特許 6984074 標的検体測定におけるビオチン干渉を補正するための多重アッセイのための組成物、キットおよび方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6984074

(24)【登録日】2021年11月26日

(45)【発行日】2021年12月17日

(54)【発明の名称】標的検体測定におけるビオチン干渉を補正するための多重アッセイのための組成物、キットおよび方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20211206BHJP

   G01N 33/536 20060101ALI20211206BHJP

   G01N 35/10 20060101ALI20211206BHJP

   G01N 37/00 20060101ALI20211206BHJP

   G01N 21/64 20060101ALI20211206BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/53 U

   G01N33/536 D

   G01N33/536 E

   G01N35/10 A

   G01N37/00 101

   G01N21/64 Z

   G01N21/64 F

【請求項の数】38

【全頁数】28

(21)【出願番号】特願2021-531081(P2021-531081)

(86)(22)【出願日】2019年9月19日

(65)【公表番号】特表2021-529975(P2021-529975A)

(43)【公表日】2021年11月4日

(86)【国際出願番号】US2019051895

(87)【国際公開番号】WO2020068548

(87)【国際公開日】20200402

【審査請求日】2021年5月28日

(31)【優先権主張番号】62/735,905

(32)【優先日】2018年9月25日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】508147326

【氏名又は名称】シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(72)【発明者】

【氏名】ティエ・ウェイ

【審査官】 海野 佳子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００９−５３６７４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許出願公開第２０１５／０１９８５２８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／００３４４４５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００５／０１４７５３１（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプル中のビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体の濃度を決定するための化学発光検出システムを利用する多重アッセイを実行するためのキットであって：
（ａ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合しているビオチンまたはその類似体を有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物と；
活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子と
を含む組成物と；
（ｂ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合している標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物と；
活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子であって、（ａ）の蛍光分子と異なり、（ａ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、蛍光分子と
を含む組成物と；
（ｃ）標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｂ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと；
（ｄ）一重項酸素をその励起状態において生成することができ、増感剤に直接的または間接的に結合しているビオチン特異的結合パートナーを有することができる増感剤を含む組成物と
を含む、前記キット。

【請求項2】

一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、一重項酸素との化学反応を受けて、同時または後の発光により分解することができる準安定中間体種を形成する物質である、請求項１に記載のキット。

【請求項3】

増感剤は光増感剤である、請求項１に記載のキット。

【請求項4】

（ｂ）および（ｃ）の第１および第２の検体特異的結合パートナーの各々は、標的検体に対する抗体である、請求項１に記載のキット。

【請求項5】

（ｄ）のビオチン特異的結合パートナーは、アビジンまたはその類似体である、請求項１に記載のキット。

【請求項6】

（ｄ）のビオチン特異的結合パートナーは、ビオチンに対する抗体である、請求項１に記載のキット。

【請求項7】

（ａ）および／または（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、それに直接的または間接的に結合しているハプテンを有する、請求項１に記載のキット。

【請求項8】

（ａ）および（ｂ）の蛍光分子は、各々独立して、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される、請求項１に記載のキット。

【請求項9】

テルビウムは約５４５ｎｍの波長で発光し；
ウランは約６１２ｎｍの波長で発光し；かつ
サマリウムは約６４５ｎｍの波長で発光する、
請求項８に記載のキット。

【請求項10】

（ｅ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合している第２の標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物と；
活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子であって、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なり、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、蛍光分子と
を含む組成物と；
（ｆ）第２の標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｅ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる第２の標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと
をさらに含む、請求項１に記載のキット。

【請求項11】

（ｅ）の蛍光分子は、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される、請求項１０に記載のキット。

【請求項12】

サンプル中のビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体の濃度を決定するためのマイクロ流体デバイスであって：
（ｉ）サンプルが適用される入口チャネルと；
（ｉｉ）入口チャネルと流体連絡することができ、
（ａ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合しているビオチンまたはその類似体を有する、少なくとも第１の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含む、第１の組成物と；
（ｂ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合している標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する少なくとも第２の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）の蛍光分子と異なり、（ａ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第２の組成物と；
（ｃ）標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｂ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと；
（ｄ）一重項酸素をその励起状態において生成することができ、増感剤に直接的または間接的に結合しているビオチン特異的結合パートナーを有することができる増感剤を含む組成物と
を含有することができる少なくとも第１の区画と
を含む、前記マイクロ流体デバイス。

【請求項13】

（ａ）〜（ｄ）は同じ区画に存在する、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項14】

（ａ）〜（ｄ）は２つまたはそれ以上の区画の間で分割される、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項15】

（ａ）および（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、一重項酸素との化学反応を受けて、同時または後の発光により分解することができる準安定中間体種を形成する物質である、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項16】

増感剤は光増感剤である、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項17】

（ｂ）および（ｃ）の第１および第２の検体特異的結合パートナーの各々は、標的検体に対する抗体である、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項18】

（ｉｉｉ）のビオチン特異的結合パートナーは、アビジンまたはその類似体である、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項19】

（ｉｉｉ）のビオチン特異的結合パートナーは、ビオチンに対する抗体である、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項20】

（ａ）および／または（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、それに直接的または間接的に結合しているハプテンを有する、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項21】

（ａ）および（ｂ）の蛍光分子は、各々独立して、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項22】

テルビウムは約５４５ｎｍの波長で発光し；
ウランは約６１２ｎｍの波長で発光し；かつ
サマリウムは約６４５ｎｍの波長で発光する、
請求項２１に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項23】

（ｉｉ）は：
（ｅ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合しているその第２の検体標的についての第１の検体特異的結合パートナーを有する少なくとも第３の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なり、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第３の組成物と；
（ｆ）第２の標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｅ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる第２の標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと
をさらに含有する、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項24】

第３の組成物の蛍光分子は、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される、請求項２３に記載のマイクロ流体デバイス。

【請求項25】

サンプル中のビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体の存在および／または濃度を検出するための方法であって：
（１）ビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体を含有すると疑われるサンプルを：
（ａ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合しているビオチンまたはその類似体を有する少なくとも第１の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含む、第１の組成物と；
（ｂ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合している標的検体の第１の検体特異的結合パートナーを有する少なくとも第２の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）の蛍光分子と異なり、（ａ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第２の組成物と；
（ｃ）標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｂ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと；
（ｄ）一重項酸素をその励起状態において生成することができ、増感剤に直接的または間接的に結合しているビオチン特異的結合パートナーを有することができる増感剤を含む過剰な組成物と
同時にまたは全体的もしくは部分的に連続して合わせる工程と；
（２）サンプル中に存在する標的検体への（ｂ）および（ｃ）の結合ならびに（ｄ）への（ｃ）の結合を可能にする工程であって、（（ｃ）および標的検体を介する）（ｄ）への（ｂ）の間接的な結合は、増感剤が化学発光化合物と近接する標的検体複合体の形成を生じ、（ａ）はサンプル中のビオチンの不在下で（ｄ）に結合し、増感剤が化学発光化合物と近接するビオチン複合体の形成を生じる、工程と、
（３）増感剤を活性化して一重項酸素を生成する工程であって、ビオチン複合体および標的検体複合体に存在する増感剤の活性化は、各複合体に存在する化学発光化合物の活性化を引き起こす、工程と；
（４）（ａ）の蛍光分子によって発せられた光の量を測定することによってビオチン複合体における活性化された化学発光化合物によって生じる化学発光の量を決定する工程であって、サンプル中のビオチンの量は発せられた光の量と反比例する、工程と；
（５）（ｂ）の蛍光分子によって発せられた光の量を測定することによって標的検体複合体における活性化された化学発光化合物によって生じる化学発光の量を決定して、サンプル中の標的検体の量を決定する工程と；
（６）場合により、工程（２）〜（５）を反復する工程と；
（７）工程（４）において検出されたいくらかのビオチン干渉に基づいて工程（５）の結果を補正する工程または工程（４）において検出されたビオチン濃度が最大閾値レベルを超える場合、工程（５）の結果を信頼できないとしてフラグ付けする工程と
を含む、前記方法。

【請求項26】

一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、一重項酸素との化学反応を起こして、同時または後の発光により分解することができる準安定中間体種を形成する物質である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

増感剤は光増感剤であり、工程（３）における増感剤の活性化は光による照射を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

サンプルは生体サンプルである、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

生体サンプルは、全血またはそのいずれかの部分、尿、唾液、痰、脳脊髄液、皮膚、腸液、腹腔内液、嚢胞液、汗、間質液、細胞外液、涙、粘液、膀胱洗浄液、精液、糞便、胸膜液、鼻咽頭液、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

（ｂ）および（ｃ）の第１および第２の検体特異的結合パートナーの各々は、標的検体に対する抗体である、請求項２５に記載の方法。

【請求項31】

（ｄ）のビオチン特異的結合パートナーは、アビジンまたはその類似体である、請求項２５に記載の方法。

【請求項32】

（ｄ）のビオチン特異的結合パートナーは、ビオチンに対する抗体である、請求項２５に記載の方法。

【請求項33】

（ａ）および／または（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、それに直接的または間接的に結合しているハプテンを有する、請求項２５に記載の方法。

