特許 6983772 タンパク質のフコシル化及び脱フコシル化形態の作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6983772

(24)【登録日】2021年11月26日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】タンパク質のフコシル化及び脱フコシル化形態の作製方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 21/00 20060101AFI20211206BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211206BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20211206BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211206BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20211206BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20211206BHJP

   C07K 19/00 20060101ALN20211206BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20211206BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20211206BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20211206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20211206BHJP

   C12N 15/10 20060101ALN20211206BHJP

【ＦＩ】

   C12P21/00 ZZNA

   C12N5/10

   C12N1/19

   A61K39/395 N

   !C12P21/08

   !C07K16/00

   !C07K19/00

   !C12N15/13

   !C12N15/62 Z

   !C12N15/113 130Z

   !C12N15/09 110

   !C12N15/09 100

   !C12N15/10 200Z

【請求項の数】21

【全頁数】80

(21)【出願番号】特願2018-522671(P2018-522671)

(86)(22)【出願日】2016年11月1日

(65)【公表番号】特表2019-505164(P2019-505164A)

(43)【公表日】2019年2月28日

(86)【国際出願番号】US2016059922

(87)【国際公開番号】WO2017079165

(87)【国際公開日】20170511

【審査請求日】2019年11月1日

(31)【優先権主張番号】62/249,828

(32)【優先日】2015年11月2日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/338,280

(32)【優先日】2016年5月18日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509012625

【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ミサギ， シャーラム

(72)【発明者】

【氏名】ロウ， ジョン ビー．

(72)【発明者】

【氏名】スネデカー， ブラッドリー アール．

【審査官】 中村 勇介

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１２−５２８５９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０１３０１３（ＷＯ，Ａ２）

【文献】 KANDA Yutaka, et al.，ESTABLISHMENT OF A GDP-MANNOSE 4,6-DEHYDRATASE (GMD) KNOCKOUT HOST CELL LINE: A NEW STRATEGY FOR GENERATING COMPLETELY NON-FUCOSYLATED RECOMBINANT THERAPEUTICS ，JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY，2007年06月19日，VOL:130, NR:3，PAGE(S):300 - 310，http://dx.doi.org/10.1016/j.jbiotec.2007.04.025

【文献】 IMAI-NISHIYA H, et al.，DOUBLE KNOCKDOWN OF α1,6-FUCOSYLTRANSFERASE (FUT8) AND GDP-MANNOSE 4,6-DEHYDRATASE (GMD) IN ANTIBODY-PRODUCING CELLS: A NEW STRATEGY FOR GENERATING FULLY NON-FUCOSYLATED THERAPEUTIC ANTIBODIES WITH ENHANCED ADCC.，BMC BIOTECHNOLOGY，英国，BIOMED CENTRAL LTD，2007年11月30日，VOL:7, NR:84，PAGE(S):1 - 13，http://dx.doi.org/10.1186/1472-6750-7-84

【文献】 LOUIE SALINA, et al.，FX KNOCKOUT CHO HOSTS CAN EXPRESS DESIRED RATIOS OF FUCOSYLATED OR AFUCOSYLATED ANTIBODIES WITH HIGH TITERS AND COMPARABLE PRODUCT QUALITY.，BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，2016年09月26日，VOL:114,NR:3，PAGE(S):632-644，https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/bit.26188

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質の産生方法であって、タンパク質が、所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生され、方法が、
タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含み、
宿主細胞におけるＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）活性が不活性化されており、
宿主細胞が、全てのアレルにおいてＦＸノックアウトを有するＦＸノックアウト宿主細胞であり、かつ
培地が、フコース源を、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量で含む、方法。

【請求項2】

所定の割合が５０：１〜１：５０である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるタンパク質のフコシル化レベルの調整方法であって、方法が、
ａ）宿主細胞を初期培地中で培養することであって、宿主細胞におけるＦＸ活性が不活性化されており、宿主細胞が、全てのアレルにおいてＦＸノックアウトを有するＦＸノックアウト宿主細胞であり、かつ培地がフコース源を含む、培養することと、
ｂ）タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、
ｃ）培地中のフコース源の量を、タンパク質が所定のフコシル化レベルで産生されるように調整することと、を含む、方法。

【請求項4】

フコース源の量を調整することが、フコシル化レベルが低い場合にフコース源の量を増加させること、またはフコシル化レベルが高い場合にフコース源の量を減少させることを含む、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

（ｉ）宿主細胞をフコース源を含む培地中で培養する前に、宿主細胞をフコース源を含まない培地中で培養することを含む、または（ｉｉ）培養ステップの開始時にフコース源が培地中に存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

培養ステップの間の培地中のフコース源の量が、０．０１ｍＭ〜１ｍＭである、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

培養ステップが、３７℃未満で実行される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

タンパク質を細胞培養物から単離することを更に含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

フコース源がフコースである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

フコース源がＧＤＰ−フコースである、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

フコース源がＬ−フコースである、請求項９に記載の方法。

【請求項12】

フコース源が−フコース−１−ホスフェートである、請求項９に記載の方法。

【請求項13】

タンパク質がＦｃ含有タンパク質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

（ｉ）Ｆｃ含有タンパク質が抗体重鎖またはその断片を含む、または（ｉｉ）Ｆｃ含有タンパク質が完全長抗体である、または（ｉｉｉ）Ｆｃ含有タンパク質がＦｃ含有融合タンパク質である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

完全長抗体がモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

Ｆｃ含有融合タンパク質がイムノアドヘシンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

宿主細胞が真核細胞である、かつ／または宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

宿主細胞が、不活性化されていない野生型ＦＸ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、２０％以下のＦＸ活性を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

ＦＸ遺伝子が配列欠失、配列付加、または配列置換によって不活性化される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

ＦＸ遺伝子が、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、またはメガヌクレアーゼ系を使用して不活性化される、請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１１月２日に出願された米国仮特許第６２／２４９，８２８号、及び２０１６年５月１８日出願の米国仮特許出願第６２／３３８，２８０号に対する優先権を主張し、それらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出物の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：１４６３９２０３５３４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１６年１０月２７日、サイズ：２ＫＢ）。

【0003】

本出願は、所定の割合でのタンパク質のフコシル化及び脱フコシル化形態の産生方法に関する。

【背景技術】

【0004】

糖タンパク質は、自然免疫系及び適応免疫系を含む免疫系の全てのアームの適切な機能に必須である。糖タンパク質は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した脅威の認識、結合、シグナル伝達、及び排除に関与する（Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，２００１，２３７０−２３７６、及びＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，１６３，１９９８，５９−７６）。哺乳動物の発現抗体は、それらの重鎖（ＨＣ）のＡｓｎ^２９７残基上に単一のグリカンを保持する。このグリカン構造の存在及び組成が、抗体の受容体結合及びエフェクター機能に影響する（Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，２００１，２３７０−２３７６、及びＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，１６３，１９９８，５９−７６）。例えば、ＩｇＧのＦｃ領域（Ｆｃγ）のグリカン組成における多様性は、Ｆｃ領域及びＦｃ結合受容体（ＦｃγＲ）の結合親和性に異なって影響する。ＦｃγＲには、３つのクラス、即ち、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩが存在する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，１６３，１９９８，５９−７６；Ｒａｖｅｔｃｈ＆Ｂｏｌｌａｎｄ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９，２００１，２７５−２９０）。抗体及びＦｃγ受容体の異なる親和性は、特定の抗原に対する宿主の免疫反応の行く末を決定付け、更に、活性化、阻害、抗体有効性／半減期、耐性、及び自己免疫応答に関与し得る（Ｒａｖｅｔｃｈ＆Ｂｏｌｌａｎｄ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９，２００１，２７５−２９０）。異なる種類の受容体に対する抗体の親和性は、それが保持するグリカンの存在及び組成に応じて変化し得るため、オリゴ糖／タンパク質相互作用が抗体の生物学的機能に有する重要性を強調する（Ｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０，２０００，４７７−４８６；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ，１６３，１９９８，５９−７６）。

【0005】

治療用タンパク質分野の進歩により、無血清培地における組換えタンパク質の発現（Ｗｕｒｍ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，２００４，１３９３−１３９８）及び増え続ける疾患治療用の抗体系治療薬などのタンパク質系治療薬の開発（Ｃａｒｔｅｒ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１７，２０１１，１２６１−１２６９）が可能となる。

【0006】

真核性、例えば、哺乳動物の宿主細胞におけるタンパク質の発現の後、タンパク質は、一般に「グリコシル化」と称される糖残基の酵素付加を含むことが多い翻訳後修飾を受ける。

【0007】

ポリペプチドのグリコシル化は典型的には、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列であるアスパラギン（Ａｓｎ）−Ｘ−セリン（Ｓｅｒ）及びアスパラギン（Ａｓｎ）−Ｘ−トレオニン（Ｔｈｒ）（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖への酵素結合の認識配列である。Ｏ−結合型グリコシル化とは、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、またはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもＯ−結合型グリコシル化に関与し得る。

【0008】

タンパク質のグリコシル化パターンは、Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｐｕｔｎａｍ，Ｆ．Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．４，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８４，特にｐｐ．２７１−３１５において詳述されている。この章では、アスパラギン結合型オリゴ糖（複合体、高マンノース、及びハイブリッド構造と称される少なくとも３つの群へのそれらの細分を含む）、ならびにグリコシド結合型オリゴ糖が考察されている。

【0009】

Ｎ−結合型グリカンの場合、オリゴ糖の還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基のアノマー炭素（Ｃ−１）とポリペプチドのアスパラギン（Ａｓｎ）残基の窒素とを接続するアミン結合が存在する。動物細胞においては、Ｏ−結合型グリカンは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、またはキシロースと、いくつかのヒドロキシアミノ酸のうちの１つ、最も一般的にはセリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）であるが、一部の場合にはヒドロキシプロリンまたはヒドロキシルシン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｓｉｎｅ）との間のグリコシド結合を介して結合する。

【0010】

Ｏ−結合型オリゴ糖の生合成経路は、一連の特異的グリコシルトランスフェラーゼによるヌクレオチド糖からの単一糖残基の段階的輸送で構成される。単糖供与体として機能するヌクレオチド糖は、ウリジン−ジホスホ−ＧａｌＮＡｃ（ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ）、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ−Ｇａｌ、グアニジン−ジホスホ−フコース（ＧＤＰ−Ｆｕｃ）、及びシチジン−モノホスホ−シアル酸（ＣＭＰ−ＳＡ）である。

【0011】

Ｎ−結合型オリゴ糖合成において、Ｎ−結合型オリゴ糖アセンブリの始動は、タンパク質のＡｓｎ残基上で直接生じるものではないが、脂質結合型前駆体オリゴ糖のプリアセンブリを伴い、これはその後、ｍＲＮＡからのその翻訳中または翻訳直後にタンパク質に輸送される。この前駆体オリゴ糖（Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２）は、いくつかの膜結合グリコシルトランスフェラーゼを活用して、ピロリン酸塩橋を介してポリイソプレノイド担体脂質であるドリコールに結合する間に、合成される。脂質結合型前駆体のアセンブリが完了した後、別の膜結合酵素がそれを立体的にアクセス可能なＡｓｎ残基に輸送し、これは配列−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−の一部として生じるものである。

【0012】

新たに合成された糖タンパク質のグリコシル化Ａｓｎ残基は、１種のみのオリゴ糖Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２を一時的に担持する。このオリゴ糖構造の処理により、成熟糖タンパク質上で見い出される多様な構造が生成される。

【0013】

Ｎ−結合型オリゴ糖の処理は、いくつかの膜結合酵素の連続作用によって達成され、３つのグルコース残基の除去、様々な数のマンノース残基の除去、及び結果として得られるトリミングされたコアへの様々な糖残基の付加を含む。

【0014】

作用機序及びエフェクター機能の必要性に応じて、標的化されたタンパク質またはグリカン修飾を用いて、治療抗体の臨床的可能性を向上させる（Ｃａｒｔｅｒ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，３１７，２０１１，１２６１−１２６９）。これらの修飾のうちの１つは、それらのキトビオースコア（Ｎ−結合型）グリカン（脱フコシル化）上にフコース分子を有しない組換え抗体の発現を伴い、これにより、通常は末梢血単球及びナチュラルキラー細胞上で発現される、ＦｃγＲＩＩＩに対するそれらのより強力な親和性に起因するＡＤＣＣの増加が生じる（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７，２００２，２６７３３−２６７４０）。抗体のフコシル化とＡＤＣＣレベルの低下との相関も、いくつかのグループによって研究及び文書化されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７，２００２，２６７３３−２６７４０；Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３０，２００７，３００−３１０；及びＹａｍａｎｅ−Ｏｈｕｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，８７，２００４，６１４−６２２）。

【0015】

グリカンのフコシル化には、デノボ経路またはサルベージ経路を介したＧＤＰ−フコースの合成が必要とされる。フコシル化プロセスは、グリカン還元末端の第１のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分に対するフコース分子の付加をもたらす、いくつかの酵素の連続機能を伴う（Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｌｏｗｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，２００３，４１Ｒ−５３Ｒ）。Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｌｏｗｅ ａｎｄ Ｆｕｋｕｄａによって、マンノース及び／またはグルコースからのＧＤＰ−フコースの産生に貢献するデノボ経路の２つの主要な酵素が発見された。具体的には、本研究所は、ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）及びＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）を発見した（Ｏｈｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７３，１９９８，１４５８２−１４５８７；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１５８，２００２，８０１−８１５；及びＢｅｃｋｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ Ｇｌｙｃａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，２００２，Ｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ，ＵＭＩ３１２１８９１）。フコースの非存在下で、ＧＭＤ及びＦＸは、マンノース及び／またはグルコースをＧＤＰ−フコースに変換する。同様に、ＧＤＰ−フコースはゴルジ複合体へと輸送され、ここで、９個のフコシル−トランスフェラーゼ（ＦＵＴ１−９）が協調して作用して、グリカンの第１のＧｌｃＮＡｃ分子をフコシル化する（Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｌｏｗｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，２００３，４１Ｒ−５３Ｒ）。しかしながら、フコースの存在下では、フコース−キナーゼ及びＧＤＰ−フコースピロホスホリラーゼは、フコースをＧＤＰ−フコースに変換することができ、ＧＭＤ及びＦＸ酵素によるＧＤＰ−フコースのデノボ合成の必要を回避する（Ｂｅｃｋｅｒ＆Ｌｏｗｅ，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３，２００３，４１Ｒ−５３Ｒ）。

【0016】

ＦＸノックアウト（ＫＯ）以外の多くの戦略が、ＡＤＣＣエフェクター機能を強化するようにＣＨＯ細胞株によって発現される脱フコシル化抗体種のパーセントを増大させるために利用されてきたが、それらの使用には、通常、特定のセットバックが伴う。例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧＮＴＩＩＩ）の過剰発現は、２つに分かれるＧｌｃＮＡｃ（グリカンの第１のマンノースへの第３のＧｌｃＮＡｃの付着）中間体種のレベルを増加させることによってフコシル化抗体レベルを低下させることが示されている（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１７，１９９９，１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，７４，２００１，２８８−２９４）。しかしながら、これらのグリカン種は、抗体上に一般に存在するものではなく、これらを一定した再現可能なレベルで維持することは困難であり、製造現場での製品品質及び一貫性を脅かし得る。加えて、サイレンシングまたはＤＮＡコピー数損失に起因する経時的な組換えＧＮＴＩＩＩの発現レベルの低下により、予測可能な脱フコシル化抗体レベルを製造目的で再現可能に発現させることは困難となる。同様に、原核生物ＧＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−リキソ−４−ヘキスロースレダクターゼ（ＲＭＤ）酵素の過剰発現（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０，２０１０，１６０７−１６１８）、または脱フコシル化抗体種のパーセントを増加させるために過剰発現を利用するいずれのアプローチも、かかるセットバックを被り得る。ノックダウン戦略（Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７，２００７，＊１−１３）または市販のフコシル化経路の阻害剤を使用することは、ノックダウン安定性、または製品不均一性をもたらし得る阻害剤のオフターゲット活性に起因して、困難である。製造現場におけるフコシル化の化学的阻害剤の利用に関連する費用は言うまでもない。発現またはフコシダーゼによる精製後の抗体産物の処理（Ｉｎｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３９２，２００７，３４−４６）も不十分であり、製品品質非一貫性の欠如を招き、これらの酵素の除去に求められる更なるステップ（複数可）に起因して製造プロセスを複雑化する。

【0017】

脱フコシル化抗体発現のためのＧＭＤ ＫＯ宿主の利用が提案されているが（Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３０，２００７，３００−３１０）、かかる宿主は、広く利用されているものではなく、この宿主の報告されている特異的産生性はあまり高くない（Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３０，２００７，３００−３１０）。

【0018】

一方で、ＦＵＴ８ ＫＯ宿主は、製造目的に好適な脱フコシル化抗体を発現することができるクローンを生成するために広く使用されている（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｕｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，８７，２００４，６１４−６２２；及びＭａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１０６，２０１０，７７４−７８３）。とはいえ、ＦＵＴ８ ＫＯ宿主の利用は、その欠点及び困難を伴わないわけではない。一般に、インビボ及びインビトロの抗体機能の分析が、脱フコシル化抗体対野生型（フコシル化）抗体の必要性及び有効性を決定するために必要とされる。ＦＵＴ８ ＫＯ宿主は脱フコシル化抗体を発現することしかできないため、比較目的で野生型抗体を発現させるためには平行細胞株開発（ＣＬＤ）努力を行う必要があり、求められるＣＬＤ努力を倍増させる。更に、同等の製品品質属性を有するクローンを得て、いずれの観察された利点もフコシル化の欠如のみに起因することを確実にするためには、脱フコシル化抗体及び野生型抗体を発現する多数のクローンをスクリーニングする必要がある。加えて、ＦＵＴ８ ＫＯ宿主が成長に関する問題を有し、より長い懸濁適合時間を必要とし得ることで、より低い力価への可能性のある影響を伴ってＣＬＤタイムラインを長引かせる（Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１０６，２０１０，７７４−７８３）。

【0019】

このため、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態を所望の割合で産生することができる細胞株、及び該細胞株の培養方法、ならびにそのタンパク質を含む組成物の必要性が当該技術分野において存在する。

【0020】

本明細書において言及される全ての出版物、特許、特許出願、及び特許公開の開示は、ここに参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【発明の概要】

【0021】

本出願は、いくつかの実施形態において、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるタンパク質の産生方法を提供し、本方法は、タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）活性を実質的に含まないか、またはＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）活性を実質的に含まず、培地は、フコース源を、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量で含む。いくつかの実施形態において、この所定の割合は、約５０：１〜約１：５０（例えば、約５０：５．５、約５０：１２．５、約５０：２１．５、約５０：３３．５、約５０：５０、約５０：７５、約５０：１１６．５、約５０：２００、または約５０：４５０を含む）である。

【0022】

いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質の産生方法が提供され、本方法は、タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地は、フコース源を、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合で前記タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量で含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＡＤＣＣアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＦＣγＲＩＩＩ結合アッセイによって決定される。

【0023】

いくつかの実施形態において、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるタンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地が、フコース源を含む、培養することと、タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、タンパク質が所定のフコシル化レベルで産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化レベルを決定することは、タンパク質のフコシル化形態を決定することを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化レベルを決定することは、タンパク質の脱フコシル化形態を決定することを含む。いくつかの実施形態において、フコース源の量を調整することは、フコース源の量を、フコシル化レベルが低いときに増加させることを含む。いくつかの実施形態において、フコース源の量を調整することは、フコース源の量を、フコシル化レベルが高いときに減少させることを含む。

【0024】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、宿主細胞を、フコース源を含む培地中で培養する前に、宿主細胞を、フコース源を含まない培地中で培養することを含む。上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、フコース源が培養ステップの開始時に培地中に存在する、宿主細胞を培地中で培養することを含む。上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、フコース源が培養ステップ中に培地に添加される、宿主細胞を培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態において、フコース源は、ボーラス添加によって培地に添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は、連続流加によって培地に添加される。

【0025】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、培養ステップ中の培地におけるフコース源の量が約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである、宿主細胞を培地中で培養することを含む。

【0026】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、培養ステップが約３７℃未満で実行される、宿主細胞を培地中で培養することを含む。

【0027】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、培地がグルコース源またはマンノース源を更に含む、宿主細胞を培地中で培養することを含む。

【0028】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、本方法は、タンパク質を細胞培養から単離することを更に含む。

【0029】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0030】

いくつかの実施形態において、脱フコシル化形態にあるタンパク質の特性評価方法が提供され、本方法は、脱フコシル化タンパク質の生物学的活性を、タンパク質のフコシル化形態と比較することを含み、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態は、フコース源を含まない第１の細胞培養において宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、フコース源を含む第２の細胞培養において宿主細胞によって産生される。

【0031】

いくつかの実施形態において、脱フコシル化形態にあるタンパク質の特性評価方法は、生物学的活性をインビトロで比較することを含む。いくつかの実施形態において、脱フコシル化形態にあるタンパク質の特性評価方法は、生物学的活性をインビボで比較することを含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＡＤＣＣアッセイによって決定される。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＦＣγＲＩＩＩ結合アッセイによって決定される。

