

【図13】ｄｓＲＮＡがＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理によって除去されることを示す。

【図14】ＩＶＴ特徴付け研究の結果を示しており、過剰のＧＴＰを用いるＩＶＴは低温誘導性サイトカインスパイクに対してそれほど敏感ではないことを示している。

【図15】ＩＶＴ特徴付け研究のヌクレアーゼＰ１の結果を示す。

【図16A】図１６Ａは、等モルプロセス（図１６Ａ）においてＧ５を使用した、異なる化学物質におけるＲＮＡに基づくＩＶＴのＬＣＭＳによる不純物分析を示す。

【図16B】図１６Ｂは、アルファプロセス（図１６Ｂ）においてＧ５を使用した、異なる化学物質におけるＲＮＡに基づくＩＶＴのＬＣＭＳによる不純物分析を示す。

【図17】異なるＩＶＴ条件下でのＢＪ線維芽細胞中のＩＦＮ−βを示す。

【図18】ｄｓＲＮＡがワクシニアによってキャップされ得ないことを示す。

【図19】異なるｄｓＲＮＡ種に対するＣＩＰ処理の効果を示す。

【図20】インビボ実験からのＦＡ純度データを示す。

【図21】ＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮ−β誘導を示す。

【図22】ｈＥＰＯのインビボ発現を示す。

【図23A】図２３Ａ〜２３Ｄは、インビボ実験からのサイトカインＬｕｍｉｎｅｘデータを示す。

【図23B】図２３Ｂは、図２３Ａの続きである。

【図23C】図２３Ｃは、図２３Ａの続きである。

【図23D】図２３Ｄは、図２３Ａの続きである。

【図24】インビボでのＢ細胞活性化頻度を示す。

【図25】短いｄｓＲＮＡを分析したＩＦＮ−βアッセイの結果を示す。このアッセイは、短い５’三リン酸化オリゴのインビトロ分析である。

【図26】２０ｍｅｒ及びポリＵ／Ａ ｄｓＲＮＡを分析したＩＦＮ−βアッセイの結果を示す。

【図27】ＩＦＮ−β応答に関する３’オーバーハングの分析を示す。

【図28】５’オーバーハング、完全二重鎖、及び３’オーバーハングを様々な長さで用いてｄｓＲＮＡ標準を試験するサイトカインアッセイの結果を示す。

【図29】ポリＵ種のインビトロ分析を示すグラフである。

【図30】ｓｓＲＮＡオリゴ標準のインビトロ分析を示すグラフである。

【図31】５’官能価が異なるｄｓＲＮＡオリゴ標準のインビトロ分析を示すグラフである。

【図32】ホスファターゼがｄｓＲＮＡを脱リン酸化し得ないことを実証するグラフである。

【図33】ｓｓＲＮＡ不純物用量反応（ＢＪ線維芽細胞中のＩＦＮβ）を実証するグラフである。

【図34】ｄｓＲＮＡ不純物用量反応（ＢＪ線維芽細胞中のＩＦＮβ）を示すグラフである。

【図35】フォワードオリゴ標準における修飾５’ヌクレオチドのＩＦＮβ応答を示すグラフである。

【図36】逆相補性オリゴ標準上の修飾５’ヌクレオチドに対するＩＦＮβ応答を示すグラフである。

【図37】５’ヒドロキシル官能化ｄｓＲＮＡのＩＦＮβ応答を示すグラフである。

【図38】そのアルファプロセスが等モルプロセスよりも多くのＯＨ（クリーン）を生成することを実証するグラフである。

【図39】１ｕｇのｍＲＮＡについて計算されたｄｓＲＮＡを示すグラフである。

【図40】伝統的なインビトロ転写（ＩＶＴ）プロセス及び形成された不純物の種類を示す概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0051】

タンパク質をコードするポリマーを製造する方法を強化するために、ＲＮＡを生成する新しい方法が開発された。伝統的なインビトロ転写（ＩＶＴ）プロセスを使用して生成されたＲＮＡとは大きく異なる特性を有するＲＮＡ調製物を産生するために、インビトロ転写プロセスに変更を加えてもよいことが発見された。本発明の方法に従って製造されたＲＮＡ調製物（本明細書ではＩＶＴ ＲＮＡ組成物とも呼ばれる）は、上記ＲＮＡ転写物を含む定性的及び定量的に優れた組成物の生成を可能にする特性を有する。広範囲の精製プロセスと組み合わせた場合でさえも、伝統的なＩＶＴ法を使用して製造されたＲＮＡは、本発明のＲＮＡ調製物と定性的及び定量的に異なる。例えば、本発明のＲＮＡ調製物（及びそれを含む組成物）は、伝統的なＩＶＴを用いて製造されたＲＮＡ調製物（及びそれを含む組成物）と比較して免疫原性が低い。本発明の方法に従って生成されたＲＮＡ調製物（本明細書ではＩＶＴ ＲＮＡ組成物とも呼ばれる）は、例えば翻訳時に、定性的及び定量的に優れたタンパク質産生の産生を可能にする特性をさらに有する。例えば、本発明のＲＮＡ調製物から生成されたタンパク質は、伝統的なＩＶＴを用いて製造されたＲＮＡ調製物と比較して免疫原性が低い。

【0052】

さらに、より高い純度でのタンパク質発現レベルの増大が、本明細書に記載のＲＮＡ調製物から生じる。ある機構に拘束されるものではないが、実質的なタンパク質発現レベルは、精製試料中のｍＲＮＡの高い完全性の結果であると考えられている。いくつかの精製手順は、それらの混入物の分解によってあるレベルの混入物を効果的に除去し得るが、医薬品の完全性は悪影響を受ける。例えば、ｍＲＮＡ試料のＲＮＡｓｅ消化は、ＲＮＡ混入物を除去するのに有用であることが先行技術において主張されている。しかしながら、ＲＮＡｓｅ消化はまた、ＩＶＴ反応によって生成された全長転写物の一部を分解することによってｍＲＮＡの完全性を低下させる。先行技術のＩＶＴ／精製プロセスとは対照的に、本発明の方法を用いたｍＲＮＡの完全性は、ＲＮＡｓｅ消化などの手順を用いた除去を必要とするであろう二本鎖転写物を、この方法がほとんどまたは全く生じないので、非常に高い。

【0053】

本明細書中に記載されるプロセスによって産生されるＲＮＡは、治療目的または診断目的のために使用され得る、３０ヌクレオチド長を超える任意のＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、４０、５０、６０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、または１，０００ヌクレオチド長を超えるＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、または１２，０００ヌクレオチド長を超えるＲＮＡである。ＲＮＡは、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、約５００〜約４０００ヌクレオチド長、１０００〜約２０００ヌクレオチド長、７５０〜約１８００ヌクレオチド長、約１５００〜約３０００ヌクレオチド長、約４０００〜約７０００ヌクレオチド長、または約６０００〜約１２０００ヌクレオチド長のＲＮＡである。ｍＲＮＡは修飾されていてもよいし、修飾されていなくてもよい。他の実施形態では、ＲＮＡは、以下：ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、非修飾ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡのうちの１つ以上である。

【0054】

伝統的なＩＶＴ反応は、転写緩衝液中でＤＮＡ鋳型をＲＮＡポリメラーゼならびにＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰを含む等モル量のヌクレオチド三リン酸と共にインキュベートすることによって行われる。この反応から、５’末端グアノシン三リン酸を有するＲＮＡ転写産物が生成される。これらの反応はまた、免疫刺激性であり、かつ付加的な影響を及ぼし得る、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡのような多数の不純物の生成をもたらす。逆相補体の形成を妨げる本発明の方法は、両方の種の自然免疫認識を妨げる。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、等モルのＮＴＰを用いた先行技術の方法を用いて生成されたＲＮＡ調製物よりも有意に低いＴ細胞活性を有するＲＮＡの産生をもたらす。この先行技術は、一連のその後の精製ステップを用いてこれらの望ましくない成分を除去しようと試みている。そのような精製方法は、それらが追加の時間及び資源を含み、そして最終生成物中に残留有機溶媒の混入（医薬製品にとって望ましくない）をもたらすので望ましくない。逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）のようなプロセスを大規模化することは、例えば、耐圧防爆設備、ＨＰＬＣカラム及び高圧、高温、可燃性溶媒等に定格された精製システムなどを利用するため、労力集約的及び資本集約的である。このスケール及び大規模製造の処理能力は、これらの要因によって制限される。ＲＰプロセスにおいて利用されるアルキルアンモニウムイオン対を除去するために、その後の精製もまた必要とされる。対照的に、本明細書に記載の方法は、現在利用されている方法（例えばＲＰ）をさらに向上させる。不純物負荷が低いほど、サイトカイン誘導性混入物を含まない全長ＲＮＡの精製回収率が高くなり、例えば、最初は材料の品質が高い。分取精製としてＲＮａｓｅ ＩＩＩを使用する場合、本発明の修飾ＩＶＴプロセスのさらなる利点は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質が少ないので、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理によって生成される不活性／無関係な切断生成物（分解するが翻訳しないもの）がより少ないということである。ごく微量のｄｓＲＮＡ／ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質しかない場合は、たとえサイトカインがサイレントであっても、タンパク質を翻訳することができる、より最終的なインタクトなＲＮＡ産物（インタクトなキャップ／ＯＲＦ／ポリＡ）が存在する。これにより、その後の精製に対する負担が軽減される。

【0055】

驚くべきことに、本発明の態様によれば、ＩＶＴ反応における１つ以上の反応パラメーターの操作により、先行技術のプロセスを用いて生成される１つ以上の望ましくない混入物なしで高機能ＲＮＡのＲＮＡ調製物が生成されることが発見された。操作され得るＩＶＴ反応における１つのパラメーターは、反応混合物中の１つ以上の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と比較した、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の相対量（例えば、異なるヌクレオチド量または濃度）である。例えば、ＩＶＴ反応は、過剰のヌクレオチド、例えば、一リン酸ヌクレオチド、二リン酸ヌクレオチドもしくは三リン酸ヌクレオチド、及び／または過剰のヌクレオチド類似体及び／またはヌクレオシド類似体を含んでもよい。本発明の方法は、伝統的なＩＶＴ法によって製造された生成物よりも著しく純粋な高収率の生成物を生成する。

【0056】

ヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドの一般構造を有するか、またはヌクレオチドもしくはその一部と構造的に類似している化合物である。特に、ヌクレオチド類似体は、例えば、ヌクレオチドの核酸部分、糖部分及び／またはリン酸基の類似体を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドとしては、例えば、ヌクレオチド一リン酸、ヌクレオチド二リン酸、及びヌクレオチド三リン酸が挙げられる。本明細書で使用されるヌクレオチド類似体は、ヌクレオチドまたはその一部と構造的に類似しているが、典型的なヌクレオチド構造（核酸塩基−リボース−リン酸）を有さない。ヌクレオシド類似体は、ヌクレオシドの一般構造を有するか、またはヌクレオシドもしくはその一部と構造的に類似している化合物である。特に、ヌクレオシド類似体は、例えば、ヌクレオシドの核酸及び／または糖部分の類似体を含むヌクレオシドである。

【0057】

本明細書で使用されるヌクレオシド三リン酸は、リボースに結合した核酸塩基（すなわちヌクレオシド）及び３つのリン酸（すなわちヌクレオチド）を含む分子を指す。ヌクレオチド二リン酸は、同じ分子であるが、２つのリン酸部分を有するものを指す。ヌクレオチド一リン酸は、同じ分子であるが、１つのリン酸部分を有するものを指す。ヌクレオチド一リン酸、ヌクレオチド二リン酸及び三リン酸は、本明細書においてそれぞれＮＭＰ、ＮＤＰ及びＮＴＰと呼ばれる場合がある。ＮＭＰ、ＮＤＰ及びＮＴＰ中のＮは、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、及び修飾ヌクレオチドを含む任意のヌクレオチドを指す。したがって、ＮＤＰ及びＮＴＰという用語は、天然に存在するか、合成であるか、または修飾された任意のヌクレオチドをその中に有する、それぞれヌクレオチド二リン酸及びヌクレオチド三リン酸を指す。

【0058】

天然ヌクレオチド二リン酸としては、少なくともアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、及びウリジン二リン酸（ＵＤＰ）が挙げられる。天然ヌクレオチド三リン酸としては、少なくともアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、５−メチルウリジン三リン酸（ｍ５ＵＴＰ）、及びウリジン三リン酸（ＵＴＰ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＮＤＰ及び／またはＮＴＰは修飾されている。例えば、修飾ＮＤＰまたはＮＴＰは、容易な精製及び単離を可能にするためのハンドルを有し得る。

【0059】

ヌクレオチド三リン酸は、Ｔ７ポリメラーゼなどのポリメラーゼによってＲＮＡ鎖に付加される。対照的に、ヌクレオチド二リン酸及び一リン酸は反応を開始し得る（例えば、最初に転写されるモノマーとして働く）が、Ｔ７ポリメラーゼによって鎖内に組み込まれることはない（例えば、鎖の他の場所に組み込まれることはない）。場合によっては、ＧＤＰなどのヌクレオチド二リン酸を第１のモノマーとして組み込んでもよい。例えば、Ｔ７がＧＤＰで始まり５’ＧＤＰを産生する場合、機能的ＲＮＡが生成され得る。５’ＧＤＰ開始ＲＮＡは、依然としてワクシニアキャッピング酵素の基質である。ＧＭＰのような過剰のＮＭＰが反応物中で使用される場合、５’ＰＯ４を有する転写産物はリガーゼ（複数可）の基質であるので（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（複数可））、キャップをライゲーションすることによって純度を高めてもよい。

【0060】

本発明において有用なヌクレオチド類似体は、構造的にヌクレオチドまたはその一部と類似しているが、例えば、Ｔ７によって重合可能ではない。本明細書で使用されるヌクレオチド／ヌクレオシド類似体（Ｃ、Ｔ、Ａ、Ｕ、Ｇ、ｄＣ、ｄＴ、ｄＡ、ｄＵ、またはｄＧ類似体を含む）としては、例えば、抗ウイルスヌクレオチド類似体、リン酸類似体（可溶性または固定化、加水分解性または非加水分解性）、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、例えばキャップ類似体、または酵素キャッピング用の前駆体／基質（ワクシニア、またはリガーゼ）、キャップまたは５’部分のライゲーション／コンジュゲーションを容易にするための官能基で標識されたヌクレオチド（ＩＲＥＳ）、キャップもしくは５’部分の連結を容易にするために５’ＰＯ４で標識されたヌクレオチド、または化学的もしくは酵素的に切断可能であり得る官能基／保護基で標識されたヌクレオチドが挙げられる。抗ウイルスヌクレオチド／ヌクレオシド類似体としては、限定するものではないが、ガンシクロビル、エンテカビル、テルビブジン、ビダラビン及びシドフォビルが挙げられる。

【0061】

ＩＶＴ反応条件
例示的な態様では、本発明の方法は、ＩＶＴ反応によるＲＮＡの産生を含む。ＩＶＴは、インビトロで合成ポリヌクレオチドを生成するために使用される当該分野で認識されている方法である。インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡは、天然のＲＮＡに構造的に類似することによってタンパク質を一時的に発現するように操作され得る。しかしながら、この薬物クラスには固有の課題があり、特にＩＶＴ ＲＮＡの翻訳効率及び免疫原性の制御に関連している。特に、ＩＶＴ ＲＮＡは、望ましくない自然免疫効果を生み出し、ＨＰＬＣによる極めてストリンジェントな精製手順は、典型的には追加の最終ＲＮＡ生成ステップとして適用される。少量の短い二本鎖ＲＮＡ断片の除去は、このさらなる免疫応答の低下を達成するために極めて重要である。

【0062】

先行技術で使用されている典型的な反応は、高忠実度で適度に高収率の産物を提供する。しかし、この産物にはベースラインレベルの混入物が含まれており、そのうちのいくつかだけが日常的な精製方法を使用して除去され得る。ＩＶＴ反応は、典型的には以下を含む：ＲＮＡポリメラーゼ、例えば１０００〜１２０００Ｕ／ｍＬ、例えば７０００Ｕ／ｍＬという最終濃度の例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ；例えば１０〜７０ｎＭ、例えば４０ｎＭの最終濃度のＤＮＡ鋳型；例えば、０．５〜１０ｍＭ、例えば、それぞれ７．５ｍＭの最終濃度のヌクレオチド（ＮＴＰ）；最終濃度が例えば１２〜６０ｍＭのマグネシウム、例えば４０ｍＭの酢酸マグネシウム；例えば、７〜８．５のｐＨの、例えば、ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓなどの緩衝剤、例えば、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ８。いくつかの実施形態では、５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び／または１ｍＭスペルミジンが含まれ得る。いくつかの実施形態では、転写反応中にＲＮａｓｅ誘導分解を確実に防止するために、ＲＮａｓｅ阻害剤がＩＶＴ反応に含まれる。例えば、マウスＲＮａｓｅ阻害剤は、１０００Ｕ／ｍＬの最終濃度で利用してもよい。いくつかの実施形態では、ピロホスファターゼがＩＶＴ反応に含まれて、各ヌクレオチドが２単位の無機リン酸に組み込まれた後に生成された無機ピロリン酸を切断する。これによって、マグネシウムが溶液中に留まりそしてピロリン酸マグネシウムとして沈殿しないことが確実になる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ無機ピロホスファターゼは、１Ｕ／ｍＬの最終濃度で利用され得る。

【0063】

典型的なインビトロ転写反応は以下のものを含む：
１ 鋳型ｃＤＮＡ １．０μｇ
２ １０×転写緩衝液（４００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１９０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＤＴＴまたはＴＣＥＰ、１０ｍＭスペルミジン）２．０μｌ
３ カスタムＮＴＰ（各２５ｍＭ）７．２μｌ
４ ＲＮａｓｅ阻害剤 ２０Ｕ
５ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ３０００ Ｕ
６ ｄＨ_２Ｏ 最大２０．０μｌ、及び
７ ３７℃で１時間〜５時間のインキュベーション

【0064】

粗ＩＶＴ混合物は、４℃で４〜１２時間貯蔵され得る。次いで、１単位のＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅを用いて元の鋳型を消化する。３７℃で１５分間インキュベートした後、ｄＴレジン、逆相ＨＰＬＣ、またはＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡＣＬＥＡＲ（商標）Ｋｉｔ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）などの精製技術を使用して、製造元の指示に従ってＲＮＡを精製する。例示的なＩＶＴ反応は、使用される成分または成分の量に関して限定的ではない。

【0065】

伝統的な方法と同様に、本発明のＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型、ならびにＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ（または対応する前述の成分の類似体）などの１つ以上のＮＴＰ、及び緩衝液を含む反応混合物を形成することによっても生成してもよい。次いで、ＲＮＡが転写されるような条件下で反応物をインキュベートする。しかしながら、本発明の方法は、過剰量の１つ以上のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の存在が最終生成物に有意な影響を及ぼし得るという驚くべき知見を含む。本発明の方法は、意図しないまたは望ましくない不純物を欠き、かつ反応の有効性に影響を与えることなく、高品質の製品を製造するために使用され得る。

【0066】

本発明のＩＶＴ方法は、反応混合物中のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体の量（例えば、モル量または分量）の変更を含む。いくつかの態様では、１つ以上のヌクレオチド及び／または１つ以上のヌクレオチド類似体を過剰に反応混合物に添加してもよい。過剰のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体は、反応混合物中のＮＴＰのような１つ以上の他のヌクレオチドの量よりも大きい任意の量である。例えば、過剰のヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体は、反応混合物中の他の個々のＮＴＰのそれぞれまたは少なくとも１つの量よりも多い量であってもよいし、または等モル量よりも多い量の他のＮＴＰを指してもよい。

【0067】

反応混合物に含まれるヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体がＮＴＰである実施形態では、ＮＴＰは、反応混合物に含まれる他の３つ全てのＮＴＰよりも高濃度で存在してもよい。他の３つのＮＴＰは、互いに等モル濃度であってもよい。あるいは、他の３つのＮＴＰのうちの１つ以上が、他の１つ以上のＮＴＰとは異なる濃度であってもよい。

【0068】

いくつかの実施形態では、選択されたＮＴＰの過剰とは、反応混合物中の他の個々のＮＴＰのうちのいずれか１つ以上の量よりも２倍または倍（×）、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×、またはさらにはそれより多い。他の実施形態では、選択されたＮＴＰの過剰とは、反応混合物中の他の個々のＮＴＰの合計の量よりも２倍または倍（×）、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×、さらにはそれ以上である。例示的な実施形態では、ＮＴＰは、反応混合物中の他のＮＴＰに対してモル過剰である。例えば、過剰のＮＴＰは、反応混合物中の１以上の他のＮＴＰの、例えば２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１またはそれを超えるモル比で添加されてもよい。他の実施形態では、過剰の選択されたＮＴＰは、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭの濃度、または反応混合物中の他の個々のＮＴＰのいずれか１つ以上の量をさらに超える量、または６０〜１００ｍＭもしくは４．５〜１００ｍＭの範囲である。他の実施形態では、過剰の選択されたＮＴＰは、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭの濃度、または反応混合物中の他のＮＴＰの合計のいずれか１つ以上の量よりもさらに多い。

【0069】

いくつかの例において、反応混合物中の過剰のＮＴＰはＮＴＰ−１であり、反応混合物中の他のＮＴＰは、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４である。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４よりも高濃度でＮＴＰ−１が反応混合物中に存在し、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４はそれぞれ等モル量である。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ−１：ＮＴＰ−２：ＮＴＰ−３：ＮＴＰ−４の比は、少なくとも２：１：１：１、少なくとも３：１：１：１、少なくとも４：１：１：１、少なくとも５：１：１：１、少なくとも６：１：１：１、少なくとも７：１：１：１、少なくとも８：１：１：１、少なくとも９：１：１：１、少なくとも１０：１：１：１、少なくとも１１：１：１：１、少なくとも１２：１：１：１、少なくとも１３：１：１：１、少なくとも１４：１：１：１、少なくとも１５：１：１：１、少なくとも１６：１：１：１、少なくとも１７：１：１：１、少なくとも１８：１：１：１、少なくとも１９：１：１：１であり、それぞれＮＴＰ−１の潜在的なキャップ上限は２０である。いくつかの実施形態では、ＮＴＰ−１：ＮＴＰ−２＋ＮＴＰ−３＋ＮＴＰ−４の比は、少なくとも３：３、少なくとも５：３、少なくとも６：３、少なくとも７：３、少なくとも８：３、少なくとも９：３、少なくとも１０：３、または少なくとも１５：３であり、それぞれ潜在的な上限は２０：３である。

【0070】

他の実施形態では、ＮＴＰ−１は、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４よりも高い濃度で反応混合物中に存在し、ＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３はそれぞれ等モル量であり、ＮＴＰ−４は、反応混合物中に、ＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３より高濃度でかつＮＴＰ−１より低い濃度で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＴＰ−１：ＮＴＰ−４：ＮＴＰ−２：ＮＴＰ−３の比は、少なくとも３：２：１：１、少なくとも４：３：１：１、少なくとも４：２：１：１、少なくとも５：３：１：１、少なくとも５：３：２：２、少なくとも６：４：２：２、少なくとも８：４：２：２、少なくとも９：２：１：１、少なくとも１０：２：１：１、少なくとも１１：２：１：１、少なくとも１２：２：１：１、少なくとも１３：２：１：１、少なくとも１４：２：１：１、少なくとも１５：２：１：１、少なくとも１６：２：１：１、少なくとも１７：２：１：１、少なくとも１８：２：１：１、少なくとも１９：２：１：１であり、それぞれＮＴＰ−１の潜在的な上限は２０である。

