特許 6984956 ＤＩＣの診断方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6984956

(24)【登録日】2021年11月29日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】ＤＩＣの診断方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/49 20060101AFI20211213BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/49 A

   G01N33/49 X

【請求項の数】9

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2018-539804(P2018-539804)

(86)(22)【出願日】2017年1月25日

(65)【公表番号】特表2019-507338(P2019-507338A)

(43)【公表日】2019年3月14日

(86)【国際出願番号】FR2017050158

(87)【国際公開番号】WO2017129895

(87)【国際公開日】20170803

【審査請求日】2019年12月17日

(31)【優先権主張番号】1650667

(32)【優先日】2016年1月27日

(33)【優先権主張国】FR

(31)【優先権主張番号】1650765

(32)【優先日】2016年1月29日

(33)【優先権主張国】FR

(31)【優先権主張番号】1661823

(32)【優先日】2016年12月1日

(33)【優先権主張国】FR

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】505257372

【氏名又は名称】オピトー・ユニヴェルシテール・ドゥ・ストラスブール

(73)【特許権者】

【識別番号】517019887

【氏名又は名称】ダイアグノスティカ スターゴ

(74)【代理人】

【識別番号】100126505

【弁理士】

【氏名又は名称】佐貫 伸一

(74)【代理人】

【識別番号】100131392

【弁理士】

【氏名又は名称】丹羽 武司

(72)【発明者】

【氏名】ボワラメ−エルムズ，ジュリー

(72)【発明者】

【氏名】トティ，フロランス

(72)【発明者】

【氏名】スシェル，ロール

(72)【発明者】

【氏名】モービュー，ローラン

(72)【発明者】

【氏名】メジアニ，フェルハト

【審査官】 倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１８４４７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１３−０９２４３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 SANG HOON SONG，NEUTROPHIL CD64 EXPRESSION IS ASSOCIATED WITH SEVERITY AND PROGNOSIS OF DISSEMINATED 以下備考，THROMBOSIS RESEARCH，米国，2008年01月01日，VOL:121, NR:4,，PAGE(S):499 - 507，http://dx.doi.org/10.1016/j.thromres.2007.05.013，INTRAVASCULAR COAGULATION

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８−３３／４９，

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

好中球蛍光測定を含む、第一の生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するためのインビトロの方法であって、
前記好中球蛍光測定が、ＤＮＡインターカレーターを用いて行われるものであり、
好中球蛍光測定値に基づいてＤＩＣを予測するおよび／または検出するためのものである、方法。

【請求項2】

好中球蛍光測定値と好中球蛍光基準値を比較する工程を含む、請求項１に記載の検出方法。

【請求項3】

生物試料が血液試料を含む群から選択される、請求項１または２に記載の検出方法。

【請求項4】

ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１０５（ＣＤ１０５）である膜微粒子の濃度Ｒ０_{ＣＤ１０５}を、第二の生物試料から、測定する工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記第一および第二の生物試料が同一の試料である、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記第一および第二の生物試料が敗血症性ショックの患者に由来するものである、請求項４または５に記載の方法。

【請求項7】

生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行を検出するおよび／またはモニタリングするための方法であって、以下の工程：
ａ． 好中球蛍光Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}を測定することであって、前記好中球蛍光の測定が、ＤＮＡインターカレーターを用いて行われること
ｂ． 測定した好中球蛍光値Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}を、基準値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}と比較する
ｃ． ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１０５（ＣＤ１０５）である膜微粒子の濃度Ｒ０_{ＣＤ１０５}を測定する
ｄ． 測定値Ｒ０_{ＣＤ１０５}を、基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}と比較する
ｅ． 血小板濃度Ｒ０_Ｐｌｔを測定する
ｆ． 測定値Ｒ０_Ｐｌｔを、基準値Ｒ_Ｐｌｔと比較する
ｇ． プロトロンビン含有量Ｒ０_ＴＰを測定する
ｈ． 測定値Ｒ０_ＴＰを、基準値Ｒ_ＴＰと比較する
ｉ． Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}が値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より大きい場合、好中球蛍光値Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}を１とする、またはＲ０_{ｎｅｕｔｆｌ}が値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より小さい場合、Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}を０とする
ｊ． Ｒ０_{ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より大きい場合、値Ｖ_{ＣＤ１０５}を１とする、またはＲ０_{ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より小さい場合、値Ｖ_{ＣＤ１０５}を０とする
ｋ． Ｒ０_Ｐｌｔが値Ｒ_Ｐｌｔより小さい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを１とする、またはＲ０_Ｐｌｔが値Ｒ_Ｐｌｔより大きい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを０とする
ｌ． Ｒ０_ＴＰが値Ｒ_ＴＰより小さい場合、値Ｖ_ＴＰを１とする、またはＲ０_ＴＰが値Ｒ_ＴＰより大きい場合、値Ｖ_ＴＰを０とする
ｍ． 以下の式に従い、スコアＳ１を算出する
Ｓ１＝ε＋Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}×α＋Ｖ_{ＣＤ１０５}×β＋Ｖ_Ｐｌｔ×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは−０．７０８〜２．２８０、αは０．１５２〜１．９２８、βは０．１５４〜１．５４９、Ωは−０．０１６〜−０．００５、およびθは−０．０３６〜０．００１である、
または
Ｓ１＝０．７８６＋１．０４０×Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}＋０．８５１×Ｖ_{ＣＤ１０５}＋（−０．０１０×Ｖ_Ｐｌｔ）＋（−０．０１７×Ｖ_ＴＰ）である、
を含み、
スコアＳ１に基づいてＤＩＣの進行を検出するおよび／またはモニタリングするものである、方法。

【請求項8】

生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行を検出するおよび／またはモニタリングするための方法であって、以下の工程：
ａ． 好中球蛍光Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}を測定することであって、前記好中球蛍光の測定が、ＤＮＡインターカレーターを用いて行われること
ｂ． 測定した好中球蛍光値Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}を、基準値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}と比較する
ｃ． 血小板濃度Ｒ０_Ｐｌｔを測定する
ｄ． 測定値Ｒ０_Ｐｌｔを、基準値Ｒ_Ｐｌｔと比較する
ｅ． プロトロンビンレベルＲ０_ＴＰを測定する
ｆ． 測定値Ｒ０_ＴＰを、基準値Ｒ_ＴＰと比較する
ｇ． Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}が値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より大きい場合、好中球蛍光値Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}を１とする、またはＲ０_{ｎｅｕｔｆｌ}が値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より小さい場合、Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}を０とする
ｈ． Ｒ０_Ｐｌｔが値Ｒ_Ｐｌｔより小さい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを１とする、またはＲ０_Ｐｌｔが値Ｒ_Ｐｌｔより大きい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを０とする
ｉ． Ｒ０_ＴＰが値Ｒ_ＴＰより小さい場合、値Ｖ_ＴＰを１とする、またはＲ０_ＴＰが値Ｒ_ＴＰより大きい場合、値Ｖ_ＴＰを０とする
ｊ． 以下の式に従い、スコアＳ２を算出する
Ｓ２＝ε＋Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}×α＋Ｖ_Ｐｌｔ×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは０．３８１〜３．０７０、αは０．２０９〜１．９１０、Ωは−０．０１５〜−０．００５、θは−０．０４０〜−０．００４である、
または
Ｓ２＝１．７２６＋１．０６０×Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}＋（−０．０１０×Ｖ_Ｐｌｔ）＋（−０．０２２×Ｖ_ＴＰ）である、
を含み、
スコアＳ２に基づいてＤＩＣの進行を検出するおよび／またはモニタリングするものである、方法。

【請求項9】

生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行を検出するおよび／またはモニタリングするための方法であって、以下の工程：
ａ． 好中球蛍光Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}を測定することであって、前記好中球蛍光の測定が、ＤＮＡインターカレーターを用いて行われること
ｂ． 測定した好中球蛍光値Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}を、基準値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}と比較する
ｃ． ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１０５（ＣＤ１０５）である膜微粒子の濃度Ｒ０_{ＣＤ１０５}を測定する
ｄ． 測定値Ｒ０_{ＣＤ１０５}を、基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}と比較する
ｅ． 血小板濃度Ｒ０_Ｐｌｔを測定する
ｆ． 測定値Ｒ０_Ｐｌｔを、基準値Ｒ_Ｐｌｔと比較する
ｇ． プロトロンビンレベルＲ０_ＴＰを測定する
ｈ． 測定値Ｒ０_ＴＰを、基準値Ｒ_ＴＰと比較する
ｉ． Ｒ０_{ｎｅｕｔｆｌ}が値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より大きい場合、好中球蛍光値Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}を１とする、またはＲ０_{ｎｅｕｔｆｌ}が値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より小さい場合、値Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}を０とする
ｊ． Ｒ０_{ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より大きい場合、値Ｖ_{ＣＤ１０５}を１とする、またはＲ０_{ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より小さい場合、値Ｖ_{ＣＤ１０５}を０とする
ｋ． Ｒ０_Ｐｌｔが値Ｒ_Ｐｌｔより大きい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを１とし、また、Ｒ０_Ｐｌｔが値Ｒ_Ｐｌｔより小さい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを０とする
ｌ． Ｒ０_ＴＰが値Ｒ_ＴＰより大きい場合、値Ｖ_ＴＰを１とする、またはＲ０_ＴＰが値Ｒ_ＴＰより小さい場合、値Ｖ_ＴＰを０とする
ｏ． 以下の式に従い、スコアＳ１および／またはＳ２を算出する
Ｓ１＝ε＋Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}×α＋Ｖ_{ＣＤ１０５}×β＋Ｖ_Ｐｌｔ×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは−０．７０８〜２．２８０、αは０．１５２〜１．９２８、βは０．１５４〜１．５４９、Ωは−０．０１６〜−０．００５、およびθは−０．０３６〜０．００１であり、
Ｓ２＝ε＋Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}×α＋Ｖ_Ｐｌｔ×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは０．３８１〜３．０７０、αは０．２０９〜１．９１０、Ωは−０．０１５〜−０．００５、θは−０．０４０〜−０．００４である、
を含み、
スコアＳ１および／またはスコアＳ２に基づいてＤＩＣの進行を検出するおよび／またはモニタリングするものである、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物試料における播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するための方法、ならびに生物試料における播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するためのキットに関する。

【0002】

本発明はまた、生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行をモニタリングするための方法に関する。

【0003】

本発明は、医学および獣医学の分野に適応できる。

【0004】

以下の記述において、角括弧（［］）内の参考文献は、本書の最後の参照文献リストを指す。

【背景技術】

【0005】

敗血症性ショックは、病原因子に反応した宿主の炎症反応によって特徴づけられる症状であり、体液貯留に抵抗を示し昇圧剤（ノルアドレナリン）の導入を要する低血圧の原因となり、臓器不全を伴う。

【0006】

凝固は、敗血症性ショックの間常に活性化され、宿主の防御に関与する。しかしながらこの活性化は、血小板減少症、白血球および内皮刺激、ならびに凝固因子および凝固阻止因子の消費について「無調節」な場合があり、微小血栓症に影響し、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の原因となる。ＤＩＣ、重症度と多臓器不全の間の関連は、長年にわたって知られており、病因および臓器不全の治療に加えて、敗血症性ショックの間の抗凝固剤治療を行うことの根拠となっている。しかしながら、凝固に効果のある治療（ＤＩＣの患者を厳密に対象にしたことはない）に関する臨床研究では、それが患者の予後を改善することができないという理由で期待外れであることがわかっている。