【0032】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、グリカン構造レベルで決定される。いくつかの実施形態において、ＰＮＧａｓｅ Ｆが、グリカン構造をタンパク質から切断するために使用される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、グリカン構造レベルで決定され、ここでは、タンパク質のフコシル化形態は、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定される。

【0033】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、タンパク質レベルで決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、タンパク質レベルで決定され、ここでは、タンパク質のフコシル化形態は、質量分析（ＭＳ）によって決定される。

【0034】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、タンパク質はＦｃ含有タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、抗体重鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は完全長抗体である。いくつかの実施形態において、完全長抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質はイムノアドヘシンである。

【0035】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。

【0036】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、それぞれ、２０％以下のＦＸまたはＧＭＤ活性を含む。

【0037】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は不活性化される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子はｓｉＲＮＡによって不活性化される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子はｓｈＲＮＡによって不活性化される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子が配列欠失によって不活性化される方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子が配列付加または置換によって不活性化される方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）系を使用して不活性化される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を使用して不活性化される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系を使用して不活性化される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、メガヌクレアーゼ系を使用して不活性化される。

【0038】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まない。

【0039】

上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。上記の実施形態のうちのいずれかに従う（またはそれに適用される）いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0040】

また、本明細書に記載の方法のうちのいずれか１つによって産生されるタンパク質を含む組成物が本明細書で提供される。

【0041】

いくつかの実施形態において、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質を含む組成物が提供され、本組成物は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態を含む。

【0042】

いくつかの実施形態において、本組成物は、グリカン構造の還元末端にフコースを含むタンパク質のフコシル化形態を含む。いくつかの実施形態において、本組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態において、本組成物は細胞培地である。いくつかの実施形態において、本組成物は細胞溶解物である。いくつかの実施形態において、本組成物はタンパク質精製カラムからの溶出物である。

【0043】

また、細胞培養であって、タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であって、本宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞と、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む培地と、を含む、細胞培養が提供される。

【0044】

また、疾患の治療を、それを必要とする個体において行う方法が提供され、本方法は、個体に本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態において、本組成物は非経口投与される。いくつかの実施形態において、本組成物は静脈内または皮下投与される。いくつかの実施形態において、本組成物は局所投与される。いくつかの実施形態において、本組成物は局部投与される。

【0045】

本発明のこれら及び他の態様及び利点は、後続の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなる。本明細書に記載される様々な実施形態の特性うちの１つ、いくつか、または全てを組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成し得ることが理解される。

【図面の簡単な説明】

【0046】

【図1】ＧＤＰ−フコースを生成するためのデノボ経路及びサルベージ経路を含むフコシル化経路の概観を示す。ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）及びＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）は、デノボ経路の成員である。

【図2A】ＦＸ不活性化のワークフロー、及びＦＸ遺伝子が不活性化された細胞のＰＣＲ分析を示す。ＦＸ不活性化のワークフローを示す。

【図2B】ＦＸ不活性化のワークフロー、及びＦＸ遺伝子が不活性化された細胞のＰＣＲ分析を示す。欠失したＦＸアレル検出のためのＰｏｏｌ−３、Ｐｏｏｌ−９、及び対照のＰＣＲ分析を示す。野生型（ＷＴ、内）及びノックアウト（ＫＯ、外）プライマーを個々の反応で使用した。ｇＲＮＡのみでトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｃａｓ９なし）を対照として使用した。

【図3】非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、ＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ−Ｋ１ ＦＸＫＯ−Ｐｏｏｌ−３）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１宿主）のＦＡＣＳ分析を示す。

【図4A】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＸ遺伝子及びタンパク質分析を示す。野生型（ＷＴ）プライマー及びノックアウト（ＫＯ）プライマーを使用するＦＸ遺伝子のＰＣＲ分析を示す。

【図4B】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＸ遺伝子及びタンパク質分析を示す。ＦＸタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。ＦＸブロットパネルにおいて、アスタリスク（^＊）によって示される低い方のバンドは、全ての試料に存在する非特異的バンドであることに留意されたい。アクチンブロットをローディングコントロールとして使用する。

【図5A】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン３のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5B】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン５のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5C】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン６のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5D】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン７のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5E】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン９のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5F】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン１１のＦＡＣＳ分析を示す。

【図6A】ＦＸＫＯ細胞株を使用する抗体の産生プロセス、及び該ＦＸＫＯ細胞株によって産生されたグリカン構造の分析を示す。培地中のフコースの存在下または非存在下で、ＦＸＫＯ宿主３−５、３−７、及び３−１１から抗体Ａを発現させるためのトランスフェクション及びプール選択の概略図を示す。ＣＨＯ−Ｋ１宿主を対照として使用した。

【図6B】ＦＸＫＯ細胞株を使用する抗体の産生プロセス、及び該ＦＸＫＯ細胞株によって産生されたグリカン構造の分析を示す。キャピラリー電気泳動に供した、ＦＸＫＯクローン３−１１によって発現された抗体Ａの代表的な電気泳動図プロファイルを示す。

【図6C】ＦＸＫＯ細胞株を使用する抗体の産生プロセス、及び該ＦＸＫＯ細胞株によって産生されたグリカン構造の分析を示す。フコースの存在下または非存在下で異なるプールからキャピラリー電気泳動によって検出されたグリカン種を示す。フコシル化の欠如は「−Ｆ」によって示す。レベルが低いグリカン種は示さない。Ｇ０＝フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１＝ＧｌｃＮａｃ分岐のうちの１つにある１つのガラクトース、Ｇ−１＝１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠くキトビオースコアグリカン、Ｇ１’＝Ｇ１の位置異性体、Ｇ１−１＝１つのガラクトースが残りの分岐したＧｌｃＮＡｃにある、１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠くキトビオースコアグリカン、Ｇ２＝分岐したＧｌｃＮＡｃの各々に１つずつ、２つのガラクトース、Ｍａｎ５＝ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−５ｘ（マンノース）、Ｇ０−１＝１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠くキトビオースコアグリカン、Ｇ０−１−Ｆ＝１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠く脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ０−Ｆ＝脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１−Ｆ＝１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１’−Ｆ＝Ｇ１−Ｆの位置異性体、Ｇ２−Ｆ＝２つのガラクトースが分岐したＧｌｃＮＡｃの各々に１つずつある脱フコシル化キトビオースコアグリカン。

【図7A】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。抗体の力価（ｇ／Ｌ）を示す。

【図7B】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンの特異的産生性（ｐｇ／細胞−日）を示す。

【図7C】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンの成長を示す。

【図7D】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンによって産生されたＧ０−Ｆ（脱フコシル化キトビオースコアグリカン）であるグリカン構造のパーセンテージを示す。

【図7E】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンによって産生されたＧ１−Ｆ（１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある、脱フコシル化キトビオースコアグリカン）であるグリカン構造のパーセンテージを示す。

【図7F】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンによって産生されたＧ０−１−Ｆ（１つの分岐ＧｌｃＮＡｃを欠く脱フコシル化キトビオースコアグリカン）であるグリカン構造のパーセンテージを示す。

【図8A】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。ＣＨＯ−Ｋ１宿主対照と比較した、フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ａの電荷変異型のパーセンテージを示す。

【図8B】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。ＣＨＯ−Ｋ１宿主対照と比較した、フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ａの凝集のパーセンテージを示す。

【図8C】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの力価（ｇ／Ｌ）を示す。

【図8D】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの主要な糖型のパーセンテージを示す。Ｇ０＝フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１＝ＧｌｃＮａｃの分岐のうちの１つにある１つのガラクトース、Ｍａｎ５＝ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−５ｘ（マンノース）、Ｇ０−Ｆ＝脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１−Ｆ＝１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある脱フコシル化キトビオースコアグリカン。

【図8E】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ｂの電荷変異型のパーセンテージを示す。

【図8F】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ｂの凝集のパーセンテージを示す。

【図9A】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１によって産生された抗体Ｂの主要な糖型のパーセンテージを示す。

【図9B】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン２によって産生された抗体Ｂの主要な糖型のパーセンテージを示す。Ｇ０＝フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１＝ＧｌｃＮａｃの分岐のうちの１つにある１つのガラクトース、Ｍａｎ５＝ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−５ｘ（マンノース）、Ｇ０−Ｆ＝脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１−Ｆ＝１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある脱フコシル化キトビオースコアグリカン。

【図9C】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１及び２によって産生された抗体Ｂの力価（ｇ／Ｌ）を示す。

【図9D】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１及び２によって産生された抗体Ｂの凝集のパーセンテージを示す。

【図9E】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１及び２によって産生された抗体Ｂの電荷変異型のパーセンテージを示す。

【図10A】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。示されるフコースの濃度にて産生培地中で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂ（ＩｇＧ１）の脱フコシル化糖型対フコシル化糖型の割合を示す。

【図10B】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。１０μｇ／ｍｌの非飽和濃度での精製抗体Ｂ抗体のＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイからの結果を示す。

【図10C】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。示されるフコースの濃度にて産生培地中で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｃ（ＩｇＧ１）の脱フコシル化グリカン種対フコシル化種の割合を示す。

【図10D】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。異なるフコース流加培養物から精製した抗体Ｃ抗体のＮＫ細胞系ＡＤＣＣアッセイからのＡＤＣＣ活性％の結果を示す。

【図10E】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。０ｍＭのフコース流加の培養物及び１ｍＭのフコース流加の培養物から調製した抗体混合物の脱フコシル化グリカン合計パーセント及び相対ＡＤＣＣ活性パーセントを示す。

【図10F】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。脱フコシル化グリカン種合計パーセントに対するＡＤＣＣ活性％を示す。

【図10G】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。フコシル化グリカン対脱フコシル化グリカンの割合が異なる抗体Ｃ試料についてのＡＤＣＣ用量応答曲線を示す。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本出願は、ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ,４−レダクターゼノックアウト（ＦＸＫＯ）細胞が、様々な量のフコースを含む培地における培養時に、抗体のフコシル化形態と脱フコシル化形態との両方を産生することができるという原理を利用する。産生培地中のフコースの力価により、抗体力価または産物品質にいかなる変化ももたらさずに、所望の割合のフコシル化グリカン形態及び脱フコシル化グリカン形態の抗体産生が可能となることが見い出された。ＦＸＫＯ宿主細胞のクローンが、比較的高い特異的産生性及び良好な成長プロファイルを有する標的抗体を発現した。

【0048】

このため、本出願は、同じＦＸＫＯ宿主細胞からのフコシル化タンパク質及び脱フコシル化タンパク質の産生方法を提供する。これは、類似の産物品質でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の産生を可能にするため有利である。そして、類似の産物品質のフコシル化タンパク質及び脱フコシル化タンパク質を比較することで、脱フコシル化タンパク質上のフコースの欠如が実際に生物学的機能（例えば、強化されたＡＤＣＣ機能）の観察される変化の原因であるか否かを決定することができるようになる。タンパク質の野生型形態または脱フコシル化形態のいずれかを産生する能力を有するＦＵＴ８ノックアウト宿主細胞とは対照的に、ＦＸＫＯ宿主は、２つの別々の細胞株開発（ＣＬＤ）努力を負う必要性をなくす。更に、単一の宿主細胞を使用してタンパク質のフコシル化形態と脱フコシル化形態との両方を産生させることで、同等の産物品質のクローンを特定できる可能性のために多くのコロニーをスクリーニングする必要性が回避される。

【0049】

加えて、ＦＸＫＯクローンを使用して、フコシル化糖型及び脱フコシル化糖型の治療的に関連のある割合で任意の抗体またはＦｃ含有ポリペプチドを発現させてもよい。脱フコシル化抗体が単核細胞（ＮＫ細胞など）によってＡＤＣＣ媒介性細胞死を強化する一方、多形核（ＰＭＮ）細胞は、フコシル化グリカンを有する抗体への結合によってそれらの標的を選択的に認識し殺滅することが報告されている（Ｐｅｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２，２００８，２３９０−２３９９）。このため、ＦＸＫＯ宿主細胞の使用、及び適正量のフコースの培地への滴定を使用して、所望の割合の抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生させることができ、これは、原理上は単核細胞及びＰＭＮ細胞の両方によるＡＤＣＣ媒介性細胞死を強化することに効果的であるはずである。更に、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の割合を調整できることにより、いずれの潜在的なＡＤＣＣ関連毒性も最小限に抑えながら最大レベルのＡＤＣＣ機能を有するタンパク質の産生が可能となる。

【0050】

このため、本出願は、ある態様において、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない宿主細胞を培養することを含む、所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態にあるタンパク質の産生方法を提供し、培地は、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。本出願は、別の態様において、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質の産生方法を提供し、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。本出願は、別の態様において、タンパク質フコシル化レベルの調整方法を提供し、本方法は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない宿主細胞を培養することと、タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコースの量をタンパク質が所定のフコシル化レベルで産生されるように調整することとを含む。本出願は、別の態様において、脱フコシル化タンパク質の生物学的活性をタンパク質のフコシル化形態と比較することを含む、脱フコシル化形態にあるタンパク質の特性評価方法を提供し、ここでは、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、本タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。本出願は、別の態様において、上記の方法のうちのいずれかによって産生されたタンパク質を含む組成物を提供する。本出願は、別の態様において、本タンパク質を含む医薬組成物の投与を含む疾患治療方法を提供する。本出願は、別の態様において、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない宿主細胞と、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭのフコース源とを含む細胞培養を提供する。

【0051】

定義
タンパク質のフコシル化形態は、本明細書で使用される場合、フコース部分を有するグリカン構造を指す。

【0052】

タンパク質の脱フコシル化形態は、本明細書で使用される場合、フコース部分を欠くグリカン構造を指す。

【0053】

「Ｆｃ含有タンパク質」は、本明細書で使用される場合、Ｆｃドメインを含有するタンパク質（例えば、抗体またはＦｃ含有融合タンパク質）を指す。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のタンパク質サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は、１つ以上のポリペプチドを含む。

【0054】

「Ｆｃドメイン」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域またはそのＣ末端断片を指す。本用語は、野生型Ｆｃドメイン及び変異型Ｆｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端に及ぶ（アミノ酸番号がＥＵインデックスとも称されるＥＵ付番系に従い、これは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１で説明されている通りである）。いくつかの実施形態において、本用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端断片及び１つ以上の定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ＩｇＧについて、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３、ならびにＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジを含み得る。

【0055】

本明細書で使用される場合、「Ｆｃ含有融合タンパク質」は、少なくとも１つの他の異種タンパク質単位またはポリペプチドに融合したＦｃドメインを含むタンパク質を指す。

【0056】

本明細書で使用される「重鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖を指す。

【0057】

抗体は、Ｆｃ領域にグリコシル化を有する糖タンパク質である。このため、例えば、ＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ領域は、鎖間ジスルフィド結合ヒンジ領域、アスパラギン２９７（Ａｓｎ−２９７）でＮ結合型オリゴ糖を担持するグリコシル化ＣＨ２ドメイン、及び非共有的に対形成したＣＨ３ドメインを含むホモ二量体である。グリコシル化は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＣ１ｑを媒介するエフェクター機能において重要な役割を果たす。このため、本発明の抗体断片は、グリコシル化Ｆｃ領域及び抗原結合領域を含む必要がある。

【0058】

「抗体」という用語は、本明細書で最も広義に使用され、それらがＦｃドメインを含む限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。

【0059】

「完全長抗体」という用語は、本明細書で、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、または本明細書に定義されるＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように使用される。

【0060】

「天然抗体」とは、様々な構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｈｅａｖｙ ｄｏｍａｉｎ）または重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメイン（ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｉｇｈｔ ｄｏｍａｉｎ）または軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、その後に定常軽（ＣＬ）ドメインとを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型うちの１つに割り当てられ得る。

【0061】

抗体の「クラス」は、その重鎖によって保有される定常ドメインまたは定常領域の型を指す。５つの主要なクラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２に更に分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0062】

「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の源または種に由来し、重鎖及び／または軽鎖の残りが異なる源または種に由来する抗体を指す。

【0063】

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原と結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；二重特異性抗体；線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。

【0064】

「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を明確に除外する。

【0065】

「ヒト化」抗体は、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）由来のアミノ酸残基及びヒトフレームワーク（ＦＲ）由来のアミノ酸残基を含む、キメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

【0066】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、その集団を成す個々の抗体は、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、例えば、天然に存在する変異を含むか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能な変異形抗体を除き、かかる変異形は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体の集団から得られるものとして抗体の特徴を示しており、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるものではない。

【0067】

本明細書で使用されるとき、「イムノアドヘシン」という用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを組み合わせた分子を指す。構造的に、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を有するアミノ酸配列（このアミノ酸配列は、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち、抗体の定常領域と比較して「異種」である））と、免疫グロブリン定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧのＣ_Ｈ２及び／またはＣ_Ｈ３配列）との融合を含む。例示的なアドヘシン配列としては、目的とするタンパク質に結合する受容体またはリガンドの一部分を含む連続したアミノ酸配列が挙げられる。アドヘシン配列は、目的とするタンパク質に結合するが、受容体またはリガンド配列ではない配列（例えば、ペプチボディにおけるアドヘシン配列）でもあり得る。かかるポリペプチド配列は、ファージディスプレイ技法及びハイスループット選別方法を含む様々な方法によって選択または特定され得る。イムノアドヘシン中の免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから取得され得る。

【0068】

「治療用抗体」という用語は、疾患の治療に使用される抗体を指す。治療用抗体は、様々な作用機序を有し得る。治療用抗体は、抗原に関連する標的に結合し、その正常な機能を無効化し得る。例えば、癌細胞の生存に必要なタンパク質の活性を遮断するモノクローナル抗体は、細胞の死滅を引き起こす。別の治療用モノクローナル抗体は、抗原に関連する標的に結合し、その正常な機能を活性化する。例えば、モノクローナル抗体は、細胞上のタンパク質に結合し、アポトーシスシグナルを誘発することができる。更に別のモノクローナル抗体は、病変組織のみにおいて発現される標的抗原に結合し得、化学療法剤または放射性薬剤などの毒性ペイロード（有効薬剤）のモノクローナル抗体への共役により、毒性ペイロードを病変組織に特異的に送達して、正常な組織への害を低減するための薬剤を創出することができる。治療用抗体の「生物学的に機能的な断片」は、少なくとも標的抗原への特異的結合を含む、インタクトな抗体に帰属する生物学的機能のうちのいくつかまたは全てではないにせよ少なくとも１つを呈することになる。

【0069】

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を説明するために使用される。好ましいＦｃＲは、天然配列のヒトＦｃＲである。更に、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、これらの受容体のアレル変異形及び代替としてはスプライシング形態を含め、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含み、これらは、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有する。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質側ドメイン内に免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｍ．ｉｎ Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）を参照されたい）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）、Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）、及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）に概説されている。今後特定されるものも含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、母体ＩｇＧｓの胎児への移行に関与し（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）、及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））、より遅い異化、したがってより長い半減期を媒介する、新生児受容体ＦｃＲｎも含む。

【0070】

「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより異なる抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。

【0071】

「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、かつエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書に記載されるように、その天然源から、例えば、血液またはＰＢＭＣから単離され得る。

【0072】

「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載のアッセイなどのインビトロＡＤＣＣアッセイが行われ得る。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替としてまたは加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、動物モデル、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８に胃開示されるものなどで評価され得る。

【0073】

「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、同種抗原と複合した分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるようなＣＤＣアッセイが行われ得る。

【0074】

「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、タンパク質またはポリペプチド産物を産生することができる細胞を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＦｃ含有タンパク質を産生し得る。

【0075】

本明細書で使用される場合、「ＦＸ活性が実質的にない」または「ＧＭＤ活性が実質的にない」は、それぞれ活性レベルの減少のない野生型ＦＸまたはＧＭＤを含む宿主細胞と比較した場合に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、それぞれＦＸまたはＧＭＤの活性レベルが減少することを指す。いくつかの実施形態において、活性レベルは、約８０％〜１００％、約８５％〜１００％、約９０％〜１００％、または約９５％〜１００％減少する。いくつかの実施形態において、活性レベルは、少なくとも９５％減少する。いくつかの実施形態において、活性レベルは、１００％減少する。いくつかの実施形態において、酵素の活性レベルは、酵素の活性レベルの減少のない野生型酵素を含む宿主細胞と比較した場合、２０％以下である。いくつかの実施形態において、酵素の活性レベルは、酵素の活性レベルの減少のない野生型酵素を含む宿主細胞と比較した場合、１５％以下である。いくつかの実施形態において、酵素の活性レベルは、酵素の活性レベルの減少のない野生型酵素を含む宿主細胞と比較した場合、１０％以下である。いくつかの実施形態において、酵素の活性レベルは、酵素の活性レベルの減少のない野生型酵素を含む宿主細胞と比較した場合、５％以下である。

【0076】

「遺伝子の破壊」及び「遺伝子破壊」という語句は、天然の内因性ＤＮＡ配列及び／または遺伝子のプロモーター領域の突然変異を指し、この突然変異は、細胞におけるその遺伝子の発現を、遺伝子の野生型または天然に存在する配列と比較した場合に減少させるかまたは防止するものである。