【0071】

他の実施形態では、ＮＴＰ−１は、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４よりも高い濃度で反応混合物中に存在し、ＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３はそれぞれ等モル量であり、ＮＴＰ−４は、反応混合物中に、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３未満の濃度で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＴＰ−１：ＮＴＰ−３：ＮＴＰ−２：ＮＴＰ−４の比は、少なくとも３：２：２：１、少なくとも４：３：３：１、少なくとも４：２：２：１、少なくとも５：３：３：１、少なくとも５：３：３：２、少なくとも６：４：４：２、少なくとも８：４：４：２、少なくとも９：２：２：１、少なくとも１０：２：２：１、少なくとも１１：２：２：１、少なくとも１２：２：２：１、少なくとも１３：２：２：１、少なくとも１４：２：２：１、少なくとも１５：２：２：１、少なくとも１６：２：２：１、少なくとも１７：２：２：１、少なくとも１８：２：２：１、少なくとも１９：２：２：１であり、それぞれＮＴＰ−１の潜在的な上限のキャップは２０である。

【0072】

いくつかの実施形態におけるＮＴＰ−１は、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰである。いくつかの実施形態におけるＮＴＰ−２は、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰである。いくつかの実施形態におけるＮＴＰ−３は、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰである。いくつかの実施形態におけるＮＴＰ−４は、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、またはＣＴＰである。

【0073】

いくつかの実施形態では、ＮＴＰはＧＴＰであり、混合物中に、ＡＴＰ、ＣＴＰ、またはＵＴＰのいずれか１つの濃度に対して少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、少なくとも８：１、少なくとも９：１、少なくとも１０：１、少なくとも１１：１、少なくとも１２：１、少なくとも１３：１、少なくとも１４：１、または少なくとも１５：１の比で存在する。ＧＴＰと他のＮＴＰとの比は、約２：１〜約３：１、約２．５：１〜約３．５：１、約３：１〜約４：１、約３．５：１〜約４．５：１、約４：１〜約５：１、約４．５：１〜約５．５：１、約５：１〜約６：１、約５．５：１〜約６．５：１、約６：１〜７：１、約６．５：１〜約７．５：１、約７：１〜約８：１、約７．５：１〜約８．５：１、約８：１〜約９：１、約８．５：１〜約９．５：１、及び約９：１〜約１０：１であってもよい。一実施形態では、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰの濃度に対するＧＴＰの濃度の比は、それぞれ２：１、４：１、及び４：１であってもよい。別の実施形態では、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰの濃度に対するＧＴＰの濃度の比は、それぞれ３：１、６：１、及び６：１であってもよい。

【0074】

反応混合物に含まれるヌクレオチド及び／またはヌクレオチド類似体がＮＤＰまたはヌクレオチド類似体である実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、反応混合物に含まれる４つ全てのＮＴＰよりも高濃度で存在してもよい。４つのＮＴＰは互いに等モル濃度であってもよい。あるいは、４つのＮＴＰのうちの１つ以上が、他のＮＴＰのうちの１つ以上とは異なる濃度であってもよい。

【0075】

他の実施形態では、過剰の選択されたＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、反応混合物中の個々のＮＴＰのうちのいずれか１つ以上の量よりも２倍または倍（×）、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×、さらにはそれ以上である。他の実施形態では、過剰の選択されたＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、反応混合物中の個々のＮＴＰの合計の量よりも２倍または倍（×）、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×またはさらにそれ以上である。例示的な実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、反応混合物中の他のＮＴＰに対してモル過剰である。例えば、過剰のＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、反応混合物中の１以上のＮＴＰの、例えば２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、またはそれを超えるモル比で添加されてもよい。他の実施形態では、過剰の選択されたＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭの濃度、またはさらには反応混合物中の個々のＮＴＰのうちのいずれか１つ以上のＮＴＰの量より高いか、または６０〜１００ｍＭもしくは４．５〜１００ｍＭの範囲である。他の実施形態では、過剰の選択されたＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、１．５ｍＭ、２．０ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭ、３．５４．０ｍＭ、４．５ｍＭ、５．０ｍＭ、５．５ｍＭ、６．０ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭの濃度であるか、またはさらには反応混合物中のＮＴＰの合計のうちのいずれか１つ以上の量を超える。

【0076】

いくつかの例において、反応混合物中のＮＴＰは、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４である。いくつかの実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４よりも高い濃度で反応混合物中に存在し、ここでＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４はそれぞれ等モル量である。いくつかの実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体：ＮＴＰ−１＋ＮＴＰ＋２：ＮＴＰ−３＋ＮＴＰ−４の比は少なくとも４：４、少なくとも５：４、少なくとも６：４、少なくとも７：４、少なくとも８：４、少なくとも９：４、少なくとも１０：４、または少なくとも１５：４であり、それぞれ潜在的な上限キャップは２０：４である。

【0077】

いくつかの実施形態では、過剰のＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、同等またはそれ以上の濃度の４つのＮＴＰのうちの１つと組み合わされる。

【0078】

他の実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４よりも高い濃度で反応混合物中に存在し、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３はそれぞれ、等モル量であり、ＮＴＰ−４は、反応混合物中にＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３より低いかまたは大きい濃度で存在する。例えば、いくつかの実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体：ＮＴＰ−１：ＮＴＰ−３：ＮＴＰ−２：ＮＴＰ−４の比は少なくとも３：２：２：２：１、少なくとも４：３：３：３：１、少なくとも４：２：２：２：１、少なくとも５：３：３：３：１、少なくとも５：３：３：３：２、少なくとも６：４：４：４：２、少なくとも８：４：４：４：２、少なくとも９：２：２：２：１、少なくとも１０：２：２：２：１、少なくとも１１：２：２：２：１、少なくとも１２：２：２：２：１、少なくとも１３：２：２：２：１、少なくとも１４：２：２：２：１、少なくとも１５：２：２：２：１、少なくとも１６：２：２：２：１、少なくとも１７：２：２：２：１、少なくとも１８：２：２：２：１、少なくとも１９：２：２：２：１であり、それぞれＮＤＰまたはヌクレオチド類似体の潜在的な上限キャップは２０である。

【0079】

他の実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４よりも高い濃度で反応混合物中に存在し、ＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３はそれぞれ等モル量であり、ＮＴＰ−１及び／またはＮＴＰ−４は、反応混合物中にＮＴＰ−２及びＮＴＰ−３未満の濃度またはそれより高い濃度で存在する。他の実施形態では、ＮＤＰまたはヌクレオチド類似体は、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４よりも高い濃度で反応混合物中に存在し、ＮＴＰ−１、ＮＴＰ−２、ＮＴＰ−３、及びＮＴＰ−４はそれぞれ互いに異なる量で存在する。

【0080】

いくつかの実施形態では、反応混合物中の過剰のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の上限は、溶解度の限界によって支配される。

【0081】

いくつかの実施形態では、ＮＴＰは、塩ＮＴＰである。例えば、ＮＴＰは、アンモニウムＮＴＰ、トリスＮＴＰ、リチウムＮＴＰ、カリウムＮＴＰ、またはナトリウムＮＴＰであってもよい。

【0082】

本発明の一実施形態では、ＩＶＴ法は、反応混合物へのＮＴＰとＮＤＰの組み合わせの添加を含み得る。ＮＴＰとＮＤＰを組み合わせて反応混合物に過剰に添加してもよい。ＮＴＰとＮＤＰの組み合わせの過剰とは、反応混合物中の他のＮＴＰのうちの少なくとも１つまたは他の全てのＮＴＰのうちの１つ以上の量よりも大きい量である。例えば、過剰のＮＴＰ及びＮＤＰは、反応混合物中の他のＮＴＰの少なくとも１つの量よりも多い量である合計量であってもよい。

【0083】

したがって、いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、そのヌクレオチドの総量がその反応中に過剰に存在する限り、対応するヌクレオチド二リン酸と組み合わせて使用される場合、他のヌクレオチド三リン酸の少なくとも１つに対して等モル量のヌクレオチド三リン酸を含んでも、または過剰に満たないヌクレオチド三リン酸を含んでもよい。対応するヌクレオチド二リン酸は、ヌクレオチド三リン酸と同じ塩基を有するヌクレオチド二リン酸を指す。例えば、ヌクレオチド三リン酸はＧＴＰであってもよく、そしてヌクレオチド二リン酸はＧＤＰであってもよい。

【0084】

いくつかの実施形態では、ＮＴＰとＮＤＰは組み合わせて等モルである。別の実施形態では、ＮＴＰの量は、反応混合物に添加された組み合わせ中のＮＤＰの量よりも多い。ＮＤＰの量は、反応混合物に添加される組み合わせ中のＮＴＰの量よりも多くてもよい。いくつかの実施形態では、過剰のＮＴＰとＮＤＰの組み合わせ混合物は、反応混合物中の他の個々のＮＴＰの量よりも２倍または倍（×）、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×、またはそれよりもさらに大きい。各実施形態では、他の個々のＮＴＰは、反応混合物中に同じ（等モル）で存在しても、または異なる量で存在してもよい。本明細書に記載の倍数差は、反応混合物中の他のＮＴＰの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つ全てとの比較を指す。

【0085】

他の実施形態では、ＮＴＰは、反応混合物中のＮＤＰの量よりも２倍または倍（×）、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×またはさらにそれ以上である。さらに他の実施形態では、ＮＤＰは、反応混合物中のＮＴＰの量よりも２倍または倍（×）、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×、またはさらにそれより大きい。

【0086】

本明細書に記載の各実施形態では、ＮＴＰ及びＮＤＰは、例えば、それぞれＧＴＰ及びＧＤＰであり得、混合物中に少なくとも６倍または倍（×）、７×、８×、９×、１０×、１１×、１２×、１３×、１４×、１５×、１５×〜１００×、１０×〜９０×、１０×〜８０×、１０×〜７０×の濃度で、または反応混合物中のＡＴＰ、ＣＴＰ、またはＵＴＰのいずれか１つの量よりさらに多い量で存在し得る。例示的な実施形態では、ＮＴＰとＮＤＰとの組み合わせは、反応混合物中の他の個々のＮＴＰに対してモル過剰である。例えば、ＮＴＰとＮＤＰの組合せ混合物は、反応混合物中に、例えば２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、またはそれを超えるモル比で添加されてもよい。ＧＴＰ及びＧＤＰ対他のＮＴＰの比は、約２：１〜約３：１、約２．５：１〜約３．５：１、約３：１〜約４：１、約３．５：１〜約４．５：１、約４：１〜約５：１、約４．５：１〜約５．５：１、及び約５：１〜約６：１であってもよい。一実施形態では、ＧＴＰの濃度対ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＵＴＰの濃度の比は、それぞれ３：１、６：１、及び６：１であってもよい。

【0087】

他の実施形態では、ＮＴＰ対ＮＤＰの比、及びいくつかの実施形態では、ＧＴＰ対ＧＤＰは、反応混合物中のプリンヌクレオチド対ピリミジンヌクレオチドの比（Ｐｕ：Ｐｙ）と比較して考慮される。いくつかの実施形態では、ＧＴＰ：ＧＤＰ対Ｐｕ：Ｐｙの比は、反応混合物中で２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１以上である。

【0088】

いくつかの実施形態では、緩衝液はリン酸塩を含む。リン酸塩の有効濃度は、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも１６０ｍＭ、少なくとも１７０ｍＭ、少なくとも１８０ｍＭ、少なくとも１９０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも２１０ｍＭ、少なくとも２２０ｍＭ、または少なくとも２３０ｍＭのリン酸塩である。一実施形態では、リン酸塩の有効濃度は１８０ｍＭである。別の実施形態では、リン酸塩の有効濃度は１９５ｍＭである。

【0089】

別の実施形態では、緩衝剤はマグネシウムを含む。この緩衝液は、少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．２５、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．７５、少なくとも１．８、及び少なくとも１．８５または３というＭｇ^２＋のモル濃度に対するＡＴＰ＋ＣＴＰ＋ＵＴＰ＋ＧＴＰ及び任意選択的にＧＤＰの濃度の比を有してもよい。他の実施形態では、この比は１．０、１．１、１．２、１．２５、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．７５、１．８、１．８５、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９もしくは３またはこれらの変数の任意の範囲である。一実施形態では、この比は１．５である。別の実施形態では、上記モル比は、１．８８である。一実施形態では、この比は３である。

【0090】

本発明の例示的な態様では、ＩＶＴ反応（反応混合物）は、ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、ＳＰ６、Ｔ３などを含む。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、例えばＴ７ポリメラーゼは、５Ｕ／μｌ超、１０Ｕ／μｌ超、２０Ｕ／μｌ超、５０Ｕ／μｌ超、または１００Ｕ／μｌ超の濃度で含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ポリメラーゼの濃度は、反応混合物１μｌあたり約１〜約２５０Ｕ、例えば、約１〜約１００Ｕ／μｌ、または約１００〜約２５０Ｕ／μｌの範囲である。いくつかの実施形態では、Ｔ７ポリメラーゼ濃度は、約３０〜約６０Ｕ／μｌ、約６０〜約８０Ｕ／μｌ、約８０〜約１００Ｕ／μｌ、約１００〜約１５０Ｕ／μｌ、または約１５０〜約２００Ｕ／μｌの範囲である。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ、例えばＴ７ポリメラーゼは、７、１４、２５、５０、７５、または１４０の濃度で含まれる。

【0091】

本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ鋳型とは、ＲＮＡポリメラーゼのためのポリヌクレオチド鋳型を指す。本明細書に記載の方法に従って有用なＤＮＡ鋳型は、いくつかの実施形態では、例えば目的のポリペプチドをコードする目的の遺伝子を含む。いくつかの実施形態におけるＤＮＡ鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えば、目的の遺伝子の５’側に位置し、かつ作動可能に連結されたＴ７プロモーター、及び任意選択的に、目的の遺伝子の３’に位置するポリＡテールをコードする配列を含む。

【0092】

当該分野で公知のＲＮＡポリメラーゼは、本発明の方法において使用され得る。ＲＮＡポリメラーゼとしては、限定するものではないが、ファージＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、及び／または突然変異型ポリメラーゼ、例えば、限定するものではないが、修飾型核酸を取り込むことができるポリメラーゼが挙げられる。非限定的な例として、ＲＮＡポリメラーゼは、未修飾のＲＮＡポリメラーゼと比較して、２’修飾ヌクレオチド三リン酸を取り込む能力の増大を示すように修飾されてもよい。

【0093】

本明細書中で使用される場合、「目的の遺伝子」とは、目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドをいう。文脈次第で、目的の遺伝子とは、デオキシリボ核酸、例えば、ＲＮＡ転写物に転写され得るＤＮＡ鋳型中の目的の遺伝子、またはリボ核酸、例えば、ＲＮＡ転写物中の目的の遺伝子（インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボで、コードされた目的のポリペプチドを生成するために翻訳され得る）を指す。目的のポリペプチドとしては、限定するものではないが、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質またはペプチドなどが挙げられる。

【0094】

「ＲＮＡ転写物」とは、ＤＮＡ鋳型及びＲＮＡポリメラーゼを用いたＩＶＴ反応によって産生されたリボ核酸を指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡであり、典型的には目的の遺伝子のコード配列及びポリＡテールを含む。ＲＮＡ転写物は、ｍＲＮＡを含む。ＲＮＡ転写物は修飾、例えば修飾ヌクレオチドを含んでもよい。本明細書中で使用される場合、ＲＮＡ転写物という用語は、ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ「ｍｍＲＮＡ」または修飾ｍＲＮＡ、及び一次構築物を含み、それらと交換可能である。

【0095】

純度
本発明の方法に従って製造されたＲＮＡは、驚くほど純粋でありそして完全性が高い。それは伝統的なＩＶＴ法に従って製造されたＲＮＡ調製物よりも混入物が少ない。いくつかの実施形態では、それは伝統的なＩＶＴ方法に従って製造されたＲＮＡ調製物よりも免疫刺激混入物が少ない。この混入物は、所望のＲＮＡ以外の反応によって生成されたＲＮＡ断片である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ断片混入物は、逆相補体転写産物及び／またはサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物である。他の実施形態では、ＲＮＡ断片混入物は、二本鎖ＲＮＡまたは免疫原性混入物である。

【0096】

いくつかの実施形態における本発明のＲＮＡ調製物は、伝統的なＩＶＴ法に従って製造されたＲＮＡ調製物よりも混入物が少ない。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ調製物は、伝統的なＩＶＴ方法に従って生成されたＲＮＡ調製物よりも少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％混入物が少ない。他の実施形態では、本発明のＲＮＡ調製物は、混入物を実質的に含まない。他の実施形態では、本発明のＲＮＡ調製物は混入物を１００％含まない。

【0097】

したがって、いくつかの態様における本発明は、さらなる精製ステップを必要とせずに、逆相補体転写産物を実質的に含まないＩＶＴ ＲＮＡの調製を含む。本明細書中で使用される場合、「逆相補体転写産物」という用語は、ＲＮＡ鋳型転写から生じるＲＮＡ分子をいう。逆相補体転写産物は、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ鋳型転写産物であってもよい。理論に拘束されるものではないが、逆相補体産物は、主にまたは全てＲＮＡ鋳型転写産物であると考えられる。逆相補体産物がＤＮＡ鋳型転写産物から構成される場合、その産物は、例えばＤＮＡ鋳型由来のＴ７プロモーター領域に相補的なヌクレオチド配列を含むであろう。今日までに特徴付けられている逆相補体産物は、例えばＴ７プロモーター領域に相補的な配列を主には含まない。いくつかの実施形態では、逆相補体転写産物は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、これはＩＶＴ ＲＮＡの少なくとも一部の逆相補体である配列をコードする一本鎖を含み得る。他の実施形態では、逆転写相補体産物は、ポリＵ配列を含む一本鎖を有するｄｓＲＮＡであってもよい。目的のポリペプチドをコードする逆相補鎖またはポリＵ配列をコードする鎖のいずれもが、５’三リン酸（５’ｐｐｐ）で開始し得る。ＲＮＡ鋳型転写産物は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体か、及び／またはＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体を含んでもよい。さらに、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’ＵＴＲの全部または一部に相補的である場合がある。逆相補体は、５’ＵＴＲの最初の１０〜１５個、最初の５〜１５個、最初の５〜２０個、最初の１０〜２０個、最初の１５〜２５個のヌクレオチドに相補的な配列を含んでもよい。同様に、ＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡのポリＡテールの全部または一部に相補的であってもよい。逆相補体転写産物は、ＲＮＡ上のどこからでも鋳型化され得、したがって鋳型上で任意のサイズであっても、または任意の位置に相補的であってもよい。例えば、逆相補体生成物は、５ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、４０ｍｅｒ、５０ｍｅｒ、６０ｍｅｒ、７０ｍｅｒ、１００ｍｅｒ、２００ｍｅｒなど、最大で意図される生成物の全長か、または所望の生成物の全長までであり得る。

【0098】

本発明は、ＩＶＴ ＲＮＡ及び実質的に逆相補体転写産物を含まない薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＩＶＴにおいて、逆相補体転写産物を実質的に含まないＲＮＡは、総ＲＮＡの質量の約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４．５％、４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、または０．５５％、０．５％、０．４５％、０．４％、０．３５％、０．３％、０．０２５％、０．２％、０．１５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、または０．００１％未満を構成する逆相補体転写産物を含む。ＲＮＡ組成物の質量は、当該分野で公知の任意の手段によって決定され得る。ＲＮＡの質量を決定するための方法の例としては、液体クロマトグラフィー及び質量分析が挙げられる。

【0099】

理論に拘束されるものではないが、本発明のいくつかの実施形態では、混入物は、より長いＲＮＡの状況において二本鎖構造を形成するＩＶＴ ＲＮＡの集団に結合した一本鎖逆相補体であると考えられる。Ｔ７は、アボーティブ（センス鎖）新生ＲＮＡならびに全長産物新生ＲＮＡを鋳型にしてもよい。ＲＮＡ鋳型転写物（アンチセンス）は、一度転写されると（主にｐｐｐＣ、ｐｐｐＵ、及びｐｐｐＡで開始される）、おそらく新生センスＲＮＡと会合したままである。あるいは、そのような構築物が形成するならば、それらは本質的にサイレントであってもよい。２本鎖の結合は、効果的には５’ｐｐｐを有するｄｓＲＮＡである。１本以上のハイブリダイズした鎖に５’ｐｐｐが存在することによって、構造は免疫刺激性になる。アンチセンスＲＮＡ鋳型転写物がＲＮＡから解離されるときでさえ、ｐｐｐＣ、ｐｐｐＵ、及びｐｐｐＡを有するｓｓＲＮＡの存在は、依然としてサイトカイン誘導性である。本発明の方法は、Ｊ２ ＥＬＩＳＡ及びＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理において見られるようにｄｓＲＮＡを欠くＲＮＡを生成するので、この産物は大きな全長ＲＮＡの構造をとらないであろう。等モルまたは本発明のＩＶＴプロセスで転写された場合、ＲＮＡは同様に折り畳まれていると思われる。

【0100】

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ調製物は、サイトカイン誘導性のＲＮＡ混入物を実質的に含まない。本明細書中で使用される場合、「サイトカイン誘導性混入物」という用語は、例えば、細胞ベースのサイトカイン誘導アッセイにおいて決定されるように、例えば、本明細書の実施例に記載されるような、ＢＪ線維芽細胞／ＩＦＮβアッセイ及び／またはＬｕｍｉｎｅｘアッセイにおいて決定されるように、サイトカイン生成を誘導するＲＮＡ分子、例えばＩ型インターフェロン（ＩＦＮα／β誘導）を指す。本発明の例示的な態様では、「サイトカイン誘導」混入物という用語は、サイトカイン誘導を誘導し、そして本質的に実質的に二本鎖であるＲＮＡ分子を指す。

【0101】

理論に縛られることなく、異常なポリメラーゼ転写、例えばＩＶＴ反応で生成される所望のＲＮＡから鋳型が取られた転写から生じる二本鎖ＲＮＡ分子は、天然の抗ウイルス免疫応答と似た自然免疫応答の活性化を介してサイトカインを誘導すると考えられ、これには、２種類の病原体認識受容体（ＰＲＲ）：トール様受容体（ＴＬＲ）及びＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、例えばトール様受容体３（ＴＬＲ３）、ならびにＲＮＡヘリカーゼ、例えばＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５が挙げられる。他のサイトカイン誘導分子の例としては、ＲＮａｓｅＩＩＩ基質が挙げられる。本明細書で使用されるＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質とは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素による切断を受けやすい二本鎖ＲＮＡ分子を指す。

【0102】

いくつかの実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、ＩＶＴ ＲＮＡに相補的な逆配列またはポリＵ配列を有する二本鎖ＲＮＡであってもよい。ＩＶＴ ＲＮＡの逆相補体またはポリＵ配列は５’ｐｐｐで始まる場合がある。