【0007】

フランスでは、毎年８０，０００件の敗血症が観測され、敗血症は病原微生物の侵襲に反応した生体による全身炎症反応と定義され、多臓器不全の発症に進行することもある臓器のかん流低下および酸素負債に反映される。動脈低血圧症は、適切な血流にもかかわらず持続し、昇圧剤（ノルアドレナリン、アドレナリン）の使用が必要となる。そのため重症であり、比較的一般的な疾病である。

【0008】

これは、炎症性サイトカインおよび血管内皮の表現型の変異の導入による集中的な細胞活性化と関連しており、接着促進性、炎症性および血栓形成性を担っている。

【0009】

従来技術において、病原因子による侵襲後の宿主の応答には自然免疫系および適応免疫系が含まれるということが示されている。自然免疫系は、多量のケモカインおよびサイトカインを放出することによる防御の第一線を構成する（Ａｚｉｚ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。

【0010】

多核好中球（ＰＮＮ）は自然免疫系の細胞である。長い間これらの細胞は細胞外の病原菌を貪食するという機能だけを持つ細胞だと考えられていた。ここ数年、生理学に関する知識の発達とＰＮＮの置かれる状況は、自然免疫、適応免疫および止血を結び付けた、より複雑なものへと進んでいる（Ｍｏｃｓａｉ， ２０１３）。ＰＮＮが貪食によって抗細菌防御において主要な役割を果たす一方で、２０００年代の初めから、特に脾臓内の辺縁帯Ｂリンパ球との相互作用によって、細胞内細菌（ウイルス、マイコバクテリア）に対す
る保護および適応免疫反応の調節においても役割を果たしていることが立証されてきた。したがって、ＰＮＮはその核の中身、ＤＮＡおよびヒストン、を放出することができ、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）またはエラスターゼなどの酵素をサポートするネットワークを形成する。これらの構造は、２００４年に初めて記述され、ＮＥＴｓ（好中球細胞外トラップ（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｒａｐｓ））と言われ、その高分子ネットワークにおいて病原体を捕捉することができる（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ２００４）。ＮＥＴｏｓｉｓ（ＮＥＴｓによる細胞死のプログラム）の２つのメカニズムが記述されており、一方は細胞自殺を引き起こし数時間持続し、他方は「バイタルな」ＮＥＴｏｓｉｓであり、貪食が可能な無核形のＰＮＮの生存をより早く可能にする新たなタンパク質の合成に依存しない、したがって核の存在に依存しない機能である（Ｆｕｃｈｓ ｅｔ ａｌ．， ２００７）。

【0011】

この２つのメカニズムは、ＰＮＮの形態上の変化と同時に起こり、ＰＭＡまたはホルボールミリステートアセテートによるインビトロのＮＥＴｏｓｉｓの誘発に続く電子顕微鏡法で説明される（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ， ２０１２）。はじめに、クロマチンが脱凝縮し、核がその小葉（ｌｏｂｕｌｅｓ）を失い、細胞質が脱顆粒し、細胞がＮＥＴｓを放出する。バイタルなＮＥＴｏｓｉｓ経路はグラム陽性細菌による感染に関連するようである。ＮＥＴｓは脱凝縮したクロマチンおよび抗菌性タンパク質を含む小胞から放出される。

【0012】

ＮＥＴｓは、バクテリアおよび真菌を捕捉することによって抗菌機能を示すが、血栓形成においての役割も持っている可能性がある。したがってＮＥＴｓは、免疫学的血栓形成（ｉｍｍｕｎｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）と呼ばれる新しいコンセプトにおいて主要な役割を担う可能性がある（Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ Ｋ， ｅｔ ａｌ．， ２０１５； Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ ｅｔ Ｍａｓｓｂｅｒｇ， ＰＭＩＤ ２０１３）。

【0013】

近年、ＮＥＴｏｓｉｓ工程のスピード、感染部位におけるＮＥＴｏｓｉｓの集中および循環ヌクレアーゼによるＤＮＡの分解が、循環血液において、直接インビボでの検出することの障害となっている。しかしながら、間接的なＮＥＴｏｓｉｓマーカー、特に高いレベルでの循環ヌクレオソーム、シトルリン化ヒストンおよびＭＰＯｓの組み合わせ、が存在する（Ａｂｒａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）、（Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ ｅｔ
ａｌ．， ２００９）。ＮＥＴｏｓｉｓはこれらのマーカーを通じて様々な病態、特に血栓症、感染症、がんまたは自己免疫病態と関連づけられている（Ｋｅｓｓｅｎｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， ２００９）、（Ｄｅｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）。

【0014】

したがって、ＮＥＴｓは宿主の防御機構における役割だけでなく、感染過程における炎症と凝固間の相互作用にもかかわっている（Ｂｒａｎｚｋ ａｎｄ Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ， ２０１３）。

【0015】

米国特許出願第２０１３／０１０１９９６に記載されているように、例えば宿主防御の過程にあるかどうかを検出するための、フローサイトメトリーを用いた白血球および好中球の検出方法がある。

【0016】

血液に関するパラメーターを組み合わせた、従来から利用可能な二つの生物学的スコアがＤＩＣの診断に提案されている。スコア開発の難点の一つは、現在ＤＩＣの生物学的定義についての統一見解がないという事実にある。２００１年に記述された第一の検出試験は、国際血栓止血学会（ＩＳＴＨ）から発せられており、第二の試験は、２００５年に日本救急医学会（ＪＡＡＭ）から発せられ、２００６年に改訂された。

【0017】

ＩＳＴＨスコアは、重度の血小板減少症の存在、プロトロンビン量の減少（Ｑｕｉｃｋ
プロトロンビン時間の長時間化）、フィブリノーゲンの消費、および線維素溶解マーカーであるＤダイマーの増加をベースにしており、これは腫瘍性疾患、外傷、または産科病態が生じている間に生じるＤＩＣの診断を可能にするが、血小板増加症、フィブリノーゲンの増加、およびＤダイマーの存在に伴う炎症症状の重要性のため、敗血症性ショックの場合では十分でないようである。したがって、敗血症性ショックの間のＤＩＣの検出には適していないようである。

【0018】

ＪＡＡＭスコアは、敗血症性ショックの間のＤＩＣを診断するために開発され、フィブリノーゲンを診断基準に取り入れず、Ｄダイマーおよび血小板に関する敗血症という状況に対してより「整合性のある」閾値を用いている。これらの違いはＩＳＴＨのＤＩＣ委員会で、産科、外傷をベースにしたもの、敗血症または腫瘍性凝固障害に分けてＤＩＣの再定義をするという議論となっている。

【0019】

しかしながら、これらのスコアは、特定のサンプルにより算出でき使用できるのみで、結果を得るのにかなりの時間を要し、したがってかなりのコストおよび治療の遅れが生じる。

【0020】

加えて、現在、安全に体系的にＤＩＣを検出する方法がない。また播種性血管内凝固症候群の発生を、例えば生物試料から、方法および／または手段がない。

【0021】

従来技術では、敗血症性ショックの個人において、前記敗血症性ショックが近い将来播種性血管内凝固症候群を引き起こす／示すかどうかを決定する方法がない一方で、敗血症性ショックの個人においてＤＩＣ陰性の診断を予測する方法を確立することができる方法はある。これは、特に３つのパラメーター、ホスファチジルセリンおよびＣＤ１０５を露出する血中膜微粒子の濃度、血小板数、およびプロトロンビンレベルを組み合わせた、特異度７１．２％、感度７１．０％および陰性予測値９３．１％スコアである。この方法は効果的であるものの、技術的に容易でなく実行に時間がかかる。

【0022】

したがって、従来技術のこの欠点、難点、障害を克服する方法および／または手段、個人の生命予後を改善し、前記個人の治療コストを下げるために、特に、ＤＩＣを検出することができる簡潔で、素早く、効果的な方法、を見出すことに真の必要性がある。

【発明の概要】

【0023】

本発明の目的は、少なくとも一つの生物的マーカーの濃度および／または量を検出および／または測定する工程を含む、生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するための方法を提供することによって、従来技術の難点を克服することである。

【0024】

本明細書において、「生物試料」とは、好中球、血小板、およびホスファチジルセリンを露出する血液微粒子からなる群から選ばれる少なくとも一つの生物的マーカーを意味する。

【0025】

本発明によれば、前記少なくとも一つの生物的マーカーは、当業者に既知の任意の適切な方法によって検出することができる。

【0026】

本発明によれば、前記少なくとも一つの選択された生物的マーカーは、当業者に既知の任意の適切な方法によって測定することができる。

【0027】

本発明によれば、前記少なくとも一つの選択された生物的マーカーの濃度は、当業者に既知の任意の適切な方法によって測定することができる。

【0028】

本明細書において、「好中球」とは、白血球に属し、したがって免疫システムにおいて役割がある、血液細胞である好中性顆粒球または多核好中球（ＰＮＮ）を意味する。

【0029】

本明細書において、好中球の蛍光は、当業者に既知の任意の適切な方法によって測定することができる。これは、例えば、蛍光ラベルなどの好中球に対するラベリングを用いる方法であってもよい。蛍光は、当業者に既知の任意の適切な方法によって測定することができる。これは、例えば、蛍光色素および／または蛍光プローブの認識をベースにしたフローサイトメトリー方法であってもよい。これは、例えば、蛍光色素を用いることを含む好中球をラベリングすることを含む方法であってもよい。これは、例えば、白血球膜に作用してそれを透過する反応も起こす、第一の反応物質による赤血球溶解工程の後に、血液試料などの試料に蛍光色素を適用することを含む方法であってもよく、それによって前記蛍光色素を付加することができる。

【0030】

本明細書において、「蛍光色素」とは、膜透過を伴わない、核酸を結合するポリメチンをベースにするまたはベースにしない剤を意味する。これは、有利に透過または固定白血球膜を通じて細胞質にのみ拡散する蛍光色素であってもよい。蛍光プローブは、例えば、ＤＮＡベース間に挿入されるインターカレーター、抗体などのシトルリン化ヒストンに特異的なプローブ、ヒストンまたはヌクレオソームの翻訳後修飾または構造に特異的なプローブ、任意のＤＮＡ構成タンパク質、ＤＮＡのデコンパクション（ｄｅｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）と関連してまたはＮＥＴｏｓｉｓによってＤＮＡに結合するタンパク質、ＮＥＴｏｓｉｓの際に標識化に接近できる特定の核配列、ＤＮＡの切断を目的とするプローブ、または細胞膜またはミトコンドリア膜への変異などのアポトーシスの初期段階を測定するプローブであってもよい。

【0031】

これらは、不溶化しているかどうか、任意の種類の担体に結合しているかどうかにかかわらず、例えば、インターカレーター、デコンパクションプローブ、ＮＥＴｏｓｉｓの間のＤＮＡに関連した酵素活動マーカー、からなる群から選択される分子であってもよい。

【0032】

これらは、例えば、ヨウ化プロピジウム、抗シトルリン化ヒストン、抗ＤＮＡ抗体などの抗体、白血球エラスターゼ、ＰＲ３またはミエロペルオキシダーゼ等のデコンパクションＤＮＡに関連したタンパク質の活性の蛍光基質フローサイトメトリーを用いたＴＵＮＥＬ効果によるＤＮＡ修飾の測定、膜外アネキシンＶの測定、またはＤｉＯＣ６（３，３’−ジヘキシルオキサカルボシアニンヨージド）の取り込みであってもよい。

【0033】

蛍光色素および／または蛍光プローブは、当業者に既知の任意の適切な蛍光色素および／または蛍光プローブであってもよい。それは例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ社よりＳｙｔｏ４０、ＤＩＯＣ６（３）およびチアゾールオレンジという商品名で販売されるもの等の市販の蛍光色素および／または蛍光プローブであってもよい。当業者は、好中球のラベリングのために、その一般的知識によって、適切な蛍光色素および／または蛍光プローブを選択するだろう。