【0077】

「ノックアウト」という用語は、通常は改変されていない遺伝子と比較して少なくとも８０％そこからコードされる、ポリペプチドの生物学的活性を減少させる遺伝子の核酸配列における改変を指す。改変は、例えば、挿入、置換、欠失、フレームシフト突然変異、またはミスセンス突然変異であってもよい。

【0078】

「ノックダウン」という用語は、遺伝子修飾（有機体の染色体のうちの１つのＤＮＡにおける変化）か、ｍＲＮＡ転写産物または遺伝子のいずれかに相補的な配列を有する短いＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの試薬による処理かのいずれかによって、１つ以上の遺伝子の発現を減少させる技法を指す。ＤＮＡの遺伝子修飾が行われる場合、結果は「ノックダウン有機体」または「ノックダウン宿主細胞」となる。

【0079】

「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子が染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

【0080】

「ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、それが結合している別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。ある特定のベクターは、それらが作動可能に結合している核酸の発現を誘導することができる。かかるベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。

【0081】

「単離された」タンパク質とは、その天然環境の成分から分離されたタンパク質である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％を超える純度に精製される。例えば、抗体純度の評価方法の概説に関して、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。

【0082】

「薬学的組成物」という用語は、調製物中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になるような形態であり、かつその製剤が投与されるであろう対象にとって許容できないほどに有毒である追加の構成成分を全く含有しない、調製物を指す。

【0083】

「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0084】

本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果などの有益または所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的上、有益なまたは所望の臨床結果には、以下の疾患に起因する１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減退、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の防止または遅延）、疾患の蔓延（例えば、転移）の防止もしくは遅延、疾患の再発の防止もしくは遅延、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の向上、疾患の寛解（部分寛解または完全寛解）、疾患の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の改善、及び／または生存率の延長のうちの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法は、これらの治療的態様のいずれか１つ以上を企図する。

【0085】

「個体」という用語は、哺乳動物を指し、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、齧歯動物、または霊長類を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体はヒトである。

【0086】

「治療有効量」は、特定の障害の測定可能な改善をもたらすために必要な少なくとも最小限の濃度である。治療有効量は、本明細書において、患者の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の応答を引き起こすための抗体の能力のような因子によって変動し得る。治療有効量は、抗体のいずれの毒性または有害な影響よりも治療的に有益な効果が勝ることでもある。「予防有効量」は、必要な投与量及び投与期間にて、所望の予防的結果を達成するのに有効な量を指す。典型的であって必ずしもそうではないが、疾患の早期段階前または早期段階で予防用量が対象において用いられるため、予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少なくてもよい。

【0087】

本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態が、態様及び実施形態「からなる」及び／または「から本質的になる」を含むことが理解される。

【0088】

本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変動を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。

【0089】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ（１つの）」、「ｏｒ（または）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。

【0090】

タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の産生方法
本出願は、いくつかの実施形態において、タンパク質の産生方法を提供し、タンパク質は、所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生され、本方法は、培地中で、本明細書の実施形態に記載される、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない任意の宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、タンパク質の産生方法が提供され、本方法は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、Ｆｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、Ｆｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、抗体の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合で抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、抗体の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合で抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0091】

いくつかの実施形態において、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、タンパク質の産生方法が提供され、本方法は、ＦＸ活性を実質的に有しない宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、タンパク質の産生方法が提供され、本方法は、ＦＸ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、Ｆｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸ活性を実質的に含まない宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、Ｆｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、抗体の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸ活性を実質的に有しない宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合で抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される、抗体の産生方法が提供され、本方法は、培地中で、ＦＸ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含み、培地は、所定の割合で抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0092】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約５０：１〜約１：５０、約５０：２．５〜約１：５０、約５０：５．５〜約１：５０、約５０：８．５〜約１：５０、約５０：１２．５〜約１：５０、約５０：１５．５〜約１：５０、約５０：２１．５〜約１：５０、約５０：２７〜約１：５０、約５０：３３．５〜約１：５０、約５０：４１〜約１：５０、約５０：５０〜約１：５０、約５０：６１〜約１：５０、約５０：７５〜約１：５０、約５０：９３〜約１：５０、約５０：１１６．５〜約１：５０、約５０：１５０〜約１：５０、約５０：２００〜約１：５０、約５０：２８３．５〜約１：５０、約５０：４５０〜約１：５０、または約５０：９５０〜約１：５０である。

【0093】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約５０：１〜約２．５：５０、約５０：１〜約５．５：５０、約５０：１〜約８．５：５０、約５０：１〜約１２．５：５０、約５０：１〜約１５．５：５０、約５０：１〜約２１．５：５０、約５０：１〜約２７：５０、約５０：１〜約３３．５：５０、約５０：１〜約４１：５０、約５０：１〜約５０：５０、約５０：１〜約６１：５０、約５０：１〜約７５：５０、約５０：１〜約９３：５０、約５０：１〜約１１６．５：５０、約５０：１〜約１５０：５０、約５０：１〜約２００：５０、約５０：１〜約２８３．５：５０、約５０：１〜約４５０：５０、または約５０：１〜約９５０：５０である。

【0094】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約５０：２．５〜約２．５：５０、約５０：５．５〜約５．５：５０、約５０：８．５〜約８．５：５０、約５０：１２．５〜約１２．５：５０、約５０：１５．５〜約１５．５：５０、約５０：１５．５〜約２１．５：５０、約５０：２７〜約２７：５０、約５０：３３．５〜約３３．５：５０、または約５０：４１〜約４１：５０である。

【0095】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約１２．５：５０〜約２．５：５０、約１２．５：５０〜約５．５：５０、約１２．５：５０〜約８．５：５０、約１２．５：５０〜約１２．５：５０、または約１２．５：５０〜約１５．５：５０である。

【0096】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約２１．５：５０〜約２．５：５０、約２１．５：５０〜約５．５：５０、約２１．５：５０〜約８．５：５０、約２１．５：５０〜約１２．５：５０、または約２１．５：５０〜約１５．５：５０である。

【0097】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約３３．５：５０〜約２．５：５０、約３３．５：５０〜約５．５：５０、約３３．５：５０〜約８．５：５０、約３３．５：５０〜約１２．５：５０、約３３．５：５０〜約１５．５：５０、約３３．５：５０〜約２１．５：５０、または約３３．５：５０〜約２７：５０である。

【0098】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約５０：５０〜約２．５：５０、約５０：５０〜約５．５：５０、約５０：５０〜約８．５：５０、約５０：５０〜約１２．５：５０、約５０：５０〜約１５．５：５０、約５０：５０〜約２１．５：５０、約５０：５０〜約２７：５０、約５０：５０〜約３３．５：５０、または約５０：５０〜約４１：５０である。

【0099】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約７５：５０〜約２．５：５０、約７５：５０〜約５．５：５０、約７５：５０〜約８．５：５０、約７５：５０〜約１２．５：５０、約７５：５０〜約１５．５：５０、約７５：５０〜約２１．５：５０、約７５：５０〜約２７：５０、約７５：５０〜約３３．５：５０、約７５：５０〜約４１：５０、約７５：５０〜約５０：５０、または約７５：５０〜約６１：５０である。

【0100】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約１１６．５：５０〜約２．５：５０、約１１６．５：５０〜約５．５：５０、約１１６．５：５０〜約８．５：５０、約１１６．５：５０〜約１２．５：５０、約１１６．５：５０〜約１５．５：５０、約１１６．５：５０〜約２１．５：５０、約１１６．５：５０〜約２７：５０、約１１６．５：５０〜約３３．５：５０、約１１６．５：５０〜約４１：５０、約１１６．５：５０〜約５０：５０、約１１６．５：５０〜約６１：５０、約１１６．５：５０〜約７５：５０、または約１１６．５：５０〜約９３：５０である。

【0101】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約２００：５０〜約２．５：５０、約２００：５０〜約５．５：５０、約２００：５０〜約８．５：５０、約２００：５０〜約１２．５：５０、約２００：５０〜約１５．５：５０、約２００：５０〜約２１．５：５０、約２００：５０〜約２７：５０、約２００：５０〜約３３．５：５０、約２００：５０〜約４１：５０、約２００：５０〜約５０：５０、約２００：５０〜約６１：５０、約２００：５０〜約７５：５０、約２００：５０〜約９３：５０、約２００：５０〜約１１６．５：５０、または約２００：５０〜約１５０：５０である。

【0102】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合は、約５０：１、約５０：２．５、約５０：５．５、約５０：８．５、約５０：１２．５、約５０：１５．５、約５０：２１．５、約５０：２７、約５０：３３．５、約５０：４１、約５０：５０、約５０：６１、約５０：７５、約５０：９３、約５０：１１６．５、約５０：１５０、約５０：２００、約５０：２８３．５、約５０：４５０、または約５０：９５０である。

【0103】

所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む培地中のフコース源の量は、系の構成要素、例えば、宿主細胞の種類、宿主細胞の数、タンパク質産生率、ならびにタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合に大きく依存する。いくつかの実施形態において、フコース源は、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである。いくつかの実施形態において、フコース源は、約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０４ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０３ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０２ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０４ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０３ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０４ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．６ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０７ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０７ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０７ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０８ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０８ｍＭ〜約０．９ｍＭ、または約０．０９ｍＭ〜約０．１ｍＭである。いくつかの実施形態において、フコース源は、約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．１１ｍＭ、約０．１２ｍＭ、約０．１３ｍＭ、約０．１４ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約０．１６ｍＭ、約０．１７ｍＭ、約０．１８ｍＭ、約０．１９ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、または約１ｍＭである。

【0104】

ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質の産出方法も提供され、本方法は、タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含み、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地は、フコース源を、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合で前記タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量で含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するＦｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有さず、Ｆｃ含有タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するＦｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、Ｆｃ含有タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するＦｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、抗体を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有する抗体の産生方法が提供され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、抗体を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合で抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ及びＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0105】

いくつかの実施形態において、ＦＸ活性を実質的に有しない宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ遺伝子破壊を有する宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ活性を実質的に有しない宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するＦｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ活性を実質的に有さず、Ｆｃ含有タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するＦｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ遺伝子破壊を有し、Ｆｃ含有タンパク質を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するＦｃ含有タンパク質の産生方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でＦｃ含有タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、抗体を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有する抗体の産生方法が提供され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まず、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ遺伝子破壊を有し、抗体を培地中で発現するように操作された宿主細胞を培養することを含む方法が提供され、培地は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合で抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生するのに十分な量でフコース源を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0106】

いくつかの実施形態において、タンパク質の強化されたＡＤＣＣ機能は、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルが減少していない野生型宿主から産生されたタンパク質と比較したものである。いくつかの実施形態において、タンパク質の強化されたＡＤＣＣ機能は、タンパク質のフコシル化形態と比較したものである。いくつかの実施形態において、タンパク質の強化されたＡＤＣＣ機能は、野生型タンパク質と比較したものである。いくつかの実施形態において、タンパク質のＡＤＣＣ機能は、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルが減少していない野生型宿主から産生されたタンパク質と比較して、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、または１００倍強化される。

【0107】

いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＡＤＣＣアッセイによって決定される。ＡＤＣＣアッセイ、及びＡＤＣＣ機能の決定方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｔａｄａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９，２０１４，ｅ９５７８７、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，４１４，２０１４，６９−８１を参照されたい。例えば、タンパク質のＡＤＣＣ機能は、Ｆｃ含有タンパク質などのタンパク質を、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などのその表面上にＦｃ受容体を発現するエフェクター細胞、及び標的細胞と共にインキュベートすることによって決定することができる。標的疾患細胞に結合したタンパク質のＦｃ領域がＦｃ受容体とかみ合うと、Ｆｃ受容体は、エフェクター細胞内で細胞内シグナルを伝達し、標的細胞の排除を引き起こす。続いて、標的細胞を、シンチレーションカウンターまたは分光光度法を用いて細胞内標識の放出によって測定する。これらの方法には、クロム−５１放出アッセイ、ユーロピウム放出アッセイ、及び硫黄−３５放出アッセイが挙げられる。例えば、標的細胞溶解を、例えば、特定のプローブの事前標識した標的細胞からの特定のプローブの放出を、^５１Ｃｒもしくは蛍光色素、例えば、カルセイン−ＡＭ４４、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ）、もしくはユーロピウムを使用して測定することによって、または乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）もしくはＡＴＰなどの細胞質内酵素の放出を測定することによって、評価することができる。ＡＤＣＣ機能を評価するための他のアッセイには、例えば、標的細胞中に天然に存在する酵素の放出を測定する結合生物発光方法（ＡＣＥＬＬＡ（商標）ＴＯＸ；Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。標的細胞標識ステップは必要とされず、放射性薬剤も使用しない。

【0108】

いくつかの実施形態において、タンパク質のＡＤＣＣ機能はＡＤＣＣアッセイによって決定され、このＡＤＣＣアッセイはＮＫ細胞を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質のＡＤＣＣ機能はＡＤＣＣアッセイによって決定され、このＡＤＣＣアッセイはＰＢＭＣを含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣアッセイはインビトロアッセイである。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣアッセイはインビボアッセイである。

【0109】

いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＦＣγＩＩＩ結合アッセイによって決定される。例えば、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３８５，２０１２，４５−５０を参照されたい。代理結合方法をＡＤＣＣ機能の評価に使用してもよい。一般に、これらの方法は、細胞表面標的抗原への相補性決定領域（ＣＤＲ）の結合及びＦｃγＲへのＦｃの結合を、別々にまたは同時に測定する。様々なフローサイトメトリー及びプレート系の形式をＣＤＲ及びＦｃγＲ結合アッセイに使用することができる。組換えタンパク質受容体結合及びＣ１ｑ結合アッセイは、表面プラズモン共鳴及び酵素結合免疫吸着法を含むいくつかのプラットフォームによって開発されている。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＥＬＩＳＡ系アッセイによって決定される。

【0110】

タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるタンパク質のフコシル化レベルの調整方法も提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地が、フコース源を含む、培養することと、タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるタンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、培地がフコース源を含む、培養することと、タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるＦｃ含有タンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地が、フコース源を含む、培養することと、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるＦｃ含有タンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、培地がフコース源を含む、培養することと、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、抗体を産生するように操作された宿主細胞によって産生される抗体のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、培地が、フコース源を含む、培養することと、抗体のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、抗体を産生するように操作された宿主細胞によって産生される抗体のフコシル化レベルの調整方法であって、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、培地がフコース源を含む、培養することと、抗体のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む、方法。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ及びＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0111】

いくつかの実施形態において、ＦＸ活性を実質的に有さず、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるタンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、培地がフコース源を含む、培養することと、タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ遺伝子破壊を有し、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるタンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、培地がフコース源を含む、培養することと、タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるＦｃ含有タンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まず、培地が、フコース源を含む、培養することと、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ遺伝子破壊を有し、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞によって産生されるＦｃ含有タンパク質のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、培地がフコース源を含む、培養することと、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、Ｆｃ含有タンパク質が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、抗体を産生するように操作された宿主細胞によって産生される抗体のフコシル化レベルの調整方法が提供され、本方法は、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まず、培地が、フコース源を含む、培養することと、抗体のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸ遺伝子破壊を有し、抗体を産生するように操作された宿主細胞によって産生される抗体のフコシル化レベルの調整方法であって、宿主細胞を初期培地中で培養することであって、培地がフコース源を含む、培養することと、抗体のフコシル化レベルを決定することと、培地中のフコース源の量を、抗体が所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生されるように調整することと、を含む、方法。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0112】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態を決定することを含む、タンパク質のフコシル化レベルの決定方法が提供される。タンパク質のフコシル化形態の決定方法は、本明細書の適用に記載される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化レベルの決定は、タンパク質の脱フコシル化形態を含む。タンパク質の脱フコシル化形態の決定方法は、本明細書の適用に記載される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化レベルの決定は、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の決定を含む。

【0113】

いくつかの実施形態において、フコシル化及び／または脱フコシル化レベルは、培養ステップ中に決定される。いくつかの実施形態において、フコシル化及び／または脱フコシル化レベルは、宿主細胞の培養中に１回超決定される。いくつかの実施形態において、培地中のフコース源の量は、フコシル化及び／または脱フコシル化レベルの決定後に調整される。いくつかの実施形態において、フコース源の量は、フコシル化及び／または脱フコシル化レベルの決定後に調整される。いくつかの実施形態において、フコース源の量は、宿主細胞の培養中に１回超調整される。

【0114】

いくつかの実施形態において、フコース源の量をフコシル化レベルが低い時に増加させることを含む、初期培地中のフコース源の量の調整方法が提供される。いくつかの実施形態において、初期培地中のフコース源の量を増加させることは、フコース源をボーラス添加によって初期培地に添加することを含む。いくつかの実施形態において、初期培地中のフコース源の量を増加させることは、フコース源を含む第２の培地をボーラス添加によって初期培地に添加することを含み、第２の培地中のフコース源の量は、初期培地中のフコース源の量を上回る。いくつかの実施形態において、初期培地中のフコース源の量を増加させることは、フコース源を連続流加によって初期培地に添加することを含む。いくつかの実施形態において、初期培地中のフコース源の量を増加させることは、フコース源を含む第２の培地を連続流加によって初期培地に添加することを含み、第２の培地中のフコース源の量は、初期培地中のフコース源の量を上回る。

【0115】

いくつかの実施形態において、初期培地中のフコース源の量をフコシル化レベルが高い時に減少させることを含む、初期培地中のフコース源の量の調整方法が提供される。いくつかの実施形態において、初期培地中のフコース源の量を減少させることは、フコース源を欠く第２の培地を添加することを含む。いくつかの実施形態において、初期培地中のフコース源の量を減少させることは、初期培地と比較した場合に減少したレベルのフコース源を含む第２の培地を添加することを含む。

【0116】

本出願は、いくつかの態様において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の生物学的活性の比較方法を提供し、本方法は、脱フコシル化タンパク質の生物学的活性を、タンパク質のフコシル化形態と比較することを含み、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化タンパク質の生物学的活性を、タンパク質のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化Ｆｃ含有タンパク質の生物学的活性を、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、Ｆｃ含有タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、Ｆｃ含有タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化Ｆｃ含有タンパク質の生物学的活性を、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、Ｆｃ含有タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、Ｆｃ含有タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、脱フコシル化抗体の生物学的活性を、抗体のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、抗体の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、抗体を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化抗体の生物学的活性を、抗体のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、抗体の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子破壊を有し、抗体を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ及びＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0117】

いくつかの実施形態において、脱フコシル化タンパク質の生物学的活性を、タンパク質のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化タンパク質の生物学的活性を、タンパク質のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、ＦＸ遺伝子破壊を有し、タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化Ｆｃ含有タンパク質の生物学的活性を、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、Ｆｃ含有タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、Ｆｃ含有タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化Ｆｃ含有タンパク質の生物学的活性を、Ｆｃ含有タンパク質のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、Ｆｃ含有タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、ＦＸ遺伝子破壊を有し、Ｆｃ含有タンパク質を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、脱フコシル化抗体の生物学的活性を、抗体のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、抗体の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、抗体を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生され、宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、脱フコシル化抗体の生物学的活性を、抗体のフコシル化形態と比較することを含む方法が提供され、抗体の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、ＦＸ遺伝子破壊を有し、抗体を産生するように操作された同じ宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ及びＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0118】

タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を同じ宿主細胞から産生させることにより、類似の産物品質属性と、フコシル化状況によるものとするタンパク質のフコシル化形態と脱フコシル化形態との間の生物学的活性の差異とを有するタンパク質の形態を生成できるようになる。

【0119】

いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態は、フコース源を含まない第１の細胞培養において宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、フコース源を含む第２の細胞培養において宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、ａ）タンパク質の脱フコシル化形態を、フコース源を含まない第１の細胞培養における宿主細胞の培養によって産生させること、ｂ）脱フコシル化タンパク質を単離すること、ｃ）フコース源を含む第２の細胞培養における宿主細胞の培養によって産生させること、ｄ）フコシル化タンパク質を単離すること、ならびにｅ）タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の生物学的活性を比較すること、を含む、方法が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の生物学的活性を比較することを含む方法が提供され、タンパク質のフコシル化形態は第１の細胞培養において産生され、タンパク質の脱フコシル化形態は第２の細胞培養において産生される。

【0120】

いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態は、フコース源を含む培地において宿主細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、培地中のフコース源の量は、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである。一般に、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態が同じ培地において宿主細胞によって産生される場合、タンパク質のフコシル化形態と脱フコシル化形態とを分離する必要がある。タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の分離は、例えば、ＬＣＡプルダウン技法を使用して達成することができる。例えば、Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｄｙｎ，２３９，２０１０，３３８０−３３９０、及びＪｉｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ，２００３，５１，５９７−６０４を参照されたい。

【0121】

タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の生物学的活性は、タンパク質の単離したフコシル化形態及び脱フコシル化形態を使用して比較され得る。いくつかの実施形態において、生物学的活性の比較はインビトロで実行される。いくつかの実施形態において、生物学的活性の比較はインビボで実行される。いくつかの実施形態において、生物学的活性はＡＤＣＣ機能である。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＡＤＣＣアッセイによって決定される。ＡＤＣＣアッセイは、当該技術分野で周知であり、本明細書の適用に記載される。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能は代理ＡＤＣＣアッセイによって決定される。代理ＡＤＣＣアッセイは、当該技術分野で周知であり、本明細書の適用に記載される。いくつかの実施形態において、代理ＡＤＣＣアッセイはＦＣγＲＩＩＩ結合アッセイである。いくつかの実施形態において、ＡＤＣＣ機能はＦＣγＲＩＩＩ結合アッセイによって決定される。ＦＣγＲＩＩＩ結合アッセイは、当該技術分野で周知であり、本明細書の適用に記載される。

