特許 6983906 ライブラリーの定量および定性

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6983906

(24)【登録日】2021年11月26日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】ライブラリーの定量および定性

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6851 20180101AFI20211206BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20211206BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20211206BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20211206BHJP

   C12Q 1/6855 20180101ALI20211206BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20211206BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20211206BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/6851 Z

   C40B40/06

   C12Q1/6869 Z

   C12Q1/686 Z

   C12Q1/6855 Z

   !C12Q1/6876 Z

   !C12N15/09 Z

【請求項の数】20

【全頁数】18

(21)【出願番号】特願2019-555479(P2019-555479)

(86)(22)【出願日】2017年4月11日

(65)【公表番号】特表2020-516274(P2020-516274A)

(43)【公表日】2020年6月11日

(86)【国際出願番号】US2017027060

(87)【国際公開番号】WO2018190814

(87)【国際公開日】20181018

【審査請求日】2020年3月13日

(73)【特許権者】

【識別番号】501430467

【氏名又は名称】ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】アモアズ， ダグラス エー．

(72)【発明者】

【氏名】リー， ビン

(72)【発明者】

【氏名】シュローダー， ベンジャミン ジー．

(72)【発明者】

【氏名】フェケテ， リチャード エー．

【審査官】 藤澤 雅樹

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１５−５１１８１９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１３−１１１０８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０１８６８２７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００６９２５０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２３１２５３（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００２／０１９７６１１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 中国特許出願公開第１０５８９０７２２（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／６８

Ｃ１２Ｎ １５／００

Ｃ４０Ｂ １０／００

Ｃ４０Ｂ ４０／０２

Ｃ４０Ｂ ４０／０６−４０／１０

Ｃ４０Ｂ ５０／０６

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ライブラリーを定量する方法であって、
ＤＮＡ断片を提供すること；
複数のプライマーの存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記ＤＮＡ断片を増幅し、ここで、前記複数のプライマーの少なくとも１つはフルオロフォアで標識されており、結果として、増幅された各ＤＮＡ断片に所定の数のフルオロフォアを結合させること；
前記増幅されたＤＮＡ断片から生成された蛍光シグナルを検出すること；
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出すること；
前記増幅されたＤＮＡ断片を所定の濃度に希釈すること；および
前記増幅されたＤＮＡ断片を固体支持体上に固定化すること
を含む方法。

【請求項2】

前記増幅されたＤＮＡ断片によって生成されたシグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記複数のプライマーが、第１のプライマータイプおよび第２のプライマータイプを含み、前記第１のプライマータイプが、結合した単一のフルオロフォアを有する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

単一のフルオロフォアが各ＤＮＡ断片に結合している、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

参照試料に由来するＤＮＡ断片の数と、前記ＤＮＡ断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することを含む、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

２回目の測定を行って、前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定すること
をさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

試料中のＤＮＡの総質量を決定することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴が、断片の数とＤＮＡの質量との間の比に由来する、前記増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含む、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＤＮＡ断片が少なくとも１つのアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

ＤＮＡ試料を配列決定する方法であって、
前記ＤＮＡ試料を使用してＤＮＡ断片を生成すること；
２つの別個のプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記ＤＮＡ断片を増幅し、ここで、前記プライマーの１つがフルオロフォアで標識されており、各ＤＮＡ断片に結合する所定の数のフルオロフォアを提供すること；
前記増幅されたＤＮＡ断片によって生成された蛍光シグナルを検出すること；
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出すること；
前記増幅されたＤＮＡ断片を、蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈すること；および
蛍光に基づく配列決定技術を使用して、前記増幅されたＤＮＡ断片の少なくとも一部分を配列決定すること
を含む方法。

【請求項13】

前記増幅されたＤＮＡ断片によって生成された前記シグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

単一のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合している、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

前記増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

既知の平均サイズおよび濃度を有する核酸ライブラリーに由来するＤＮＡ断片の数と、前記ＤＮＡ断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定すること
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴が、前記増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ＤＮＡ断片がアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表
本出願に関連付けられる配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔである。テキストファイルは、約２７ＫＢであり、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。

【背景技術】

【0002】

次世代Ｇｅｎ ＤＮＡシーケンサーは、通常、既知の配列の末端を有するＤＮＡ断片を使用する。両末端に既知の配列があると、ＤＮＡ断片を増幅し、固定化でき、配列決定のための開始位置（例えば、プライミング部位）を提供することができる。既知の配列の両末端は、典型的には、アダプターと呼ばれ、それらは、ＤＮＡ断片をシーケンサーのニーズに適合させる。溶液中のすべてのＤＮＡ断片に、配列決定用にアダプターが両末端に存在するわけではない。アダプターの１つにそれぞれ固有の２つの異なるプライマーを使用するＰＣＲ増幅ステップは、典型的には、それらの末端に２つの異なるアダプターを有する断片を濃縮するために使用される。末端にアダプターを有するこのＤＮＡ断片の集合は、典型的には、ライブラリーと呼ばれる。これらのライブラリーは、ライブラリー要素（例えば、異なるＤＮＡ断片がそれらの間に挿入されたアダプター）間の空間距離により、互いからの単一要素の視覚化（検出）および認識が可能になるように固体支持体に固定化され得る。