【0034】

加えて、当業者は、その一般的知識によって、異なる白血球集団を知っており、例えばフローサイトメトリーの際に、その粒子サイズの分布またはサイズの関数としてそれらを同定する方法を知るだろう。

【0035】

多核好中球の蛍光を測定するための方法が、フローサイトメトリー方法など蛍光色素の挿入を用いる方法である場合、この蛍光色素はＳｙｔｏ４０、ヨウ化プロピジウムおよびＧａｌｌｉｏｓ（ベックマン・コールター社製）またはＦＡＣＳ−Ｃａｎｔｏ（ベクトンディッキンソン社製）フローサイトメーターおよび／またはバイオレット（４０５ｎｍ）
、ブルー（４８８ｎｍ）を含む３種のレーザー、対数ゲイン設定、バイオレット（４０５ｎｍ）レーザーに結合した検出器で測定されるＳＹＴＯ４０の蛍光などを備え、４５０〜４６０ｎｍを中心とする帯域フィルターと組み合わされ、その他のレーザーは抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ４９ｄ抗体などを用いた白血球および好中球の同定に使用されているその他のフローサイトメーターなどであってもよい。

【0036】

本発明によれば、「蛍光強度」は、例えば６３０ｎｍで励起された蛍光分子の再放出波長において測定された任意のシグナルを意味することを意図している。蛍光強度は、ＤＮＡのデコンパクション状態に比例する。

【0037】

本明細書において、好中球の蛍光は、当業者に既知の本発明に適切な任意の機器によって測定することができる。これは、Ｓｙｓｍｅｘ社、Ｓｏｃｉｍｅｄ社またはＡｌｅｒｅ社によって販売される機器などであってもよい。例えば、ＳｙｓｍｅｘＸＮ自動分析装置であってもよい。

【0038】

本発明の発明者らは、血液試料などの生物試料からの好中球蛍光の測定により、敗血症性ショックの個人におけるＤＩＣの存在を決定するおよび／またはＤＩＣが進行する可能性がある個人を同定することができることを実証している。

【0039】

本発明の主題は、好中球蛍光測定を含む、第一の生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するためのインビトロの方法である。

【0040】

加えて、本発明の主題は、好中球蛍光測定を含む、第一の生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を検出するためのインビトロの方法である。

【0041】

本明細書において、「生物試料」は、哺乳類、例えばカモノハシ目、オポッサム目、ケノレステス目、ミクロビオテリウム目、フクロモグラ目、フクロネコ目、バンディクート目、カンガルー目、ツチブタ目、ジュゴン目、アフリカトガリネズミ目、ハネジネズミ目、イワダヌキ目、ゾウ目、アルマジロなどの被甲目、有毛目、ツパイ目、ヒヨケザル目、霊長目、ネズミ目、ウサギ目、ハリネズミ目、トガリネズミ目、コウモリ目、センザンコウ目、ネコ目、ウマ目、ウシ目およびクジラ目からなる群から選択される哺乳類、から得られる任意の試料を意味することを意図している。これは、ヒトまたは動物などであってもよい。これは、家畜動物、ペット、絶滅危惧種またはその他の動物などであってもよい。

【0042】

本発明によれば、生物試料は血液試料であってもよい。

【0043】

本発明によれば、生物試料は敗血症性ショックの哺乳類または敗血症性ショックのリスクのある哺乳類に由来してもよい。

【0044】

本発明によれば、検出方法は測定された蛍光強度を基準蛍光値と比較する工程を含んでもよい。

【0045】

本発明によれば、基準蛍光値は、対象において測定された好中球の蛍光強度または基準となる健康な対象群において測定された平均濃度であってもよい。

【0046】

本明細書において、「基準となる健康な対象」は、ヒトなどの哺乳類で、感染、ショック、出血、敗血症性ショックおよび／または上記の播種性血管内凝固症候群につながる可能性のあるその他の発作を受けていないものを意味することを意図している。

【0047】

本発明によれば、「基準となる健康な対象群」は信頼性のある基準値を生成することができる群を意味することを意図している。これは上記で定義されているような少なくとも２基準対象からなる群、例えば、少なくとも１０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも１００基準対象であってもよい。これは例えば、３０〜５００対象、４０〜２００、４５〜１１０基準対象であってもよい。

【0048】

本発明によれば、好中球蛍光基準値Ｒ_{Ｎｅｕｔ ＳＦＬ}またはＲｎｅｕｔｆｌは、基準対象および／または基準対象群から得られる値の統計的分析により得られるＲＯＣ曲線の解析により得られるものであってもよい。基準値は決定されてよく、例えばＳｔｉｅｌ ｅｔ ａｌ． “Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ： Ａ Ｎｅｗ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．”Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２０１６；４４（１１）：ｅ１１３２−ｅ１１３６に記載されているようにＲＯＣ曲線を通じて得られてもよい。

【0049】

本発明によれば、Ｓｙｓｍｅｘ社により販売されるＳｙｓｍｅｘＸＮ自動分析装置などの機器によって好中球蛍光が測定される場合、好中球蛍光基準値は、 Ｓｔｉｅｌ ｅｔ
ａｌ． “Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ： Ａ Ｎｅｗ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ
Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．”Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２０１６；４４（１１）：ｅ１１３２−ｅ１１３６に記載されるＲＯＣ曲線を通じて得られる好中球蛍光基準値Ｒ_{Ｎｅｕｔ ＳＦＬ}またはＲｎｅｕｔｆｌは５７より大きい任意の単位の蛍光値であってもよい。

【0050】

有利なことに、本発明者らは、測定された蛍光値が基準値よりも大きい場合、本発明による方法により播種性血管内凝固症候群を検出するおよび／または予測することが可能になることを実証している。

【0051】

有利なことに、本発明者らは、好中球蛍光の決定／測定を含むＤＩＣの検出方法によりＤＩＣの検出を感度９１％以上および特異度８１％以上にできることも実証している。

【0052】

本発明によれば、播種性血管内凝固症候群を予測するおよび／または検出するための方法は、第二の生物試料からＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１０５（ＣＤ１０５）でありホスファチジルセリンを露出する膜微粒子濃度Ｒ０_{ＣＤ１０５}を測定する工程をも含んでもよい。

【0053】

本明細書において、「ホスファチジルセリンを露出する微粒子」は、ホスファチジルセリンを露出する細胞膜微粒子を意味することを意図している。これらは、例えば、内皮細胞、血小板、単球、顆粒球または多核細胞（好中球、好酸球または好塩基球）およびその循環前駆細胞、赤血球細胞、リンパ球または非血管由来細胞などの細胞から血管内などに放出され、ホスファチジルセリンを露出する膜微粒子であってもよい。例えば、膜微粒子には５０ｎｍ〜１μｍのサイズ、すなわち個別の直径があってもよく、ホスファチジルセリンを露出してもよい。例えば、膜微粒子は、組織因子活性または線維素溶解活性があってもよい。

【0054】

ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）をもつ膜微粒子の濃度は、当業者に既知の任意の適切な方法で測定することができる。これは例えば、ビーズに固定されたか否かに関わらず、標識抗体、タンパク質または脂質プローブなどの蛍
光プローブあるいは微粒子に含まれるｍｉＲＮＡなどの遺伝物質を認識する均一なプローブをベースにしたフローサイトメトリー方法であってもよい。プローブは、ホスファチジルセリン（ＰｈｔｄＳｅｒ）、例えばアネキシン５または分子工学によって得られるジアネキシンなどその他のアネキシン誘導体に特異的であってよい。プローブはまた、より長いまたは短い炭素をベースにした鎖をもつ脂質プローブなどの膜脂質およびそのコンパクション（ｃｏｍｐａｃｔｉｏｎ）の程度を認識してもよい。タンパク質プローブは例えば、微粒子の表面においてＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を検出するか、あるいは微粒子の表面においてまたは内部に位置する他のタンパク質または酵素、アクチン、メタロプロテアーゼ、組織因子またはｕＰＡＲなど酵素活性のあるタンパク質受容体、サイトカインおよびインターロイキンなどを検出する抗体であってもよい。微粒子の濃度は全脂質または全タンパク質の定量分析によってまたは調整可能な抵抗パルスセンシング（Ｔｕｎａｂｌｅ Ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ Ｐｕｌｓｅ Ｓｅｎｓｉｎｇ）技術を用いて測定されてもよい。膜微粒子の濃度は、例えば、Ｈｕｇｅｌ Ｂ，
Ｚｏｂａｉｒｉ Ｆ， Ｆｒｅｙｓｓｉｎｅｔ ＪＭ． Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００４ Ｏｃｔ；２（１０）：１８４６−７ ［１２］に記載されているようにプロトロンビナーゼ試験を通じて測定されてもよい。簡潔には、この方法では、反応培地に加えられた外因性プロトロンビンからの溶解性トロンビンの生成において、ＰｈｔｄＳｅｒが限定的なパラメーターとなるように血液凝固因子およびカルシウム濃度が決定される。結果は、Ｈｕｇｅｌ Ｂ， Ｚｏｂａｉｒｉ Ｆ， Ｆｒｅｙｓｓｉｎｅｔ ＪＭ． “Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”， Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ． ２００４ Ｏｃｔ；２（１０）：１８４６−７ ［１２］に記載されているように既知の組成および濃度のリポソームにより作成される検量線を参照することにより、ナノモル当量のＰｈｔｄＳｅｒ（ｎＭｅｑ．ＰｈｔｄＳｅｒ）で表現される。微粒子の濃度はまた、例えば、組織因子活性測定することによって通じて測定することができる。簡潔には、Ａｕｐｅｉｘ Ｋ， ｅｔ ａｌ． “Ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｓｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｖｉｔｒｏ， ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ， ｉｎ
ＨＩＶ−１ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．” Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９７； ９９（７）： １５４６−５４． ［１３］に記載されているように、この方法はテナーゼと呼ばれる複合体に固有の凝固因子を用い、反応培地に加えられたＸ因子からＸａ因子の形成をアッセイする。ＴＦ＋ＭＰによってもたらされる活性は既知の濃度の組織因子の検量線に関連する。得られた濃度は、組織因子活性１リットル当たりのピコモルで表現される。膜微粒子の濃度はまた、例えば、微粒子の同定（表現型）を可能にする抗体などの捕捉手段で覆われたビーズをベースにした計時法（ｃｈｒｏｎｏｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ）およびリン脂質を持たない原形質を加えた後の凝固時間の測定によって測定されてもよい。この方法では、凝固時間は、ビーズによってあらかじめ捕捉された微粒子（ＭＰ）から提供されるアニオン性リン脂質（ＰｈｔｄＳｅｒ）の量に依存する。既知の濃度のリポソームを用いた計時試験（ｃｈｒｏｎｏｍｅｔｒｉｃ ｔｅｓｔ）の較正が任意で実施されてもよく、それにより計時結果（秒）を凝固促進活性（ｎＭｅｑ．ＰｈｔｄＳｅｒ）に変換することができる。これは例えば、Ｓｔａｇｏ社の自動分析装置ＳＴＡＲによって実施することができる。

【0055】

本発明によれば、第二の生物試料は上に定義された生物試料である。

【0056】

本発明によれば、第二の生物試料は、第一の生物試料を同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0057】

本発明によれば、第一および第二の生物試料は、単一で同じ生物試料であってもよい。

【0058】

本発明によれば、第一および／または第二の生物試料は、敗血症性ショックの哺乳類に由来してもよい。

【0059】

本発明によれば、ＤＩＣを予測するおよび／または検出するための方法はまた、濃度測定値Ｒ０_{ＣＤ１０５}を基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}と比較する工程を含んでもよい。