【0122】

本出願は、いくつかの態様において、タンパク質のフコシル化形態及び／または脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞の特定方法を提供する。

【0123】

タンパク質のフコシル化形態及び／または脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞の特定に好適な方法は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、フコシル化タンパク質を産生することができる宿主細胞の特定は、細胞レベルで決定される。いくつかの実施形態において、脱フコシル化タンパク質を産生することができる宿主細胞の特定は、細胞レベルで決定される。例えば、レンチルレクチン（ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＬＣＡ）系アッセイを使用して、タンパク質のフコシル化形態及び／または脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞を細胞レベルで特定することができる。例えば、Ｏｋｅｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１１０，５４０４−５４０９を参照されたい。ＬＣＡはグリカンなどの炭水化物をコアフコースと結合させる。フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役ＬＣＡ（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）などの標識されたＬＣＡを使用して、宿主細胞表面上のフコシル化グリカンを結合し得る。続く蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の使用を使用して、タンパク質のフコシル化形態及び／または脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞を特定し得る。いくつかの実施形態において、フコシル化形態を産生することができる宿主細胞の特定が行われる。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞の特定が行われる。いくつかの実施形態においては、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞の特定が行われ、ここでは、宿主細胞を、フコースを含む培地において培養した後で評価し、またそれとは別に、宿主細胞を、フコースを欠く培地において培養した後で評価する。

【0124】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態を産生することができる宿主細胞は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって特性される。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって特定される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によって特定される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態を産生することができる宿主細胞は、ＬＣＡ系アッセイによって特定される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役レンチルレクチン（ＬＣＡ）で染色される。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態を産生することができる宿主細胞は、ＬＣＡ系アッセイによって特定される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役レンチルレクチン（ＬＣＡ）で染色されない。

【0125】

本出願は、いくつかの態様において、タンパク質のフコシル化形態及び／または脱フコシル化形態の決定方法を提供する。

【0126】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態がグリカン構造レベルで決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態がグリカン構造レベルで決定される方法が提供される。本明細書で使用される場合、「グリカン構造レベル」は、単離したグリカン構造を使用する、フコシル化または脱フコシル化の分析を指す。一般に、グリカン構造レベルでのフコシル化または脱フコシル化の決定方法は、グリカン構造をタンパク質から切断することを伴う。グリカン構造をタンパク質から切断する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｚａｂｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８２，２０１０，２５８８−２５９３、及びＭｕｌｌｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４７，２００９を参照されたい。いくつかの実施形態において、グリカン構造は酵素的切断によって切断される。いくつかの実施形態において、酵素はＮ結合型グリカン構造に特異的である。いくつかの実施形態において、ＰＮＧａｓｅ Ｆを使用して、グリカン構造をタンパク質から切断する。

【0127】

次に、単離したグリカン構造を分析して、グリカン構造の組成、例えば、フコシル化の存否を決定する。グリカン構造の分析方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｍｕｌｌｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４７，２００９を参照されたい。一般に、グリカン構造の混合物は、例えば、キャピラリー電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーによって分離することになる。次に、後続の分析方法を使用して、グリカン構造の混合物中に存在するグリカン構造の種類を特定する。

【0128】

いくつかの実施形態において、グリカン構造のフコシル化形態がキャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、グリカン構造の脱フコシル化形態がＣＥによって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、グリカン構造のフコシル化形態が質量分析（ＭＳ）によって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、グリカン構造の脱フコシル化形態がＭＳによって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、グリカン構造のフコシル化形態が核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、グリカン構造の脱フコシル化形態がＮＭＲによって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、グリカン構造のフコシル化形態がシンチレーションによって決定される方法が提供され、このシンチレーションでは、フコースは放射性標識されたフコースである。いくつかの実施形態において、グリカン構造の脱フコシル化形態が標識系アッセイによって決定される方法が提供され、この標識系アッセイでは、グリカン構造の遊離還元末端は蛍光タグなどのタグによって標識される。

【0129】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態がタンパク質レベルで決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態がタンパク質レベルで決定される方法が提供される。本明細書で使用される場合、「タンパク質レベル」は、グリカン構造に結合したタンパク質（例えば、糖タンパク質）を使用する、フコシル化または脱フコシル化の分析を指す。タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態のタンパク質レベルでの決定方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｂａｌａｇｕｅｒ＆Ｎｅｕｓｕｓｓ，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，７８，２００６，５３８４−５３９３を参照されたい。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は質量分析（ＭＳ）によって決定される。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態がＭＳによって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態がトップダウン型ＭＳによって決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態がトップダウン型ＭＳによって決定される方法が提供される。

【0130】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態がグリカン構造レベル及びタンパク質レベルで決定される方法が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質の脱フコシル化形態がグリカン構造レベル及びタンパク質レベルで決定される方法が提供される。

【0131】

培地及び培養方法
本明細書の実施形態に記載される所望のタンパク質の産生に使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。一般に、該培地のフコース含有量を知ることになる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＭＥＭ），（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ），Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地が宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚ，５８，１９７９，Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０２，１９８０、米国特許第４，７６７，７０４号、同第４，６５７，８６６号、同第４，９２７，７６２号、同第４，５６０，６５５号、もしくは同第５，１２２，４６９号、国際特許出願第ＷＯ９０／０３４３０号もしくは同第ＷＯ８７／００１９５号、または米国特許再発行第３０，９８５号に記載されている培地のうちのいずれかを、本宿主細胞のための培地として使用してもよい。これらの培地のいずれにも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量要素（マイクロモルの範囲の最小濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。いくつかの実施形態において、培地はグルコース源を更に含む。いくつかの実施形態において、培地はマンノース源を更に含む。任意の他の必要な補充物もまた、当業者には既知であろう適切な濃度で含まれ得る。

【0132】

いくつかの実施形態において、培地はフコース源を含まない。いくつかの実施形態において、培地はフコース源を含む。本明細書で使用される場合、「フコース源」は、フコシル化経路に関与するフコースを含む部分を指す。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。いくつかの実施形態において、培地はフコース源を含み、培地中のフコース源の量は約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである。いくつかの実施形態において、フコース源は、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである。いくつかの実施形態において、フコース源は、約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０４ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０３ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．０２ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０４ｍＭ、約０．０２ｍＭ〜約０．０３ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０３ｍＭ〜約０．０４ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．６ｍＭ、約０．０４ｍＭ〜約０．０５ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０５ｍＭ〜約０．０６ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０６ｍＭ〜約０．０７ｍＭ、約０．０７ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０７ｍＭ〜約０．０９ｍＭ、約０．０７ｍＭ〜約０．０８ｍＭ、約０．０８ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０８ｍＭ〜約０．９ｍＭ、または約０．０９ｍＭ〜約０．１ｍＭである。いくつかの実施形態において、フコース源は、約０．０１ｍＭ、約０．０２ｍＭ、約０．０３ｍＭ、約０．０４ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．０６ｍＭ、約０．０７ｍＭ、約０．０８ｍＭ、約０．０９ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．１１ｍＭ、約０．１２ｍＭ、約０．１３ｍＭ、約０．１４ｍＭ、約０．１５ｍＭ、約０．１６ｍＭ、約０．１７ｍＭ、約０．１８ｍＭ、約０．１９ｍＭ、約０．２ｍＭ、約０．３ｍＭ、約０．４ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．６ｍＭ、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、または約１ｍＭである。

【0133】

宿主細胞の培地における培養方法は当業者に周知である。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ，２，２０１０を参照されたい。いくつかの実施形態において、宿主細胞の培養は、宿主細胞を、フコース源を含む培地中で培養する前に、宿主細胞を、フコース源を含まない培地中で培養することを含む。いくつかの実施形態において、フコース源は、培養ステップの開始時に培地中に存在する。いくつかの実施形態において、フコース源は、培養ステップ中に培地に添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は、例えば、少なくとも２×１０^５細胞／ｍＬの細胞密度で添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は、例えば、５０％の溶存Ｏ_２の酸素レベルで添加される。いくつかの実施形態において、フコース源、例えば、６ｇ／Ｌのグルコースレベルで添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は培養ステップの開始時に培地中に存在し、フコース源は培養ステップ中に添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は、ボーラス添加によって培養ステップ中に培地に添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は、連続流加によって培養ステップ中に培地に添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は、ボーラス添加によって培地に添加される。いくつかの実施形態において、フコース源は、連続流加によって培地に添加される。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0134】

温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞にこれまでに使用されているものであり得、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、培養ステップは、約３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、または３０℃未満で実行される。いくつかの実施形態において、培養ステップは、約３７℃未満で実行される。いくつかの実施形態において、培養ステップは、約３４℃未満で実行される。いくつかの実施形態において、培養ステップは、約３７℃で実行される。いくつかの実施形態において、培養ステップは、約３４℃で実行される。いくつかの実施形態において、培養ステップは、初期温度で実行された後、第２の温度に移行する。いくつかの実施形態において、初期温度は約３７℃であり、第２の温度は約３４℃である。いくつかの実施形態において、初期温度は約３４℃であり、第２の温度は約３７℃である。

【0135】

一般に、タンパク質の産生は、大規模（商業規模など）で行われる。商業規模の産生に好適な宿主細胞の集団を獲得するために、当業者は、段階的アプローチを使用して宿主細胞集団を拡大することの有用性を認識するであろう。例えば、本プロセスは、シードトレインなど、所望の宿主細胞をより小規模で成長させて宿主細胞集団の増大を可能にすることを伴う。宿主細胞の集団を更に増大させるために、方法は、シードトレインを使用して、より大きい種菌タンクなどの培養タンクに植菌することを伴う。多くの場合、サイズが漸増する一連の種菌タンクを使用して、種菌トレインなどの宿主細胞の集団を拡大させる。このプロセスにより、産生培地における培養に好適な宿主細胞集団が提供されることになる。いくつかの実施形態において、産生培地は１０００Ｌの培養タンクである。

【0136】

いくつかの実施形態において、バッチ流加法を使用する宿主細胞の培養を含む、タンパク質の作製方法が提供される。いくつかの実施形態において、連続流加法を使用する宿主細胞の培養を含む、タンパク質の作製方法が提供される。いくつかの実施形態において、バッチ流加法と連続流加法とを含む流加方法を使用する宿主細胞の培養を含む、Ｆｃ含有タンパク質の作製方法が提供される。

【0137】

本出願は、他の態様において、本明細書の実施形態に記載のいずれかの宿主細胞と、低レベルのフコース源を含む培地とを含む細胞培養を提供する。いくつかの実施形態において、細胞培養は、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態を更に含み得る。いくつかの実施形態において、細胞培養は、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態を特定の割合で更に含み得る。いくつかの実施形態において、タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であって、本宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞と、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む培地と、を含む、細胞培養が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であって、本宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、本宿主細胞が、ノックアウト宿主細胞である、宿主細胞と、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む培地と、を含む、細胞培養が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であって、本宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞と、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む培地と、を含み、本タンパク質が、Ｆｃ含有タンパク質である、細胞培養が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であって、本宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、本宿主細胞が、ノックアウト宿主細胞である、宿主細胞と、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む培地と、を含み、本タンパク質が、Ｆｃ含有タンパク質である、細胞培養が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であって、本宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞と、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む培地と、を含み、本タンパク質が、抗体である、細胞培養が提供される。いくつかの実施形態において、タンパク質を発現するように操作された宿主細胞であって、本宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まず、本宿主細胞が、ノックアウト宿主細胞である、宿主細胞と、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む培地と、を含み、本タンパク質が、抗体である、細胞培養が提供される。いくつかの実施形態において、所定の割合でタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を発現する宿主細胞を含む細胞培養が提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＦＸ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ及びＧＭＤ活性を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0138】

いくつかの実施形態において、細胞培養は、宿主細胞を成長環境に維持する。いくつかの実施形態において、細胞培養は、宿主細胞をタンパク質産生環境に維持する。いくつかの実施形態において、このタンパク質は、所定の割合でフコシル化形態及び脱フコシル化形態で産生される。

【0139】

いくつかの実施形態において、培地は、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭで含む。いくつかの実施形態において、培地は、フコース源を約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭで含む。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0140】

いくつかの実施形態において、細胞培養はシード培養である。いくつかの実施形態において、細胞培養は植菌培養である。いくつかの実施形態において、この植菌培養は主に種菌培養である。いくつかの実施形態において、この種菌培養は二次種菌である。いくつかの実施形態において、細胞培養系は産生培養を含む。

【0141】

いくつかの実施形態において、細胞培養は特定の温度で維持される。いくつかの実施形態において、特定の温度は約１５℃〜約４５℃である。いくつかの実施形態において、特定の温度は約３０℃である。いくつかの実施形態において、特定の温度は約３７℃未満である。いくつかの実施形態において、特定の温度は約３５℃未満である。いくつかの実施形態において、特定の温度は約３４℃未満である。

【0142】

いくつかの実施形態において、細胞培養は特定のｐＨで維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養は特定の溶存酸素濃度で維持される。いくつかの実施形態において、細胞培養は特定の栄養素レベルで維持される。

【0143】

いくつかの実施形態において、細胞培養系は、本明細書の実施形態に記載の単数のタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養は、本明細書の実施形態に記載の複数のタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、細胞培養は、本明細書の実施形態に記載のタンパク質を含む組成物を含む。

【0144】

宿主細胞
本出願は、いくつかの態様において、タンパク質発現のための宿主細胞を提供し、本宿主細胞は、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない。

【0145】

用いられ得る宿主細胞には、酵母または高等真核細胞などの真核細胞がある。高等真核細胞には、昆虫細胞、及び哺乳動物期限の樹立細胞株が挙げられる。

【0146】

好適な哺乳動物宿主細胞の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２３，１９８１）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、もしくはそれらの誘導体、例えば、無血清培地中で成長するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ及び関連の細胞株（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，１９９８）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０）細胞株、及びＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１０，１９９１によって説明されているアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ ＥＢＮＡ、もしくはＭＳＲ ２９３などのヒト胎児腎臓細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換された霊長類細胞株、正常２倍体細胞、霊長類組織のインビトロ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫ、またはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。任意に、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３、またはＳ４９などの哺乳動物細胞株を宿主細胞として使用することができる。

【0147】

いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。ＣＨＯ細胞は当該技術分野で周知である。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２９，２０１１を参照されたい。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＤＰ１２宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＤＵＸＢ−１１由来ＤＨＦＲ欠乏ＤＰ１２宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ−Ｋ１宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＤＨＦＲ陽性ＣＨＯ−Ｋ１宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯＫ１Ｍ宿主細胞である。

【0148】

いくつかの実施形態において、宿主細胞はマウス宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＳｐ２／０宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はＮＳ０宿主細胞である。

【0149】

いくつかの実施形態において、宿主細胞はハイブリドーマである。いくつかの実施形態において、ハイブリドーマは抗体産生細胞であり、この抗体産生細胞は、宿主細胞の抗原による免疫付与の後に宿主から収集される。いくつかの実施形態において、抗体産生細胞は骨髄腫細胞と融合する。いくつかの実施形態において、宿主細胞はマウス骨髄腫由来細胞株である。

【0150】

代替として、宿主細胞は酵母などの下等真核生物であり得る。好適な酵母には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、Ｃａｎｄｉｄａ、または異種ポリペプチドを発現することができる任意の酵母が挙げられる。

【0151】

本明細書で使用される場合、「ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない」は、不活性化されていない野生型ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、それぞれ、４０％以下のＦＸまたはＧＭＤ活性を含む宿主細胞を指す。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、それぞれ、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下のＦＸまたはＧＭＤ活性を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＦＸを含む宿主細胞と比較して、２０％、１５％、１０％、または５％以下のＦＸ活性を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＦＸを含む宿主細胞と比較して、ＦＸ活性を含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＧＭＤを含む宿主細胞と比較して、２０％、１５％、１０％、または５％以下のＧＭＤ活性を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＧＭＤを含む宿主細胞と比較して、ＧＭＤ活性を含まない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＦＸ及びＧＭＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、２０％、１５％、１０％、または５％以下のＦＸ及びＧＭＤ活性を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されていない野生型ＦＸ及びＧＭＤ遺伝子を含む宿主細胞と比較して、ＦＸ及びＧＭＤ活性を含まない。

【0152】

ＦＸ及びＧＭＤは、サルベージ経路に属し、Ｌ−フコースからＧＰＤ−フコースを産生する酵素である。Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｌｏｗｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１４５５，１９９９，１９３−２０４を参照されたい。サイトゾルにおいて、ＦＸは、Ｌ−フコースをＬ−フコース−１−ホスフェートに変換し、ＧＭＤは、Ｌ−フコース−１−ホスフェートをＧＰＤ−フコースに変換する。その後、ＧＰＤ−フコースはゴルジ内腔に輸送され、そこでグリカン構造をフコシル化するために使用される基質として働く。

【0153】

いくつかの実施形態において、宿主細胞におけるＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は不活性化される。本明細書で使用される場合、「不活性化」は、機能的遺伝子の翻訳、または今後生じる可能性のある翻訳（即ち、機能的酵素の発現）を阻害することを指す。不活性化は、転写、翻訳、及びタンパク質発現を含むがこれらに限定されない、遺伝子発現のいずれの段階またはプロセスにおいても生じ得、また不活性化は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、及びポリペプチドを含むがこれらに限定されない、いずれの遺伝子または遺伝子産物にも影響し得る。

【0154】

いくつかの実施形態において、宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は不活性化され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ活性はＤＮＡレベルに基づく。いくつかの実施形態において、宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は不活性化され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ活性はＲＮＡレベルに基づく。いくつかの実施形態において、宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は不活性化され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ活性はポリペプチドレベルに基づく。

【0155】

ノックアウト宿主細胞の産生方法も本出願で提供される。例えば、方法には、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、及びメガヌクレアーゼ系の使用が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、遺伝子欠失、または遺伝子付加もしくは置換を含む。

【0156】

一般に、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、この宿主細胞の産生方法は、宿主細胞のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む。宿主細胞中でＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化するための方法及び技法には、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；ショートヘアピン型ＲＮＡとも称される）、クラスターを形成し規則正しい間隔を持つ短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、相同的組換え、非相同的末端結合、メガヌクレアーゼ、及び酵素阻害が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，Ｍａｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３，２０１３、Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３２，２０１４、Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３１，２０１４、及びＳｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１１，２０１１を参照されたい。

【0157】

一般に、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９などのカスパーゼタンパク質とヌクレオチド配列を含むＲＮＡ配列とを含み得、目的とする配列に相補的であり、ガイド配列と称される。カスパーゼ及びＲＮＡ配列は、宿主細胞のＤＮＡ配列を特定する複合体を形成し、その後、カスパーゼのヌクレアーゼ活性により、ＤＮＡ鎖の切断が可能となる。カスパーゼアイソタイプは、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡヌクレアーゼ活性を有する。ＣＲＩＳＰＲ系で使用されるガイドＲＮＡ配列の設計及びガイドＲＮＡ配列の数により、遺伝子の特定のストレッチの除去及び／またはＤＮＡ配列の付加が可能となる。

【0158】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む。いくつかの実施形態において、コード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ遺伝子を含むコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＡＳ遺伝子を含むコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＡＳ９遺伝子を含むコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＡＳ９遺伝子をコードするコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＡＳ９タンパク質と相互作用することができるＲＮＡ分子をコードするコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）単位を含むＲＮＡ分子をコードするコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供され、このｇＲＮＡ単位は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供され、このｇＲＮＡ単位は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）単位を含むＲＮＡ分子をコードするコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ単位及びｔｒａｃｒＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子をコードするコード化ベクターを含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供され、このｇＲＮＡ単位は、遺伝子配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ単位及びｔｒａｃｒＲＮＡ単位を含むＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供され、このｇＲＮＡ単位は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、以下を含むＣＲＩＳＰＲ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される：ａ）ｇＲＮＡ単位を含む第１のＲＮＡ分子であって、このｇＲＮＡ単位が、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の一部に相補的な第１のヌクレオチド配列を含む、第１のＲＮＡ分子、及びｂ）ｇＲＮＡ単位を含む第２のＲＮＡ分子であって、このｇＲＮＡ単位が、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の一部に相補的な第２のヌクレオチド配列を含む、第２のＲＮＡ分子。いくつかの実施形態において、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は異なる。いくつかの実施形態において、第１のヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列に相補的なＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の部分の領域とは異なる場所にあるＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の一部に相補的である。

【0159】

いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターを使用してＣＲＩＳＰＲ系を含むベクターを送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはアデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ベクターはプロモーターを含む。