【0103】

サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体を含んでもよいし、及び／またはＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体を含んでもよい。さらに、ＩＶＴ ＲＮＡの５’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡの５’ＵＴＲの全部または一部に相補的であり得る。逆相補体は、５’ＵＴＲの最初の１０〜１５個、最初の５〜１５個、最初の５〜２０個、最初の１０〜２０個、最初の１５〜２５個のヌクレオチドに相補的な配列を含み得る。いくつかの実施形態では、逆相補体は、５’ＵＴＲ以内で１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、１〜２００、１〜３００、１〜４００、１〜５００、１〜６００、１〜７００、１〜８００、１〜９００、１〜１０００、１〜２０００、１〜２５００、または１〜３０００ヌクレオチド長の範囲に相補的な配列を含んでもよい。他の実施形態では、逆相補体は、５’ＵＴＲ内で、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜７００、１０〜８００、１０〜９００、１０〜１０００、１０〜２０００、１０〜２５００、または１０〜３０００ヌクレオチド長の範囲に相補的な配列を含んでもよい。他の実施形態では、逆相補体は、５’ＵＴＲ内で２０〜２５、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜２００、２０〜３００、２０〜４００、２０〜５００、２０〜６００、２０〜７００、２０〜８００、２０〜９００、２０〜１０００、２０〜２０００、２０〜２５００、または２０〜３０００ヌクレオチド長の範囲に相補的な配列を含んでもよい。同様に、ＩＶＴ ＲＮＡの３’末端の逆相補体は、ＩＶＴ ＲＮＡのポリＡテールの全部または一部に相補的である場合がある。逆相補体は、３’ＵＴＲの最初の１０〜１５個、最初の５〜１５個、最初の５〜２０個、最初の１０〜２０個、最初の１５〜２５個のヌクレオチドに相補的な配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、逆相補体は、３’ＵＴＲ内の１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜７０、１〜８０、１〜９０、１〜１００、１〜２００、１〜３００、１〜４００、１〜５００、１〜６００、１〜７００、１〜８００、１〜９００、１〜１０００、１〜２０００、１〜２５００、１〜３０００、または１から全長または最大サイズのＲＮＡヌクレオチド長という範囲に相補的な配列を含んでもよい。他の実施形態では、逆相補体は、３’ＵＴＲ内の１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、１０〜１００、１０〜２００、１０〜３００、１０〜４００、１０〜５００、１０〜６００、１０〜７００、１０〜８００、１０〜９００、１０〜１０００、１０〜２０００、１０〜２５００、または１０〜３０００ヌクレオチド長の範囲に相補的な配列を含んでもよい。他の実施形態では、逆相補体は、３’ＵＴＲ内の２０〜２５、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜２００、２０〜３００、２０〜４００、２０〜５００、２０〜６００、２０〜７００、２０〜８００、２０〜９００、２０〜１０００、２０〜２０００、２０〜２５００、または２０〜３０００ヌクレオチド長の範囲に相補的な配列を含んでもよい。

【0104】

本開示は、ＩＶＴ ＲＮＡと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物を実質的に含まない組成物を包含する。いくつかの実施形態では、サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物は、ＲＮＡの量の０．５％、０．４５％、０．４％、０．３５％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％または０．００１％未満を構成する。ＲＮＡ組成物の質量は、当該分野で公知の任意の手段によって決定され得る。例としては、液体クロマトグラフィー及び質量分析法が挙げられる。

【0105】

サイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物及び／または逆相補体転写産物などの混入物のｄｓＲＮＡは、２０〜５０ヌクレオチド長であってもよい。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２２５、２２５〜２５０、２５０〜２７５、２７５〜３００、３００〜３２５、３２５〜３５０、３５０〜３７５、３７５〜４００、４００〜４２５、４２５〜４５０、４５０〜４７５、４７５〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、及び９５０〜１０００ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの質量は、４０塩基対より大きく、ＲＮＡ組成物の約０．５％未満を構成する。

【0106】

混入物鎖は５’ｐｐｐ端部を有する場合がある。いくつかの実施形態では、混入物鎖は、等モルのプロセス産生ＲＮＡと比較して、より低量のｐｐｐＡ、ｐｐｐＣ、及びｐｐｐＵを有し得る。別の実施形態では、混入物鎖は、等モルプロセスと比較して、より低い比のｐｐｐＡ：ｐｐｐＧ、ｐｐｐＣ：ｐｐｐＧ、及び／またはｐｐｐＵ：ｐｐｐＧを有し得る。ｐｐｐＮＴＰは、全ヌクレアーゼ消化、例えば、ヌクレアーゼＰ１処理後にＬＣ−ＭＳによって検出してもよい。ヌクレアーゼＰ１は、ＲＮＡ及びＤＮＡを単一のヌクレオチドに消化する。存在すべき唯一の三リン酸種は、開始ヌクレオチドに対するものである。ＲＮＡ鋳型転写産物が形成されない場合は、５’ＰＰＰＧが開始の唯一の標的部位であるため、存在するはずの唯一の三リン酸である。Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１消化後にＬＣ／ＭＳで検出された５’ｐｐｐＡ、５’ｐｐｐＣ、及び／または５’ｐｐｐＵの存在及び量は、ＲＮＡ鋳型ＲＮＡ転写産物を示す。

【0107】

不純物、特に二本鎖不純物が少ないことに加えて、ＩＶＴ ＲＮＡ組成物は、特に精製ステップ、例えば、逆相クロマトグラフィーまたはＲＮＡｓｅ ＩＩＩ処理と組み合わせたＩＶＴ法を用いて生成された従来の精製ＲＮＡ組成物と比較した場合、組成物中の他のＲＮＡ種に対して高い割合の全長機能的ＲＮＡ転写物を有する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡの質量の約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．８％超が、一本鎖全長転写物を含む。一本鎖全長転写物に加えて、ＩＶＴ ＲＮＡ組成物は、アボーティブ転写物を含む、センス配向の一本鎖部分ＲＮＡ転写物のような他の一本鎖ＲＮＡ種を含んでもよい。しかしながら、ＩＶＴ ＲＮＡ組成物は、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片を実質的に含まない。

【0108】

本明細書に記載のＲＮＡ組成物は、全長ＲＮＡ転写物以外の他の成分、例えば短縮型転写物及び／またはランオン（ｒｕｎ−ｏｎ）転写物を含んでもよい。例えば、ＲＮＡは、異なる長さの転写物、例えば、全長の転写物よりも短いかまたは長い転写物を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡ調製物は、切断型及び／またはアボーティブ型転写物を含む。ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡプロモーターに結合し、そして短いｍＲＮＡ転写物を合成する。本明細書中で使用される場合、「短縮された転写物」という用語は、ＩＶＴ ＲＮＡに対して同一性を有するが、不十分な長さであり、かつ目的のポリペプチドをコードするために必要な全ての要素（例えば、ポリＡ）を欠く転写物を指す。特定の場合には、切断型転写物は、アボーティブ転写物と呼ばれる、転写複合体がプロモーターを離れる前に放出される。本明細書中で使用される場合、「アボーティブ転写物」という用語は、ＩＶＴ ＲＮＡに対して同一性を有するが、不十分な長さであり、目的のポリペプチドをコードするのに必要な全ての要素（例えば、ポリＡ）を欠く、一般には、１５ヌクレオチド以下の長さを有する転写物を指す。本発明の例示的な態様では、短縮型及び／またはアボーティブ型の転写物が存在し、サイトカイン誘導性ではない。ある実施形態では、短縮型及び／またはアボーティブ転写物は試料から除去される。いくつかの実施形態では、短縮された転写物は、１００ヌクレオチド以下の長さを有する。

【0109】

本発明の方法はまた、本明細書において３’均一性または３’末端均一性の増大とも呼ばれる、３’不均一性または３’末端不均一性が低減された組成物を生成すると判断された。本発明者らは、伝統的な等モルのＩＶＴ反応条件が、異なる３’残基で終結する転写物（例えば、転写が一様に終結していない）を生じ得ると判断した。実施例に記載されたアッセイは、伝統的なＩＶＴ反応（特定の試験転写物の３’末端で生じる非Ａ核酸塩基間を識別するアッセイ）から生じる３’末端の不均一性を検出するために開発された。特に、本発明の方法は、より低い程度の３’末端不均一性（またはより均一な３’末端）を有する転写物を生成する。例えば、伝統的なＩＶＴ反応（例えば、等モル反応）に従って製造された転写物は、５０％を超える（任意選択的に６０％を超える、７０％を超える、７５％を超える、８０％を超える）転写産物が異なる末端を有する組成物を生成し得るが、本発明のＩＶＴ反応（例えば、アルファ反応）に従って生成された転写物は、５０％未満の転写物、すなわち５０％を超える転写物が、（例えば、ＤＮＡ鋳型に対して）同じ核酸塩基で同じ末端を有する、すなわち、終止する（任意選択的に、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満またはそれ以下）が異なる末端を有する）組成物を生成することができる。

【0110】

一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団内の短縮転写物は、ある範囲のサイズを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、短縮転写産物の集団の少なくとも８０％が、１００ヌクレオチド以下の長さを有する。他の実施形態では、短縮転写産物の集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％が１００ヌクレオチド以下の長さを有する。

【0111】

本明細書に記載のＩＶＴ ＲＮＡ組成物内の一本鎖ＲＮＡ集団は、典型的にはＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片を含まないか、または実質的に含まない。本明細書で使用される「ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片」とは、ＩＶＴ ＲＮＡに対する同一性（センス配向）を有するが、不十分な長さであり、目的のポリペプチドをコードするのに必要な全ての要素を欠く（全長転写産物未満のヌクレオチドを有する）一本鎖転写産物であって、ここで、この断片が、酵素的、特にＲＮＡｓｅ ＩＩＩ切断によって生成されるものを指す。ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片の生成は、例えば、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ消化と組み合わせた（図４０に示されるような）伝統的なＩＶＴプロセスを生じ得る。

【0112】

図４０に示すように、従来のＩＶＴ／ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ精製プロセスの最初のステップは、Ｍｇ^２＋存在下での直鎖ｄｓＤＮＡ鋳型、等モル濃度のＮＴＰ及びＲＮＡポリメラーゼを利用した転写反応に関与する。この反応は、一本鎖切断型／アボーティブ転写物、全長ＲＮＡ転写物、ランオン転写物、及び逆相補体不純物の混合集団を生成する。逆相補体不純物は、一本鎖ＲＮＡのいくつかまたは他の不純物、例えば、短縮転写物に結合して、二本鎖ＲＮＡ及び／または二本鎖領域と一本鎖領域との両方を有するＲＮＡを生成し得る。当該技術分野では、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩを使用してＩＶＴ組成物から二本鎖ＲＮＡを分解し、それによってそれを組成物から効果的に除去することができると想定されてきた。しかし、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩはまた、全長ＲＮＡ転写物及び／またはランオン転写物の二本鎖領域（例えば、ポリＡテール領域内の逆相補体の結合から生じる二本鎖領域）を分解し、全長ＲＮＡ転写物より短い長さの一本鎖断片を残し得る。これらの一本鎖断片は、本明細書に記載のＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片である。このＲＮＡｓｅ分解の結果として、ＩＶＴプロセスの間に生成されたかなりの量の全長転写物が失われ、それにより生成物の完全性が著しく失われる。これらの組成物は、細胞または対象に送達されたときにタンパク質を発現する能力が有意に低い。

【0113】

図４０に示す方法などの方法に従って生成された生成物のＲＮＡｓｅ ＩＩＩ処理後に生成されたＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片は、ある範囲のサイズを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、アボーティブ転写産物の集団の少なくとも８０％は、１００ヌクレオチドを超える長さを有する。他の実施形態では、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片の集団の少なくとも５０％、６０％、７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または１００％が１００ヌクレオチド超の長さを有する。

【0114】

理論に拘束されるものではないが、特定の種または混入物、例えばｄｓＲＮＡ種または混入物の除去は、治療用途のためのＩＶＴ ＲＮＡ組成物の調製において重要であると考えられる。対照的に、ＩＶＴ ＲＮＡ組成物中の残留短縮型転写物及び／またはアボーティブ転写物の存在は、必要であるとは考えられない；そのような種は、望ましくないサイトカイン及び／またはＩＶＴ ＲＮＡに対する自然免疫応答を誘発するとは考えられていない。他の実施形態では、本発明のＲＮＡ調製物は、短縮転写物またはアボーティブ転写物を実質的に含まない。

【0115】

短縮型／アボーティブ転写物は、ＩＶＴ ＲＮＡ組成物または本発明に存在し得るが、組成物はＲＮＡｓｅ ＩＩＩで処理されないので、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片は、ＩＶＴ ＲＮＡ組成物には存在しない。短縮型転写物及びＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片は両方とも様々なサイズまたは長さを有するが、短縮型転写物の平均長は、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ非感受性断片の平均長より短い。したがって、組成物がセンス配向の一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団を含む場合、センス配向の一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団の８０％超が１００ヌクレオチド以下のヌクレオチド長を有する場合。いくつかの実施形態では、センス配向における一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団の９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％超が、１００ヌクレオチド以下のヌクレオチド長を有する。他の実施形態では、センス配向の一本鎖部分ＲＮＡ転写物の集団の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、または８８％超が１００ヌクレオチド以下のヌクレオチド長を有する。

【0116】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ調製物は、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物である。他の実施形態では、ＲＮＡ調製物は、さらなる精製技術にまだ供されていない反応生成物（例えば、ＩＶＴ反応生成物）である。ＲＮＡ調製物は、ＲＮＡに加えて多数の他の成分を含み得る。しかしながら、この反応生成物は、逆相補体転写産物及び／またはサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物を実質的に含まない。

【0117】

アッセイ
逆相補体転写産物及び／またはサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物を含む混入物の量は、当該分野で公知の方法によって決定され得る。核酸試料の純度を決定するための多くの方法が当技術分野において公知である。例示的な方法としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：高速液体クロマトグラフィー（逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、ゲル電気泳動、ならびに核酸産生の品質及び純度を評価するための翻訳アッセイ。ＲＮＡ調製物の品質はまた、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒチップベースの電気泳動システムを使用して決定されてもよい。インビトロの有効性は、例えば、ＲＮＡ転写物をヒト細胞株（例えば、ＨｅＬＡ、ＰＢＭＣ、ＢＪ線維芽細胞、Ｈｅｋ ２９３）にトランスフェクトすることによって分析してもよい。目的のポリペプチドのタンパク質発現は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、またはフローサイトメトリーなどの方法を用いて定量してもよい。

【0118】

ｄｓＲＮＡ特異的抗体を用いてｄｓＲＮＡを検出及び／または定量するために様々な方法が用いられてきた。これらとしては、ＥＬＩＳＡ、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｓｃｈｏｎｂｏｒｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：２９９３−３０００）、ドットブロット（定量化、特異性試験用）（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９：ｅ１４２）、及び免疫沈降／イムノブロッティングが挙げられる。本発明の例示的な態様では、混入物は、ＥＬＩＳＡを使用して認識され得る。Ｋ１／Ｊ２またはＫ２／Ｊ２アッセイは、試料中のｄｓＲＮＡ混入物の存在量を決定するために使用され得る。例示的なＥＬＩＳＡは、以下のようにサンドイッチＥＬＩＳＡである。ブロッキング：マイクロタイタープレートを、４℃で一晩、タンパク質、例えば、０．４μｇ／ウェルのプロテインＡで予めコーティングする。遊離結合部位を、緩衝液（例えばＰＢＳ）中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（例えば２％）で飽和させ、次いでプレートを緩衝液（例えばＰＢＳ）で洗浄し、そして４℃で保存する。ｄｓＲＮＡ特異的Ｊ２モノクローナル抗体（ＩｇＧ２ａ）を、ハイブリドーマ上清（例えば、１ウェルあたり１００μｌ、４℃で一晩）をインキュベートすることにより、プロテインＡ層に固定する。そのプレートを、緩衝液、例えば、ＰＢＳに加えてＴｗｅｅｎ２０（例えば、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）で複数回洗浄し、及び核酸試料を緩衝液（例えば、ＴＥ緩衝液、３７℃、２時間）に添加する。上記のような洗浄後、結合した核酸（すなわち、Ｊ２抗原）を、ｄｓＲＮＡ特異的Ｋ２ ＩｇＭモノクローナル抗体、続いてアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体（例えば、１：５０００希釈ヤギ抗マウスＩｇＭ）の希釈ハイブリドーマ上清（例えば１：２）との連続インキュベーションによって特定する。両方のインキュベーションステップとも、３７℃で約１〜２時間行う。洗浄、基質のインキュベーション及び吸収の読み取りは、当技術分野で認められている方法に従って行う。

【0119】

ドットブロットを使用する同様のアッセイは、Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１１；３９（２１）：ｅ１４２に記載される。このアッセイは、ＲＮＡ（２００ｎｇ）を、超荷電Ｎｙｔｒａｎ膜上にブロットし、そこでそれを乾燥させ、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中の５％脱脂粉乳でブロックすることによって行う。次いで、試料を、ｄｓＲＮＡ特異的Ｋ１またはＪ２モノクローナル抗体（ＩｇＧ）と共に１時間インキュベートする。この膜は、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、例えば、ＨＲＰ結合抗ヤギポリクローナル抗体と共にインキュベートしてもよい。この膜を再び洗浄し、そしてシグナルを、ＴＭＢを用いて検出する。そのシグナルは、ＴＭＢを添加して発生させる。このアッセイは、長さが４０塩基対を超えるｄｓＲＮＡ二本鎖を検出するのに有用である。

【0120】

サイトカインアッセイもまた、ＲＮＡ混入物を検出するために使用してもよい。多数のサイトカインアッセイが当該分野において公知である。このアッセイは、不純なＩＶＴ生成物に関連する任意のサイトカインの誘導について試験し得る。これらのサイトカインとしては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、干渉（ＩＦＮ）アルファ、ベータ、及びガンマ、ならびにＴＮＦが挙げられる。一実施形態では、ＩＦＮ−β細胞ベースのアッセイを使用してもよい。その結果は、ＬＣ−ＭＳによって検出されたＲＮａｓｅＩＩＩ基質の存在と相関することが示されている。例えば、ＩＬまたは多重サイトカインアッセイなどの他の細胞ベースのサイトカインアッセイを使用してもよい。

【0121】

例示的なＢＪＦ ＩＦＮβ及びｈＥＰＯ発現アッセイでは、ＢＪ線維芽細胞（ＡＴＣＣ）を細胞培養プレートに播種する。播種の約２４時間後に、リポフェクタミンまたは他の送達剤を用いて細胞にｍＲＮＡをトランスフェクトする。トランスフェクション後、上清を回収し、ＩＦＮβ発現は、製造業者の指示（ＰＢＬ Ａｓｓａｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ）に従ってヒトＩＦＮβ ＥＬＩＳＡキット、Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙを用いて測定する。要するに、ヒトＩＦＮ−βを、細胞上清中で間接的酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定する。予めコーティングしたプレートを、細胞上清と共にインキュベートし、次いで洗浄して非特異的に結合した物質を除去する。ウェルを抗ＩＦＮ−β抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートした二次抗体と共にインキュベートすることによって、ＩＦＮ−β発現を分析する。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）は、検出に使用されるＨＲＰ基質である。ヒトＥｐｏレベルは、Ｅｐｏ Ｈｕｍａｎ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して測定される。

【0122】

例示的なＬｕｍｉｎｅｘアッセイでは、Ｌｕｍｉｎｅｘスクリーニングアッセイ技術（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、マウス由来の血清を収集してサイトカインレベルを評価する。要するに、分析物特異的抗体を、色分けされたビーズ上に予めコーティングする。ビーズ、標準物質、及び試料をウェル中にピペッティングして、固定した抗体を目的の分析物に結合させる。未結合物質を洗い流した後、目的の分析物に特異的なビオチン化抗体カクテルを、各ウェルに加える。未結合ビオチン化抗体を除去するための洗浄の後、ビオチン化検出抗体に結合するストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート（ストレプトアビジン−ＰＥ）を、各ウェルに添加する。最後の洗浄により未結合ストレプトアビジン−ＰＥを除去し、ビーズを緩衝液に再懸濁し、Ｌｕｍｉｎｅｘアナライザー（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて読み取る。第１のレーザーはビーズ特異的であり、どの分析物が検出されているかを決定する。第２のレーザーはＰＥ由来のシグナルの大きさを決定し、それは結合した分析物の量に正比例する。

【0123】

純度のサロゲートアッセイ
本発明の例示的な態様では、生成物及び／または不純物の高度に定性的及び／または定量的な検出に適している代替アッセイの使用によって純度を決定することが望ましい場合がある。したがって、本発明は、同一の条件によって産生されたサロゲートＲＮＡ（例えば、モデルＲＮＡ）の純度を決定することによる、特定のＩＶＴ方法によって産生されたＲＮＡ組成物、例えばＩＶＴ ＲＮＡの純度の決定を企図している。このようにして、代替システムにおける高度に定性的及び／または定量的な検出方法を介して、間接的に純度を決定してもよく、この純度決定は、生成システムにおいて生成されるＩＶＴ ＲＮＡの純度に相関する。さらに、再構成または代替型アッセイを使用して、所与のＲＮＡ調製物中の混入物の量及び同一性を間接的に決定してもよい。ある場合には、低レベルの混入物またはＲＮＡ転写物と類似の構造特性を有する混入物を検出することは困難である場合がある。再構成系を用いて、伝統的なＩＶＴ法によって生成されたＲＮＡ組成物による生物学的活性と比較して、本発明のＲＮＡ調製物から欠けている推定混入物を加えることによって、免疫刺激活性、例えば、混入物に関連するサイトカイン活性などの生物学的活性を試験してもよい。本発明の純粋なＲＮＡ調製物と推定上の混入物との再構成は、純粋なＲＮＡ調製物中に混入物がないことを実証し得る。

【0124】

さらに、モデルＲＮＡ（サロゲートｍＲＮＡ）を使用してもよい。ＩＶＴ ＲＮＡを生成するために使用されたのと同じＩＶＴ条件下で、モデルＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型からモデルＲＮＡが生成される。本明細書で使用されるモデルＲＮＡまたはサロゲートｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びポリＡテールのみからなる非コードＲＮＡ転写物を指す。ショートモデルＲＮＡもまた使用されてもよい。ショートモデルＲＮＡは、モデルＲＮＡのより短いバージョンである（５’ＵＴＲと、より短いポリＡテール（Ａ２０）のみで構成されている）。モデルＲＮＡの量は組成物中の逆相補体転写産物またはサイトカイン誘導種の量を示すので、組成物中の逆相補体転写産物またはサイトカイン誘導種の量は、ＬＣ−ＭＳまたは他の分析方法によって決定される。アッセイで検出された混入物の量及び性質は、全長ｍＲＮＡを生成するために同一のＩＶＴ反応条件を用いて得られるであろう混入物の量及び性質と相関しており、これを予測する。

【0125】

本発明のＲＮＡ調製物は高品質の調製物である。いくつかの実施形態では、ＩＶＴプロセスから直接得られるＲＮＡ調製物は、さらなる精製なしに研究用試薬または診断用もしくは治療用試薬として直接使用され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ調製物は、１つ以上の精製ステップに供され得る。例えば、ＲＮＡ調製物は、オリゴｄＴクロマトグラフィーを用いて短縮型ＲＮＡ、ＤＮＡ鋳型、及び残留酵素から精製してもよい。例示的なオリゴｄＴクロマトグラフィーアッセイは、固相抽出真空マニホールド上の５ｍＬのＳＰＥカラムに２０ｍｅｒのポリチミジンセファロース（３ｍｌ）を充填することを包含する。ＲＮＡ転写物をカラムに加え、続いて洗浄及び溶出する。オリゴｄＴ精製ＲＮＡ転写物を、水中に透析濾過し、１００ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して１．２２ｍｇ／ｍＬに濃縮する。このＲＮＡを回収し、その濃度をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒゲル電気泳動を用いて決定してもよい。

【0126】

試料の純度及び品質を決定するためのＲＮＡ調製物の分析は、キャッピングの前または後に実施してもよい。あるいは、分析は、ポリＡ捕捉に基づくアフィニティー精製の前に行っても、または後に行ってもよい。別の実施形態では、分析は、任意選択の追加の精製ステップ、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの前または後に行ってもよい。