【0060】

本発明によれば、基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}は、対照において測定されたまたは基準となる健康な対象群において測定された平均濃度、ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）がＣＤ１０５である微粒子の濃度であってもよい。

【0061】

本発明によれば、基準となる健康な対象または基準となる健康な対象群とは、上に定義されたとおりである。

【0062】

本発明によれば、基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}はまた、ＲＯＣ曲線の分析によって得られる値であってもよい。

【0063】

本発明によれば、基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}は、０．６５ｎＭ当量のＰｈｔｄＳｅｒまたはＰＳより大きいＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を持つ微粒子の濃度であってもよい。

【0064】

有利なことに、本発明者らは、本発明の方法によれば、ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）がＣＤ１０５である微粒子の濃度測定値が基準値より大きい場合、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を検出するおよび／または予測することができることを実証している。

【0065】

有利なことに、本発明の発明者らはまた、濃度Ｒ０_{ＣＤ１０５}を決定することを含むＤＩＣの検出方法により感度６９％以上および特異度４８％以上での検出が可能になることを実証している。

【0066】

本発明によれば、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するための方法はまた、第三の生物試料から血小板濃度Ｒ０Ｐｌｔを測定する工程を含んでもよい。

【0067】

本明細書において、「血小板」は巨核球の分裂により形成される血小板を意味することを意図している。

【0068】

本発明によれば、第三の生物試料とは、上に定義されたとおりである。

【0069】

本発明によれば、第三の生物試料は、第一および／または第二の生物試料と同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0070】

本発明によれば、第一および第三の生物試料は、同じ試料であってもよい。

【0071】

本発明によれば、第二および第三の生物試料は、同じ試料であってもよい。

【0072】

本発明によれば、第一、第二および第三の生物試料は、同じ試料であってもよい。

【0073】

本発明によれば、試料中の血小板濃度は、当業者に既知の任意の適切な方法で測定することができる。これは例えば、ＭｃＮａｉｒ ｅｔ ａｌ， ＪＥＣＴ． ２０１５；
４７：１１３−１１８に記載されている方法および／または電気インピーダンスを用いてそれから血小板濃度を導き出すコールター型カウンターにより自動化された方法などであってもよい。実際、電解液中に分散された細胞の通過により、２電極間の電気抵抗が変化し、細胞の通過に関連したインパルスの形式で記録されるインピーダンスにばらつきが生じ、それによって濃度がはっきりする（コールター原理）。

【0074】

本発明によれば、ＤＩＣを予測するおよび／または検出するための方法はまた、測定濃度Ｒ０Ｐｌｔを基準値ＲＰｌｔと比較する工程を含んでもよい。

【0075】

本発明によれば、基準値ＲＰｌｔは、基準となる健康な対象において測定された血小板濃度または基準となる健康な対象群において測定された平均濃度であってもよい。

【0076】

本発明によれば、基準となる健康な対象または基準となる健康な対象群は上に定義されたとおりである。

【0077】

本発明によれば、基準値ＲＰｌｔはまた、ＲＯＣ曲線の分析により得られた値であってもよい。

【0078】

本発明によれば、基準値ＲＰｌｔは、１２７ｇ／ｌと等しい血小板含有量であってもよい。

【0079】

有利なことに、本発明の発明者らは、濃度ＲＰｌｔを決定することを含むＤＩＣを検出するための方法により、感度６８％以上、特異度９０％以上での検出が可能になることを実証している。

【0080】

本発明によれば、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するための方法はまた、プロトロンビンレベルＲｏＴＰを測定する工程を含んでもよい。

【0081】

本発明によれば、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を予測するおよび／または検出するための方法はまた、第四の生物試料からプロトロンビンレベルＲ０ＴＰを測定する工程を含んでもよい。

【0082】

本発明によれば、第四の生物試料は上に提起されたとおりの生物試料である。

【0083】

本発明によれば、第四の生物試料は、第一、第二および／または第三の生物試料と同一であってもよく、異なっていてもよい。

【0084】

本発明によれば、第一および第四の生物試料は単一で同じ試料であってもよい。

【0085】

本発明によれば、第二および第四の生物試料は、同じ試料であってもよい。

【0086】

本発明によれば、第三および第四の生物試料は、単一で同じ試料であってもよい。

【0087】

本発明によれば、第一、第二および第四の生物試料は、単一で同じ試料であってもよい。

【0088】

本発明によれば、第一、第三および第四の生物試料は、単一で同じ試料であってもよい。

【0089】

本発明によれば、第二、第三および第四の生物試料は、単一で同じ試料であってもよい
。

【0090】

本発明によれば、第一、第二、第三および第四の生物試料は、単一で同じ試料であってもよい。

【0091】

本発明によれば、試料中のプロトロンビンレベルは、当業者に既知の任意の適切な方法で測定することができる。これは例えば、Ｄｅｌａｂｒａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．， ＣＣＭＥＤ ２０１６に記載されている方法および／または比色分析によっておよび／またはＳＴＡＧＯ社の自動分析装置ＳＴＡ−Ｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎタイプの使用を通じて、ルーチンであって、適切な、市販の反応剤を使用した因子ＩＩのアッセイなどを含む方法であってもよい。

【0092】

本発明によれば、ＤＩＣを予測するおよび／または検出するための方法はまた、測定されたプロトロンビンレベルＲ０ＴＰを基準値ＲＴＰと比較する工程を含んでもよい。

【0093】

本発明によれば、基準値ＲＴＰは、基準となる健康な対象において測定されたプロトロンビンレベルＲ０ＴＰ、または基準となる健康な対象群において測定された平均濃度であってもよい。

【0094】

本発明によれば、基準となる健康な対象または基準となる健康な対象群は上に定義されたとおりである。

【0095】

本発明によれば、基準値Ｒ０ＴＰはまた、ＲＯＣ曲線の分析によって得られてもよい。

【0096】

本発明によれば、基準値Ｒ_ＴＰは、５８％より小さいプロトロンビンレベルであってもよい。

【0097】

有利なことに、本発明者らは、測定されたプロトロンビンレベルが基準値より小さい場合、本発明による方法により播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を検出するおよび／または予測することが可能となることを実証している。

【0098】

有利なことに、本発明の発明者らはまた、濃度Ｒｏ_ＴＰを決定することを含むＤＩＣの検出方法により、感度７３％以上、特異度６０％以上での検出が可能になることを実証している。

【0099】

有利なことに、本発明の発明者らはまた、蛍光およびＣＤ１０５の組み合わせ、血小板ならびにプロトロンビンレベルを決定することを含むＤＩＣの検出方法により、感度７６％以上、特異度８６％超での検出が可能になることを実証している。

【0100】

言い換えれば、少なくとも一つの生物試料から、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ自動分析装置などを用いた好中球蛍光測定、血小板濃度、プロトロンビンレベルおよびＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１０５（ＣＤ１０５）を含む膜微粒子の測定を含む本発明による方法により、感度７６％以上、特異度８６％以上での検出が可能になることを実証している。

【0101】

有利なことに、本発明の発明者らはまた、好中球蛍光、血小板数およびプロトロンビンレベルの組み合わせを決定することを含むＤＩＣの検出方法により、感度６６％以上、特異度８５％以上での検出が可能になることを実証している。

【0102】

本明細書において、測定された好中球蛍光値Ｒ０Ｎｅｕｔ ＳＦＬは独立に示されたＲ
０ｎｅｕｔｆｌであり、値Ｖｎｅｕｔｆｌはまた、示されたＶｎｅｕｔｓｆｌであってよく、基準値ＲＮｅｕｔ ＳＦＬは独立に示されたＲＮｅｕｔｆｌである。

【発明を実施するための形態】

【0103】

本発明のもう一つの主題は、生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行を検出するおよび／またはモニタリングするための、以下の工程を含むインビトロの方法である。
ａ． 好中球蛍光Ｒ_{０ｎｅｕｔｆｌ}を測定する
ｂ． 測定した好中球蛍光値Ｒ０ｎｅｕｔｆｌを、基準値Ｒｎｅｕｔｆｌと比較する
ｃ． ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１０５（ＣＤ１０５）である膜微粒子の濃度Ｒ_{０ＣＤ１０５}を測定する
ｄ． 測定値Ｒ_{０ＣＤ１０５}を、基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}と比較する
ｅ． 血小板濃度ＲｏＰｌｔを測定する
ｆ． 測定値ＲｏＰｌｔを、基準値ＲＰｌｔと比較する
ｇ． プロトロンビンレベルＲｏＴＰを測定する
ｈ． 測定値ＲｏＴＰを、基準値ＲＴＰと比較する
ｉ． Ｒ０ｎｅｕｔｆｌが値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より大きい場合、好中球蛍光値Ｖｎｅｕｔｆｌを１とする、またはＲ０ｎｅｕｔｆｌが値Ｒ_{ｎｅｕｔｆｌ}より小さい場合、Ｖｎｅｕｔｆｌを０とする
ｊ． Ｒ_{０ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より大きい場合、値Ｖ_{ＣＤ１０５}を１とする、またはＲ_{０ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より小さい場合、ＣＤ１０５値を０とする
ｋ． ＲｏＰｌｔが値ＲＰｌｔより小さい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを１とする、またはＲｏＰｌｔが値ＲＰｌｔより大きい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを０とする
ｌ． ＲｏＴＰが値ＲＴＰより小さい場合、値Ｖ_ＴＰを１とする、またはＲｏＴＰが値ＲＴＰより大きい場合、値Ｖ_ＴＰを０とする
ｍ． 以下の式に従い、スコアＳ１を算出する
Ｓ１＝ε＋Ｖｎｅｕｔｆｌ×α＋Ｖ_{ＣＤ１０５}×β＋Ｖ_{ｐｌａｔｅｌｅｔｓ}×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは−０．７０８〜２．２８０、例えば、０．７８６、αは０．１５２〜１．９２８、例えば、１．０４０、βは０．１５４〜１．５４９、例えば、０．８５１、Ωは−０．０１６〜−０．００５、例えば、−０．０１０、およびθは−０．０３６〜０．００１、例えば、−０．０１７である。

【0104】

加えて、本発明者らは、値Ｓ１が−０．４７より大きい場合、本方法により有利に感度７６％以上特異度８６％以上の予測が可能になることを示している。

【0105】

言い換えれば、得られたスコアはその生物試料の起源である哺乳類の将来の結果に関連している。

【0106】

本発明によれば、本方法は Ｓ１スコアの算出の代わりにまたはそれに加えて、以下の通りｎ．Ｓ２スコアの算出工程を含んでもよい。
ｎ．以下の式に従い、スコアＳ２を算出する：
Ｓ２＝ε＋Ｖｎｅｕｔｆｌ×α＋Ｖ_{ｐｌａｔｅｌｅｔｓ}×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは０．３８１〜３．０７０、例えば、１．７２６、αは０．２０９〜１．９１０、例えば、１．０６０、Ωは−０．０１５〜−０．００５、例えば、−０．１０、θは−０．０４０〜−０．００４、例えば、−０．０２２である。