【請求項34】

（ａ）および（ｂ）の蛍光分子は、各々独立して、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

【請求項35】

テルビウムは約５４５ｎｍの波長で発光し；
ウランは約６１２ｎｍの波長で発光し；かつ
サマリウムは約６４５ｎｍの波長で発光する、
請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

工程（１）は：
（ｅ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合している第２の標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含む少なくとも第３の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なり、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第３の組成物と；
（ｆ）第２の標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｅ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる第２の標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと
を（ａ）〜（ｄ）と合わせる工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項37】

（８）（ｅ）の蛍光分子によって発せられた光の量を測定することによって第２の標的検体複合体における活性化された化学発光化合物によって生じる化学発光の量を決定して、サンプル中の標的検体の量を決定する工程と；
（９）工程（４）において検出されたいくらかのビオチン干渉に基づいて工程（８）の結果を補正する工程または工程（４）において検出されたビオチン濃度が最大閾値レベルを超える場合、工程（８）の結果を信頼できないとしてフラグ付けする工程と
をさらに含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

（ｅ）の蛍光分子は、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照／参照による組み入れの記述
対象の出願は、２０１８年９月２５日に出願された米国仮出願第６２／７３５，９０５号に対し米国特許法第１１９条（ｅ）の下で利益を主張する。上記の参照特許出願の全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。

【0002】

連邦政府の支援による研究または開発に関する記述
適用なし。

【背景技術】

【0003】

診断アッセイ試薬は、多くの場合、抗体または他の小薬物分子と、ビオチンおよびフルオレセインのような、ハプテンとのコンジュゲートを含む。固体支持体または表面上に被覆される大きなタンパク質分子へのこれらのハプテンの強固な結合（例えば、ビオチンに対するアビジン／ストレプトアビジンおよびフルオレセインに対する抗ＦＩＴＣ）は、固体支持体／表面上にハプテン−抗体またはハプテン−薬物コンジュゲートを固定化するための簡便な手法を提供する。

【0004】

ビオチンは、栄養補助食品としてのその使用に関して当該技術分野において周知であり；例えば、ビオチンは、健康な毛髪および爪の成長を促進し、種々の疾患状態を処置するために利用される。この使用が与えられると、有意なビオチンレベルが、（限定されないが）血液のような生体サンプルにおいて見出される。ビオチンは多くの診断アッセイ（例えば、固体支持体を被覆するため）に使用されるので、試験サンプル中の高レベルのビオチンは、ビオチン化アッセイ成分が利用される任意のアッセイにおいてアッセイシグナルと干渉することがある。これは特に、Ｓｉｅｍｅｎｓ’ ＡＤＶＩＡ ＣＥＮＴＡＵＲ（登録商標）免疫アッセイシステム、ＤＩＭＥＮＳＩＯＮ ＥＸＬ（商標）統合化学システム、およびＤＩＭＥＮＳＩＯＮ ＶＩＳＴＡ（登録商標）ＬＯＣＩ（登録商標）システム（Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）において見出されるもののようなアッセイに当てはまり、ビオチン化アッセイ成分はストレプトアビジンにより被覆された固体支持体に結合すると予想される。

【0005】

干渉は異なるビオチン濃度で種々のアッセイ方法において観察されるので、患者サンプル中に存在するビオチンのレベルは、サンプルが特定のアッセイにおける使用に適しているかどうかを決定するために定量されなければならない。しかしながら、現在利用可能なビオチンアッセイのほとんどは、実際の患者サンプル中に典型的に見出されるビオチン濃度の広い動的範囲（すなわち、０〜１５００ｎｇ／ｍｌ）を検出するのに適していない狭い範囲（すなわち、０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を有する。

【0006】

例としてビオチンを使用すると、ハプテン干渉の問題を軽減する３つの手法が存在する。１つは予め形成された試薬を使用することであり、すなわち、ビオチン化アッセイ成分は、試薬製造の間、ストレプトアビジンにより被覆された固体支持体と「予め結合する」。ストレプトアビジンとビオチンとの間の強固な結合および遅いオフレートのために、ストレプトアビジンから既に結合したビオチンを患者サンプル中の流入するビオチンと置き換えることは優位なプロセスではない。第２の手法は、固体支持体上のストレプトアビジン結合部位を増加させることであり、その結果、ビオチン化アッセイ成分に加えて、サンプルビオチン分子に利用可能な追加の結合部位が存在する。第３の手法は上記の両方の組合せである。しかしながら、これらの３つのストラテジーのいずれも、活性アッセイ成分としてのビオチン−ストレプトアビジンの使用が完全に回避されない限り、ビオチン干渉の問題を真に解決しない。上記の解決策の全てに関する別の主要な問題はアッセイ成分が干渉の阻止に関与することであり、これはアッセイシグナル自体の大きさに容易に影響を及ぼし得る。

【0007】

特許文献１は、遊離ビオチンを濾過する目的のために、ビオチン結合コアおよびタンパク質、炭水化物またはコポリマーの被覆層を有するポリマー粒子の使用を教示しているが、大きな分子とコンジュゲートしたビオチンを濾過していない。このアプローチはいくつかのアッセイ形式に効果的であり得るが、それはまた、アッセイシグナルと干渉し得る余分な吸光度を生じ得る粒子を導入する。

【0008】

医療診断の分野は多くの異なる形態のアッセイ技術を利用する。商業的に使用されるアッセイの一例は、発光性酸素チャネリングアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ）（ＬＯＣＩ（登録商標））技術である。ＬＯＣＩ（登録商標）による進化した化学発光アッセイは、例えば、特許文献２（Ｕｌｌｍａｎら）に記載されており、その全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。現在利用可能なＬＯＣＩ（登録商標）技術は高い感度を有し、いくつかの試薬を使用する。特に、ＬＯＣＩ（登録商標）アッセイは、これらの試薬のうちの２つ（「センシビーズ（ｓｅｎｓｉｂｅａｄ）」および「ケミビーズ（ｃｈｅｍｉｂｅａｄ）」と称される）が、センシビーズおよびケミビーズが互いに近接してシグナルを達成する様式で他の特異的結合パートナーアッセイ試薬によって保持されることを必要とする。ある特定の波長の光に曝露すると、センシビーズは一重項酸素を放出し、２つのビーズが近接している場合、一重項酸素はケミビーズに移動する；これにより化学反応が引き起こされ、その結果、ケミビーズが、異なる波長で測定することができる光を発する。

【0009】

しかしながら、ＬＯＣＩ（登録商標）形式で利用可能なビオチンアッセイまたはＬＯＣＩ（登録商標）形式においてサンプルビオチンによって引き起こされる干渉を排除する任意の現在利用可能な方法は存在しない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許第５，２１２，０６３号

【特許文献2】米国特許第５，３４０，７１６号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

したがって、従来技術の不利益および欠点を克服するビオチン干渉を検出し、補正するための新規かつ改良されたアッセイが当該技術分野において必要とされている。本開示が対象とするのは、このようなアッセイ、ならびにキットおよびそれを含有するマイクロ流体デバイスおよびそれを使用する方法である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】本開示の１つの非限定的な実施形態において利用される多重アッセイ成分を概略的に示す図である。

【図2】ビオチンおよび標的検体が試験サンプル中に存在するか否かに応じて、図１の多重アッセイ成分から形成される複合体を概略的に示す図である。

【図3】本開示に従って利用することができるアクセプタービーズの２つの非限定的な実施形態（上側パネル）および本開示に従って実行される多重アッセイ（下側パネル）を概略的に示す図である。

【図4】２つの検体、タンパク質Ｘ（ＰｒＸ）およびビオチンが測定されるべきである、本開示に従って構築された多重アッセイの１つの非限定的な実施形態についてのアッセイ順序を示す図である。Ｓ、サンプル。Ｓビオチン、サンプルビオチン。Ａｂ１、ＰｒＸに対する第１の抗体。Ａｂ２、ＰｒＸに対する第２の抗体。ＣＢ、ケミビーズ。ＳＢ、センシビーズ。「：：」は結合を表す。

【図5】ビオチンシグナルが適切な較正によってどのように濃度（［ビオチン］ｎｇ／ｍｌ）に変換されるかをグラフで示す図である。

【図6】本開示に従う多重アッセイの１つの非限定的な実施形態における、標的検体シグナルとのビオチン干渉およびその補正に関連する様々なシナリオをグラフで示す図である。

【図7】本開示に従って多重アッセイによって得られたデータの仮定シナリオを提供し、標的検体シグナルに対するサンプルビオチンによる干渉パーセントを実証する表を含む図である。

【図8】標的検体シグナルがサンプルビオチンシグナルまたは濃度に基づいて補正される１つの非限定的な方法を含む図である。

【図9】標的検体シグナルがサンプルビオチンシグナルまたは濃度に基づいて補正される別の非限定的な方法を含む図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

例示的な言語および結果によって本開示の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本開示は、その適用において以下の説明に記載される構成の詳細および構成要素の配列に限定されないことは理解されるべきである。本開示は、他の実施形態が可能であるか、または種々の手法で実践もしくは実行することができる。したがって、本明細書に使用される言語は、可能な限り最も広い範囲および意味を与えることを意図し；実施形態は包括的ではなく、例示的であることを意味する。また、本明細書に利用される表現および用語は、説明の目的のためであり、限定的とみなされるべきではないことは理解されるべきである。