【0127】

質量分析は、混合物中の化合物を同定し、特徴付けるための広範囲の技術を包含する。試料を分析してその組成を決定するために、異なる種類の質量分析に基づくアプローチを使用してもよい。質量分析法は、イオン化プロセスによって、分析されている試料を複数のイオンに変換することを包含する。得られた各イオンは、力場に置かれると、その加速がその質量電荷比に反比例するように軌道に沿ってその力場内を移動する。このようにして分子の質量スペクトルが生成され、これは前駆イオンの相対量対それらの質量電荷比のプロットを表示する。タンデム質量分析などの質量分析の次の段階が、前駆イオンをより高いエネルギーにさらすことによって試料をさらに分析するために使用されるとき、各前駆イオンは、生成物イオンと呼ばれる断片への解離を受ける場合がある。得られた断片は、それらの前駆体分子の性質及び構造に関する情報を提供するために使用され得る。

【0128】

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間）質量分析法は、光吸収材料のマトリックスにそれらを埋め込んでその分子の重量を、それがイオン化され、揮発によって飛行するようになるにつれて測定することによって、低揮発性の低イオン化分析物または容易に断片化される分析物の質量の分光測定を提供する。電場と磁場の組み合わせを試料に印加して、分子の個々の質量及び電荷に応じてイオン化材料を移動させる。Ｋｏｓｔｅｒらに発行された米国特許第６，０４３，０３１号は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ及び他の質量分析法を用いて、ＤＮＡ内の一塩基変異を同定するための例示的な方法を記載している。

【0129】

ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）は、バイオポリマーの特性に基づいて、バイオポリマーの分析的分離に使用される。ＨＰＬＣを使用して、サイズ電荷及び塩基組成に基づいて核酸配列を分離してもよい。別の核酸と１塩基対の差がある核酸配列が、ＨＰＬＣを用いて分離され得る。したがって、単一のヌクレオチドを除いて同一である核酸試料は、特定の核酸断片の存在または非存在を同定するために、ＨＰＬＣを用いて示差的に分離され得る。好ましくは、ＨＰＬＣは、ＨＰＬＣ−ＵＶである。

【0130】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｄｓＲＮａｓｅステップを使用せずに精製され得る。例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩが使用されないことがある。組成物は、逆相クロマトグラフィー精製ステップを使用しないプロセスによって生成してもよい。一実施形態では、ＲＮＡ組成物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製を使用することなく生成され得る。従って、この組成物は、伝統的な精製プロセスと関連する残留有機試薬または混入物を含まない。

【0131】

場合によっては、本発明の方法は、ＲＮＡ試料の純度を決定するために使用される。本明細書で使用される「純粋な」という用語は、無関係の核酸の存在が低減または排除される、すなわち、ＲＮＡ断片を含む不純物または混入物が低減または排除されるような標的核酸活性剤のみを有する材料を指す。例えば、精製されたＲＮＡ試料は、１つ以上の標的または試験核酸を含むが、記載された方法によって検出可能な他の核酸を実質的に含まないことが好ましい。本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、材料の分析試験の文脈において操作上使用される。好ましくは、精製された材料は、本明細書に記載の逆相補体転写産物及び／またはサイトカイン誘導性ＲＮＡ混入物を含む１つ以上の不純物または混入物を実質的に含まず、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、または９７％の純度である；より好ましくは少なくとも９８％純粋、そしてさらにより好ましくは少なくとも９９％純粋である。いくつかの実施形態では、純粋なＲＮＡ試料は、１００％の標的または試験ＲＮＡからなり、他のＲＮＡを含まない。

【0132】

いくつかの実施形態では、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）を用いてＲＮＡを分離する。試料が水性緩衝液などの電解質溶液を通って毛細管を介して目的のバイアルに流れるように、試料に電場を印加する。この分析物は、電気泳動移動度に基づいて示差的に移動し、そしてキャピラリーの出口端で検出される。出力データが記録され、その後エレクトロフェログラムとして表示される。試料成分の同一性を決定するために、これを質量分析と組み合わせて使用してもよい。キャピラリー電気泳動システムは、３つ程度の小さい塩基対の差を検出し得る、ＦＲＡＧＭＥＮＴ ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）で完全に自動化されている。

【0133】

いくつかの実施形態では、フラグメントアナライザー（ＦＡ）を用いてＲＮＡを定量及び精製してもよい。フラグメントアナライザーはキャピラリー電気泳動及びＨＰＬＣを自動化する。

【0134】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡ分子である。本明細書中で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ」（ｍＲＮＡ）という用語は、少なくとも１つの目的のペプチドまたはポリペプチドをコードし、インビトロ、インビボ、インサイチュまたはエキソビボで、コードされた目的のペプチドポリペプチドを生成するために翻訳され得る任意のポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によってＤＮＡ配列から転写され、そしてリボソームと相互作用して、ＤＮＡによってコードされる遺伝情報を合成する。一般に、ｍＲＮＡは、２つのサブクラスに分類される：プレｍＲＮＡ及び成熟ｍＲＮＡ。前駆体ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されたが、いかなる転写後プロセシング（例えば、５’キャッピング、スプライシング、編集、及びポリアデニル化）も受けていないｍＲＮＡである。成熟ｍＲＮＡは、転写後プロセシング（例えば、イントロンを除去するためにスプライスされそしてポリアデニル化される）を介して修飾されており、そしてリボソームと相互作用してタンパク質合成を行い得る。ｍＲＮＡは、様々な方法によって組織または細胞から単離してもよい。例えば、全ＲＮＡ抽出を、細胞または細胞溶解物に対して実施してもよく、得られた抽出全ＲＮＡを（例えば、オリゴｄＴビーズを含むカラム上で）精製して抽出ｍＲＮＡを得てもよい。

【0135】

あるいは、ｍＲＮＡは、例えばインビトロ転写（ＩＶＴ）によって、無細胞環境で合成してもよい。本明細書で使用される場合「インビトロ転写鋳型」とは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の生成のためのＩＶＴ反応での使用に適したデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を指す。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ鋳型は、５’非翻訳領域をコードし、オープンリーディングフレームを含み、そして３’非翻訳領域及びポリＡテールをコードする。ＩＶＴ鋳型の特定のヌクレオチド配列組成及び長さは、その鋳型によってコードされる目的のｍＲＮＡに依存するであろう。

【0136】

「５’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、タンパク質もペプチドもコードしない開始コドン（すなわち、リボソームによって翻訳されるｍＲＮＡ転写物の最初のコドン）からすぐ上流（すなわち、５’）にあるｍＲＮＡの領域を指す。

【0137】

「３’非翻訳領域（ＵＴＲ）」とは、タンパク質もペプチドもコードしない、終止コドン（すなわち、翻訳の終結をシグナル伝達するｍＲＮＡ転写物のコドン）のすぐ下流（すなわち、３’）であるｍＲＮＡの領域を指す。

【0138】

「オープンリーディングフレーム」とは、開始コドン（例えば、メチオニン（ＡＴＧ））で始まり、終止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡ）で終わり、タンパク質またはペプチドをコードする、一続きの連続的なＤＮＡである。

【0139】

「ポリＡテール」とは、複数の連続したアデノシン一リン酸を含有する３’ＵＴＲから下流、例えばすぐ下流（すなわち３’）であるｍＲＮＡの領域である。ポリＡテールは、１０〜３００個のアデノシン一リン酸を含んでもよい。例えば、ポリＡテールは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００のアデノシン一リン酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリＡテールは、５０〜２５０個のアデノシン一リン酸を含む。関連する生物学的設定（例えば、細胞内、インビボなど）では、ポリ（Ａ）テールは、例えば、細胞質内で、酵素分解からｍＲＮＡを保護するように機能し、ならびに転写終結、核からのｍＲＮＡの輸送、及び翻訳を補助する。

【0140】

したがって、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ａ）目的のポリペプチドをコードする連結ヌクレオチドの第１の領域；（ｂ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、上記第１の領域に対して５’に位置する第１の末端領域；（ｃ）上記第１の領域に対して３’に位置する第２の末端領域；及び（ｄ）テーリング領域を含む。ポリヌクレオチド及び核酸という用語は、本明細書では互換的に使用される。

【0141】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、約１〜約３，０００、１０〜約３，０００、２０〜約３，０００、３０〜約３，０００、４０〜約３，０００、５０〜約３，０００、１００〜約３，０００、２００〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、２００〜５００、２００〜１，０００、２００〜１，５００、２００〜３，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、１０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，５００〜３，０００、及び２，０００〜３，０００）を含む。

【0142】

ＩＶＴ ＲＮＡはＲＮＡとして機能し得るが、それらの機能的及び／または構造的設計の特徴において野生型ＲＮＡとは区別され、これは核酸ベースの治療剤を用いた効果的なポリペプチド生成の既存の問題を克服するのに役立つ。例えば、ＩＶＴ ＲＮＡは、構造的に修飾されていても化学的に修飾されていてもよい。本明細書中で使用される場合、「構造的」修飾とは、ヌクレオチド自体に対する有意な化学修飾なしに、２つ以上の連結ヌクレオチドが、ポリヌクレオチド中に挿入、欠失、重複、反転または無作為化される修飾である。化学結合は必然的に破壊され、構造的修飾をもたらすように再形成されるので、構造的修飾は、化学的性質のものであり、したがって化学的修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレオチド配列をもたらすであろう。例えば、ポリヌクレオチド「ＡＴＣＧ」は、「ＡＴ−５ｍｅＣ−Ｇ」に化学修飾されていてもよい。同じポリヌクレオチドを「ＡＴＣＧ」から「ＡＴＣＣＣＧ」に構造的に修飾してもよい。ここでは、ジヌクレオチド「ＣＣ」が挿入されており、その結果、ポリヌクレオチドに対する構造的修飾がもたらされる。

【0143】

本明細書に記載のポリヌクレオチドをコードするｃＤＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）系を用いて転写してもよい。この系は典型的には転写緩衝液、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリメラーゼを含む。ＮＴＰは、自家製であってもよく、供給者から選択されてもよく、または本明細書に記載のように合成されてもよい。ＮＴＰは、限定するものではないが、天然及び非天然（修飾）ＮＴＰを含む本明細書に記載のＮＴＰから選択され得る。ポリメラーゼは、限定するものではないが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、及び突然変異ポリメラーゼ（限定するものではないが、ポリヌクレオチド（例えば、修飾核酸）を取り込み得るポリメラーゼなど）から選択されてもよい。

【0144】

化学修飾ＲＮＡ
したがって、例示的な態様では、本発明のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの化学修飾を含んでもよい。このポリヌクレオチドは、天然のまたは天然に存在するポリヌクレオチドからの種々の置換及び／または挿入を含み得る。本明細書中でポリヌクレオチドにおいて使用される場合、「化学修飾」または必要に応じて「化学修飾された」という用語は、位置、パターン、百分率または母集団のうちの１つ以上における、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、ウリジン（Ｕ）、チミジン（Ｔ）またはシチジン（Ｃ）リボ−またはデオキシリボヌクレオシドに関する修飾を指す。一般に、本明細書において、これらの用語は、天然に存在する５’末端ＲＮＡキャップ部分におけるリボヌクレオチド修飾を指すことを意図していない。

【0145】

この修飾は、様々な異なる修飾であり得る。いくつかの実施形態では、この領域は、１つ、２つ、またはそれ以上（任意選択的に異なる）のヌクレオシドまたはヌクレオチド修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞に導入された修飾ポリヌクレオチドは、未修飾ポリヌクレオチドと比較して、細胞内で分解の低下を示し得る。

【0146】

ポリヌクレオチドの修飾としては、限定するものではないが、以下に詳細に列挙される修飾が挙げられる。ポリヌクレオチドは、天然に存在するか、天然に存在しない修飾を含んでもよく、またはポリヌクレオチドは、天然に存在する修飾及び天然に存在しない修飾の両方を含んでもよい。

【0147】

本発明のポリヌクレオチドは、糖、核酸塩基、またはヌクレオチド間結合に対するもの（例えば、結合ホスフェートに対するもの／ホスホジエステル結合に対するもの／ホスホジエステル骨格に対するもの）などの任意の有用な修飾を含んでもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチルまたはエチル）、またはハロ（例えば、クロロまたはフルオロ）で置き換えられても、または置換されてもよい。特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ以上の修飾）が、糖及びヌクレオチド間結合のそれぞれに存在する。本発明による修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）またはそれらのハイブリッドへのリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であってもよい。追加の修飾が本明細書に記載される。

【0148】

非天然修飾ヌクレオチドを、鎖の合成中または合成後にポリヌクレオチドに導入して、所望の機能または特性を達成してもよい。修飾は、ヌクレオチド間系統、プリンもしくはピリミジン塩基、または糖に対するものであってもよい。修飾は鎖の末端または鎖の他の場所に導入されてもよい（化学合成またはポリメラーゼ酵素によって）。ポリヌクレオチドのいずれの領域も化学的に修飾されてもよい。

【0149】

本開示は、未修飾または修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドならびにそれらの組み合わせからなるポリヌクレオチドを提供する。本明細書に記載の場合、「ヌクレオシド」とは、有機塩基（例えばプリンまたはピリミジン）またはその誘導体（本明細書において「核酸塩基」とも呼ばれる）と組み合わせて糖分子（例えば、ペントースまたはリボース）またはその誘導体を含む化合物として定義される。本明細書中に記載される場合、「ヌクレオチド」とは、リン酸基を含むヌクレオシドとして定義される。修飾ヌクレオチドは、本明細書中に記載されるように、任意の有用な方法によって（例えば、化学的、酵素的、または組換え的に、１つ以上の修飾ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含むように）合成され得る。このポリヌクレオチドは、連結ヌクレオチドの領域（複数可）を含んでもよい。そのような領域は、可変主鎖結合を有してもよい。この結合は、標準的なホスホジエステル結合であってもよく、その場合、ポリヌクレオチドはヌクレオチドの領域を含むであろう。塩基／糖またはリンカーの任意の組み合わせを本発明のポリヌクレオチドに組み込んでもよい。

【0150】

いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡは、１つ以上の前述の修飾核酸塩基の組み合わせ（例えば、２つ、３つまたは４つの前述の修飾核酸塩基の組み合わせ）を含む。

【0151】

本発明において有用である核酸の修飾としては、限定するものではないが、以下の表中の修飾が挙げられる。

【0152】

【表A-1】

【表A-2】

【表A-3】

【表A-4】

【表A-5】

【表A-6】

【表A-7】

【表A-8】

【表A-9】

【表A-10】

【表A-11】

【表A-12】

【表A-13】

【表A-14】

【表A-15】

【表A-16】

【表A-17】

【表A-18】

【表A-19】

【表A-20】

【表A-21】

【表A-22】

【表A-23】

【表A-24】

【表A-25】

【表A-26】

【表A-27】

【0153】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、シュードウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチルシュードウリジン（ｍ^１Ψ）、２−チオウリジン、４’−チオウリジン、５−メチルシトシン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−シュードウリジン、２−チオ−１−メチル−シュードウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−２−チオ−シュードウリジン、４−メトキシ−シュードウリジン、４−チオ−１−メチル−シュードウリジン、４−チオ−シュードウリジン、５−アザ−ウリジン、ジヒドロシュードウリジン、５−メトキシウリジン、または２’−Ｏ−メチルウリジンである。いくつかの実施形態では、本発明のＲＮＡは、１つ以上の前述の修飾核酸塩基の組み合わせ（例えば、２つ、３つまたは４つの前述の修飾核酸塩基の組み合わせ）を含む。

【0154】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、１−メチル−シュードウリジン（ｍ^１Ψ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）、５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、α−チオ−グアノシン、またはα−チオ−アデノシンである。いくつかの実施形態では、本発明のｍＲＮＡは、１つ以上の前述の修飾核酸塩基の組み合わせ（例えば、２つ、３つまたは４つの前述の修飾核酸塩基の組み合わせ）を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、シュードウリジン（Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは１−メチル−シュードウリジン（ｍ^１Ψ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１−メチル−シュードウリジン（ｍ^１Ψ）及び５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２−チオウリジン（ｓ^２Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２−チオウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ^５Ｕ）及び５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジンを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、２’−Ｏ−メチルウリジン及び５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ^６Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡはＮ６−メチル−アデノシン（ｍ^６Ａ）及び５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）を含む。

【0156】

特定の実施形態では、本発明のＲＮＡは、特定の修飾のために均一に修飾されている（すなわち、完全に修飾されている、全配列にわたって修飾されている）。例えば、ＲＮＡは、５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）で均一に修飾されてもよく、これは、ＲＮＡ配列中の全てのシトシン残基が、５−メチル−シチジン（ｍ^５Ｃ）で置換されることを意味する。同様に、本発明のＲＮＡは、配列中に存在する任意の種類のヌクレオチド残基について、上記のような修飾残基と交換することによって均一に修飾されてもよい。

【0157】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は修飾シトシンである。修飾シトシンを有する例示的な核酸塩基、ヌクレオシド、及びヌクレオチドとしては、Ｎ４−アセチル−シチジン（ａｃ４Ｃ）、５−メチル−シチジン（ｍ５Ｃ）、５−ハロ−シチジン（例えば、５−ヨード−シチジン）、５−ヒドロキシメチル−シチジン（ｈｍ５Ｃ）、１−メチル−シュードイソシチジン、２−チオ−シチジン（ｓ２Ｃ）、２−チオ−５−メチル−シチジンが挙げられる。

【0158】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウリジンである。修飾ウリジンを有する例示的な核酸塩基、ヌクレオシド、及びヌクレオチドとしては、５−シアノウリジンまたは４’−チオウリジンが挙げられる。

【0159】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する例示的な核酸塩基、ヌクレオシド、及びヌクレオチドとしては、７−デアザ−アデニン、１−メチル−アデノシン（ｍ１Ａ）、２−メチル−アデニン（ｍ２Ａ）、Ｎ６−メチル−アデノシン（ｍ６Ａ）、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。

【0160】

いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する例示的な核酸塩基、ヌクレオシド、及びヌクレオチドとしては、イノシン（Ｉ）、１−メチル−イノシン（ｍ１Ｉ）、ワイオシン（ｉｍＧ）、メチルワイオシン（ｍｉｍＧ）、７−デアザ−グアノシン、７−シアノ−７−デアザ−グアノシン（プレＱ０）、７−アミノメチル−７−デアザ−グアノシン（プレＱ１）、７−メチル−グアノシン（ｍ７Ｇ）、１−メチル−グアノシン（ｍ１Ｇ）、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシンが挙げられる。

【0161】

一実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチドなどの本発明のポリヌクレオチドは、全てまたは任意の同じヌクレオチド型の均一の化学修飾または全てまたは任意の同じヌクレオチド型において同じ出発修飾の単なる下向き滴定によって生じる修飾の集団、または全てのウリジンがウリジン類似体、例えばシュードウリジンで置換されている場合のように、任意の同じヌクレオチド型であるが、ランダムに組み込まれた化学修飾の測定パーセントを有してもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド全体にわたって同じヌクレオチド型の２つ、３つ、または４つの均一な化学修飾を有していてもよい（全てのウリジン及び全てのシトシンなどが同様に修飾される）。本発明のポリヌクレオチドが化学的及び／または構造的に修飾されている場合、そのポリヌクレオチドは「修飾ポリヌクレオチド」と呼ばれてもよい。

【0162】

一般に、目的のポリペプチドをコードするＩＶＴポリヌクレオチド（例えば、ＩＶＴ ＲＮＡ）の長さは、約３０ヌクレオチドより長い（例えば、少なくとも約３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００またはそれを超え、最大１００，０００ヌクレオチド以下）。

【0163】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴポリヌクレオチド（例えば、ＩＶＴ ＲＮＡ）は、約３０〜約１００，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜３，０００、３０〜５，０００、３０〜７，０００、３０〜１０，０００、３０〜２５，０００、３０〜５０，０００、３０〜７０，０００、１００〜２５０、１００〜５００、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜３，０００、１００〜５，０００、１００〜７，０００、１００〜１０，０００、１００〜２５，０００、１００〜５０，０００、１００〜７０，０００、１００〜１００，０００、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜３，０００、５００〜５，０００、５００〜７，０００、５００〜１０，０００、５００〜２５，０００、５００〜５０，０００、５００〜７０，０００、５００〜１００，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜３，０００、１，０００〜５，０００、１，０００〜７，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜２５，０００、１，０００〜５０，０００、１，０００〜７０，０００、１，０００〜１００，０００、１，５００〜３，０００、１，５００〜５，０００、１，５００〜７，０００、１，５００〜１０，０００、１，５００〜２５，０００、１，５００〜５０，０００、１，５００〜７０，０００、１，５００〜１００，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜５，０００、２，０００〜７，０００、２，０００〜１０，０００、２，０００〜２５，０００、２，０００〜５０，０００、２，０００〜７０，０００、及び２，０００〜１００，０００）を含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の核酸は、キメラポリヌクレオチドである。キメラポリヌクレオチドまたはＲＮＡ構築物は、ＩＶＴポリヌクレオチドと同様のモジュール構造を維持するが、キメラポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに有用な特性を付与する１つ以上の構造的及び／または化学的修飾または改変を含む。したがって、本発明の修飾ＲＮＡ分子であるキメラポリヌクレオチドは、「キメラ修飾ＲＮＡ」または「キメラＲＮＡ」と呼ばれる。キメラポリヌクレオチドは、サイズ及び／または化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾パーセントまたは化学修飾集団及びこれらの組み合わせが異なる部分または領域を有する。

【0165】

目的のポリペプチド
本発明のいくつかの実施形態では、本発明は、以下のうちの1つ以上である：ｍＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、非修飾ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、自己複製ＲＮＡ、環状ＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡなど。この実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたは自己複製ＲＮＡなどのポリペプチドをコードするＲＮＡである。

【0166】

本発明の例示的な態様では、高純度のＲＮＡ組成物を使用して目的のポリペプチド、例えば、治療用タンパク質、ワクチン抗原などを生成する。いくつかの実施形態では、この核酸は治療用ＲＮＡである。本明細書中で使用される場合、「治療用ｍＲＮＡ」という用語は、治療用タンパク質をコードするｍＲＮＡを指す。治療用タンパク質は、疾患を処置するため、または疾患の徴候及び症状を改善するために、宿主細胞または対象において様々な効果を媒介する。例えば、治療用タンパク質は、欠損または異常であるタンパク質を置換し、内因性タンパク質の機能を増強し、細胞に新規機能を提供する（例えば、内因性細胞活性を阻害もしくは活性化する）か、または別の治療用化合物（例えば、抗体−薬物コンジュゲート）の送達剤として作用し得る。治療用ｍＲＮＡは、以下の疾患及び状態の処置に有用であり得る：細菌感染症、ウイルス感染症、寄生虫感染症、細胞増殖障害、遺伝的障害、及び自己免疫障害。

【0167】

したがって、本発明のポリヌクレオチドは、治療剤または予防剤として使用してもよい。それらは医学分野での使用のために提供されている。例えば、本明細書に記載のＲＮＡを対象に投与してもよく、ここでポリヌクレオチドはインビボで翻訳されて治療用ペプチドを生成する。ヒト及び他の哺乳動物における疾患または状態の診断、処置または予防のための組成物、方法、キット、及び試薬が提供される。本発明の活性治療剤としては、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含有する細胞、またはポリヌクレオチドから翻訳されたポリペプチドが挙げられる。

【0168】

ポリヌクレオチドは、細胞、組織または生物体において翻訳のために誘導され得る。そのような翻訳は、インビボであっても、エクスビボであっても、培養物中であっても、またはインビトロであってもよい。細胞、組織または生物体は、ＲＮＡポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含有する有効量の組成物と接触させられる。

【0169】

ポリヌクレオチドの「有効量」とは、少なくとも部分的には、標的組織、標的細胞型、投与手段、ポリヌクレオチドの物理的特性（例えば、サイズ及び修飾ヌクレオチドの程度）ならびにポリヌクレオチドの他の成分及び他の決定基に基づいて提供される。一般に、有効量のポリヌクレオチドは、好ましくは同じペプチドをコードする対応する未修飾ポリヌクレオチドを含有する組成物よりも効率的に、細胞内で誘導されるかまたは促進されたペプチド生成を提供する。ペプチド産生の増大は、細胞トランスフェクションの増大、ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の増大、核酸分解の減少（例えば、修飾ポリヌクレオチドからのタンパク質翻訳の持続時間の増大により示される）、または宿主細胞におけるペプチド産生の変化により実証され得る。