【0003】

要素間の距離は、個々の要素が表面上で増幅されて、それらの数が増加し、断片が配列決定されているので、フルオロフォアの効率的な検出を可能にしなければならないためより重要になる。この増幅は、しばしばブリッジ増幅と呼ばれ、結果として、しばしばクラスターと呼ばれるものになる。断片が増幅すると、支持体上に同一配列の断片のクラスターが生成される。

【0004】

クラスター内のＤＮＡの配列を決定するために、クラスターは均質であり、任意の他のライブラリー要素からのＤＮＡを含有しない。クラスターが近すぎるか、極端に近く、重なり合っている場合、画像分析ソフトウェアはクラスターの境界を区別するのが難しく、データ抽出のためにそれらを単一の特徴に統合する場合がある。このクラスターからのデータは、２つの異なる配列を有する２つの異なるＤＮＡ断片に由来するため、ソフトウェアは配列を正確に決定することができない場合がある。クラスターがさらに離れている場合、各クラスターを個別に分析し、配列を正確に決定することができる。クラスターが離れすぎている場合、配列決定は非効率的になる。試料の処理コストは固定されており、クラスターあたりのコストが増加する。

【0005】

クラスターの間隔は個々のライブラリー要素の濃度によって決定されるため、これらのライブラリー要素の濃度を正確に決定する必要がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

要旨
本明細書には、ライブラリーを定量および定性するための方法、組成物、およびキットが記載されている。一部の実施形態は、ライブラリーを定量する方法に関する。例えば、本方法は、ＤＮＡ断片を提供すること、それぞれフルオロフォアで標識されたプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ断片を増幅することを含み得る。これらの事例では、所定の数のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合する。本方法は、増幅されたＤＮＡ断片によって生成された蛍光シグナルを検出すること、および検出された蛍光シグナルに基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することをさらに含み得る。

【0007】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片によって生成されたシグナルを検出する前に、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去し、または増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーによって生成されたシグナルをクエンチすることをさらに含み得る。

【0008】

一部の実施形態では、単一のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合している。

【0009】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片の蛍光に基づく配列決定のステップをさらに含み得る。

【0010】

一部の実施形態では、蛍光光度計を使用して増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアによって生成された蛍光シグナルを検出することにより、増幅されたＤＮＡ断片によって生成されたシグナルを検出することができる。

【0011】

一部の実施形態では、本方法は、標準ライブラリーに由来するＤＮＡ断片の数と、ＤＮＡ断片によって生成された蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成することをさらに含み得る。

【0012】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の数は、検出された蛍光シグナルおよび標準曲線に基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することにより、検出されたシグナルに基づいて算出され得る。

【0013】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片を、蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈することをさらに含み得る。

【0014】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定することをさらに含み得る。

【0015】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の特徴は、増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含み得る。

【0016】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片はアダプターを含むことができ、プライマーはアダプターに相補的である。

【0017】

一部の実施形態は、所定の数のフルオロフォアのみがそれぞれ結合したＤＮＡ断片を含む核酸ライブラリーに関し、それにより、結合したＤＮＡ断片により生成された蛍光シグナルに基づいてＤＮＡ断片の数が算出される。

【0018】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片は、所定の数のフルオロフォアのみが各ＰＣＲアンプリコン断片に結合するように、フルオロフォアでそれぞれ標識されたプライマーを使用して生成されるＰＣＲアンプリコンである。

【0019】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片はアダプターを含むことができ、プライマーはアダプターに相補的である。

【0020】

一部の実施形態は、ＤＮＡ試料を配列決定する方法に関する。例えば、本方法は、ＤＮＡ試料を使用してＤＮＡ断片を生成すること、およびそれぞれフルオロフォアで標識されたプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ断片を増幅することを含み得る。これらの事例では、所定の数のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合する。本方法は、増幅されたＤＮＡ断片によって生成される蛍光シグナルを検出すること、検出された蛍光シグナルに基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出すること、増幅されたＤＮＡ断片を蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈すること、および蛍光に基づく配列決定技術を使用して、増幅されたＤＮＡ断片の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含み得る。

【0021】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片によって生成されたシグナルを検出する前に、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去する、または増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーによって生成されるシグナルをクエンチすることをさらに含み得る。

【0022】

一部の実施形態では、単一のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合している。

【0023】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルは、蛍光光度計を使用して、増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された蛍光シグナルを検出することにより検出され得る。

【0024】

一部の実施形態では、本方法は、標準ライブラリーに由来するＤＮＡ断片の数と、ＤＮＡ断片によって生成された蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成することをさらに含み得る。

【0025】

一部の実施形態では、検出された蛍光シグナルにおよび標準曲線に基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することにより、検出されたシグナルに基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数が算出され得る。

【0026】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定することをさらに含み得る。

【0027】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の特徴は、増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含み得る。