【0014】

本明細書で別段に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって別段に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。前述の技術および手順は、一般に、当該技術分野において周知であり、本明細書全体を通して引用され、論じられている種々の一般的およびより具体的な参考文献に記載されている従来の方法に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学、ならびに医薬品化学および薬化学と関連して利用される命名法、ならびにそれらの実験手順および技術は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されているものである。標準的な技術が化学合成および化学分析のために使用される。

【0015】

本明細書において述べられている全ての特許、公開された特許出願、および非特許刊行物は、本開示が関係する当業者の技術レベルを示す。本出願のいずれかの部分に参照されている全ての特許、公開された特許出願、および非特許刊行物は、各個々の特許または刊行物が参照によって組み入れることを具体的かつ個別に示している場合と同じ程度までそれらの全体を参照によって明示的に本明細書に組み入れる。

【0016】

本明細書に開示される物品、組成物、キットおよび／または方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製され、実行される。物品、組成物、キットおよび／または方法は特定の実施形態に関して記載されているが、本開示の概念、趣旨および範囲から逸脱せずに、物品、組成物、キットおよび／または方法に対して、ならびに本明細書に記載される方法の工程または一連の工程において変更を適用することができることは当業者には明らかであろう。当業者に明らかである全てのこのような同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の趣旨、範囲および概念内であるとみなされる。

【0017】

本開示に従って利用される場合、別段に示さない限り、以下の用語は以下の意味を有すると理解されるべきである：

【0018】

特許請求の範囲および／または明細書において「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と併せて使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味することがあるが、それはまた、「１つまたはそれ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つより多い」の意味と一致する。したがって、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その」という用語は、文脈が明確に別段を示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「化合物」に対する言及は、１つもしくはそれ以上の化合物、２つもしくはそれ以上の化合物、３つもしくはそれ以上の化合物、４つもしくはそれ以上の化合物、またはより多い数の化合物を指すことがある。「複数」という用語は、「２つまたはそれ以上」を指す。

【0019】

「少なくとも１つ」という用語の使用は、１つおよび限定されないが、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００などを含む１つより多い任意の量を含むと理解されるだろう。「少なくとも１つ」という用語は、それが付されている用語に応じて、１００または１０００またはそれ以上にまで及ぶことがある；さらに、より高い限界値も満足のいく結果をもたらす可能性があるため、１００／１０００の量は限定的と考えられるべきではない。さらに、「Ｘ、Ｙ、およびＺのうちの少なくとも１つ」という用語の使用は、Ｘ単独、Ｙ単独、およびＺ単独、ならびにＸ、ＹおよびＺの任意の組合せを含むと理解されるだろう。序数の用語（すなわち、「第１」、「第２」、「第３」、「第４」など）の使用は、２つまたはそれ以上の項目を区別する目的のためのみであり、例えば、任意の順列もしくは順序または１つの項目の別の項目に対する重要性あるいは添加の任意の順序を意味することを意図するものではない。

【0020】

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すように明示的に示されない限りまたは選択肢が相互に排他的でない限り、包括的な「および／または」を意味するために使用される。例えば、条件「ＡまたはＢ」は、以下のいずれかによって満たされる：Ａは真であり（または存在する）、かつＢは偽である（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在しない）、かつＢは真である（または存在する）、およびＡとＢは両方とも真である（または存在する）。

【0021】

本明細書で使用される場合、「１つの実施形態」、「ある実施形態」、「いくつかの実施形態」、「１つの例」、「例えば」または「ある例」に対するいずれかの言及は、実施形態に関連して記載される特定の要素、機能、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。例えば、明細書の種々の場所における「いくつかの実施形態において」または「１つの例」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、１つまたはそれ以上の実施形態または例に対する言及は、全て、特許請求の範囲を限定するものではないと解釈されるべきである。

【0022】

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が組成物／装置／デバイスについての誤差の固有の変動、値を決定するために用いられる方法、または研究対象の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。例えば、限定するものではないが、「約」という用語が利用される場合、指定された値は、特定された値から、プラスマイナス２０パーセント、または１５パーセント、または１２パーセント、または１１パーセント、または１０パーセント、または９パーセント、または８パーセント、または７パーセント、または６パーセント、または５パーセント、または４パーセント、または３パーセント、または２パーセント、または１パーセントだけ変化することがあり、このような変動は、開示された方法を実施するのに適切であり、当業者によって理解されている通りである。

【0023】

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」のような含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」のような有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」のような含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」のような含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形）という単語は、包括的であるかまたは無制限であり、追加の、引用されていない要素または方法ステップを排除しない。

【0024】

本明細書で使用される場合、「またはそれらの組合せ」という用語は、この用語に先立って列挙された項目の全ての順列および組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃまたはそれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣまたはＡＢＣの少なくとも１つを含むことを意図し、特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣまたはＣＡＢも、含むことを意図する。この例に引き続いて、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどのような、１つまたはそれ以上の項目または用語の繰り返しを含有する組合せも明示的に含まれる。当業者は、文脈からそうでないことが明らかでない限り、典型的には、いかなる組合せにおいても項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。

【0025】

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、それに引き続いて記載される事象もしくは状況が完全に起きるか、またはそれに引き続いて記載される事象もしくは状況が大いにもしくはかなりの程度起きることを意味する。例えば、特定の事象または状況と関連する場合、「実質的に」という用語は、それに引き続いて記載される事象または状況が時間の少なくとも８０％、または時間の少なくとも８５％、または時間の少なくとも９０％、または時間の少なくとも９５％に起きることを意味する。「実質的に隣接している」という用語は、２つの項目が互いに１００％隣接していること、または２つの項目が互いに近接している範囲内であるが、互いに１００％隣接していないこと、または２つの項目のうちの１つの一部が他の項目に１００％隣接していないが、他の項目に近接している範囲内であることを意味することがある。

【0026】

本明細書で使用される場合、「会合する」および「連結する」という語句は、２つの部分の互いに直接的な会合／結合および２つの部分の互いに間接的な会合／結合の両方を含む。会合／連結の非限定的な例には、例えば、直接結合によるもしくはスペーサー基を介した１つの部分の別の部分への共有結合、直接的なもしくは両部分に結合している特異的結合対メンバーによる１つの部分の別の部分への非共有結合、１つの部分の別の部分への溶解もしくは合成によるような１つの部分の別の部分への組み込み、および１つの部分の別の部分への被覆が含まれる。

【0027】

「類似体」および「誘導体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、その構造において所与の化合物と同じ基本的な炭素骨格および炭素官能基を含むが、それらに対する１つまたはそれ以上の置換も含有することができる物質を指す。本明細書で使用される場合、「置換」という用語は、化合物上の少なくとも１つの置換基の残基Ｒによる置き換えを指すと理解されるだろう。ある特定の非限定的な実施形態では、Ｒは、Ｈ、ヒドロキシル、チオール、フッ化物、塩化物、臭化物またはヨウ化物から選択されるハロゲン化物、以下：場合により置換されている、直鎖、分枝または環状アルキル、および直鎖、分枝または環状アルケニルのうちの１つから選択されるＣ１−Ｃ４化合物を含んでもよく、任意選択の置換基は、１つまたはそれ以上のアルケニルアルキル、アルキニルアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニルアルキル、アリールアルキル、ヘテロアリールアルキル、複素環アルキル、場合により置換されているヘテロシクロアルケニルアルキル、アリールシクロアルキル、およびアリールヘテロシクロアルキルから選択され、それらの各々は場合により置換されており、任意選択の置換基は、アルケニルアルキル、アルキニルアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニルアルキル、アリールアルキル、アルキルアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環アルキル、場合により置換されているヘテロシクロアルケニルアルキル、アリールシクロアルキル、およびアリールヘテロシクルアルキル、フェニル、シアノ、ヒドロキシル、アルキル、アリール、シクロアルキル、シアノ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、−ＮＨ（アルキル）、−ＮＨ（シクロアルキル）_２、カルボキシ、および−Ｃ（Ｏ）−アルキルのうちの１つまたは複数から選択される。

【0028】

本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、本開示に従って利用することができる任意の種類の生体サンプルを含むと理解されるだろう。利用することができる流体生体サンプルの例には、限定されないが、全血またはそのいずれかの部分（すなわち、血漿または血清）、尿、唾液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、皮膚、腸液、腹腔内液、嚢胞液、汗、間質液、細胞外液、涙、粘液、膀胱洗浄液、精液、糞便、胸膜液、鼻咽頭液、それらの組合せなどが含まれる。

【0029】

特に（限定する目的ではないが）本明細書で使用される場合、「ビオチン特異的結合パートナー」または「標的検体特異的結合パートナー」という用語における「特異的結合パートナー」という用語は、それぞれビオチンまたは標的検体と特異的に会合することができる任意の分子を指すと理解される。例えば、限定する目的ではないが、結合パートナーは、抗体、受容体、リガンド、アプタマー、分子インプリントポリマー（すなわち、無機マトリクス）、それらの組合せまたは誘導体、ならびにビオチンまたは標的検体にそれぞれ特異的に結合することができる任意の他の分子であってもよい。