【0170】

本発明のＲＮＡは、限定するものではないが、生物製剤、抗体、ワクチン、治療用タンパク質またはペプチド、細胞透過性ペプチド、分泌タンパク質、原形質膜タンパク質、細胞質または細胞骨格タンパク質、細胞内膜結合タンパク質、核タンパク質、ヒト疾患に関連するタンパク質、標的化部分、または治療適応が同定されていないが、それにもかかわらず研究及び発見の分野において有用性があるヒトゲノムによってコードされるタンパク質を含む任意のいくつかの標的カテゴリーから選択される目的のポリペプチドをコードするように設計され得る。「治療用タンパク質」とは、細胞に投与したときに治療的、診断的、及び／または予防的効果を有し、かつ／または所望の生物学的効果及び／または薬理学的効果を引き出すタンパク質を指す。

【0171】

本明細書中に開示されるＲＮＡは、１つ以上の生物製剤をコードし得る。本明細書中で使用される場合、「生物学的」とは、本明細書中に提供される方法によって産生され、そして重篤なまたは生命を脅かす疾患または病状を処置、治癒、軽減、予防または診断するために使用され得るポリペプチドベースの分子である。本発明による生物製剤としては、限定するものではないが、アレルギー性抽出物（例えば、アレルギー注射及び試験用）、血液成分、遺伝子治療製品、移植に使用されるヒト組織または細胞製品、ワクチン、モノクローナル抗体、サイトカイン、増殖因子、酵素、血栓溶解薬、及び免疫調節薬がとりわけ挙げられる。

【0172】

本発明によれば、現在市販されているかまたは開発中の１つ以上の生物製剤は、本発明のＲＮＡによってコードされ得る。理論に拘束されることを望まないが、本発明のＲＮＡへの公知の生物製剤のコードポリヌクレオチドの組み込みは、少なくとも部分的には、構築物設計の特異性、純度、及び／または選択性に起因して改善された治療効果をもたらすと考えられる。

【0173】

本明細書中に開示されるＲＮＡは、１つ以上の抗体またはその断片をコードし得る。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、及び一本鎖分子）、ならびに抗体断片を含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書において「抗体」と互換的に用いられる。本明細書中で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量で存在し得る、天然に存在する突然変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）の可能性以外は同一である。モノクローナル抗体は、極めて特異的であり、単一の抗原部位に対して向けられている。

【0174】

本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的には、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、ただし、鎖（複数可）の残りの部分は、それらが所望の生物活性を示す限り、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにそのような抗体の断片中の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む。本明細書において目的のキメラ抗体としては、限定するものではないが、非ヒト霊長類由来の可変ドメイン抗原結合配列（例えば、Ｏｌｄ Ｗｏｒｌｄ Ｍｏｎｋｅｙ、Ａｐｅなど）及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が挙げられる。

【0175】

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合及び／または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；ナノボディ；一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

【0176】

任意の５つのクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる重鎖を含む、本発明のＲＮＡによってコードされ得る。サブクラスである、ガンマ及びミューをコードするポリヌクレオチド配列も含まれる。それ故、抗体の任意のサブクラスが、部分的または全体的にコードされ得、そして以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む。本発明によれば、現在市販されているかまたは開発中の１つ以上の抗体または断片は、本発明のＲＮＡによってコードされ得る。

【0177】

本発明のＲＮＡにコードされた抗体は、限定するものではないが、血液、心血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科、内分泌学、胃腸、医用イメージング、筋骨格、腫瘍学、免疫学、呼吸器系、感覚系及び抗感染症などの多くの治療分野における状態または疾患の処置に利用され得る。

【0178】

一実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡは、モノクローナル抗体及び／またはその変異体をコードし得る。抗体の変異体としてはまた、限定するものではないが、置換変異体、保存的アミノ酸置換、挿入変異体、欠失変異体及び／または共有結合誘導体も挙げられる。一実施形態では、本明細書に開示のＲＮＡは、免疫グロブリンＦｃ領域をコードし得る。別の実施形態では、ＲＮＡは、変異免疫グロブリンＦｃ領域をコードし得る。

【0179】

本明細書中に開示されるｍＲＮＡは、１つ以上のワクチン抗原をコードし得る。本明細書中で使用される場合、「ワクチン抗原」とは、特定の疾患または感染因子に対する免疫を向上させる生物学的調製物である。本発明によれば、現在市販されているかまたは開発中の１つ以上のワクチン抗原は、本発明のＲＮＡによってコードされ得る。

【0180】

本発明のＲＮＡ中にコードされたワクチン抗原は、がん、アレルギー及び感染性疾患を含むがこれらに限定されない多くの治療分野における状態または疾患を治療するために利用してもよい。いくつかの実施形態では、がんワクチンは、コンカテマーもしくはペプチドエピトープをコードする個々のＲＮＡまたはそれらの組み合わせの形態の個別化されたがんワクチンであってもよい。

【0181】

本発明のＲＮＡは、１つ以上の抗菌ペプチド（ＡＭＰ）または抗ウイルスペプチド（ＡＶＰ）をコードするように設計され得る。ＡＭＰ及びＡＶＰは、限定するものではないが、微生物、無脊椎動物、植物、両生類、鳥類、魚類、及び哺乳類などの広範囲の動物から単離及び記載されている。本明細書に記載の抗微生物ポリペプチドは、１つ以上のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）による細胞融合及び／またはウイルス侵入を遮断し得る。例えば、抗微生物ポリペプチドは、ある領域に対応する合成ペプチド、例えば、ウイルスエンベロープタンパク質、例えばＨＩＶ−１ ｇｐ１２０またはｇｐ４１の膜貫通サブユニットの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０アミノ酸の連続配列を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０またはｇｐ４１のアミノ酸及びヌクレオチド配列は、例えば、Ｋｕｉｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００８）“ＨＩＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ，”Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載されている。

【0182】

いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列相同性を有し得る。

【0183】

他の実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、ある領域に対応する合成ペプチド、例えば、キャプシド結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０アミノ酸の連続配列を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、キャプシド結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列相同性を有し得る。

【0184】

本明細書に記載の抗菌ポリペプチドは、プロテアーゼ二量体化を遮断し、ウイルスプロタンパク質（例えば、ＨＩＶ Ｇａｇ−ｐｏｌプロセシング）の機能性タンパク質への切断を阻害し、それによって１つ以上のエンベロープウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ）の放出を防止し得る。いくつかの実施形態では、抗微生物ポリペプチドは、対応するウイルスタンパク質配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。

【0185】

他の実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、ある領域に対応する合成ペプチド、例えば、プロテアーゼ結合タンパク質の結合ドメインの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０アミノ酸の連続配列を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。いくつかの実施形態では、抗菌性ポリペプチドは、プロテアーゼ結合タンパク質の対応する配列に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％の配列相同性を有し得る。

【0186】

ＲＮＡワクチン抗原または抗菌ペプチドが処置し得る感染性疾患の非限定的な列挙を以下に示す：ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マイコバクテリア感染を引き起こすＨＩＶ、ＡＩＤＳ関連悪液質、ＡＩＤＳ関連サイトメガロウイルス感染、ＨＩＶ関連腎症、脂肪異栄養症、ＡＩＤ関連クリプトコックス髄膜炎、ＡＩＤＳ関連好中球減少症、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｉｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）感染症、ＡＩＤ関連トキソプラズマ症、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型またはＥ型の肝炎、疱疹、帯状疱疹（水疱瘡）、風疹（風疹ウイルス）、黄熱病、デング熱など（フラビウイルス）、インフルエンザ（インフルエンザウイルス）、出血性感染症（マールブルグまたはエボラウイルス）、レジオネラ症などの細菌感染症（レジオネラ）、胃潰瘍（ヘリコバクター）、コレラ（ビブリオ））、Ｅ．ｃｏｌｉ感染、ブドウ球菌感染症、サルモネラ感染症またはレンサ球菌感染症、破傷風（破傷風菌）、原虫感染症（マラリア、睡眠病、リーシュマニア症、トキソプラズマ症、すなわち、プラスモジウム、トリパノソーマ、リーシュマニア及びトキソプラズマによって引き起こされる感染症）、ジフテリア、ハンセン病、はしか、百日咳、狂犬病、破傷風、結核、腸チフス、水痘、下痢感染症、例えば、アメーバ症、クロストリジウム・ディフィシレ関連下痢症（ＣＤＡＤ）、クリプトスポリジウム症、ジアルジア症、シクロスポリア症及びロタウイルス性胃腸炎、日本脳炎などの脳炎、西部ウマ脳炎及びダニ媒介脳炎（ＴＢＥ）、真菌性皮膚病、例えば、カンジダ症、爪甲真菌症、頭部白癬／しらくも、体部白癬（Ｔｉｎｅａ ｃｏｒｐｏｒｉｓ）／体部白癬（ｂｏｄｙ ｒｉｎｇｗｏｒｍ）、頑癬／いんきんたむし、スポロトリクム症及び足白癬／水虫（Ａｔｈｌｅｔｅ’ｓ ｆｏｏｔ）、髄膜炎、例えば、インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）、髄膜炎、ウイルス性、髄膜炎菌感染症及び肺炎球菌感染症、軽視される熱帯病、例えば、アルゼンチン出血熱、リーシュマニア症、線形動物／線虫感染、ロスリバーウイルス感染症及び西ナイルウイルス（ＷＮＶ）病、非ＨＩＶ ＳＴＤ、例えば、トリコモナス症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、性感染性クラミジア疾患、軟性下疳及び梅毒、非特異的細菌感染、例えば、蜂窩織炎、ライム病、ＭＲＳＡ感染、シュードモナス、ブドウ球菌感染症、ボタン熱、レプトスピラ症、リウマチ熱、ボツリヌス中毒症、リケッチア症及び乳様突起炎、寄生生物感染、例えば、嚢虫症、エキノコックス症、吸虫（Ｔｒｅｍａｔｏｄｅ）／吸虫感染（Ｆｌｕｋｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、旋毛虫症、バベシア症、牛バエ幼虫症、裂頭条虫症及びトリパノソーマ症、呼吸器感染症、例えば、アデノウイルス感染、アスペルギルス症感染、鳥（Ｈ５Ｎ１）インフルエンザ、インフルエンザ、ＲＳＶ感染、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、副鼻腔炎、レジオネラ症、コクシジオイデス症及びブタ（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザ、菌血症などの敗血症、敗血症／敗血性ショック、未熟児における敗血症、尿路感染症、例えば、膣感染症（細菌性）、膣感染症（真菌）及び淋菌感染、ウイルス性皮膚疾患、例えば、Ｂ１９パルボウイルス感染症、いぼ、性器ヘルペス、口腔顔面ヘルペス、帯状疱疹、内耳感染症、胎児サイトメガロウイルス症候群、食物感染症、例えば、ブルセラ症（Ｂｒｕｃｅｌｌａ種）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（Ｅｐｓｉｌｏｎ毒素）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サルモネラ中毒（サルモネラ種）、Ｓｈｉｎｇｅｌｌｏｓｉｓ（Ｓｈｉｎｇｅｌｌａ）、ビブリオ症及びリステリア症、バイオテロリズム及び潜在的な流行性疾患、例えば、エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルク出血熱、ペスト、炭疽ニパウイルス病、ハンタウイルス、痘瘡、鼻疽（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、Ｐｓｉｔｔａｃｏｓｉｓ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、Ｑ熱（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、野兎病（Ｆａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、風疹、おたふく風邪及びポリオ。

【0187】

本明細書中に開示されるＲＮＡは、１つ以上の確認された、または「試験中」の治療用タンパク質またはペプチドをコードし得る。本発明によれば、現在市販されているかまたは開発中の１つ以上の治療用タンパク質またはペプチドを、本発明のＲＮＡによってコードしてもよい。本発明のＲＮＡにコードされる治療用タンパク質及びペプチドは、限定するものではないが、血液、心血管、ＣＮＳ、中毒（抗毒素を含む）、皮膚科、内分泌学、遺伝学、尿生殖器、胃腸、筋骨格系、腫瘍学、及び免疫学、呼吸器系、感覚系及び抗感染症などの、多くの治療分野における状態または疾患を処置するために利用され得る。

【0188】

本明細書中に開示されるＲＮＡは、１つ以上の細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。本明細書中で使用される場合、「細胞透過性ポリペプチド」またはＣＰＰとは、分子の細胞内取り込みを促進し得るポリペプチドを指す。本発明の細胞透過性ポリペプチドは、１つ以上の検出可能な標識を含み得る。ポリペプチドは部分的に標識されていても全体にわたって完全に標識されていてもよい。ＲＮＡは、検出可能な標識を完全にコードしていても、部分的にコードしていても、または全くコードしていなくてもよい。細胞透過性ペプチドは、シグナル配列も含んでもよい。本明細書中で使用される場合、「シグナル配列」とは、タンパク質翻訳中に新生タンパク質のアミノ末端に結合したアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、細胞透過性ポリペプチドの分泌をシグナル伝達するために使用され得る。

【0189】

一実施形態では、ＲＮＡはまた、融合タンパク質もコードし得る。この融合タンパク質は、荷電タンパク質を治療用タンパク質に作動可能に連結することによって作製され得る。本明細書中で使用される場合、「作動可能に連結された」とは、細胞内に導入された場合、複合体の発現を可能にするように連結されている治療用タンパク質及び荷電タンパク質を指す。本明細書中で使用される場合、「荷電タンパク質」とは、正、負または全体的に中性の電荷を帯びたタンパク質を指す。好ましくは、治療用タンパク質は、融合タンパク質の形成において荷電タンパク質に共有結合され得る。全アミノ酸または表面アミノ酸に対する表面電荷の比は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８または０．９であってもよい。

【0190】

ＲＮＡによってコードされる細胞透過性ポリペプチドは、翻訳後に複合体を形成し得る。この複合体は、細胞透過性ポリペプチドに連結、例えば、共有結合した荷電タンパク質を含んでもよい。

【0191】

一実施形態では、細胞透過性ポリペプチドは、第１ドメイン及び第２ドメインを含んでもよい。第１ドメインは、過荷電ポリペプチドを含んでもよい。第２ドメインは、タンパク質結合パートナーを含んでもよい。本明細書中で使用される場合、「タンパク質結合パートナー」としては、限定するものではないが、抗体及びその機能的断片、足場タンパク質、またはペプチドが挙げられる。細胞透過性ポリペプチドは、タンパク質結合パートナーに対する細胞内結合パートナーをさらに含んでもよい。細胞透過性ポリペプチドは、ＲＮＡが導入され得る細胞から分泌され得る。細胞透過性ポリペプチドはまた、第１の細胞も透過し得る。

【0192】

一実施形態では、ＲＮＡは、タンパク質結合パートナーを含み得る細胞透過性ポリペプチドをコードし得る。タンパク質結合パートナーとしては、限定するものではないが、抗体、超荷電抗体または機能的断片が挙げられる。ＲＮＡは、タンパク質結合パートナーを含む細胞透過性ポリペプチドが導入されている細胞に導入されてもよい。

【0193】

ヒト及び他の真核細胞は、膜によって多くの機能的に異なる区画に細分される。各膜結合区画、すなわち細胞小器官は、細胞小器官の機能に必須の異なるタンパク質を含む。細胞は、タンパク質を特定の細胞小器官に向けるために、タンパク質内に位置するアミノ酸モチーフである「選別シグナル」を使用する。シグナル配列、シグナルペプチド、またはリーダー配列と呼ばれる１種の選別シグナルは、あるクラスのタンパク質を小胞体（ＥＲ）と呼ばれる細胞小器官へ向かわせる。

【0194】

シグナル配列によってＥＲを標的とするタンパク質は、分泌タンパク質として細胞外空間に放出され得る。同様に、細胞膜上に存在するタンパク質もまた、タンパク質を膜に保持する「リンカー」のタンパク質分解的切断によって細胞外空間に分泌され得る。理論に束縛されることを望まないが、本発明の分子は、上記の細胞輸送を活用するために使用され得る。そのため、本発明のいくつかの実施形態では、分泌タンパク質を発現させるためにＲＮＡが提供される。一実施形態では、これらは大量の貴重なヒト遺伝子産物の製造に使用してもよい。

【0195】

本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡを提供して、原形質膜のタンパク質を発現する。

【0196】

本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡを提供して、細胞質タンパク質または細胞骨格タンパク質を発現する。

【0197】

本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡを提供して、細胞内膜結合タンパク質を発現する。

【0198】

本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡを提供して、核タンパク質を発現する。

【0199】

本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡを提供して、ヒトの疾患に関連するタンパク質を発現する。

【0200】

ＲＮＡは、天然もしくは天然に存在するＲＮＡのヌクレオチド配列を有してもよく、または天然もしくは天然に存在するペプチドをコードするヌクレオチド配列を有してもよい。あるいは、ＲＮＡは、天然または天然に存在するＲＮＡのヌクレオチド配列に対してあるパーセントの同一性を有するヌクレオチド配列を有してもよいし、またはｍＲＮＡは、天然または天然に存在するペプチドのヌクレオチド配列に対してあるパーセントの同一性を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を有してもよい。当技術分野において公知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性とはまた、２つ以上のアミノ酸残基のストリング間の一致の数によって決定されるように、ペプチド間の配列関連性の程度も意味する。同一性は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって対処されるギャップアライメント（もしあれば）を有する２つ以上の配列のうち小さい方の間の同一の一致のパーセントを測定する。関連ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。そのような方法としては、限定するものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載される方法が挙げられる。

【0201】

したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡによってコードされるペプチドは、参照ポリペプチドと同じまたは類似の活性を有し得るポリペプチド変異体である。あるいは、変異体は、参照ポリペプチドと比較して変更された活性（例えば、増大または減少）を有し得る。一般に、本発明の特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、本明細書に記載の及び当業者に公知の配列アラインメントプログラム及びパラメーターにより決定した場合、その特定の参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、ただし１００％未満の配列同一性を有する。そのようなアラインメントのためのツールとしては、ＢＬＡＳＴスイートのツール（Ｓｔｅｐｈｅｎ Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，Ａｌｅｊａｎｄｒｏ Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ，Ｊｉｎｇｈｕｉ Ｚｈａｎｇ，Ｚｈｅｎｇ Ｚｈａｎｇ，Ｗｅｂｂ Ｍｉｌｌｅｒ，ａｎｄＤａｖｉｄ Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）ａｎｄ“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２．）が挙げられる。他のツールは、本明細書中に、具体的には「同一性」の定義において、記載されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズム中のデフォルトパラメーターとしては、例えば、期待閾値１０、ワードサイズ２８、一致／不一致スコア１、−２、ギャップコスト線形が挙げられる。例えばホモサピエンスのような、種特異的反復のための選択と同様に、任意のフィルターを適用してもよい。

【0202】

本発明によれば、ポリヌクレオチドは、目的の１つ以上のポリペプチドまたはその断片をコードするためのＲＮＡを含む。目的のポリペプチドとしては、限定するものではないが、全ポリペプチド、複数のポリペプチドまたはポリペプチドの断片が挙げられる。本明細書中で使用される場合、「目的のポリペプチド」という用語は、本発明の一次構築物中にコードされるように選択される任意のポリペプチドを指す。本明細書において用いる場合、「ポリペプチド」とは、最も多くの場合ペプチド結合によって一緒に結合される、アミノ酸残基のポリマー（天然または非天然）を意味する。この用語は、本明細書で使用する場合、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。いくつかの例では、コードされるポリペプチドは、約５０アミノ酸より小さく、そのためこのポリペプチドは、ペプチドと呼ばれる。ポリペプチドがペプチドである場合、それは少なくとも約２、３、４、または少なくとも５アミノ酸残基の長さであろう。したがって、ポリペプチドとしては、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、ならびに上述の他の等価物、変異体、及び類似体が挙げられる。ポリペプチドは、単一分子であってもよく、または二量体、三量体もしくは四量体のような多分子複合体であってもよい。それらはまた、抗体またはインスリンなどの単鎖または多鎖ポリペプチドを含んでもよく、そして会合または連結されてもよい。最も一般的なジスルフィド結合は、多鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用され得る。

【0203】

「ポリペプチド変異体」という用語は、それらのアミノ酸配列が天然または参照配列と異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然または参照配列と比較して、アミノ酸配列内の特定の位置に置換、欠失、及び／または挿入を有し得る。通常、変異体は天然または参照配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有し、そして好ましくは、それらは天然または参照配列に対して少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％同一である。

【0204】

いくつかの実施形態では、「変異体模倣物」が提供される。本明細書において用いる場合、「変異体模倣物」という用語は、活性化配列を模倣するであろう１つ以上のアミノ酸を含むものである。例えば、グルタメートは、ホスホロ−トレオニン及び／またはホスホロ−セリンの模倣物として役立ち得る。あるいは、変異体模倣物は、不活性化をもたらし得る場合もあるし、または模倣物を含有する不活性化生成物をもたらす場合もあり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活性化置換として作用する場合もあり；またはアラニンは、セリンの不活性化置換として作用する場合もある。

【0205】

本発明は、変異体及び誘導体を含むポリペプチドベースのいくつかの種類の組成物を企図する。これらとしては、置換型、挿入型、欠失型及び共有結合型の変異体及び誘導体が挙げられる。「誘導体」という用語は、「変異体」という用語と同義で使用されるが、一般には、参照分子または出発分子に対して何らかの方法で修飾及び／または変更されている分子を指す。

【0206】

そのように、参照配列、特に本明細書に開示されているポリペプチド配列に関して置換、挿入及び／または付加、欠失及び共有結合修飾を含むポリペプチドをコードするＲＮＡは、本発明の範囲内に含まれる。例えば、１以上のリジンのような配列タグまたはアミノ酸を、本発明のペプチド配列に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端に）付加してもよい。配列タグは、ペプチド精製に使用しても、または局在化に使用してもよい。リジンは、ペプチドの溶解度を高めるため、またはビオチン化を可能にするために使用してもよい。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシ及びアミノ末端領域に位置するアミノ酸残基は任意選択的に、短縮配列を提供するために欠失されてもよい。特定のアミノ酸（例えば、Ｃ末端残基またはＮ末端残基）は、代わりに、例えば、可溶性であるか、または固体に結合しているより大きな配列の一部としての配列の発現など、配列の用途に応じて欠失されてもよい。

【0207】

ポリペプチドに言及する場合の「置換変異体」とは、天然配列または出発配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所の同じ位置に異なるアミノ酸が挿入されているものである。置換は、分子中の１個のアミノ酸のみが置換されている場合は単一でもよく、または同一分子中で２個以上のアミノ酸が置換されている場合は複数であってもよい。

【0208】

本明細書中で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、同様のサイズ、電荷、または極性の異なるアミノ酸による置換をいう。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン及びロイシンなどの非極性（疎水性）残基の別の非極性残基への置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、グリシンとセリンの間などの、ある極性（親水性）残基の別のものへの置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニンもしくはヒスチジンなどの塩基性残基の別のものへの置換、またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基の別の酸性残基への置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、システイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリジンなどの極性（親水性）残基の代わりに、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基の置換及び／または非極性残基の場合は極性残基の置換が挙げられる。

【0209】

ポリペプチドに言及するときの「挿入変異体」とは、天然または出発配列中の特定の位置のアミノ酸に直接隣接して挿入された１つ以上のアミノ酸を有するものである。アミノ酸に「直接隣接する」とは、そのアミノ酸のアルファ−カルボキシ官能基またはアルファ−アミノ官能基のいずれかに結合していることを意味する。