【0160】

一般に、本明細書で使用されるＴＡＬＥＮ系は、ＤＮＡ配列の認識及び続く二本鎖ＤＮＡの切断を可能にする、１つ以上の制限ヌクレアーゼ及び２つ以上のタンパク質複合体を含み得る。ＴＡＬＥＮ系のタンパク質複合体は、各々が特定のヌクレオチドと制限ヌクレアーゼのドメインとを認識するいくつかの転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）を含む。一般に、ＴＡＬＥＮ系は、制限ヌクレアーゼの２つのドメイン（各タンパク質複合体から１つ）が活性なヌクレアーゼを形成し、特定のＤＮＡ配列を切断する様式で、各々がＴＡＬＥと制限ヌクレアーゼのドメインとを含む２つのタンパク質複合体が個々にＤＮＡ配列に結合することになるように、設計される。ＴＡＬＥＮ系におけるタンパク質複合体及び切断されることになる配列の数の設計により、遺伝子の特定のストレッチの除去及び／またはＤＮＡ配列の付加が可能となる。

【0161】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が低下したレベルのＦＸ活性またはＧＭＤ活性を有する、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ単位を含むＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ単位は、第１のＴＡＬＥＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１個の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及び第１のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第１のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第１のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したＴＡＬＥは第１のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ単位は、第２のＴＡＬＥＮ結合単位を更に含む。いくつかの実施形態において、第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１つの転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）と第２のヌクレアーゼドメインとを含む。いくつかの実施形態において、第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第２のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第２のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したＴＡＬＥは第２のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ結合単位及び第２のＴＡＬＥＮ結合単位は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第２のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第２のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第２のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性な制限エンドヌクレアーゼを構成する。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性なＦｏｋ１酵素を構成する。

【0162】

いくつかの実施形態において、第２のＴＡＬＥＮ単位を更に含むＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、第２のＴＡＬＥＮ単位は、第３のＴＡＬＥＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態において、第３のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１個の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及び第３のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、第３のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第３のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第３のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第３のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したＴＡＬＥは第３のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第２のＴＡＬＥＮ単位は、第４のＴＡＬＥＮ結合単位を更に含む。いくつかの実施形態において、第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも１個の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）及び第４のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第４のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＴＡＬＥと、第４のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのＴＡＬＥは共に連結し、連結したＴＡＬＥはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したＴＡＬＥは第４のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第３のＴＡＬＥＮ結合単位及び第４のＴＡＬＥＮ結合単位は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第４のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第４のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第４のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性な制限エンドヌクレアーゼを構成する。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性なＦｏｋ１酵素を構成する。

【0163】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＴＡＬＥＮ系は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の異なる非重複部分に結合する第１のＴＡＬＥＮ単位及び第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。

【0164】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位をコードするコード化ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位をコードするコード化ベクターを含み、かつＴＡＬＥＮ系は、第２のＴＡＬＥＮ単位をコードするコード化ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位をコードするコード化ベクターを含み、かつＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位及び第２のＴＡＬＥＮ単位をコードするコード化ベクターを含む。

【0165】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＴＡＬＥＮ系は第１のＴＡＬＥＮ単位を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＴＡＬＥＮ系は第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＴＡＬＥＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＴＡＬＥＮ系は、第１のＴＡＬＥＮ単位及び第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。

【0166】

いくつかの実施形態において、第１のＴＡＬＥＮ結合単位は連結したＴＡＬＥの群を含み、このＴＡＬＥの群はヌクレオチド配列を認識する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子プロモーターの一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子のフランキング配列の一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、本配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の一部に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態において、本配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子プロモーターの一部に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態において、本配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子のフランキング配列の一部に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。

【0167】

いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターを使用してＴＡＬＥＮ系を含むベクターを送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはアデノウイルスである。

【0168】

一般に、本明細書で使用されるＺＦＮ系は、ＤＮＡ配列の認識及び続く二本鎖ＤＮＡの切断を可能にする、１つ以上の制限ヌクレアーゼ及び２つ以上のタンパク質複合体を含み得る。ＺＦＮ系のタンパク質複合体は、各々が特定のヌクレオチドコドンと制限ヌクレアーゼのドメインとを認識するいくつかのジンクフィンガーを含む。一般に、ＺＦＮ系は、制限ヌクレアーゼの２つのドメイン（各タンパク質複合体から１つ）が活性なヌクレアーゼを形成し、特定のＤＮＡ配列を切断する様式で、各々がジンクフィンガーと制限ヌクレアーゼのドメインとを含む２つのタンパク質複合体が個々にＤＮＡ配列に結合することになるように、設計される。ＺＦＮ系におけるタンパク質複合体及び切断されることになる配列の数の設計により、遺伝子の特定のストレッチの除去及び／またはＤＮＡ配列の付加が可能となる。

【0169】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む。いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ単位を含むＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ単位は、第１のＺＦＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１個のジンクフィンガー及び第１のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第１のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第１のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したジンクフィンガーは第１のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ単位は、第２のＺＦＮ結合単位を更に含む。いくつかの実施形態において、第２のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１個のジンクフィンガー及び第２のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第２のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第２のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第２のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したジンクフィンガーは第２のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ結合単位及び第２のＺＦＮ結合単位は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第２のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第２のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第２のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性な制限エンドヌクレアーゼを構成する。いくつかの実施形態において、第１のヌクレアーゼドメイン及び第２のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性なＦｏｋ１酵素を構成する。

【0170】

いくつかの実施形態において、第２のＺＦＮ単位を更に含むＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、第２のＺＦＮ単位は、第３のＺＦＮ結合単位を含む。いくつかの実施形態において、第３のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１個のジンクフィンガー及び第３のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、第３のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第３のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第３のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第３のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したジンクフィンガーは第３のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第２のＺＦＮ単位は、第４のＺＦＮ結合単位を更に含む。いくつかの実施形態において、第４のＺＦＮ結合単位は、少なくとも１個のジンクフィンガー及び第４のヌクレアーゼドメインを含む。いくつかの実施形態において、第４のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第４のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識する。いくつかの実施形態において、第４のＺＦＮ結合単位は、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のジンクフィンガーと、第４のヌクレアーゼドメインとを含み、これらのジンクフィンガーは共に連結し、連結したジンクフィンガーはＦＸまたはＧＭＤヌクレオチド配列の一部を認識し、かつ連結したジンガーフィンガーは第４のヌクレアーゼドメインに更に連結する。いくつかの実施形態において、第３のＺＦＮ結合単位及び第４のＺＦＮ結合単位は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の異なる配列に結合する。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第４のヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第４のヌクレアーゼドメインは、制限エンドヌクレアーゼのドメインである。いくつかの実施形態において、第４のヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のドメインである。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性な制限エンドヌクレアーゼを構成する。いくつかの実施形態において、第３のヌクレアーゼドメイン及び第４のヌクレアーゼドメインは、会合して、活性なＦｏｋ１酵素を構成する。

【0171】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＺＦＮ系は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の異なる非重複部分に結合する第１のＺＦＮ単位及び第２のＴＡＬＥＮ単位を含む。

【0172】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位をコードするコード化ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位をコードするコード化ベクターを含み、かつＺＦＮ系は、第２のＺＦＮ単位をコードするコード化ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位をコードするコード化ベクターを含み、かつＺＦＮ系は、第１のＺＦＮ単位及び第２のＺＦＮ単位をコードするコード化ベクターを含む。

【0173】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＺＦＮ系は第１のＺＦＮ単位を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＺＦＮ系は第２のＺＦＮ単位を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＺＦＮ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含み、ここでは、ＺＦＮ系は第１のＺＦＮ単位及び第２のＺＦＮ単位を含む。

【0174】

いくつかの実施形態において、第１のＺＦＮ結合単位は連結したジンクフィンガーの群を含み、このジンクフィンガーの群はヌクレオチド配列を認識する。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子プロモーターの一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子のフランキング配列の一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、本配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の一部に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態において、本配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子プロモーターの一部に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。いくつかの実施形態において、本配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子のフランキング配列の一部に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相同である。

【0175】

いくつかの実施形態において、ＺＦＮ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターを使用してＺＦＮ系を含むベクターを送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはアデノウイルスである。

【0176】

一般に、本明細書で使用されるメガヌクレアーゼ系は、ＤＮＡ配列の認識及び続く二本鎖ＤＮＡの切断を可能にする１つ以上のメガヌクレアーゼを含み得る。

【0177】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、メガヌクレアーゼ系を使用したＧＭＤ遺伝子のＦＸの不活性化を含む。いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、約８〜約３５ヌクレオチド塩基対長のＤＮＡ認識配列を有する。いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼは、約１２〜約３０ヌクレオチド塩基対長のＤＮＡ認識配列を有する。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ認識配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ認識配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子プロモーターの一部を含む配列である。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ認識配列は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子のフランキング配列の一部を含む配列である。

【0178】

いくつかの実施形態において、メガヌクレアーゼ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターを使用してメガヌクレアーゼ系を含むベクターを送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、送達ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはアデノウイルスである。

【0179】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に有しないか、またはＧＭＤ活性を実質的に有しない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を更に含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を含む宿主細胞の産生方法が提供され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子欠失が検出される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を含む宿主細胞の産生方法が提供され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の付加または置換が検出される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を含む宿主細胞の産生方法が提供され、ＦＸまたはＧＭＤ発現のレベルは、宿主細胞中の遺伝子を不活性する前に決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を含む宿主細胞の産生方法が提供され、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルは、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化した後で決定される。いくつかの実施形態において、ＧＭＤ活性のＦＸのレベルの決定を含む宿主細胞の産生方法が提供され、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルは、ＴＡＬＥＮ系を使用して宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化した後で決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を含む宿主細胞の産生方法が提供され、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルは、ＺＦＮ系を使用して宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化した後で決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子不活性化のレベルの決定を含む宿主細胞の産生方法が提供され、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルは、メガヌクレアーゼ系を使用して宿主細胞中のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化した後で決定される。

【0180】

本明細書に開示される方法のいくつかにおいて、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルはＤＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルはＲＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲを使用してＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを決定することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲを使用してＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを決定することを含む、宿主細胞の産生方法が提供され、ここでは、変異型配列が検出される。いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲを使用してＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを決定することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｑＰＣＲを使用してＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを決定することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。

【0181】

本明細書に開示される方法のいくつかにおいて、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルはタンパク質レベルで決定され得る。いくつかの実施形態において、免疫組織化学を使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ウエスタンブロットを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。

【0182】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子不活性化のレベルは、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化した後のＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルを対照値と比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子不活性化のレベルは、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化した後のＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルを、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を不活性化する前のＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルと比較することによって決定される。

【0183】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）系によって不活性化され、ここでは、宿主細胞がｓｉＲＮＡ系を含むことになる。

【0184】

いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系は、約１０〜２００ヌクレオチド長、または約１０〜１００ヌクレオチド長、または約１５〜１００ヌクレオチド長、または約１０〜６０ヌクレオチド長、または約１５〜６０ヌクレオチド長、または約１０〜５０ヌクレオチド長、または約１５〜５０ヌクレオチド長、または約１０〜３０ヌクレオチド長、または約１５〜３０ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は約１０〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は約１５〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列は、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系は、ＦＸまたはＧＭＤ ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、また１００％相補的である、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系は、ＦＸまたはＧＭＤ前段階ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、また１００％相補的である、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系は二本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系は一本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｉＲＮＡ系を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される活性なｓｉＲＮＡ分子へと処理される前段階ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的である、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｉＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される前段階ｓｉＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。

【0185】

いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系は送達ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は送達ベクターを含む。いくつかの実施形態において、送達ベクターは前段階ｓｉＲＮＡ及び／またはｓｉＲＮＡ分子を含む。

【0186】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ；ショートヘアピン型ＲＮＡとも称される）系によって不活性化され、ここでは、宿主細胞はｓｈＲＮＡ系を含むことになる。ｓｈＲＮＡ系による遺伝子不活性化は当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系は、約１０〜２００ヌクレオチド長、または約１０〜１００ヌクレオチド長、または約１５〜１００ヌクレオチド長、または約１０〜６０ヌクレオチド長、または約１５〜６０ヌクレオチド長、または約１０〜５０ヌクレオチド長、または約１５〜５０ヌクレオチド長、または約１０〜３０ヌクレオチド長、または約１５〜３０ヌクレオチド長のｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は約１０〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は約１５〜２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列は、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系は、ＦＸまたはＧＭＤ ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、また１００％相補的である、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系は、ＦＸまたはＧＭＤ前段階ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、また１００％相補的である、ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系は二本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系は一本鎖ＲＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｈＲＮＡ系を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される活性なｓｈＲＮＡヌクレオチド配列において処理される前段階ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡで構成される前段階ｓｈＲＮＡ分子。いくつかの実施形態において、前段階ｓｈＲＮＡ分子はＤＮＡ構築物である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的である、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載されるｓｈＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される前段階ｓｈＲＮＡ分子をコードする発現ベクターを含む。

【0187】

いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系は送達ベクターを含む。いくつかの実施形態において、宿主は送達ベクターを含む。いくつかの実施形態において、送達ベクターは前段階ｓｈＲＮＡ及び／またはｓｈＲＮＡ分子を含む。

【0188】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は不活性化され、ここでは、宿主細胞は遺伝子欠失を含む。本明細書で使用される場合、「遺伝子欠失」は、単個の核酸などのＤＮＡ配列の少なくとも一部を遺伝子からまたは遺伝子の近位で除去することを指す。いくつかの実施形態において、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子のエクソン配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子のプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子欠失に供される配列は、遺伝子のフランキング配列を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子配列の一部が遺伝子から除去される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列の一部が、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子から、またはその近位で除去される。いくつかの実施形態において、遺伝子配列全体が染色体から除去される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ配列全体が染色体から除去される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される遺伝子欠失を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子中に遺伝子欠失を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の近位に遺伝子欠失を含む。

【0189】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は不活性化され、ここでは、宿主細胞は遺伝子付加または置換を含む。本明細書で使用される場合、「遺伝子付加」または「遺伝子置換」は、１つ以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の挿入または置換を含む、遺伝子配列の改変を指す。いくつかの実施形態において、遺伝子のイントロン配列が改変される。いくつかの実施形態において、遺伝子のエクソン配列が改変される。いくつかの実施形態において、遺伝子のプロモーター配列が改変される。いくつかの実施形態において、遺伝子のフランキング配列が改変される。いくつかの実施形態において、１個のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が遺伝子配列に付加される。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の連続ヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対が遺伝子配列に付加される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、本明細書の実施形態のいずれかに記載される遺伝子付加または置換を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子中に遺伝子付加または遺伝子置換を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸ及びＧＭＤ遺伝子中に遺伝子付加または遺伝子置換を含む。

【0190】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は遺伝子欠失によって不活性化され、ここでは、遺伝子配列における少なくとも１個のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の欠失により、非機能性遺伝子産物がもたらされる。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は遺伝子欠失によって不活性化され、ここでは、遺伝子配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失により、元の遺伝子産物機能または活性を有さない遺伝子産物がもたらされる。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は遺伝子欠失によって不活性化され、ここでは、遺伝子配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの欠失により、機能不全の遺伝子産物がもたらされる。

【0191】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は遺伝子付加または置換によって不活性化され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列への少なくとも１個のヌクレオチドまたはヌクレオチド塩基対の付加または置換により、非機能性遺伝子産物がもたらされる。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は遺伝子不活性化によって不活性化され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの組み込みまたは置換により、元の遺伝子産物機能または活性を有さない遺伝子産物がもたらされる。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は遺伝子付加または置換によって不活性化され、ここでは、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子配列への少なくとも１個のヌクレオチドの組み込みまたは置換により、機能不全の遺伝子産物がもたらされる。

【0192】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、非機能性ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、それぞれ元のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物機能または活性を有しないＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、機能不全のＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物を含む。

【0193】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されたＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を含み、ここでは、この不活性化されたＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、それぞれ、完全長の機能性ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物（例えば、完全長ＦＸまたはＧＭＤポリペプチド配列）を発現しない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されたＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を含み、ここでは、この不活性化されたＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、それぞれ、内在性ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物配列を発現しない。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、不活性化されたＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を含み、ここでは、この不活性化されたＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、それぞれ、変異型ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物を発現する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、変異型ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子産物を含む。

【0194】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は送達ベクターを含む。いくつかの実施形態において、送達ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはレンチウイルスである。いくつかの実施形態において、送達ベクターはアデノウイルスである。いくつかの実施形態において、ベクターはプロモーターを含む。

【0195】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は安定したノックダウン宿主細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は安定したＦＸまたはＧＭＤノックダウン細胞株である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は一過性ノックダウン細胞株である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は一過性ＦＸまたはＧＭＤノックダウン細胞株である。

【0196】

いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）系によって不活性化される。ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子不活性化に好適なｓｉＲＮＡ配列の特定方法は当該技術分野で周知である。例えば、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子を標的化するためのｓｉＲＮＡを開発及び特定するための一般的考察には、ａ）好ましくは２１〜２３ヌクレオチド長（その後、必要に応じて配列長の短縮）の配列をまず検索すること、ｂ）開始コドン及び終止コドンの５０〜１００塩基対内の領域を回避すること、ｃ）イントロン領域を回避すること、ｄ）４つ以上の塩基のストレッチ、例えば、ＡＡＡＡを回避すること、ｅ）３０％未満または６０％超のＧＣ含有量を有する領域を回避すること、ｆ）反復及び低い配列複雑性を回避すること、ｇ）一塩基多型部位を回避すること、ｈ）他のオフターゲット遺伝子中の配列に相補的な配列を回避すること、が含まれる。例えば、Ｒｕｌｅｓ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｏｎｌｉｎｅ，Ｍａｙ ２９，２００４、及びＲｅｙｎｏｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２，２００４を参照されたい。

【0197】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＧ遺伝子の不活性化を含む。いくつかの実施形態において、約１０〜２００ヌクレオチド長、または約１０〜１００ヌクレオチド長、または約１５〜１００ヌクレオチド長、または約１０〜６０ヌクレオチド長、または約１５〜６０ヌクレオチド長、または約１０〜５０ヌクレオチド長、または約１５〜５０ヌクレオチド長、または約１０〜３０ヌクレオチド長、または約１５〜３０ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、約１０〜２５ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、約１５〜２５ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチド長のｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ前段階ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的なｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、一本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。

【0198】

いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供され、これにおいては、ｓｉＲＮＡ系はｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションを使用してｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、トランスフェクション技法を使用してｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスを使用してｓｉＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。

【0199】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、宿主細胞におけるＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を更に含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定は、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達する前のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定は、ｓｉＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルはＲＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルはタンパク質レベルで決定される。いくつかの実施形態において、免疫組織化学を使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、ウエスタンブロットを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ｓｉＲＮＡを送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを対照値と比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ｓｉＲＮＡを送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを野生型の値と比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、それぞれ、ｓｉＲＮＡを送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを、ＦＸまたはＧＭＤ ｓｉＲＮＡを送達する前のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルと比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ＦＸもしくはＧＭＤ ＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現などのＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の発現レベルに基づく。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ＦＸまたはＧＭＤタンパク質の発現レベルに基づく。

【0200】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、ｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む。いくつかの実施形態において、約１０〜２００ヌクレオチド長、または約１０〜１００ヌクレオチド長、または約１５〜１００ヌクレオチド長、または約１０〜６０ヌクレオチド長、または約１５〜６０ヌクレオチド長、または約１０〜５０ヌクレオチド長、または約１５〜５０ヌクレオチド長、または約１０〜３０ヌクレオチド長、または約１５〜３０ヌクレオチド長のｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、約１０〜２５ヌクレオチド長のｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、約１５〜２５ヌクレオチド長のｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約２５ヌクレオチド長のｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的なヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ前段階ｍＲＮＡ分子の領域に、少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または１００％相補的なｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、二本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、一本鎖ＲＮＡ分子を含むｓｈＲＮＡ系を使用したＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の不活性化を含む、宿主細胞の産生方法が提供される。

【0201】

いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供され、これにおいては、ｓｈＲＮＡ系はｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、エレクトロポレーションを使用してｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、トランスフェクション技法を使用してｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。いくつかの実施形態において、ウイルスを使用してｓｈＲＮＡ系を宿主細胞に送達することを含む、宿主細胞の産生方法が提供される。

【0202】

いくつかの実施形態において、宿主細胞が、ＦＸ活性を実質的に含まないか、またはＧＭＤ活性を実質的に含まない、宿主細胞の産生方法が提供され、本方法は、宿主細胞におけるＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルの決定を更に含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定は、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達する前のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定は、ｓｈＲＮＡヌクレオチド配列を宿主細胞に送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルはＲＮＡレベルで決定される。いくつかの実施形態において、ＰＣＲを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性のレベルはタンパク質レベルで決定される。いくつかの実施形態において、免疫組織化学を使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、ウエスタンブロットを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、フローサイトメトリーを使用したＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定を含む、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルの決定方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ｓｈＲＮＡを送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを対照値と比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ｓｈＲＮＡを送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを野生型の値と比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、それぞれ、ｓｈＲＮＡを送達した後のＦＸまたはＧＭＤ活性レベルを、ＦＸまたはＧＭＤ ｓｈＲＮＡを送達する前のＦＸまたはＧＭＤ発現レベルと比較することによって決定される。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ＦＸもしくはＧＭＤ ＲＮＡ及び／またはタンパク質の発現などのＦＸまたはＧＭＤ遺伝子の発現レベルに基づく。いくつかの実施形態において、ＦＸまたはＧＭＤ活性レベルは、ＦＸまたはＧＭＤタンパク質の発現レベルに基づく。

