特許 6984858 Ｔ細胞に関連する疾病の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6984858

(24)【登録日】2021年11月29日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】Ｔ細胞に関連する疾病の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20211213BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20211213BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20211213BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 37/02 20060101ALN20211213BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/02

   G01N33/50 Z

   G01N33/68

   G01N33/15 Z

   G01N33/50 K

   !A61P37/02

【請求項の数】2

【全頁数】7

(21)【出願番号】特願2016-247112(P2016-247112)

(22)【出願日】2016年12月3日

(65)【公開番号】特開2018-88905(P2018-88905A)

(43)【公開日】2018年6月14日

【審査請求日】2019年7月24日

(73)【特許権者】

【識別番号】599055382

【氏名又は名称】学校法人東邦大学

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】近藤 元就

(72)【発明者】

【氏名】桑原 卓

(72)【発明者】

【氏名】松井 幸英

【審査官】 上村 直子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／０２４５７９４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１０−２０８９５４（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／０２

Ｇ０１Ｎ ３３／５０

Ｇ０１Ｎ ３３／６８

Ｇ０１Ｎ ３３／１５

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｔ細胞機能亢進より生じる自己免疫疾患の治療のための薬剤を同定するための方法であって、
候補薬剤の存在下及び非存在下で、Ｔ細胞をインキュベートする工程と
インキュベート後のＪＮＫ１及びＭＫＫ４、又はＪＮＫ１若しくはＭＫＫ４のアセチル化を、前記候補薬剤の存在下及び
非存在下のそれぞれについて測定する工程と、
候補薬剤の非存在下と比較して、有意に候補薬剤の存在下でアセチル化の割合が増大している候補薬剤をＴ細胞機能亢進より生じる自己免疫疾患の治療のための薬剤として同定する工程と
を含む、前記方法。

【請求項2】

Ｔ細胞機能亢進より生じる自己免疫疾患はヒト多発性硬化症（ＭＳ）である請求項１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｔ細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法に関する。

【背景技術】

【0002】

感染源から身体を守る免疫系には種々の細胞が関与している。免疫細胞の特徴として、一細胞単位で機能を果たすことが挙げられる。個々の細胞が特有の役割を担い、その集合として生体防御が達成される。一つひとつの細胞はサイトカインと呼ばれる細胞外信号分子を用いて情報をやりとりし、全体としては統制のある集団行動をとる。サイトカインを受信した細胞はその内側でシグナル伝達タンパク質になんからの分子修飾を加えて機能スイッチのオンとオフを切り替えている。例えば受信前のシグナル伝達分子はリン酸化修飾の無いオフの状態であるが、サイトカインを受け取るとリン酸化されたオンの状態になる。このように免疫細胞は、シグナル伝達分子のリン酸化により細胞外のサイトカインの情報を解釈し、適切な遺伝子を発現している。分子修飾がスイッチとなっている。最近申請者開示した論文（非特許文献１）のようにシグナル伝達分子のアセチル化が情報伝達の調節に関与することを見出した。

【0003】

免疫系細胞のひとつであるＴ細胞は感染源を抗原特異的に排除することができる。この抗原特異性はＴ細胞の発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）による。個々のＴ細胞はそれぞれ個別のＴＣＲを発現し、固有の抗原と反応する。身体が正常である場合、Ｔ細胞は感染源を対象に攻撃しこれを排除する。しかしながら、何らかの原因により制御が乱れると、Ｔ細胞は身体の構成成分に攻撃を仕掛ける。これを自己免疫反応と言う。この反応が過剰に生じると臓器の破壊と強く持続した炎症反応を伴う自己免疫疾患が生じる。たとえばヒト多発性硬化症（ＭＳ）は自己反応性Ｔ細胞により引き起こされる疾患である。

【0004】

抗原を認識したＴＣＲからの情報伝達もリン酸化により進行する。申請者の解析から、ＴＣＲからリン酸化により伝達される情報が、アセチル化の干渉により減弱することが判ってきた。アセチル化の特徴を有効に調節すれば、Ｔ細胞の反応性を制御できる可能性が浮かぶ。アセチル化によりＴＣＲ刺激を減弱できるならば、Ｔ細胞の制御不全で生じる自己免疫疾患を治療することも可能となるかも知れない。また、アセチル化調節下のＴ細胞を用いれば治療薬のスクリーニングや診断法の確立も可能かも知れない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１６，１９７，４３３４−４３４３ Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ＩＬ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ Ｔａｋｕ Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｈｉｒｏｔａｋｅ Ｋａｓａｉ，ａｎｄ Ｍｏｔｏｎａｒｉ Ｋｏｎｄｏ

