特許 6983762 臨床グレードの網膜色素上皮細胞の再現性のある分化のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6983762

(24)【登録日】2021年11月26日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】臨床グレードの網膜色素上皮細胞の再現性のある分化のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/079 20100101AFI20211206BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211206BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20211206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20211206BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/079

   C12N5/10

   A61L27/38

   A61L27/38 300

   A61L27/38 100

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】25

【全頁数】67

(21)【出願番号】特願2018-512373(P2018-512373)

(86)(22)【出願日】2016年9月7日

(65)【公表番号】特表2018-526014(P2018-526014A)

(43)【公表日】2018年9月13日

(86)【国際出願番号】US2016050543

(87)【国際公開番号】WO2017044483

(87)【国際公開日】20170316

【審査請求日】2019年4月17日

(31)【優先権主張番号】62/215,579

(32)【優先日】2015年9月8日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】508285606

【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ

(73)【特許権者】

【識別番号】510003830

【氏名又は名称】フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】バーティ， カピル

(72)【発明者】

【氏名】チェイス， ルーカス

(72)【発明者】

【氏名】フェン， シュエジュ

(72)【発明者】

【氏名】ジャ， バレンドゥ シェクハール

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１５／０８７２３１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１２１０７７（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｌ

Ａ６１Ｋ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

成熟ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を産生するための方法であって、
ａ）本質的に単一細胞に解離するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む出発集団を得る工程であって、ヒトｉＰＳＣの前記出発集団が、単一細胞に解離したプレコンフルエント細胞である、工程；
ｂ）網膜誘導培地中で該ｉＰＳＣを培養して、網膜系細胞への該細胞の分化を開始させる工程；
ｃ）網膜分化培地中で該網膜系細胞をさらに培養して、該網膜系細胞をさらに分化させる工程；
ｄ）網膜培地中で該細胞を培養して、分化ＲＰＥ細胞を形成する工程；
ｅ）ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養し、それにより、ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程、および
ｆ）少なくとも１つの一次繊毛インデューサーを含むＲＰＥ成熟培地中で前記ヒトＲＰＥ細胞を培養し、それにより、成熟ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程であって、少なくとも１つの一次繊毛インデューサーが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）である、工程、
を含み、
ここで、該方法が胚様体の形成を含まない、方法。

【請求項2】

工程（ｂ）の前記ｉＰＳＣをマトリックス上で培養する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記マトリックスが少なくとも１つの組換え細胞接着タンパク質を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記少なくとも１つの細胞接着タンパク質がラミニン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンである、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記少なくとも１つの細胞接着タンパク質がヒトのものである、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記網膜誘導培地が、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記網膜分化培地が、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＩＧＦ１を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

工程（ｅ）に続いて前記ＲＰＥ細胞を解離し、該ＲＰＥ細胞を再播種し、ＭＥＫ阻害剤を含む前記ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養することをさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記ＲＰＥ細胞を解離し、該ＲＰＥ細胞を前記ＲＰＥ成熟培地中の分解性足場上に再播種することをさらに含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）および／または４−（１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド（ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１）を含む前記ＲＰＥ成熟培地中で前記ＲＰＥ細胞を培養することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＲＰＥ細胞を凍結保存することをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

工程（ｂ）の前記ｉＰＳＣを、５，０００〜４０，０００個の細胞／ｃｍ^２の初期細胞密度で培養する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

フィーダー層を用いずに前記ｉＰＳＣを培養する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

十分に定義された培養培地中で前記ｉＰＳＣを培養する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

ゼノフリー培養培地中で前記ｉＰＳＣを培養する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ＷＮＴ経路阻害剤が、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミドジヒドロクロリド（ＣＫＩ−７）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−３−（２−メトキシフェニル）−４−オキソチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ４）、２−フェノキシ安息香酸−［（５−メチル−２−フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ７４６５４）２，４−ジアミノ−キナゾリン、ケルセチン、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−メチル−４−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ５３５）、Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ７１５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）または分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ１）１である、請求項６または７に記載の方法。

【請求項17】

前記ＴＧＦβ経路阻害剤が、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）、６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン（ＳＢ５２５３３４）、２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−イエリ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ８３−０１）、４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（Ｄ４４７６）、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド（ＧＷ７８８３８８）、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４８４７）、４−［２−フルオロ−５−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−１−エタノール（Ｒ２６８７１２）または２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）である、請求項６または７に記載の方法。

【請求項18】

前記ＭＥＫ阻害剤が、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６−メトキシフェニル］−１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン−１−スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）または６−（４−ブロモ−２−クロロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）である、請求項７または８に記載の方法。

【請求項19】

前記ＢＭＰ経路阻害剤が、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンヒドロクロリド（ＬＤＮ１９３１８９）、６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンジヒドロクロリド（ドルソモルフィン）、４−［６−［４−（１−メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン（ＤＭＨ１）、４−［６−［４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＤＭＨ−２）または５−［６−（４−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＭＬ３４７）である、請求項６または７に記載の方法。

【請求項20】

前記網膜誘導培地中の、前記ＢＭＰ経路阻害剤がＬＤＮ１９３１８９である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記網膜分化培地中の、前記ＢＭＰ経路阻害剤がＬＤＮ１９３１８９であり、前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である、請求項７に記載の方法。

【請求項22】

ｉＰＳＣの前記出発集団が、それを必要とする被験体に対してＭＨＣハプロタイプがマッチしている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

ｉＰＳＣの前記出発集団が、少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−ＤＲである、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

成熟ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を産生するための方法であって、
ａ）十分に定義された培地中で本質的に単一細胞に解離するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む出発集団を得る工程であって、ヒトｉＰＳＣの前記出発集団が、単一細胞に解離したプレコンフルエント細胞である、工程；
ｂ）ＬＤＮ１９３１８９、ＣＫＩ−７およびＳＢ４３１５４２を含む網膜誘導培地中のラミニン上で該ｉＰＳＣを培養して、網膜系細胞への該細胞の分化を開始させる工程；
ｃ）ＬＤＮ１９３１８９、ＣＫＩ−７、ＳＢ４３１５４２およびＰＤ０３２５９０１を含む網膜分化培地中で該網膜系細胞をさらに培養して、該網膜系細胞をさらに分化させる工程；
ｄ）ニコチンアミドおよびアクチビンＡを含む網膜培地中で該細胞を培養して、分化ＲＰＥ細胞を形成する工程；
ｅ）ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養し、それにより、ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程、および
ｆ）少なくとも１つの一次繊毛インデューサーを含むＲＰＥ成熟培地中で前記ヒトＲＰＥ細胞を培養し、それにより、成熟ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程であって、少なくとも１つの一次繊毛インデューサーが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）である、工程、
を含み、
ここで、該方法が胚様体の形成を含まない、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、２０１５年９月８日に出願された米国仮特許出願第６２／２１５，５７９号に対する優先権の利益を主張し、この内容の全体が参考として本明細書に援用される。

【0002】

共同研究契約の当事者
本発明は、本発明がなされた時点で有効であった共同研究契約の範囲内で行われた活動の結果としてなされたものである。該共同研究契約の当事者は、アメリカ合衆国政府、国立眼科研究所によって代表される米国保健福祉省、国立衛生研究所およびＣｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃである。

【背景技術】

【0003】

背景
１．分野
本開示は、一般に、幹細胞生物学の分野に関する。より具体的には、それは、細胞療法として使用するための幹細胞由来網膜色素上皮細胞集団の効率的な産生方法に関する。

【0004】

２．関連技術の説明
網膜は、眼の内面を覆う光感受性組織層である。網膜における視細胞（桿体または錐体のいずれか）は光に直接感受性であり、化学的光シグナルを電気的事象に変換し、これが神経インパルスをトリガーする。網膜色素上皮（ＲＰＥ）は、血液網膜関門を形成する色素細胞の層である。ＲＰＥ細胞は、視覚機能の維持、ならびに網膜下腔から血液へのイオン、水および代謝最終産物の輸送において重要な役割を果たす（Ｓｔｒａｕｓｓら、２００５）。さらに、ＲＰＥ細胞は、免疫抑制因子を分泌することによって、眼の免疫特権を確立する。ＲＰＥ細胞の障害または傷害は、網膜の変性、視覚機能の喪失および失明をもたらし得る。急性および加齢黄斑変性ならびにベスト病を含むいくつかの網膜障害は、ＲＰＥの変性を伴う；したがって、細胞補充療法は、視力の保存のための可能な治療選択肢である（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、２００９）。

【0005】

一般に、幹細胞は、一連の成熟機能細胞を生じさせ得る未分化細胞である。例えば、造血幹細胞は、様々なタイプの最終分化血液細胞のいずれかを生じさせ得る。胚性幹（ＥＳ）細胞は胚に由来し、多能性であるので、ＲＰＥ細胞を含む任意の器官または組織型に発達する能力を有する。

【0006】

２００６年における成体体細胞性マウス細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の産生は、幹細胞研究、薬物開発、疾患モデル、および細胞治療薬の重要なブレイクスルーを提供した（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６）。ヒトｉＰＳＣは特殊化した細胞型に分化し得、再生医療のための患者特異的免疫適合細胞の可能性を有する（Ｙｕら、２００７）。

【0007】

ｉＰＳＣは、ＲＰＥ細胞を含む眼細胞を生じさせることが示されている（Ｈｉｒａｍｉら、２００９）。しかしながら、ｉＰＳＣまたはＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の産生についてこれまでに公知の技術はすべて、胚様体の出発集団の使用に依存する。治療薬、スクリーニングアッセイ、網膜疾患モデル、ＲＰＥ生物学研究に必要なｉＰＳＣまたはＥＳＣ由来ＲＰＥ細胞の効率的な大規模産生方法は存在しない。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

概要
残念ながら、胚様体自体の産生プロセスは再現可能ではなく、効率が変動するものであり、スケーラブル（これは、ＲＰＥの商業規模産生に必要である）ではないという事実により、ｉＰＳＣまたはＥＳＣなどの多能性細胞からの、すなわち胚様体の出発集団からのルーチンかつ再現性があるＲＰＥ産生は困難である。網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞集団を得るための方法であって、胚様体を使用する必要性を回避し、その代わりに、胚様体を使用するのではなく、多能性幹細胞の細胞懸濁物集団、好ましくは単一細胞懸濁物を用いる方法が開示される。ある特定の実施形態において、多能性幹細胞の出発細胞集団は、例えば、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞であり得る。

【0009】

いくつかの実施形態において、多能性幹細胞を網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化させるための方法が提供される。例えば、多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一実施形態において、ヒトＲＰＥ細胞を産生するための方法であって、ａ）本質的に単一細胞に解離するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む出発集団を得る工程；ｂ）網膜誘導培地中で該ｉＰＳＣを培養して、網膜系細胞への該細胞の分化を開始させる工程；ｃ）網膜分化培地中で該網膜系細胞をさらに培養して、該網膜系細胞をさらに分化させる工程；ｄ）網膜培地中で該細胞を培養して、分化ＲＰＥ細胞を形成する工程；およびｅ）ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養し、それにより、ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記方法は、胚様体の形成を含まない。いくつかの態様において、ＲＰＥ細胞は、産生後に凍結保存される。

【0010】

ある特定の態様において、ｉＰＳＣはマトリックス上で培養される。いくつかの実施形態において、マトリックスは、ラミニン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンなどの少なくとも１つの組換え細胞接着タンパク質を含む。特に、少なくとも１つの細胞接着タンパク質はヒトのものである。

【0011】

ある特定の態様において、ｉＰＳＣは、フィーダー層なしで培養される。いくつかの態様において、ｉＰＳＣは、十分に定義された培養培地中で培養される。別の態様において、ｉＰＳＣはゼノフリー培養培地中で培養される。

【0012】

さらなる態様において、網膜誘導培地は、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含む。いくつかの態様において、ＷＮＴ経路阻害剤は、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミドジヒドロクロリド（ＣＫＩ−７）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−３−（２−メトキシフェニル）−４−オキソチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ４）、２−フェノキシ安息香酸−［（５−メチル−２−フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ７４６５４）２，４−ジアミノ−キナゾリン、ケルセチン、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−メチル−４−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ５３５）、Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ７１５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）および分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ１）１からなる群から選択される。例えば、ＷＮＴ経路阻害剤は、ＣＫＩ−７である。ある特定の態様において、ＢＭＰ経路阻害剤は、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンヒドロクロリド（ＬＤＮ１９３１８９）、６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンジヒドロクロリド（ドルソモルフィン）、４−［６−［４−（１−メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン（ＤＭＨ１）、４−［６−［４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＤＭＨ−２）または５−［６−（４−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＭＬ３４７）である。例えば、ＢＭＰ経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。ある特定の態様において、ＴＧＦβ経路阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）、６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン（ＳＢ５２５３３４）、２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−イエリ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ８３−０１）、４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（Ｄ４４７６）、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド（ＧＷ７８８３８８）、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４８４７）、４−［２−フルオロ−５−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−１−エタノール（Ｒ２６８７１２）または２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）である。例えば、ＴＧＦβ経路阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。

【0013】

いくつかの態様において、網膜分化培地は、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＩＧＦ１を含む。いくつかの態様において、ＷＮＴ経路阻害剤は、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミドジヒドロクロリド（ＣＫＩ−７）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−３−（２−メトキシフェニル）−４−オキソチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ４）、２−フェノキシ安息香酸−［（５−メチル−２−フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ７４６５４）２，４−ジアミノ−キナゾリン、ケルセチン、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−メチル−４−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ５３５）、Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ７１５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）および分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ１）１からなる群から選択される。例えば、ＷＮＴ経路阻害剤は、ＣＫＩ−７である。ある特定の態様において、ＢＭＰ経路阻害剤は、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンヒドロクロリド（ＬＤＮ１９３１８９）、６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンジヒドロクロリド（ドルソモルフィン）、４−［６−［４−（１−メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン（ＤＭＨ１）、４−［６−［４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＤＭＨ−２）または５−［６−（４−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＭＬ３４７）である。例えば、ＢＭＰ経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。ある特定の態様において、ＴＧＦβ経路阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）、６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン（ＳＢ５２５３３４）、２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−イエリ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ８３−０１）、４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（Ｄ４４７６）、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド（ＧＷ７８８３８８）、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４８４７）、４−［２−フルオロ−５−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−１−エタノール（Ｒ２６８７１２）または２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）である。例えば、ＴＧＦβ経路阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。いくつかの態様において、ＭＥＫ阻害剤は、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６−メトキシフェニル］−１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン−１−スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）または６−（４−ブロモ−２−クロロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）である。例えば、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１である。ある特定の態様において、網膜分化培地は、ＬＤＮ１９３１８９、ＣＫＩ−７、ＳＢ４３１５４２およびＰＤ０３２５９０１を含む。

【0014】

さらなる実施形態において、ＲＰＥ成熟培地中で培養した後に、ＲＰＥ細胞を解離する。さらなる態様において、解離ＲＰＥ細胞を播種し、ＲＰＥ成熟培地中で培養する。ある特定の態様において、ＲＰＥ成熟培地は、ＭＥＫ阻害剤を含む。いくつかの態様において、ＭＥＫ阻害剤は、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６−メトキシフェニル］−１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン−１−スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）または６−（４−ブロモ−２−クロロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）である。いくつかの態様において、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１である。

【0015】

なおさらなる実施形態において、ＲＰＥ培地中で培養した後にＲＰＥ細胞を解離し、ＲＰＥ成熟培地中の分解性足場に再播種し、それにより、成熟ＲＰＥ細胞を産生する。ある特定の態様において、ＲＰＥ成熟培地は、少なくとも１つの一次繊毛インデューサーを含み得る。いくつかの態様において、少なくとも１つの一次繊毛インデューサーは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはアフィジコリンである。他の態様において、ＲＰＥ成熟培地は、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）または４−（１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド（ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１）を含み得る。

【0016】

さらなる態様において、ｉＰＳＣの出発集団は、単一細胞に解離したプレコンフルエント細胞である。他の態様において、ｉＰＳＣを、約５，０００〜４０，０００個の細胞／ｃｍ^２の初期細胞密度で培養する。ある特定の態様において、ｉＰＳＣを、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００または４０，０００個の細胞／ｃｍ^２の初期細胞密度で培養する。

【0017】

なおさらなる態様において、ｉＰＳＣの出発集団は、それを必要とする被験体にハプロタイプ一致のＭＨＣである。いくつかの態様において、ｉＰＳＣは、少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子についてホモ接合性である。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−ＤＲにおいてホモ接合性である。いくつかの態様において、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂにおいてホモ接合性である。

【0018】

別の実施形態において、ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を産生するための方法であって、ａ）十分に定義された培地中で本質的に単一細胞に解離するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む出発集団を得る工程；ｂ）ＬＤＮ１９３１８９、ＣＫＩ−７およびＳＢ４３１５４２を含む網膜誘導培地中のラミニン上で該ｉＰＳＣを培養して、網膜系細胞への該細胞の分化を開始させる工程；ｃ）ＬＤＮ１９３１８９、ＣＫＩ−７、ＳＢ４３１５４２およびＰＤ０３２５９０１を含む網膜分化培地中で該網膜系細胞をさらに培養して、該網膜系細胞をさらに分化させる工程；ｄ）ニコチンアミドおよびアクチビンＡを含む網膜培地中で該細胞を培養して、分化ＲＰＥ細胞を形成する工程；ならびにｅ）ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養し、それにより、ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程を含む、方法が提供される。ある特定の態様において、方法は胚様体の形成を含まない。