【0203】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ以外の不活性化された遺伝子を更に含む。

【0204】

一般に、宿主細胞は、所望のタンパク質をコードするＤＮＡを含む組換え発現ベクターによって形質転換される。加えて、本出願の宿主細胞は空の宿主細胞であり得る。本明細書で使用される場合、「空の宿主」は、タンパク質をコードする発現ベクターを含有しない細胞を指す。いくつかの実施形態において、空の宿主細胞はＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態において、空の宿主細胞はマウス細胞である。

【0205】

本明細書に記載のタンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞も本出願によって提供される。本発明によって提供される核酸分子には、一本鎖形態と二本鎖形態との両方にあるＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに対応する相補配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びこれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子、及びその断片の組み合わせが含まれる。本明細書で提供される核酸は、優先的にヒト源に由来する。

【0206】

ある特定の実施形態において、核酸は、汚染内在物質を実質的に含まない。この核酸分子は、標準的な生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）において概説されているものなど）によって、実質的に純粋な形態、かつその構成要素のヌクレオチド配列の特定、操作、及び回収を可能にする量または濃度で少なくとも１回単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来していることが好ましい。かかる配列は、真核生物遺伝子中に典型的に存在する内部の翻訳されていない配列またはイントラン（ｉｎｔｒａｎ）によって妨げられていないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／または構築されることが好ましい。翻訳されていないＤＮＡの配列は、この配列がコード化領域の操作または発現に干渉しない、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在し得る。

【0207】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、タンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、タンパク質を分泌することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、Ｆｃ含有タンパク質を分泌することができる。

【0208】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子不活性化前の宿主細胞に類似した産生率でタンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子不活性化前の宿主細胞と同じ産生率でタンパク質を発現することができる。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、ＦＸまたはＧＭＤ遺伝子不活性化前の宿主細胞の産生率の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％でタンパク質を発現することができる。

【0209】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、遺伝子修飾を更に含む。タンパク質の産生を目的とした宿主細胞の遺伝子修飾による最適化は、当該技術分野で周知であり、例えば、統合法のためのベクター選択特性、及びタンパク質産生に対して操作するのに望ましい任意の他の細胞特性に関する検討を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、標的化された遺伝子修飾である。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、ノックアウト遺伝子修飾である。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾は、ノックイン遺伝子修飾である。

【0210】

また、ＦＸまたはＧＭＤ活性の決定を含む、宿主細胞をタンパク質発現の適合性について評価する方法も提供され、これにおいては、低下したレベルのＦＸまたはＧＭＤ活性は適合性を示す。

【0211】

タンパク質を産生するように操作された細胞
本出願は、いくつかの態様において、本明細書の実施形態に記載されるタンパク質を産生するように操作された宿主細胞を提供する。本出願は、他の態様において、本明細書の実施形態に記載される宿主細胞の作製方法を提供する。

【0212】

いくつかの実施形態において、宿主細胞は、タンパク質を産生するように操作される。

【0213】

いくつかの実施形態において、タンパク質を産生するように操作された宿主細胞の作製方法が提供され、本方法は、ａ）宿主細胞を、タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターによって形質転換することを含む。

【0214】

発現ベクターを使用する宿主細胞の形質転換方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ，３９７，２０１０を参照されたい。宿主細胞の形質転換方法には、形質転換、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質転換、または他の既知の技法が挙げられるが、これらに限定されない。選択する方法は、一部には使用する宿主細胞の種類の機能となる。これらの方法及び他の好適な方法は当業者に周知である。

【0215】

本明細書に記載される少なくとも１つのタンパク質を含む、プラスミド、発現ベクター、転写、または発現カセットの形態にある発現系及び構築物も提供される。ある特定の実施形態において、本明細書で提供されるプラスミド、発現ベクター、転写、または発現カセットは、少なくとも１つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0216】

いくつかの実施形態において、宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド保持ならびに内在ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含有することになる。「フランキング配列」と総称されるかかる配列は、ある特定の実施形態において、典型的には、以下のヌクレオチド配列のうちの１つ以上を含むことになる：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、供与体及び受容体スプライス部位を含む全イントロン配列、ポリペプチド分泌に関するリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるタンパク質をコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択可能なマーカー要素。これらの配列の各々は以下で考察される。

【0217】

フランキング配列は、同種（即ち、宿主細胞と同じ種及び／または株由来）、異種（即ち、宿主細胞種または株以外の種に由来）、ハイブリッド（即ち、１つ超のソース由来のフランキング配列の組み合わせ）、合成、または天然であってもよい。このため、フランキング配列のソースは、フランキング配列が宿主細胞機構において機能的であり、それによって活性化され得ることを条件として、いずれの真核生物であっても、いずれの脊椎動物もしくは無脊椎動物であっても、またはいずれの植物であってもよい。

【0218】

本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術分野で周知であるいくつかの方法のうちのいずれかによって得られ得る。典型的には、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピングによって及び／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってそれまでに特定されているため、制限エンドヌクレアーゼを使用して適当な組織源から単離することができる。いくつかの場合、フランキング配列の全ヌクレオチド配列が分かっていてもよい。ここでは、フランキング配列は、核酸合成またはクローニングについて本明細書に記載される方法を使用して合成され得る。

【0219】

分かっているフランキング配列が全てであっても一部であっても、これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ならびに／または同じもしくは別の種由来のオリゴヌクレオチド及び／もしくはフランキング配列断片などの好適なプローブによるゲノムライブラリのスクリーニングをすることによって得られ得る。フランキング配列が分かっていない場合には、フランキング配列を含むＤＮＡの断片は、例えばコード化配列または更には別の遺伝子（単数または複数）を含み得るより大きいＤＮＡ片から単離され得る。単離は、適当なＤＮＡ断片を産生するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、または当業者に既知の他の方法を使用した単離によって達成され得る。この目的を達成するのに好適な酵素の選択は、当業者には容易に明らかとなる。

【0220】

複製起点は、典型的には、商業的に購入した部分発現ベクターであり、この起点は宿主細胞中のベクターの増幅を支援する。選択したベクターが複製起点部位を含まない場合、分かっている配列に基づいて化学的に合成し、ベクターへとライゲーションしてもよい。例えば、様々なウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）が、哺乳動物細胞中のベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（ＳＶ４０起点が、ウイルス初期プロモーターも含有するという理由だけで、使用されることが多い）。

【0221】

転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード化領域の端部に対して３’に位置し、転写を終結させるために働く。この配列はライブラリから容易にクローニングするか、または更にはベクターの部分として商業的に購入するものであるが、明細書に記載されるものなどの核酸合成のための方法を使用して容易に合成することもできる。

【0222】

選択可能なマーカー遺伝子は、選択培地中で成長させた宿主細胞の生存及び成長に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素への耐性を与えるか、（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏を補完するか、または（ｃ）複合もしくは限定培地から入手不可能な必須の栄養素を供給する、タンパク質をコードする。具体的な選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピリシン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利にも、ネオマイシン耐性遺伝子も真核性宿主細胞における選択に使用し得る。

【0223】

他の選択可能な遺伝子を使用して、発現されることになる遺伝子を増幅してもよい。増幅とは、成長または細胞生存に必須のタンパク質の産生に求められる遺伝子が組換え細胞の継続的世代の染色体内で直列に繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択可能なマーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターを有しないチロシンキナーゼ遺伝子が挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが、ベクター中に存在する選択可能な遺伝子によって生存するように特異的に適応する。選択圧は、培地中の選択剤の濃度を連続的に増加させることで、選択可能な遺伝子と抗体軽鎖または重鎖などの別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方の増幅を生じさせる条件下で、形質転換した細胞を培養することによってかけられる。その結果、増加量のポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。

【0224】

リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要とされ、例えば、コザック配列によって特徴付けられる。本要素は、発現されるポリペプチドのプロモーターに対して３’、コード化配列に対して５’に位置する。ある特定の実施形態において、１つ以上のコード化領域は、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結し、これにより単一のＲＮＡ転写産物からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能となる。

【0225】

本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的に、宿主細胞によって認識され、ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結するプロモーターを含むことになる。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドン（一般に約１００〜１０００ｂｐ以内）に対して上流（即ち、５’）に位置する転写されていない配列である。プロモーターは、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターという２つのクラスのうちの１つに従来的にはグループ分けされる。誘導性プロモーターは、栄養素の存否または温度の変化などの培養条件の変化に応答して、その制御下でＤＮＡからの転写レベルの減少を始動する。一方で構成的プロモーターは、それらが作動可能に連結する遺伝子を均一に、つまり遺伝子発現に対する制御をほとんどまたは全く有さずに転写する。様々な可能性のある宿主細胞によって認識される多数のプロモーターが周知である。好適なプロモーターは、制限酵素消化によりソースＤＮＡからプロモーターを除去し、かつ所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、例えば重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に結合する。

【0226】

酵母宿主を用いた使用に好適なプロモーターも当該技術分野で周知である。酵母エンハンサーが酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞を用いた使用に好適なプロモーターは、当該技術分野で周知であり、これらには、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが挙げられる。

【0227】

関心対象となり得る更なるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）遺伝子からのプロモーター及び調節配列Ｐｒｉｎｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２；またはタックプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が挙げられるが、これらに限定されない。組織特異性を呈し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域も関心のものである：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｍｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパ系、及びマスト細胞において活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓において活性なアルファ−フェタ（ｆｅｔａ）−タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：５３−５８）；肝臓において活性なアルファ１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞において活性なベータ−グロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）；ならびに視床下部において活性な性腺刺激性放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。

【0228】

エンハンサー配列は、ベクターに挿入されて、高等真核生物による本発明の軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させ得る。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常は長さが約１０〜３００ｂｐであるＤＮＡのシス作用性要素である。エンハンサーは、配向及び位置に比較的依存せず、転写単位に対して５’及び３’両方の位置で見い出されている。哺乳動物遺伝子から利用可能ないくつかのエンハンサー配列が既知である（例えば、グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトタンパク質、及びインスリン）。しかしながら、典型的には、ウイルスからのエンハンサーが使用される。当該技術分野で既知であるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが、真核性プロモーターの活性化のための例示的な増強要素である。エンハンサーは、コード配列の５’または３’のいずれかでベクター中に位置付けられ得るが、典型的には、プロモーターから５’部位に位置する。適切な天然または異種シグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列は、発現ベクター中に組み込まれて、抗体の細胞外分泌を促進し得る。シグナルペプチドの選択は抗体が産生される宿主細胞の種類に左右され、異種シグナル配列は天然のシグナル配列を代置し得る。哺乳動物宿主細胞中で機能的であるシグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）に対するシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：７６８に記載のインターロイキン−２受容体に対するシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−Ｉ受容体シグナルペプチド；欧州特許第０４６０８４６号に記載のＩＩ型インターロイキン−Ｉ受容体シグナルペプチドが挙げられる。

【0229】

ベクターは、ベクターが宿主細胞ゲノムに統合されるときに発現を促進する１つ以上の要素を含み得る。例には、ＥＡＳＥ要素（Ａｌｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．１９：１４３３−３８）及びマトリックス付着領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲは、クロマチンの構造的構成を媒介し、統合されたベクターを「位置」効果から防護し得る。このため、ＭＡＲは、ベクターが安定した形質転換体を創出するために使用される場合に特に有用である。いくつかの天然及び合成ＭＡＲ含有核酸が、米国特許第６，２３９，３２８号、同第７，３２６，５６７号、同第６，１７７，６１２号、同第６，３８８，０６６号、同第６，２４５，９７４号、同第７，２５９，０１０号、同第６，０３７，５２５号、同第７，４２２，８７４号、同第７，１２９，０６２号など、当該技術分野で既知である。

【0230】

本発明によって提供される発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築されてもよい。かかるベクターは、所望のフランキング配列の全てを含む場合も含まない場合もある。本明細書に記載されるフランキング配列のうちの１つ以上は、ベクター中に既に存在しない場合、これらを個別に得て、ベクター中にライゲーションしてもよい。フランキング配列の各々を得るために使用される方法は当業者に周知である。

【0231】

ベクターを構築し、タンパク質配列をコードする核酸分子をベクターの適当な部位に挿入した後、完成したベクターを、増幅及び／またはポリペプチド発現のために好適な宿主細胞中に挿入し得る。

【0232】

Ｆｃ含有タンパク質などのタンパク質をコードする核酸を含むベクターの作製方法は当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第７，９２３，２２１号を参照されたい。

【0233】

タンパク質ならびに所望のコード化配列及び対照配列を含む好適なベクターの構築には、標準的なライゲーション技法が用いられる。単離されたプラスミドまたはＤＮＡ断片は、切断され、調整され、再ライゲーションされて、求められるプラスミドを形成するために所望される形態となる。用いられる方法は、ＤＮＡ源または意図される宿主に左右されない。

【0234】

いくつかの実施形態において、宿主細胞に導入するのに最適なポリヌクレオチドの割合を決定することを更に含む、タンパク質の作製方法が提供される。いくつかの実施形態において、質量分析を使用してタンパク質の収率を決定し、割合を調整してタンパク質の収率を最大化する。いくつかの実施形態において、二重抗原ＥＬＩＳＡを使用してＦｃ含有タンパク質などのタンパク質の収率を決定し、割合を調整してタンパク質の収率を最大化する。

【0235】

精製
本明細書に記載される方法は、いくつかの態様において、本明細書に記載される方法によって産生されるタンパク質の単離方法を更に含む。

【0236】

タンパク質の獲得方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈ Ｍｅｔｈ，５１，２００２を参照されたい。タンパク質は、細胞内で産生され得るか、または培地に直接分泌され得る。タンパク質が細胞内で産生される場合、第１のステップとして、微粒子残屑（宿主細胞または溶解断片のいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。タンパク質が培地に分泌される場合、かかる発現系の上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して、まず濃縮される。いくつかの実施形態において、プロテアーゼ阻害剤が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を阻止するための抗生物質が含まれてもよい。

【0237】

細胞から調製された組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、このうち親和性クロマトグラフィーが典型的な精製技術である。Ｆｃ含有タンパク質について、親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、Ｆｃ含有タンパク質内に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに左右される。タンパク質Ａは、１、２、または４個の重鎖を含むヒト免疫グロブリンに基づくＦｃ含有タンパク質を精製するために使用することができる（例えば、Ｌｉｎｄｍａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ，６２，１９８３を参照されたい）。タンパク質Ｇは、全てのマウスアイソタイプ及びヒト３に推奨される（Ｇｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ，５，１９８６を参照されたい）。親和性リガンドが結合するマトリックスは、ほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。孔制御ガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成可能なものよりも速い流速、及び短い処理時間を可能にする。タンパク質精製のための他の技法、例えば、イオン交換カラム上での分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン上でのクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿も、回収されるタンパク質に応じて利用可能である。

【0238】

いくつかの実施形態において、充填剤の使用を含むタンパク質の精製方法が提供される。いくつかの実施形態において、充填剤は透析濾過系である。いくつかの実施形態において、充填剤は限外濾過系である。いくつかの実施形態において、充填剤はウイルス濾過系である。いくつかの実施形態において、タンパク質の精製は、一連の濾過ステップの使用を含む。いくつかの実施形態において、一連の濾過ステップは、以下のうちの少なくとも１つから選択される：透析濾過、限外濾過、及びウイルス濾過。

【0239】

いくつかの実施形態において、濾過、タンパク質Ａ精製、カチオン交換精製、強カチオン交換精製、アニオン交換精製、逆相精製、及びマルチモーダル精製から選択される一連のタンパク質精製技法を使用したタンパク質の精製方法が提供される。

【0240】

組成物
本出願は、いくつかの態様において、グリカン構造を含むタンパク質を提供し、本タンパク質は、本明細書に記載される方法のいずれかによって産生されるタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態の所定の割合にある。

【0241】

いくつかの実施形態において、タンパク質はＦｃ含有タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質はＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は１つ以上のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は２つのＦｃドメインを含む。

【0242】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は重鎖またはその断片を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は少なくとも１つの重鎖を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は１つ以上の重鎖を含む。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は２つの重鎖を含む。

【0243】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は完全長抗体である。いくつかの実施形態において、完全長抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、完全長抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態において、完全長抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、完全長抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、完全長抗体は二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、完全長抗体は多特異性抗体である。

【0244】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質はＦｃ含有融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質は１つ以上のＦｃドメインを含む。

【0245】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の血漿半減期を延長する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の生物学的活性を延長する。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の腎クリアランス率を低下させる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の可溶性を増大させる。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質のＦｃドメインは、Ｆｃ含有融合タンパク質の安定性を増大させる。

【0246】

Ｆｃ含有融合タンパク質は当該技術分野で周知である。例えば、Ｃｚａｊｋｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｍｏｌ Ｍｅｄ，４，２０１２，１０１５−１０２８を参照されたい。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質はイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質はサイトカイン−Ｆｃ融合タンパク質である。

【0247】

いくつかの実施形態において、タンパク質は多量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は多量体タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有融合タンパク質は多量体タンパク質である。

【0248】

いくつかの実施形態において、タンパク質は薬剤に共役される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、薬剤の分子少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個に共役される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、薬剤の分子約２〜１０、約４〜１０、約６〜１０、または約８〜１０個に共役される。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質は薬剤に共役され、薬剤はＦｃ含有タンパク質のＦｃドメインに共役される。いくつかの実施形態において、薬剤は治療薬である。いくつかの実施形態において、治療薬は小分子治療薬である。いくつかの実施形態において、治療薬は化学療法剤である。いくつかの実施形態において、薬剤は検出薬である。いくつかの実施形態において、検出薬は放射性標識である。いくつかの実施形態において、検出薬は蛍光標識である。いくつかの実施形態において、検出薬は免疫標識である。いくつかの実施形態において、タンパク質はコンパニオン診断薬である。いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質はコンパニオン診断薬である。

【0249】

いくつかの実施形態において、タンパク質は翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態において、翻訳後修飾は非酵素的に産生される。いくつかの実施形態において、翻訳後修飾は酵素的に産生される。いくつかの実施形態において、翻訳後修飾は、ジスルフィド対形成、脱アミド化、酸化、及びＮ末端グルタミン環化から選択される。

【0250】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ含有タンパク質などのタンパク質は、任意のタンパク質に結合するか、またはそれと相互作用し、これらのタンパク質には、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４などのＨＥＲ受容体ファミリーメンバー；ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、及びＣＤ３４などのＣＤタンパク質；ＬＦＡ−１、Ｍｏｌ、ｐ１５０，９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、及びαもしくはβまたはそのサブユニットを含むａｖ／ｐ３インテグリンなどの細胞接着分子（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）；ＣＲＩｇなどのマクロファージ受容体、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ−２などの腫瘍壊死因子、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの成長因子；ＩｇＥ；血液型抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ならびにタンパク質Ｃが含まれるが、これらに限定されない。他の例示的なタンパク質には、成長ホルモン（ＧＨ）、例えば、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−抗トリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子；抗凝固因子、例えば、タンパク質；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性剤；プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）；ボンバジン；トロンビン；腫瘍壊死因子α及びβ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、通常はＴ細胞が発現及び分泌している）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ＤＮａｓｅ；インヒビン；アクチビン；ホルモンまたは成長因子に対する受容体；インテグリン；タンパク質ＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えば、ＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えば、ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ；表皮成長因子（ＥＧＦ）；形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−α及びＴＧＦ−β、例えば、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）；インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えば、インターフェロン−α、−β、及び−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子（ＤＡＦ）；ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部など；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；イムノアドヘシン；抗体；ならびに上に挙げたポリペプチドのうちのいずれかの生物学的に活性な断片または変異型が挙げられる。多くの他の抗体及び／または他のタンパク質が本発明に従って使用されてもよく、上のリストは限定的であることを意味しない。

【0251】

本出願は、いくつかの態様において、本明細書に記載される方法のいずれかによって作製されるタンパク質を含む組成物を提供する。本出願は、別の態様において、ＮＫ細胞及びＰＭＮ細胞によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質を含む組成物を提供し、本組成物は、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合でタンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態を含む。

【0252】

いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、グリカン構造の還元末端にフコースを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質のフコシル化形態は、グリカン構造の還元末端にフコースを含み、フコースは、グリカン構造の還元末端の第１のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）部分に共有結合する。いくつかの実施形態において、グリカン構造は、グリカン構造の還元末端にフコース部分を含む。いくつかの実施形態において、フコース部分は、グリカン構造に共有結合した単個のフコース分子である。いくつかの実施形態において、グリカン構造はＬ−フコースを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質は２つ以上のグリカン構造を含む。

【0253】

いくつかの実施形態において、本組成物は医薬組成物である。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は貯蔵用形態にある。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は製品輸送用形態にある。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は凍結される。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は再構成される。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は投与用組成物である。いくつかの実施形態において、本医薬組成物はそれを必要とする個体への投与用形態にある。