【0028】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片はアダプターを含むことができ、プライマーはアダプターに相補的である。

【0029】

一部の実施形態は、ＤＮＡ断片に連結することができるアダプター、およびアダプターに相補的なプライマーを含むキットをさらに含み得る。各プライマーをフルオロフォアで標識し得、それにより、プライマーを使用してＤＮＡ断片を増幅し、所定の数のフルオロフォアのみで各ＤＮＡ断片を結合させる。

【0030】

一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のポリメラーゼを含み得る。

【0031】

一部の実施形態では、キットは、増幅のための試薬を含み得る。

【0032】

一部の実施形態では、キットは、配列決定のための試薬を含み得る。

【0033】

一部の実施形態では、キットは、キットの使用に関する指示書を含み得る。

【0034】

一部の実施形態では、キットは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの任意の混合物を含み得る。

【0035】

詳細な説明は、添付の図面を参照して説明される。図面において、参照番号の左端の数字は、参照番号が最初に現れる図を識別する。異なる図における同じ参照番号は、類似または同一のアイテムを示す。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】図１は、ライブラリー定量の例を示す図である。

【0037】

【図2】図２は、ライブラリー定量の別の例を示す図である。

【0038】

【図3】図３は、ライブラリー定量のさらに別の例を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0039】

詳細な説明
本明細書には、ライブラリーを定量および定性するための方法、組成物、およびキットが記載されている。本開示の実施形態は、ライブラリーの定量および定性のためにＤＮＡ断片に蛍光色素を結合させることが、その後の配列決定を妨げないという驚くべき発見に関する。一部の実施形態では、蛍光色素が結合したプライマーが、ライブラリーの定量および定性に使用される。蛍光色素が結合したプライマーはライブラリーに残存するが、その後のライブラリーの配列決定は、蛍光に基づく配列決定技術を使用して実施することができる。

【0040】

ＮＧＳライブラリーを定量するための様々な方法が報告されている。いくつかの方法は、様々な長さの断片の定量（曲線下面積の評価）と組み合わせたライブラリー要素の電気泳動分離に依存する。このアプローチでは、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が一般的に使用される。場合によっては、科学者は、特定のサイズの断片の質量を推定し、経験に基づいて補正係数を適用して、ライブラリーを希釈してシーケンサーの適切な範囲に収める量を決定し得る。他者は、この情報を総核酸質量と組み合わせて使用し、ＵＶ分光測光法により決定して、再度、実際の経験に基づいて補正係数を導き出す。さらに、他者は、ｑＰＣＲを使用して実際のライブラリー（総核酸ではない）の質量をより正確に決定し、これを、クラスター形成単位の数をより正確に決定するためにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒからの断片サイズ、およびＤＮＡシーケンサーに適用するための所望の濃度を取得するために試料を適切に希釈する仕方と組み合わせて使用する。

【0041】

これらの方法は効果的であり得るが、それらは、学習／判断、推定および／または費用および時間のかかるｑＰＣＲならびにＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ処理に依存している。ライブラリーには異なる長さの断片を含有し、所定の質量が与えられた断片の数を決定するには長さの情報が重要である。したがって、これらの方法の精度は、個体とライブラリーとの間で変動することがある。例えば、クラスター形成要素が、見積もられたそれらのサイズの半分である場合、予想よりも２倍の濃度になる可能性がある。さらに、溶液に存在するすべての断片が２つのアダプターまたは２つの異なるアダプターを有するわけではないため、これらの断片は、真のクラスター形成要素をマスクし、不正確な平均サイズ推定をもたらす可能性がある。

【0042】

本開示は、クラスターを生成することができる要素の数を決定するための技術を提供する。本開示の一部の実施形態は、ＵＶ分光測光法、ｑＰＣＲ、および平均断片サイズ推定などの技術に依存することなく、ライブラリーを定量および定性する方法に関する。

【0043】

一部の実施形態では、蛍光標識されたＰＣＲプライマーが、ライブラリー濃縮ステップで用いられ得る。濃縮ステップは、単一のフルオロフォアまたは断片ごとに所定の数のフルオロフォアを有するアンプリコンを生成するため、分子の数を決定することができる。各増幅産物（例えば、アンプリコン）は、その長さとは独立して、所定の数のフルオロフォアを有し得る。例えば、増幅された要素のみにフルオロフォアが結合している。ＰＣＲ濃縮後、組み込まれていないプライマーを除去し、蛍光プライマー／アンプリコンの量を蛍光測定的に決定する。溶液中の蛍光断片の数を決定するために、標準曲線を作成することができる。

【0044】

他に明記しない限り、生化学、核酸化学、分子生物学および分子遺伝学の用語および記号は、当該技術分野において標準的な論文およびテキストの用語および記号に従う。

【0045】

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈からそうでないことが明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリメラーゼ」への言及は、１つの薬剤またはこのような薬剤の混合物を指すことができ、「方法」への言及は、同等のステップおよび／または当業者に公知の方法などへの言及を含む。