【0019】

[本発明1001]
ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を産生するための方法であって、
ａ）本質的に単一細胞に解離するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む出発集団を得る工程；
ｂ）網膜誘導培地中で該ｉＰＳＣを培養して、網膜系細胞への該細胞の分化を開始させる工程；
ｃ）網膜分化培地中で該網膜系細胞をさらに培養して、該網膜系細胞をさらに分化させる工程；
ｄ）網膜培地中で該細胞を培養して、分化ＲＰＥ細胞を形成する工程；および
ｅ）ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養し、それにより、ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程
を含み、
ここで、該方法が胚様体の形成を含まない、方法。
[本発明1002]
工程（ｂ）の前記ｉＰＳＣをマトリックス上で培養する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記マトリックスが少なくとも1つの組換え細胞接着タンパク質を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
前記少なくとも1つの細胞接着タンパク質がラミニン、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンである、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記少なくとも1つの細胞接着タンパク質がヒトのものである、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
前記網膜誘導培地が、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびインスリン成長因子1（ＩＧＦ1）を含む、本発明1001〜1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記網膜分化培地が、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＭＥＫ阻害剤およびＩＧＦ1を含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
工程（ｅ）に続いて前記ＲＰＥ細胞を解離し、該ＲＰＥ細胞を再播種し、ＭＥＫ阻害剤を含む前記ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養することをさらに含む、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記ＲＰＥ細胞を解離し、該ＲＰＥ細胞を前記ＲＰＥ成熟培地中の分解性足場上に再播種することをさらに含む、本発明1008の方法。
[本発明1010]
少なくとも1つの一次繊毛インデューサーを含む前記ＲＰＥ成熟培地中で前記ＲＰＥ細胞を培養し、それにより、成熟ＲＰＥ細胞を産生することをさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
前記少なくとも1つの一次繊毛インデューサーがプロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）またはアフィジコリンである、本発明1010の方法。
[本発明1012]
Ｎ−（6−メチル−2−ベンゾチアゾリル）−2−［（3，4，6，7−テトラヒドロ−4−オキソ−3−フェニルチエノ［3，2−ｄ］ピリミジン−2−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ2）および／または4−（1，3，3ａ，4，7，7ａ−ヘキサヒドロ−1，3−ジオキソ−4，7−メタノ−2Ｈ−イソインドール−2−イル）−Ｎ−8−キノリニル−ベンズアミド（ｅｎｄｏ−ＩＷＲ1）を含む前記ＲＰＥ成熟培地中で前記ＲＰＥ細胞を培養することをさらに含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1013]
前記ＲＰＥ細胞を凍結保存することをさらに含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
工程（ａ）のｉＰＳＣの前記出発集団が、単一細胞に解離したプレコンフルエント細胞である、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1015]
工程（ｂ）の前記ｉＰＳＣを、約5，000〜40，000個の細胞／ｃｍ²の初期細胞密度で培養する、本発明1001〜1014のいずれかの方法。
[本発明1016]
フィーダー層を用いずに前記ｉＰＳＣを培養する、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
十分に定義された培養培地中で前記ｉＰＳＣを培養する、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
ゼノフリー培養培地中で前記ｉＰＳＣを培養する、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1019]
前記ＷＮＴ経路阻害剤が、Ｎ−（2−アミノエチル）−5−クロロイソキノリン−8−スルホンアミドジヒドロクロリド（ＣＫＩ−7）、Ｎ−（6−メチル−2−ベンゾチアゾリル）−2−［（3，4，6，7−テトラヒドロ−4−オキソ−3−フェニルチエノ［3，2−ｄ］ピリミジン−2−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ2）、Ｎ−（6−メチル−2−ベンゾチアゾリル）−2−［（3，4，6，7−テトラヒドロ−3−（2−メトキシフェニル）−4−オキソチエノ［3，2−ｄ］ピリミジン−2−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ4）、2−フェノキシ安息香酸−［（5−メチル−2−フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ74654）2，4−ジアミノ−キナゾリン、ケルセチン、3，5，7，8−テトラヒドロ−2−［4−（トリフルオロメチル）フェニル］−4Ｈ−チオピラノ［4，3−ｄ］ピリミジン−4−オン（ＸＡＶ939）、2，5−ジクロロ−Ｎ−（2−メチル−4−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ535）、Ｎ−［4−［2−エチル−4−（3−メチルフェニル）−5−チアゾリル］−2−ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ715）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質1（ＤＫＫ1）または分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ1）1である、本発明1006〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
前記ＴＧＦβ経路阻害剤が、4−［4−（1，3−ベンゾジオキソール−5−イル）−5−（2−ピリジニル）−1Ｈ−イミダゾール−2−イル］ベンズアミド（ＳＢ431542）、6−［2−（1，1−ジメチルエチル）−5−（6−メチル−2−ピリジニル）−1Ｈ−イミダゾール−4−イル］キノキサリン（ＳＢ525334）、2−（5−ベンゾ［1，3］ジオキソール−5−イル−2−イエリ−ブチル−3Ｈ−イミダゾール−4−イル）−6−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−505124）、4−（5−ベンゾール［1，3］ジオキソール−5−イル−4−ピリジン−2−イル−1Ｈ−イミダゾール−2−イル）−ベンズアミド水和物、4−［4−（1，3−ベンゾジオキソール−5−イル）−5−（2−ピリジニル）−1Ｈ−イミダゾール−2−イル］−ベンズアミド水和物、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）、3−（6−メチル−2−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−4−（4−キノリニル）−1Ｈ−ピラゾール−1−カルボチオアミド（Ａ83−01）、4−［4−（2，3−ジヒドロ−1，4−ベンゾジオキシン−6−イル）−5−（2−ピリジニル）−1Ｈ−イミダゾール−2−イル］ベンズアミド（Ｄ4476）、4−［4−［3−（2−ピリジニル）−1Ｈ−ピラゾール−4−イル］−2−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−2Ｈ−ピラン−4−イル）−ベンズアミド（ＧＷ788388）、4−［3−（2−ピリジニル）−1Ｈ−ピラゾール−4−イル］−キノリン（ＬＹ364847）、4−［2−フルオロ−5−［3−（6−メチル−2−ピリジニル）−1Ｈ−ピラゾール−4−イル］フェニル］−1Ｈ−ピラゾール−1−エタノール（Ｒ268712）または2−（3−（6−メチルピリジン−2−イル）−1Ｈ−ピラゾール−4−イル）−1，5−ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）である、本発明1006〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
前記ＭＥＫ阻害剤が、Ｎ−［（2Ｒ）−2，3−ジヒドロキシプロポキシ］−3，4−ジフルオロ−2−［（2−フルオロ−4−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ0325901）、Ｎ−［3−［3−シクロプロピル−5−（2−フルオロ−4−ヨードアニリノ）−6，8−ジメチル−2，4，7−トリオキソピリド［4，3−ｄ］ピリミジン−1−イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ1120212）、6−（4−ブロモ−2−フルオロアニリノ）−7−フルオロ−Ｎ−（2−ヒドロキシエトキシ）−3−メチルベンゾイミダゾール−5−カルボキサミド（ＭＥＫ162）、Ｎ−［3，4−ジフルオロ−2−（2−フルオロ−4−ヨードアニリノ）−6−メトキシフェニル］−1−（2，3−ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン−1−スルホンアミド（ＲＤＥＡ119）または6−（4−ブロモ−2−クロロアニリノ）−7−フルオロ−Ｎ−（2−ヒドロキシエトキシ）−3−メチルベンゾイミダゾール−5−カルボキサミド（ＡＺＤ6244）である、本発明1007〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記ＢＭＰ経路阻害剤が、4−（6−（4−（ピペラジン−1−イル）フェニル）ピラゾロ［1，5−ａ］ピリミジン−3−イル）キノリンヒドロクロリド（ＬＤＮ193189）、6−［4−［2−（1−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−3−（4−ピリジニル）−ピラゾロ［1，5−ａ］ピリミジンジヒドロクロリド（ドルソモルフィン）、4−［6−［4−（1−メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［1，5−ａ］ピリミジン−3−イル］−キノリン（ＤＭＨ1）、4−［6−［4−［2−（4−モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［1，5−ａ］ピリミジン−3−イル］キノリン（ＤＭＨ−2）または5−［6−（4−メトキシフェニル）ピラゾロ［1，5−ａ］ピリミジン−3−イル］キノリン（ＭＬ347）である、本発明1006〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記網膜誘導培地中の、前記ＢＭＰ経路阻害剤がＬＤＮ193189である、本発明1006〜1021のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記網膜分化培地中の、前記ＢＭＰ経路阻害剤がＬＤＮ193189であり、前記ＭＥＫ阻害剤がＰＤ0325901である、本発明1007〜1023のいずれかの方法。
[本発明1025]
ｉＰＳＣの前記出発集団が、それを必要とする被験体に対してＭＨＣハプロタイプがマッチしている、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
ｉＰＳＣの前記出発集団が、少なくとも1つのＨＬＡ対立遺伝子についてホモ接合性である、本発明1001〜1025のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記少なくとも1つのＨＬＡ対立遺伝子がＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−ＤＲである、本発明1026の方法。
[本発明1028]
ヒト網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を産生するための方法であって、
ａ）十分に定義された培地中で本質的に単一細胞に解離するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む出発集団を得る工程；
ｂ）ＬＤＮ193189、ＣＫＩ−7およびＳＢ431542を含む網膜誘導培地中のラミニン上で該ｉＰＳＣを培養して、網膜系細胞への該細胞の分化を開始させる工程；
ｃ）ＬＤＮ193189、ＣＫＩ−7、ＳＢ431542およびＰＤ0325901を含む網膜分化培地中で該網膜系細胞をさらに培養して、該網膜系細胞をさらに分化させる工程；
ｄ）ニコチンアミドおよびアクチビンＡを含む網膜培地中で該細胞を培養して、分化ＲＰＥ細胞を形成する工程；ならびに
ｅ）ＲＰＥ成熟培地中で該ＲＰＥ細胞を培養し、それにより、ヒトＲＰＥ細胞を産生する工程
を含み、
ここで、該方法が胚様体の形成を含まない、方法。
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、この詳細な説明から、本発明の精神内および範囲内の様々な変更および改変が当業者に明らかになるという理由で、詳細な説明および具体的な例が、本発明の好ましい実施形態を示すが説明という目的でのみ与えられることが理解されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【0020】

下記の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに実証するために含められる。本開示は、本明細書中に提示されるある具体的な実施形態の詳細な説明とともに、これらの図面のうちの１つまたはそれよりも多くを参照することによって、より良く理解され得る。

【0021】

【図1A】Ａ）プレコンフルエントｉＰＳＣの画像。Ｂ）ＲＰＥ分化の２５日目の画像例。Ｃ）ＲＰＥ分化の４０日目の画像例。Ｄ）４０日目にＲＰＥ−ＭＭ中の培養物を再播種した後の６０日目の１００倍の明視野での画像例。

【図1B】Ａ）プレコンフルエントｉＰＳＣの画像。Ｂ）ＲＰＥ分化の２５日目の画像例。Ｃ）ＲＰＥ分化の４０日目の画像例。Ｄ）４０日目にＲＰＥ−ＭＭ中の培養物を再播種した後の６０日目の１００倍の明視野での画像例。

【図1C】Ａ）プレコンフルエントｉＰＳＣの画像。Ｂ）ＲＰＥ分化の２５日目の画像例。Ｃ）ＲＰＥ分化の４０日目の画像例。Ｄ）４０日目にＲＰＥ−ＭＭ中の培養物を再播種した後の６０日目の１００倍の明視野での画像例。

【図1D】Ａ）プレコンフルエントｉＰＳＣの画像。Ｂ）ＲＰＥ分化の２５日目の画像例。Ｃ）ＲＰＥ分化の４０日目の画像例。Ｄ）４０日目にＲＰＥ−ＭＭ中の培養物を再播種した後の６０日目の１００倍の明視野での画像例。

【0022】

【図2A】ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団の細胞選別前の関連マーカー（ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む）のフローサイトメトリー分析。

【図2B】ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団の細胞選別前の関連マーカー（ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む）のフローサイトメトリー分析。

【0023】

【図3A】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４陽性およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４陽性およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４陽性、ＣＤ５６陽性およびＣＤ９０陽性細胞を除去するための、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団の細胞選別後の関連マーカー（ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む）のフローサイトメトリー分析。

【図3B】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４陽性およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４陽性およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４陽性、ＣＤ５６陽性およびＣＤ９０陽性細胞を除去するための、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団の細胞選別後の関連マーカー（ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む）のフローサイトメトリー分析。

【図3C】ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ２４陽性およびＣＤ５６陽性細胞、ＣＤ２４陽性およびＣＤ９０陽性細胞、ならびにＣＤ２４陽性、ＣＤ５６陽性およびＣＤ９０陽性細胞を除去するための、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞集団の細胞選別後の関連マーカー（ＭＡＰ２、ＮＥＳ、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＴＹＲＰ１、ＣＲＡＬＢＰおよびＢＥＳＴ１を含む）のフローサイトメトリー分析。

【0024】

【図4A】Ａ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のβカテニンおよびＦ−アクチン染色。βカテニン染色は、未処理細胞の細胞質および処理細胞の膜において見られる。Ｂ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のｐＥＲＭ（エズリン）およびＺＯ１染色。ＥＲＭ染色は、未処理細胞の細胞質では低く、処理細胞の細胞質では高いが、ＺＯ１染色は、未処理細胞および処理細胞の両方の原形質膜の密着結合において見られる。Ｃ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のＲＰＥ６５およびＺＯ１染色。ＲＰＥ６５染色は、未処理細胞の細胞質では低く、処理細胞の細胞質では高い。Ｄ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞の透過電子顕微鏡写真。ＰＧＥ２で処理した細胞は、より広範な先端突起を有する。

【図4BC】Ａ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のβカテニンおよびＦ−アクチン染色。βカテニン染色は、未処理細胞の細胞質および処理細胞の膜において見られる。Ｂ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のｐＥＲＭ（エズリン）およびＺＯ１染色。ＥＲＭ染色は、未処理細胞の細胞質では低く、処理細胞の細胞質では高いが、ＺＯ１染色は、未処理細胞および処理細胞の両方の原形質膜の密着結合において見られる。Ｃ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のＲＰＥ６５およびＺＯ１染色。ＲＰＥ６５染色は、未処理細胞の細胞質では低く、処理細胞の細胞質では高い。Ｄ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞の透過電子顕微鏡写真。ＰＧＥ２で処理した細胞は、より広範な先端突起を有する。

【図4D】Ａ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のβカテニンおよびＦ−アクチン染色。βカテニン染色は、未処理細胞の細胞質および処理細胞の膜において見られる。Ｂ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のｐＥＲＭ（エズリン）およびＺＯ１染色。ＥＲＭ染色は、未処理細胞の細胞質では低く、処理細胞の細胞質では高いが、ＺＯ１染色は、未処理細胞および処理細胞の両方の原形質膜の密着結合において見られる。Ｃ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のＲＰＥ６５およびＺＯ１染色。ＲＰＥ６５染色は、未処理細胞の細胞質では低く、処理細胞の細胞質では高い。Ｄ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥ未処理細胞、およびＰＧＥ２で処理したｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞の透過電子顕微鏡写真。ＰＧＥ２で処理した細胞は、より広範な先端突起を有する。

【0025】

【図5AB】Ａ）ＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のβカテニン染色。ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１で処理した細胞は、細胞膜上にβカテニンを有する。ＬｉＣｌで処理した細胞は核内にβカテニンを有し、未処理細胞は細胞質中にβカテニンを有する。Ｂ）ＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のｐ２７染色。ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１で処理した細胞は、核内により高いｐ２７発現を有するが、これは、細胞が細胞周期から脱出したことを示唆している。ＬｉＣｌで処理した細胞または未処理細胞は、核内に弱いｐ２７発現を有する。Ｃ）ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のＲＰＥ６５およびＺＯ１密着結合。ＲＰＥ６５は、ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１処理細胞およびＩＷＰ２細胞の細胞質では高く、未処理細胞では低く、染色は、ＬｉＣｌ処理細胞では見られない。Ｄ）ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞の機能的密着結合の電子顕微鏡法の画像。

【図5CD】Ａ）ＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のβカテニン染色。ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１で処理した細胞は、細胞膜上にβカテニンを有する。ＬｉＣｌで処理した細胞は核内にβカテニンを有し、未処理細胞は細胞質中にβカテニンを有する。Ｂ）ＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のｐ２７染色。ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１で処理した細胞は、核内により高いｐ２７発現を有するが、これは、細胞が細胞周期から脱出したことを示唆している。ＬｉＣｌで処理した細胞または未処理細胞は、核内に弱いｐ２７発現を有する。Ｃ）ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞のＲＰＥ６５およびＺＯ１密着結合。ＲＰＥ６５は、ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１処理細胞およびＩＷＰ２細胞の細胞質では高く、未処理細胞では低く、染色は、ＬｉＣｌ処理細胞では見られない。Ｄ）ＩＷＰ２＋ＩＷＲ１、ＩＷＰ２またはＬｉＣｌで処理した細胞の機能的密着結合の電子顕微鏡法の画像。

【0026】

【図6A】Ａ）マルチオペレーター（ｍｕｌｔｉ−ｏｐｅｒａｔｏｒ）によるＲＰＥ分化。示されているデータは、ＲＰＥマーカーであるレチンアルデヒド結合タンパク質１（Ｃｒａｌｂｐ）のフローサイトメトリーによって測定した場合の、３つの株にわたる最適化プロトコールを使用して複数のオペレーターがセットアップしたＲＰＥ分化を表す。Ｂ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、３Ｄ１、ＡＭＤ１Ｂ、ＢＥＳＴ１Ｌ、ＢＥＳＴ３Ａ、ＢＥＳＴ８Ａ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３Ｄ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３ＣおよびＨＬＡ ＬｉｎｅＡを含む異なる出発細胞株集団間で示されている。Ｃ〜Ｄ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、異なる出発細胞株集団間で示されている。データは、１３人のドナーに由来する２８個のｉＰＳＣ株に対して、５人のオペレーターが実施した１０９の分化を表す。Ｃｒａｌｂｐ陽性細胞の割合は、異なる純度の精製前細胞集団と比較して９０〜１００％に増加した。

【図6B】Ａ）マルチオペレーター（ｍｕｌｔｉ−ｏｐｅｒａｔｏｒ）によるＲＰＥ分化。示されているデータは、ＲＰＥマーカーであるレチンアルデヒド結合タンパク質１（Ｃｒａｌｂｐ）のフローサイトメトリーによって測定した場合の、３つの株にわたる最適化プロトコールを使用して複数のオペレーターがセットアップしたＲＰＥ分化を表す。Ｂ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、３Ｄ１、ＡＭＤ１Ｂ、ＢＥＳＴ１Ｌ、ＢＥＳＴ３Ａ、ＢＥＳＴ８Ａ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３Ｄ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３ＣおよびＨＬＡ ＬｉｎｅＡを含む異なる出発細胞株集団間で示されている。Ｃ〜Ｄ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、異なる出発細胞株集団間で示されている。データは、１３人のドナーに由来する２８個のｉＰＳＣ株に対して、５人のオペレーターが実施した１０９の分化を表す。Ｃｒａｌｂｐ陽性細胞の割合は、異なる純度の精製前細胞集団と比較して９０〜１００％に増加した。

【図6C】Ａ）マルチオペレーター（ｍｕｌｔｉ−ｏｐｅｒａｔｏｒ）によるＲＰＥ分化。示されているデータは、ＲＰＥマーカーであるレチンアルデヒド結合タンパク質１（Ｃｒａｌｂｐ）のフローサイトメトリーによって測定した場合の、３つの株にわたる最適化プロトコールを使用して複数のオペレーターがセットアップしたＲＰＥ分化を表す。Ｂ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、３Ｄ１、ＡＭＤ１Ｂ、ＢＥＳＴ１Ｌ、ＢＥＳＴ３Ａ、ＢＥＳＴ８Ａ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３Ｄ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３ＣおよびＨＬＡ ＬｉｎｅＡを含む異なる出発細胞株集団間で示されている。Ｃ〜Ｄ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、異なる出発細胞株集団間で示されている。データは、１３人のドナーに由来する２８個のｉＰＳＣ株に対して、５人のオペレーターが実施した１０９の分化を表す。Ｃｒａｌｂｐ陽性細胞の割合は、異なる純度の精製前細胞集団と比較して９０〜１００％に増加した。

