特許 6985150 新規抗感染症化合物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6985150

(24)【登録日】2021年11月29日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】新規抗感染症化合物

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/56 20060101AFI20211213BHJP

   C07K 5/03 20060101ALI20211213BHJP

   C12P 21/04 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20211213BHJP

   A23L 33/135 20160101ALN20211213BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20211213BHJP

【ＦＩ】

   C07K7/56ZNA

   C07K5/03

   C12P21/04

   A61K38/12

   A61P31/04

   !A23L33/135

   !C12N1/21

【請求項の数】33

【全頁数】44

(21)【出願番号】特願2017-549649(P2017-549649)

(86)(22)【出願日】2016年3月23日

(65)【公表番号】特表2018-510873(P2018-510873A)

(43)【公表日】2018年4月19日

(86)【国際出願番号】EP2016056358

(87)【国際公開番号】WO2016151005

(87)【国際公開日】20160929

【審査請求日】2019年1月7日

(31)【優先権主張番号】15160285.1

(32)【優先日】2015年3月23日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】513008971

【氏名又は名称】エバーハルト カール ウニヴェルジテート テュービンゲン

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】クリスマー，ベルンハルト

(72)【発明者】

【氏名】ペシェル，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】グロント，シュテファニー

(72)【発明者】

【氏名】ツィペラー，アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】コーナート，マルティン クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ヤネク，ダニエラ

(72)【発明者】

【氏名】カルバヘール，フーベルト

(72)【発明者】

【氏名】シリング，ナディーネ アンナ

【審査官】 田中 晴絵

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５２５５１２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００６／０７３１３３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｐ２１／００−２１／０４

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

化学式：

【化1】

（式中、−Ｘは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

【化6】

【化7】

【化8】

【化9】

および

【化10】

からなる群より選択され、少なくとも１つのＸは、

【化11】

および／または

【化12】

であり；
−Ｙは、Ｏ、ＳおよびＮからなる群から選択され、
−ｍは、０〜３（両端を含む）の整数であり；
−ｎは、０〜４（両端を含む）の整数である）の化合物、その塩、その溶媒和物ならびにその塩の溶媒和物。

【請求項2】

下記の化学式：

【化13】

（式中、−Ｘは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、アントラニルアラニン、ＤＯＰＡ、チロシン、トレオニン、

【化14】

【化15】

【化16】

【化17】

および

【化18】

からなる群より選択され、少なくとも１つのＸは、

【化19】

および／または

【化20】

である）で示されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

下記の化学式：

【化21】

（式中、Ｙは、

【化22】

【化23】

および

【化24】

からなる群より選択される）で示されることを特徴とする、請求項１または２に記載の化合物。

【請求項4】

下記の化学式：

【化25】

で示されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項5】

下記の化学式：

【化26】

で示される化合物、その塩、その溶媒和物ならびにその塩の溶媒和物。

【請求項6】

下記の化学式：

【化27】

で示される化合物、その塩、その溶媒和物ならびにその溶媒和物の塩。

【請求項7】

疾患の治療用および／または予防用の請求項１〜６のいずれか1項に記載の化合物。

【請求項8】

感染症の治療用および／または予防用の請求項１〜７のいずれか1項に記載の化合物。

【請求項9】

細菌性疾患の治療用および／または予防用の請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項10】

グラム陽性細菌による感染症の治療用および／または予防用の請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項11】

メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる感染症の治療用および／または予防用の請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。

【請求項12】

疾患の治療用および／または予防用の医薬組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の化合物の使用。

【請求項13】

感染症の治療用および／または予防用の医薬組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の化合物の使用。

【請求項14】

細菌性疾患の治療用および／または予防用の医薬組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の化合物の使用。

【請求項15】

グラム陽性細菌による感染症の治療用および／または予防用の医薬組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の化合物の使用。

【請求項16】

メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる感染症の治療用および／または予防用の医薬組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか1項に記載の化合物の使用。

【請求項17】

請求項１〜１１のいずれか1項に記載の化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項18】

疾患の治療用および／または予防用の請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

感染症の治療用および／または予防用の請求項１８に記載の医薬組成物。

【請求項20】

細菌性疾患の治療用および／または予防用の請求項１９に記載の医薬組成物。

【請求項21】

グラム陽性細菌による感染症の治療用および／または予防用の請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる感染症の治療用および／または予防用の請求項２１に記載の医薬組成物。

【請求項23】

請求項４に記載の化合物を製造する方法であって、
１．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ菌種の細菌を提供する工程、および
２．前記細菌から請求項４に記載の化合物を精製する工程
を含む方法。