【0046】

本明細書で使用される用語「アダプター」とは、既知の配列のオリゴヌクレオチドを指すことができ、その特定の核酸配列または対象の標的ポリヌクレオチド鎖への結合は、特定の核酸または対象の標的ポリヌクレオチド鎖の増幅可能な産物の生成を可能にする。特定の核酸試料は、少なくとも１つのアダプターを添加する前に断片化することもでき、または断片化しないこともできる。

【0047】

対象の特定の配列領域／鎖の増幅可能な産物の生成に適した様々なアダプター設計が想定される。例えば、二本鎖アダプターを使用する場合、アダプターの２本鎖は、自己相補的、非相補的、または部分的に相補的であり得る。アダプターは、少なくとも部分的なフォワード配列プライミング部位およびランダム配列を含有し得る。

【0048】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「増幅する」、「増幅」、および特定の核酸を「増幅する」とは、対象の核酸試料の複数コピーが、例えば、ＤＮＡコピーの形態で、生成される手法を指すことができる。ＰＣＲおよびｑＰＣＲなどの核酸を増幅するための多数の方法およびプロトコールが当該技術分野において公知である。

【0049】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「ｃＤＮＡ」とは、相補的ＤＮＡを指すことができる。ＤＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鋳型からの逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応において合成することができる。

【0050】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「相補的」とは、配列の全体または一部分のみに対する相補性を指すことができる。特定のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブのハイブリダイズ可能な配列中のヌクレオチドの数は、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブをハイブリダイズするために使用されるストリンジェンシー条件が過度のランダムな非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐことができるような数であり得る。オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブのハイブリダイズ部分におけるヌクレオチドの数は、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブが通常約２０〜約５０ヌクレオチドにハイブリダイズする標的ポリヌクレオチドの定義された配列と少なくとも同数であり得る。標的ポリヌクレオチド／オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプライマー、プライマーまたはプローブよりも大きくなり得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「変性する」は、二本鎖核酸の一本鎖への分離を指すことができる。変性は、当該技術分野において公知である方法のいずれかを使用して達成することができ、限定されないが、物理的、熱的、および／または化学的な変性を含む。

【0052】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される語句「ゲノムＤＮＡ」とは、ゲノムデオキシリボ核酸のｇＤＮＡと略される染色体ＤＮＡを指すことができる。ｇＤＮＡには、生物の遺伝物質が含まれる。

【0053】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される用語「ゲノム」とは、患者、組織、臓器、単一細胞、腫瘍、患者から採取した有機流体の検体、自由に循環する核酸、真菌、原核生物およびウイルスに由来する配列、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはｃＤＮＡを指すことができる。

【0054】

本明細書で使用される場合、用語「トランスクリプトーム」は、生物の発現ゲノムの一部分または全体を反映することができるすべてのＲＮＡ配列であり得る。

【0055】

本明細書で使用される場合、用語「キット」とは、材料を送達するための任意のシステムを指すことができる。反応アッセイとの関連で、このような送達システムは、ある場所から別の場所への適切な容器内で、オリゴヌクレオチド、緩衝成分、添加剤、反応促進剤、酵素などの反応成分の保存、輸送、または送達を可能にする要素を含むことができ、一般的に、アッセイを実施するための指示書が提供される。キットには、関連する反応試薬および補助材料を含有する１つまたは複数のエンクロージャーまたはボックスを含めることができる。キットは、２つまたはそれよりも多い別個の容器を含むことができ、これらの容器の各々は、キット全体の成分の一部分を含む。容器は、意図されたレシピエントに一緒にまたは別々に送達することができる。

【0056】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される語句「核酸（ＮＡ）修飾酵素」は、ＤＮＡ特異的修飾酵素を指すことができる。ＮＡ修飾酵素は、二本鎖ＤＮＡに対する特異性を選択することができる。酵素は、二重鎖特異的エンドヌクレアーゼ、平滑末端頻度カッター制限酵素、または別の制限酵素であり得る。

【0057】

本明細書で使用される場合、「核酸断片」および「特定の核酸」という語句は、互換的に使用され、本明細書で使用される場合、核酸試料の一部分を指すことができる。入力試料中の核酸は、断片化された核酸分子の集団または１つまたは複数の特定のサイズ範囲のポリヌクレオチドに断片化され得る。

【0058】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「特定の核酸配列」または「特定の配列」という語句は、デジタル測定および／または定量が望まれる対象のポリヌクレオチド配列であり得、限定されないが、核酸断片が含まれる。特定の配列は、その実際の配列の観点から、既知であるかまたは未知であり得る。本明細書で使用される「鋳型」は、特定の核酸配列を含有するポリヌクレオチドであり得る。「特定の配列」、「特定の核酸配列」、「特定のヌクレオチド配列」、「対象の領域」、または「対象の配列」という用語、およびそれらのバリエーションは、交換可能に使用される。