【図6D】Ａ）マルチオペレーター（ｍｕｌｔｉ−ｏｐｅｒａｔｏｒ）によるＲＰＥ分化。示されているデータは、ＲＰＥマーカーであるレチンアルデヒド結合タンパク質１（Ｃｒａｌｂｐ）のフローサイトメトリーによって測定した場合の、３つの株にわたる最適化プロトコールを使用して複数のオペレーターがセットアップしたＲＰＥ分化を表す。Ｂ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、３Ｄ１、ＡＭＤ１Ｂ、ＢＥＳＴ１Ｌ、ＢＥＳＴ３Ａ、ＢＥＳＴ８Ａ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３Ｄ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３ＣおよびＨＬＡ ＬｉｎｅＡを含む異なる出発細胞株集団間で示されている。Ｃ〜Ｄ）ＲＰＥ分化プロトコールの再現性は、異なる出発細胞株集団間で示されている。データは、１３人のドナーに由来する２８個のｉＰＳＣ株に対して、５人のオペレーターが実施した１０９の分化を表す。Ｃｒａｌｂｐ陽性細胞の割合は、異なる純度の精製前細胞集団と比較して９０〜１００％に増加した。

【0027】

【図7A】Ａ）ＲＰＥ分化プロトコールを使用して作製したＲＰＥ細胞の関門機能の機能性は、単層全体にわたるイオン勾配の経上皮電位（ＴＥＰ）測定によって示される。Ｂ）ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ２で処理したＲＰＥ細胞の機能性。Ｃ〜Ｅ）未処理細胞、ＰＧＥ２処理細胞およびＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１処理細胞の経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）およびＴＥＰ（明るい線）。Ｆ）ｉＰＳＣ由来分化プロトコールの５４日目から７５日目までの、ＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地中、５０μＭ ＰＧＥ２で、対１００μＭ ＰＧＥ２で成熟させた細胞からの機能的応答（ＴＥＲ）。分化プロトコールの５４日目から７５日目までの、ＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地中、５０μＭ ＰＧＥ２を使用して培養したｉＰＳＣ由来ＲＰＥと比較して、１００μＭの場合には、それらの分化経過中のＴＥＲの尺度が漸進的に増加した。これは、ＰＧＥ２の濃度の増加が、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ培養物の成熟および機能的効率を促進することを実証している。Ｇ）ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ分化プロトコールを５４日目から７５日目までに開始した、５０μＭ対１００μＭ ＰＧＥ２を用いた培養物中の７５日目における成熟ＲＰＥマーカーの発現率によるｉＰＳＣ由来ＲＰＥの純度。Ｐｍｅｌ１７、Ｔｒｙｐ１およびＣｒａｌｂｐ（ＲＰＥ特異的マーカー）の発現は、５０μＭ ＰＧＥ２を使用して培養したｉＰＳＣ由来ＲＰＥと同程度である。これは、ＰＧＥ２が一連の濃度にわたりｉＰＳＣ由来ＲＰＥの分化を促進することを示している。Ｂｅｓｔ１マーカー（後期成熟ＲＰＥマーカー）の発現は、１００μＭ ＰＧＥ２で処理した細胞では、５０μＭ ＰＧＥ２で処理した細胞と比較してかなり高いが、これは、ＰＧＥ２の濃度の増加がｉＰＳＣ由来ＲＰＥの純度および成熟を増強することを示している。

【図7B】同上

【図7C】同上

【図7D】同上

【図7E】同上

【図7F】同上

【図7G】同上

【発明を実施するための形態】

【0028】

例示的な実施形態の説明
本開示の特定の態様は、多能性幹細胞の出発細胞懸濁物、好ましくは、多能性幹細胞の本質的に単一細胞懸濁物からＲＰＥ細胞集団を産生するための方法を提供することによって、現状技術に関するいくつかの主要な問題を克服する。ＲＰＥ細胞は、ＥＳ細胞およびｉＰＳＣ細胞などの多能性幹細胞から誘導され得る；しかしながら、現在の方法は、胚様体の出発集団に依存する。いくつかの実施形態において、本開示は、胚様体を使用せずに、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を機能的成熟ＲＰＥ細胞に分化させる高効率かつ再現性がある方法を提供する。さらなる実施形態および利点は、以下に記載されている。
Ｉ．定義

【0029】

用語「精製された」は、絶対的な純度を必要としない；むしろ、それは、相対的な用語として意図される。したがって、精製された細胞集団は、約９０％超、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％純粋であるか、または最も好ましくは他の細胞型を本質的に含まない。

【0030】

本明細書中で使用されるとき、特定の成分に関して「本質的に」または「本質的に含まない」は、本明細書中では、いかなる特定の成分も組成物に意図的に配合されておらず、および／または夾雑物としてもしくは微量でのみ存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の意図しないいかなる混入に起因する特定の成分の総量は、０．０５％よりかなり少なく、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、標準的な分析方法を用いて特定の成分の量が検出され得ない組成物である。

【0031】

本明細書中で使用されるとき、本明細書では「ａ」または「ａｎ」は、１つまたはそれより多い、を意味し得る。本明細書で使用されるとき、請求項（複数可）において、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用されるとき、単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ、または２つ以上を意味し得る。

【0032】

特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみを指すことが明確に示されない限り、または該代替物が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物ならびに「および／または」のみを指す定義を支持する。本明細書中で使用されるとき、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれを超えるものを意味し得る。

【0033】

本出願を通じて、用語「約」は、値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法の固有の誤差変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。

【0034】

用語「細胞」は、本明細書中では、独立して複製し得る生物の構造および機能単位であって、膜によって囲まれており、生体分子および遺伝物質を含有する生物の構造および機能単位を指すために使用される。本明細書中で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝的に改変された細胞など）であり得る。

【0035】

用語「細胞集団」は、本明細書中では、典型的には共通の型の細胞の群を指すために使用される。細胞集団は、共通の前駆体に由来し得るか、または１つを超える細胞型を含み得る。「富化」細胞集団は、出発集団におけるその細胞型の割合よりも大きい割合の特定の細胞型を含有する出発細胞集団（例えば、未分画の異種細胞集団）に由来する細胞集団を指す。細胞集団は、１つまたはそれを超える細胞型が富化され、１つまたはそれを超える細胞型が枯渇され得る。

【0036】

用語「幹細胞」は、本明細書中では、適切な条件下で多様な特殊化した細胞型に分化することができ、他の適切な条件下では、自己複製して本質的に未分化の多能性状態であり続けることができる細胞を指す。用語「幹細胞」はまた、多能性細胞、複能性細胞、前駆体細胞および前駆細胞を包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血幹細胞もしくは間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、または胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から得られ得る。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連する特定の転写因子の発現によってそれらを多能性状態に再プログラミングすることによって、体細胞から産生され得る；これらの細胞は、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」と称される。

【0037】

用語「多能性」は、胚体外細胞または胎盤細胞を除いて、生物におけるすべての他の細胞型に分化する細胞の特性を指す。多能性幹細胞は、長期間培養した後であっても、３つの胚葉すべての細胞型（例えば、外胚葉細胞型、中胚葉細胞型および内胚葉細胞型）に分化することができる。多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹細胞である。他の実施形態において、多能性幹細胞は、体細胞を再プログラミングすることによって誘導される人工多能性幹細胞である。

【0038】

用語「分化」は、特殊化していない細胞が構造特性および／または機能特性の変化を伴うより特殊化した型になるプロセスを指す。成熟細胞は、典型的には、変化した細胞構造および組織特異的タンパク質を有する。より具体的には、本方法との関連では、前記ＲＰＥ細胞が成熟最終分化細胞であることを示す特徴を有する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の細胞型を獲得するヒト幹細胞のプロセスを示す。

【0039】

本明細書中で使用されるとき、「未分化」は、胚または成体起源の最終分化細胞と明確に区別可能な未分化細胞の特徴的マーカーおよび形態学的特徴を示す細胞を指す。

【0040】

「胚様体（ＥＢ）」は、内胚葉、中胚葉および外胚葉の細胞に分化し得る多能性幹細胞の凝集体である。多能性幹細胞が凝集し、懸濁物中のＥＢの非接着性培養が可能になると、スフェロイド構造が形成される。

【0041】

「単離された」細胞は、生物または培養物中の他の細胞から実質的に分離または精製されている。単離された細胞は、例えば、少なくとも９９％、少なくとも９８％純粋、少なくとも９５％純粋または少なくとも９０％純粋であり得る。

【0042】

「胚」は、接合体または人工的に再プログラミングされた核を有する活性化卵母細胞の１回またはそれを超える分裂によって得られる細胞塊を指す。

【0043】

「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期段階の胚、例えば胚盤胞期の内部細胞塊から得られるか、または人工的手段（例えば、核移植）によって産生される未分化多能性細胞であって、胚または成体における任意の分化細胞型（生殖細胞（例えば、精子および卵子）を含む）を生じさせ得る未分化多能性細胞である。

【0044】

「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子（本明細書中では、再プログラミング因子と称される）の組み合わせを発現させるかまたはその発現を誘導することによって体細胞を再プログラミングすることによって作製される細胞である。ｉＰＳＣは、胎児体細胞、出生後体細胞、新生児体細胞、幼若体細胞または成体体細胞を使用して作製され得る。ある特定の実施形態において、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングするために使用され得る因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と称されることもある）、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態において、体細胞は、少なくとも２つの再プログラミング因子、少なくとも３つの再プログラミング因子または４つの再プログラミング因子を発現させて、体細胞を多能性幹細胞に再プログラミングすることによって再プログラミングされる。

【0045】

「対立遺伝子」は、遺伝子の２つまたはそれを超える形態の一方を指す。ヒトなどの二倍体生物は、２コピーの各染色体を含有するので、それぞれに１つの対立遺伝子を有する。

【0046】

用語「ホモ接合性」は、特定の遺伝子座において２つの同じ対立遺伝子を含有すると定義される。用語「ヘテロ接合性」は、特定の遺伝子座において２つの異なる対立遺伝子を含有すると定義される。

【0047】

「ハプロタイプ」は、単一染色体に沿った複数の遺伝子座における対立遺伝子の組み合わせを指す。ハプロタイプは、単一染色体上の一塩基多型（ＳＮＰ）のセットおよび／または主要組織適合性複合体中の対立遺伝子に基づき得る。

【0048】

本明細書中で使用されるとき、用語「ハプロタイプ一致」は、細胞（例えば、ｉＰＳＣ細胞）および処置されている被験体が１つまたはそれを超える主要組織適合性遺伝子座ハプロタイプを共有することと定義される。被験体のハプロタイプは、当技術分野で周知のアッセイを使用して容易に決定され得る。ハプロタイプ一致ｉＰＳＣ細胞は、自己または同種であり得る。組織培養で成長させ、ＲＰＥ細胞に本質的に分化した自己細胞は、被験体にハプロタイプ一致である。

【0049】

「実質的に同じＨＬＡ型」は、ドナーの体細胞に由来するｉＰＳＣの分化を誘導することによって得られた移植細胞を患者に移植する場合、それらを生着させ得る程度に、ドナーのＨＬＡ型が患者のものと一致することを示す。

【0050】

「スーパードナー」は、本明細書中では、特定のＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子についてホモ接合性の個体をいう。これらのホモ接合性個体はスーパードナーとして機能し得、それらの細胞（それらの細胞を含む組織および他の材料を含む）は、そのハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかの個体に移植され得る。スーパードナーは、それぞれＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座（複数可）対立遺伝子についてホモ接合性であり得る。

【0051】

「フィーダーフリー」または「フィーダー非依存性」は、本明細書中では、フィーダー細胞層の代替品としてサイトカインおよび成長因子（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ）を補充した培養を指すために使用される。したがって、「フィーダーフリー」またはフィーダー非依存性培養系および培地は、未分化および増殖状態の多能性細胞を培養および維持するために使用され得る。いくつかの場合では、フィーダーフリー培養物は、動物ベースのマトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を利用するか、またはフィブロネクチン、コラーゲンもしくはビトロネクチンなどの基材上で成長させる。これらのアプローチにより、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とせずに、ヒト幹細胞は、本質的に未分化状態であり続けることが可能になる。

【0052】

「フィーダー層」は、本明細書中では、培養皿の底面上などの細胞のコーティング層と定義される。フィーダー細胞は、培養培地中に栄養素を放出し、多能性幹細胞などの他の細胞が付着し得る表面を提供し得る。

【0053】

培地、細胞外マトリックスまたは培養条件に関して使用されるとき、用語「定義された」または「十分に定義された」は、ほぼすべての成分の化学組成および量が既知である培地、細胞外マトリックスまたは培養条件を指す。例えば、定義された培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミンなどの定義されていない因子を含有しない。一般に、定義された培地は、組換えアルブミン、化学的に定義された脂質、および組換えインスリンが補充された基礎培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、バッファ、抗酸化剤およびエネルギー源を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２、またはロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含む。例示的な十分に定義された培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地である。

【0054】

培地、細胞外マトリックスまたは培養条件に関して使用されるとき、用語「ゼノフリー（ＸＦ）」は、異種動物由来成分を本質的に含まない培地、細胞外マトリックスまたは培養条件を指す。ヒト細胞の培養では、マウスなどの非ヒト動物の任意のタンパク質は異種成分である。ある特定の態様において、ゼノフリーマトリックスは、いかなる非ヒト動物由来成分も本質的に含み得ないので、マウスフィーダー細胞またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は除外される。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）は、ラミニン（主要成分）、コラーゲンＩＶ、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびエンタクチン／ニドゲンを含むように、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫（細胞外マトリックスタンパク質が豊富な腫瘍）から抽出された可溶化基底膜調製物である。

【0055】

「ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替品」は、本明細書中では、培養において幹細胞などの未分化細胞を成長および維持するために最適化された無血清調合物を指す。

【0056】

「プレコンフルエント」は、細胞によって覆われている培養物表面の割合が約６０〜８０％である細胞培養物を指す。通常、プレコンフルエントは、培養物表面の約７０％が細胞によって覆われている培養物を指す。

【0057】

「網膜」は、眼の内面を覆う組織の光感受性層を指す。

【0058】

「網膜色素上皮」は、血管が充満した層である脈絡膜と、網膜との間の色素細胞の単層を指す。

【0059】

「網膜系細胞」は、本明細書中では、ＲＰＥ細胞を生じさせ得るか、またはＲＰＥ細胞に分化し得る細胞を指す。

【0060】

「網膜誘導培地（ＲＩＭ）」は、本明細書中では、ＷＮＴ経路阻害剤およびＢＭＰ経路阻害剤を含む成長培地であって、網膜系細胞へのＰＳＣの分化をもたらし得る成長培地を指す。ＲＩＭはまた、ＴＧＦβ経路阻害剤を含む。

【0061】

「網膜分化培地（ＲＤＭ）」は、本明細書中では、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびＭＥＫ阻害剤を含む培地であって、網膜細胞を分化させる培地と定義される。ＲＤＭはまた、ＴＧＦβ経路阻害剤を含む。

【0062】

「網膜培地（ＲＭ）」は、網膜細胞の培養のための成長培地であって、アクチビンＡおよびニコチンアミドを含む成長培地と定義される。

【0063】

「ＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ−ＭＭ）」は、本明細書中では、ＲＰＥ細胞の成熟のための培地であって、タウリンおよびヒドロコルチゾンを含む培地を指す。ＲＰＥ−ＭＭはまた、トリヨードチロニンを含む。ＲＰＥ−ＭＭはまた、ＰＤ０３２５９０１またはＰＧＥ２を含み得る。

【0064】

「成熟」ＲＰＥ細胞は、本明細書中では、Ｐａｘ６などの未成熟ＲＰＥマーカーの発現がダウンレギュレートしているＲＰＥ細胞であって、ＲＰＥ６５などの成熟ＲＰＥマーカーの発現がアップレギュレートしているＲＰＥ細胞を指す。

【0065】

ＲＰＥ細胞「成熟」は、本明細書中では、成熟ＲＰＥ細胞を生成するようにＲＰＥ発達経路をモジュレートするプロセスを指す。例えば、繊毛機能の調整は、ＲＰＥ成熟をもたらし得る。

【0066】

本明細書中で使用される「治療有効量」は、疾患または状態の処置のために被験体に投与される場合に、このような処置を達成するために十分な化合物の量を指す。

【0067】

「インデューサー」は、本明細書中では、遺伝子発現を制御する（例えば、細胞内の遺伝子を活性化する）分子と定義される。インデューサーは、抑制因子または活性化因子に結合し得る。インデューサーは、抑制因子を無効化することによって機能する。
ＩＩ．多能性幹細胞
Ａ．胚性幹細胞

【0068】

ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊から誘導され、高いインビトロ分化能力を有する。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外側栄養外胚葉層を取り出し、次いで、非成長細胞のフィーダー層上で内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｍａｓｓ ｃｅｌｌｓ）を培養することによって単離され得る。再播種された細胞は増殖し続け、ＥＳ細胞の新たなコロニーを生成し得、これを取り出し、解離し、再播種し、成長させ得る。未分化ＥＳ細胞を「継代培養」するこのプロセスを多数回反復して、未分化ＥＳ細胞を含有する細胞株を産生し得る（米国特許第５，８４３，７８０号；米国特許第６，２００，８０６号；米国特許第７，０２９，９１３号）。ＥＳ細胞は、それらの多能性を維持しながら増殖する潜在力を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞に関する、および細胞分化を制御する遺伝子に関する研究において有用である。遺伝子操作および選択と組み合わせたＥＳ細胞の多能性は、トランスジェニックマウス、キメラマウスおよびノックアウトマウスの作製によって、インビボにおける遺伝子分析研究に使用され得る。

【0069】

マウスＥＳ細胞を作製するための方法は、周知である。１つの方法では、１２９系統のマウス由来の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、ウシ胎仔血清を含む培地中の、化学的に不活化したマウス胎仔線維芽細胞のフィーダー細胞層上で内部細胞塊を培養する。発生する未分化なＥＳ細胞のコロニーは、ウシ胎仔血清の存在下のマウス胎仔線維芽細胞のフィーダー層上で継代培養されることにより、ＥＳ細胞の集団が生成される。いくつかの方法では、マウスＥＳ細胞は、サイトカインである白血病抑制因子（ＬＩＦ）を血清含有培養培地に加えることによって、フィーダー層の非存在下において成長し得る（Ｓｍｉｔｈ，２０００）。他の方法では、マウスＥＳ細胞は、骨形態形成タンパク質およびＬＩＦの存在下の無血清培地中で成長し得る（Ｙｉｎｇら、２００３）。

【0070】

ヒトＥＳ細胞は、精子と卵細胞との融合、核移植、発病機序によって産生される接合体もしくは胚盤胞期哺乳動物胚から、または以前に記載されている方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００）によってクロマチンを再プログラミングし、続いて再プログラミングしたクロマチンを原形質膜に取り込ませて胚性細胞を産生させることから産生または誘導され得る。１つの方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に曝露し、栄養外胚葉細胞を溶解し、マウス胎仔線維芽細胞のフィーダー層上で培養した内部細胞塊から取り出す。さらに、内部細胞塊に由来する細胞集塊を化学的または機械的に解離し、再播種し、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットによって選択し、解離し、再播種する（米国特許第６，８３３，２６９号）。いくつかの方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞成長因子の存在下において、線維芽細胞のフィーダー層上でＥＳ細胞を培養することによって、血清なしで成長し得る（Ａｍｉｔら、２０００）。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、それらの細胞を、塩基性線維芽細胞成長因子を含む「馴化」培地の存在下においてタンパク質マトリックス（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ^ＴＭまたはラミニン）上で培養することによって、フィーダー細胞層なしで成長し得る（Ｘｕら、２００１）。