【0030】

「抗体」という用語は、最も広い意味において本明細書で使用され、例えば、インタクトなモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、検体結合の所望の生物活性を示す抗体断片およびそのコンジュゲート（例えば、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ダイアボディ、一本鎖抗体、ならびにインタクトな抗体の可変領域の少なくとも一部を保持する他の抗体断片およびそのコンジュゲート）、抗体置換タンパク質またはペプチド（すなわち、操作された結合タンパク質／ペプチド）、ならびにそれらの組合せまたは誘導体を指す。抗体は、任意の種類またはクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＡ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）であってもよい。

【0031】

本明細書で使用される場合、「ハプテン」という用語は、（限定されないが）抗体のような標的検体特異的結合パートナーによって認識することができる小さなタンパク質性または非タンパク質抗原決定基（または「エピトープ」）を指す。本明細書で使用される場合、「ポリハプテン」という用語は、それに付着される複数のエピトープ／抗原決定基を含有する合成分子を指すと理解される。

【0032】

「検体」は、（限定されないが）抗体のような検体特異的結合パートナーによって認識することができる巨大分子である。検体およびハプテンの両方は、少なくとも１つの抗原決定基または「エピトープ」を含み、それは検体特異的結合パートナー（すなわち、抗体）に結合する抗原またはハプテンの領域である。典型的に、ハプテンにおけるエピトープは分子全体である。

【0033】

本開示のある特定の非限定的な実施形態は、サンプル中のビオチンおよび標的検体の両方を検出するための多重アッセイならびにそれを含有するキットおよびその使用方法を対象とする。一部のアッセイ実施形態では、シグナル生成システム（ｓｐｓ）メンバーは、例えば、光増感剤および２つまたはそれ以上の化学発光−蛍光分子組成物のような増感剤を含み（第１の化学発光組成物はビオチンの存在に関連するシグナルを生成するのに対して、少なくとも第２の化学発光組成物は標的検体の存在に関連するシグナルを生成する）；これらのアッセイ実施形態では、増感剤の活性化は化学発光組成物を活性化する産生物を生じ、それによって検出される結合標的検体および結合ビオチンの量に関連する検出可能なシグナルを生成する。本開示が基づくことができるアッセイプラットフォームの例示的（しかし非限定的）な実施形態は、発光酸素チャネリングアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｈａｎｎｅｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ）（ＬＯＣＩ（登録商標）；Ｓｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．、Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）である。ＬＯＣＩ（登録商標）アッセイは、例えば、米国特許第５，３４０，７１６号（Ｕｌｌｍａｎら）に記載されており、それらの全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。

【0034】

本明細書に記載されるか、またはそうでなければ企図されるアッセイ形式を介して検出可能な任意の標的検体は、本開示の多重アッセイによって検出される。標的検体の非限定的な例には：プロカルシトニン（ＰＣＴ）、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、Ｄ−ダイマー、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ミエロペルオキシダーゼ、ＳＴ２、ｈＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ｉＰＴＨ、ＴＳＨ、ｆＴ_４、Ｔ_４、ＰＳＡ、ｆＰＳＡおよびｃＰＳＡ、ならびにそれらの組合せが含まれる。

【0035】

本開示のある特定の非限定的な実施形態は、サンプル中のビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体の濃度を決定するための化学発光検出システムを利用する多重アッセイを実行するためのキットを対象とする。キットは：（ａ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合しているビオチンまたはその類似体を有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物と、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子とを含む組成物と；（ｂ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合している標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物と、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子であって、（ａ）の蛍光分子と異なり、（ａ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、蛍光分子とを含む組成物と；（ｃ）標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｂ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと；（ｄ）一重項酸素をその励起状態において生成することができ、増感剤に直接的または間接的に結合しているビオチン特異的結合パートナーを有することができる増感剤を含む組成物とを含む。

【0036】

ある特定の非限定的な実施形態では、キットは、（ｅ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合している第２の標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物と、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子であって、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なり、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、蛍光分子とを含む組成物と；（ｆ）第２の標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、第１の検体特異的結合パートナーと異なる第２の標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーとをさらに含む。

【0037】

化学発光化合物（化学発光物質（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ））は、化学的に活性化可能であり、そのような活性化の結果として、ある特定の波長で光を発する化合物である。例示を目的とし、限定ではない化学発光物質の例には：一重項酸素または過酸化物と反応してヒドロペルオキシドまたはジオキセタンを形成することができるオレフィン、これはケトンまたはカルボン酸誘導体に分解することができる；光の作用によって分解することができる安定なジオキセタン；一重項酸素と反応してジケトンを形成することができるアセチレン；（限定されないが）ルミノールのようなアゾ化合物またはアゾカルボニルを形成することができるヒドラゾンまたはヒドラジド；および例えば、エンドペルオキシドを形成することができる芳香族化合物が含まれる。活性化反応の結果として、化学発光物質は直接的または間接的に発光を引き起こす。

【0038】

ある特定の実施形態では、一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、一重項酸素との化学反応を起こして、同時または後の発光により分解することができる準安定中間体種を形成する物質であり得る。化学発光化合物を含む組成物は活性化された化学発光化合物によって直接励起される；あるいは組成物は活性化された化学発光化合物によって励起される少なくとも１つの蛍光分子をさらに含んでもよい。

【0039】

増感剤は、化学発光化合物の活性化のための、例えば、一重項酸素のような反応中間体を生じる、分子、通常、化合物である。一部の非限定的な実施形態では、増感剤は光増感剤である。（例えば、酵素および金属塩によって）化学的に活性化される（ｃｈｅｍｉ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）他の増感剤には、例を目的とし、限定ではない、外部光源によって活性化されてまたは活性化されずに一重項酸素を生じることができる他の物質および組成物が含まれる。例えば、ある特定の化合物は、過酸化水素の一重項酸素および水への変換を触媒することが示されている。他の増感剤物質および組成物の非限定的な例には：アルカリ土類金属Ｃａ、ＳｒおよびＢａの酸化物；ｄ^０配置の３Ａ、４Ａ、ＳＡおよび６Ａ族の元素の誘導体；アクチニドおよびランタニドの酸化物；ならびに酸化剤ＣｌＯ⁻、ＢｒＯ⁻、Ａｕ^３＋、ＩＯ_３⁻およびＩＯ_４⁻；ならびに特に、モリブデン酸イオン、ペルオキソモリブデン酸イオン、タングステン酸イオンおよびペルオキソタングステン酸イオン、ならびにアセトニトリルが含まれる。それらの全体を参照によって明示的に本明細書に組み入れる以下の参考文献は、本開示の範囲内でもある増感剤物質および組成物に関するさらなる開示を提供する：Ａｕｂｒｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０７：５８４４〜５８４９（１９８５）；Ａｕｂｒｙ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５４：７２６〜７２８（１９８９）；ＢｏｈｍｅおよびＢｒａｕｅｒ、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３１：３４６８〜３４７１（１９９２）；ＮｉｕおよびＦｏｏｔｅ、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３１：３４７２〜３４７６（１９９２）；Ｎａｒｄｅｌｌｏら、Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、３４：４９５０〜４９５７（１９９５）；ＡｕｂｒｙおよびＢｏｕｔｔｅｍｙ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１９：５２８６〜５２９４（１９９７）；ならびにＡｌｍｅｉｄａら、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、４８２：９９〜１０４（２００３）；これらの各々の全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。

【0040】

光増感剤の範囲内には、真の増感剤ではないが、熱、光、電離放射線または化学活性化による励起で一重項酸素の分子を放出する化合物も含まれる。このクラスの化合物のメンバーには、例えば（限定する目的ではないが）、１，４−ビスカルボキシエチル−１，４−ナフタレンエンドペルオキシド；９，１０−ジフェニルアントラセン−９，１０−エンドペルオキシド；および５，６，１１，１２−テトラフェニルナフタレン５，１２−エンドペルオキシドのようなエンドペルオキシドが含まれる。加熱またはこれらの化合物による光の直接吸収は一重項酸素を放出する。

【0041】

光増感剤は、例えば、光による励起による一重項酸素の生成によって光活性化合物を活性化するための増感剤である。光増感剤は光活性化可能であり、例えば、色素および芳香族化合物を含み、通常、複数の共役二重または三重結合を有する、通常、共有結合原子からなる化合物である。化合物は、励起波長において、５００Ｍ^−１ｃｍ^−１より大きい、または５，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１より大きい、または５０，０００Ｍ^−１ｃｍ^−１より大きい、その吸収最大における吸光係数で、（限定されないが）約３００ｎｍ〜約１，０００ｎｍの範囲または約４５０ｎｍ〜９５０ｎｍの範囲のような約２００ｎｍ〜約１，１００ｎｍの波長範囲の光を吸収すべきである。光増感剤は比較的光安定性であるべきであり、一重項酸素と効率的に反応しなくてもよい。例示を目的とし、限定ではない、光増感剤の例には：アセトン；ベンゾフェノン；９−チオキサントン；エオシン；９，１０−ジブロモアントラセン；メチレンブルー；（限定されないが）ヘマトポルフィリンのようなメタロ−ポルフィリン；フタロシアニン；クロロフィル；ローズベンガル；およびバックミンスターフラーレン；ならびにこれらの化合物の誘導体が含まれる。