【0059】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「定性された核酸」および「標的核酸断片を定性する」という語句は、以下のようなｇＤＮＡまたはＲＮＡ配列の断片を指すことができる：ｉ．）ＤＮＡポリメラーゼの許容される鋳型、すなわち、鋳型は、ＤＮＡポリメラーゼに対する架橋または阻害剤を含まない、またはｉｉ．）鋳型は、限定されないが、ポリヌクレオチド配列５’および／もしくは３’末端での少なくとも１つのバーコード、アダプター、プライマーに相補的な配列などの結合を含む修飾を有し、それにより、断片は、定量、増幅、検出の目的で、またはｇＤＮＡおよびｃＤＮＡ配列分析の当業者に公知である他の方法に修飾することができる。

【0060】

本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」とは、典型的には２００残基長未満、例えば、１５〜１００ヌクレオチド長の間のポリヌクレオチド鎖を指すことができるが、より長いポリヌクレオチド鎖も包含することができる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり得る。本開示で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、用語「プライマー」、「プローブ」、および「アダプター」と交換可能に使用することができる。

【0061】

本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ」は、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」の略語であり、一般的に利用可能な核酸増幅技術である。一部の実施形態では、ＰＣＲは、次のＰＣＲサイクルで１つのプライマーの伸長が別のプライマーの鋳型を提供するように設計された各鎖に対して２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。一対のオリゴヌクレオチドプライマーのいずれか１つは、検討においてオリゴヌクレオチドプライマーを区別する目的で、本明細書において「フォワード」または「リバース」プライマーと命名することができる。ＰＣＲは、（ｉ）二本鎖核酸の鎖を分離する変性ステップ、それに続く（ｉｉ）プライマーが対象の配列に隣接する位置にアニーリングし得るアニーリングステップ、次に、（ｉｉｉ）５’から３’方向にプライマーを伸長し、それにより標的配列に相補的な核酸断片を形成する伸長ステップ、の反復（またはサイクル）からなることができる。上記ステップの各々は、自動サーモサイクラーを使用して異なる温度で実行することができる。ＰＣＲサイクルは、必要に応じて何度でも繰り返すことができ、その結果、使用されるプライマーの５’末端によって末端が通常定義される標的ＤＮＡ断片が指数関数的に蓄積する。

【0062】

本明細書で使用される語句「定量的ＰＣＲ」または「ｑＰＣＲ」は、試料中の１つまたは複数の特定の標的配列の存在量を測定するように設計されたＰＣＲを指すことができる。定量的測定は、個別にまたは標的核酸と一緒にアッセイされ得る１つまたは複数の参照核酸配列を用いて行うことができる。

【0063】

本明細書で使用される用語「一部分」とは、核酸配列、核酸配列断片、特定の核酸配列、特定の核酸断片、プローブ、プライマーなどの全長未満を指すことができる。

【0064】

本明細書で使用される用語「プライマー」とは、一般的に、遊離３’ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドを指し、これは、鋳型（例えば、特定のポリヌクレオチド、標的ＤＮＡ、標的ＲＮＡ、プライマー伸長産物またはプローブ伸長産物）とハイブリダイズまたはアニーリングすることができ、鋳型に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進することもできる。プライマーは、プライマーの尾部を構成する非ハイブリダイズ配列を含有することができる。プライマーは、その配列が標的に完全に相補的ではない場合でさえ、標的にハイブリダイズできる。

【0065】

本明細書で利用されるプライマーは、ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、伸長反応などの、ポリヌクレオチド鋳型に沿ったポリメラーゼによる伸長反応において用いられるオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、標的ポリヌクレオチドの配列とハイブリダイズすることができるその３’末端に配列を含有する、一本鎖であり得る合成ポリヌクレオチドであり得る。

【0066】

特定の核酸にハイブリダイズするプライマーの３’領域は、配列またはプライマー結合部位に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の相補性を含むことができる。

【0067】

本明細書で使用される用語「試料」とは、対象の核酸を含有するまたは含有することが推定される任意の物質を指すことができ、したがって、核酸、細胞、有機体、組織、体液（例えば、脊髄液またはリンパ液）、患者から採取された有機液の試料、および、限定されないが、血液、血漿、血清、尿、涙、便、呼吸器および泌尿生殖路、唾液、様々な臓器の断片、組織、血液細胞、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または播種性腫瘍細胞（ＣＴＤ）、骨、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養の試料、または核酸分子を含有すると疑われる検体などを含む試料が挙げられる。

【0068】

本明細書で使用される用語「ＰＣＲ複製」とは、同じ元の核酸分子に由来する任意の配列決定読み取りを指すことができ、そのため、したがって、別の配列決定読み取りと同じプライマー／プローブ伸長産物配列は、固有の核酸分子に代表的なものではない。

【0069】

定義、プロセス、方法の構造、および他の実施形態に関連する追加情報は、Ｎｕｇｅｎ Ｃｏｒｐ．に譲渡され、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許出願公開番号ＵＳ２０１６０２０３２５９に提供されている。