【0107】

加えて、本発明者らは、Ｓ２の値が０．１６より大きい場合、本方法により有利に感度６６％以上特異度９５％以上のＤＩＣの予測が可能になることを実証している。

【0108】

言い換えれば、本発明者らは、得られたスコアはその生物試料の起源である哺乳類の将来の結果に関連していて、有利にＤＩＣの予測を可能にすることを実証している。

【0109】

本発明のもう一つの主題は、生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行を検出するおよび／またはモニタリングするための、以下の工程を含む方法である。
ａ．ＣＤ分類（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）１０５（ＣＤ１０５）である膜微粒子の濃度Ｒ_{０ＣＤ１０５}を測定する
ｂ．測定値Ｒ_{０ＣＤ１０５}を、基準値Ｒ_{ＣＤ１０５}と比較する
ｃ．血小板濃度ＲｏＰｌｔを測定する
ｄ．測定値ＲｏＰｌｔを、基準値ＲＰｌｔと比較する
ｅ．プロトロンビンレベルＲｏＴＰを測定する
ｆ．測定値ＲｏＴＰを、基準値ＲＴＰと比較する
ｇ．Ｒ_{０ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より大きい場合、値Ｖ_{ＣＤ１０５}を１とする、またはＲ_{０ＣＤ１０５}が値Ｒ_{ＣＤ１０５}より小さい場合、Ｖ_{ＣＤ１０５}値を０とする
ｈ．ＲｏＰｌｔが値ＲＰｌｔより小さい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを１とする、またはＲｏＰｌｔが値ＲＰｌｔより大きい場合、値Ｖ_Ｐｌｔを０とする
ｉ．ＲｏＴＰが値ＲＴＰより小さい場合、値Ｖ_ＴＰを１とする、またはＲｏＴＰが値ＲＴＰより大きい場合、値Ｖ_ＴＰを０とする
ｊ．以下の式に従い、スコアＳ３を算出する：
Ｓ３＝ε＋α×Ｖ_{ＣＤ１０５}＋β×Ｖ_Ｐｌｔ＋γ×Ｖ_ＴＰ
式中、εは０．６８６〜２．８３０、例えば、１．７５８、αは０．１８０〜０．７８５、例えば、０．４８３、βは−０．０１８〜−０．００９、例えば、−０．０１４、およびγは−０．０２７〜０．００１、例えば、−０．０１３である。

【0110】

本発明者らは、Ｓ３の値が０．０３より大きい場合、本方法により有利に感度６７％以上特異度９４％以上のＤＩＣの予測が可能になることを実証している。

【0111】

言い換えれば、本発明者らは、得られたスコアはその生物試料の起源である将来の結果に関連している。

【0112】

言い換えれば、本発明者らは、得られたスコアはその生物試料の起源である将来の結果に関連している。

【0113】

本発明のもう一つの主題は、本発明にかかる播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を検出するための、好中球蛍光の測定および好中球濃度の測定を含む試験である。

【0114】

好中球濃度および／または蛍光は、上に定義されたとおりである。

【0115】

本発明のもう一つの主題は、播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行を検出するための、血液塗抹標本上での好中球の形態分析工程を含むインビトロの方法である。

【0116】

言い換えれば、この方法は、例えば血液塗抹標本上での形態分析工程をさらに含んでもよい。

【0117】

本発明によれば、このＤＩＣの予測および／または検出方法は、例えば血液塗抹標本上での好中球の形態を、対象または基準となる健康な対象群由来の血液塗抹標本上などで観察された好中球の形態と比較する工程も含んでもよい。

【0118】

本発明によれば、基準となる健康な対象または基準となる健康な対象群は上に定義されたとおりである。

【0119】

本発明によれば、形態分析は血液塗抹標本により実施することができる。本発明によれば、血液塗抹標本は当業者に既知の任意の適切な方法によって得られてもよい。これは例えば、スライド上で行われるメイ・グリュンワルド・ギムザ染色またはライト染色の後に光学顕微鏡を用いた目視観察によって特別な分析を可能にするＳｔｉｅｌ ｅｔ ａｌ．， “Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ： Ａ Ｎｅｗ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．” Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２０１６；Ｎｏｖ；４４（１１）：ｅ１１３２−ｅ１１３６に記載されている方法であってもよい。

【0120】

本発明によれば、好中球の形態の分析または比較工程は、好中球のクロマチン濃縮、好中球の顆粒および好中球の液胞を含む群から選択される少なくとも一つのパラメーターの観察を含んでもよい。

【0121】

本発明によれば、好中球の形態の分析または比較工程は、好中球のクロマチン濃縮、好中球の顆粒および／または好中球の液胞を含む群から選択される少なくとも二つのパラメーターの観察を含んでもよい。

【0122】

本発明によれば、本発明によれば、好中球の形態の分析または比較工程は、好中球のクロマチン濃縮、好中球の顆粒および／または好中球の液胞の観察を含んでもよい。

【0123】

本発明によれば、好中球のクロマチンは濃縮または脱濃縮されてもよい。当業者は、彼らの一般知識により、好中球クロマチンの濃縮または脱濃縮を決定する方法を知っている。

【0124】

本発明によれば、好中球の顆粒の観察は、当該好中球の顆粒の数および／または密度を決定することを含んでもよい。当業者は、彼らの一般知識により、好中球の顆粒の正常な密度および形態的外観を知っている。

【0125】

本発明によれば、液胞の観察は前記塗抹標本上に好中球の小胞が存在するかしないかを決定することを含んでもよい。当業者は、彼らの一般知識により、好中球の液胞が存在するかしないかを決定する方法を知っている。

【0126】

本発明によれば、この方法はまた、生物試料に由来する異常形態などの形態を、健康な対象の好中球の正常な形態と比較し、細胞学的異常スコアを求める工程を含んでもよい。

【0127】

本発明によれば、形態分析は例えば、１〜１０００個、例えば、１〜１００個、の好中球について生物試料によって行われてもよい。例えば、形態分析が血液塗抹標本上で行われた場合、１〜１００個の好中球について行われてもよい。

【0128】

もう一つの本発明の主題は、生物試料から播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）の進行を検出するおよび／またはモニタリングするための、以下の工程をも含む方法である：
−好中球のクロマチン濃縮の観察
−好中球の顆粒の数および／または密度の観察
−好中球の顆粒の観察

【0129】

以下の添付のイラストによる図に示された実施例を読むことで、その他の有利な点は、当業者に明らかになるだろう。

【図面の簡単な説明】

【0130】

【図1】図１は、多核好中球（ＰＮＮ）蛍光の高さ（ＮＥＵＴ−ＦＬ）を表し、有意にＤＩＣと関連している。この結果は赤（ＤＩＣ）および青（非ＤＩＣ）の箱ひげ図で示される。箱の水平方向の線は中央値に対応する。箱の上下限はそれぞれ２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイルに対応し、上下のバーは１０および９０パーセンタイルに対応する。破線は基準値に対応する。統計的分析により、ＤＩＣを有する患者とＤＩＣを有さない患者間での反復測定間の差が表わされる。Ａは、敗血症性ショックの患者１００人におけるＮＥＵＴ−ＦＬである。Ｂは、敗血症性ショックの間のＮＥＵＴ−ＦＬのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線である。Ｃは、敗血症性ショックの患者１００人における好中球数に関連する好中球に基づく微粒子である。

【図2】図２は、ホスファチジルセリン当量として細胞膜微粒子の平均濃度（Ｙ軸）を、ＤＩＣの場合（グレー）およびＤＩＣでない場合（白）の時間の関数として箱ひげ図で表す。破線は正常値を表す。統計的分析により、ＤＩＣを有する対象とＤＩＣを有さない対象間での反復測定間の差が時間の関数として表わされる。図２Ａは、ホスファチジルセリン当量として膜微粒子の平均濃度（Ｙ軸）を、敗血症性ショックの場合（グレー）および敗血症性ショックでない場合（白）の箱ひげ図で表す。示される結果は、全膜微粒子濃度（ホスファチジルセリン微粒子）である。図２Ｂは、循環白血球に関連する白血球由来膜微粒子（ＣＤ１１ａ微粒子）の濃度を表す。図２Ｃは、内皮細胞由来膜微粒子ＣＤ１０５微粒子を表す。図２Ｄは、内皮細胞由来膜微粒子ＣＤ３１微粒子を表す。

【図3】図３は、ＤＩＣの存在（グレー）または不存在（白）の関数として得られた結果の箱ひげ図を表す。破線は正常値を表す。Ｙ軸は、白血球濃度（ｇ／ｌ）、血小板濃度（ｇ／ｌ）、ＣＤ１１ａである膜微粒子の白血球数（ｎＭ／ｇ）に対する割合、プロトロンビンレベル（％）アンチトロンビンレベル（％）、Ｄダイマー濃度（ｍｇ／ｌ）、循環ＣＤ１０５微粒子およびＣＤ３１微粒子の量を表す。Ｘ軸は、測定の状態および日にちを表し、１日目（Ｄ１）、３日目（Ｄ３）である。統計的分析により、ＤＩＣを有する対象とＤＩＣを有さない対象間での反復測定の差が時間の関数として表わされる。

【図4A】図４は、Ａにおいて、ＣＤ１０５微粒子、プロトロンビンレベル、血小板数および予測ＤＩＣスコアのＲＯＣ曲線を表す。

【図4B】図４は、Ｂにおいて、治療オプションについての患者のための決定木を表す。Ｎ＋はＤＩＣの患者数に関連し、Ｎ−はＤＩＣでない患者数である。

【図5】図５は、図４の補足で、Ａにおいて、自動サイトメーターで記録されパラメーターＮＥＵＴ−ＦＬの解析に使用される表示ウインドウを表す。Ｃにおいて、対照者、ＤＩＣを伴うまたは伴わない敗血症の対象における散布図のばらつきを表す。Ｄにおいて、ＭＧＧ染色後の血液塗抹標本上で観察された形態上の変化を表す。

【図6A】図６は、実施例４で記述される実験における、従来のサイトメトリーで得られた結果を表す。図６Ａは、ＤＩＣを伴う敗血症の患者（ＤＩＣ、ｎ＝５）、敗血症でない患者（非敗血症、ｎ＝１１）における、インターカレーターであるＳｙｔｏ４０によってラベリングされた平均好中球蛍光（ＮＥＵＴ−ＦＬ（ＭＦＩ））箱ひげ図、および対応する蛍光ヒストグラム（それぞれＰＮＮ非敗血症、ＰＮＮ ＤＩＣ）を表す。

【図6B】図６Ｂは、全細胞の散布図（ＳＳＣ／ＦＳＣ）および非敗血症対象の血液試料中のＮＥＴｓの検出のための好中球の細胞内および細胞外ラベリング後および外因性の要因（イオノマイシン）によるＮＥＴｏｓｉｓの誘発後に得られた好中球蛍光プロットを表す。研究された二つのＮＥＴｓマーカーはミエロペルオキシダーゼおよびシトルリン化ヒストンＨ３である。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３は、ＳＳＣおよびＦＳＣ散布図においてラベリングに関連する蛍光シグナル（散布図とヒストグラムの色に対応する）により同定される好中球の亜集団を示す。図６ＢＩは、全細胞の散布図（ＳＳＣ／ＦＳＣ）ならびにＮＥＴｏｓｉｓが進行している好中球の表面におけるミエロペルオキシダーゼラベリングの前（Ｔ０）および前記ラベリングの後イオノマイシンとともに３０分培養した後（Ｔ３０）の好中球蛍光プロットを表す。図６ＢＩＩは、全細胞の散布図（ＳＳＣ／ＦＳＣ）ならびにＮＥＴｏｓｉｓが進行している好中球の表面における細胞内ミエロペルオキシダーゼラベリングの前（Ｔ０）および前記ラベリングの後イオノマイシンとともに３０分培養した後（Ｔ３０）の好中球蛍光プロットを表す。