【0042】

特に、本開示に従って利用することができる化学発光化合物および光増感剤の非限定的な例は米国特許第５，３４０，７１６号（Ｕｌｌｍａｎら）に記載されており、その全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。

【0043】

当該技術分野において公知であるか、またはそうでなければ本明細書に企図される任意の標的検体特異的結合パートナーは、本開示に従って利用することができる。標的検体についての検体特異的結合パートナーの非限定的な例には、抗体、受容体、リガンド、アプタマー、分子インプリントポリマー（すなわち、無機マトリクス）、およびそれらのいずれかの組合せまたは誘導体、ならびに標的検体に特異的に結合することができる任意の他の分子が含まれる。ある特定の（しかし非限定的な）例において、（ａ）および（ｂ）の第１および第２の検体特異的結合パートナーの各々は、標的検体に対する抗体である。同様に、（ｅ）および（ｆ）の第１および第２の検体特異的結合パートナーの各々は、存在する場合、ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、第２の標的検体に対する抗体であってもよい。

【0044】

当該技術分野において公知であるか、またはそうでなければ本明細書に企図される任意のビオチン特異的結合パートナーは、本開示に従って利用することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、ビオチン特異的結合パートナーはビオチンに対する抗体である。他の非限定的な実施形態では、ビオチン特異的結合パートナーはアビジンまたはその類似体である。

【0045】

当該技術分野において公知であるか、またはそうでなければ本明細書に企図される任意のアビジン類似体は、アビジンまたはアビジン類似体が：（１）増感剤と会合することができ；（２）ビオチン化した検体特異的結合パートナーに結合することができ；（３）サンプル中に存在し得るビオチンに結合することができる限り、本開示に従って利用することができる。本開示に従って利用することができるアビジン類似体の非限定的な例には、Ｋａｎｇら（Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ（１９９５）３：１５９〜６５）に開示されているものが含まれ、その全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。アビジン類似体の特定の非限定的な例には、アビジン、ストレプトアビジン、トラプトアビジン、中性アビジン、ニュートラライトアビジン（Ｎｅｕｔｒａｌｉｔｅ ａｖｉｄｉｎ）、ニュートラアビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、ライト−アビジン（Ｌｉｔｅ−ａｖｉｄｉｎ）、スクシニル化アビジン、修飾もしくは遺伝子操作されたアビジンの他の形態、上記のいずれかのエステル、塩および／または誘導体などが含まれる。

【0046】

ある特定の非限定的な実施形態では、（ａ）および／または（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、それに直接的または間接的に結合しているハプテンを有する。

【0047】

活性化された化学発光化合物によって励起され、特定の検出可能な波長で発光することができる当該技術分野において公知の任意の蛍光分子は、各蛍光分子によって生成されるシグナルが、利用される他の蛍光分子によって生成されるシグナルから検出可能である限り、（ａ）および（ｂ）（および存在する場合、（ｅ））の蛍光分子として本開示に従って利用することができる。すなわち、（ａ）の蛍光分子は、（ｂ）の蛍光分子が発光する波長と十分に異なる波長で発光しなければならず、それによって２つのシグナルは、同時に検出される場合、互いに区別される。ある特定の（しかし非限定的な）例において、本開示に従って利用される各蛍光分子は、独立して、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される。例えば（限定する目的ではないが）、同時に検出される場合、互いに区別される２つまたは３つのシグナルの生成に関して、テルビウムは約５４５ｎｍの波長で発光し、ウランは約６１２ｎｍの波長で発光し、サマリウムは約６４５ｎｍの波長で発光する。

【0048】

組成物／キット／マイクロ流体デバイス／方法のアッセイ成分／試薬は、それらが本開示に従って機能することを可能にする任意の形態で提供される。例えば、限定の目的ではないが、試薬の各々は、液体形態で提供され、キット内にバルクおよび／または単一のアリコート形態で配置される。あるいは、特に（しかし非限定的な）実施形態では、試薬の１つまたはそれ以上は、単一のアリコートの凍結乾燥試薬の形態でキット内に配置される。マイクロ流体デバイスにおける乾燥試薬の使用は米国特許第９，２４４，０８５号（Ｓａｍｐｒｏｎｉ）に詳細に記載されており、それらの全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。

【0049】

本明細書上記で詳細に記載されるアッセイ成分／試薬に加えて、キットは、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ企図される特定のアッセイのいずれかを行うための他の試薬をさらに含有してもよい。これらのさらなる試薬の性質は特定のアッセイ形式に依存し、それらの同定は十分に当業者の技術の範囲内である；したがってそれらのさらなる説明は必要ないと考えられる。また、キットに存在する成分／試薬の各々は別個の容器／区画にあってもよいか、または種々の成分／試薬が、成分／試薬の交差反応および安定性に応じて、１つもしくはそれ以上の容器／区画内に合わせられる。さらに、キットは、成分／試薬が配置されているマイクロ流体デバイスを含んでもよい。

【0050】

キット内の種々の成分／試薬の相対量は、アッセイ方法の間に発生することを必要とする反応を十分に最適化し、さらに、アッセイの感度を十分に最適化する濃度の成分／試薬を提供するために広範に変更することができる。適切な状況下で、キット内の成分／試薬の１つまたはそれ以上は凍結乾燥粉末のような乾燥粉末として提供することができ、キットは乾燥試薬を溶解するための賦形剤をさらに含んでもよい；このように、本開示に従って方法またはアッセイを実施するための適切な濃度を有する試薬溶液はこれらの成分から得ることができる。陽性および／または陰性対照もまた、キット内に含んでもよい。さらに、キットは、キットの使用方法を説明している書面の説明書のセットをさらに含んでもよい。この性質のキットは、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ企図される方法のいずれかにおいて使用することができる。

【0051】

本開示のある特定のさらなる非限定的な実施形態は、本明細書上記に記載されるキットのいずれかの成分を含むマイクロ流体デバイスを対象とする。特に、ある特定の非限定的な実施形態は、サンプル中のビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体の濃度を決定するためのマイクロ流体デバイスを含む。マイクロ流体デバイスは、（ｉ）サンプルが適用される入口チャネルと；（ｉｉ）入口チャネルと流体連絡することができる少なくとも第１の区画とを含む。（ｉｉ）の区画は：（ａ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合しているビオチンまたはその類似体を有する、少なくとも第１の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含む、第１の組成物と；（ｂ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合している標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する少なくとも第２の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）の蛍光分子と異なり、（ａ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第２の組成物と；（ｃ）標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｂ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと；（ｄ）一重項酸素をその励起状態において生成することができ、増感剤に直接的または間接的に結合しているビオチン特異的結合パートナーを有することができる増感剤を含む組成物とを含有する。ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ｉｉ）の区画は、一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合している第２の標的検体またはその類似体を有する少なくとも第３の組成物であって、第３の組成物は、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なり、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第３の組成物をさらに含有する。

【0052】

本明細書上記に詳細に記載されるか、またはそうでなければ本明細書に企図される一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物、増感剤、蛍光分子、ビオチンまたはその類似体、標的検体またはその類似体、および標的検体特異的結合パートナーのいずれかは、本開示のマイクロ流体デバイスに利用することができる。

【0053】

例えば、ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ａ）および（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、一重項酸素との化学反応を受けて、同時または後の発光により分解することができる準安定中間体種を形成する物質である。

【0054】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、増感剤は光増感剤である。

【0055】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ｂ）および（ｃ）の第１および第２の検体特異的結合パートナーの各々は、標的検体に対する抗体である。

【0056】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ｉｉｉ）のビオチン特異的結合パートナーは、アビジンもしくはその類似体であるか、またはビオチンに対する抗体である。

【0057】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ａ）および／または（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、それに直接的または間接的に結合しているハプテンを有する。

【0058】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子は、各々独立して、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される。例えば（限定する目的ではないが）、テルビウムは約５４５ｎｍの波長で発光し、ウランは約６１２ｎｍの波長で発光し、サマリウムは約６４５ｎｍの波長で発光する。

【0059】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ｉｉ）の区画は：（ｅ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合している第２の標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する少なくとも第３の組成物であって、第３の組成物は、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なり、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第３の組成物と；（ｆ）第２の標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｅ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる第２の標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーとをさらに含有する。ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、第３の組成物の蛍光分子は、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される。

【0060】

ある特定の非限定的な実施形態では、（ｉｉ）の要素（ａ）〜（ｄ）の全て（ならびに存在する場合、（ｅ）および（ｆ））は同じ区画中に存在する。代替の非限定的な実施形態では、要素（ａ）〜（ｄ）（ならびに存在する場合、（ｅ）および（ｆ））は、２つまたはそれ以上の区画の間で分割される。

【0061】

デバイスは、本開示に従ってそのデバイスが機能することを可能にする、区画の任意の配列およびそれらの間の種々の成分の分配を提供することができる。

【0062】

マイクロ流体デバイスの区画のいずれかは、試薬を使用するまで、実質的に気密環境でその中に配置される試薬を維持するために封止され；例えば、凍結乾燥試薬を含有する区画は試薬のあらゆる意図的でない再構成を阻止するために封止される。入口チャネルおよび区画、ならびに２つの区画は互いに「流体連絡することができる」と記載され；この語句は、区画の各々を常に封止することができるが、２つの区画はそれらの中またはそれらの間に形成される封止が破壊されるとそれらの間に流体が流れることができることを示す。