【0070】

本開示の実施形態は、ライブラリーを定量および定性するための方法、組成物、およびキットに関する。

【0071】

一部の実施形態は、ライブラリーを定量する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、ＤＮＡ断片を提供すること、およびそれぞれフルオロフォアで標識されたプライマーの存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ断片を増幅することを含み得る。これらの事例では、所定の数のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合する。本方法は、増幅されたＤＮＡ断片によって生成された蛍光シグナルを検出し、検出された蛍光シグナルに基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することをさらに含み得る。

【0072】

一部の実施形態は、２つまたはそれよりも多いタイプのプライマーを使用する、ライブラリーを定量する方法に関する。各プライマータイプは、関連付けられる単一のフルオロフォア、複数のフルオロフォアを有し、または完全にフルオロフォアがない場合がある。２つのタイプのプライマーを用いたこれらの実施形態について、第１のタイプは、関連付けられた単一のフルオロフォアを有し、第２のタイプのプライマーはフルオロフォアを欠損する。ＤＮＡ断片は、フルオロフォアで標識された少なくとも１つのプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され得、結果として、各ＤＮＡ断片に所定の数のフルオロフォアを結合させる。増幅されたＤＮＡ断片から生成された蛍光シグナルが検出され、検出された蛍光シグナルに基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数が算出される。一部の態様では、増幅されたＤＮＡ断片を所定濃度に希釈することによって、蛍光配列決定のためにＤＮＡ断片をさらに調製することができる。

【0073】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルを検出する前に、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去し、または増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーにより生成されたシグナルをクエンチすることをさらに含み得る。

【0074】

一部の実施形態では、定量測定を行う前に、組み込まれていない蛍光ＰＣＲプライマーを除去し得る。例えば、プライマーの蛍光はクエンチされ得る。ＰＣＲ反応後、蛍光オリゴに相補的であり、フルオロフォアをクエンチすることができる化合物が結合した短いオリゴをアニーリングすることによって、組み込まれていない色素のクエンチングを達成することができる。配列決定前に、複数の試料を一緒にプールすることが意図される場合、本開示の一部の実施形態は、粗試料を正確に定量し、適切な割合で混合し、次いで、個別ではなく集合として精製することができる。

【0075】

一部の実施形態では、粗混合物中の機能的要素を測定するためにクエンチャーを有する別個のオリゴを使用して、ヘアピン構造、およびフルオロフォアとクエンチャーの両方を有する濃縮用のオリゴを使用する。オリゴがヘアピン構造内にある場合、フルオロフォアおよびクエンチャーは、蛍光検出を妨げるのに十分近接している。オリゴ構造が緩和され、オリゴがＰＣＲ鋳型にアニールした場合、フルオロフォアとクエンチャーとの間隔が増大し、フルオロフォアが検出されるようになる。ＰＣＲの後、溶液を冷却した場合、組み込まれていないオリゴにおいてヘアピンが再形成される。測定が行われた場合、アンプリコンに組み込まれたオリゴが検出されるが、組み込まれていないオリゴは暗くなる。

【0076】

一部の実施形態では、単一のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合している。

【0077】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片の蛍光に基づく配列決定のステップをさらに含み得る。

【0078】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルは、蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）（あるいは「蛍光光度計（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）」と綴られる）を使用して、増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された蛍光シグナルを検出することにより検出され得る。

【0079】

一部の実施形態では、本方法は、標準ライブラリーに由来するＤＮＡ断片と、ＤＮＡ断片により生成された蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成することをさらに含み得る。

【0080】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の数は、検出された蛍光シグナルおよび標準曲線に基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することにより、検出されたシグナルに基づいて算出され得る。

【0081】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片を蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈することをさらに含み得る。

【0082】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定することをさらに含み得る。例えば、蛍光プライマーの測定に続いて、蛍光挿入色素を試料に添加し得る。蛍光挿入色素は、二本鎖ＤＮＡの総質量に比例して結合し得る。次に、この蛍光読み取り値を標準曲線と比較することにより、絶対質量を決定することができる。正確な要素数と総質量により、ライブラリー断片の平均サイズを決定することができる。測定により、ライブラリーの品質とライブラリーが正しく作製されているかどうかに関連付けられたデータが提供され得る。

【0083】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の特徴は、増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含み得る。

【0084】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片はアダプターを含み得、プライマーはアダプターに相補的である。

【0085】

一部の実施形態は、所定の数のフルオロフォアのみがそれぞれ結合したＤＮＡ断片を含む核酸ライブラリーに関し、それにより、結合したＤＮＡ断片により生成された蛍光シグナルに基づいてＤＮＡ断片の数が算出される。

【0086】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片は、所定の数のフルオロフォアのみが各ＰＣＲアンプリコン断片に結合するようにフルオロフォアでそれぞれ標識されたプライマーを使用して生成されるＰＣＲアンプリコンである。

【0087】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片はアダプターを含むことができ、プライマーはアダプターに相補的である。