【図6C】図６Ｃは、全細胞の散布図（ＳＳＣ／ＦＳＣ）および非敗血症対象の血液試料中のＮＥＴｓの検出のための好中球の細胞内および細胞外ラベリング後および外因性の要因（イオノマイシン）によるＮＥＴｏｓｉｓの誘発後に得られた好中球蛍光プロットを表す。研究された二つのＮＥＴｓマーカーはミエロペルオキシダーゼおよびシトルリン化ヒストンＨ３である。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３は、ＳＳＣおよびＦＳＣ散布図においてラベリングに関連する蛍光シグナル（散布図とヒストグラムの色に対応する）により同定される好中球の亜集団を示す。図６ＣＩは、全細胞の散布図（ＳＳＣ／ＦＳＣ）ならびにＮＥＴｏｓｉｓが進行している好中球の表面におけるシトルリン化ヒストンラベリングの前（Ｔ０）および前記ラベリングの後イオノマイシンとともに３０分培養した後（Ｔ３０）の好中球蛍光プロットを表す。図６ＣＩＩは、全細胞の散布図（ＳＳＣ／ＦＳＣ）ならびにＮＥＴｏｓｉｓが進行している好中球の表面におけるシトルリン化ヒストンラベリングの前（Ｔ０）および前記ラベリングの後イオノマイシンとともに３０分培養した後（Ｔ３０）の好中球蛍光プロットを表す。

【実施例】

【0131】

実施例１ ＣＤ１０５^＋ＭＰｓ、プロトロンビンレベルおよび血小板数を組み合わせたスコアの利用
概要
目的：敗血症性ショックの患者の層別化は十分でなく、特に抗凝固剤治療において、ランダム化臨床試験（ＲＣＴ）における適切でない治療の割り当てにつながる可能性がある。我々は、内皮由来微粒子ＣＤ１０５が敗血症性ショックにおける播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）に関連のある生物マーカーであることを示す。四つの蘇生ユニット（ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ ｕｎｉｔｓ）における、敗血症性ショックで入院している患者における、有望な、観察による研究である。

【0132】

患者および方法：敗血症性ショックを患う、連続して入院している２５６患者で、ＪＡＡＭ２００６スコアでＤＩＣと診断された。

【0133】

主な結果：２５９患者が分析された。６１人は入院時にＤＩＣであり、（ＤＩＣ−Ｄ１）、３２人が入院後２４時間の間にＤＩＣを発症した（ＤＩＣ−Ｄ２）。いくつかのロジスティック回帰モデルにより内皮細胞由来のＭＰｓはＤＩＣに関連していて、ＣＤ１０５＋ＭＰｓ（ＯＲ２．１３）およびＣＤ３１＋ＭＰｓ（ＯＲ０．６５）（ｐ＜０．０５）であることが確かめられた。加えて、白血球に対するＣＤ１１ａ微粒子の割合が白血球の活性化の証拠である（ＯＲ １．５９、ｐ＜０．０５）。ＤＩＣの予測はまた、ＤＩＣ−Ｄ１の患者を除いて分析された。複数のロジスティック回帰による新たな分析により、ＣＤ１０５ＭＰｓ（＞０．６０ｎＭｅｑ．ＰｈｔｄＳｅｒ、ＯＲ１．６７、ｐ＜０．０１）、血小板数（≦１２７ｇ／ｌ、ＯＲ０．９９、ｐ＜０．０１）およびプロトロンビン時間（≦５８％、ＯＲ０．９８、ｐ＜０．０５）のＤＩＣとの関連が示された。これらのマーカーを組み合わせた入院時におけるスコアにより、ＤＩＣになっていないかが予測される（ＡＵＣ７２．９％、特異度７１．２％、感度７１．０％、陰性適中率９３．１％および陽性適中率３１．０％）。

【0134】

患者および方法
患者
１８〜８５歳の２５０人の患者が含まれた。すべての患者は、入院時に敗血症性ショックの基準に合致した。ＪＡＡＭ２００６^１０スコアに従うと、４０％の患者がＤ１またはＤ２においてＪＡＡＭスコア≧４であることにより定義される初期ＤＩＣである。患者の特性をまとめたものが表１である。またＤＩＣ群での死亡率も高いＤＩＣ患者は、より重
症で、統計的なＳＯＦＡ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ）およびＳＡＰＳ２（Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｏｒｅ）重症度スコアが高かった。血小板数および好中球数は２群間で有意に異なっている。

【0135】

【表1】

【0136】

採血
患者の治療に必要な分析のために、ＤＮＡデコンパクションに関連した全血球算定および蛍光の検出を行うために用いられるＥＤＴＡ採血管（バキュテイナ（商標）、ベクトン
ディッキンソン社、ル・ポン・ド・クレ、フランス）を含む採血管が用いられた。敗血症性ショックの診断の際には１５ミリリットルの血液が採取され、３日目（Ｄ３）および７日目（Ｄ７）にクエン酸入り採血管（０．１０９Ｍ、バキュテイナ（商標）、ベクトンディッキンソン社、ル・ポン・ド・クレ、フランス）およびドライ採血管（ｄｒｙ ｔｕｂｅ）（バキュテイナ（商標）、ベクトンディッキンソン社、ル・ポン・ド・クレ、フランス）に採取された。採血管は速やかに２回、２５００ｇで１５分間遠心分離され血小板を枯渇させた血漿及び血清を得て、試料を速やかに−８０℃で凍結させた。血液試料は、動脈圧の侵襲的なモニタリングおよび患者の状態によって必要とされる複数の血液試料を採取することを目的とした動脈カテーテルを導入した後に採取され、いかなる追加の穿刺も必要としなかった。研究のために追加で採取された血液試料はなかった。最も一般的に用いられている手法は、橈骨動脈を経由したものであった。６人の健康なボランティアから血液試料を末梢静脈より採取した。

【0137】

血球算定および全血球算定
医学データを扱うための普通の院内サーキット（ｃｕｓｔｏｍａｒｙ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｃｉｒｃｕｉｔ）を用いて採血管を血液学研究室に運んだ後に、自動フローサイトメーター（ＸＮ２０、シスメックス（登録商標）株式会社、神戸、日本）を用いて、血球算定および全血球算定を実施した。蛍光チャネルから、および二つの反応剤を用いたラベリングの後に、全血球算定が行われた。シスメックス（登録商標）株式会社の説明によると、第一の反応剤は赤血球細胞を溶解し、白血球膜上を透過してそこで反応する。第二の反応剤は、ポリメチンをベースにした蛍光色素と結合しており、核酸と結合する。これは細胞が固定されたのちに適用される非透過剤である。その後他の白血球は、波長６３３ｎｍにおける側方散乱光および前方散乱光センサーを用いて、その蛍光の関数として同定される。

【0138】

止血
止血評価は、ＳＴＡ−Ｒ（登録商標）Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ自動分析装置（Ｓｔａｇｏ社、アニエール、フランス）において普通の反応剤を用いて実施された。このようにして、プロトロンビンレベル（ＴＰ）、活性化セファリン時間（ＡＣＴ）、第Ｖ因子レベル（ＦＶ）、フィブリノーゲンレベル、Ｄダイマー（ＤＤ）およびアンチトロンビン（ＡＴ）を各患者に対して測定した。

【0139】

ＤＩＣの同定に「ゴールドスタンダード」は存在しない。したがって我々は、ＤＩＣの診断をＪＡＡＭ２００６スコア^１０に従って定義することに決定した。ショック後の最初の４８時間でのＪＡＡＭ（日本救急医学会）スコアが４以上であることにより、初期のＤＩＣと定義した。

【0140】

【表2】

【0141】

微粒子アッセイ：
ストレプトアビジンをコートしたマルチウェルプレート（ロシュ（登録商標）社、フランス）上での、機能性プロトロンビナーゼ試験により、アネキシンＶでの捕捉によりまたは微粒子の表現型検査のための細胞起源に特有の抗体を用いて、ＭＰの凝固促進活性をアッセイした。これを異なるサンプリング時間において実施した。

【0142】

本チームで開発したＭＰｓの機能性アッセイの方法は、マルチウェルプレート上でプロトロンビナーゼ酵素試験を用いる。ストレプトアビジンをコートしたマルチウェルプレートの底で不溶化ビオチン化アネキシンＶでのＭＰｓの捕捉の後にアッセイを実施した。本試験は、アネキシンＶ（ＡＶ）のＭＰｓの表面に発現するホスファチジルセリン（ＰｈｔｄＳｅｒ）への親和性を利用する一方で、ビオチンのストレプトアビジンへの親和性を利用している。ストレプトアビジンは、ウェルの底部と共有結合し、ビオチンしたＡＶがストレプトアビジンに結合する。ＭＰｓの表現型について、ＡＶは、ＭＰｓの細胞起源に特異的な別の標的に特異的な異なるビオチン化モノクローナル抗体（Ａｂ）に置き換わる。したがって我々は、抗ＣＤ１０５抗体（エンドグリン）（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、米国）を内皮起源のＭＰｓの特性付けに使用し、抗ＣＤ１１ａ抗体（Ｌｅｉｎｃｏ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、セントルイス、米国）を白血球起源のＭＰｓの特性付けに使用し、抗ＣＤ６６ｂ −ＣＥＡＣＡＭ８−抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社、フランクリンレイクス、米国）を好中球起源のＭＰｓの特性付けに使用する。健康なボランティアの基準は、以前の研究の過程で確立された（Ｓｔｉｅｌ ｅｔ ａｌ： “Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ： Ａ Ｎｅｗ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ
Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｓｅｐｔｉｃ Ｓｈｏｃｋ−Ｉｎｄ
ｕｃｅｄ Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．”Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ． ２０１６；４４（１１）：ｅ１１３２−ｅ１１３６）。

【0143】

微粒子を含む血漿試料（１００μｌ／ｗｅｌｌ）を次いでウェルに二重に配置し、３７℃で３０分間培養した。ウェルの底部でのＭＰｓを捕捉、入念な洗浄の後、プロトロンビナーゼ酵素反応を実施した。ＭＰｓに固定されたホスファチジルセリンが、トロンビンのプロトロンビンへの変異を制限する要因となるように、カルシウムおよび添加した凝固因子ＩＩ、ＶａおよびＸａを決定した。発色基板の溶解作用により、生成したトロンビン量が明らかになった（ｐＮＡＰＥＰ０２１６、１．５２ｍＭ、Ｃｒｙｏｐｅｐ、モンペリエ、フランス）。４０５ｎｍで、分光光度計（ＶｅｒｓａＭａｘ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール、カリフォルニア、米国）を用いて吸収を測定した。測定した吸収値は、ＭＰｓが露出するＰｈｔｄＳｅｒの量に比例する。結果は、既知の量のＰｈｔｄＳｅｒをもつ合成小胞について作成される検量線を参照してナノモル当量のホスファチジルセリン（ｎＭｅｑ．ＰｈｔｄＳｅｒ）として表わされる。

【0144】

統計
変数は頻度として記述され、χ二乗検定またはＦｉｓｈｅｒの正確検定によって比較された。繰り返し測定はクラスカル−ウォリス検定を用いて平均値および標準偏差として定量データが与えられた。繰り返し測定は繰り返し測定ＡＮＯＶＡまたは混合線形モデルによって分析された。ｔ検定とボンフェローニ補正をもちいて事後分析を実施した。この分析を実施する前に、変数は正規性について評価され、正規分布でない変数は対数変換、平方根変換、逆変換、または指数変換のいずれかを用いて変換された。ＤＩＣの発生を説明するために、ロジスティック回帰のいくつかのモデルが使用された。すべての統計分析はＲバージョン３．１．３ソフトウェア（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１２）、Ｒ：統計計算のための言語および環境、Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、ウイーン、オーストリア）を用いて行われた。ｐ＜０．０５の場合統計的に有意であるとみなされる。