【0063】

本開示のマイクロ流体デバイスは、当該技術分野において公知であるか、またはそうでなければ本明細書に企図される任意の他の所望の機能を提供することができる。例えば、限定する目的ではないが、本開示のマイクロ流体デバイスは読み取りチャンバをさらに含んでもよく；読み取りチャンバは本明細書上記に記載される試薬を含有する区画のいずれかであってもよいか、または読み取りチャンバは前記区画と流体連絡することができる。マイクロ流体デバイスは、（限定されないが）洗浄液、希釈液、賦形剤、干渉液、陽性対照、陰性対照、品質対照などのような他の溶液を含有する１つまたはそれ以上のさらなる区画をさらに含んでもよい。これらのさらなる区画は他の区画の１つまたはそれ以上と流体連絡することができる。例えば、マイクロ流体デバイスは洗浄液を含有する１つまたはそれ以上の区画をさらに含んでもよく、これらの区画はデバイスのいずれかの他の区画と流体連絡することができる。別の例では、マイクロ流体デバイスは１つまたはそれ以上の乾燥試薬を溶解するための賦形剤を含有する１つまたはそれ以上の区画をさらに含んでもよく、区画はデバイスのいずれかの他の区画と流体連絡することができる。なおさらなる例では、マイクロ流体デバイスは希釈液を含有する１つまたはそれ以上の区画を含んでもよく、区画はデバイスのいずれかの他の区画と流体連絡することができる。

【0064】

さらに、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ企図されるキット／マイクロ流体デバイスのいずれかは、単一のキット／デバイスにおけるビオチンアッセイと多重化された１つより多い標的検体アッセイを含んでもよい。複数の標的検体アッセイが存在する場合、アッセイの各々は本明細書に記載されるように構築することができ、機能する。あるいは、本明細書に記載されるビオチンおよび標的検体アッセイは、本開示のキット／マイクロ流体デバイス内に含有することができる、当該技術分野において公知である任意の他の標的検体アッセイと多重化される。本明細書に開示され、請求されるアッセイと多重化される他のアッセイの非限定的な例には、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、Ｄ−Ｄｉｍｅｒ、ＣＫＭＢ、ミオグロビン、ミエロペルオキシダーゼ、ＳＴ２、ＰＣＴ、ｈＣＧ、ＬＨ、ＦＳＨ、ｉＰＴＨ、ＴＳＨ、ｆＴ_４、Ｔ_４、ＰＳＡ、ｆＰＳＡ、およびｃＰＳＡ、ならびにそれらの組合せが含まれる。

【0065】

複数の標的検体アッセイが単一のマイクロ流体デバイスに存在する場合、複数の入口チャネルをサンプル適用チャンバに接続することができる。ある特定の実施形態では、サンプルの一部は、その内容物にかかわらず、サンプル適用チャンバから複数の入口チャネルまで通過することができる。あるいは、ある特定の成分のサンプル全体からの分離および前記成分の異なるアッセイへの送達を可能にする構造が、サンプル適用チャンバ、入口チャネル、および／またはそれらの間の接続部に存在してもよい。本開示に従って利用することができるサンプル分配デバイスの非限定的な例は、米国特許第９，４１６，７７６号（Ｌｅｄｄｅｎら）に詳細に記載され、それらの全体の内容は参照によって明示的に本明細書に組み入れる。

【0066】

ある特定の非限定的な実施形態はまた、サンプル中のビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体の存在および／または濃度を検出するための方法を対象とする。その方法は以下の工程を含む。

【0067】

第１の工程において、ビオチンおよび少なくとも１つのさらなる標的検体を含有すると疑われるサンプルは：（ａ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合しているビオチンまたはその類似体を有する少なくとも第１の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含む、第１の組成物と；（ｂ）一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含み、それに直接的または間接的に結合している標的検体の第１の検体特異的結合パートナーを有する少なくとも第２の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）の蛍光分子と異なり、（ａ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第２の組成物と；（ｃ）標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｂ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーと；（ｄ）一重項酸素をその励起状態において生成することができ、増感剤に直接的または間接的に結合しているビオチン特異的結合パートナーを有することができる増感剤を含む過剰な組成物と同時にまたは全体的もしくは部分的に連続して合わせられる。

【0068】

第２の工程において、成分は、サンプル中に存在する標的検体への（ｂ）および（ｃ）の結合ならびに（ｄ）への（ｃ）の結合を可能にするために一緒にインキュベートされ、（（ｃ）および標的検体を介する）（ｄ）への（ｂ）の間接的な結合は、増感剤が化学発光化合物と近接する標的検体複合体の形成を生じる。さらに、（ａ）は、サンプル中のビオチンの不在下で（ｄ）に結合し、増感剤が化学発光化合物と近接するビオチン複合体の形成を生じる。

【0069】

第３の工程において、増感剤は活性化されて一重項酸素を生成し、ビオチン複合体および標的検体複合体に存在する増感剤の活性化は、各複合体に存在する化学発光化合物の活性化を引き起こす。

【0070】

第４の工程において、ビオチン複合体における活性化された化学発光化合物によって生じる化学発光の量は、（ａ）の蛍光分子によって発せられた光の量を測定することによって決定され、サンプル中のビオチンの量は発せられた光の量と反比例する。

【0071】

第５の工程において、標的検体複合体における活性化された化学発光化合物によって生じる化学発光の量は、（ｂ）の蛍光分子によって発せられた光の量を測定することによって決定されて、サンプル中の標的検体の量を決定する。

【0072】

第６の工程において、第２から第５の工程は、所望の場合、場合により反復することができる。

【0073】

第７の工程において、工程（５）の結果は、工程（４）において検出されたいくらかのビオチン干渉に基づいて補正される。あるいは、工程（５）の結果は、工程（４）において検出されたビオチン濃度が最大閾値レベルを超える場合、信頼できないとしてフラグ付けされる。

【0074】

方法のある特定の非限定的な実施形態では、工程（１）は：（ｅ）化学発光化合物に直接的または間接的に結合している第２の標的検体についての第１の検体特異的結合パートナーを有する一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含む少なくとも第３の組成物であって、活性化された化学発光化合物によって励起される蛍光分子をさらに含み、蛍光分子は、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なり、（ａ）および（ｂ）の蛍光分子と異なる波長で発光する、第３の組成物と；（ｆ）第２の標的検体についてのビオチン化した第２の検体特異的結合パートナーであって、（ｅ）の第１の検体特異的結合パートナーと異なる第２の標的検体のエピトープに結合する、第２の検体特異的結合パートナーとを、要素（ａ）〜（ｄ）と合わせる工程をさらに含む。この場合、方法は：（８）（ｅ）の蛍光分子によって発せられた光の量を測定することによって第２の標的検体複合体における活性化された化学発光化合物によって生じる化学発光の量を決定して、サンプル中の標的検体の量を決定する工程と；（９）工程（４）において検出されたいくらかのビオチン干渉に基づいて工程（８）の結果を補正する工程および／または工程（４）において検出されたビオチン濃度が最大閾値レベルを超える場合、工程（８）の結果を信頼できないとしてフラグ付けする工程をさらに含んでもよい。

【0075】

本明細書上記に詳細に記載されるか、またはそうでなければ本明細書に企図される一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物、増感剤、蛍光分子、ビオチンまたはその類似体、標的検体またはその類似体、および標的検体特異的結合パートナーのいずれかは、本開示の方法において利用することができる。

【0076】

例えば、ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ａ）および（ｂ）（および存在する場合、（ｅ））の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、一重項酸素との化学反応を受けて、同時または後の発光により分解することができる準安定中間体種を形成する物質である。

【0077】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、増感剤は光増感剤であり、工程（３）における増感剤の活性化は、光による照射（例えば、限定されないが、約６８０ｎｍでの照射）を含む。

【0078】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ｂ）および（ｃ）（ならびに存在する場合、（ｅ）および（ｆ））の第１および第２の検体特異的結合パートナーの各々は、標的検体に対する抗体である。

【0079】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ｄ）のビオチン特異的結合パートナーは、アビジンもしくはその類似体であるか、またはビオチンに対する抗体である。

【0080】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ａ）および／または（ｂ）の一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物は、それに直接的または間接的に結合しているハプテンを有する。

【0081】

ある特定の（しかし非限定的な）実施形態では、（ａ）および（ｂ）（および存在する場合、（ｅ））の蛍光分子は、各々独立して、テルビウム、ウラン、サマリウム、ユーロピウム、ガドリニウムおよびジスプロシウムからなる群から選択される。例えば（限定する目的ではないが）、テルビウムは約５４５ｎｍの波長で発光し、ウランは約６１２ｎｍの波長で発光し、サマリウムは約６４５ｎｍの波長で発光する。