【0071】

ＥＳ細胞はまた、以前に記載されている方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ，ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５；Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｏｄｏｒｉｃｏ，２０００）によってアカゲザルおよびマーモセットを含む他の生物から、ならびに樹立されたマウス細胞株およびヒト細胞株から誘導され得る。例えば、樹立されたヒトＥＳ細胞株としては、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４およびＡＣＴ３０が挙げられる。さらなる例として、樹立されたマウスＥＳ細胞株としては、マウス系統１２９胚の内部細胞塊から樹立されたＣＧＲ８細胞株が挙げられ、ＣＧＲ８細胞の培養物は、フィーダー層を用いずにＬＩＦの存在下で成長され得る。

【0072】

ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ−１、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ−３、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２またはＲＥＸ１を含むタンパク質マーカーによって検出され得る。
Ｂ．人工多能性幹細胞

【0073】

多能性の誘導は、当初は２００６年にマウス細胞（Ｙａｍａｎａｋａら、２００６）を使用して、および２００７年にヒト細胞（Ｙｕら、２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７）を使用して、多能性に関連する転写因子の導入による体細胞の再プログラミングによって達成された。多能性幹細胞は、未分化状態で維持され得、ほぼあらゆる細胞型に分化することができる。ｉＰＳＣの使用は、ＥＳ細胞の大規模な臨床使用に関連する倫理的および実践的な問題の大部分を回避し、ｉＰＳＣ由来自己移植物を有する患者は、移植片拒絶を予防するために生涯にわたる免疫抑制処置が不要であり得る。

【0074】

生殖細胞を除いて、任意の細胞がｉＰＳＣの出発点として使用され得る。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝臓細胞または胃細胞であり得る。Ｔ細胞はまた、再プログラミングのための体細胞の供給源として使用され得る（米国特許第８，７４１，６４８号）。細胞分化の程度、または細胞が収集される動物の年齢に制限はない；未分化前駆細胞（体性幹細胞を含む）および最終分化成熟細胞さえも、本明細書中に開示される方法において体細胞の供給源として使用され得る。１つの実施形態において、体細胞はそれ自体が、ヒトＲＰＥ細胞などのＲＰＥ細胞である。ＲＰＥ細胞は、成体または胎児のＲＰＥ細胞であり得る。ｉＰＳＣは、ヒトＥＳ細胞を特定の細胞型に分化させることが公知の条件下で成長され得、ＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１を含むヒトＥＳ細胞マーカーを発現する。

【0075】

体細胞は、当業者に公知の方法を使用して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生するために再プログラミングされ得る。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に産生し得る。例えば、米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号、米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号；米国特許出願公開第２０１２０２７６６３６号；米国特許第８，０５８，０６５号；米国特許第８，１２９，１８７号；米国特許第８，２７８，６２０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０６９６６６号および米国特許第８，２６８，６２０号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。一般に、核再プログラミング因子は、体細胞から多能性幹細胞を産生するために使用される。いくつかの実施形態において、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８の少なくとも３つまたは少なくとも４つが利用される。他の実施形態において、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４が利用される。

【0076】

細胞は、核再プログラミング物質（これは一般に、体細胞からｉＰＳＣを誘導することができる１つまたはそれを超える因子である）またはこれらの物質をコードする核酸（ベクターに組み込まれた形態を含む）で処理される。核再プログラミング物質は、一般に、少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２、またはこれらの分子をコードする核酸を含む。ｐ５３の機能阻害剤、Ｌ−ｍｙｃ、またはＬ−ｍｙｃをコードする核酸、およびＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂ、またはＬｉｎ２８もしくはＬｉｎ２８ｂをコードする核酸は、さらなる核再プログラミング物質として利用され得る。Ｎａｎｏｇもまた、核再プログラミングのために利用され得る。公開されている米国特許出願第２０１２０１９６３６０号に開示されるように、ｉＰＳＣの生産のための例示的な再プログラミング因子として、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２はＳｏｘｌ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘｌ５、Ｓｏｘｌ７またはＳｏｘｌ８で置き換え可能である；Ｋｌｆ４はＫｌｆｌ、Ｋｌｆ２またはＫｌｆ５で置き換え可能である）；（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）；（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６ Ｅ６；（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７（５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８；（８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ；（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ−Ｍｙｃ（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能である）；（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２；（１３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶＩ ６ Ｅ６；（１５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（１８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（２１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ；または（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能である）が挙げられる。非限定的な一例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃが利用される。他の実施形態において、Ｏｃｔ４、ＮａｎｏｇおよびＳｏｘ２が利用される。例えば、米国特許第７，６８２，８２８号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。これらの因子としては、限定されないが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＳｏｘ２が挙げられる。他の例では、因子としては、限定されないが、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４およびＭｙｃが挙げられる。いくつかの非限定的な例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−ＭｙｃおよびＳｏｘ２が利用される。他の非限定的な例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＳａｌ４が利用される。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４またはｃ−Ｍｙｃのような因子は再プログラミング効率を増加させ得、いくつかの異なる発現ベクターから発現され得る。例えば、ＥＢＶエレメントベースの系などの組込型ベクターが使用され得る（米国特許第８，５４６，１４０号）。さらなる態様において、再プログラミングタンパク質は、タンパク質形質導入によって体細胞に直接導入され得る。再プログラミングは、細胞と、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）受容体阻害剤またはシグナル伝達阻害剤、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤またはそれらの組み合わせを含む１つまたはそれを超えるシグナル伝達受容体とを接触させることをさらに含み得る。これらの制御因子は、小分子、阻害性ヌクレオチド、発現カセットまたはタンパク質因子を含み得る。事実上あらゆるｉＰＳ細胞または細胞株が使用され得ると予想される。

【0077】

これらの核再プログラミング物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０６９６６６号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）において言及されているＮＣＢＩアクセッション番号を参照して利用可能である。１つまたはそれを超える再プログラミング物質またはこれらの再プログラミング物質をコードする核酸を導入するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１９６３６０号および米国特許第８，０７１，３６９号（これらは両方とも、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されている。

【0078】

誘導されたら、ｉＰＳＣは、多能性を維持するために十分な培地中で培養され得る。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号および米国特許公開第２００３／０２１１６０３号に記載されている、多能性幹細胞、より具体的には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地および技術とともに使用され得る。マウス細胞の場合、培養は、分化抑制因子として白血病阻害因子（ＬＩＦ）を通常の培地に添加することによって行われる。ヒト細胞の場合、ＬＩＦに代えて、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。当業者に公知であるように、ｉＰＳＣの培養および維持のための他の方法が使用され得る。

【0079】

ある特定の実施形態において、定義されていない条件が使用され得る；例えば、幹細胞を未分化状態に維持するために、多能性細胞は、線維芽細胞フィーダー細胞上で、または線維芽細胞フィーダー細胞に曝露された培地上で培養され得る。いくつかの実施形態において、細胞は、フィーダー細胞として、放射線または抗生物質で処理して細胞分裂を終了させたマウス胎仔線維芽細胞の共存下で培養される。あるいは、多能性細胞は、定義されたフィーダー非依存性培養系、例えばＴＥＳＲ（商標）培地（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｂ）またはＥ８（商標）培地（Ｃｈｅｎら、２０１１）を使用して培養され、本質的に未分化状態に維持され得る。

【0080】

いくつかの実施形態において、ｉＰＳＣは、外来性核酸を発現するように（例えば、プロモーターおよび第１のマーカーをコードする核酸配列に作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｙ ｌｉｎｋｅｄ）チロシナーゼエンハンサーを含むように）改変され得る。チロシナーゼ遺伝子は、例えば、２０１３年１月１日において利用可能であるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号２２１７３に開示されている。この配列は、Ｃ５７ＢＬ／６系統マウスの７番染色体の位置５２８６９７１−５２９１６９１（逆配向）に整列している。４７２１塩基対の配列は、ＲＰＥ細胞における発現に十分である。Ｍｕｒｉｓｉｅｒら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３０３：８３８−８４７，２００７（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。この構築物は、網膜色素上皮細胞において発現される。他のエンハンサーも利用され得る。他のＲＰＥ特異的エンハンサーとしては、Ｄ−ＭＩＴＦ、ＤＣＴ、ＴＹＲＰ１、ＲＰＥ６５、ＶＭＤ２、ＭＥＲＴＫ、ＭＹＲＩＰおよびＲＡＢ２７Ａが挙げられる。適切なプロモーターとしては、限定されないが、網膜色素上皮細胞において発現される任意のプロモーター（チロシナーゼプロモーターを含む）が挙げられる。構築物はまた、他のエレメント、例えば翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）および転写／翻訳ターミネーターを含み得る。一般に、構築物で細胞をトランスフェクトすることが有利である。安定トランスフェクションのための適切なベクターとしては、限定されないが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびセンダイウイルスが挙げられる。

【0081】

プラスミドは、いくつかの目標、例えば、制御された高コピー数の達成、および細菌におけるプラスミドの不安定性の潜在的原因の回避、およびヒト細胞を含む哺乳動物細胞における使用に適合するプラスミドを選択するための手段の提供を念頭において設計されている。ヒト細胞において使用するためのプラスミドの二要件に対して、特に注意が払われてきた。第１に、大量のＤＮＡを産生および精製し得るように、それらは、大腸菌における維持および発酵に適切である。第２に、それらは安全であり、ヒト患者および動物における使用に適切である。第１の要件は、細菌発酵のために選択可能であり、細菌発酵中に比較的容易に安定に維持可能な高コピー数のプラスミドを要求する。第２の要件は、選択マーカーおよび他のコード配列などのエレメントに対する注意を要求する。いくつかの実施形態において、マーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数の複製起点、（２）選択マーカー（例えば、限定されないが、カナマイシンによる抗生物質選択のためのｎｅｏ遺伝子）、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、および（４）様々な核酸カセットを組み込むためのマルチクローニング部位；および（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するための当技術分野で公知の多数のプラスミドベクターがある。これらとしては、限定されないが、米国特許第６，１０３，４７０号；米国特許第７，５９８，３６４号；米国特許第７，９８９，４２５号；および米国特許第６，４１６，９９８号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されているベクターが挙げられる。

【0082】

ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡベースまたはＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。

【0083】

マーカーとしては、限定されないが、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼまたはホタル／ウミシイタケルシフェラーゼまたはｎａｎｏｌｕｃ）または他のタンパク質が挙げられる。マーカーは、タンパク質（分泌タンパク質、細胞表面タンパク質または内部タンパク質を含む；細胞によって合成されるかまたは取り込まれる）；核酸（例えば、ｍＲＮＡまたは酵素的に活性な核酸分子）または多糖であり得る。抗体、レクチン、プローブまたは核酸増幅反応によって検出可能な任意のこのような細胞成分であって、目的の細胞型のマーカーに特異的な細胞成分の決定因子が含まれる。マーカーはまた、生化学的アッセイもしくは酵素アッセイ、または遺伝子産物の機能に依存する生物学的応答によって同定され得る。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに作動可能に連結され得る。加えて、ＲＰＥ分化またはＲＰＥ機能または生理機能または病態について幹細胞に影響を及ぼし得る遺伝子などの他の遺伝子が含まれ得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＭＩＴＦ、ＰＡＸ６、ＴＦＥＣ、ＯＴＸ２、ＬＨＸ２、ＶＭＤ２、ＣＦＴＲ、ＲＰＥ６５、ＭＦＲＰ、ＣＴＲＰ５、ＣＦＨ、Ｃ３、Ｃ２Ｂ、ＡＰＯＥ、ＡＰＯＢ、ｍＴＯＲ、ＦＯＸＯ、ＡＭＰＫ、ＳＩＲＴ１−６、ＨＴＲＰ１、ＡＢＣＡ４、ＴＩＭＰ３、ＶＥＧＦＡ、ＣＦＩ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＡＰＰ、ＣＤ４６、ＢＡＣＥ１、ＥＬＯＬＶ４、ＡＤＡＭ１０、ＣＤ５５、ＣＤ５９およびＡＲＭＳ２のうちの１つまたはそれよりも多くをコードする核酸が含まれる。
１．ＭＨＣハプロタイプ一致

【0084】

主要組織適合性複合体は、同種器官移植物の免疫拒絶の主な原因である。３つの主要クラスＩ ＭＨＣハプロタイプ（Ａ、ＢおよびＣ）および３つの主要ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰおよびＤＱ）がある。ＨＬＡ遺伝子座は高度に多型性であり、６番染色体上に４Ｍｂにわたって分布している。この領域は、自己免疫疾患および感染性疾患に関連し、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡハプロタイプの適合性は、移植の臨床転帰に影響を与え得るので、この領域内のＨＬＡ遺伝子をハプロタイピングする能力は臨床的に重要である。Ｔリンパ球に対して、ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは細胞の内側からペプチドを提示し、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは細胞の外側から抗原を提示する。移植片と宿主との間のＭＨＣハプロタイプの不適合性は、移植片に対する免疫応答をトリガーし、その拒絶をもたらす。したがって、拒絶を予防するために、患者は、免疫抑制剤で処置され得る。ＨＬＡ一致幹細胞株は、免疫拒絶のリスクを克服し得る。

【0085】

移植におけるＨＬＡの重要性から、好ましいドナー−レシピエントペアを同定するために、ＨＬＡ遺伝子座は、通常、血清学およびＰＣＲによって分類される。ＨＬＡクラスＩおよびＩＩ抗原の血清学的検出は、精製Ｔリンパ球またはＢリンパ球を用いた補体媒介性リンパ球傷害性試験を使用して達成され得る。この手順は、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ遺伝子座のマッチングのために主に使用される。分子ベースの組織タイピングは、多くの場合、血清学的試験よりも正確であり得る。一連のオリゴヌクレオチドプローブに対してＰＣＲ産物を試験する低分解能分子法、例えばＳＳＯＰ（配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）法は、ＨＬＡ抗原を同定するために使用され得、現在、これらの方法は、クラスＩＩ−ＨＬＡタイピングに使用される最も一般的な方法である。ＰＣＲ増幅用の対立遺伝子特異的プライマーを利用する高分解能技術、例えばＳＳＰ（配列特異的プライマー）法は、特異的ＭＨＣ対立遺伝子を同定し得る。

【0086】

ドナー細胞がＨＬＡホモ接合性である（すなわち、各抗原提示タンパク質について同一の対立遺伝子を含有する）場合、ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣ適合性は有意に増加する。ほとんどの個体は、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ遺伝子についてヘテロ接合性であるが、特定の個体は、これらの遺伝子についてホモ接合性である。これらのホモ接合性個体はスーパードナーとして機能し得、彼らの細胞から作製された移植片は、そのハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかであるすべての個体に移植され得る。さらに、ホモ接合性ドナー細胞が、集団において高頻度で見られるハプロタイプを有する場合、これらの細胞は、多数の個体で移植療法に適用され得る。

【0087】

したがって、ｉＰＳＣは、処置すべき被験体、または患者のものと同じもしくは実質的に同じＨＬＡ型を有する別の被験体の体細胞から産生され得る。ある場合では、ドナーの主要ＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３つの主な遺伝子座）は、レシピエントの主要ＨＬＡと同一である。いくつかの場合では、体細胞ドナーは、スーパードナーであり得る；したがって、ＭＨＣホモ接合スーパードナーに由来するｉＰＳＣは、ＲＰＥ細胞を作製するために使用され得る。したがって、スーパードナーに由来するｉＰＳＣは、そのハプロタイプについてホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかである被験体に移植され得る。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂなどの２つのＨＬＡ対立遺伝子においてホモ接合性であり得る。このように、スーパードナーから産生されるｉＰＳＣは、本明細書中に開示される方法において、多数の潜在的レシピエントに潜在的に「マッチ」し得るＲＰＥ細胞を産生するために使用され得る。
２．エピソームベクター

【0088】

ある特定の態様において、再プログラミング因子は、１つまたはそれを超える外因性エピソーム性遺伝子エレメントに含まれる発現カセットから発現される（米国特許公開第２０１０／０００３７５７号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと）。したがって、ｉＰＳＣは、レトロウイルスベクターエレメントまたはレンチウイルスベクターエレメントなどの外因性遺伝子エレメントを本質的に含み得ない。これらのｉＰＳＣは、染色体外複製ベクター（すなわち、エピソームベクター）（これは、エピソームとして複製することができるベクターである）を使用して外来性ベクターまたはウイルスエレメントを本質的に含まないｉＰＳＣを作製することによって調製される（参照により本明細書中に組み込まれる米国特許第８，５４６，１４０号を参照のこと；Ｙｕら、２００９）。いくつかのＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、サル空胞化ウイルス４０（ＳＶ４０）もしくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、または出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドは、哺乳動物細胞において、染色体外的にまたはエピソームとして複製する。これらのエピソームプラスミドは、組込型ベクターに関連するすべてのこれらの欠点（Ｂｏｄｅら、２００１）を本質的に伴わない。例えば、上記で定義されるリンパ球指向性ヘルペスウイルスベース（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、染色体外的に複製し、体細胞への再プログラミング遺伝子の送達を支援し得る。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１またはそれらの変異体もしくは機能的同等物である。エピソームベクターのさらなる利点は、細胞への導入後に、外因性エレメントが時間とともに消失し、これらのエレメントを本質的に含まない自己持続性ｉＰＳＣをもたらすことである。

【0089】

他の染色体外ベクターとしては、他のリンパ球向性ヘルペスウイルスベースのベクターが挙げられる。リンパ球向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えば、ヒトＢリンパ芽球）において複製し、その天然の生活環の一部の間、プラスミドになる、ヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ球向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ球向性ヘルペスウイルスとしては、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；リスザルヘルペスウイルス（ＨＳ）およびマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。エピソームベースのベクターの他の供給源も企図される（例えば、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０またはＢＰＶ）。
Ｃ．体細胞核移植

【0090】

多能性幹細胞は、体細胞核移植によって調製され得る。体細胞核移植は、ドナー核の紡錘体を含まない卵母細胞への移行を伴う。１つの方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞からのドナー線維芽細胞核を、電気融合によって、紡錘体を含まない成熟中期ＩＩのアカゲザル卵母細胞（ｏｏｃｔｙｅ）の細胞質に導入する（Ｂｙｒｎｅら、２００７）。融合された卵母細胞は、イオノマイシンへの曝露によって活性化され、次いで、胚盤胞期までインキュベートされる。次いで、選択された胚盤胞の内部細胞塊を培養することにより、胚性幹細胞株が得られる。その胚性幹細胞株は、正常なＥＳ細胞の形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、インビトロとインビボの両方において複数の細胞型に分化する。
ＩＩＩ．網膜色素上皮細胞