【0254】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は滅菌医薬組成物である。滅菌医薬組成物は、当業者に記載の医薬品グレード滅菌基準（例えば、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ Ｃｈａｐｔｅｒｓ ７９７，１０７２，ａｎｄ １２１１、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ ＆ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎｓ Ｃｏｄｅ ４１２７．７、１６ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ １７５１，２１ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ ２１、またはかかる規制に対する旧米国カウンターパート（ｅｘ−Ｕ．Ｓ．ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ））に従って調合または製造される。

【0255】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は安定製剤である。本明細書で使用される場合、「安定」製剤は、含まれるタンパク質が貯蔵中に物理的及び化学的安定性及び完全性を本質的に保持するものである。タンパク質安定性を測定するための様々な分析技法が当該技術分野で利用可能であり、例えば、Ｊｏｎｅｓ，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ，１０，１９９３において概説されている。安定性は、選択された温度にて選択された期間測定することができる。例えば、貯蔵中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として用いることができる。よって、「安定」製剤は、タンパク質の約１０％未満及び好ましくは約５％未満が製剤中に凝集物として存在するものであってもよい。

【0256】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は再構成された製剤である。本明細書で使用される場合、「再構成された」製剤は、凍結乾燥したタンパク質製剤をタンパク質が全体に分散するように希釈液に溶解させることによって調製されたものである。再構成された製剤は、それを必要とする個体への投与（例えば、静脈内または皮下投与）に好適である。

【0257】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は等張製剤である。本明細書で使用される場合、「等張」製剤は、ヒト血液と本質的に同じ浸透圧を有するものである。等張製剤は、一般的に、約２５０〜３５０ｍＯｓｍの浸透圧を有する。「低張」という用語は、ヒト血液のものより低い浸透圧を有する製剤を説明する。同様に、「高張」という用語は、ヒト血液のものより高い浸透圧を有する製剤を説明するために用いられる。

【0258】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は特定のｐＨである。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、約５〜７、約５〜６、または約５〜５．５のｐＨである。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は約５．３のｐＨである。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は約５．４のｐＨである。いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、ｐＨが調整されている。

【0259】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、活性成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、これには、緩衝液、例えばリン酸、クエン酸、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、アクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの介在性薬物分散剤を更に含む。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、酢酸ナトリウム、スクロース、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）、コハク酸ナトリウム、ヒスチジンＨＣｌ、及び塩化ナトリウムからなる群から選択される。

【0260】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容される酸を更に含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される酸」は、処方される濃度及び様式にて非毒性である無機及び有機酸を含む。例えば、適切な無機酸としては、塩化水素酸、過塩素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルファニル酸、リン酸、炭酸などが挙げられる。適切な有機酸としては、直鎖及び分岐鎖アルキル、芳香族、環状、脂環式、アリール脂肪族、複素環式、飽和、不飽和のモノ、ジ、及びトリカルボン酸（例えばギ酸、酢酸、２−ヒドロキシ酢酸、トリフルオロ酢酸、フェニル酢酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、アントラニル酸、プロパン酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、シクロペンタンプロピオン酸、シクロペンタンプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、ブタン酸、ブタン二酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、アスコルビン酸、桂皮酸、ラウリル硫酸、ステアリン酸、ムコン酸、マンデル酸、コハク酸、エンボン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、マロン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、グリコン酸、グルコン酸、ピルビン酸、グリオキサル酸、シュウ酸、メシル酸、コハク酸、サリチル酸、フタル酸、パルモ酸、パルメイン酸、チオシアン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−クロロベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファスルホン酸、４−メチルビシクロ［２，２，２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４′−メチレンビス−３−（ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、ヒドロキシナフトエ酸を含む）が挙げられる。

【0261】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容される塩基を更に含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩基」は、処方される濃度及び様式にて非毒性である無機及び有機塩基を含む。例えば、適切な塩基には、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、Ｎ−メチルグルカミン、モルホリン、ピペリジンのような無機塩基形成性金属から形成されるもの、ならびに第一級、第二級、及び第三級アミン、置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン（ｔｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂などが挙げられる。特に好ましい有機非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、及びカフェインである。

【0262】

本発明で用いることができる更なる薬学的に許容される酸及び塩基としては、アミノ酸、例えばヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、及びアスパラギンに由来するものが挙げられる。

【0263】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝液または塩、例えば、上記の酸及び塩基の酸及び塩基付加塩の両方に由来するものを更に含む。具体的な緩衝液及び／または塩には、ヒスチジン、コハク酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。

【0264】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容される糖を更に含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される糖」は、目的とするタンパク質と混合した場合に、貯蔵の際のタンパク質の化学的及び／または物理的不安定性を著しく妨げるかまたは低減する分子である。製剤を凍結乾燥させ、次いで再構成することを目的とする場合、「薬学的に許容される糖類」は、「凍結乾燥保護剤」としても知られ得る。例示的な糖類及び対応する糖アルコールには、グルタミン酸１ナトリウムまたはヒスチジンなどのアミノ酸；ベタインなどのメチルアミン；硫酸マグネシウムなどのリオトロピックな塩；三価またはそれより高い分子量の糖アルコールなどのポリオール、例えばグリセリン、デキストラン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、及びマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）；及びそれらの混合物が挙げられる。更なる例示的な凍結乾燥保護剤には、グリセリン及びゼラチン、ならびに糖類メリビオース、メレジトース、ラフィノース、マンノトリオース、及びスタキオースが挙げられる。還元糖類の例には、グルコース、マルトース、ラクトース、マルツロース、イソマルツロース、及びラクツースが挙げられる。非還元糖類の例には、糖アルコール及び他の直鎖多価アルコールから選択されるポリヒドロキシ化合物の非還元グリコシドが挙げられる。好ましい糖アルコールは、モノグリコシド、特にラクトース、マルトース、ラクツロース、及びマルツロースなどの二糖類の還元により得られる化合物である。グリコシド側鎖は、グルコシドまたはガラクトシドのいずれかであり得る。糖アルコールの更なる例は、グルシトール、マルチトール、ラクチトール、及びイソマルツロースである。好ましい薬学的に許容される糖類は、非還元糖類トレハロースまたはショ糖である。薬学的に許容される糖類は、タンパク質がその物理的及び化学的な安定性及び完全性を貯蔵中（例えば再構成及び貯蔵の後）に本質的に保持することを意味する「保護量」（例えば凍結乾燥前）で製剤に加えられる。

【0265】

いくつかの実施形態において、本医薬組成物は、薬学的に許容される保存剤を更に含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される保存剤」は、細菌の活性を低減するために本明細書における製剤に加えることができる化合物である。可能性のある保存剤の例には、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド（アルキル基が長鎖化合物であるアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライドの混合物）及びベンゼトニウムクロライドが挙げられるが、これらに限定されない。他の型の保存剤には、芳香族アルコール、例えばフェノール、ブチル、及びベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが挙げられる。

【0266】

いくつかの実施形態において、複数のタンパク質を含む本組成物は細胞培地である。いくつかの実施形態において、細胞培地は栄養培地である。栄養培地は、宿主細胞成長に必要な全ての要素を含有する。いくつかの実施形態において、細胞培地は最小培地である。最小培地は、例えば、一般にはアミノ酸が存在しない、宿主細胞成長にとって可能な限り最低限の栄養素を含有する。いくつかの実施形態において、細胞培地は選択培地である。選択培地は、選択生物の成長を阻害する薬剤を含有する。

【0267】

いくつかの実施形態において、細胞培地は、細胞支持及び／または成長のための細胞培地栄養素を更に含む。いくつかの実施形態において、細胞培地栄養素は、例えば、タンパク質；ペプチド；アミノ酸；炭水化物；金属及び鉱物、例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄；微量金属、例えば、リン酸塩及び硫酸塩；緩衝液；ｐＨ指示薬、例えば、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル；ならびに抗菌薬から選択される。

【0268】

いくつかの実施形態において、細胞培地は宿主細胞を更に含む。いくつかの実施形態において、培地は宿主細胞を実質的に欠いている。

【0269】

いくつかの実施形態において、細胞培地はフコース源を含む。いくつかの実施形態において、フコース源はフコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコースである。いくつかの実施形態において、フコースはＬ−フコース−１−ホスフェートである。いくつかの実施形態において、フコース源はＧＤＰ−フコースである。

【0270】

いくつかの実施形態において、本組成物は細胞溶解物である。いくつかの実施形態において、細胞溶解物は、複数のタンパク質及び宿主細胞成分を含む。いくつかの実施形態において、細胞溶解物は、遠心分離された細胞溶解物である。いくつかの実施形態において、細胞溶解物は、細胞溶解物の沈殿部分と細胞溶解物の上清部分とを含む。いくつかの実施形態において、細胞溶解物は、細胞溶解物のペレット部分と細胞溶解物の上清部分とを含む。

【0271】

いくつかの実施形態において、本組成物はタンパク質精製カラムからの溶出物である。本明細書で使用される場合、「溶出物」は、タンパク質精製カラムを通る任意の流体を指す。いくつかの実施形態において、溶出物は、通過画分液から単離される流体を含む。いくつかの実施形態において、溶出物は、洗浄液から単離される流体を含む。いくつかの実施形態において、溶出物は、１つ以上の洗浄液から単離される流体を含む。いくつかの実施形態において、溶出物は、溶出液から単離される流体を含む。

【0272】

いくつかの実施形態において、組成物は、複数のタンパク質のうちの少なくとも２つのタンパク質が異なる、タンパク質のライブラリである。いくつかの実施形態において、ライブラリは、異なる抗原に結合する少なくとも２つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリは、異なるエピトープに結合する少なくとも２つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、異なるタンパク質は、異なる容器中に含まれる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも２、３、４、５、１０、３０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、７５００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１０００００、２５００００、５０００００、７５００００、１００００００、２５０００００、５００００００、７５０００００、１０００００００、または１０００００００個超の異なるタンパク質を含むライブラリを提供する。

【0273】

本出願は、本明細書の実施形態に記載される組成物のいずれかの大規模なバッチ（例えば、商業用バッチまたは製造規模のバッチ）を提供する。例えば、いくつかの実施形態において、バッチは、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を所定の割合で含む。いくつかの実施形態において、バッチは、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、バッチは、抗体のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を所定の割合で含む。いくつかの実施形態において、バッチは、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有する抗体を含む。

【0274】

いくつかの実施形態において、バッチは、少なくとも約５ｇ、１０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇ、１，０００ｇ、１，５００ｇ、２，０００ｇ、２，５００ｇ、３，０００ｇ、３，５００ｇ、４，０００ｇ、４，５００ｇ、または５，０００ｇのタンパク質を含み、このタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態は所定の割合である。いくつかの実施形態において、バッチは、少なくとも約５〜５，０００ｇ、５０〜４，０００ｇ、または約１００〜１，０００ｇのタンパク質を含み、このタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態は所定の割合である。

【0275】

いくつかの実施形態において、バッチは薬物貯蔵用形態にある。いくつかの実施形態において、バッチは製品輸送用形態にある。いくつかの実施形態において、バッチはそれを必要とする個体への投与用形態にある。いくつかの実施形態において、バッチは凍結乾燥される。いくつかの実施形態において、バッチは薬剤に共役されない。いくつかの実施形態において、バッチは薬剤に共役される。いくつかの実施形態において、バッチは製剤成分を更に含む。

【0276】

いくつかの実施形態において、バッチは細胞培地である。いくつかの実施形態において、バッチは細胞溶解物である。

【0277】

いくつかの実施形態において、バッチまたはその一部は容器中にある。いくつかの実施形態において、バッチまたはその一部はバイアルの中にある。いくつかの実施形態において、バッチまたはその一部は複数のバイアル中にある。いくつかの実施形態において、バッチまたはその一部はシリンジ中にある。

【0278】

いくつかの実施形態において、バッチまたはその一部は複数のバイアル中にあり、各バイアルはタンパク質を含み、このタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態は所定の割合である。いくつかの実施形態において、バッチまたはその一部は複数のバイアル中にあり、バイアルの少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％は、タンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態を所定の割合で含む。

【0279】

いくつかの実施形態において、バッチは単位用量に等分される。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、単回単位用量としての投与を意図したタンパク質の量である。いくつかの実施形態において、単回単位用量は約１〜約５００ｍｇのタンパク質である。いくつかの実施形態において、単位用量は容器の中にパッケージ化される。いくつかの実施形態において、単位用量はバイアルの中にパッケージ化される。

【0280】

いくつかの実施形態において、商業用バッチのサイズは、臨床用バッチサイズの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍以下である。本明細書で使用される場合、「商業用バッチ」は、商業生産及び／または流通を目的として完了される１つ以上の生産運転中に生産されるタンパク質の量を指す。本明細書で使用される場合、「臨床用バッチ」は、臨床試験を目的として完了される１つ以上の生産運転中に生産されるタンパク質の量を指す。いくつかの実施形態において、商業用バッチのサイズは、臨床用バッチサイズの１０倍以下である。

【0281】

いくつかの実施形態において、容器は、本明細書に記載される商業用バッチのアリコートを含み、この商業用バッチはタンパク質を含む組成物を含み、このタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態は所定の割合である。いくつかの実施形態において、バイアルは、本明細書に記載される商業用バッチのアリコートを含み、この商業用バッチはタンパク質を含む組成物を含み、このタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態は所定の割合である。いくつかの実施形態において、シリンジは、本明細書に記載される商業用バッチのアリコートを含み、この商業用バッチはタンパク質を含む組成物を含み、このタンパク質のフコシル化形態及び脱フコシル化形態は所定の割合である。

【0282】

治療方法
本出願は、いくつかの態様において、疾患の治療を、それを必要とする個体において行う方法が提供され、本方法は、その個体に、本明細書の実施形態に記載される医薬組成物を投与することを含む。

【0283】

いくつかの実施形態において、医薬組成物の有効量が、それを必要とする個体に投与され、この医薬組成物は、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態を所定の割合で含む。

【0284】

いくつかの実施形態において、医薬組成物の有効量が、それを必要とする個体に投与され、この医薬組成物は、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物の有効量が、それを必要とする個体に投与され、この医薬組成物は、ＮＫ細胞とＰＭＮ細胞との両方によって媒介される強化されたＡＤＣＣ機能を有するタンパク質を含み、かつこの医薬組成物は、タンパク質の脱フコシル化形態及びフコシル化形態を、強化されたＡＤＣＣ機能を提供する割合で含む。

【0285】

本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、経口、吸入、膀胱内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、または経皮を含む、非経口などの様々な経路で投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は非経口投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は静脈内投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は皮下投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は局所投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は局部投与され得る。

【0286】

本明細書の方法によって治療され得る疾患は、タンパク質によって治療され得る任意の疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は癌である。いくつかの実施形態では、疾患は自己免疫疾患である。いくつかの実施形態において、疾患は感染症である。

【0287】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される医薬組成物は、別の投与様式または治療と組み合わせて使用される。

【0288】

当業者であれば、いくつかの実施形態が本発明の範囲及び趣旨の内で可能であることを認識するであろう。本発明は、これから以下の非限定例を参照してより詳細に説明される。以下の実施例は、本発明を更に説明するが、決してその範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【実施例】

【0289】

実施例１：
各々フコース滴定によって調整することができるフコシル化：脱フコシル化の割合を有する抗体を発現する能力があるＦＸノックアウトＣＨＯ細胞株の開発
抗体の脱フコシル化形態の生物学的機能の変化を評価するためには、抗体の野生型（フコシル化）形態と脱フコシル化形態との両方を産生させる必要がある。これまでに、力価が比較的妥当な抗体の脱フコシル化形態を発現する能力があるＣＨＯ細胞株を開発するためにＦＵＴ８ノックアウト宿主（ＦＵＴ８−ＫＯ）が使用されてきた（Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，１０６，２０１０，７７４−７８３）。しかしながら、ＦＵＴ８−ＫＯ細胞株は、クローンの成長及び適合速度がより遅いことが観察されている。更に、抗体を野生型形態（即ち、フコシル化形態）でも産生させるためには、更なる別々の細胞株開発（ＣＬＤ）が必要とされる。これを達成するためには、多数のクローニングを産生させスクリーニングして、見合った製品品質を有する抗体の野生型形態及び脱フコシル化形態を産生するクローンを得るという骨の折れる面倒な作業が必要である。類似した十分な製品品質属性を有する抗体を産生し、抗体の野生型形態及び脱フコシル化形態によって観察されるいずれの差異も厳密に脱フコシル化に帰属し得ることを確実にする、野生型及びＦＵＴ８−ＫＯクローンを得ることは、更により困難である。

【0290】

抗体の野生型形態及び脱フコシル化形態を産生することができる単一細胞株により、同じ製品品質属性を有する抗体の産生が可能となり得る。ここでは、デノボ経路の不活性化及びフコースレベルの制御によって、抗体の野生型フコシル化形態及び脱フコシル化形態を産生することができる細胞株を産生させることが可能であり得ると仮定した。ＧＭＤノックアウトＣＨＯ宿主株の世代及び特性評価は既に報告されているが、達成された特異的産生性（Ｑｐ）は低く、約１６ｐｇ／細胞−ｄであった（Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３０，２００７，３００−３１０）。ここでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によってＣＨＯ−Ｋ１宿主株におけるＦＸ遺伝子のノックアウトを調査し、かかる宿主（複数可）における抗体の成長、発現、及びフコシル化状況を評価する。

【0291】

結果：
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するＦＸ遺伝子座の標的化
ＦＸ遺伝子座を標的化するため、ＣＨＯ−Ｋ１ ＦＸ遺伝子の５’及び３’コード領域の配列決定を行った。この配列を使用して、配列に相補的であったガイド−ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）構築物を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と共に使用するために設計した（Ｌｅ Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９，２０１３，８１９−８２３；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，２０１３，９５７−９６３）。ｇＲＮＡ配列をＦＸ遺伝子の５’及び３’領域にフランキングするように設計し、Ｃａｓ９発現ベクターと共に等モル比で共トランスフェクトして、６Ｋｂ全てのＦＸ遺伝子を欠失させた。個々のｇＲＮＡを、ｐＬＫＯ．５ベクター（カタログ＃ＳＨＣ−２０１、Ｓｉｇｍａ）のヒトＵ６プロモーターの制御下でクローニングし発現させた。トランスフェクションの７２時間後、トランスフェクトした細胞のプールを、２００μｇ／ｍｌのＬＣＡを含有する培地中で選択した（フコシル化表面糖タンパク質を有する細胞を取捨するため）。ＤＮＡ抽出及びＰＣＲ分析には、それぞれ、ＱＩＡＧＥＮ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ＃６９５０６）及びＲｏｃｈｅ ＨｉＦｉ Ｔａｑ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（カタログ＃１１７３２６５０００１）を使用した。ｇＲＮＡに対して外側及び内側のＰＣＲプライマーを、それぞれ、完全なＦＸ欠失を有するアレルと野生型または少しの欠失を有するアレルとを区別するように設計した（図２Ａ）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９発現ベクターによってトランスフェクトし、レンチルレクチン（ＬＣＡ）の存在下でプールとして選択した。フルオレセイン（ＦＩＴＣ）共役ＬＣＡ（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）試薬を使用して、フローソーターによって細胞表面上のフコシル化糖タンパク質の低減を確認した。

【0292】

ＦＸ遺伝子欠失をＰＣＲ分析によって確認した（図２Ｂ）。ｇＲＮＡに対して内側のプライマーは、野生型アレルまたは欠失が小さいアレルを検出するために使用し、外側プライマーは、ＦＸ遺伝子の完全な欠失を有するアレルを検出するために使用した。

【0293】

ＦＸ欠失のプールは、限界希釈によってクローニングし、ＰＣＲ、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）、及びウエスタンブロットによってＦＸ遺伝子の欠失についてスクリーニングした単一細胞であった。ＬＣＡ−ＦＩＴＣで染色したＦＸＫＯプール３のフローサイトメーター分析により、細胞表面でのフコシル化グリコールタンパク質レベルの不在／低減を確認した（図３）。

【0294】

単一細胞クローンの単離及びＦＸ遺伝子ノックアウトの確認
ＦＸ遺伝子が全てのアレルにおいてノックアウトされる単一クローンを得るために、プール３からの細胞を限界希釈によって単一細胞クローニングし、ＰＣＲによってＦＸ遺伝子中の欠失についてスクリーニングした（図４Ａ）。スクリーニングしたクローンの中で、５個のクローンが少なくとも１個の欠失したアレル及び１個の野生型アレルを保有し、１個のクローン（クローン１１）がそのアレルの全てにおいて完全なＦＸ欠失を示した（図４Ａ）。ＫＯプライマーセットによって検出されたＰＣＲ産物（複数可）の存在はＦＸ遺伝子欠失を示すが、野生型プライマーセットによって増幅されたＰＣＲバンドの存在は、必ずしもＦＸ遺伝子が機能的タンパク質を発現できることを意味しないことに留意されたい（図２Ａ及び図４Ａ）。野生型プライマー用に設計されたスクリーニングアプローチは、点突然変異及び小さい欠失を区別しないため、非機能的もしくは不完全なＦＸタンパク質の発現、または更にはまとめてＦＸタンパク質発現の欠乏につながり得る。ＦＸタンパク質発現の欠如を確認するために、上位６個のクローンを免疫ブロットアッセイによって分析し、クローンの全てがＦＸタンパク質発現を欠いたことを確認した（図４Ｂ）。これは、ＦＸ遺伝子が完全なアレル欠失または欠失とフレームシフトとの組み合わせのいずれかによってノックアウトされることを示す。また、ＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色及びフローサイトメトリーを使用して、培地中のフコースの存否に応じて、これらのクローンが、それぞれ、脱フコシル化糖タンパク質またはフコシル化糖タンパク質を発現できることを確認した（図５Ａ〜５Ｆ）。

