【図1】ＧＤＰ−フコースを生成するためのデノボ経路及びサルベージ経路を含むフコシル化経路の概観を示す。ＧＤＰ−ケト−６−デオキシマンノース−３，５−エピメラーゼ，４−レダクターゼ（ＦＸ）及びＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）は、デノボ経路の成員である。

【図2A】ＦＸ不活性化のワークフロー、及びＦＸ遺伝子が不活性化された細胞のＰＣＲ分析を示す。ＦＸ不活性化のワークフローを示す。

【図2B】ＦＸ不活性化のワークフロー、及びＦＸ遺伝子が不活性化された細胞のＰＣＲ分析を示す。欠失したＦＸアレル検出のためのＰｏｏｌ−３、Ｐｏｏｌ−９、及び対照のＰＣＲ分析を示す。野生型（ＷＴ、内）及びノックアウト（ＫＯ、外）プライマーを個々の反応で使用した。ｇＲＮＡのみでトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞（Ｃａｓ９なし）を対照として使用した。

【図3】非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、ＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＨＯ−Ｋ１ ＦＸＫＯ−Ｐｏｏｌ−３）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１宿主）のＦＡＣＳ分析を示す。

【図4A】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＸ遺伝子及びタンパク質分析を示す。野生型（ＷＴ）プライマー及びノックアウト（ＫＯ）プライマーを使用するＦＸ遺伝子のＰＣＲ分析を示す。

【図4B】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＸ遺伝子及びタンパク質分析を示す。ＦＸタンパク質のウエスタンブロット分析を示す。ＦＸブロットパネルにおいて、アスタリスク（^＊）によって示される低い方のバンドは、全ての試料に存在する非特異的バンドであることに留意されたい。アクチンブロットをローディングコントロールとして使用する。

【図5A】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン３のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5B】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン５のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5C】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン６のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5D】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン７のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5E】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン９のＦＡＣＳ分析を示す。

【図5F】Ｐｏｏｌ−３から得た単一細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す。各ＦＡＣＳ分析は、非染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（非染色）、フコースを含む培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ＋フコース）、フコースを欠く培地中で成長させたＦＸを不活性化したＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＦＸＫＯ）、及びＬＣＡ−ＦＩＴＣ染色野生型ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＷＴ ＣＨＯ−Ｋ１）を示す。クローン１１のＦＡＣＳ分析を示す。

【図6A】ＦＸＫＯ細胞株を使用する抗体の産生プロセス、及び該ＦＸＫＯ細胞株によって産生されたグリカン構造の分析を示す。培地中のフコースの存在下または非存在下で、ＦＸＫＯ宿主３−５、３−７、及び３−１１から抗体Ａを発現させるためのトランスフェクション及びプール選択の概略図を示す。ＣＨＯ−Ｋ１宿主を対照として使用した。

【図6B】ＦＸＫＯ細胞株を使用する抗体の産生プロセス、及び該ＦＸＫＯ細胞株によって産生されたグリカン構造の分析を示す。キャピラリー電気泳動に供した、ＦＸＫＯクローン３−１１によって発現された抗体Ａの代表的な電気泳動図プロファイルを示す。

【図6C】ＦＸＫＯ細胞株を使用する抗体の産生プロセス、及び該ＦＸＫＯ細胞株によって産生されたグリカン構造の分析を示す。フコースの存在下または非存在下で異なるプールからキャピラリー電気泳動によって検出されたグリカン種を示す。フコシル化の欠如は「−Ｆ」によって示す。レベルが低いグリカン種は示さない。Ｇ０＝フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１＝ＧｌｃＮａｃ分岐のうちの１つにある１つのガラクトース、Ｇ−１＝１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠くキトビオースコアグリカン、Ｇ１’＝Ｇ１の位置異性体、Ｇ１−１＝１つのガラクトースが残りの分岐したＧｌｃＮＡｃにある、１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠くキトビオースコアグリカン、Ｇ２＝分岐したＧｌｃＮＡｃの各々に１つずつ、２つのガラクトース、Ｍａｎ５＝ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−５ｘ（マンノース）、Ｇ０−１＝１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠くキトビオースコアグリカン、Ｇ０−１−Ｆ＝１つの分岐したＧｌｃＮＡｃを欠く脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ０−Ｆ＝脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１−Ｆ＝１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１’−Ｆ＝Ｇ１−Ｆの位置異性体、Ｇ２−Ｆ＝２つのガラクトースが分岐したＧｌｃＮＡｃの各々に１つずつある脱フコシル化キトビオースコアグリカン。