【0091】

ＲＰＥ細胞は、本明細書中に開示される方法において産生される。光に直接感受性である網膜の細胞は、視細胞である。光受容体は、網膜の外側部分の光感受性ニューロンであり、桿体または錐体のいずれかであり得る。光伝達（ｐｈｏｔｏｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）のプロセスでは、視細胞は、レンズによって集束された入射光エネルギーを電気シグナルに変換し、次いで、それを、視神経を介して脳に送る。脊椎動物は、錐体および桿体を含む２種類の視細胞を有する。錐体は、詳細な中心視および色視を検出するように適合されており、明るい光で十分に機能する。桿体は、周辺視および暗所視を担う。桿体および錐体からの神経シグナルは、網膜の他のニューロンによる処理を受ける。

【0092】

網膜色素上皮は、血流と網膜との間の障壁として作用し、視覚機能の維持において光受容体と密接に相互作用する。網膜色素上皮は、網膜に到達する光エネルギーを吸収するメラニンの顆粒が密集する六角細胞の単一層から構成される。特殊化したＲＰＥ細胞の主な機能としては、血液から光受容体へのグルコース、レチノールおよび脂肪酸などの栄養素の輸送；網膜下腔から血液への水、代謝最終産物およびイオンの輸送；光の吸収および光酸化に対する保護；１１−シス−レチナールへのオール−トランス−レチノールの再異性化；脱落した光受容体膜のファゴサイトーシス；ならびに網膜の構造的完全性のための様々な必須因子の分泌が挙げられる。

【0093】

網膜色素上皮は、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、ＲＰＥ６５、ベスト卵黄様黄斑ジストロフィー遺伝子（ＶＭＤ２）および色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）などのマーカーを発現する。網膜色素上皮の機能不全は、網膜色素上皮剥離、形成異常、萎縮、網膜症、網膜色素変性、黄斑ジストロフィーまたは変性などの多くの視力変化状態に関連する。

【0094】

網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、それらの色素沈着、上皮形態および頂端−基底極性に基づいて特性評価され得る。分化ＲＰＥ細胞は、それらの敷石状形態および色素の初期外観によって視覚的に認識され得る。加えて、分化ＲＰＥ細胞は、単層全体にわたって経上皮抵抗性／ＴＥＲおよび経上皮電位／ＴＥＰを有し（ＴＥＲ＞１００ｏｈｍｓ．ｃｍ２；ＴＥＰ＞２ｍＶ）、頂端側から基底側に流体およびＣＯ_２を輸送し、サイトカインの極性分泌を制御する。

【0095】

ＲＰＥ細胞は、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリーおよび酵素結合免疫測定（ＥＬＩＳＡ）などの方法論の使用による検出のためのマーカーとして機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。例えば、ＲＰＥ特異的マーカーとしては、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質（ＣＲＡＬＢＰ）、小眼症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ−１）、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）、プレメラノソームタンパク質（ＰＭＥＬ１７）、ベストロフィン１（ＢＥＳＴ１）およびｃ−ｍｅｒ癌原遺伝子チロシンキナーゼ（ＭＥＲＴＫ）が挙げられ得る。ＲＰＥ細胞は、胚性幹細胞マーカーＯｃｔ−４、ｎａｎｏｇまたはＲｅｘ−２を（いかなる検出可能なレベルでも）発現しない。具体的には、これらの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した場合、ＥＳ細胞またはｉＰＳＣ細胞におけるよりもＲＰＥ細胞において約１００〜１０００倍低い。

【0096】

ＲＰＥ細胞マーカーは、例えば、公的に利用可能な配列データ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標））を使用した標準的な増幅方法において配列特異的プライマーを使用して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット分析またはドットブロットハイブリダイゼーション分析によって、ｍＲＮＡレベルで検出され得る。タンパク質またはｍＲＮＡレベルで検出した場合の組織特異的マーカーの発現は、そのレベルが、未分化多能性幹細胞または他の無関係な細胞型などの対照細胞のものよりも少なくともまたは約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍または９倍、より具体的には１０倍超、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍またはそれを超える場合に陽性とみなされる。

【0097】

ＲＰＥ細胞の機能不全、傷害および喪失は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、遺伝性黄斑変性（ベスト疾患を含む）および網膜色素変性を含む多くの眼疾患および眼障害の要因である。このような疾患の可能な処置は、このような処置を必要とする者の網膜へのＲＰＥ細胞の移植である。それらの移植によるＲＰＥ細胞の補充は、劣化を遅延、停止または逆転させ、網膜機能を改善し、このような状態から生じる失明を予防し得ると推測される。しかしながら、ヒトドナーおよび胚からＲＰＥ細胞を直接得ることは困難である。
Ａ．ＰＳＣの胚様体からのＲＰＥ細胞の誘導

【0098】

周知の再プログラミング因子を使用して再プログラミングされたｉＰＳＣは、ＲＰＥ細胞を含むニューロン系統の眼細胞を生じさせ得る（Ｈｉｒａｍｉら、２００９）。ＰＣＴ公開第２０１４／１２１０７７号（これは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）には、ｉＰＳＣから産生された胚様体（ＥＢ）を懸濁培養においてＷｎｔおよびＮｏｄａｌアンタゴニストによって処理して、網膜前駆細胞のマーカーの発現を誘導する方法が開示されている。この公報には、ＲＰＥ細胞高富化培養物へのｉＰＳＣのＥＢの分化プロセスによって、ｉＰＳＣからＲＰＥ細胞を誘導する方法が開示されている。例えば、ｒｈｏ関連コイルドコイルキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を添加することによって、ｉＰＳＣから胚様体を産生し、２つのＷＮＴ経路阻害剤およびＮｏｄａｌ経路阻害剤を含む第１の培地中で培養する。さらに、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含まない第２の培地であって、Ｎｏｄａｌ経路阻害剤を含み、約２０ｎｇ〜約９０ｎｇのノギンを含み、約１〜約５％のｋｎｏｃｋ ｏｕｔ血清代替品を含む第２の培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）コーティング組織培養物上にＥＢをプレーティングして、分化ＲＰＥ細胞を形成する。アクチビンおよびＷＮＴ３ａを含む第３の培地中で、分化ＲＰＥ細胞を培養する。次いで、約５％の胎仔血清、カノニカルＷＮＴ阻害剤、非カノニカルＷＮＴ阻害剤ならびにソニックヘッジホッグおよびＦＧＦ経路の阻害剤を含むＲＰＥ培地中でＲＰＥ細胞を培養して、ヒトＲＰＥ細胞を産生する。

【0099】

分化細胞型の産生のためにＥＢを使用することにはいくつかの欠点がある。例えば、効率が変動するので、ＥＢの産生は、一貫しない再現性のないプロセスである。ｉＰＳＣまたはＥＳ細胞から産生されるＥＢのサイズおよび形状は均一ではなく、ＥＢＳの産生も律速な遠心分離処理を伴う。本開示は、臨床用途、研究用途または治療用途に必要なｉＰＳＣまたはＥＳ由来細胞の大規模産生を可能にする方法であって、ＥＢ非依存性の方法を提供する。
Ｂ．実質的に単一細胞ＰＳＣからのＲＰＥ細胞の誘導

【0100】

いくつかの実施形態において、ヒトｉＰＳＣなどの多能性幹細胞（ＰＳＣ）の本質的に単一細胞懸濁物からＲＰＥ細胞を産生するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、いかなる細胞凝集も防止するために、ＰＳＣは、プレコンフルエントまで培養される。ある特定の態様において、ＰＳＣは、ＴＲＹＰＳＩＮ（商標）またはＴＲＹＰＬＥ（商標）などによって例示される細胞解離酵素とともにインキュベートすることによって解離される。ＰＳＣはまた、ピペッティングによって本質的に単一細胞懸濁物に解離され得る。加えて、細胞が培養容器に接着していない間に、ブレビスタチン（例えば、約２．５μＭ）を培地に添加して、単一細胞への解離後のＰＳＣ生存を増加させ得る。あるいは、単一細胞への解離後のＰＳＣ生存を増加させるために、ブレビスタチンに代えてＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。

【0101】

単一細胞ＰＳＣからＲＰＥ細胞を効率的に分化させるために、正確なカウントの注入密度は、ＲＰＥ分化効率を増加させ得る。したがって、ＰＳＣの単一細胞懸濁物は、一般に、播種前にカウントされる。例えば、ＰＳＣの単一細胞懸濁物は、血球計または自動細胞カウンター、例えばＶＩＣＥＬＬ（登録商標）またはＴＣ２０によってカウントされる。細胞は、約１０，０００〜約５００，０００個の細胞／ｍＬ、約５０，０００〜約２００，０００個の細胞／ｍＬまたは約７５，０００〜約１５０，０００個の細胞／ｍＬの細胞密度に希釈され得る。非限定的な例では、ＰＳＣの単一細胞懸濁物は、十分に定義された培養培地、例えばＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地で約１００，０００個の細胞／ｍＬの密度に希釈される。

【0102】

ＰＳＣの単一細胞懸濁物が既知の細胞密度で得られたら、細胞は、一般に、適切な培養容器、例えば組織培養プレート、例えばフラスコ、６ウェルプレート、２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートに播種される。細胞（複数可）を培養するために使用される培養容器は、その中で幹細胞を培養することができる限り、フラスコ、組織培養のためのフラスコ、皿、ペトリ皿、組織培養のための皿、マルチ皿、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグおよびローラーボトルを含むことができるが、それらに特に限定されない。細胞を、培養の必要性に応じて、少なくとももしくは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌまたはその中の導き出せる任意の範囲の容量で培養することができる。ある特定の実施形態において、培養容器はバイオリアクターであってよく、これは、細胞が増殖できるような生物学的に活性な環境を支持するエクスビボの任意のデバイスまたは系を指し得る。バイオリアクターは、少なくとも、もしくは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートルまたはその中の導き出せる任意の範囲の容量を有し得る。

【0103】

ある特定の態様において、ｉＰＳＣなどのＰＳＣは、効率的な分化に適切な細胞密度でプレーティングされる。一般に、細胞は、約１，０００〜約７５，０００個の細胞／ｃｍ^２、例えば、約５，０００〜約４０，０００個の細胞／ｃｍ^２の細胞密度でプレーティングされる。６ウェルプレートでは、細胞は、ウェル当たり約５０，０００〜約４００，０００細胞の細胞密度で播種され得る。例示的な方法では、細胞は、ウェル当たり約１００，０００、約１５０，００、約２００，０００、約２５０，０００、約３００，０００または約３５０，０００個の細胞、例えば、ウェル当たり約２００，００個の細胞の細胞密度で播種される。

【0104】

細胞生存性を維持しながら細胞接着を促進するために、ｉＰＳＣなどのＰＳＣは、一般に、１つまたはそれを超える細胞接着タンパク質によってコーティングされた培養プレート上で培養される。例えば、好ましい細胞接着タンパク質としては、多能性細胞の成長のための固体支持体を提供する手段として培養物表面をコーティングするために使用され得る細胞外マトリックスタンパク質、例えばビトロネクチン、ラミニン、コラーゲンおよび／またはフィブロネクチンが挙げられる。用語「細胞外マトリックス」は、当技術分野で認識されている。その成分としては、以下のタンパク質：フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、リンクタンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンデュリン、エピリグリンおよびカリンの１つまたはそれよりも多くが挙げられる。例示的な方法では、ＰＳＣは、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンでコーティングされた培養プレート上で成長される。いくつかの実施形態において、細胞接着タンパク質は、ヒトタンパク質である。

【0105】

細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質は天然起源のものであり得、ヒトもしくは動物組織から精製され得るか、またはあるいはＥＣＭタンパク質は、遺伝子操作組換えタンパク質もしくは本質的に合成物であり得る。ＥＣＭタンパク質は、全タンパク質もしくはペプチド断片の形態、ネイティブなものまたは操作されたものであり得る。細胞培養のためのマトリックスにおいて有用であり得るＥＣＭタンパク質の例としては、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチンおよびビトロネクチンが挙げられる。いくつかの実施形態において、マトリックス組成物は、フィブロネクチンまたは組換えフィブロネクチンの合成的に生成されたペプチド断片を含む。いくつかの実施形態において、マトリックス組成物は、ゼノフリーである。例えば、ヒト細胞を培養するためのゼノフリーマトリックスでは、いかなる非ヒト動物成分も除外され得るヒト起源のマトリックス成分が使用され得る。

【0106】

いくつかの態様において、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬであり得る。いくつかの好ましい実施形態において、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬである。より好ましい実施形態において、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約５μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬである。

【0107】

ＲＰＥ細胞またはＰＳＣなどの細胞は、各特定の細胞集団の成長を支援するために必要な栄養素とともに培養され得る。一般に、細胞は、炭素源、窒素源およびｐＨを維持するためのバッファを含む成長培地中で培養される。培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン（複数可）、成長因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤および無機塩を含有し得る。幹細胞成長を増強するために、例示的な成長培地は、非必須アミノ酸およびビタミンなどの様々な栄養素を補充した最小必須培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地を含有する。最小必須培地の例としては、限定されないが、最小必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、１９９培地およびＦ１２培地が挙げられる。加えて、最小必須培地は、ウマ血清、子牛血清またはウシ胎仔血清などの添加物が補充され得る。あるいは、培地は、無血清であり得る。他の場合では、成長培地は、培養液中の幹細胞などの未分化細胞を成長および維持するために最適化された無血清調合物と本明細書中で称される「ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品」を含有し得る。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替品は、例えば、米国特許出願第２００２／００７６７４７号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）に開示されている。好ましくは、ＰＳＣは、十分に定義されたフィーダーフリー培地中で培養される。

【0108】

したがって、プレーティング後に、単一細胞ＰＳＣは、一般に、十分に定義された培養培地で培養される。ある特定の態様において、播種の約１８〜２４時間後に培地を吸引し、Ｅ８（商標）培地などの新鮮培地を培養物に添加する。ある特定の態様において、プレーティング後に、単一細胞ＰＳＣは、十分に定義された培養培地中で約１日間、２日間または３日間培養される。好ましくは、分化プロセスでの進行前に、単一細胞ＰＳＣは、十分に定義された培養培地中で約２日間培養される。

【0109】

いくつかの実施形態において、培地は、血清の代替物を含有してもよいし、または含有しなくてもよい。血清の代替物としては、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、アルブミン代用物、例えば組換えアルブミン、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロール（３’−ｔｈｉｏｌｇｉｙｃｅｒｏｌ）またはそれの同等物を適切に含有する材料が挙げられ得る。血清の代替物は、例えば、国際公開第ＷＯ９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製され得る。あるいは、より利便性のために、任意の市販の材料が使用され得る。市販の材料としては、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替品（ＫＳＲ）、化学的に定義された脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）およびＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。

【0110】

他の培養条件を適宜定義することができる。例えば、培養温度は約３０〜４０℃、例えば、少なくともまたは約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であってよいが、特にそれらに限定されない。一つの実施形態において、細胞は３７℃で培養される。ＣＯ_２濃度は約１〜１０％、例えば、約２〜５％、またはその中の導き出せる任意の範囲であってよい。酸素張力は少なくとも、最大で、もしくは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％またはその中の導き出せる任意の範囲であってよい。
ａ．分化培地
網膜誘導培地

【0111】

単一細胞ＰＳＣを培養プレートに接着させた後、好ましくは、網膜誘導培地中で細胞を培養して、網膜系細胞への分化プロセスを開始させる。網膜誘導培地（ＲＩＭ）はＷＮＴ経路阻害剤を含み、網膜系細胞へのＰＳＣの分化をもたらし得る。ＲＩＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＢＭＰ経路阻害剤をさらに含む。１つの例示的なＲＩＭ培地は、表３に示されている。

【0112】

ＲＩＭは、約１：１の比でＤＭＥＭおよびＦ１２を含み得る。例示的な方法では、ＲＩＭに、ＣＫＩ−７などのＷＮＴ経路阻害剤を含め、ＬＤＮ１９３１８９などのＢＭＰ経路阻害剤を含め、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ経路阻害剤を含める。例えば、ＲＩＭは、約５ｎＭ〜約５０ｎＭ、例えば約１０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、約０．１μＭ〜約５μＭ、例えば約０．５μＭのＣＫＩ−７および約０．５μＭ〜約１０μＭ、例えば約１μＭのＳＢ４３１５４２を含む。加えて、ＲＩＭは、ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品、例えば約１％〜約５％ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメント、アスコルビン酸およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含み得る。好ましくは、ＩＧＦ１はアニマルフリーＩＧＦ１（ＡＦ−ＩＧＦ１）であり、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約１０ｎｇ／ｍＬ、例えば約１ｎｇ／ｍＬをＲＩＭに含める。例えば、培地を毎日吸引し、新鮮ＲＩＭに交換する。一般に、ＲＩＭ中で細胞を約１〜約５日間、例えば約１日間、２日間、３日間、４日間または５日間、例えば約２日間培養して、網膜系細胞を産生させる。
網膜分化培地

【0113】

次いで、さらなる分化のために、網膜分化培地（ＲＤＭ）中で網膜系細胞を培養し得る。ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびＭＥＫ阻害剤を含む。１つの実施形態において、ＲＤＭは、ＣＫＩ−７などのＷＮＴ経路阻害剤、ＬＤＮ１９３１８９などのＢＭＰ経路阻害剤、ＳＢ４３１５４２などのＴＧＦβ経路阻害剤およびＰＤ０３２５９０１などのＭＥＫ阻害剤を含む。あるいは、ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびｂＦＧＦ阻害剤を含み得る。一般に、ＲＤＭ中では、Ｗｎｔ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＩＭと比較して、例えば、約９〜約１１倍高く、例えば約１０倍高い。例示的な方法では、ＲＤＭは、約５０ｎＭ〜約２００ｎＭ、例えば約１００ｎＭのＬＤＮ１９３１８９、約１μＭ〜約１０μＭ、例えば約５μＭのＣＫＩ−７、約１μＭ〜約５０μＭ、例えば約１０μＭのＳＢ４３１５４２および約０．１μＭ〜約１０μＭ、例えば約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭまたは９μＭのＰＤ０３２５９０１を含む。１つの例示的なＲＤＭ培地は、表３に示されている。

【0114】

一般に、ＲＤＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品（例えば、約１％〜約５％、例えば約１．５％）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメント、アスコルビン酸およびＩＧＦ１（例えば、約１ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ）を含む。特定の方法では、前日から培地を吸引した後に、新鮮ＲＤＭを細胞に毎日与える。一般に、ＲＤＭ中で細胞を約２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間または１６日間、例えば約７日間培養して、分化網膜細胞を誘導する。
網膜培地

【0115】

次に、網膜培地（ＲＭ）中で分化網膜細胞を培養することによって、該細胞をさらに分化させ得る。網膜培地はアクチビンＡを含み、ニコチンアミドをさらに含み得る。ＲＭは、約５０〜約２００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、例えば約１０ｍＭのニコチンアミドを含み得る。あるいは、ＲＭは、他のＴＧＦ−β経路活性化因子、例えばＧＤＦ１および／またはＷＮＴ経路活性化因子、例えばＷＡＹ−３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ−２１６７６３、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）または２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジンを含み得る。あるいは、ＲＭは、ＷＮＴ３ａをさらに含み得る。１つの例示的なＲＭ培地は、表３に示されている。