【0088】

一部の実施形態は、ＤＮＡ試料を配列決定する方法に関する。例えば、本方法は、ＤＮＡ試料を使用してＤＮＡ断片を生成すること、およびそれぞれフルオロフォアで標識されたプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡ断片を増幅することを含み得る。これらの事例では、所定の数のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合する。本方法は、増幅されたＤＮＡ断片によって生成される蛍光シグナルを検出すること、検出された蛍光シグナルに基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出すること、増幅されたＤＮＡ断片を蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈すること、および蛍光に基づく配列決定技術を使用して、増幅されたＤＮＡ断片の少なくとも一部分を配列決定することをさらに含み得る。

【0089】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片によって生成されたシグナルを検出する前に、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去すること、または増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーによって生成されるシグナルをクエンチすることをさらに含み得る。

【0090】

一部の実施形態では、単一のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合している。

【0091】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルは、蛍光光度計を使用して、増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された蛍光シグナルを検出することによって検出され得る。

【0092】

一部の実施形態では、本方法は、標準ライブラリーに由来するＤＮＡ断片とＤＮＡ断片により生成された蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成することをさらに含み得る。

【0093】

一部の実施形態では、検出された蛍光シグナルおよび標準曲線に基づいて、増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することにより、検出されたシグナルに基づく増幅されたＤＮＡ断片の数が算出され得る。

【0094】

一部の実施形態では、本方法は、増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定することをさらに含み得る。

【0095】

一部の実施形態では、増幅されたＤＮＡ断片の特徴は、増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含み得る。

【0096】

一部の実施形態では、ＤＮＡ断片はアダプターを含むことができ、プライマーはアダプターに相補的である。

【0097】

一部の実施形態は、ＤＮＡ断片に連結することができるアダプター、およびアダプターに相補的なプライマーを含むキットをさらに含み得る。各プライマーをフルオロフォアで標識して、それにより、プライマーを使用してＤＮＡ断片を増幅し、所定の数のフルオロフォアのみで各ＤＮＡ断片を結合させることができる。

【0098】

一部の実施形態では、キットは、１つまたは複数のポリメラーゼを含み得る。

【0099】

一部の実施形態では、キットは、増幅のための試薬を含み得る。

【0100】

一部の実施形態では、キットは、配列決定のための試薬を含み得る。

【0101】

一部の実施形態では、キットは、キットの使用に関する指示書を含み得る。

【0102】

一部の実施形態では、キットは、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの任意の混合物を含み得る。

【0103】

本開示は、以下の実施例を参照してさらに説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、特に指定がない限り、限定することを意図したものではない。したがって、本開示は、決して以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、本明細書において提供される教示の結果として明らかになるいずれかのものおよびすべてのバリエーションを包含するものと解釈されるべきである。

【実施例】

【0104】

（実施例１）
蛍光標識ＰＣＲプライマー（／５６−ＦＡＭ／ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧ（配列番号１））を使用して、２つのＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡライブラリー（ＢＣ１１およびＢＣ１３）をＰＣＲ増幅した。精製されたライブラリーをＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで分析し、ライブラリーの平均サイズを決定し、結果を図１（Ａ）に示す。ライブラリーはまた、ＮａｎｏＤｒｏｐ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計およびＫＡＰＡライブラリー定量キットによって定量された。モル濃度は、ＫＡＰＡライブラリー定量キットによって決定された量、およびＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒによって決定されたライブラリーの平均サイズを使用して算出された。２〜８マイクロリットルのライブラリーを２００μＬのＴＥ緩衝液と混合し、Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光計で蛍光を読み取った。Ｑｕｂｉｔ蛍光読み取り値およびモル量の線形相関を図１（Ｂ）に示す。

【0105】

蛍光標識ＰＣＲプライマー（／５６−ＦＡＭ／ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧ（配列番号１））を使用して、２つのＩｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡライブラリー（ＢＣ１２およびＢＣ１４）をＰＣＲ増幅した。５マイクロリットルのライブラリーを２００μｌのＴＥ緩衝液と混合し、Ｑｕｂｉｔ ２．０蛍光計で蛍光を読み取った。ライブラリーＢＣ１３を標準として使用して、図２（Ａ〜Ｃ）に示されるようにライブラリーＢＣ１２およびＢＣ１４のモル濃度を算出した。４つのライブラリーの等モルプールをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑシーケンサーで配列決定した。配列決定の結果を図２（Ｄ）に示す。
（実施例２）

【0106】

蛍光標識ＰＣＲプライマー（／５６−ＦＡＭ／ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＡＴＡ ＣＧ（配列番号１））を最終ＰＣＲ増幅で使用することにより、６つのＤＮＡライブラリーを作製した。正確な要素数と総質量を用いて、ライブラリー断片の平均サイズを決定することができる。したがって、精製されたライブラリーをＡｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで分析して、ライブラリーの平均サイズを決定し、結果を図３（Ａ）に示した。２マイクロリットルのライブラリーを１９８μＬのＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ試薬または１９８μＬのＴＥ緩衝液のいずれかと混合し、蛍光をＱｕｂｉｔ ２．０蛍光計で蛍光を読み取った。結果を表１に示した。ライブラリーサイズとＱｕｂｉｔ読み取り値との比（ＤＮＡ色素／Ｆａｍ）の相関を図３（Ｂ）に示した。