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本分野において、Ｔ細胞に関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定する要求が存在する。本発明は、その要求を満たすための方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明者らは、上記課題を解決するため、まず宿主細胞にヒトＴ細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞を用い、アセチル化酵素であるＣＢＰを細胞質で発現させた。この狙いは、ＣＢＰが細胞質中で基質タンパク質をアセチル化するという現象の顕著化を目指したためである。アセチル化されるタンパク質に情報伝達に関わる分子群も含まれれば、その伝達様式に変化が生じて細胞機能も変わると考えた。実際にＪｕｒｋａｔ細胞をＴ細胞受容体で刺激した場合に活性化される転写因子のうち、ＡＰ−１の活性が低下した。これはＡＰ−１に至る経路のＪＮＫ１とＭＫＫ４が細胞質ＣＢＰによりアセチル化されたためであるらしいことが判った。Ｔ細胞はＴ細胞受容体刺激によりインターロイキン−２を産生するが、これもＭＫＫ４／ＪＮＫ１／ＡＰ−１の活性減弱に起因して産生減となった。

【0008】

このようにＴＣＲ刺激によってＪＮＫ１とＭＫＫ４がアセチル化されることが示された。そのため、Ｔ細胞が異常に活性化することにより生じると考えられる疾患はＪＮＫ１とＭＫＫ４のアセチル化を阻害することによりＴ細胞に関連する、たとえば多発性硬化症（ＭＳ）のような疾患の治療及び診断のための薬剤を同定することが可能であることが示唆される。

【0009】

そこで、本発明は、Ｔ細胞に関連する疾病の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法であって、候補薬剤の存在下及び非存在下で、Ｔ細胞をインキュベートする工程とインキュベート後のＪＮＫ１及びＭＫＫ４、又はＪＮＫ１若しくはＭＫＫ４のアセチル化を、前記候補薬剤の存在下及び非存在下のそれぞれについて測定する工程と、候補薬剤の非存在下と比較して、有意に候補薬剤の存在下でアセチル化の割合が減少している候補薬剤をＴ細胞に関連する疾病の治療及び診断のための薬剤として同定する工程とを含む、前記方法を提供する。

【0010】

さらに、本発明は、上記したＴ細胞に関連する疾患はＭＳである方法を提供する。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、Ｔ細胞関連する疾患の治療及び診断のための薬剤を同定するための方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】 ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ、およびＮＦＡＴの活性の測定結果を示す図である。正しいです。

【図2】 全ＪＮＫおよびリン酸化ＪＮＫの検出結果を示す図である。

【図3】 全ＺＡＰ７０およびリン酸化ＺＡＰ７０とＩｋａｐｐａＢの分解を解析した図である。

【図4】 アセチル化したＪＮＫ１およびＭＫＫ４と全ＪＮＫ１と全ＭＫＫ４を検出した結果を示す図である。

【図5】 正常細胞（ＣＴＲＬ）と細胞質ＣＢＰ発現細胞（ＥＲＴ２−ＣＢＰ）でのＭＫＫ４とＪＮＫ１の相互作用の解析結果を示す図（図中左）と、ＭＫＫ４−ＪＮＫ１経路の活性を知るため下流のｃ−Ｊｕｎリン酸化の解析結果を示す図（図右）である。

【図6】 それぞれＴＣＲ刺激した後の正常細胞（ＣＴＲＬ）と細胞質ＣＢＰ発現細胞（ＥＲＴ２−ＣＢＰ）の細胞上清中に含まれるインターロイキン−２濃度の解析結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

前述したようにＴＣＲ刺激によってＪＮＫ１とＭＫＫ４がアセチル化されることが示された。そのため、Ｔ細胞が異常に活性化することにより生じると考えられる疾患はＪＮＫ１とＭＫＫ４のアセチル化を調節することによりＴ細胞に関連する、たとえば多発性硬化症（ＭＳ）のような疾患の治療及び診断のための薬剤を同定することが可能であることが示唆される。