【0116】

ＲＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、約１％〜約５％、例えば約１．５％のｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含み得る。培地を室温ＲＭで毎日交換し得る。一般に、ＲＭ中で細胞を約８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間または１７日間、例えば約１０日間培養して、分化ＲＰＥ細胞を誘導する。
ＲＰＥ成熟培地

【0117】

ＲＰＥ細胞のさらなる分化のために、好ましくは、ＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ−ＭＭ）中で細胞を培養する。例示的なＲＰＥ−ＭＭ培地は、表３に示されている。ＲＰＥ成熟培地は、約１００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、例えば約２５０μｇ／ｍＬのタウリン、約１０μｇ／Ｌ〜約３０μｇ／Ｌ、例えば約２０μｇ／Ｌのヒドロコルチゾンおよび約０．００１μｇ／Ｌ〜約０．１μｇ／Ｌ、例えば約０．０１３μｇ／Ｌのトリヨードチロニンを含み得る。加えて、ＲＰＥ−ＭＭは、ＭＥＭアルファ、Ｎ−２サプリメント、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）およびピルビン酸ナトリウム、ならびにウシ胎仔血清（例えば、約０．５％〜約１０％、例えば約１％〜約５％）を含み得る。培地を室温ＲＰＥ−ＭＭで隔日に交換し得る。一般に、ＲＰＥ−ＭＭ中で細胞を約５〜約１０日間、例えば約５日間培養する。次いで、細胞解離酵素などを用いて細胞を解離し、再播種し、ＲＰＥ細胞へのさらなる分化のためにさらなる期間、例えばさらに約５〜約３０日間、例えば約１５〜２０日間培養し得る。さらなる実施形態において、ＲＰＥ−ＭＭは、ＷＮＴ経路阻害剤を含まない。この段階で、ＲＰＥ細胞を凍結保存し得る。
ｂ．ＲＰＥ細胞の成熟

【0118】

次いで、成熟のために継続的な期間、ＲＰＥ−ＭＭ中でＲＰＥ細胞を培養し得る。いくつかの実施形態において、６ウェル、１２ウェル、２４ウェルなどのウェルまたは１０ｃｍプレート中で、ＲＰＥ細胞を成長させる。ＲＰＥ培地中でＲＰＥ細胞を約４〜約１０週間、例えば約６〜８週間、例えば６週間、７週間または８週間維持し得る。ＲＰＥ細胞の継続的成熟のための例示的な方法では、ＴＲＹＰＬＥ（商標）などの細胞解離酵素で細胞を解離し、ＰＤ０３２５９０１などのＭＥＫ阻害剤を含むＲＰＥ−ＭＭ中、特殊化したＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）デザインにおけるなどの分解性足場アセンブリ上に約１〜２週間再播種し得る。あるいは、ＲＰＥ−ＭＭは、ＭＥＫ阻害剤に代えてｂＦＧＦ阻害剤を含み得る。分解性足場上でＲＰＥ細胞を培養するための方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／１２１０７７号（これは、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に教示および記載されている。簡潔に言えば、前記方法の主な要素は、ＣＯＲＮＩＮＧ（登録商標）ＣＯＳＴＡＲ（登録商標）ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）プレート、生体不活性０−リングおよび生分解性足場である。ＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）プレートは、生分解性足場のための構造およびプラットフォームを提供する。頂端側および基底側を作り出す微多孔膜は、支持体を足場に提供するだけではなく、細胞の分極層の異なる面（ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｉｄｅｓ）を分離するために理想的である。膜を脱着させるためのＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）インサートの能力は、インサートの支持リングを足場のためのアンカーとして使用することを可能にする。得られた分化した、分極した、およびコンフルエントの機能的ＲＰＥ細胞の単層を、この段階で（例えば、ゼノフリーＣＳ１０培地中に）凍結保存し得る。

【0119】

いくつかの実施形態において、成熟ＲＰＥ細胞を機能的ＲＰＥ細胞単層（これは、ＲＰＥ成熟を促進するさらなる化学物質または小分子を含むＲＰＥ−ＭＭ中で継続培養することによって、インタクトなＲＰＥ組織として機能する）にさらに発達させ得る。例えば、これらの小分子は、一次繊毛インデューサー、例えばプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）またはアフィジコリンである。ＰＧＥ２を約２５μＭ〜約２５０μＭ、例えば約５０μＭ〜約１００μＭの濃度で培地に添加し得る。あるいは、ＲＰＥ−ＭＭは、カノニカルＷＮＴ経路阻害剤を含み得る。例示的なカノニカルＷＮＴ経路阻害剤は、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）または４−（１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル）−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド（ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１）である。この培地中で細胞をさらなる期間、例えばさらに約１週間〜約５週間、例えばさらに約２〜４週間培養して、成熟機能的ＲＰＥ細胞単層を得ることができる。したがって、本開示の方法は、臨床用途のために大規模で一貫して再産生され得る多能性細胞の単一細胞懸濁物由来の成熟ＲＰＥ細胞を提供する。
ｃ．ＲＰＥ細胞の凍結保存

【0120】

本明細書中に開示される方法によって産生される網膜色素上皮細胞は、凍結保存され得る。例えば、ＰＣＴ公開第２０１２／１４９４８４Ａ２号（これは、参照により本明細書中に組み込まれる）を参照のこと。細胞は、基材を用いてまたは基材を用いずに凍結保存され得る。いくつかの実施形態において、貯蔵温度は、約−５０℃〜約−６０℃、約−６０℃〜約−７０℃、約−７０℃〜約−８０℃、約−８０℃〜約−９０℃、約−９０℃〜約−１００℃およびその重複範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、より低い温度が、凍結保存細胞の貯蔵（例えば、維持）のために使用される。複数の実施形態において、液体窒素（または他の類似の冷却剤）が、細胞を貯蔵するために使用される。さらなる実施形態において、細胞は、約６時間超貯蔵される。さらなる実施形態において、細胞は、約７２時間貯蔵される。複数の実施形態において、細胞は、４８時間〜約１週間貯蔵される。さらに他の実施形態において、細胞は、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間または８週間貯蔵される。さらなる実施形態において、細胞は、１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、７カ月間、８カ月間、９カ月間、１０カ月間、１１カ月間または１２カ月間貯蔵される。細胞はまた、より長時間貯蔵され得る。細胞は別々に、または本明細書中に開示される基材のいずれかなどの基材上で凍結保存され得る。

【0121】

いくつかの実施形態において、さらなる抗凍結剤が使用され得る。例えば、細胞は、１つまたはそれを超える抗凍結剤、例えばＤＭ８０、血清アルブミン、例えばヒトまたはウシの血清アルブミンを含む凍結保存溶液中で凍結保存され得る。ある特定の実施形態において、溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％・、約８％、約９％、または約１０％のＤＭＳＯを含む。別の実施形態において、溶液は、約１％〜約３％、約２％〜約４％、約３％〜約５％、約４％〜約６％、約５％〜約７％、約６％〜約８％、約７％〜約９％、または約８％〜約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはアルブミンを含む。特定の実施形態において、溶液は、２．５％ＤＭＳＯを含む。別の特定の実施形態において、溶液は、１０％ＤＭＳＯを含む。

【0122】

細胞は、凍結保存中に、例えば約１℃／分で冷却され得る。いくつかの実施形態において、凍結保存温度は、約−８０℃〜約−１８０℃または約−１２５℃〜約−１４０℃である。いくつかの実施形態において、細胞は、約１℃／分で冷却される前に、４℃に冷却される。凍結保存細胞は、使用のための解凍前に、液体窒素の気相に移され得る。いくつかの実施形態において、例えば、細胞が約−８０℃に達したら、それらは液体窒素貯蔵区域に移される。凍結保存はまた、速度調節冷凍庫を使用して行われ得る。凍結保存細胞は、例えば、約２５℃〜約４０℃の温度、典型的には約３７℃の温度で解凍され得る。
ｄ．阻害剤
ＷＮＴ経路阻害剤

【0123】

ＷＮＴは、細胞間相互作用を制御してショウジョウバエセグメント極性遺伝子ｗｉｎｇｌｅｓｓに関連する高度に保存された分泌シグナル伝達分子のファミリーである。ヒトでは、ＷＮＴファミリーの遺伝子は、３８〜４３ｋＤａのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。ＷＮＴタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されたアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら、Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ８：１３４９−１３５８（１９９７）を参照のこと）および２２個の保存されたシステイン残基を有する。細胞質β−カテニンの安定化を促進する能力により、ＷＮＴタンパク質は転写活性化因子として作用し、アポトーシスを阻害し得る。特定のＷＮＴタンパク質の過剰発現は、特定のがんに関連することが示されている。

【0124】

本明細書中のＷＮＴ阻害剤は、一般的にＷＮＴ阻害剤を指す。したがって、ＷＮＴ阻害剤は、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１１およびＷｎｔ１６を含むＷＮＴファミリータンパク質のメンバーの任意の阻害剤を指す。本方法のある特定の実施形態は、分化培地中のＷＮＴ阻害剤に関する。当技術分野ですでに公知の好適なＷＮＴ阻害剤の例として、Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミドジヒドロクロリド（ＣＫＩ−７）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ２）、Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−３−（２−メトキシフェニル）−４−オキソチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］−アセトアミド（ＩＷＰ４）、２−フェノキシ安息香酸−［（５−メチル−２−フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ７４６５４）２，４−ジアミノ−キナゾリン、ケルセチン、３，５，７，８−テトラヒドロ−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−チオピラノ［４，３−ｄ］ピリミジン−４−オン（ＸＡＶ９３９）、２，５−ジクロロ−Ｎ−（２−メチル−４−ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ５３５）、Ｎ−［４−［２−エチル−４−（３−メチルフェニル）−５−チアゾリル］−２−ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ７１５）、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ１）および分泌型Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質（ＳＦＲＰ１）１が挙げられる。加えて、ＷＮＴ阻害剤としては、ＷＮＴに対する抗体、ＷＮＴのドミナントネガティブバリアント、ならびにＷＮＴの発現を抑制するｓｉＲＮＡおよびアンチセンス核酸が挙げられ得る。ＷＮＴの阻害はまた、ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）を使用して達成され得る。
ＢＭＰ経路阻害剤

【0125】

骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する多機能性成長因子である。ＢＭＰは、体中の構造を組織化する一群の重要な形態形成シグナルを構成すると考えられる。生理学におけるＢＭＰシグナルの重要な機能は、病的プロセスにおける制御不能なＢＭＰシグナル伝達に関する多数の役割によって強調される。

【0126】

ＢＭＰ経路阻害剤は、一般にＢＭＰシグナル伝達の阻害剤、またはＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０もしくはＢＭＰ１５に特異的な阻害剤を含み得る。例示的なＢＭＰ阻害剤としては、４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンヒドロクロリド（ＬＤＮ１９３１８９）、６−［４−［２−（１−ピペリジニル）エトキシ］フェニル］−３−（４−ピリジニル）−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンジヒドロクロリド（ドルソモルフィン）、４−［６−［４−（１−メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］−キノリン（ＤＭＨ１）、４−［６−［４−［２−（４−モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＤＭＨ−２）および５−［６−（４−メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノリン（ＭＬ３４７）が挙げられる。
ＴＧＦβ経路阻害剤

【0127】

トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）は、ほとんどの細胞において増殖、細胞分化および他の機能を調節する分泌タンパク質である。それは、免疫、がん、気管支喘息、肺線維症、心疾患、糖尿病および多発性硬化症において役割を果たす一種のサイトカインである。ＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３と称される少なくとも３つのアイソフォームで存在する。ＴＧＦ−βファミリーは、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形態形成タンパク質、デカペンタプレジックおよびＶｇ−１を含むトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーとして公知のタンパク質のスーパーファミリーの一部である。

【0128】

ＴＧＦβ経路阻害剤は、一般にＴＧＦβシグナル伝達の任意の阻害剤を含み得る。例えば、ＴＧＦβ経路阻害剤は、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）、６−［２−（１，１−ジメチルエチル）−５−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］キノキサリン（ＳＢ５２５３３４）、２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−２−イエリ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ−５０５１２４）、４−（５−ベンゾール［１，３］ジオキソール−５−イル−４−ピリジン−２−イル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−ベンズアミド水和物、４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド水和物、左右決定因子（Ｌｅｆｔｙ）、３−（６−メチル−２−ピリジニル）−Ｎ−フェニル−４−（４−キノリニル）−１Ｈ−ピラゾール−１−カルボチオアミド（Ａ８３−０１）、４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド（Ｄ４４７６）、４−［４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−２−ピリジニル］−Ｎ−（テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−４−イル）−ベンズアミド（ＧＷ７８８３８８）、４−［３−（２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−キノリン（ＬＹ３６４８４７）、４−［２−フルオロ−５−［３−（６−メチル−２−ピリジニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］フェニル］−１Ｈ−ピラゾール−１−エタノール（Ｒ２６８７１２）または２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）である。
ＭＥＫ阻害剤

【0129】

ＭＥＫ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１またはＭＥＫ２を阻害する化学物質または薬物である。それらは、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を及ぼすために使用され得る。例えば、ＭＥＫ阻害剤として、Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨードフェニル）アミノ］−ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ−［３−［３−シクロプロピル−５−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６，８−ジメチル−２，４，７−トリオキソピリド［４，３−ｄ］ピリミジン−１−イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６−（４−ブロモ−２−フルオロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ−［３，４−ジフルオロ−２−（２−フルオロ−４−ヨードアニリノ）−６−メトキシフェニル］−１−（２，３−ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン−１−スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）および６−（４−ブロモ−２−クロロアニリノ）−７−フルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシエトキシ）−３−メチルベンゾイミダゾール−５−カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）が挙げられる。
ｂＦＧＦ阻害剤

【0130】

塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、ＦＧＦ２またはＦＧＦ−βとしても公知である）は、線維芽細胞成長因子ファミリーのメンバーである。ｂＦＧＦは、基底膜中に、および血管の内皮下細胞外マトリックス中に存在する。加えて、ｂＦＧＦは、細胞が未分化状態であり続けるために必要なヒトＥＳＣ培養培地の一般的な成分である。

【0131】

本明細書中のｂＦＧＦ阻害剤は、一般にｂＦＧＦ阻害剤を指す。例えば、ｂＦＧＦ阻害剤としては、限定されないが、Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）尿素（ＰＤ１７３０７４）、２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン（ＰＤ９８０５９）、１−ｔｅｒｔ−ブチル−３−［６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］尿素（ＰＤ１６１５７０）、６−（２，６−ジクロロフェニル）−２−［［４−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］フェニル］アミノ］−８−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン二塩酸塩水和物（ＰＤ１６６２８５）、Ｎ−［２−アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ’−（１，１−ジメチルエチル）−尿素（ＰＤ１６６８６６）およびＭＫ−２２０６が挙げられる。
ＩＶ．網膜色素上皮細胞の使用

【0132】

ある特定の態様は、多くの重要な研究、開発および商業目的のために使用され得るＲＰＥまたはＲＰＥ富化細胞集団を産生する方法を提供する。

【0133】

いくつかの態様において、本明細書に開示の方法は、少なくともまたは約９０％（例えば、少なくともまたは約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはその中の導き出せる任意の範囲）のＲＰＥ細胞を含む少なくともまたは約１０^６、１０^７、１０^８、５ｘ１０^８、１０^９、１０^１０個の細胞（またはその中の導き出せる任意の範囲）の細胞集団をもたらす。

【0134】

ある特定の態様において、本方法のための開始細胞は、少なくともまたは約１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３個の細胞またはその中の導き出せる任意の範囲の使用を含み得る。開始細胞は、少なくともまたは約１０、１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８個の細胞／ｍｌ、またはその中の導き出せる任意の範囲の播種密度を有し得る。

【0135】

本明細書中に開示される方法によって産生されるＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞について当技術分野で現在公知の任意の方法および用途において使用され得る。例えば、化合物を評価する方法であって、ＲＰＥ細胞に対する化合物の薬理学的特性または毒物学的特性をアッセイすることを含む方法が提供され得る。ＲＰＥ細胞に対する効果について化合物を評価する方法であって、ａ）本明細書中で提供されるＲＰＥ細胞と該化合物とを接触させること；およびｂ）該ＲＰＥ細胞に対する該化合物の効果をアッセイすることを含む方法も提供され得る。
Ａ．試験化合物のスクリーニング

【0136】

ＲＰＥ細胞は、このような細胞およびそれらの様々な子孫の特徴に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、小分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）または環境条件（例えば、培養条件または操作）をスクリーニングするために商業的に使用され得る。例えば、試験化合物は、化学的な化合物、小分子、ポリペプチド、成長因子、サイトカインまたは他の生物学的薬剤であり得る。

【0137】

１つの実施形態において、方法は、ＲＰＥ細胞と試験薬剤とを接触させること、前記試験薬剤が集団内のＲＰＥ細胞の活性または機能をモジュレートするかを決定することを含む。いくつかの用途では、スクリーニングアッセイは、ＲＰＥ細胞の増殖をモジュレートするか、またはＲＰＥ細胞の分化を変化させる薬剤の同定のために使用される。スクリーニングアッセイは、インビトロまたはインビボで実施され得る。眼用薬剤またはＲＰＥ薬剤をスクリーニングおよび同定する方法としては、ハイスループットスクリーニングに適切なものが挙げられる。例えば、潜在的治療分子の同定のために、ＲＰＥ細胞は、任意選択で規定の位置において、培養皿、フラスコ、ローラーボトルまたはプレート（例えば、シングルマルチウェルディッシュまたはディッシュ、例えば８、１６、３２、６４、９６、３８４および１５３６マルチウェルプレートまたはディッシュ）上に位置決めまたは置くことができる。スクリーニングされ得るライブラリーとしては、例えば、小分子ライブラリー、ｓｉＲＮＡライブラリーおよびアデノウイルストランスフェクションベクターライブラリーが挙げられ得る。

【0138】

他のスクリーニング用途は、網膜組織の維持または修復に対する効果についての医薬化合物の試験に関する。化合物は、細胞に対して薬理学的効果を有するように設計されるので、または他の場所で効果を有するように設計された化合物は、この組織型の細胞に対して意図しない副作用を有し得るので、スクリーニングが行われ得る。
Ｂ．治療および移植

【0139】

他の実施形態はまた、眼組織の維持ならびに修復を必要とする任意の状態（網膜変性または重大な傷害を含む）に対する修復を強化するためのＲＰＥ細胞の使用を提供し得る。

【0140】

治療薬投与のための細胞組成物の適切性を決定するために、最初に、細胞は、適切な動物モデルにおいて試験され得る。１つの態様において、ＲＰＥ細胞は、インビボで生存してそれらの表現型を維持するそれらの能力について評価される。細胞組成物は、免疫不全動物（例えば、ヌードマウスまたは化学的にもしくは放射線照射によって免疫不全にされた動物）に投与される。一定期間の成長後に組織を採取し、多能性幹細胞由来細胞が依然として存在するかについて評価する。