【表1】

【0107】

主題が構造的特徴および／または方法論的作用に特有の言語で説明されているが、添付の特許請求の範囲において定義される主題は、上記の特定の特徴または作用に必ずしも限定されないことを理解されたい。むしろ、特定の機能および作用は、特許請求の範囲を実装する例示的な形態として開示されている。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
ライブラリーを定量する方法であって、
ＤＮＡ断片を提供すること；
フルオロフォアで標識された少なくとも１つのプライマーで、少なくとも１つのプライマーの存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記ＤＮＡ断片を増幅し、結果として、増幅された各ＤＮＡ断片に所定の数のフルオロフォアを結合させること；
前記増幅されたＤＮＡ断片から生成された蛍光シグナルを検出すること；
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出すること；および
前記増幅されたＤＮＡ断片を所定の濃度に希釈することにより、固相結合を調製すること
を含む方法。
（項目２）
前記増幅されたＤＮＡ断片によって生成されたシグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記少なくとも１つのプライマーが、第１のプライマータイプおよび第２のプライマータイプを含み、前記第１のプライマータイプが、結合した単一のフルオロフォアを有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
単一のフルオロフォアが各ＤＮＡ断片に結合している、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、項目２に記載の方法。
（項目６）
参照試料に由来するＤＮＡ断片の数と、前記ＤＮＡ断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
２回目の測定を行って、前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定すること
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
試料中のＤＮＡの総質量を決定することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴が、断片の数とＤＮＡの質量との間の比に由来する、前記増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＤＮＡ断片が少なくとも１つのアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、項目１に記載の方法。
（項目１２）
所定の数のフルオロフォアのみがそれぞれ結合したＤＮＡ断片を含む核酸ライブラリーであって、それにより、前記結合したフルオロフォアにより生成された蛍光シグナルに基づいて、前記ＤＮＡ断片の数が算出される、核酸ライブラリー。
（項目１３）
前記ＤＮＡ断片が２つの別個のプライマーを使用して生成されるＰＣＲアンプリコンであり、１つのプライマーがフルオロフォアで標識され、それにより、所定の数のフルオロフォアのみが各ＰＣＲアンプリコン断片に結合する、項目１２に記載の核酸ライブラリー。
（項目１４）
前記ＤＮＡ断片がアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、項目１２に記載の核酸ライブラリー。
（項目１５）
ＤＮＡ試料を配列決定する方法であって、
前記ＤＮＡ試料を使用してＤＮＡ断片を生成すること；
１つのプライマーがフルオロフォアで標識された２つの別個のプライマーの存在下でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記ＤＮＡ断片を増幅して、各ＤＮＡ断片に結合する所定の数のフルオロフォアを提供すること；
前記増幅されたＤＮＡ断片によって生成された蛍光シグナルを検出すること；
前記検出された蛍光シグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出すること；
前記増幅されたＤＮＡ断片を、蛍光に基づく配列決定に適した所定の濃度に希釈すること；および
蛍光に基づく配列決定技術を使用して、前記増幅されたＤＮＡ断片の少なくとも一部分を配列決定すること
を含む方法。
（項目１６）
前記増幅されたＤＮＡ断片によって生成された前記シグナルを検出する前に、
蛍光配列決定の調製において前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれていないプライマーを除去すること
をさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
単一のフルオロフォアのみが各ＤＮＡ断片に結合している、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記増幅されたＤＮＡ断片により生成されたシグナルを検出することが、蛍光光度計を用いて、前記増幅されたＤＮＡ断片に組み込まれたフルオロフォアにより生成された前記蛍光シグナルを検出することを含む、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
標準ライブラリーに由来するＤＮＡ断片の数と、前記ＤＮＡ断片によって生成される蛍光シグナルとの間の関係を示す標準曲線を生成すること
をさらに含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記検出されたシグナルに基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することが、前記検出された蛍光シグナルおよび前記標準曲線に基づいて、前記増幅されたＤＮＡ断片の数を算出することを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴を決定すること
をさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記増幅されたＤＮＡ断片の特徴が、前記増幅されたＤＮＡ断片の平均サイズを含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ＤＮＡ断片がアダプターを含み、前記プライマーが前記アダプターに相補的である、項目１５に記載の方法。
（項目２４）
ライブラリーアダプターに相補的な２つの別個のプライマーを含むキットであって、少なくとも１つのプライマーがフルオロフォアで標識され、それにより、ＤＮＡ断片が所定の数の結合したフルオロフォアを有するプライマーを使用して増幅される、キット。
（項目２５）
１つまたは複数のポリメラーゼをさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目２６）
増幅のための試薬をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目２７）
配列決定のための試薬をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目２８）
キットの使用に関する指示書をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目２９）
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはそれらの任意の混合物をさらに含む、項目２４に記載のキット。
（項目３０）
ＤＮＡ断片に連結することができるアダプターをさらに含む、項目２４に記載のキット。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]