【0145】

主な結果：２５９患者が分析された。６１人は入院時にＤＩＣであり、（ＤＩＣ−Ｄ１）、３２人が入院後２４時間の間にＤＩＣを発症した（ＤＩＣ−Ｄ２）。いくつかのロジスティック回帰モデルにより内皮細胞由来のＭＰｓはＤＩＣに関連していて、ＣＤ１０５＋ＭＰｓ（ＯＲ ２．１３）およびＣＤ３１＋ＭＰｓ（ＯＲ ０．６５）（ｐ＜０．０５）であることが確かめられた。加えて、白血球に対するＣＤ１１ａ微粒子の割合が白血球の活性化の証拠である（ＯＲ１．５９、ｐ＜０．０５）。ＤＩＣの予測はまた、ＤＩＣ−Ｄ１の患者を除いた後、分析された。複数のロジスティック回帰による新たな分析により、ＣＤ１０５ＭＰｓ（＞０．６０ｎＭｅｑ．ＰｈｔｄＳｅｒ、ＯＲ１．６７、ｐ＜０．０１）、血小板数（≦１２７ｇ／ｌ、ＯＲ０．９９、ｐ＜０．０１）およびプロトロンビン時間（≦５８％、ＯＲ０．９８、ｐ＜０．０５）のＤＩＣとの関連が示された。これらのマーカーを組み合わせた入院時におけるスコアにより、ＤＩＣを伴わないことが予測される（ＡＵＣ７２．９％、特異度７１．２％、感度７１．０％、陰性適中率９３．１％および陽性適中率３１．０％）。

【0146】

詳細な結果
入院中の患者を分析するために、Ｄ２におけるＤＩＣを評価するために（ＤＩＣ−Ｄ２）、ＤＩＣ−Ｄ１の患者を除外した。これらの８８患者を分析した。血小板数およびプロトロンビンレベルは、ＤＩＣを伴わない患者と比べてＤＩＣ−Ｄ２患者では有意に低かった。アンチトロンビンおよびＤダイマーについては、差はなかった。Ｄ２およびＤ３において、血小板数、プロトロンビンレベルおよびアンチトロンビンは、ＤＩＣ−Ｄ２患者のＤ１より低く、Ｄダイマーでは有意に高かった（ｐ＜０．０５）。これらのパラメーター
はすべてＤＩＣを伴わない患者において有意に差があり（ｐ＜０．０５）、３つのパラメーター全てで大きく増加した。注目すべきはＩＳＴＨの「ｏｖｅｒｔ」スコアおよびＩＳＴＨの「ｎｏｎ−ｏｖｅｒｔ」スコアではＤＩＣは予測できないということである。

【0147】

微粒子、ＤＩＣの初期マーカー
合計の微粒子（ＭＰｓ）の循環レベルは、敗血症性ショックの患者において高い。細胞活性化によりＤＩＣが進行し、Ｄ２におけるＤＩＣの診断を改善するために患者の蘇生が認められるポイントから、我々は内皮微粒子および白血球の活性化を分析した。

【0148】

ＣＤ１０５＋ＭＰｓ（ｐ＝０．０９）およびＣＤ１１ａ＋ＭＰｓ／白血球（ｐ＝０．１８）は、ＤＩＣ−Ｄ２と関連があり、一方でＣＤ３１＋ＭＰｓではそうではなかった。

【0149】

Ｄ１において評価されたＤＩＣの生物学的指標として実施された単変量解析は、ルーチンの微粒子試験を含み、４つのパラメーター、ＣＤ１０５＋ＭＰｓ、血小板数、プロトロンビンレベルおよび好中球蛍光（ＮＥＵＴ−ＦＬ）が、ｐ＜０．２０であることを明らかにした。ＣＤ１０５ＭＰｓ、プロトロンビンレベルおよび血小板数は、多重ロジスティック回帰において有意にＤＩＣと関連があった。

【0150】

各パラメーターの個別の動きは、それらを組み合わせることで非常に大きくなる。予測方程式は１．３４２＋（０．５１５×［ＣＤ１０５^＋ＭＰｓ］）−（０．０１２×［Ｐｌｔ］）−（０．０１８×［ＰＴ］）と記述され、単位は［ＣＤ１０５^＋ＭＰｓ］が ｎＭ
ｅｑ． ＰｔｄＳｅｒ、［Ｐｌｔ］がｇ／ｌ、［ＰＴ］がパーセント（％）である。

【0151】

曲線下面積は７２．９％であり、９５％ＣＩ［６６．２〜７８．９］（ｐ＜０．００１）であった。閾値、つまりカットオフ値は−１．２３１であり、特異度７１．２％［６３．７〜７７．９］、感度７１．０％［５２．０〜８５．８］、陰性的中率９３．１％［７２．５〜９９．６］および陽性的中率３１．０％［７．９〜６４．５］であった。

【0152】

我々のコホートでは、２５９患者は初期の臨床試験において確立された特定の抗凝固治療のために入院できたかもしれない。ＪＡＡＭによれば、６１人は入院時にＤＩＣがあり、速やかに入院したかもしれない。日常的なＪＡＡＭスコアの算出により、２日目における残りの１９８患者のうち抗凝固治療がふさわしい３１患者をＤＩＣと診断することが可能になるだろう。我々の予測スコアの使用により、１２５患者はＤＩＣのリスクが非常に低いと考えることができ、抗凝固治療を受けずに済んだ。わずか８人（６．５％）が、２日目にＪＡＡＭによって認識されたであろうＤＩＰを発症するだろう。

【0153】

微粒子、ＤＩＣの初期マーカー
合計の微粒子（ＭＰｓ）の循環レベルは、敗血症性ショックの患者において高い。ＤＩＣ群と非ＤＩＣ群で測定されたＭＰｓに量的な違いはない。しかしながら、ＤＩＣを伴う患者は、血漿微粒子の表現型という点で違いを生じる。ＤＩＣを伴う患者において、ＤＩＣを発症していない患者と比較して内皮ＣＤ１０５ＭＰｓの量はとても増加した（ｐ＜０．０１）。この違いは、Ｄ１から表れて、Ｄ７まで続いた。白血球ＣＤ１１ａ ＭＰｓは、白血球の活性化を反映するもので、Ｄ１からＤ７までＤＩＣを伴う患者において有意に高かった。同様に、白血球ＣＤ１１ａＭＰｓ／白血球の割合は、ＤＩＣを発症した患者において高かった（ｐ＜０．０５）。この違いは、Ｄ１から表れて、続いた（図１Ｃ）。同様に、ＤＩＣを伴う患者において、好中球ＣＤ６６ｂＭＰｓの有意な増加があった。ＭＰｓ−ＣＤ６６ｂ／好中球の割合は、敗血症性ショックの患者において増加し、２群間での差が観察された（ｐ＜０．０１）

【0154】

【表3】

【0155】

【表4】

【0156】

実施例２ 好中球蛍光、プロトロンビンレベル血小板数およびＣＤ１０５ＭＰ微粒子を組み合わせたスコアの例
患者
集中治療室への入院時に敗血症性ショックの基準に該当した、成人年齢の１５０人の患者が、本研究に含まれた。末期の慢性疾患を患う患者および好中球減少症を患う患者は本研究から除外された。ＪＡＡＭスコアに従うことにより、３５％の患者にＤＩＣが見られた。敗血症性ショックにより誘発された初期のＤＩＣを伴う患者は、より重症で、統計的なＳＯＦＡ（Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｏｒｇａｎ Ｆａｉｌｕｒｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｓｃｏｒｅ）およびＳＡＰＳ２（Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｓｃｏｒｅ）重症度スコアが高く、またＤＩＣ群において死亡率も高かった（表５）。白血球および好中球数は、ＤＩＣを伴う患者において有意に低く、ヘモグロビン数およびナトリウムレベルは変化なしであり、したがって血漿希釈効果は除外された。

【0157】

採血
表１に表した試料に加え、患者の治療に必要な分析のために、ＤＮＡデコンパクションに関連した全血球算定および蛍光の検出を行うために用いられるＥＤＴＡ採血管（バキュテイナ（商標）、ベクトンディッキンソン社、ル・ポン・ド・クレ、フランス）を含む採血管が用いられ、ＤＮＡデコンパクションに関連する蛍光の検出のために用いられた。検証過程を通じて我々は、健康なボランティアから得た試料から、濃度４μＭのイオノマイシン（カルビオケム、メルクバイオディベロップメント社、マルティヤック、フランス）により刺激された好中球の生体外活性化を分析した。

【0158】

血球算定および全血球算定
二重鎖への近づきやすさ（未熟細胞、細胞活性化など）を示す、ＤＮＡインターカレーターによるラベリングの強度をＮＥＵＴ−ＦＬとして同定した。ＮＥＵＴ−ＦＬパラメーターの基準は、１３００回の評価、つまりストラスブールＣＨＵ（大学病院）の成人の外科的および内科的専門分野をすべて集めた２か所の病院にて２４時間生物学的評価をうけているすべての成人患者により確立された。

【0159】

細胞の形態分析
患者について血液塗抹標本が作製され、ＥＤＴＡ（７．２ｍｇ／４ｍｌ）／クエン酸（０．１２９Ｍ）採血管に採取され、その後メイ・グリュンワルド・ギムザ染色を行った。健康なボランティアのサンプルも、末梢静脈より採取させてもらった血液試料から、作製された。

【0160】

統計：
カテゴリー（または質的）変数は、Ｆｉｓｈｅｒの正確検定により分析し、連続型変数は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの符号付き順位検定により分析した。分布の正規性は、シャピロ・ウィルク（Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋ）検定により分析した。Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ−Ｈｏｌｍ法を用いて、多重比較における調整済ｐ値を得た。曲線下の受信者動作特性（ＲＯＣ）を分析し、Ｓｐｅａｒｍａｎの相関係数を決定した。ｐ値が０．０５より小さい場合、統計的に有意と考えられる。すべての統計分析はＲバージョン３．１．３ソフトウェア（Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ（２０１２）、Ｒ：統計的計算のための言語および環境、Ｒ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、ウイーン、オーストリア ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／）によって行った。非対称変数は、グラフパッドプリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）（登録商標）ソフトウェア、バージョン６（ラホヤ、カリフォルニア、米国）に基づいて四分位点付きの中央値の形式で表わされる。

【0161】

結果：
白血球数
白血球および好中球数は、ＤＩＣを伴う患者において有意に低かった。好中球蛍光は、敗血症性ショックの患者すべてにおいて増加した（ｐ＜０．０１）。

【0162】

好中球の細胞形態学
検討された患者において、ＤＩＣを、図５Ｄに示されるようなメイ・グリュンワルド・ギムザ染色による血液塗抹標本で観察される好中球の形態変化と関連づけることが可能であることが観察された。実際、好中球中の核の粒度の減少および分葉の減少が特に観察された。これらの変化は、細胞学的スコアによって、採血の後３日間にわたってその値とＤＩＣの間に正のおよび有意な相関（ｐ＜０．０５）を得ることを目的として、定量化されてもよい。