【実施例】

【0014】

以下に本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
主な実験の結果を示す。
Ｊｕｒｋａｔ細胞はＲＰＭＩ１６４０培地に１０％ウシ胎児血清、５０ｍｉｃｒｏＭ２−メルカプトエタノールにストレプトマイシンとペニシリンを加えた培養液で培養した。細胞質局在をしめすエストロゲン受容体の断片とＣＢＰとを融合タンパク質として発現するプラスミドをＢｉｏ−Ｒａｄ社のＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いてＪｕｒｋａｔ細胞に遺伝子導入した。同時にルシフェラーゼにＡｐ−１、ＮＦ−κＢ、あるいはＮＦＡＴの調節領域を連結したレポーターベクターも導入した。導入４８時間後に死細胞を除去し、血清を加えていないＲＰＭＩ１６４０培地に細胞数を１ｘ１０＾６個／ｍｌとして懸濁した。この細胞をＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社の抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体とでＴ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激した。刺激６時間後に回収した細胞の転写活性をＰｒｏｍｅｇａ社のＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍの方法に従って測定した。ＡＰ−１、ＮＦ−κＢ、およびＮＦＡＴの活性を測定し、その結果を図１に示した。ＡＰ−１の転写活性が低下した。ＴＣＲから始まる伝達系のうち、ＡＰ−１へ至る経路のいずれかが細胞質ＣＢＰにより下方制御されたと考えた。

【0015】

ＪＮＫはＴＣＲ刺激をＡＰ−１へ伝達する経路で活性化するリン酸化酵素である。ＡＰ−１の活性低下はＪＮＫの活性低下の結果と考え、その活性状態を解析した。活性化はＪＮＫ自体のリン酸化状態から知ることが出来る。正常Ｊｕｒｋａｔ細胞と細胞質ＣＢＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞とをＴＣＲ刺激した後、所定の時間で細胞を回収し、ＪＮＫのリン酸化をイムノブロット法で解析した。ＪＮＫおよびリン酸化ＪＮＫの検出には、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の抗体を使用した。この際、刺激後の細胞を図２に示す各時で回収し細胞抽出液を調製した。ＪＮＫの活性について抗リン酸化ＪＮＫ抗体を用いて解析した。図２に示したように、細胞質ＣＢＰ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞ではＪＮＫの活性が減弱していることが判った。ＣＴＲＬは対象の正常細胞を、ＥＲＴ２−ＣＢＰは細胞質ＣＢＰ発現細胞をそれぞれ示す。

【0016】

ＴＣＲ下流で活性化するＪＮＫ以外の経路が細胞質ＣＢＰにより正や負の調節を受けている可能性がある。図３には先の実験と同様にして調製したサンプル（どのサンプルでしょうか？図２と同様の方法で行った実験という意味で、同一のサンプルであるとは限りません。「どの」サンプルかという問いで同一性を表現するつもりはありません）を用いて、他の経路の活性化について解析した結果を示した。この際、刺激後の細胞を図３に示す各時で回収し細胞抽出液を調製した。ＺＡＰ７０活性について抗リン酸化ＺＡＰ７０抗体を用いて解析した（図中左側の二つ）。ＩｋａｐｐａＢ活性状態については抗ＩｋａｐｐａＢ抗体を用いて解析した（右側の二つ）。それぞれのアッセイはイムノブロット法で行った。抗体はいずれもＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のものを用いた。

【0017】

ＴＣＲ刺激に応答するリン酸化酵素ＺＡＰ７０の活性化に正常細胞と細胞質ＣＢＰ発現細胞との間で著明な差異を認めなかった。未刺激時は経路の抑制を維持するＩｋａｐｐａＢはＴＣＲ刺激により分解される。これにより抑制が解除され刺激が伝達される。正常細胞は刺激１０分後にＩｋａｐｐａＢ分解消失し、活性化したことが解る。この活性化は負のフィードバックがかかるため、ＩｋａｐｐａＢの発現レベルは初期状態に復帰する。こうした一連の活性化状態の変化は細胞質ＣＢＰ発現細胞でも認められた。このＩｋａｐｐａＢの結果は、図１に示したＮＫκＢの転写活性に変化が生じないことを支持する結果でもある。以上のことは、ＴＣＲ刺激により活性化する経路のうち、ＪＮＫ−ＡＰ−１経路を細胞質ＣＢＰは選択的に制御することを示唆する。