【0141】

ＲＰＥ細胞組成物の適切性を試験するために、いくつかの動物が利用可能である。例えば、英国外科医師会（ＲＣＳ）ラットは、網膜ジストロフィーの周知のモデルである（Ｌｕｎｄら、２００６）。加えて、ＲＰＥ細胞の適切性および生存は、ＮＯＧマウスなどの免疫不全動物においてマトリゲル移植（例えば、皮下または網膜下）によって決定され得る（Ｋａｎｅｍｕｒａら、２０１４）。

【0142】

本明細書中に記載されるヒトＲＰＥ細胞またはこれらの細胞を含む医薬組成物は、状態の処置を必要とする患者における状態を処置するための医薬の製造に使用され得る。ＲＰＥ細胞は、予め凍結保存され得る。ある特定の態様において、開示されるＲＰＥ細胞はｉＰＳＣに由来するので、「個別化医療」を眼疾患患者に提供するために使用され得る。いくつかの実施形態において、患者から得られた体細胞は、疾患を引き起こす変異を修正するように遺伝子操作され、ＲＰＥに分化し、ＲＰＥ組織を形成するように操作され得る。このＲＰＥ組織は、同じ患者の内因性変性ＲＰＥを交換するために使用され得る。あるいは、健常ドナーから、またはＨＬＡホモ接合性「スーパードナー」から作製されたｉＰＳＣが使用され得る。インビボで抗炎症および免疫抑制環境を生じさせるために、ＲＰＥ細胞は、特定の因子、例えば色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）−βおよび／またはレチノイン酸によってインビトロで処理され得る。

【0143】

様々な眼状態が、本明細書中に開示される方法を使用して得られるＲＰＥ細胞の導入によって処置または予防され得る。状態としては、網膜機能不全もしくは網膜劣化、網膜傷害および／または網膜色素上皮の喪失に一般に関連する網膜疾患または網膜障害が挙げられる。処置され得る状態としては、限定されないが、網膜の変性疾患、例えばシュタルガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性、黄斑変性（例えば、加齢黄斑変性）、緑内障および糖尿病性網膜症が挙げられる。さらなる状態としては、レーバー先天性黒内障、遺伝性または後天性黄斑変性、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮、コロイデレミア、パターンジストロフィー、ＲＰＥの他のジストロフィー、ならびに光傷害、レーザー傷害、炎症性傷害、感染性傷害、放射線傷害、新生血管傷害または外傷性傷害のいずれか１つによって引き起こされる損傷に起因するＲＰＥおよび網膜損傷が挙げられる。ある特定の実施形態において、網膜変性を特徴とする状態を処置または予防するための方法であって、ＲＰＥ細胞を含む有効量の組成物を、網膜変性を特徴とする状態の処置または予防を必要とする被験体に投与することを含む方法が提供される。これらの方法は、これらの状態の１つまたはそれよりも多くを有する被験体を選択すること、ならびに該状態を処置し、および／または該状態の症候を改善するために十分な治療有効量のＲＰＥ細胞を投与することを含み得る。ＲＰＥ細胞は、様々なフォーマットで移植され得る。例えば、ＲＰＥ細胞は、細胞懸濁物の形態で標的部位に導入され得るか、またはマトリックス、細胞外マトリックスもしくは基材、例えば生分解性ポリマー上に単層として接着され得るか、またはその組み合わせであり得る。ＲＰＥ細胞はまた、光受容体などを有する他の網膜細胞とともに移植（共移植）され得る。いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、処置すべき被験体由来のｉＰＳＣから産生されるので、自己性である。他の実施形態において、ＲＰＥ細胞は、ＭＨＣ一致ドナーから産生される。

【0144】

いくつかの実施形態において、ＲＰＥ細胞は、再生医療を受けるために適切な被験体に対する自己ＲＰＥ移植のために使用され得る。ＲＰＥ細胞は、光受容体を有するなどの他の網膜細胞と組み合わせて移植され得る。開示される方法によって産生されるＲＰＥ細胞の移植は、当技術分野で公知の様々な技術によって実施され得る。例えば、ＲＰＥ移植を実施するために方法は、米国特許第５，９６２，０２７号および米国特許第６，０４５，７９１号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されている。１つの実施形態によれば、移植は、経毛様体扁平部硝子体切除術（ｐａｒｓ ｐａｎａ ｖｉｔｒｅｃｔｏｍｙ）を行い、続いて細胞を、網膜小開口部を介して網膜下腔に送達するか、または直接注射することによって行う。ＲＰＥ細胞は、細胞懸濁物の形態で標的部位に導入され得るか、マトリックス、例えば細胞外マトリックス上に接着され得るか、または生分解性ポリマーなどの基材上に提供され得る。ＲＰＥ細胞はまた、光受容体を有する網膜細胞などの他の細胞とともに移植され得る（共移植）。したがって、本明細書中に開示される方法によって得られるＲＰＥ細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、これらのＲＰＥ細胞は、プロモーターおよびマーカーをコードする核酸に作動可能に連結されたチロシナーゼエンハンサーを含む。他の実施形態において、ＲＰＥ細胞はまた、第２のマーカーをコードする核酸に作動可能に連結された第２の構成的プロモーターを含む。

【0145】

ＲＰＥ細胞の医薬組成物は、本明細書中に開示される方法によって産生される。これらの組成物は、少なくとも約１ｘ１０^３個のＲＰＥ細胞、約１ｘ１０^４個のＲＰＥ細胞、約１ｘ１０^５個のＲＰＥ細胞、約１ｘ１０^６個のＲＰＥ細胞、約１ｘ１０^７個のＲＰＥ細胞、約１ｘ１０^８個のＲＰＥ細胞、または約１ｘ１０^９個のＲＰＥ細胞を含み得る。ある特定の実施形態において、組成物は、本明細書中に開示される方法によって産生される分化ＲＰＥ細胞を含む（非ＲＰＥ細胞に関して）実質的に精製された調製物である。足場、例えばポリマー担体および／または細胞外マトリックスと、本明細書中に開示される方法によって産生される有効量のＲＰＥ細胞とを含む組成物も提供される。例えば、細胞は、細胞の単層として提供される。マトリックス材料は、一般に、生理学的に許容され得るものであり（ｉｆ ｇｅｎｅｒａｌｌｙ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）、インビボ用途において使用するために適切なものである。例えば、生理学的に許容され得る材料としては、限定されないが、吸収性および／または非吸収性の固体マトリックス材料、例えば小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、架橋アルギネートまたは非架橋アルギネート、親水コロイド、発泡体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、フリースおよび生体接着剤が挙げられる。

【0146】

適切なポリマー担体としては、合成ポリマーまたは天然ポリマーおよびポリマー溶液から形成された多孔質メッシュまたはスポンジも挙げられる。例えば、マトリックスは、ポリマーメッシュもしくはスポンジまたはポリマーヒドロゲルである。使用され得る天然ポリマーとしては、タンパク質、例えばコラーゲン、アルブミンおよびフィブリン；ならびに多糖、例えばアルギネートおよびヒアルロン酸のポリマーが挙げられる。合成ポリマーとしては、生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーの両方が挙げられる。例えば、生分解性ポリマーとしては、ヒドロキシ酸のポリマー、例えばポリ乳酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）およびポリ乳酸−グリコール酸（ＰＧＬＡ）、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリホスファゼンおよびそれらの組み合わせが挙げられる。非生分解性ポリマーとしては、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレン酢酸ビニルおよびポリビニルアルコールが挙げられる。

【0147】

可鍛性のイオン的にまたは共有結合的に架橋されたヒドロゲルを形成し得るポリマーが使用され得る。ヒドロゲルは、（天然または合成の）有機ポリマーが、共有結合、イオン結合または水素結合を介して架橋されて三次元開格子構造が作られ、これが水分子を捕捉してゲルを形成した場合に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用され得る材料の例としては、多糖、例えばアルギネート、ポリホスファジンおよびポリアクリレート（これらは、イオン的に架橋される）、またはブロックコポリマー、例えばＰＬＵＲＯＮ１ＣＳ（商標）またはＴＥＴＲＯＮ１ＣＳ（商標）、ポリエチレンオキシド−ポリプロピレングリコールブロックコポリマー（これらは、それぞれ温度またはＨによって架橋される）が挙げられる。他の材料としては、タンパク質、例えばフィブリン、ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ヒアルロン酸およびコラーゲンが挙げられる。

【0148】

医薬組成物は、任意選択で、所望の目的（例えば、網膜組織の疾患または異常を改善するためのＲＰＥ細胞機能の再構成）のための書面による指示とともに適切な容器にパッケージングされ得る。いくつかの実施形態において、開示される方法によって産生されるＲＰＥ細胞を操作してＲＰＥを形成し得、これを使用して、変性ＲＰＥの交換を必要とする被験体の変性ＲＰＥを交換し得る。
Ｃ．商業目的、治療目的および研究目的のための配布

【0149】

いくつかの実施形態において、製造、配布または使用中にいつでも存在するＲＰＥ富化細胞集団を含む細胞のセットまたは組み合わせを含む試薬システムが提供される。細胞セットは、多くの場合に同じゲノムを共有する、未分化多能性幹細胞または他の分化細胞型と組み合わせて、本明細書中に開示される細胞集団の任意の組み合わせを含む。各細胞型は、同じ施設または異なる場所において、同じまたは異なる時点において、取引関係を共有する同じ実体または異なる実体の管理下において、一緒に包装されてもよいし別個の容器内に包装されてもよい。

【0150】

医薬組成物は、任意選択で、所望の目的（例えば、眼組織の疾患または傷害を改善するためのＲＰＥ細胞機能の再構成）のための書面による指示とともに適切な容器にパッケージングされ得る。
Ｖ．キット

【0151】

いくつかの実施形態において、例えば、ＲＰＥ細胞の産生のための１つまたはそれを超える培地および成分を含み得るキットが提供される。試薬システムは、必要に応じて、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージングされ得る。キットの容器手段は、一般に、成分が配置され得る（好ましくは、適切にアリコートされ得る）少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含む。１つを超える成分がキット中にある場合、キットはまた、一般に、さらなる成分が別個に配置され得る第２の、第３のまたはさらなる容器を含有する。しかしながら、成分の様々な組み合わせをバイアルに含め得る。キットの成分は、乾燥粉末（複数可）として提供され得る。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成され得る。溶媒はまた、別の容器手段で提供され得ることが想定される。キットはまた、典型的には、商業的販売のために密封してキット成分（複数可）を含有するための手段を含む。このような容器は、所望のバイアルが保持される注射またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。キットはまた、印刷形式または電子形式、例えばデジタル形式などの使用指示書を含み得る。

【実施例】

【0152】

ＶＩ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含められる。以下の実施例に開示される技法は、本発明の実施において十分に機能すると本発明者らによって発見された技法であり、ゆえに、それを実施するための好ましい形式を構成すると考えられ得ることは、当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に鑑みて、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われ得、その変更によって、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなおも同様または類似の結果を得ることができることを認識するべきである。
実施例１−出発多能性幹細胞集団の調製

【0153】

ＥＳ細胞およびｉＰＳＣなどの多能性幹細胞から、ＲＰＥ細胞の出発集団を誘導することができる。例示的な方法では、米国特許第８，５４６，１４０号、米国特許第８，７４１，６４８号、米国特許第８，６９１，５７４号、米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号、公開された米国特許第８，２７８，１０４号、公開された米国特許第９，００５，９６７号、米国特許第８，０５８，０６５号、米国特許第８，１２９，１８７号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００７／０６９６６６Ａ１号、米国特許第８，１８３，０３８号および米国特許第８，２６８，６２０号（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）などの当技術分野で公知の方法によって、体細胞から再プログラミングしたヒトｉＰＳＣから、ＲＰＥ細胞を誘導した。１つの例示的な方法では、核プログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４を使用して、体細胞から多能性幹細胞を産生した。別の例示的な方法では、核プログラミング因子Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｌ−ＭｙｃおよびＳＶ４０ラージＴ抗原を使用して、体細胞から多能性幹細胞を産生した。

【0154】

ビトロネクチンによってコーティングされたプレート上で、マウスまたはヒトフィーダー層を用いずにＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの十分に定義された培養培地中で、ｉＰＳＣを成長させた。カルシウムまたはマグネシウムを含まないＤＰＢＳでビトロネクチンを１：２００希釈し、培養プレートをビトロネクチンでコーティングし、室温で約１時間インキュベートした。プレコンフルエントになったらｉＰＳＣを分割し、過剰成長させないようにして、非健常細胞および／または分化細胞を防止した（図１Ａ）。

【0155】

ＲＰＥ細胞を誘導するために、ｉＰＳＣを単一細胞懸濁物に解離して、いかなる凝集体または胚様体も除去した。単一細胞懸濁物を得るために、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＴＲＹＰＬＥ（商標）などの細胞解離酵素中、３７℃で約１０分間インキュベートした。次いで、血清学的ピペットを用いてピペッティングすることによって、細胞を剥離させ、細胞懸濁物をコニカルチューブに収集した。穏やかなピペッティングで細胞が剥離しなかった場合には、培養物をより長く、例えばさらに２〜３分間インキュベートした。すべての細胞を収集するために、培養容器を室温Ｅ８（商標）培地で洗浄し、次いで、細胞懸濁物を含有するチューブにその培地を添加した。加えて、細胞が培養容器に接着していない間に、ブレビスタチン（例えば、２．５μＭ）をＥ８（商標）培地に添加して、単一細胞への解離後のＰＳＣ生存を増加させた。細胞を収集するために、それらを４００×ｇで約５分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞を適切な容量のＥ８（商標）培地に再懸濁した。

【0156】

単一細胞ｉＰＳＣからＲＰＥ細胞を効率的に分化させるために、ＶＩＣＥＬＬ（商標）などの自動細胞カウンターによって単一細胞ｉＰＳＣの注入密度を正確にカウントし、室温Ｅ８（商標）培地で約１×１０^５個の細胞／ｍＬの細胞懸濁物に希釈した。ｉＰＳＣの単一細胞懸濁物が既知の細胞密度で得られたら、細胞を適切な培養容器、例えばビトロネクチンでコーティングされた６ウェルプレートに入れた。約２００，０００個の細胞／ウェルの細胞密度で細胞を播種し、３７℃の加湿インキュベーターに入れた。約１８〜２４時間後、培地を吸引し、新鮮Ｅ８（商標）培地を培養物に添加した。播種後、プレートへの適切な接着のために、Ｅ８（商標）培地中で細胞を約２日間培養した。
実施例２−ＲＰＥ細胞へのｉＰＳＣの分化

【0157】

実施例１のように、適切な細胞密度で播種した単一細胞ｉＰＳＣを約２日間培養したら、ＲＰＥ細胞を誘導するための様々な分化培地中でそれらを培養した。３日目に、Ｅ８（商標）培地を吸引し、室温網膜誘導培地（ＲＩＭ）（例えば、表３）を添加した。簡潔に言えば、ＲＩＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含んでいた。加えて、ＲＩＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤およびインスリン成長因子１（ＩＧＦ１）を含んでいた。培地を毎日吸引し、新鮮ＲＩＭを細胞に添加した。ＲＩＭ中で細胞を約２〜４日間培養した。

【0158】

次に、網膜分化培地（ＲＤＭ）中で細胞を約７〜１４日間培養した。簡潔に言えば、ＲＤＭ（表２）は、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含んでいた。加えて、ＲＤＭは、ＷＮＴ経路阻害剤（例えば、ＣＫＩ−７）、ＢＭＰ経路阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）およびＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ３２５９０１）を含んでいた。Ｗｎｔ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤およびＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＤＭでは、ＲＩＭと比較して１０倍高かった。培地を毎日吸引し、室温ＲＤＭを細胞に添加して、分化網膜細胞を産生させた。

【0159】

ＲＰＥ細胞を誘導するために、次いで、網膜培地（ＲＭ）中で細胞を７〜１０日間培養した。ＲＭは、約１：１の比のＤＭＥＭおよびＦ１２、ｋｎｏｃｋｏｕｔ血清代替品、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ−２サプリメント、Ｂ−２７サプリメントおよびアスコルビン酸を含んでいた。加えて、ＲＭは、ニコチンアミドおよびアクチビンＡを含んでいた。培地を室温ＲＭと毎日交換して、ＲＰＥ細胞を得た。

【0160】

ＲＰＥ細胞の成熟のために、ＲＰＥ成熟培地（ＲＰＥ−ＭＭ）中で細胞を５〜１０日間培養した。ＲＰＥ−ＭＭ（表２）は、ＭＥＭアルファ、ウシ胎仔血清、Ｎ−２サプリメント、ＭＥＭ ＮＥＡＡおよびピルビン酸ナトリウムを含んでいた。加えて、ＲＰＥ−ＭＭは、タウリン、ヒドロコルチゾンおよび３，３’，５−トリヨード−Ｌ−チロニンを含有していた（図１Ｃ）。培地を室温ＲＰＥ−ＭＭと隔日で交換した。次いで、細胞解離酵素で細胞を解離し、ビトロネクチンコーティングプレートに再播種した。この段階で、ゼノフリーＣＳ１０培地中で誘導ＰＲＥ細胞を凍結保存することができる。ＲＰＥ成熟を継続するために、プレーティングした細胞をさらに約１５日間培養する。
実施例３−ＲＰＥ細胞の成熟

【0161】

実施例２で産生したＲＰＥ細胞の継続的成熟のために、ＴＲＹＰＬＥ（商標）などの細胞解離酵素で細胞を解離し、ＰＤ０３２５９０１などのＭＥＫ阻害剤を含むＲＰＥ−ＭＭ中、特殊化したＳＮＡＰＷＥＬＬ（商標）デザインの分解性足場アセンブリ上に１〜２週間再播種した。これにより、機能的ＲＰＥ細胞の分化、分極およびコンフルエントの単層を得（図１Ｄ）、この段階で、これをゼノフリーＣＳ１０培地中で凍結保存することができる。

【0162】

ＰＧＥ２またはアフィジコリンのような一次繊毛インデューサーなどのさらなる小分子を含むＲＰＥ−ＭＭ中で継続培養することによって、成熟ＲＰＥ細胞を、インタクトなＲＰＥ組織として機能する機能的ＲＰＥ細胞単層にさらに発達させた。理論に縛られるものではないが、これらの一次繊毛インデューサーは、カノニカルＷＮＴ経路を抑制し、細胞中で細胞周期からの脱出を誘導し、ＲＰＥ単層中で頂端−基底分極を誘導する。あるいは、カノニカルＷＮＴ経路阻害剤、例えばＩＷＰ２およびｅｎｄｏ−ＩＷＲ１（これらもまた、ＲＰＥ細胞中で細胞周期からの脱出を誘導して、ＲＰＥ成熟を促進する）によって、ＲＰＥ成熟を誘導することができる。この培地中で細胞をさらに２〜３週間培養して、機能的成熟ＲＰＥ細胞単層を得た。したがって、開示される本方法は、臨床用途のために大規模で一貫して再産生され得る多能性細胞由来の成熟ＲＰＥ細胞を提供する。
実施例４−ＲＰＥ細胞の凍結保存