【0210】

ポリペプチドに言及する場合の「欠失変異体」は、天然のまたは出発アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異体は、分子の特定の領域において１つ以上のアミノ酸が欠失しているであろう。

【0211】

ポリペプチドに言及する場合の「共有結合誘導体」としては、有機タンパク質または非タンパク質誘導体誘導体化剤を用いた天然または出発タンパク質の修飾、及び／または翻訳後修飾が挙げられる。共有結合修飾は、伝統的には、タンパク質の標的アミノ酸残基を、選択された側鎖もしくは末端残基と反応し得る有機誘導体化剤と反応させることによって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用することによって導入される。得られた共有結合誘導体は、生物学的活性、イムノアッセイ、または組換え糖タンパク質の免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体の調製に重要な残基を同定することに向けられたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、当該技術分野の範囲内であり、過度の実験をすることなく行われる。

【0212】

特定の翻訳後修飾は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基はしばしば翻訳後に対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明に従って製造されたポリペプチド中に存在し得る。

【0213】

他の翻訳後修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のアルファアミノ基のメチル化が挙げられる（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））。

【0214】

ポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、１つ以上の同定可能な構造的または機能的特徴または特性（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用の部位として働く結合能力）を有するポリペプチドのモチーフを指す。

【0215】

ポリペプチドに関して本明細書中で使用される場合、アミノ酸ベースの実施形態に関する「部位」という用語は、「アミノ酸残基」及び「アミノ酸側鎖」と同義的に使用される。ある部位は、本発明のポリペプチドに基づく分子内で修飾、操作、変更、誘導体化または多様化され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。

【0216】

本明細書中で使用される場合、「末端の」または「末端」という用語は、ポリペプチドに言及する場合、ペプチドまたはポリペプチドの末端を指す。そのような末端は、ペプチドまたはポリペプチドの最初または最後の部位だけに限定されず、末端領域にさらなるアミノ酸を含んでもよい。本発明のポリペプチドベースの分子は、Ｎ末端（遊離アミノ基（ＮＨ２）を有するアミノ酸で終結）及びＣ末端（遊離カルボキシル基（ＣＯＯＨ）を有するアミノ酸で終結）の両方を有することを特徴とし得る。本発明のタンパク質は、いくつかの場合において、ジスルフィド結合によってまたは非共有結合力（マルチマー、オリゴマー）によって一緒にされた複数のポリペプチド鎖から構成されている。これらの種類のタンパク質は、複数のＮ末端及びＣ末端を有するであろう。あるいは、ポリペプチドの末端は、場合によっては有機複合体などの非ポリペプチド系部分で開始または終了するように修飾されてもよい。

【0217】

いずれかの特徴が本発明のＲＮＡによってコードされるポリペプチドの所望の成分として同定または定義されると、これらの特徴のいくつかの操作及び／または修飾のいずれかを、移動、交換、反転、欠失、ランダム化または複製によって行ってもよい。さらに、特徴の操作が本発明の分子に対する修飾と同じ結果をもたらし得ることが理解される。例えば、全長未満の分子をコードするように核酸を修飾するのと同様に、ドメインを欠失させることを含む操作は、分子の長さの変更をもたらすであろう。

【0218】

修飾及び操作は、それだけに限らないが、部位特異的突然変異誘発などの当技術分野において公知の方法によって達成してもよい。次いで、得られた修飾分子を、本明細書に記載のものなどのインビトロまたはインビボアッセイ、または当技術分野で公知の他の任意の適切なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験してもよい。

【0219】

製剤／薬学的組成物
本発明は、ポリヌクレオチド及びそれらの医薬組成物を、任意選択的に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて提供する。薬学的組成物は、任意選択的に１つ以上の追加の活性物質、例えば、治療的及び／または予防的に活性な物質を含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、無菌であっても、及び／または発熱物質を含まないものであってもよい。製剤及び／または薬剤の製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に見出され得る。

【0220】

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という句は、一般に、本明細書に記載されるように送達されるポリヌクレオチド、例えば、ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを指す。

【0221】

本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるか、または今後開発される任意の方法によって調製される場合もある。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで必要に応じて及び／または望ましい場合には生成物を、望ましい単回または複数回投与単位に分割、成形及び／または包装するステップを包含する。

【0222】

本発明による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、治療される対象の同一性、大きさ、及び／または状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、この組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。

【0223】

本発明のポリヌクレオチドを、１つ以上の賦形剤を用いて製剤化して、以下を行ってもよい：（１）安定性を増大する；（２）細胞トランスフェクションを増大させる；（３）持続放出または遅延放出を可能にする（例えばデポ製剤から）；（４）生体内分布を変える（例えば、特定の組織または細胞型を標的とする）；（５）インビボでコードされたタンパク質の翻訳を増大させるか；及び／または（６）インビボでコードされたタンパク質の放出プロファイルを変える。あらゆる溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、賦形剤などの従来の賦形剤に加えて、本発明の賦形剤としては、限定するものではないが、脂質、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチドでトランスフェクトした細胞、ヒアルロニダーゼ、ナノ粒子模倣物、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0224】

いくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、１つ以上のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化してもよい。一実施形態では、核酸分子の医薬組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子はＭＣ３ベースの脂質ナノ粒子である。

【0225】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質−ポリカチオン複合体に製剤化してもよい。脂質−ポリカチオン複合体の形成は、当該分野において公知の方法によって達成され得る。非限定的な例として、ポリカチオンとしては、限定するものではないが、ポリリジン、ポリオルニチン及び／またはポリアルギニンなどのカチオン性ペプチドまたはポリペプチドを含み得る。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、コレステロールまたはジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などの非カチオン性脂質をさらに含み得る、脂質−ポリカチオン複合体中に製剤化され得る。

【0226】

リポソーム製剤は、限定するものではないが、カチオン性脂質成分の選択、カチオン性脂質飽和度、ＰＥＧ化の性質、全成分の比率、及びサイズなどの生物物理学的パラメーターの影響を受ける場合がある。Ｓｅｍｐｌｅら（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０ ２８：１７２−１７６：その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）による一例では、リポソーム製剤は、５７．１％のカチオン性脂質、７．１％のジパルミトイルホスファチジルコリン、３４．３％のコレステロール、及び１．４％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡから構成された。別の例として、カチオン性脂質の組成を変えることは、様々な抗原提示細胞にｓｉＲＮＡをより効果的に送達し得る（Ｂａｓｈａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１ １９：２１８６−２２００；その全体が参照により本明細書に組み入れられる）。いくつかの実施形態では、リポソーム製剤は、約３５〜約４５％のカチオン性脂質、約４０％〜約５０％のカチオン性脂質、約５０％〜約６０％のカチオン性脂質及び／または約５５％〜約６５％のカチオン性脂質を含んでもよい。いくつかの実施形態では、リポソーム中の脂質対ＲＮＡの比は、約５：１〜約２０：１、約１０：１〜約２５：１、約１５：１〜約３０：１、及び／または少なくとも３０：１であってもよい。

【0227】

いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中のＰＥＧの比率を増減してもよいし、及び／またはＰＥＧ脂質の炭素鎖長をＣ１４からＣ１８に変更してＬＮＰ製剤の薬物動態及び／または生体分布を変えてもよい。非限定的な例として、ＬＮＰ製剤は、約０．５％〜約３．０％、約１．０％〜約３．５％、約１．５％〜約４．０％、約２．０％〜約４．５％、約２．５％〜約５．０％、及び／または約３．０％〜約６．０％の脂質モル比のＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（Ｒ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル）］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン）（本明細書ではＰＥＧ−ＤＯＭＧとも呼ばれる）をカチオン性脂質、ＤＳＰＣ及びコレステロールと比較して含んでもよい。別の実施形態では、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、限定するものではないが、ＰＥＧ−ＤＳＧ（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＧ（１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール）及び／またはＰＥＧ−ＤＰＧ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール）などの、ＰＥＧ脂質で置き換えてもよい。カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、Ｃ１２−２００及びＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどの当該分野で公知の任意の脂質から選択されてもよい。

【0228】

一実施形態では、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの脂質を含み得るナノ粒子に製剤化される。この脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、９８Ｎ１２−５、Ｃ１２−２００、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ化脂質及びアミノアルコール脂質から選択され得る。別の態様では、脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−Ｄ−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＯＤＭＡ及びアミノアルコール脂質などのカチオン性脂質であってもよい。アミノアルコールカチオン性脂質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３０１５０６２５号に記載されている脂質であってもよいし、及び／またはそれに記載の方法よって製造された脂質であってもよい。非限定的な例として、カチオン性脂質は、２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５中の化合物１）；２−アミノ−３−［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ）−オクタデカ−９−エン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物２）；２−アミノ−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−［（オクチルオキシ）メチル］プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５中の化合物３）；及び２−（ジメチルアミノ）−３−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−２−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝プロパン−１−オール（ＵＳ２０１３０１５０６２５の化合物４）；またはその任意の薬学的に許容される塩もしくは立体異性体であってもよい。

【0229】

脂質ナノ粒子製剤は、典型的には脂質、特にイオン化可能カチオン性脂質、例えば２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、またはジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）を含み、さらに中性脂質、ステロール及び粒子凝集を減少し得る分子、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む。

【0230】

一実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）からなる群より選択される少なくとも１つの脂質；（ｉｉ）ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭから選択される中性脂質；（ｉｉｉ）ステロール、例えばコレステロール；ならびに（ｉｖ）約２０〜６０％のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のステロール；０．５〜１５％のＰＥＧ−脂質のモル比のＰＥＧ−脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡから本質的になる。

【0231】

一実施形態では、この製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択されるカチオン性脂質をモル基準で約２５％〜約７５％まで、例えば、モル基準で、約３５〜約６５％、約４５〜約６５％、約６０％、約５７．５％、約５０％または約４０％含む。

【0232】

一実施形態では、この製剤は、中性脂質をモル基準で約０．５％〜約１５％、例えばモル基準で約３〜約１２％、約５〜約１０％、または約１５％、約１０％、または約７．５％含む。例示的な中性脂質としては、限定するものではないが、ＤＳＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ及びＳＭが挙げられる。一実施形態では、この製剤は、ステロールをモル基準で約５％〜約５０％（例えば、モル基準で約１５〜約４５％、約２０〜約４０％、約４０％、約３８．５％、約３５％または約３１％）含む。例示的なステロールはコレステロールである。一実施形態では、この製剤は、モル基準で約０．５％〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質（例えば、モル基準で約０．５〜約１０％、約０．５〜約５％、約１．５％、約０．５％、約１．５％、約３．５％、または約５％）を含む。一実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、２，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧ分子を含む。他の実施形態では、ＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質は、２，０００未満、例えば約１，５００Ｄａ、約１，０００Ｄａ、または約５００Ｄａの平均分子量のＰＥＧ分子を含む。例示的なＰＥＧ修飾脂質としては、限定するものではないが、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（本明細書ではＰＥＧ−Ｃ１４またはＣ１４−ＰＥＧとも呼ばれる）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡが挙げられる。

【0233】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される２５〜７５％のカチオン性脂質、０．５〜１５％の中性脂質、５〜５０％のステロール、及び０．５〜２０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0234】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）、から選択される３５〜６５％のカチオン性脂質、３〜１２％の中性脂質、１５〜４５％のステロール、及び０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0235】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される４５〜６５％のカチオン性脂質、５〜１０％の中性脂質、２５〜４０％のステロール、及び０．５〜１０％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0236】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約６０％のカチオン性脂質、約７．５％の中性脂質、約３１％のステロール、及び約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0237】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約５０％のカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３８．５％のステロール、及び約１．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0238】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約５０％のカチオン性脂質、約１０％の中性脂質、約３５％のステロール、約４．５％または約５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質、及び約０．５％の標的脂質をモル基準で含む。

【0239】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約４０％のカチオン性脂質、約１５％の中性脂質、約４０％のステロール、及び約５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0240】

一実施形態では、本発明の製剤は、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）、ジリノレイル−メチル−４−ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）、及びジ（（Ｚ）−ノナ−２−エン−１−イル）９−（（４−（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）から選択される約５７．２％のカチオン性脂質、約７．１％の中性脂質、約３４．３％のステロール、及び約１．４％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0241】

一実施形態では、本発明の製剤は、ＰＥＧ脂質から選択される約５７．５％のカチオン性脂質であるＰＥＧ−ｃＤＭＡ（ＰＥＧ−ｃＤＭＡは、Ｒｅｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１０７，２７６−２８７（２００５）（その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる）にさらに考察されている）、約７．５％の中性脂質、約３１．５％のステロール、及び約３．５％のＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をモル基準で含む。

【0242】

好ましい実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、モル比で約２０〜７０％のカチオン性脂質：５〜４５％の中性脂質：２０〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質；より好ましくは、約２０〜６０％のモル比のカチオン性脂質：５〜２５％の中性脂質：２５〜５５％のコレステロール：０．５〜１５％のＰＥＧ修飾脂質の脂質混合物から本質的になる。

【0243】

特定の実施形態では、脂質モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（モル％カチオン性脂質／中性脂質、例えば、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ＤＳＧまたはＰＥＧ−ＤＰＧ）、５７．２／７．１１３４．３／１．４（モル％カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＰＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、４０／１５／４０／５（モル％カチオン性脂質／中性）脂質、例えばＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ）、５０／１０／３５／４．５／０．５（モル％カチオン性脂質／中性脂質、例えば、ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＳＧ）、５０／１０／３５／５（カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧ）、４０／１０／４０／１０（モル％カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）、３５／１５／４０／１０（ｍｏｌ％カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−修飾脂質、例えば、ＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）または５２／１３／３０／５（モル％カチオン性脂質／中性脂質、例えばＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ修飾脂質、例えばＰＥＧ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−ｃＤＭＡ）である。

【0244】

例示的な脂質ナノ粒子組成物及びそれを作製する方法は、例えば、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：１７２−１７６；Ｊａｙａｒａｍａ ｅｔ ａｌ．（２０１２）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，５１：８５２９−８５３３；及びＭａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２１，１５７０−１５７８（それぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。

【0245】

一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質、及び構造脂質を含んでもよく、任意選択的に非カチオン性脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜１５％の非カチオン性脂質、約１〜２％のＰＥＧ脂質、及び約３０〜５０％の構造的脂質を含み得る。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ脂質、及び約３８．５％の構造脂質を含み得る。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、及び約３２．５％の構造脂質を含み得る。一実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及びＬ３１９などの、本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であり得る。

【0246】

一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、４成分脂質ナノ粒子であってもよい。脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質及び構造脂質を含み得る。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約４０〜６０％のカチオン性脂質、約５〜１５％の非カチオン性脂質、約１〜２％のＰＥＧ脂質、及び約３０〜５０％の構造脂質を含んでもよい。別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約１．５％のＰＥＧ脂質、及び約３８．５％の構造脂質を含んでもよい。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質、約１０％の非カチオン性脂質、約２．５％のＰＥＧ脂質、及び約３２．５％の構造脂質を含んでもよい。一実施形態では、カチオン性脂質は、限定するものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ及びＬ３１９などの本明細書に記載の任意のカチオン性脂質であってもよい。

【0247】

一実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ脂質及び構造脂質を含んでもよい。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧ及び約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＯＭＧ及び約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５０％のカチオン性脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約１．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ及び約３８．５％の構造脂質コレステロールを含む。さらに別の非限定的な例として、脂質ナノ粒子は、約５５％のカチオン性脂質Ｌ３１９、約１０％の非カチオン性脂質ＤＳＰＣ、約２．５％のＰＥＧ脂質ＰＥＧ−ＤＭＧ、及び約３２．５％の構造脂質コレステロールを含む。

【0248】

一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、直径が約１０〜約１００ｎｍ、例えば、限定するものではないが、約１０〜約２０ｎｍ、約１０〜約３０ｎｍ、約１０〜約４０ｎｍ、約１０〜約５０ｎｍ、約１０〜約６０ｎｍ、約１０〜約７０ｎｍ、約１０〜約８０ｎｍ、約１０〜約９０ｎｍ、約２０〜約３０ｎｍ、約２０〜４０ｎｍ、約２０〜約５０ｎｍ、約２０〜約６０ｎｍ、約２０〜約７０ｎｍ、約２０〜約８０ｎｍ、約２０〜約９０ｎｍ、約２０〜約１００ｎｍ、約３０〜約４０ｎｍ、約３０〜約５０ｎｍ、約３０〜約６０ｎｍ、約３０〜約７０ｎｍ、約３０〜約８０ｎｍ、約３０〜約９０ｎｍ、約３０〜約１００ｎｍ、約４０〜約５０ｎｍ、約４０〜約６０ｎｍ、約４０〜約７０ｎｍ、約４０〜約８０ｎｍ、約４０〜約９０ｎｍ、約４０〜約１００ｎｍ、約５０〜約６０ｎｍ、約５０〜約７０ｎｍ、約５０〜約８０ｎｍ、約５０〜約９０ｎｍ、約５０〜約１００ｎｍ、約６０〜約７０ｎｍ、約６０〜約８０ｎｍ、約６０〜約９０ｎｍ、約６０〜約１００ｎｍ、約７０〜約８０ｎｍ、約７０〜約９０ｎｍ、７０〜約１００ｎｍ、約８０〜約９０ｎｍ、約８０〜約１００ｎｍ及び／または約９０〜約１００ｎｍの脂質ナノ粒子に製剤化され得る。

【0249】

一実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜５００ｎｍの直径を有し得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ超、１５０ｎｍ超、２００ｎｍ超、２５０ｎｍ超、３００ｎｍ超、３５０ｎｍ超、４００ｎｍ超、４５０ｎｍ超、５００ｎｍ超、５５０ｎｍ超、６００ｎｍ超、６５０ｎｍ超、７００ｎｍ超、７５０ｎｍ超、８００ｎｍ超、８５０ｎｍ超、９００ｎｍ超、９５０ｎｍ超または１０００ｎｍ超の直径を有してもよい。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、５０〜１５０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質ナノ粒子は、８０〜１００ｎｍの平均直径を有する。

【0250】

本開示による医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、大きさ、及び／または状態に応じて、さらに組成物を投与する経路に応じて変化してもよい。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。

【0251】

一実施形態では、この組成物は、ＭＣ３、コレステロール、ＤＳＰＣ及びＰＥＧ２０００−ＤＭＧ、緩衝剤クエン酸三ナトリウム、スクロース、ならびに注射用水を含む脂質ナノ粒子に製剤化された、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含有する。非限定的な例として、この組成物は、以下を含む：２．０ｍｇ／ｍＬの製剤原料、２１．８ｍｇ／ｍＬのＭＣ３、１０．１ｍｇ／ｍＬのコレステロール、５．４ｍｇ／ｍＬのＤＳＰＣ、２．７ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ２０００−ＤＭＧ、５．１６ｍｇ／ｍＬのクエン酸三ナトリウム、７１ｍｇ／ｍＬのスクロース及び約１．０ｍＬの注射用水。

【0252】

本発明のポリヌクレオチドは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与してもよい。本発明は、それを必要とする対象に本発明に従ってポリヌクレオチドを投与することを包含する方法を提供する。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、及び全身状態、疾患の重篤度、特定の組成物、その投与方法、その活動方法などに応じて、対象ごとに異なるであろう。本発明に従う組成物は、典型的には投与の容易さ及び投薬量の均一性のために単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の１日の総使用量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定され得ることが理解されるであろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療上有効、予防上有効、または適切な画像化投与量レベルは、処置される障害及び障害の重症度；用いた特定の化合物の活性；採用した特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食事；採用した特定の化合物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；処置の期間；使用される特定の化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬物；ならびに医学の分野で周知の同様の要因を含む様々な要因に依存するであろう。

【0253】

特定の実施形態では、本発明による組成物は、所望の治療的、診断的、予防的、または画像化を得るために、１日あたり１回以上、１日あたり対象の体重１ｋｇあたり、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約０．００５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇを送達するのに十分な用量レベルで投与され得る。所望の投与量は、１日３回、１日２回、１日１回、隔日、３日ごと、毎週、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに送達され得る。特定の実施形態では、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４またはそれ以上の投与）を使用して送達され得る。複数回投与を採用する場合、本明細書に記載の投与計画のような分割投与計画を使用してもよい。

【0254】

本明細書に記載のポリヌクレオチド医薬組成物は、鼻腔内、気管内、または注射用（例えば、静脈内、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内、心臓内、腹腔内、及び皮下）のような、本明細書に記載の剤形に製剤化してもよい。

【0255】

本発明は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子）ならびに任意選択的に１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせたポリヌクレオチド組成物及び／または複合体を含む医薬組成物を提供する。

【0256】

本発明は、ポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子）ならびに関連する医薬組成物及び複合体を、任意選択的に１つ以上の医薬上許容される賦形剤と組み合わせて提供する。薬学的組成物は、１つ以上の追加の活性物質、例えば治療的及び／または予防的活性物質を任意選択的に含んでもよい。本発明の薬学的組成物は、無菌であっても、及び／または発熱物質を含まないものであってもよい。医薬品の製剤及び／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に見出され得る。

【0257】

いくつかの実施形態では、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的のために、「活性成分」という句は、一般に、本明細書に記載されるように送達されるべきポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ分子）を指す。

【0258】

本明細書で提供される薬学的組成物の説明は、主にヒトへの投与に適した薬学的組成物を対象としているが、そのような組成物は一般に任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物への投与に適していると当業者には理解されるだろう。組成物を様々な動物への投与に適したものにさせるための、ヒトへの投与に適した薬学的組成物の修飾は十分に理解されており、当業者の獣医薬理学者は、存在する場合、単に通常の実験を用いてそのような修飾を設計及び／または実施し得る。薬学的組成物の投与が企図される対象としては、限定するものではないが、ヒト及び／または他の霊長類；哺乳動物、例としては、商業的に関連のある哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／またはラットなど；及び／または鳥類、例としては、商業的に関連する鳥、例えば、家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ及び／または七面鳥が挙げられる。

【0259】

本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野において公知であるかまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、そのような調製方法は、活性成分を賦形剤及び／または１つ以上の他の副成分と会合させ、次いで必要に応じて及び／または望ましい場合にはその生成物を、望ましい単回または複数回投与単位に分割、成形及び／または包装するステップを包含する。

【0260】

本発明による薬学的組成物中の活性成分、薬学的に許容される賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、大きさ、及び／または状態に応じて、さらにその組成物が投与される経路に応じて変化する。例として、この組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含んでもよい。

【0261】

本発明は、その適用において、以下の説明に記載されるかまたは図面に示される構成の詳細及び構成要素の配置に限定されない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または実行されてもよい。また、本明細書で使用されている表現及び用語は説明を目的としており、限定と見なされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」、「含有する」、「包含する」、及びそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目及びその等価物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。

【実施例】

【0262】

実施例１．ポリヌクレオチドの製造
本発明によれば、ポリヌクレオチド及び／またはその部分もしくは領域の製造は、「Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ」（代理人整理番号Ｍ５００）と題する、２０１３年３月１５日に出願されたＷＯ２０１４／１５２０２７（その内容が、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示される方法を利用して達成され得る。精製方法は、国際特許出願ＷＯ２０１４／１５２０３０号及びＷＯ２０１４／１５２０３１号（それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に教示されている方法を包含し得る。

【0263】

ポリヌクレオチドの検出及び特徴付け方法は、ＷＯ２０１４／１４４０３９（その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に教示されているように行ってもよい。