【0018】

細胞質ＣＢＰによるアセチル化が刺激伝達を調節したと予測した。ＪＮＫ−ＡＰ−１経路の減弱とアセチル化との直接の関係を探るため、ＪＮＫのアセチル化について解析した。また、ＪＮＫの活性も低下していることから、その上流のＭＫＫ４がアセチル化されている可能性についても検討した。正常Ｊｕｒｋａｔ細胞と細胞質ＣＢＰ発現細胞の双方から細胞抽出液を調製し、抗アセチル化リジン抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて免疫沈降を行った。沈降画分をイムノブロット法で解析した。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の抗ＪＮＫ１抗体と抗ＭＫＫ４抗体を使用した。沈降画分にＪＮＫ１とＭＫＫ４が存在したが、細胞質ＣＢＰによりそれらは著明に増大した（図４）。この結果はＪＮＫ１とＭＫＫ４がアセチル化されていることを示すが、これらの酵素はアセチル化により低活性になることが考えられる。

【0019】

なお、図４において、細胞質に存在するＪＮＫとＭＫＫ４のアセチル化を解析するため、正常細胞と細胞質ＣＢＰ発現細胞のそれぞれから細胞抽出液を調製した。各抽出液から抗アセチル化リジン抗体による免疫沈降画分を分画しイムノブロット法でＪＮＫとＭＫＫ４の修飾を調べた。図４に示すＥＲＴ２−ＣＢＰ−は正常細胞を、ＥＲＴ２−ＣＢＰ＋は細胞質ＣＢＰ発現細胞を示す。

【0020】

上流のＭＫＫ４は下流のＪＮＫ１と複合体を形成し活性を伝達する。アセチル化されたことが活性化状態に影響することを調べるため、細胞質ＣＢＰ存在下でのＭＫＫ４とＪＮＫ１との複合体形成について解析した。正常細胞と細胞質ＣＢＰ発現細胞とをＴＣＲで刺激した後、細胞溶解液を調製した。抗ＭＫＫ４抗体を用いて免疫沈降を行い、沈降画分中にＪＮＫ１が存在するか否かをイムノブロット法で解析した。試薬と装置は既述のものを使用した。正常細胞ではＭＫＫ４免疫沈降画分にＪＮＫ１の存在がＴＣＲ刺激依存にして検出できたが、細胞質ＣＢＰ発現細胞では著明に低下していることが判った（図５左）。これはアセチル化されたことによりＭＫＫ４とＪＮＫ１とが複合体を形成できない状態になっていることを示唆する。

【0021】

正常細胞ではＡＰ−１構成因子であるｃ−Ｊｕｎのリン酸化がＴＣＲ刺激依存性に検出された。細胞質ＣＢＰ発現細胞ではｃ−Ｊｕｎのリン酸化は認められなかった（図５右）。複合体形成のできないＪＮＫ１ではＡＰ−１の活性化を充分に誘導できないことが示唆された。

【0022】

図５中の左図が示すのは、正常細胞（ＣＴＲＬ）と細胞質ＣＢＰ発現細胞（ＥＲＴ２−ＣＢＰ）でのＭＫＫ４とＪＮＫ１の相互作用を解析した結果である。このときＴＣＲ刺激は抗ＣＤ３抗体と抗ＣＤ２８抗体とを用いて行った。また、図５中の右図が示すのは、ＭＫＫ４−ＪＮＫ１経路の活性を知るため、下流のｃ−Ｊｕｎリン酸化を解析した結果である。この際、抗ｃ−Ｊｕｎ抗体と抗リン酸化ｃ−Ｊｕｎ抗体はＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社のものを使用した。イムノブロット法で解析を行った。

【0023】

アセチル化によるＪＮＫ−ＡＰ−１経路の抑制が示唆されたが、このことがＴ細胞機能にどのような影響を与えているかについて検討した。図６に示す実験では、正常細胞（ＣＴＲＬ）と細胞質ＣＢＰ発現細胞（ＥＲＴ２−ＣＢＰ）の細胞上清中に含まれるインターロイキン−２濃度を解析した。ＴＣＲ刺激０時間（０ｈ）と１８時間（１８ｈ）後に培養上清を用いた。上清中のインターロイキン−２をＥＬＩＳＡ法（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社）で測定した結果、正常Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較して細胞質ＣＢＰ発現細胞ではインターロイキン−２量が少なかった（図６）。ＭＫＫ４やＪＮＫ１のアセチル化によりＴ細胞の機能が減弱したと考えられる。こうした系を応用すれば、Ｔ細胞機能亢進により生じる自己免疫疾患を治療できる可能性が示唆された。

【0024】

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】