【0295】

野生型または脱フコシル化抗体を発現するＦＸＫＯクローンの評価
ＦＸＫＯ宿主３−５、３−７、及び３−１１を、特にこれらが脱フコシル化抗体を発現できることを確実にするための更なる評価に対して成長及び生存プロファイルに基づいて選択した。このために、これらのＦＸＫＯ宿主を、抗体Ａを発現している構築物によってトランスフェクトし、３週間のプールを選択した（図６Ａ）。ＣＨＯ−Ｋ１宿主を対照として使用し、全てのプールについての抗体発現を、ＨＴＲＦアッセイを使用して確認した（データ割愛）。次に、これらのプールを使用して、フコースの存在下または非存在下にある１４日間の流加バッチ産生培地をセットアップした。次に、各培地からの発現された抗体Ａ分子を、タンパク質Ａカラムを使用して培地から精製し、それらの様々なグリカン種をＰＮＧａｓｅ Ｆ処理後のキャピラリー電気泳動によって分析した（図６Ｂ）。Ｇ０−Ｆグリカン種（脱フコシル化）を表す主要なピークは、フコースの非存在下にある全てのＦＸＫＯ宿主に存在し、一方でフコースの存在下では、Ｇ０種は電気泳動図において主要なピークを形成した（図６Ｂ）。各ＦＸＫＯ宿主の抗体グリカン種全体の９８％超を分析すると、これら全てがフコースの非存在下では脱フコシル化抗体のみ発現する一方、フコースが存在するときには、抗体の２％未満が脱フコシル化されることが示された（図６Ｃ）。したがって、フコースの非存在下ではフコシル化が欠乏する一方、フコースが存在する場合には、ＦＸＫＯクローンの全てにおいて抗体フコシル化のプロセスが完全に回復される（図６Ｃ）。ＦＸＫＯ３−１１宿主の全てのアレルにおいてＦＸ遺伝子が完全に欠失するため（図４Ａ）、この宿主を更なる試験のために選択した。

【0296】

ＣＬＤプロセスにおけるＦＸＫＯ宿主評価
ＣＬＤ中のＦＸＫＯ３−１１宿主の動作を評価するため、この宿主を、抗体Ｂを発現しているベクター、及び選択マーカーとしてグルタミン合成酵素（ＧＳ）によってトランスフェクトし、全ＣＬＤを実行した。上位２４個のクローンを産生アッセイにおいて評価すると、３．５〜５．５ｇ／Ｌの力価を有することを示した（図７Ａ）。最高Ｑｐが１６ｐｇ／細胞−日であった既に報告されているＧＭＤノックアウト株（Ｋａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３０，２００７，３００−３１０）とは異なり、ＦＸＫＯ３−１１クローンは、Ｑｐが２５〜１３０ｐｇ／細胞−日の範囲であり、大部分のクローンは、Ｑｐが４０〜７０ｐｇ／細胞−日であった（図７Ｂ）。抗体Ｂを発現しているＦＸＫＯ３−１１クローンは、多様な成長（４〜１８００万個の細胞／ｍｌ）及び１４日目の生存（４０〜９５％）を示し、また予期された通り、Ｑｐがより高いクローンは、Ｑｐがより低いクローンと比較して成長がより遅かった（図７Ｃ）（追加データ割愛）。加えて、全てのＦＸＫＯ３−１１クローンが、完全に脱フコシル化された抗体Ｂ分子を発現し、大部分の糖型が、それぞれ、豊富な順に、Ｇ０−Ｆ（図７Ｄ）、Ｇ１−Ｆ（図７Ｅ）、及びＧ０−１−Ｆ（図７Ｆ）であった。抗体Ｂの発現も、同一のＣＬＤプロトコルに従ってＦＵＴ８−ＫＯ ＤＰ１２宿主において独立して評価し、上位のクローンは、脱フコシル化抗体Ｂを、上位のＦＸＫＯ３−１１クローンと比較して３０〜４０％低い力価で発現した（データ割愛）。これらの発見は、ＦＸＫＯ宿主が、所与の抗体分子を、ＦＵＴ８−ＫＯ宿主のものと比較して同等またはより高い力価で、また抗体の野生型バージョンと脱フコシル化バージョンとの両方を発現する可能性を有しながら、発現し得ることを示す。

【0297】

ＦＸＫＯ宿主は、類似の製品品質で、抗体のＷＴバージョンまたは脱フコシル化バージョンの両方を発現する。
抗体を発現しているＦＸＫＯクローンが、同等の製品品質で同じ抗体の野生型バージョン及び脱フコシル化バージョンの両方を発現できるかどうかを評価するために、抗体Ａを発現しているＦＸＫＯクローン（図６Ａ〜６Ｃ）を、培地中に１ｍＭのフコースを含む産生アッセイまたは含まない産生アッセイにおいて使用した。抗体Ａの電荷変異型パーセント及び凝集レベルは、培地におけるフコースの存在下及び非存在下で、各クローンについて類似していた（図８Ａ〜８Ｂ）。類似の産生アッセイを、１ｍＭのフコース存在下及び非存在下で、抗体Ｂを発現している２つのＦＸＫＯクローンに対して行うと（図７Ａ〜７Ｆ）、両方のクローンがフコースレベルに関係なく同等の力価を有した（図８Ｃ）。フコースの非存在下では、抗体Ｂの全てのグリカン種が脱フコシル化されたが、フコースを産生培地に添加することで、両方のクローンは、ＷＴグリカン種の正常かつ予期した分布で抗体Ｂを発現した（図８Ｄ）。

【0298】

電荷変異型種パーセントはフコースの存在下または非存在下において２つのクローンの間で同等であった一方（図８Ｅ）、フコースを産生培地に添加すると、主要ピークパーセントは多少高く（４％）、酸性ピークパーセントは多少低かった（４％）ことに気付いた（図８Ｅ）。かかる挙動は抗体Ａ産生プールに関しては観察されなかったことに留意されたい（図８Ａ）。凝集レベルパーセントは、フコースの存在下または非存在下で、依然として抗体Ｂ発現クローンと同等であった（図８Ｆ）。

【0299】

ＦＸＫＯ宿主は、ほぼ同一の製品品質で野生型抗体と脱フコシル化抗体との両方を発現する選択肢を提供するため、インビトロ及びインビボの抗体ＡＤＣＣの強化における脱フコシル化の役割の評価に好適である。かかる特徴により、エフェクター機能または毒性試験の結果が野生型及び脱フコシル化抗体種のレベルに直結し得るのであって、異なるクローンがこれらの抗体を発現する場合に不注意に存在してしまう製品品質の差ではないことが確実となる。

【0300】

ＦＸＫＯ宿主を使用して、ＷＴ糖型対脱フコシル化糖型の所望の割合を有する抗体を発現させ得る
毒性に起因して完全に脱フコシル化された抗体種を有することが不要であるかまたは望ましくない場合には、毒性を最低限に抑えながらＡＤＣＣの全効果を発揮するのに必要な脱フコシル化抗体のレベルを決定することが有益であり得る。ＦＸＫＯクローンが、所望のレベル（複数化）の脱フコシル化糖型を有する抗体を発現することができるかどうかを評価するために、２つの抗体Ｂを発現しているクローンを選択して、培地中のフコースレベルが漸増する（０〜１ｍＭ）産生培養を確立した。この実験を、培養における脱フコシル化抗体種のある特定のパーセンテージに対応するフコース流加レベルを微調整するために数回行った。図６Ａ〜６Ｂは、フコースのある特定の濃度を産生培地及び流加に添加することによって、野生型抗体レベル対脱フコシル化抗体レベルの所望の割合を達成し得ることを示す。これらの実験にはボーラス流加アプローチを使用した。しかしながら、連続平衡アプローチを使用して、所望の野生型抗体対脱フコシル化抗体比を生み得ることも想定される。

【0301】

様々なグリカン種のレベルがＰＮＧａｓｅ Ｆ処理、続くキャピラリー電気泳動によって決定されるため、この方法によって、脱フコシル化グリカンが０個、１個、または２個である抗体分子の部分を決定することは可能ではない。いずれにせよ、抗体力価（図６Ｃ）、凝集レベル（図６Ｄ）、及び電荷変異型パーセンテージ（図６Ｅ）は、産生培地中のフコース濃度に関係なく同等であった。全体としては、これらの発見は、ＦＸＫＯ宿主により、毒性を回避しながら所望のＡＤＣＣレベルを測定するのに好適な野生型糖型対脱フコシル化糖型の所望の割合を有する抗体の発現が可能となったことを示す。更に、同等の製品品質を有する野生型抗体対脱フコシル化抗体の所望の割合は、毒性を最低限に抑えながらＡＤＣＣを最大化するのに必要な脱フコシル化のレベルを評価するために、フコースを産生培地及び流加中に滴定することによって達成され得る。

【0302】

方法：
ベクター構築物及び試薬
構成的抗体発現を、選択のためのグルタミン合成酵素（ＧＳ）の発現も指揮する抗体発現ベクターにおいてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下で重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子をクローニングすることによって達成した。最終発現ベクターのアセンブリ及びこのベクターを使用する選択は既に説明されている。Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇｒ，２９，２０１３，９８０−９８５を参照されたい。マウス抗β−アクチン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ２２２８、１：３００００にて）、及びＦＸに対するウサギポリクローナル抗体（ＧｅｎｅＴｅｘ、カタログ番号１０１６６３、１：２０００にて）を免疫ブロットに使用した。プロテアーゼ阻害カクテル（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１−８３６−１５３−００１）を溶解緩衝液中で使用した。レンチルレクチン（ＬＣＡ）（カタログ番号Ｌ−１０４０）及びＦＩＴＣ共役ＬＣＡ（ＬＣＡ−ＦＩＴＣ）（カタログ番号ＦＬ−１０４１）試薬はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。フコースはＳｉｇｍａから購入した（カタログ番号Ｆ２２５２）。以下のプライマーをＷＴまたはＦＸＫＯ遺伝子セグメントの増幅に使用した：
順方向ＷＴ ＦＸプライマー：ＧＴＣＡＣＣＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＣＴＴＧ（配列番号１）、
逆方向ＷＴ ＦＸプライマー：ＡＡＡＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣ（配列番号２）、
順方向ＦＸＫＯプライマー：ＣＴＡＧＧＣＴＴＣＣＣＴＡＧＧＣＣＡＴＴ（配列番号３）、及び
逆方向ＦＸＫＯプライマー：ＧＣＴＡＴＧＣＣＣＴＴＧＡＧＴＣＴＴＧＧ（配列番号４）。

【0303】

免疫ブロット
免疫ブロットアッセイのため、細胞を、氷上のＮＰ４０溶解緩衝液（プロテアーゼ阻害カクテルを含む、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５％のＮＰ４０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び５ｍＭのＭｇＣｌ_２）中で３０〜５０００万個の細胞／ｍｌで２０分間溶解させた。次に、溶解物を、１０分間、１３，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離させ、上清を新しい試験管に移し、ＢＣＡアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってタンパク質濃度を決定した。１５０μｌの各溶解物を５０μｌの４倍還元ローディングバッファと混合し、５分間沸騰させた。各試料について等しいタンパク質濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜２０％のトリス−グリシン）にロードし、免疫ブロットのために膜に移した。

【0304】

ＬＣＡ−ＦＩＴＣで染色した細胞のＦＡＣＳ分析
２００，０００個の細胞を遠沈させ、０．５ｍｌのＰＢＳで１回洗浄し、１％のＢＳＡを含む０．３ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。細胞を、氷上で３０分間、２μｇ／ｍｌの最終濃度で、ＬＣＡ−ＦＩＴＣを用いて染色した。次に、細胞をＦＡＣＳ管に移し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ分析用フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して全試料を分析した。

【0305】

細胞培養及び安定したトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１宿主細胞を、３７℃及び５％のＣＯ_２で無血清の専売Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ培地中で培養した。Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ｋｉｔ−Ｖ（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＶＣＡ−１００３）を使用して、標準的なトランスフェクションプロトコルに従ってＣＨＯ−Ｋ１細胞を安定してトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を３８４ウェルプレートにプレーティングし、メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いて選択した。３〜４週間後、１０００個の成長しているコロニーを選定し、ＭＳＸの存在下にある９６ウェルプレートに置いた。４〜５日後、選定したコロニーを、均一性時間分解ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）アッセイを使用して抗体発現についてアッセイした。上位のコロニーは、３８４ウェルプレートへの限界希釈、その後の撮像を使用してクローニングした単一細胞であった。３〜４週間後、約７００個の成長しているコロニーを選定して９６ウェルプレートに置き、ＨＴＲＦアッセイに供した（４〜６日目）。クローンを発現している上位２００個、及び続いて上位１００個の抗体を、ＨＴＲＦによってアッセイした。クローニングし撮像した上位４８個の単一細胞により、クローンが、懸濁成長に適合し、前述のように産生アッセイにおいて評価されたことを確認した（Ｍｉｓａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇｒ，３０，２０１４，１４３２−１４４０）。端的には、細胞を、指示量のフコースと共に、産生培地において１×１０^６細胞／ｍｌで播種した。培養に、３、７、及び１０日目に専売流加培地及びフコース（指示濃度にて）を与えた。培養中の生細胞数（ＶＣＣ）及び細胞の生存％を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲ計器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、０、３、７、１０、及び１４日目に測定した。抗体力価を、産生培養の７、１０、及び１４日目に決定した（タンパク質Ａ精製）。グルコース及び乳酸塩を、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、７日目及び１４日目に測定した。電荷変異型を、キャピラリー等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）によって測定し、グリカンサブタイプを、ＰＮＧａｓｅＦ消化、続いてキャピラリー電気泳動によって特定した。タンパク質Ａ精製した抗体をゲル濾過（サイジング）カラムに供することによって、凝集のレベルを決定した。

【0306】

実施例２：
ＦＸＫＯ宿主における抗体フコシル化の調節により、ＦｃγＲＩＩＩ結合及びＡＤＣＣレベルを調節することができる。
方法：
ＡＤＣＣアッセイ
エフェクター細胞を得るために操作したＮＫ細胞株（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、ＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で標識したＷＩＬ２−Ｓ細胞を標的細胞として使用した。標識したＷＩＬ２−Ｓ標的細胞（２×１０^４）とＮＫ細胞（１．０×１０^５）との混合物を、アッセイ培地（１０％の加熱不活性化したＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、及び２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２を含むＲＰＭＩ １６４０）中で調製し、丸底９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに加えた。抗体の標的化希釈物（１００〜０．０６ｎｇ／ｍＬ）をプレートに加え、プレートを３時間インキュベートした。細胞溶解を、３４５ｎｍの励起及び６１５ｎｍでの発光定量化による相対蛍光単位（ＲＦＵ）で時間分解蛍光を使用し、マイクロプレートリーダーＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ（登録商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して測定した。標識した標的細胞のみを含むウェルの吸光は、バックグラウンドについての対照（バックグラウンド）として働き、一方で、ＤＥＬＦＩＡ ＢＡＴＤＡ溶解緩衝液を伴う標識した標的細胞を含むウェルは、最大の利用可能なシグナル（最大放出）を提供した。自然放出（ＳＲ）を、標的細胞のみを含むウェルから測定し、一方で、ＳＲ＋ＮＫを、抗体を有しない標的細胞及びエフェクター細胞の両方を含むウェルから測定した。特異的毒性パーセント（ＳＴ％）を以下の式に従って決定した：
ＳＴ％＝｛［（特異的放出−バックグラウンド）−（自然放出−バックグラウンド）］×１００｝／［（最大放出−バックグラウンド）−（自然放出−バックグラウンド）］。
３連からの平均ＳＴ％を、４パラメータ適合を使用して単位ｎｇ／ｍＬで抗体試料の濃度に対してプロットすることによって、用量応答曲線を生成した。ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯＴＭ製の平行線分析曲線適合ソフトウェア（ＰＬＡ）を使用してデータ分析を行った。Ｓｈａｔｚ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ，５，２０１３，８７２−８１を参照されたい。

【0307】

ＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイ
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００計器（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＳＰＲ分析に使用した。抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を５０μｇ／ｍＬに希釈し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓｅｎｓｏｒ ＣＭ５ Ｃｈｉｐｓ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に、アミンカップリングキット（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して７分間１０μＬ／分で注射することによって固定した。各サイクルにおいて、ＦｃγＲＩＩＩａ−６ｘＨｉｓタグタンパク質（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を試料注射前に捕捉したＦｃγＲＩＩＩａ−６ｘＨｉｓタグタンパク質を、０．１％のＢＳＡ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ中で０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、２分間１０μＬ／分で捕捉した。０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０を含むＰＢＳ中で１０μｇ／ｍＬの抗体濃度で調製した試料を、ＦｃγＲＩＩＩａ結合のために、５分間５０μＬ／分で注射した。同じ泳動緩衝液を５分間チャンバに通すことによって解離相を得た。全ての実験は２５℃で行った。各試料及び緩衝液ブランクの３連の注射を２つの表面（参照フローセル及び試験フローセル）に流した。データを１Ｈｚの速度で収集した。読み値は、試料注射終了５秒前の解離相中の最大結合応答であった。参照フローセルを試験フローセルと併せて泳動させて、非特異的結合の効果を打ち消した。加えて、ブランク泳動緩衝液の注射を実験フローセルに含めた。参照フローセル及びブランク緩衝液注射からのシグナルを、実験フローセル上の試料注射の絶対応答から減算した（二重減算法）。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア及びＪＭＰソフトウェアを使用してデータを分析した。

【0308】

結果：
脱フコシル化糖型対フコシル化糖型の割合が異なる抗体の機能を評価するために、抗体Ｂを発現しているＦＸＫＯクローンを使用して、フコース流加レベルが異なる産生アッセイをセットアップした（図１０Ａ）。産生中のフコース流加の濃度を増加させることで、フコシル化抗体種レベルは徐々に増加した一方、脱フコシル化抗体種のレベルはそれに応じて減少した。次に、抗体Ｂをこれらの培養から精製し、ＮＫ細胞結合の代理としてインビトロＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイに供した（図１０Ｂ）。例示の通り、フコシル化抗体種レベルの減少は、ＦｃγＲＩＩＩ結合の減少と対応する（図１０Ｂ）。０．０２５ｍＭのフコース濃度ではグリカンの約４０〜５０％のみが脱フコシル化されるが、ＦｃγＲＩＩＩ結合能力の約８０％は完全なままである。ＦＸＫＯ宿主細胞を、抗体Ｃ（ＩｇＧ１）を発現した構築物によってトランスフェクトし、これに対して機能的ＡＤＣＣアッセイを開発した。プール選択後、プール産生アッセイを指示濃度のフコース流加で行って、脱フコシル化抗体種対フコシル化抗体種の割合が様々である抗体Ｃ培養を得た（図１０Ｃ）。これらの培養から精製した抗体ＣをＡＤＣＣアッセイにおいて使用すると、ＡＤＣＣ活性％と脱フコシル化グリカン種レベルとの間の線形相関が観察された（図１０Ｄ）。大部分がフコシル化された（１ｍＭのフコース）抗体Ｃ試料と完全に脱フコシル化された（０ｍＭのフコース）抗体Ｃ試料とを混合することで、脱フコシル化グリカン種レベル及びフコース滴定チャートに基づいて予測可能なＡＤＣＣ応答（図１０Ｅ）が誘引され得る（図１０Ｄ）。これは、フコース流加アプローチが、実際に、類似の製品品質、及び予測可能な様式でＡＤＣＣを誘引するためのフコシル化グリカン種対脱フコシル化グリカン種の所望の分布を有する抗体を生成する、実行可能な方法であることを示唆する。フコース流加アプローチにより、完全に脱フコシル化された抗体と大部分がフコシル化された抗体との両方を生成するために必要とされる２つの別々の製造戦略の必要性が排除されることは特筆すべきである。

【0309】

ＡＤＣＣ用量応答分析により、完全に脱フコシル化された抗体Ｃ分子が、それらの主なフコシル化カウンターパートと比較して２０倍低い濃度で、最大ＡＤＣＣ活性の５０％を達成し得ることが示された（図１０Ｇ）。ＡＤＣＣ活性のほぼ８０％が脱フコシル化グリカン種を担持する抗体分子の６０％のみで維持され得ることに留意されたい（図１０Ｄ、１０Ｅ、及び１０Ｆ）。加えて、グリカンの４０％未満が脱フコシル化される０．０２ｍＭのフコース流加では、比較的同等のＡＤＣＣ活性％が、完全に脱フコシル化された（０ｍＭのフコース）試料のものと同じ抗体Ｃ濃度で達成され得る（図１０Ｇ）。よって、これらの発見により、ほぼ最大レベルのＡＤＣＣ活性を達成するために１００％完全に脱フコシル化された抗体を有する必要はないことが示される。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図8F】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]