【0082】

ビオチンの存在についてのアッセイが所望される任意のサンプルを、本開示の方法に従ってサンプルとして利用することができる。サンプルの非限定的な例には、限定されないが、全血またはそのいずれかの部分（すなわち、血漿または血清）、尿、唾液、痰、脳脊髄液（ＣＳＦ）、皮膚、腸液、腹腔内液、嚢胞液、汗、間質液、細胞外液、涙、粘液、膀胱洗浄液、精液、糞便、胸膜液、鼻咽頭液、およびそれらの組合せのような生体サンプルが含まれる。特定の非限定的な例には、溶解全血細胞および溶解赤血球が含まれる。

【0083】

上述のように、方法の種々の成分は、（同時にまたは連続してのいずれかで）組み合わせて提供される。方法の種々の成分が連続して添加される場合、成分の添加の順序を変更させてもよく；当業者は、アッセイへの異なる成分の添加の特定の所望の順序を決定することができる。添加の最も簡単な順序は、もちろん、全ての材料を同時に添加し、それらから生成されたシグナルを決定することである。あるいは、成分の各々、または成分のグループを連続して合わせることができる。ある特定の実施形態では、インキュベーション工程は１つまたはそれ以上の追加の後に含まれる。

【0084】

代替の（しかし非限定的な）実施形態では、方法の工程（１）は、サンプルを、ビオチン化した標的検体特異的結合パートナーおよび増感剤を含む組成物と最初に合わせる工程と、それを、一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含む組成物を加える前に、インキュベートする工程とを含む。あるいは、方法の工程（１）は、サンプルを、一重項酸素により活性化可能な化学発光化合物を含む組成物と最初に合わせる工程と、それを、増感剤を含む組成物を加える前に、インキュベートする工程とを含んでもよい。この後者の実施形態では、ビオチン化した標的検体特異的結合パートナーはインキュベーション工程の前または後に加えられる。

【0085】

本開示の特定の実施形態は、ＬＯＣＩ（登録商標）アッセイ形式を有すると記載されているが、本開示はまた、サンプルビオチン干渉の排除が望まれる他のアッセイ形式（ならびにキット、マイクロ流体デバイスおよびそれを実行する方法）を対象とすることも理解されるべきである。例えば（しかし限定する目的ではないが）、本開示はまた、異なる波長でシグナルを生成する異なる酵素に連結している（限定されないが）異なる抗体のような異なるシグナル分子を、本明細書上記に記載される化学発光化合物含有組成物の代わりに利用することができる、アッセイ形式も含む。

【実施例】

【0086】

実施例を本明細書以下に提供する。しかしながら、本開示は、その適用において、本明細書に開示される特定の実験、結果、および実験手順に限定されないことは理解されるべきである。むしろ、実施例は種々の実施形態の１つとして単に提供され、包括的ではなく、例示的であることを意図する。

【実施例1】

【0087】

図１は、キットおよびマイクロ流体デバイスに存在し、本開示のある特定の非限定的な実施形態の方法に使用されるアッセイ成分を示す。これらの成分は（左から右へ）：
（ｉ）第１のケミビーズに直接的または間接的に結合しているビオチンまたはその類似体を有し、ケミビーズに存在する活性化された化学発光化合物によって励起される第１の蛍光分子を含有する第１のケミビーズと；
（ｉｉ）一重項酸素をその励起状態において生成することができ、センシビーズに直接的または間接的に結合しているビオチン特異的結合パートナーを有することができるセンシビーズと；
（ｉｉｉ）ビオチン化した標的検体特異的結合パートナーと；
（ｉｖ）第２のケミビーズに直接的または間接的に結合している標的検体またはその類似体を有し、ケミビーズに存在する活性化された化学発光化合物によって励起される第２の蛍光分子を含有する第２のケミビーズと
を含む。
第１および第２の蛍光分子は、互いに異なり、異なる波長で発光する；このように、ビオチンおよび標的検体の両方についてのアッセイは、（ｉ）を含有する複合体が（ｉｖ）を含有する複合体と異なる波長で検出されるので、同じ反応において同時に実行することができる。

【0088】

ビオチンがサンプル中に存在しない場合、図２の上側パネルの左側に示すように、複合体は（ｉ）と（ｉｉ）との間で形成され、シグナルは増感剤の活性化により生成される。しかしながら、ビオチンがサンプル中に存在する場合、それは、図２の下側パネルの左側に示すように、（ｉｉ）への結合に関して（ｉ）と競合する。したがって、サンプル中のビオチンの存在は、第１の蛍光分子から発せられた光を検出するために使用される第１の波長で検出されたシグナルの減少として検出される。

【0089】

さらに、同じ反応において、（ｉｉｉ）はサンプル中に存在する標的検体に結合し、次いで、図２の下側パネルの右側に示すように、（ｉｖ）は（ｉｉｉ）に結合する。したがって、サンプル中の標的検体の存在は、第２の蛍光分子から発せられた光を検出するために使用される第２の波長で検出されたシグナルの増加として検出される。対照的に、標的検体が存在しない場合、（ｉｉｉ）のみが（ｉｉ）に結合することができるが、（ｉｖ）はそれに結合することができず、したがって、シグナルは標的検体の不在下で生成されない（図２の上側パネルの左側）。

【0090】

ビオチンがサンプル中で検出される場合、次いで標的検体アッセイから得られた結果は、第１のケミビーズを使用して検出されたいくらかのビオチン干渉に基づいて補正することができ、および／または検出されたビオチン濃度が最大閾値レベルを超える場合、信頼できないとしてフラグ付けすることができる。

【0091】

さらに、本開示の多重アッセイは、ビオチン干渉の検出に加えて１つより多い標的検体を同時に検出するように適合することができる。検出されるべき各々のさらなる標的検体に関して、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）のようなさらなる成分が加えられ、（ｉｖ）のようなさらなる成分に存在する蛍光分子は、第１および第２の蛍光分子と異なり、別々に検出可能な波長で発光するという点で第１および第２の蛍光分子と異なる。このように、各々を検出するために使用されるケミビーズが、異なり、別々に検出可能な波長で各々発光する異なる蛍光分子を含有する限り、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の標的検体を単一の反応において検出することができ；したがって、単一反応において検出することができる標的検体の数の制限因子は、本明細書に記載されるように機能する利用可能な蛍光分子の数である。

【実施例2】

【0092】

この実施例は、ビオチンおよびプロカルシトニン（ＰＣＴ）についての多重化アッセイを提供する。ビオチンはテルビウムで染色したケミビーズに共有結合によりコンジュゲートしており（図３、上側パネルの左側）、ＰＣＴについての捕捉抗体はユーロピウムで染色したケミビーズに共有結合によりコンジュゲートしている（図３、上側パネルの右側）。多重化方法は、少なくともビオチンおよびＰＣＴの両方を含有する複数検体較正器を用いて較正される。同じストレプトアビジンセンシビーズを、ビオチンおよびＰＣＴの両方を検出するために使用する。

【0093】

図３の下側パネルに示すように、センシビーズは６８０ｎｍの励起光によって活性化して一重項酸素を生成し、一重項酸素は両方の種類のケミビーズに拡散する。ビオチンと複合体化すると、ビオチンケミビーズは５４５ｎｍで発光し、これはビオチンシグナルとして測定される。ＰＣＴと複合体化すると、ＰＣＴケミビーズは６１２ｎｍで発光し、これはＰＣＴシグナルとして測定される。次いで２つの較正曲線を多重測定から生成する：１つはビオチンについて、および１つはＰＣＴについて。

【0094】

蛍光分子としてテルビウムを使用したサンプル中の測定したビオチン濃度は、蛍光分子としてユーロピウムを使用して測定したビオチンＬＯＣＩ（登録商標）シグナルに関連する。ユーロピウムによって測定した種々のビオチン濃度でのＬＯＣＩ（登録商標）シグナルは実験的に得られる。次いである特定のビオチン濃度でのユーロピウムによるビオチンＬＯＣＩ（登録商標）シグナルを予測（外挿）することができ、必要な場合、後で差し引くか（シグナルに対するプラスの影響が観察される場合）、または加えて（シグナルに対するマイナスの影響が観察される場合）、標的検体の結果を補正する。

【0095】

このように、標的検体アッセイの結果は、多重様式においてビオチン測定から推定したビオチンシグナルを使用して補正することができる。あるいは、検出されたビオチン濃度が最大閾値レベルを超える場合、結果を信頼できないとしてフラグ付けすることができる。

【実施例3】

【0096】

図４は、本開示に従って構築した多重アッセイの１つの非限定的な実施形態についてのアッセイ順序を示し、２つの検体が測定される：標的検体（この実施例においてタンパク質Ｘ（ＰｒＸ）と称する）およびビオチン。標的検体ＰｒＸについてのアッセイは２つの抗体の使用を必要とするサンドイッチアッセイであり；第１の抗体（Ａｂ１）はケミビーズに被覆され（Ａｂ１−ＣＢ）、第２の抗体（Ａｂ２）はビオチン化される。ビオチンアッセイは、競合形式を使用し、ビオチンにより（またはビオチン類似体により）被覆したケミビーズ（ビオチン−ＣＢ）の使用を必要とする。Ａｂ１−ＣＢおよびビオチン−ＣＢの各々は異なる色素を含有するので、２つのケミビーズを含有する複合体は単一の反応において別々に検出することができる。さらに、両方のアッセイは同じストレプトアビジンにより被覆したセンシビーズ（ＳＢ）を使用する。