【0163】

白血球蛍光
Ｄ１またはＤ２においてＪＡＡＭスコア≧４で定義される初期ＤＩＣを伴う患者において、任意の単位（ＡＵ）で測定される多核好中球（ＰＮＮ）の平均蛍光は、ＤＩＣを伴わない患者と比較して有意に増加し、その差は有意であり（ｐ＜０．０１）、７０．０［６６．４〜８１．８］に対して５０．７［４６．３〜５３．８］ＡＵ、ｐ＜０．０５、健康なボランティアによる我々の研究室で得られた正常値は４４．８［４３．５〜４６．９］ＡＵ、ｐ＜０．０５、およびＣＨＵの成人患者１３４０人、つまり２４時間にわたる血球算定を受けたすべての患者、について測定された平均値は４６．８０［４２．７〜５０．４］ＡＵであった。ＲＯＣ曲線が得られ、カットオフ値５７．３ＡＵ、それ以上の蛍光の増加によりＤＩＣが感度９０．９％、特異度８０．６％で予測される、でＤＩＣの診断に対して曲線下面積は０．８８２（ｐ＜０．０００１）であった。

【0164】

Ｄ１において評価されたＤＩＣの生物学的指標として実施された単変量解析は、ルーチンの微粒子試験を含み、４つのパラメーター、ＣＤ１０５^＋ＭＰｓ、血小板数、プロトロンビンレベルおよび好中球蛍光（ＮＥＵＴ−ＦＬ）、がｐ＜０．２０であることを明らかにした。

【0165】

【表5】

【0166】

Ｄ１および上記の単変量解析中の適格者（ｐ＜０．２０）において測定された生物学的パラメーターについて実施した多変量解析を表６に記載する。

【0167】

【表6】

【0168】

以下の式による予測スコアＳ_１を算出する方法の適用
Ｓ_１＝０．７８６＋１．０４０^＊Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}＋０．８５１^＊Ｖ_{ＣＤ１０５}＋（−０．０１０^＊Ｖ_Ｐｌｔ）＋（−０．０１７^＊Ｖ_ＴＰ）

【0169】

式中、値Ｖｎｅｕｔｆｌは、血漿試料中の好中球蛍光が５７ＡＵより大きい場合１、好中球蛍光が５７ＡＵ以下の場合０、Ｖ_{ＣＤ１０５}値は、ＣＤ１０５^＋ＭＰｓ濃度が０．６５ｎＭｅｑより大きい場合１、ＰＳまたはＶ_{ＣＤ１０５}値は、ＣＤ１０５^＋ＭＰｓ濃度が０．６５ｎＭｅｑより小さい場合０であった。ＰＳ、Ｖ_Ｐｌｔ値は、血小板濃度が１２７ｇ／ｌより小さい場合１、血小板濃度が１２７ｇ／ｌより大きい場合０、Ｖ_ＴＰ値は、プロトロンビンレベルが５８．５％より小さい場合１、プロトロンビンレベルが５８．５％より大きい場合０であった。

【0170】

Ｓ値が−０．４７より大きい場合、ＤＩＣおよび／またはＤＩＣの発症を示す。

【0171】

本方法はまた、以下の予測スコアを用いて実施された。
Ｓ_１＝ε＋Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}×α＋Ｖ_{ＣＤ１０５}×β＋Ｖ_{ｐｌａｔｅｌｅｔｓ}×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは−０．７０８〜２．２８０、αは０．１５２〜１．９２８、βは０．１５４〜１．５４９、Ωは−０．０１６〜−０．００５、およびθは−０．０３６〜０．００１であった。

【0172】

このスコアは、異なる係数の９５％信頼区間に基づいて生成され、ＤＩＣの存在および／またはＤＩＣの発症を決定することができる。

【0173】

実施例３ 好中球蛍光、プロトロンビンレベルおよび血小板数を組み合わせたスコアの例
この実施例において、ＤＩＣを検出する／予測するためのアルゴリズムは、上述の実施例２で得られた臨床データから決定した。

【0174】

このアルゴリズムの構築は、実施例２からの患者のコホートにおいて初期ＤＩＣのロジスティック回帰モデル、ｐ≦０．２０で初期ＤＩＣの発生に有意に関連する変数についての単変量解析、その後多変量解析、により実施された。

【0175】

これに関連して、各患者は、実施例２に記述される方法に従って算出された好中球蛍光、プロトロンビンレベルおよび血小板数についての測定値により特徴づけされた。

【0176】

以下の式による予測スコアＳ_２を算出する方法の適用
Ｓ_２＝１．７２６＋１．０６０^＊Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}＋（−０．０１０^＊Ｖ_Ｐｌｔ）＋（−０．０２２^＊Ｖ_ＴＰ）
式中、値Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}は、血漿試料中の好中球蛍光が５７ＡＵより大きい場合１、好中球蛍光が５７ＡＵ以下の場合０、Ｖ_Ｐｌｔ値は、血小板濃度が１２７ｇ／ｌより小さい場合１、血小板濃度が１２７ｇ／ｌより大きい場合０、Ｖ_ＴＰ値は、プロトロンビンレベルが５８．５％より小さい場合１、プロトロンビンレベルが５８．５％より大きい場合０であった。

【0177】

Ｓ値が０．１６より大きい場合、ＤＩＣおよび／またはＤＩＣの発症を示す。

【0178】

本方法はまた、以下のＳ_２予測スコアを用いて実施された。
Ｓ_２＝ε＋Ｖ_{ｎｅｕｔｆｌ}×α＋Ｖ_Ｐｌｔ×Ω＋Ｖ_ＴＰ×θ
式中、εは０．３８１〜３．０７０、αは０．２０９〜１．９１０、Ωは−０．０１５〜−０．００５、およびθは−０．０４０〜−０．００４であった。

【0179】

このスコアは、異なる係数の９５％信頼区間に基づいて生成され、ＤＩＣの存在および／またはＤＩＣの発症を決定することができる。

【0180】

実施例４ フローサイトメトリーを用いた、好中球蛍光に関連するＮＥＴマーカーの同定
概要：
蛍光性好中球は、上記実施例２で記述された方法に似ているラベリング法を用いた従来のフローサイトメトリー法によって同定された。血中好中球は、蛍光性抗白血球（ｐａｎ−白血球マーカー、ＣＤ４５）抗体、抗多核好酸球（ＣＤ４９ｄ）抗体および単球（ＣＤ１４）抗体の組み合わせを用いて同定された。赤血球溶解の後に、核へのインターカレーターを用いたラベリングが実施された。ラベリングの後５分間取得することによって、ＤＩＣを伴う患者の血液試料において、敗血症を伴わない患者と比べて大きな蛍光を伴った好中球の集団を明らかにすることができた（図６Ａ）。

【0181】

目的：
有意な蛍光を持つ好中球の集団の存在を、ＮＥＴｏｓｉｓ、これは例えばＤＩＣに関連してもよい、を意味するＮＥＴｓの存在と比較する。イオノマイシンの添加（４μＭ、３７℃で３０分）によってＮＥＴｏｓｉｓが引き起こされている、敗血症を伴わない患者の血液試料、または２つのＮＥＴｓマーカー、シトルリン化ヒストンＨ３およびミエロペルオキシダーゼ活性を評価する敗血症の患者の血液試料が従来のフローサイトメトリーにより検討された。細胞表面および細胞内表面へアクセス可能な抗原の存在を示す細胞外ラベリングが、透過処理の後に実施された。

【0182】

材料および方法を以下に詳述する。
採血：血液試料を、抗凝固剤としてカルシウムヘパリナート（ｃａｌｃｉｕｍ ｈｅｐａｒｉｎａｔｅ）を用いた採血管に採取した。イオノマイシン（４μＭ）による敗血症を伴わない患者の試料への刺激および通常の全血球算定が３７℃で３０分間、最終カルシウム濃度２ｍＭで実施された。この目的のために、３．２μｌのイオノマイシン溶液が５０μｌの血液試料中に導入された。イオノマイシンはその後低速遠心分離、すなわち５４０×ｇで５分間、で除去された。

【0183】

強く蛍光する好中球の同定：血液試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に１回希釈し、その後Ｂｉｏｃｙｔｅｘから入手した蛍光性ｐａｎ−白血球抗体（ＣＤ４５−ＦＩＴＣ）、抗多核好酸球（ＣＤ４９ｄ−ＰＥ）抗体および抗ＣＤ１４−ＡＰＣ単球抗体の組み合わせとともに５分間培養し、その後赤血球溶解（ｓｌｏｗ ｌｙｓｉｓ， Ｂｉｏｃｙｔｅｘ
）した。従来のサイトメーター（ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ、ベクトンディッキンソン社）において、サンプル取得の５分前に核へのインターカレーター（ＳＹＴＯ４０、１．３３ｍＭ、またはＳＹＴＯ ＲＮＡ Ｓｅｌｅｃｔ、１３３．５μＭ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）を次いで添加した。

【0184】

好中球に関連するＮＥＴｓの同定：イオノマイシンにより刺激されたまたは刺激されていない白血球を環境温度で２０分間、抗体の組み合わせ（ｐａｎ−白血球抗ＣＤ４５クローンＨ１３０（Ｖ５００、クローンＨ１３０、ＢＤバイオサイエンス社）、抗好中球抗ＣＤ１６クローン３Ｇ８（ＢＶ４２１、ＢＤバイオサイエンス社）、抗ＭＰＯ（クローン５Ｂ８、ＢＤバイオサイエンス社）および抗シトルリン化ヒストン（ポリクローナル抗体ａｂ５１０３、アブカム社））とともに培養することにより標識化した。この目的のために、５０μｌの血液試料を上記の抗体とともに培養した。透過処理（ＢＤ Ｆａｃｓ １０倍希釈透過溶液、ＢＤバイオサイエンス社）の後に細胞内標識化が実施された。すべての抗体を、周辺温度、すなわち２０℃で、２０分間暗所で培養した。０．５％のＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＰＢＳ緩衝液で洗浄した後、Ａｌｅｘａ７００（Ａ２１０３８、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｃｈｅｒ社）とコンジュゲートした二次ウサギ抗ＩｇＧ抗体を、周辺温度、すなわち２０℃で、２０分間暗所で培養し、抗ヒストン免疫グロブリンの二次標識化を完了した。０．５％のＦＣＳを含むＰＢＳ緩衝液で洗浄した後に、従来のサイトメーター（ベクトンディッキンソン社）において、サンプル取得した。

【0185】

主な結果：図６Ａに示されるように、ＤＩＣが存在する場合、任意の単位で表わされる平均好中球蛍光は、従来のサイトメトリーを用いた敗血症を患っていない対象の値より有意に高かった（ｐ＜０．０１）。抗シトルリン化ヒストン抗体（それぞれ図６ＣＩおよびＩＩ）および抗ミエロペルオキシダーゼ（それぞれ図６ＢＩおよびＩＩ）による細胞外および細胞内標識化により、（ｉ）ＮＥＴｏｓｉｓはより大きな好中球の出現に影響される、（ｉｉ）抗シトルリン化ヒストン抗体による細胞外標識化の後に平均蛍光は増加し、一方で細胞内標識化では減少する、（ｉｉｉ）対称的に、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体による細胞外標識化の後の平均蛍光はサイズの大きい好中球の群においてより大きく、一方で平均細胞内蛍光は減少することが明らかになった。

【0186】

これらの測定により、従来のフローサイトメトリーにより、ＤＩＣ患者の試料において増加した好中球蛍光を同定することができることが明らかに実証される。加えて、この実施例により、従来のフローサイトメトリーにより、例えば核酸を挿入するためのプローブなどを用いて好中球蛍光を同定できること、また例えば外因性の要因（イオノマイシン）などにより引き起こされるまたはシトルリン化ヒストンおよびミエロペルオキシダーゼを好中球の群に標識化したＤＩＣ患者の血液試料にあるＮＥＴｏｓｉｓの存在を同定することができることが明らかに実証される。

【0187】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】