【図7A】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。抗体の力価（ｇ／Ｌ）を示す。

【図7B】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンの特異的産生性（ｐｇ／細胞−日）を示す。

【図7C】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンの成長を示す。

【図7D】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンによって産生されたＧ０−Ｆ（脱フコシル化キトビオースコアグリカン）であるグリカン構造のパーセンテージを示す。

【図7E】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンによって産生されたＧ１−Ｆ（１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある、脱フコシル化キトビオースコアグリカン）であるグリカン構造のパーセンテージを示す。

【図7F】標準的なＣＬＤプロセスの後の、ＦＸＫＯ３−１１宿主の２４個のクローンによって産生された抗体の分析を示す。クローンによって産生されたＧ０−１−Ｆ（１つの分岐ＧｌｃＮＡｃを欠く脱フコシル化キトビオースコアグリカン）であるグリカン構造のパーセンテージを示す。

【図8A】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。ＣＨＯ−Ｋ１宿主対照と比較した、フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ａの電荷変異型のパーセンテージを示す。

【図8B】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。ＣＨＯ−Ｋ１宿主対照と比較した、フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ａの凝集のパーセンテージを示す。

【図8C】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの力価（ｇ／Ｌ）を示す。

【図8D】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの主要な糖型のパーセンテージを示す。Ｇ０＝フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１＝ＧｌｃＮａｃの分岐のうちの１つにある１つのガラクトース、Ｍａｎ５＝ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−５ｘ（マンノース）、Ｇ０−Ｆ＝脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１−Ｆ＝１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある脱フコシル化キトビオースコアグリカン。

【図8E】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ｂの電荷変異型のパーセンテージを示す。

【図8F】フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ａ及び抗体Ｂの野生型形態及び脱フコシル化形態の分析を示す。フコース１ｍＭの存在のフコースの非存在下のいずれかで培養した、ＦＸＫＯクローンによって産生された精製抗体Ｂの凝集のパーセンテージを示す。

【図9A】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１によって産生された抗体Ｂの主要な糖型のパーセンテージを示す。

【図9B】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン２によって産生された抗体Ｂの主要な糖型のパーセンテージを示す。Ｇ０＝フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１＝ＧｌｃＮａｃの分岐のうちの１つにある１つのガラクトース、Ｍａｎ５＝ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ−５ｘ（マンノース）、Ｇ０−Ｆ＝脱フコシル化キトビオースコアグリカン、Ｇ１−Ｆ＝１つのガラクトースがＧｌｃＮＡｃ分岐のうちの１つにある脱フコシル化キトビオースコアグリカン。

【図9C】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１及び２によって産生された抗体Ｂの力価（ｇ／Ｌ）を示す。

【図9D】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１及び２によって産生された抗体Ｂの凝集のパーセンテージを示す。

【図9E】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂの分析を示す。様々なフコース濃度（０〜１ｍＭ）で培養したＦＸＫＯクローン１及び２によって産生された抗体Ｂの電荷変異型のパーセンテージを示す。

【図10A】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。示されるフコースの濃度にて産生培地中で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｂ（ＩｇＧ１）の脱フコシル化糖型対フコシル化糖型の割合を示す。

【図10B】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。１０μｇ／ｍｌの非飽和濃度での精製抗体Ｂ抗体のＦｃγＲＩＩＩ結合アッセイからの結果を示す。

【図10C】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。示されるフコースの濃度にて産生培地中で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体Ｃ（ＩｇＧ１）の脱フコシル化グリカン種対フコシル化種の割合を示す。

【図10D】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。異なるフコース流加培養物から精製した抗体Ｃ抗体のＮＫ細胞系ＡＤＣＣアッセイからのＡＤＣＣ活性％の結果を示す。

【図10E】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。０ｍＭのフコース流加の培養物及び１ｍＭのフコース流加の培養物から調製した抗体混合物の脱フコシル化グリカン合計パーセント及び相対ＡＤＣＣ活性パーセントを示す。

【図10F】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。脱フコシル化グリカン種合計パーセントに対するＡＤＣＣ活性％を示す。

【図10G】様々なフコース濃度で培養したＦＸＫＯクローンによって産生された抗体の分析を示す。フコシル化グリカン対脱フコシル化グリカンの割合が異なる抗体Ｃ試料についてのＡＤＣＣ用量応答曲線を示す。