【0264】

本開示のポリヌクレオチドの特徴付けは、ポリヌクレオチドマッピング、逆転写酵素配列決定、電荷分布分析、及びＲＮＡ不純物の検出からなる群より選択される手順を使用して達成してもよく、ここで特徴付けは、ＲＮＡ転写物配列を決定すること、ＲＮＡ転写物の純度を決定すること、またはＲＮＡ転写物の荷電異質性を決定することを包含する。そのような方法は、例えば、ＷＯ２０１４／１４４７１１及びＷＯ２０１４／１４４７６７に教示されており、そのそれぞれの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0265】

実施例２．キメラポリヌクレオチド合成
序
本発明によれば、三リン酸化学を用いてキメラポリヌクレオチドの２つの領域または部分を接合しても、または連結してもよい。

【0266】

この方法によれば、１００ヌクレオチド以下の最初の領域または部分は、５’一リン酸及び末端の３’ｄｅｓＯＨまたはブロックされたＯＨを用いて化学的に合成される。この領域が８０ヌクレオチドより長い場合、それはライゲーション用の２本鎖として合成され得る。

【0267】

最初の領域または部分がインビトロ転写（ＩＶＴ）を使用して非位置的に修飾された領域または部分として合成される場合、５’一リン酸の変換とそれに続く３’末端のキャッピングが続く場合がある。

【0268】

一リン酸保護基は、当該分野で公知の任意の保護基から選択され得る。

【0269】

キメラポリヌクレオチドの第２の領域または部分は、化学合成法またはＩＶＴ法のいずれを用いて合成してもよい。ＩＶＴ法は、修飾キャップを有するプライマーを利用し得るＲＮＡポリメラーゼを含み得る。あるいは、最大１３０ヌクレオチドのキャップを化学的に合成し、そしてＩＶＴ領域またはその一部に結合してもよい。

【0270】

ライゲーション方法については、ＤＮＡ Ｔ４リガーゼによるライゲーション、それに続くＤＮＡｓｅによる処理は容易に連結を回避するはずであることに留意のこと。

【0271】

キメラポリヌクレオチド全体をリン酸−糖骨格で製造する必要はない。領域または部分の１つがポリペプチドをコードする場合、そのような領域または部分はリン酸−糖骨格を含むことが好ましい。

【0272】

次いで、ライゲーションは、任意の公知のクリックケミストリー、オルソクリックケミストリー、ソルリンク（ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、または当業者に公知の他のバイオコンジュゲートケミストリーを使用して行われる。

【0273】

合成経路
キメラポリヌクレオチドは、一連の出発セグメントを用いて作製される。そのようなセグメントとしては以下が挙げられる：
（ａ）通常の３’ＯＨからなる、キャップされ保護された５’セグメント（ＳＥＧ．１）
（ｂ）ポリペプチドのコード領域を含み得、正常な３’ＯＨを含んでいる５’三リン酸セグメント（ＳＥＧ．２）
（ｃ）コルジセピンを含む、または３’ＯＨを含まない、キメラポリヌクレオチドの３’末端（例えば、テール）の５’一リン酸セグメント（ＳＥＧ．３）

【0274】

合成後（化学的またはＩＶＴ）、セグメント３（ＳＥＧ．３）をコルジセピンで処理し、次にピロホスファターゼで処理して５’一リン酸を生成する。

【0275】

次にセグメント２（ＳＥＧ．２）を、ＲＮＡリガーゼを用いてＳＥＧ．３に連結する。次いで、連結したポリヌクレオチドを精製し、ピロホスファターゼで処理して二リン酸を切断する。次いで、処理したＳＥＧ．２−ＳＥＧ．３構築物を精製し、そしてＳＥＧ．１を５’末端に連結させる。キメラポリヌクレオチドのさらなる精製ステップを実施してもよい。

【0276】

キメラポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、連結されたまたは接続されたセグメントは、５’ＵＴＲ（ＳＥＧ．１）、オープンリーディングフレームまたはＯＲＦ（ＳＥＧ．２）及び３’ＵＴＲ＋ポリＡ（ＳＥＧ．３）として表され得る。

【0277】

各ステップの収率は、９０〜９５％程度であってもよい。

【0278】

実施例３：ＤＮＡ鋳型の製造のためのＰＣＲ
ｃＤＮＡの調製のためのＰＣＲ手順は、Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）による２×ＫＡＰＡ ＨＩＦＩ（商標）ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘを使用して行われる。このシステムには、２×ＫＡＰＡ ＲｅａｄｙＭｉｘ１２．５μｌ；フォワードプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；リバースプライマー（１０ｕＭ）０．７５μｌ；鋳型ｃＤＮＡ−１００ｎｇ；及び２５．０μｌに希釈したｄＨ_２Ｏを含む。反応条件は９５℃で５分間であり、そして９８℃で２０秒間、次いで５８℃で１５秒間、次いで７２℃で４５秒間、次いで７２℃で５分間、次いで４℃の２５サイクルである。

【0279】

ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＰＵＲＥＬＩＮＫ（商標）ＰＣＲ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造元の指示（最大５μｇ）に従って使用して反応液をクリーンアップする。より大きな反応は、より大きな容量を有する生成物を使用するクリーンアップを必要とするだろう。クリーンアップ後、ＮＡＮＯＤＲＯＰ（商標）を用いてｃＤＮＡを定量し、アガロースゲル電気泳動によって分析してｃＤＮＡが予想されるサイズであることを確認する。次いで、インビトロ転写反応に進む前に、ｃＤＮＡを配列決定分析にかける。

【0280】

実施例４．ショートモデルＲＮＡ−１のＩＶＴ及びＩＦＮ−β分析
ＩＶＴ反応は、特定のヌクレオチドで「スパイク」され得、サイトカイン反応の混入物が最小限になり、収率が良くなる。あるプロセスでは、表１に示すように、他のＮＴＰに対するＧＴＰ比が増大し、総ＮＰＴ負荷が高くなり、ＮＴＰ：Ｍｇ^２＋モル比が増大した。これらの特定のヌクレオチドは、ショートモデルＲＮＡと呼ばれる。ショートモデルＲＮＡの目的は、全長ＲＮＡにおいて観察された本発明の方法と同じサイトカインシグナル／等モルの効果（従来技術）を再現することであった。この構築物は、ＬＣ／ＭＳ（全長ＲＮＡでは現在実現可能ではなかった）によって全長の不純物を検出するのに十分に小さかった。

【0281】

【表1】

【0282】

２つの異なるＩＶＴプロセスを使用して調製されたショートモデル転写物が、全長転写物について観察されたインビトロ（ＢＪ線維芽細胞）ＩＦＮβ反応を模倣するか否かを決定するために、独立した実験プロセス（すなわち、粗ＩＶＴ、限外濾過、またはｄＴ精製）研究を設定した。標的ＲＮＡと同じＩＶＴ条件下で、そして同じＤＮＡ鋳型二重鎖から産生されたサロゲートＲＮＡ、ショートモデルＲＮＡ−１を生成した。サイトカイン応答は、ＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮ−βアッセイにおける全長ＲＮＡの応答を模倣していた（図１）。等モルのＩＶＴプロセスを使用して調製されたショートモデル転写物は、アルファＩＶＴプロセスを使用して調製された材料よりも高いＩＦＮβ応答を有する。限外濾過及びｄＴ精製の後、サイトカイン応答は保存された。

【0283】

さらに、ショートモデルＲＮＡ−１（シュードウリジンに修飾された全てのウリジン及び５’Ｏ−メチルによって修飾された全てのシチジン）の不純物プロファイリングは、等モル過程における逆相補体（ｄｓＲＮＡ）の存在を示したが、アルファ反応においては示さなかった。９つの異なる種が同定された：２つの間で重なっているピークはアボーティブ種を表しているが、等モル製剤でのみ見られるピークは逆相補性種である。スクリーニングを、様々な量のウリジン及びシチジン修飾を有する種について行い、逆相補性種及びアボーティブ種を３つ全てに見出した（図２）。アボーティブ転写物は、センスであり、そして逆相補物はアンチセンス転写物である。ＩＦＮ−βレベルもまた３つの間で変動した（図２）。上部はＧ０＝標準Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり、中央は、Ｇ５＝標準Ａ、Ｇ、Ｃ及び１−メチルシュードＵであり、下部は、Ｇ６＝標準Ａ、Ｇ、Ｃ及び５−メトキシウリジンである。３つの異なる化学において２つの異なるプロセスによって調製されたショートモデル転写物は、ＢＪＦアッセイにおける相違にもかかわらず、ＬＣＭＳによる類似の不純物プロファイルを有し、異なる化学に対して鋭敏であるように思われる。

【0284】

モデル転写物及びインタクトな転写物のＬＣＭＳ分析を、２５℃で６時間のＩＶＴによって調製した。短い転写物及び全長の転写物を、２５℃で６時間、等モル及びアルファプロセスを使用して調製した（３７℃、２時間である我々の通常のＩＶＴではない）。低温ＩＶＴ反応（＜３０℃）は、３７℃よりも多量の逆相補体ＲＮＡを生成する。試料の不純物プロファイルをＬＣＭＳによって分析した。両方のプロセスを使用して調製された試料は両方ともアボーティブ／切断型生成物を含んでいた。等モルプロセスを用いて調製された転写物は、様々な長さのポリＵ種を含んでいた。アルファプロセスは、等モルプロセスを使用して存在量が標準条件よりも大きかった２５℃においてもなお逆相補体の形成を軽減する（図３）。

【0285】

相補的／アンチセンスＲＮＡの検出
Ｔ７が新生転写ＲＮＡから重合するので、免疫刺激不純物は、ＲＮＡ鋳型ＲＮＡ転写によって引き起こされるように思われる。生成された相補的／アンチセンスＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、混合塩基、ポリＵ成分、及び５’三リン酸（５’ｐｐｐ）を示し、これは任意の塩基から開始する。ＲＮＡ鋳型転写を実施した。ｑＰＣＲによってインビトロ転写に必要な閾値未満であると決定されたＤＮＡ鋳型を除く、全てのＩＶＴ成分と共に、逆相精製ｈＥＰＯ Ｇ５（低温）を、４ｍｇ／ｍＬでインキュベートして（インビトロ転写反応の典型的な収率と一致）て、ＲＮＡ鋳型転写現象を探求した。その材料をＵＰＬＣ及びインビトロＢＪＦ ＩＦＮβアッセイにより分析した。ＵＰＬＣ分析によって、異常なＲＮＡ転写産物、そして最も顕著にはポリＵ種が（ＤＮＡ鋳型の非存在下で）ＲＮＡ鋳型転写を介して産生されることが実証された。ＲＮＡ及び全てのＩＶＴ成分を用いて実施された反応は、ＩＦＮβホットであり、一方ＲＮＡを用いずに実施された反応はコールドであった。（図４）。

【0286】

二本鎖ＲＮＡは、逆相（ＲＰ）精製転写ＲＮＡから除去してもよい。ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理ｈＥＰＯ Ｇ５材料のキャピラリー電気泳動分析を実施した。ｈＥＰＯ Ｇ５を等モルまたはアルファ条件を用いて調製し、そして一部をＲＰにより精製した。次いでその試料を、ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理し、キャピラリー電気泳動により分析した。アルファプロセスによって調製された材料は、等モルプロセスによって調製されたものよりも少ないＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質を含んでいた。ＲＰ精製は、等物質及びアルファ物質からＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質の大部分を除去する。アルファプロセス及び逆相精製は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質（例えば、ｄｓＲＮＡ）における相乗的な減少を提供するように思われる（図５Ａ）。ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理ｈＥＰＯ Ｇ０材料のキャピラリー電気泳動分析を実施した。ｈＥＰＯ Ｇ０を、等モルプロセスを用いて調製し、そして一部をＲＰにより精製した。次いで、試料をＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理し、そしてキャピラリー電気泳動により分析した（青：処理済み；黒：未処理）。ＲＰ精製された材料は、ＲＰ精製されなかった材料よりも含んでいるＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質が少なかった（最新技術）（図５Ｂ）。

【0287】

ＲＮａｓｅ ＩＩＩは、ｄｓＲＮＡ特異的ヌクレアーゼである。ＲＮＡ調製物を、一定時間ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理に供する。ＲＮＡ純度／不純物プロファイルを、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理前後で比較し、ＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動によって測定する。分解された全長産物の量は、ＲＮＡ調製物中に存在する二本鎖ＲＮＡ不純物のレベルに比例した。見かけの大きさ／保持時間の変化によって示されるように分解された量は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質の量と考えられた。ｄｓＲＮＡを含まない試料は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理前後でほぼ同一の純度を示すはずである。かなりの量のｄｓＲＮＡを含有する試料は、ＨＰＬＣまたはキャピラリー電気泳動によって見られるように、未処理供給原料中に存在する実質的な切断生成物の形成及び全長ＲＮＡの枯渇を示すであろう。（例えば、元のｍＲＮＡの８０％がＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理後に残っている場合、２０％がＲＮａｓｅ ＩＩＩの基質であった）。

【0288】

図５Ａ及び５Ｂからの試料のＩＦＮβ及びｈＥＰＯ発現分析を実施した。処理試料及び未処理試料を分析して、ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ処理がＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮβ応答及びｈＥＰＯ発現にどのように影響するかを決定した（インビトロ）。ｈＥＰＯ Ａ１００ Ｇ５等モル物質は、未処理試料及びＲＩＩＩ処理試料について同様に発現することが見出された。等処理したＲＰ試料のサイトカインレベルは、ＲＩＩＩで処理した後に減少した。ｈＥＰＯ Ａ１００ Ｇ５アルファ物質は全て同様に発現し、ゼロ／低いＩＦＮβ応答を有した。ＴＬ物質は発現していない。しかしながら、ＲＩＩＩ処理は、＋及び−ＲＰ試料の両方についてＣＫレベルを低下させた。Ｇ０ ｈＥＰＯ Ａ１００材料には、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理から最大の効果が見られた。ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理後、＋及び−ＲＰ精製試料は両方とも、発現の増大及びＩＦＮβレベルの減少が見られた（図６）。

【0289】

異なるプロセスを使用して転写され、そしてＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理された短い転写物のキャピラリー電気泳動分析を行った。質問は、ショートモデル転写産物を用いてＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理の効果を特徴付け得るか否か？であった。サロゲートＲＮＡ構築物を等モルまたはアルファプロセスを用いて転写し、次いでＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理し、そしてキャピラリー電気泳動により分析した。等モルの材料はほとんどＲＮａｓｅ ＩＩＩの基質を含んでいるように見えたが、アルファプロセス材料は、ＣＥ（キャピラリー電気泳動）によれば、基質を含んでいなかった。ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理により、モデルＲＮＡのピークはフラグメントアナライザー上で５〜７ヌクレオチドシフトする。等モルのＩＶＴは、主ピークよりも２１６ヌクレオチド短い強烈な第２ピークを形成し、これはＯＲＦを含むｍＲＮＡでも観察された（図７）。したがって、モデルＲＮＡ及びＬＣ／ＭＳを使用して、どの成分が切断されたか、及び推論によってどの成分が残っているかを正確に特徴付け得る。ＨＰＬＣ純度法は、切断産物の単離及び濃縮の際にポリＵを示した（図９）。ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理したＲＮＡサロゲート２ ＥＱ転写産物のＲＰ分析（図７の上の図と同じ構築物．．．別の分析）を行った。サロゲートＲＮＡ転写物をＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理した後、ＲＰ分析によっていくつかの種が観察された。このＲＰ法は、テール選択的方法であったので、我々はこれらの早期溶出ピークが短いオリゴ及び／またはテール変異体であると仮定する（図８Ａ）。ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理されたアルファプロセス転写物を用いて転写されたＲＮＡサロゲート２アルファ構築物のＲＰ分析を行った。本発明者らは、ＲＩＩＩで処理したサロゲートＲＮＡアルファ材料についてのＲＰトレースにおいて、さらなる不純物ピークのピークの発生及び全体的な純度への明らかな変化は観察しなかった。したがって、本発明者らは、アルファプロセスは等モルプロセスと同じｄｓＲＮＡ種を作らないと結論付け得る（図８Ｂ）。

【0290】

ＲＰ画分からのＲＮａｓｅ ＩＩＩ及びサイトカインデータによるｄｓＲＮＡの存在量
ＲＮａｓｅＩＩＩ処理があったｈＥＰＯのＲＰ分画とＲＮａｓｅＩＩＩ処理がなかったｈＥＰＯのＲＰ分画を実施した。等モルプロセス及びアルファプロセスの両方を介して転写されたｈＥＰＯ Ｇ５ ｍＲＮＡを、逆相ＨＰＬＣによって精製した。画分を溶出勾配にわたって集めた。画分を、ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理し、続いて未処理のＲＮＡ及びＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理を比較するキャピラリー電気泳動により分析した（重ね合わせた）。ＲＮＡ画分もＢＪ線維芽細胞にトランスフェクトし、ＩＦＮ−Ｂ誘導を、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理の前後に評価した（図９）。

【0291】

ＲＰ分画ｈＥＰＯ ＥＱ＋／−Ｒ ＩＩＩ処理のキャピラリー電気泳動分析を行った。ｈＥＰＯ ＥＱを、ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理し、次いでＲＰ精製し、分画し、そしてＣＥ（キャピラリー電気泳動）によって分析した（青：ＲＩＩＩ処理；黒：未処理）。ＲＮＡ不純物を含有する初期等モル画分（画分１〜６）は、かなりの量のｄｓＲＮＡ／ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質を示す。ｄｓＲＮＡは、初期の画分に富んでいた。これは高いＩＮＦ−Ｂレベルによって確認された。等モル画分７〜９は、ＣＥ（キャピラリー電気泳動）によるより低レベルのｄｓＲＮＡ／ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質を示し、これはまた、ＩＦＮ−Ｂのレベルの減少によっても確認された。各画分のＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理は、ＩＦＮ−Ｂ誘導を基礎レベルまで減少させ、これもまたＩＦＮ−Ｂ不純物がｄｓＲＮＡからなることを裏付けている（図１０Ａ〜Ｃ）。未処理またはＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理後のｈＥＰＯ ＥＱ Ｇ５のインビトロＩＦＮβ分析（図１０Ｄ）。

【0292】

ＲＰ分画ｈＥＰＯアルファ＋／−ＲＩＩＩ処理のキャピラリー電気泳動分析を実施した。ｈＥＰＯアルファを、ＲＮａｓｅ ＩＩＩで処理し、次いでＲＰ精製し、分画し、そしてＣＥ（キャピラリー電気泳動）によって分析した（青：ＲＩＩＩ処理；黒：未処理）（図１１Ａ〜Ｃ）。未処理またはＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理後のｈＥＰＯアルファＧ５のインビトロＩＦＮβ分析（図１１Ｄ）。オーバーレイ電気泳動図は実質的に同一であるので、全ての画分は両方のキャピラリー電気泳動による微量レベルのｄｓＲＮＡ（ＲＮａｓｅ ＩＩＩ基質）を示す。これは、処理画分と未処理画分の両方において基礎レベルのＩＦＮ−Ｂによって確認された。アルファプロセスで転写されたＲＮＡは、初期の画分中に非全長／切断型ＲＮＡ不純物が存在するにもかかわらず、ｄｓＲＮＡを欠いていた。

【0293】

ｄｓＲＮＡ存在量のＥＬＩＳＡ検出
Ｊ２／Ｋ２ ｄｓＲＮＡ ＥＬＩＳＡは、ｄｓＲＮＡの存在量を測定するために開発された。プレートをＪ２モノクローナル（ＩｇＧ）抗体でコーティングし、次いでブロックした。次いで、目的のＲＮＡを所定の濃度で添加し、１時間インキュベートした。Ｋ２モノクローナル抗体を加え（ＩｇＭ）、そしてＨＲＰ結合抗ＩｇＭヤギポリクローナル抗体を加えた。ＴＭＢを添加してシグナルを発生させた。アッセイは、長さが４０塩基対を超える二重鎖を検出する。Ｊ２は、ＲＩＩＩエンドポイントの決定を支援し得る。ｄｓＲＮＡのノックダウンは、ＲＰまたはＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理で観察された（図１２）。Ｊ２アッセイは、等モル物質中にアルファよりもかなり多いｄｓＲＮＡが存在したことを示唆する。ＲＰプロセスは、ＲＩＩＩ処理と同程度に、ＥＱ試料からｄｓＲＮＡ材料を除去する。アルファ反応ｍＲＮＡは、等モルのＩＶＴ生成物と比較して供給原料中のｄｓＲＮＡが少なかった。また、ｄＴ精製ＲＮａｓｅ ＩＩＩ材料におけるノックダウンは、ＴｒｉｓＲＰよりも大きいことが観察された。このアッセイではまた、ｄｓＲＮＡがＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理によって除去されたことが示された（図１３）。Ｊ２によって検出されたｄｓＲＮＡレベルは、構築物／プロセス／化学に基づいて変化するが、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理は、ほとんどのｄｓＲＮＡレベルをベースラインまで減少させるように思われる。ヌクレアーゼＰ１処理後のＬＣＭＳ分析では、α反応群と比較して、非Ｇで開始された逆相補体が等モル量の群においてより多く存在するので、ＦＦＢ ｍＲＮＡ中にさらなるＮＴＰが存在することが示された（表２）。

【0294】

【表2】

【0295】

低温ＩＶＴにおけるＲＮＡ鋳型転写の緩和
異なるプロセス及び化学を用いて調製したｈＥＰＯ構築物に対するＩＦＮβ応答を実施した。ＩＶＴ特徴付け研究に示されるように、アルファ反応は低温誘導サイトカインスパイクに対してそれほど敏感ではなかった（図１４）。２５℃で行われたときの標準的な等モルＩＶＴは、増強されたＩＦＮ−Ｂ誘導不純物存在量を生成する。異なるプロセスを用いて調製したｈＥＰＯ構築物について全ヌクレオチド分析を行った。３７℃及び２５℃の両方でＩＶＴを実施する場合、アルファプロセス条件（ＧＤＰ及びＧＴＰ）は両方とも、外来のＩＦＮ−Ｂ誘導性不純物形成を軽減する。ヌクレオチド分布は、ヌクレアーゼＰ１研究における対照領域にわたって一貫しており（灰色の枠）、同じｈＥＰＯプラスミドは一貫した切断を示す（図１５）。等モルのＩＶＴプロセスを２５℃で実行すると、おそらくポリＵの進化に起因して、３７℃よりも多量のウリジン／１−メチルシュードＵが存在し、アルファプロセス（ＧＤＰ及びＧＴＰ）は２５℃でも一貫したヌクレオチド分布を示し、さらに不純物形成の緩和を支持している。バーの高さの違いは、おそらく濃度の違いに起因するものである。２５℃の標準ＩＶＴでは、Ｕ含有量は時間とともに増大した。モル補正したヌクレオチド組成を表３及び４に示した。Ｇ及びＵは理論値であるが、一方Ａは過剰に表されそしてＣは過少に表された。アルファ反応による温度条件間の偏差は少なく、標準のＩＶＴではＵで最大の偏差が観察された。

【0296】

【表3】

【0297】

【表4】

【0298】

「強制」ＲＮＡ鋳型転写
不純物分析は、Ｇ５ ｅＧＦＰ ＥＱを使用して、様々な化学におけるＲＮＡベースのＩＶＴのＬＣＭＳによって実行された。４ｍｇ／ｍＬのｅＧＦＰ Ｇ５ 等 ＲＮＡを使用し、ＤＮＡ鋳型は使用しないで、ＩＶＴを（様々な化学的性質で）設定した。ポリＵ種は、ＲＮＡ鋳型転写から生成される。ＲＮＡ鋳型転写は、化学とは無関係に起こる。逆相精製したｅＧＦＰ Ｇ５（コールド）を、ｑＰＣＲによってインビトロ転写に必要な閾値未満であると決定されたＤＮＡ鋳型を除く、全てのＩＶＴ成分と共に、４ｍｇ／ｍＬ（インビトロ転写反応の典型的な収量と一致）でインキュベートし、ＲＮＡ鋳型転写現象を探究した。その物質をＬＣ／ＭＳによって分析した（図１６Ａ（等モルプロセス）、１６Ｂ（アルファプロセス））。