【0163】

実施例２の分化ＲＰＥ細胞の凍結保存のために、培地を吸引し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）で細胞を２回洗浄した。次いで、細胞を細胞解離酵素とともにインキュベートし、細胞懸濁物をコニカルチューブにピペッティングした。細胞を遠心分離し、上清を吸引し、細胞を室温ＲＰＥ−ＭＭに再懸濁した。次いで、細胞懸濁物をＳＴＥＲＩＦＬＩＰ（登録商標）セルストレーナーでろ過し、細胞をカウントした。次に、細胞を遠心分離し、適切な密度（例えば、１×１０^７個の細胞／ｍＬ）で冷ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０に再懸濁した。細胞懸濁物をプレラベルクライオバイアルにアリコートし、これを冷凍容器に入れ、−８０℃の冷凍庫に１２〜２４時間移した。次いで、保存のために、バイアルを液体窒素に移した。
実施例５−混入非ＲＰＥ細胞のＭＡＣＳ枯渇ならびにＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０枯渇によるＲＰＥ細胞の出発集団の富化

【0164】

実施例２または３で得られたＲＰＥ細胞の集団は、残存混入非ＲＰＥ細胞および未成熟ＲＰＥ細胞（「混入細胞」と総称される）（これらを両方とも分離および除去して成熟ＲＰＥ富化細胞集団を得ることができる）を有する可能性がある。例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ（登録商標））、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または単一細胞選別などの様々な方法によって、培養物から混入細胞を除去することができる。ＭＡＣＳ（登録商標）法（これは、表面抗原に応じて、様々な細胞集団を分離することが当技術分野で公知である）を使用して、より成熟した所望のＲＰＥ細胞から混入細胞を分離した。

【0165】

ＲＰＥ細胞の出発集団のうちの混入細胞は、所望の成熟ＲＰＥ細胞から混入細胞を分離するために使用され得る特異的細胞表面マーカーを有する。例えば、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０は、（限定されないが）多能性幹細胞および他の神経細胞型上で発現される細胞表面抗原である。ＣＤ２４は、多能性幹細胞、いくつかのＢリンパ球および分化中の神経芽細胞の表面上で発現される糖タンパク質である。ＣＤ５６または神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）は、ニューロンおよびナチュラルキラー細胞の表面上で発現される糖タンパク質である。ＣＤ９０またはＴｈｙ−１は、様々な幹細胞およびニューロンの表面上で発現されるマーカーである。ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０の発現は、ＲＰＥ細胞を含む多くの成熟細胞型への幹細胞の分化中に失われる。したがって、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０について陽性の細胞の除去は、残存混入細胞の枯渇をもたらす。

【0166】

分離技術を実行するために、ＲＰＥ細胞の出発集団を、実施すべき選別（例えば、ＭＡＣＳ）用の単一細胞懸濁物に解離することが望ましい。予め凍結保存された細胞では、細胞を解凍および再播種しなければならない。接着培養物中の細胞から単一細胞懸濁物を得るために、細胞を洗浄し（例えば、ＤＰＢＳ）、細胞解離酵素を添加した（例えば、ＴＲＹＰＬＥ（商標））。細胞を３７℃で約５分間インキュベートした後、容器を穏やかに軽くたたいて、ニューロンクラスタを剥離させた。細胞をＤＰＢＳで２回洗浄し、細胞解離酵素（例えば、ＴＲＹＰＬＥ（商標））を添加した。細胞を３７℃で約３０分間インキュベートした後、細胞懸濁物をＲＰＥ−ＭＭプレーティング培地に収集し、４００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットをＲＰＥ−ＭＭプレーティング培地に再懸濁し、細胞懸濁物をセルストレーナー（例えば、２０μＭステリフリップセルストレーナー）でろ過して、残りのあらゆる細胞クラスタを解離させた。（例えば、ＶｉＣｅｌｌカウンターを使用して）細胞懸濁物を生存細胞についてカウントし、細胞濃度を得た。カウントした細胞懸濁物から、選別またはフローサイトメトリー純度アッセイに使用することができる単一細胞懸濁物を得た。

【0167】

ＲＰＥ細胞の出発集団から混入細胞を除去するために、ＭＡＣＳを使用して、ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞および／またはＣＤ９０陽性細胞を枯渇させた。ＲＰＥ細胞の出発集団由来の細胞を単一細胞懸濁物に解離した後、細胞を、例えば１×１０^７個の細胞／ｍＬでＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＭＡＣＳ緩衝液の例は、表３に含まれている。次に、抗ＣＤ２４抗体、抗ＣＤ５６抗体および／または抗ＣＤ９０抗体（それぞれ１：５００希釈）で細胞を染色し、４℃で２０分間インキュベートして、抗体を細胞上の抗原に結合させた。使用する抗体は、二次抗体に結合する標識（例えば、ＦＩＴＣ）でタグ付けされるべきである。インキュベーション後、２０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を４００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを２０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、激しく混合し、４００×ｇで５分間遠心分離して、未結合の抗体を除去した。細胞ペレットを（例えば、１．１１×１０^８個の細胞／ｍＬで）ＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、希釈（１：１０）二次抗体（例えば、抗ＦＩＴＣ）でコーティングしたマイクロビーズを添加し、細胞を４℃で２０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄して未結合のマイクロビーズを除去し、最大１．２５×１０^８個の細胞を５００μＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。強磁場に置いたＬＤカラムに細胞懸濁物を移し、マイクロビーズに付着した抗原ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０を発現する細胞はカラムに残った。ＬＤカラムをＭＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。抗原ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０を発現しない非標識細胞を流し、収集した。さらなる特性評価および培養のために、収集した非標識細胞懸濁物を（４００×ｇで５分間）遠心分離し、ＲＰＥ−ＭＭプレーティング培地に再播種し、細胞懸濁物のアリコートをフローサイトメトリー純度アッセイに使用した。したがって、ＭＡＣＳ細胞選別により、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０について陽性の細胞が枯渇したＲＰＥ富化細胞集団が得られた。この方法の使用は、実施例２に詳述されている方法から得られた出発集団に限定されず、限定されないが、米国特許出願第１２／５２３，４４４号および米国特許出願第１４／４０５，７３０号に記載されている方法などの他の方法によって産生されたＲＰＥ集団から混入細胞を除去するために用いることができることに留意すべきである。

【表1】

ＲＰＥマーカーについて陽性の細胞の選別前の割合は、実施例２のＲＰＥ細胞の出発集団に存在するものである。ＣＤ２４陽性細胞およびＣＤ５６陽性細胞の組み合わせの枯渇は、ＣＤ２４陽性細胞のみの枯渇よりも高いＲＰＥ細胞富化をもたらした。ＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞およびＣＤ９０陽性細胞の枯渇は、細胞集団において９９％超のＲＰＥ細胞をもたらした。
実施例６−ＲＰＥ富化細胞集団の特性評価のためのフローサイトメトリー純度アッセイ

【0168】

ＭＡＣＳ選別を実施する前および後に、ＢＥＳＴ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＴＹＲＰ１、ＰＭＥＬ１７、ＭＡＰ２、ＮＥＳおよびＭＩＴＦを含む関連マーカーのパネルによるＲＰＥ細胞の特性評価を（例えば、選別前および選別後に）実施した。ＭＡＣＳによるＣＤ２４陽性細胞、ＣＤ５６陽性細胞および／またはＣＤ９０陽性細胞の除去の前後に、フローサイトメトリー純度アッセイを実施して、各マーカーについて陽性の細胞の割合（表１）の測定値を得た（図２および３）。

【0169】

フローサイトメトリー純度アッセイを実施して、本開示の選別方法によって得られたＲＰＥ細胞の割合を決定した。ＭＡＣＳアッセイから収集した細胞懸濁物のアリコート（５ｍＬ ＦＡＣＳチューブ中、１サンプル当たり２×１０^６個の細胞）を４００×ｇで３分間遠心分離した。細胞ペレットを１ｍＬの染色液（例えば、Ｌｉｖｅ−Ｄｅａｄ Ｒｅｄ染色液）に再懸濁し、暗所、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、細胞を４００×ｇで３分間遠心分離して、未結合の染色液を除去した。細胞ペレットを固定緩衝液に再懸濁し、暗所、室温で１５分間インキュベートした。インキュベーション後、２ｍＬの洗浄緩衝液を添加し、細胞を４００×ｇで３分間遠心分離し、上清をデカントした。細胞ペレットを２ｍＬの洗浄緩衝液に再懸濁して懸濁物１ｍＬ当たり１×１０^６個の細胞とし、２００μＬの細胞懸濁物をＦＡＣＳチューブに移した。各チューブに２ｍＬのＰｅｒｍ緩衝液を添加し、細胞を４００×ｇで３分間遠心分離した。ＲＰＥ特異的マーカーに対する一次抗体をＰｅｒｍ緩衝液で希釈し、１００μＬの希釈抗体溶液を各チューブに添加した。暗所、４℃で一晩インキュベートした後、細胞を２ｍＬのＰｅｒｍ緩衝液で２回洗浄した。二次抗体溶液を各チューブに添加し、細胞を暗所、室温で１〜２時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰｅｒｍ緩衝液で２回洗浄し、（４００×ｇで３分間）遠心分離し、フローサイトメトリー分析のために１００μＬの洗浄緩衝液に再懸濁した。米国特許第８，６８２，８１０号およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら、２００６（これらは、参照により本明細書中に組み込まれる）などの当業者に公知の方法によって、フローサイトメトリー分析を実施して、試験した各マーカーについて陽性の細胞の割合を得た（表１）。フローサイトメトリー純度アッセイにより、ＣＤ２４、ＣＤ５６および／またはＣＤ９０について陽性の混入細胞を枯渇させるＭＡＣＳ選別は、ＢＥＳＴ１マーカーによって決定した場合、出発細胞集団（７８．６％）と比較してＲＰＥ細胞富化集団（９５〜９９％）をもたらしたことが示された。
実施例７−ＲＰＥ細胞の分化のための代替方法

【0170】

実施例２および３に記載されている方法に関して、ｉＰＳＣプレーティング後２日目から開始して分化プロセス（ＭＡＣＳ培養後を含む）の終了までの特定の時間枠にわたって、１μＭの濃度のＰＤ０３２５９０１を培地に含めることにより、ＲＰＥ集団の純度（これは、混入細胞の減少を意味する）および得られるＲＰＥ集団の成熟の両方を改善することができる。１μＭ ＰＤ０３２５９０１の含有は、ＲＤＭにおいてだけではなく、本明細書中に記載されるＲＰＥプロセスのＲＰＥ−ＭＭ（約４２〜５０日目）に含めた場合にも、ＲＰＥ集団の純度および成熟の両方を改善したことが示された。
実施例８−ＲＰＥ細胞の分化のための代替方法

【0171】

実施例２および３に記載されている方法に関して、ＲＰＥ−ＭＭおよびＲＰＥ−ＭＭプレーティング培地中のウシ胎仔血清の割合を５％から０．５〜１％に減少させることにより、ＲＰＥ集団の純度（これは、混入細胞の減少を意味する）および得られるＲＰＥ集団の成熟の両方を改善することができる。
実施例９−成熟ＲＰＥ細胞の機能性

【0172】

ＰＧＥ２による処理から産生した成熟ＲＰＥ細胞の分析のために、ＲＰＥ単層の免疫染色を実施して、ｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞のＺＯ１染色および透過電子顕微鏡検査による密着結合の六角構造物（図４Ａ〜４Ｃ）を確認した（図４Ｄ）。染色により、ＰＧＥ２処理ＲＰＥ細胞はβカテニンが減少しており、ＲＰＥ６５が増加していることが示された。加えて、ＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１またはＩＷＰ２による処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１ ｏｒ ＩＷＰ２ ｒｅｓｕｌｔｓ）もまた、βカテニンの減少（図５Ａ）およびＲＰＥ６５の増加（図５Ｃ）をもたらす。ＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１の組み合わせは、ＩＷＰ２単独またはｅｎｄｏ−ＩＷＲ１単独と比較してより有効であることが見出された。したがって、ＰＧＥ２、ＩＷＰ２またはＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１による処理は、成熟ＲＰＥ細胞をもたらす。

【0173】

本発明の方法によって作製したＲＰＥ細胞の関門機能を測定するために、経上皮電位（ＴＥＰ）は、細胞を横切る通過を制御するエネルギー駆動イオンポンプによって生じた単層全体にわたるイオン勾配を測定した。かつ、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）は、主に密着結合構造の微細構造を介して傍細胞空間を通る物質の抵抗を測定する（図７Ａ）。

【0174】

ＩＷＰ２またはｅｎｄｏ−ＩＷＲ１で処理した成熟ＲＰＥ細胞の機能性も特性評価した。未処理ＲＰＥ細胞対ＰＧＥ２またはＩＷＰ２＋ｅｎｄｏ−ＩＷＲ１で処理したＲＰＥ細胞のＴＥＰおよびＴＥＲ測定値は、処理成熟ＲＰＥ細胞の機能性の増加を示している（図７Ｃ〜７Ｅ）。次に、ＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地中のＰＧＥ２の濃度を５０μＭから１００μＭに増加させることにより、ＲＰＥ集団の純度（すなわち、混入細胞の減少）および得られるＲＰＥ集団の成熟の両方が改善されるかを試験した。５０μＭ ＰＧＥ２処理培養物対１００μＭ ＰＧＥ２処理培養物の成熟および機能性を決定するために、経上皮電気抵抗（ＴＥＲ）に関する関門機能を測定して（図７Ｆ）、実施例９で説明されている傍細胞空間を通る物質の抵抗性を比較した。ＲＰＥ−ＭＭ＋ＰＧＥ２培地中、５０μＭまたは１００μＭでｉＰＳＣ由来ＲＰＥ培養物を処理した後に得られた純粋なＲＰＥ細胞の割合を決定するために、ＲＰＥ特異的マーカーについて、実施例６に記載したように、フローサイトメトリー純度アッセイを実施した（図７Ｇ）。その結果、より高濃度の一次繊毛インデューサーＰＧＥ２は、ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ分化のプロセスにおいてＲＰＥ集団の純度および成熟の両方を促進することが示された。
実施例１０−ＲＰＥ分化方法の再現性

【0175】

ＲＰＥ分化プロセスの再現性を試験するために、複数のオペレーターが３つのｉＰＳＣ株をＲＰＥ細胞に分化させた（図６Ａ）。フローサイトメトリーによるＲＰＥマーカーレチンアルデヒド結合タンパク質１（Ｃｒａｐｌｂｐ）の測定によって、得られたＲＰＥ細胞の平均純度を特性評価した（表２）。ＲＰＥ分化プロセスは、異なる出発細胞集団および異なるオペレーター間で高度に再現性があることが見出された。加えて、３Ｄ１、ＡＭＤ１Ｂ、ＢＥＳＴ１Ｌ、ＢＥＳＴ３Ａ、ＢＥＳＴ８Ａ、ＡＭＤ Ｄｏｎｏｒ３ＤおよびＨＬＡ ＬｉｎｅＡを含む異なる出発細胞株からのＲＰＥ分化によって、再現性を確認した（図６Ｂ）。ＨＬＡ ＬｉｎｅＡ（２１５２５．１０２）は、ＨＬＡ−Ａ＊０１およびＨＬＡ−Ｂ＊０８についてホモ接合性のドナーから産生されたｉＰＳＣ株であり、米国人口の１１．３８％との有益なマッチを提供し得る。さらに、ＨＬＡ Ｌｉｎｅ Ｃ（２１５２６．１０１）（これは、米国人口の７．６３％との潜在的に有益なマッチを提供する可能性がある）と称される、ＨＬＡ−Ａ＊０３およびＨＬＡ−Ｂ＊０７についてホモ接合性のドナーから産生されたｉＰＳＣ株を使用するこのプロセスを使用したＲＰＥの産生も成功している。上記ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂにおいてホモ接合性のＨＬＡ ＬｉｎｅＡ（２１５２５．１０２）およびＨＬＡ Ｌｉｎｅ Ｃ（２１５２６．１０１）は、Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．の所有物である。加えて、精製前後のＣｒａｌｂｐ陽性細胞の割合を測定することによって、１３人のドナー由来の２８個のｉＰＳＣ株に対して実施した１０９のＲＰＥ分化において、再現性をさらに確認した（図６Ｃ〜Ｄ）。ＲＰＥ分化後のＣｒａｌｂｐ陽性細胞の割合は変動したが、ＭＡＣＳ精製は一貫して９５％超の純度をもたらし、ほとんどの場合においてほぼ１００％の純度をもたらした。したがって、本ＲＰＥ分化方法は、異なるオペレーターが実施した場合に、ドナー遺伝子型を超えてより一貫した再現性がある結果を提供するので、胚様体からＲＰＥ細胞を産生する任意の方法に対して明確な利点を有する。

【表2】

実施例１１−材料および方法

【0176】

実施例１〜１０で使用した材料は、表３に示されている。

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【表3-4】

【表3-5】

【表3-6】

【表3-7】

【表3-8】

【表3-9】

【表3-10】

【0177】

２０ｍＬのＦＢＳを１０００ｍＬのＤＰＢＳ（すなわち、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）に添加することによって、フローサイトメトリー洗浄緩衝液を調製した。緩衝液はろ過滅菌したものであり、４℃で最大４週間保存することができる。

【0178】

２０ｍＬのＦＢＳを１０００ｍＬのＤＰＢＳ（すなわち、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）に添加することによって、フローサイトメトリーＰｅｒｍ緩衝液を調製した。１グラムのサポニンを添加し、十分に混合した。緩衝液はろ過滅菌したものであり、４℃で最大４週間保存することができる。

【0179】

Ｌｉｖｅ−Ｄｅａｄ染色液をＤＰＢＳ（すなわち、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）で１：１０００希釈することによって、フローサイトメトリーＬｉｖｅ−Ｄｅａｄ Ｒｅｄ染色液を調製した。アッセイする細胞１×１０^６個当たり１ｍＬの染色液を調製した。使用前に、染色液を新たに調製した。

【0180】

１ｍＬの３６．５％ホルムアルデヒドを８．１ｍＬのＤＰＢＳ（すなわち、カルシウムおよびマグネシウムを含まない）に添加することによって、フローサイトメトリー固定緩衝液を調製した。アッセイする細胞１×１０^６個当たり１ｍＬの染色液を調製した。使用前に、緩衝液を新たに調製した。

【0181】

本明細書中に開示される方法および特許請求される方法のすべてが、本開示に鑑みて過度の実験を行うことなく、なされ、実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される方法およびそれらの方法の工程または一連の工程にバリエーションが適用され得ることが当業者には明らかである。より詳細には、化学的かつ生理的に関係するある特定の作用物質が、本明細書中に記載される作用物質の代わりに用いられ得るが、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかなそのような類似の代用物および改変のすべてが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
参照文献
以下の参照文献は、例示的方法の詳細または本明細書に記載のものに補足する他の詳細を提供する範囲で、特に本明細書において参考として援用される。

【数1】

【数2】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4BC】

【図4D】

【図5AB】

【図5CD】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図7G】