【0097】

図４は、この多重アッセイについての１つの追加の順列を示すが、このような順列は本開示を限定するとみなされるべきではなく；実際に、様々なアッセイ成分を任意の順序で追加することができ、２つのアッセイを任意の所望の順列で実行することができる。したがって、図４に示すアッセイの追加および順列の順序は本開示の範囲に限定されない。

【0098】

上記のビオチンアッセイから得られたビオチンシグナルは、図５に示す（および米国特許出願第６２／７１１，６９４号（２０１８年７月３０日に出願された）に詳細に記載される）ように、標準曲線を利用する適切な較正によってサンプルビオチン濃度（［ビオチン］ｎｇ／ｍｌ）に変換することができる。ある特定の非限定的な実施形態では、この濃度は標的検体についてアッセイする前に得ることができる。計算したビオチン濃度は４つの異なる手法のうちの１つに利用することができる：
（１）ビオチンシグナルまたは計算したビオチン濃度が閾値未満である場合であって、その閾値を超えるとビオチンが標的検体アッセイを干渉し始めることが知られている場合、標的検体アッセイの結果を正常と報告する。
（２）ビオチンシグナルまたは計算したビオチン濃度が閾値レベルを超える（すなわち、ビオチンが標的検体アッセイを干渉し始めることが知られているレベルを超える）場合、標的検体の結果を信頼できないとしてフラグ付けし、報告されない。
（３）ビオチンシグナルまたは計算したビオチン濃度が閾値レベルを超える場合、ビオチン濃度またはシグナル値を利用して標的検体アッセイの結果を補正する。
（４）この選択肢は、（１）、（２）および（３）の組合せを利用する。すなわち、ビオチンレベルが標的検体アッセイに影響を及ぼすことに関して閾値レベルを超えるが、閾値レベルを圧倒的に上回らない場合、影響を受けた標的検体アッセイの結果を補正する。検出されたビオチンシグナル／計算した濃度が低い場合（すなわち、ビオチンが標的検体の結果を干渉しないような閾値レベル未満）、標的検体の結果は正常と報告される。検出されたビオチンシグナル／計算した濃度が非常に高く（すなわち、最大閾値レベルを超える）、補正が可能ではない場合、フラグを作動すべきであり、標的検体の結果を信頼できないとしてフラグ付けすべきである。

【0099】

図６は、標的検体シグナルとのビオチン干渉およびその可能な補正に関連するこれらの様々なシナリオをグラフで示す。最も上側の曲線は、ビオチンが存在しない場合に得られたアッセイ値を示す。最も上側の曲線のすぐ下の曲線では、標的検体シグナルに対して最小限の影響を及ぼす低いビオチン濃度が存在する；このシナリオでは、標的検体の結果の補正は必要とされない。次の曲線では、ビオチン濃度／シグナルは閾値を上回り、それを超えるとビオチンは標的検体アッセイを干渉する；このシナリオでは、検出されたビオチン干渉の量に基づく標的検体の結果の補正が必要とされる。すなわち、ビオチン濃度またはシグナル値を利用して標的検体アッセイの結果を補正する。最も下側の曲線では、ビオチン濃度またはシグナル値は閾値を有意に超えて、最大閾値を上回り、それを超えると標的検体濃度はもはや補正することはできない；したがって、存在するビオチン干渉の量により、標的検体の結果が信頼できないことを示すようにフラグが作動される。

【0100】

アッセイの成分に関して、サンプル中にビオチンが存在しない場合または最小限のビオチンが存在する場合、全てのビオチン−ケミビーズは、図４の「Ｒｘｎ段階１」におけるセンシビーズに結合している；この場合、標的検体シグナルのビオチン干渉は存在しない。サンプルビオチンが十分に高い場合、サンプルビオチンおよびビオチン−ケミビーズの一部は、図４の「Ｒｘｎ段階１」において追加されるセンシビーズに結合せず、したがって図４の「Ｒｘｎ段階２」におけるセンシビーズ結合反応に持ち越される。十分な量のサンプルビオチンおよびビオチン−ケミビーズのあふれた量は、図４の「Ｒｘｎ段階２」におけるセンシビーズ／ビオチン−抗体１／標的検体／抗体２−ケミビーズ複合体（「ＳＢ：：ビオチン−Ａｂ１：：ＰｒＸ：：Ａｂ２−ＣＢ」として図４に示す）の形成に影響を及ぼし、したがって図６のグラフに示すように、減少した標的検体シグナルを生じる。

【0101】

図７の上側の表は、サンプルビオチンの不在下および存在下での本開示による多重アッセイによって得られた標的検体（ＰｒＸ）シグナル（キロカウントにおける）の仮定シナリオを示す。理解できるように、任意の最小サンプルビオチン濃度（１０ｎｇ／ｍｌ）では、標的検体シグナルに対する影響は、試験した標的検体濃度のいずれにおいても観察されない。閾値ビオチン濃度（例えば、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌの任意の値における）を過ぎると、ＰｒＸシグナルに対するサンプルビオチン濃度の影響を観察することができ、その後ＰｒＸ値を存在するビオチン干渉の量に基づいて補正することができる。しかしながら、最大閾値レベルに到達すると（例えば、３０００ｎｇ／ｍｌの任意の値）、ＰｒＸシグナルに対するビオチン干渉の影響は、もはやビオチン干渉を補正することができないほど非常に大きくなるので、ＰｒＸシグナルを信頼できないとしてフラグ付けしなければならない。３０００ｎｇ／ｍｌの任意の値の開示は例示目的のためだけであり；本開示の範囲は、本明細書に記載されるか、またはそうでなければ企図されるように計算される任意の閾値の値を含み、３０００ｎｇ／ｍｌよりはるかに低い閾値の値および３０００ｎｇ／ｍｌよりはるかに高い閾値の値を含むことに留意されたい。

【0102】

図７の上側の表は検出された実際の標的検体シグナルを示すが、図７の下側の表はＰｒＸシグナルに対するサンプルビオチンによる干渉パーセント（上側の表の値に基づく）を示す。理解できるように、サンプルビオチン濃度が一定のままであっても、干渉の異なるパーセンテージが異なるＰｒＸ濃度において見られる。

【0103】

図８および９は、標的検体シグナルを、検出されたサンプルビオチンシグナル／濃度に基づいて補正することができる２つの方法を例示する。図９に例示した方法は、図７に提示したデータの全てを利用するのに対して、図８に例示した方法は図７からのデータのサブセットを利用する。しかしながら、これらの２つの例は例示の目的のために提供され、標的検体シグナルを、当業者に明らかであるサンプルビオチンシグナル／濃度に基づいて補正することができる任意の方法を本開示に従って利用することができることは理解されるべきである。

【0104】

図８において、上側の表の影付きの長方形（図７から単に再現されている）は、ＰｒＸシグナルのより局所的な補正を提供するために、サンプルビオチンシグナル／濃度を使用してＰｒＸシグナルを補正するために利用される。図８の下側の表に示すように、影付きの長方形からの値を再配置し、次いで回帰を行う統計ソフトウェアに入力して、影付きの長方形からのデータに基づいて補正式を得る。この例において得られる回帰補正式を図８の下部に示す。

【0105】

この工程は、種々の既知の濃度でＰｒＸおよびビオチンの両方を含有する較正器を用いた共較正（製造時または顧客の較正による）の間に完了することができる。２つの検体共較正により、ビオチンおよびＰｒＸの各々についての較正とは別の表面方程式が得られる。ビオチンまたはＰｒＸシグナル検体較正は他の検体の不在下で行われる。しかし、この共較正は、両方の検体が種々の濃度で存在する場合に実行される。共較正の目的は、ＰｒＸ濃度（または０ｎｇ／ｍｌビオチンでのＰｒＸシグナル）がビオチン干渉の存在下でＰｒＸシグナルの関数として役立つ表面方程式を得ることである。

【0106】

図８の方法においてデータのサブセットを使用する理由は、より局所的なレベルでの補正についてのより正確な回帰を保証するためである。したがって、ＰｒＸシグナルおよびビオチンシグナル／濃度（ｎｇ／ｍｌ）が既知である場合、正確なＰｒＸ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を計算することができる。

【0107】

あるいは、図９に示すように、得られた表全体またはアッセイ範囲全体（ビオチンおよびＰｒＸ）を利用する同様の回帰を実行することによって、補正したＰｒＸ濃度を計算することができる。図９の左側には、図７からのデータを、示した表に単に再配置している。次いで、本明細書上記に記載されるように回帰分析を実行して、図９の右側に示すように回帰式を得る。

【0108】

どの特定の方法が使用されるかにかかわらず、図８および９の方法は両方とも、ビオチン干渉の存在下で標的検体（ＰｒＸ）濃度を予測するための回帰式を作成する。

【0109】

このように、本開示に従って、本明細書上記に示した目的および利点を完全に満たす、組成物、キット、およびデバイス、ならびにそれらを製造し、使用する方法が提供される。本開示は、本明細書上記に示した具体的な図面、実験、結果、および言語と併せて記載してきたが、多くの代替、修飾、および変更が当業者には明らかであることは自明である。したがって、本開示の趣旨および広い範囲内である全てのこのような代替、修飾、および変更を包含することを意図する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】