【0299】

ＲＮＡ鋳型ＩＶＴ産物についてのＩＦＮβ分析を実施した。材料は、図１６由来のものであった。ＲＮＡに基づくＩＶＴの後、ＬＣＭＳ分析（ポリＵ種）とＩＦＮβ応答との間に相関があるか否かを決定するために試料をインビトロで分析した。アルファ（Ａ１００）ＲＮＡベースのＩＶＴは、等モルの材料よりもＣＫ応答が低い材料を生成する。（Ｇ０またはＧ５）；ここでも、アルファプロセスがＲＮＡ鋳型転写産物の形成を軽減することを示唆している。Ｇ６は全てコールドであった；（不純物の生成にもかかわらず本質的にコールド）（図１７）。

【0300】

ｄｓＲＮＡがキャップされてもよいか否かを決定するために、ｄｓＲＮＡをワクシニアによってキャップできないことが実施された。両方とも５’三リン酸を有するフォワード相補オリゴ及びリバース相補オリゴをアニーリングし、次いでワクシニアを使用してキャッピングプロセスに供し、ｄｓＲＮＡをキャッピングしてもよいか否かを決定した。ｐｐｐＦオリゴ（５’ｐｐｐＧを含む）は、ワクシニアを使用してｃａｐ１にキャップすることができる。ｐｐｐＲＣオリゴ（５’ｐｐｐＵを含む）は、ワクシニアを使ってキャップできない。ｐｐｐＦ＋ｐｐｐＲＣを有するｄｓＲＮＡは、ワクシニアを用いてキャップできない（図１８）。

【0301】

ＣＩＰを使用したｄｓＲＮＡの脱リン酸化を行って、子牛の腸ホスファターゼが異なる５’／３’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡを脱リン酸化するか否かを確認した。種々のＦ及びＲＣオリゴをアニーリングし、次いでＣＩＰで処理し、脱リン酸化効率についてＬＣＭＳにより分析した。５’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡは完全に脱リン酸化されてもよい。完全二重鎖ｄｓＲＮＡは、部分的に脱リン酸化できる。３’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、完全に脱リン酸化できない。これによって、ホスファターゼがＣＫ応答を低下させるのに１００％有効ではなかった理由が示される（図１９）。

【0302】

エレクトロフェログラムで示される前述のインビボ研究において投与されたｍＲＮＡのＣＥ（キャピラリー電気泳動）純度を実施した。（図２０）。５’ＵＴＲがアルファ反応の有効性に影響を与える可能性があるので、構造がある役割を果たす可能性がある（図２０）。

【0303】

インビボ研究
ＲＩＩＩ処理は、未修飾種及び完全に修飾された種（全てのウリジンが１−メチルシュードウリジンであった）の両方を用いて、マウスにおいて明確なサイトカインノックダウンを示した。それは基礎レベル近くまでサイトカインをノックダウンするための独立した方法として使用され得る。雌性マウス（１群あたりｎ＝５）に０．５ｍｇ／ｋｇの選択した試験材料を１回注射した。

【0304】

異なるＩＶＴプロセス及び精製順列を使用して転写されたＧ０及びＧ５ ｈＥＰＯ ｍＲＮＡのＩＦＮβ分析を実施して、異なる化学物質、プロセス、及び処理を用いて生成された材料に対するＩＦＮβ応答が何であるかを決定した（インビトロ；ＢＪ線維芽細胞）。＋ＲＩＩＩ、＋ＲＰ、及びアルファプロセスは、Ｇ５のインビトロでのＩＦＮβ応答に対して同様の効果（減少）を有する。Ｇ０は、アルファ＋ＲＩＩＩが、等＋ＲＩＩＩより優れていたことを実証している（図２１）。

【0305】

Ｇ０またはＧ５化学、等モル量またはアルファプロセス、及びＥＬＩＳＡによるＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理を用いて調製したｈＥＰＯのインビボ（Ｂａｌｂ−Ｃマウス）発現を行って、種々のプロセス（化学、ＩＶＴプロセス、ＲＩＩＩ処理）を用いて調製したｈＥＰＯによって発現がどのように影響されるかを調べた。図１２、２０、２１、２２と同じ材料。異なるプロセスによって生成されたＲＮＡを用いたｈＥＰＯ発現に有意差はない（図２２）。

【0306】

ＲＮａｓｅＩＩＩ処理が有った異なるＩＶＴプロセス及び精製順列とＲＮａｓｅＩＩＩ処理がなかった異なるＩＶＴプロセス及び精製順列を使用して転写されたインビボ（Ｂａｌｂ−Ｃマウス）Ｇ０及びＧ５のｈＥＰＯのｍＲＮＡについてのサイトカイン（ｌｕｍｉｎｅｘ）パネルを実施して、図１２、２０、２１、２２と同じ材料で決定した。Ｂａｌｂ−Ｃマウスを０．５ｍｐｋ製剤化ＲＮＡで処理した後のサイトカイン分析。未処理のアルファ物質は、ＩＰ１０のＥＱ物質（Ｇ５）と同様のＣＫ応答を有する。全体的に、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理と組み合わせたアルファプロセスは、特にＧ０において、等モル比較剤（＋ＲＮａｓｅ ＩＩＩ）よりも低い免疫刺激活性を付与するようである。ＲＩＩＩ処理は、ＣＫ応答を低下させる（図２３Ａ〜２３Ｄ）。

【0307】

Ｇ０またはＧ５化学、等モルまたはアルファプロセス、及びＲＮａｓｅ ＩＩＩ処理を用いて調製したｈＥＰＯで処理したＢａｌｂ−Ｃマウスの脾臓からのＢ細胞活性化、を行った。活性化Ｂ細胞（ＣＤ８６＋ ＣＤ６９＋）を、様々なプロセスを用いて調製したｈＥＰＯでの処理後のそれらの応答に関して分析した。Ｂ細胞活性化は、サイトカイン（ｌｕｍｉｎｅｘ）パネルとおおまかに相関している。ＲＩＩＩ処理は、未処理対照と比較して、ＣＫ応答を減少させる（図２４）。

【0308】

短い５’三リン酸化オリゴのインビトロ分析を行って、短い５’三リン酸化オリゴがインビトロでＩＦＮβ応答を刺激するか否かを決定した（ＢＪＦ、ＩＦＮβ）。ｓｓＲＮＡ及びｄｓＲＮＡの１２未満のヌクレオチドまたは塩基対は、ＢＪＦ中のＩＦＮβを刺激しない（図２５）。

【0309】

ポリＵ及びｄｓＲＮＡ標準のインビトロ分析を行い、５’三リン酸化オリゴ標準を使用しているか否か、ＢＪＦのＩＦＮβ応答を刺激するのは何かを判断した。２０ｂｐ超のｐｐｐＦ＋ｐｐｐＲＣ ｄｓＲＮＡは免疫刺激性であった。５’三リン酸化ポリＵは、＜２５ｎｔまたは２５ｂｐのｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡとして免疫刺激性ではなかった（図２６）。

【0310】

３’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡ標準のインビトロ分析を行って、ｄｓＲＮＡ標準についてＩＦＮβ応答に対して３’オーバーハング長の依存性があるか否かを決定した。３’オーバーハングが長いほど、ＩＦＮβ反応は低くなる（図２７）。

【0311】

５’オーバーハング、完全二重鎖、及び３’オーバーハングの長さが異なるｄｓＲＮＡ標準のインビトロ分析を実施して、オーバーハングの長さ／同一性がＩＦＮβ応答に依存するか否かを決定した。ｓｓＲＮＡ ｐｐｐＲＣオリゴはホットである。５’オーバーハング（及び約２０ｂｐ二重鎖）のｄｓＲＮＡは、完全な二重鎖より免疫刺激性が低くなる。３’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、完全二重鎖と同等かそれ未満の免疫刺激を有する。ｄｓＲＮＡ二重鎖が長いほど、ＣＫ応答が高い（図２８）。

【0312】

ポリＵ種のインビトロ分析を実施して、ポリＵ種がＩＦＮβ応答をシミュレートするのに何が必要かを決定した。５’三リン酸を含むｓｓＲＮＡ ポリＵ標準はわずかに免疫刺激性である。ＯＨ−Ｆ３０（３０ｂｐ二重鎖）を有するｄｓＲＮＡとして、相加的ＣＫ応答があった。しかしながら、ポリＵ標準は、全長ｍＲＮＡ（Ａ１００）の存在下では免疫刺激性ではない（図２９）。

【0313】

ｓｓＲＮＡオリゴヌクレオチド標準のインビトロ分析を行って、ｓｓＲＮＡ標準に対するＩＦＮβ応答が何であるかを決定した。（Ｆまたはフォワードオリゴは、アボーティブまたは短縮型種を表し；ＲまたはＲＣまたは逆相補体オリゴは、ＲＮＡ鋳型転写によって生成された逆相補体種を表す）。５’三リン酸を含むフォワードオリゴは、ＩＦＮβを刺激しない。５’三リン酸を有する逆相補体オリゴは、２５ｎｔを超える長さでＩＦＮβを刺激する（図３０）。

【0314】

５’官能基（三リン酸及びヒドロキシル）がＩＦＮβ応答に影響するか否かを判断するために、異なる５’官能基を有するｄｓＲＮＡオリゴ標準のインビトロ分析を行った。Ｆオリゴ上の５’三リン酸及びＲＣオリゴ上の５’ヒドロキシルは、＞２０ｂｐでＩＦＮβをシミュレートする。Ｆオリゴ上の５’三リン酸とＲＣオリゴ上の５’ヒドロキシルは、＞２５ｂｐでＩＦＮβをシミュレートする。Ｆオリゴ上の５’ヒドロキシル及びＲＣオリゴ上の５’三リン酸は、＞２０ｂｐでＩＦＮβを刺激する。２０ｂｐ超のＩＦＮβをシミュレートするために必要な三リン酸は１つだけであった（図３１）。

【0315】

ＣＩＰ処理ｄｓＲＮＡオリゴ標準のＩＦＮβ分析を実施した。様々なオーバーハング長のｄｓＲＮＡオリゴ標準をＣＩＰで処理し、ＩＦＮβ応答を分析した。ＬＣＭＳによって、脱リン酸化（すなわち、５’オーバーハング）が観察された試料（図１９）は、未処理試料ほどＩＦＮβを刺激しなかった。ＣＩＰによって脱リン酸化されなかった試料（すなわち、完全二重鎖及び３’オーバーハング）は、ＩＦＮβ応答＋／−ＣＩＰに変化がなかった（図３２）。

【0316】

ｓｓＲＮＡ不純物用量応答（ＢＪ線維芽細胞中のＩＦＮβ）を実施して、インビトロでのｓｓＲＮＡ不純物標準の用量依存性が何であるかを決定した（ＢＪＦ、ＩＦＮβ）。反応を刺激するためにいずれか１つの種類の不純物がどれくらい必要だったか。＜２０ｍｅｒのｓｓＲＮＡ（ＲＣ）はホットではなかった。＞３０ｍｅｒのｓｓＲＮＡ（ＲＣ）は、約＞１ｎｇ／ｕＬ（または＞２．５ｎｇ／トランスフェクション）でＩＦＮβを刺激した。ｓｓＲＮＡ ＣＫ応答（ＲＣ）に対して見かけの長さ依存性があった。オリゴが長ければ長いほど、ＣＫ応答は高くなる（図３３）。

【0317】

ｄｓＲＮＡ不純物用量応答（ＢＪ線維芽細胞におけるＩＦＮβ）を実施して、インビトロでのｄｓＲＮＡ不純物標準の用量依存性（ＢＪＦ、ＩＦＮβ）を決定した。２０〜３０ｂｐのｄｓＲＮＡは、約＞１ｎｇ／ｕＬ（＞２．５ｎｇ／トランスフェクション）でＩＦＮβを刺激する。＞３０ｂｐのｄｓＲＮＡは、約０．１ｎｇ／ｕＬ（＞０．２５ｎｇ／トランスフェクション）でＩＦＮβを刺激する。ＩＦＮβ応答をサイレンシングするためには、＞１０００×の希釈の＞３０ｂｐのｄｓＲＮＡが必要であった・・・応答を刺激するには、これらの不純物のほんの数分子で十分であることが示されている。ｄｓＲＮＡ ＣＫ応答に対する見かけの長さ依存性があった・・・二重鎖が長いほど、ＣＫ応答は高い（図３４）。

【0318】

フォワードオリゴ標準の修飾５’ヌクレオチドに対するＩＦＮβ応答を、５’ヌクレオチド（三リン酸化）がＣＫ応答に影響するか否かを決定するために行った。５’Ａ／Ｃ／ＵがＦオリゴに付加されたとき、ＣＫ応答が誘導された。５’非−Ｇは、ＩＦＮβ応答を変化させない（依然としてコールド）。これは、配列依存性があったことを示唆する（ＲＣがホットなので）（図３５）。

【0319】

５’ヌクレオチド（三リン酸化）がＣＫ応答に影響を与えるか否かを判断するために、逆相補体オリゴ標準の修飾５’ヌクレオチドに対するＩＦＮβ応答を実施した。５’ＧがＲＣオリゴに付加されると、ＣＫ応答が誘導された。ＲＣオリゴ上の５’ｐｐｐＧはＩＦＮβ応答をサイレンシングする。これによって、配列同一性が何であっても、５’ＧがＣＫ応答をサイレンシングすることが示唆される（図３６）。

【0320】

５’ヒドロキシル官能化ｄｓＲＮＡのＩＦＮβ応答を行って、５’官能基（ｐｐｐ対ＯＨ）がｄｓＲＮＡのサイトカイン応答にどの程度影響するかを決定した。５’ｐｐｐ−Ｆ／５’ｐｐｐ−ＲＣ二重鎖から５’ＯＨ−Ｆ／５’ＯＨ−ＲＣまでを試験した。５’ｐｐｐまたは５’ＯＨのいずれかを用いた＞３０ｂｐ ｄｓＲＮＡのＩＦＮβ応答があった。これによって、５’の官能基が何であっても、３０ｂｐを超えるｄｓＲＮＡがＢＪＦのＩＦＮβ応答を刺激したことが示唆される（図３７）。

【0321】

推測
ＩＶＴ副産物としてのＲＮＡ鋳型転写は大幅に減少し、アルファ反応プロセスでほぼ排除された。逆相補体の形成を軽減した結果として、目的の不純物であるｄｓＲＮＡ（５’ｐｐｐを有する）と非ｐｐｐＧ（ｐｐｐＡ、ｐｐｐＣ、及びｐｐｐＵ）で開始するＲＮＡの両方が対処される。

【0322】

ＲＮＡ鋳型転写は、３７℃未満のＩＶＴ反応温度（例えば、２５℃）で増強された。ＩＶＴ反応が進行している間に３７℃の加熱を達成するための傾斜時間は、特に２５℃〜３７℃の時間傾斜が増大するにつれて、より高い不純物レベルをもたらし得る。微量のＲＮＡ鋳型転写種が周囲温度で検出されたので、アルファ反応プロセスは２５℃でより寛容であった。

【0323】

ＲＰは、等モルプロセスよりもアルファ反応の方が効果的であった。アルファ反応では不純物量がより少なく、分離の改善をもたらす。「純度」がより明確に解明され得、潜在的に負荷の課題を増やし、生産性を高め得る。単一のＲＰサイクルは、ＧＤＰアルファ反応を用いて未修飾種をベースラインにノックするのに十分であるが、一方、等モルのＩＶＴを用いて未修飾種の２つの画分を得るためには２〜３連続するＲＰサイクルが必要である。

【0324】

実施例５．アルファプロセスを用いて生成されたＲＮＡは＜４０％のランオン転写物を有する。
ｈＥＰＯ ＲＮＡは、等モルまたはアルファプロセスを用いて生成した。ＲＮＡを、Ｒｎａｓｅ Ｔ１で消化し、テール断片をＬＣＭＳによって分析した。３’ｍＰのテールの断片は、ランオン転写物を示す。アルファプロセスは、３２７８０Ｄａであると計算された３’ＯＨ（クリーン）と３２８６０Ｄａであると計算された５’ＯＨ／３’ｍＰ（ランオン）を生成した。等モルプロセスは、３２８６１Ｄａの５’ＯＨ／３’ｍＰ（ランオン）及びはるかに少量の３’ＯＨ（クリーン）を生成した（図３８）。

【0325】

実施例６．総消化は、等モルプロセス由来のＲＮＡがアルファプロセスで作られたＲＮＡより高い存在量の非ＧＴＰ５’ヌクレオチドを有することを示す
短いオープンリーディングフレームＲＮＡを４つの異なる条件を用いて生成した：３７℃２時間（標準）対２５℃６時間及び等モル対アルファ。各ＲＮＡを、単一ヌクレオチドに酵素的に消化し、次いで５’ヌクレオチド存在量をＬＣＭＳ（例えば、ｐｐｐＧまたはＧＴＰ、ｐｐｐＡまたはＡＴＰなど）によって分析した。５’Ｇは、最初の鋳型ヌクレオチドであり、つまり、不純なＲＮＡ集団が生成されたならば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、またはＵＴＰ（例えば、等モルプロセス）として５’ヌクレオチドの大部分が存在することになり、純粋なＲＮＡ集団が生成されたならば、５’ヌクレオチドの大部分はＧＴＰになる（例えば、アルファプロセス）ことを意味する。

【0326】

実施例７．アルファプロセスによって生成された短いオープンリーディングフレームＲＮＡは、より少ない逆相補体を生成する
３２Ｐ−ＧＴＰまたは３２Ｐ−ＣＴＰのいずれかを含む等モルまたはアルファプロセスを用いて、Ｇ０（野生型）及びＧ５（ｍ^１Ψ）化学において、短いオープンリーディングフレームＲＮＡを生成した。３２Ｐ−ＧＴＰ標識アボーティブ転写物及び３２Ｐ−ＣＴＰ標識逆相補補体転写物。Ｇ０とＧ５の化学の間でアボーティブまたはＲＣプロファイルに違いはなかった。等モルプロセス及びアルファプロセスは、同様のアボーティブプロファイルを有する。等モルプロセスは、アルファプロセスよりも多くの逆相補体を生成する。

【0327】

実施例８．ＲＮａｓｅ Ｔ１消化は、ランオンの転写物集団に情報提供する
ＲＮａｓｅ Ｔ１は、５’水酸化物と３’一リン酸を残して、グアノシンヌクレオチドの後でＲＮＡを特異的に切断するエンドヌクレアーゼである。３’末端に鋳型化グアノシンヌクレオチドを含む構築物では、ＲＮａｓｅ Ｔ１を使用して、３’水酸化物を含むきれいな転写物と比較して、３’一リン酸を残すランオン転写物の集団を識別し得る。等モルまたはアルファプロセスを用いてｈＥＰＯ ＲＮＡを生成し、次いでＲＮａｓｅ Ｔ１で消化し、そして質量分析により分析した。３’オリゴ断片を分析し、その３’不均一性について定量した。等モルプロセスで生成されたＲＮＡは、約７０〜８０％のランオン転写物を含むが、アルファプロセスで生成されたＲＮＡは、３０〜４０％のランオン転写物を含む。

【0328】

実施例９．試料純度を決定するためのＲＮＡの全消化
ショートモデルＲＮＡ構築物（サロゲートＲＮＡ１）を、３７℃または２５℃のインキュベーションで等モルまたはアルファプロセスを用いて生成した。各試料をオリゴｄＴ樹脂で精製して未反応のＮＴＰを除去した。各試料を、Ｓ１及びベンゾナーゼヌクレアーゼを用いて単一ヌクレオチドに酵素的に消化した。５’末端で三リン酸化されている５’ヌクレオチドの存在量を質量分析によって分析した。抽出されたイオンピークを積分し、ＮＴＰ存在量％を表５にまとめる。５’ＧＴＰが最初の鋳型化ヌクレオチドであるため、純粋なＲＮＡ集団は高い％ＧＴＰ値で示される。同様に、不純なＲＮＡ集団は、比較的少量のＧＴＰによって示される。ＥＱプロセスを使用して生成された試料は、５％を超える非ＧＴＰ５’ヌクレオチドを含むが、アルファプロセスを使用して生成された試料は５％未満の非ＧＴＰ５’ヌクレオチドを有する。

【0329】

【表5】

【0330】

実施例１０．ｄｓＲＮＡ ＥＬＩＳＡはｄｓＲＮＡの存在を示す
ｈＥＰＯ ＲＮＡ構築物を、等モルまたはアルファプロセスを使用して生成し、そしてオリゴｄＴ樹脂のみ（−ＲＰ）または逆相精製（＋ＲＰ）のいずれかにより精製した。ｄｓＲＮＡ特異的抗体を使用するＥＬＩＳＡを使用して、異なるプロセスを使用して生成されたＲＮＡの純度の相対的差異を決定する。等モルプロセスを用いて生成されたＲＮＡは、アルファプロセスを用いて生成されたＲＮＡよりも有意により多くのｄｓＲＮＡを含む（図３９）。逆相精製は、−ＲＰ ＲＮＡの純度を向上させる。

【0331】

実施例１１．放射性シーケンシングゲル分析は試料純度を決定する
ショートモデルＲＮＡ構築物（サロゲートＲＮＡ １）を等モルまたはアルファプロセスを用いて作製した。各ＩＶＴ反応は、アボーティブ転写物を標識する^３２Ｐ−ＧＴＰ、または逆相補体転写物を標識する^３２Ｐ−ＣＴＰのいずれかを含有した。ＲＮＡ試料を配列決定ゲルによって分析した。^３２Ｐ−ＧＴＰデータに基づくと、２つのプロセス間でアボーティブ転写物量に差はない。^３２Ｐ−ＣＴＰデータに基づいて、等モルプロセスは、アルファプロセスよりも多くの逆相補体を生成する。

【0332】

実施例１２．ｍＲＮＡにドープされたｄｓＲＮＡのインビボ分析
逆相精製したｈＥＰＯ ｍＲＮＡを、インタクトなｈＥＰＯ構築物の最初の６０ヌクレオチドに相当する５％、０．５％または０．０５％ｗ／ｗの６０ｂｐ ｄｓＲＮＡを用いてドープした。ｍＲＮＡ試料を、ＭＣ３中に製剤化し、次いで０．５ｍｐｋでＣ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ−ｃマウスにＩＶ投与した。２４時間後、脾臓を採取し、ホモジナイズして単細胞懸濁液を生成した。脾細胞をＢ細胞マーカーについて染色し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。活性化Ｂ細胞集団を、それらのＣＤ８６及びＣＤ６９マーカーの発現に基づいて分析した。６０ｂｐのｄｓＲＮＡは以下の配列を有する。

【0333】

【化1】

【0334】

アルファプロセスによって生成されたｈＥＰＯ ｍＲＮＡを与えられた群は、ドープされたｄｓＲＮＡとともにｈＥＰＯを与えられた群よりもＢ細胞活性化が低かった。血清も６時間後に収集し、サイトカイン・ルミネックス（ｌｕｍｉｎｅｘ）パネルによって分析した。ｌｕｍｉｎｅｘパネルからのＩＰ−１０、ＩＦＮ−ガンマ、及びＩＦＮ−アルファのマーカーについての発現傾向は、Ｂ細胞活性化分析からの傾向と一致しており、ドープされた試料中のｄｓＲＮＡがＩ型インターフェロン経路を誘発させ、それがＢ細胞活性化をもたらしたことが示される。

【0335】

等価物
当業者は、本明細書に記載されている本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、または慣用的な実験のみを用いて確認し得る。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されるものとする。

【0336】

本明細書に開示されている、特許文献を含む全ての参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]