【請求項24】

工程（１）の後かつ工程（２）の前に、前記細菌および前記細菌の培養液を抽出処理に供し、前記細菌からの抽出物および前記培養液からの抽出物を工程（２）に供して、これらの抽出物から前記化合物を精製することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

工程（２）の精製が、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、前記化合物に関連するシグナルピークを確認することを含む、請求項２３または２４に記載の方法。

【請求項26】

前記シグナルピークが、６５０Ｄａ〜９５０Ｄａの分子量に対応することを特徴とする、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記シグナルピークが、７００Ｄａ〜８５０Ｄａの分子量に対応することを特徴とする、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記シグナルピークが、７５０Ｄａ〜８００Ｄａの分子量に対応することを特徴とする、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記シグナルピークが、７７０Ｄａ〜７９０Ｄａの分子量に対応することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記シグナルピークが、７８２．５Ｄａの分子量に対応することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

請求項４に記載の化合物を製造する方法であって、
１．生体系（ただしヒトを除く）においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ菌種の非リボソームペプチド合成酵素系ＩＩ（ＮＲＰＳ−ＩＩ）を発現させる工程、
２．発現させたＮＲＰＳ−ＩＩを、請求項４に記載の化合物の合成が可能な条件下でインキュベートする工程、および
３．前記化合物を精製する工程
を含む方法。

【請求項32】

前記ＮＲＰＳ−ＩＩが、遺伝子ｌｕｇＡ、ｌｕｇＢ、ｌｕｇＣおよびｌｕｇＤのコード配列と、任意で、ＧｎｔＲファミリー転写制御因子、ＡＢＣトランスポーター（ＧｄｍＦ型の多剤輸送システム）、ＡＢＣ−２型輸送システムの透過酵素タンパク質、ＡＢＣトランスポーター、仮定上の膜蛋白質、ＴｅｔＲ／ＡｃｒＲファミリー制御因子、チオエステラーゼファミリータンパク質、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよび（バチルス属菌の）ｓｉｇＹの推定上の負の制御因子のコード配列のいずれかを含む核酸分子でコードされていることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記条件が、アミノ酸、チオエステラーゼおよび緩衝液を含むことを特徴とする、請求項３１または３２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規の抗感染症化合物；疾患、好ましくは感染症の治療用および／または予防用の医薬組成物の製造のための前記化合物の使用；前記化合物を含む医薬組成物；ならびに前記化合物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

感染症の制御および治療は、現代社会の最大の課題の一つである。世界全体で毎日４０，０００人近い男女や子供が感染症で死亡している。

【0003】

感染性因子の中でも病原性細菌は、これまで以上に重要視されている。細菌感染症の治療の選択肢として、細菌の死滅またはその増殖の阻止を目的とする抗生物質の使用が可能である。しかし、抗生物質に対する耐性という問題が、病原性細菌の種類が増え続けている状況において、細菌感染の予防および治療を脅かす存在になっている。抗生物質に対する耐性は、世界中のあらゆる地域でみられ、世界の公衆衛生にとってますます深刻な脅威となっており、科学や社会のあらゆる分野で措置を講じることが求められている。

【0004】

抗生物質に対する耐性は、例えば、尿路感染症、肺炎、血液感染症などの世界中のあらゆる地域で共通して見られる感染症の起因菌において高い割合で発生している。院内感染症の起因菌の中で、高い割合を占めているのは、いわゆるメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）である。ＭＲＳＡは、ヒトにおいて、治療が困難な種々の感染症を引き起こす細菌である。ＭＲＳＡは、オキサシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＯＲＳＡ）とも呼ばれる。ＭＲＳＡは、自然淘汰の過程で、メチシリン、ジクロキサシリン、ナフシリン、オキサシリンなどのペニシリン系抗生物質やセファロスポリン系抗生物質を含むβ−ラクタム系抗生物質に対して耐性化したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓの任意の菌株である。ＭＲＳＡは、病院、刑務所や介護施設においては特に厄介であり、その理由として、開放創、侵襲性装置の装着や免疫機能の低下を伴う患者は、一般の人よりも院内感染のリスクが高いということが挙げられる。ＭＲＳＡは、院内感染型として始まったが、その後、限られた地域で流行するようになり、現在では市中感染型が増えてきている。

【0005】

ＭＲＳＡに関しては、予防策に加えて、新規治療法に対する研究も鋭意進められている。ヘンリー・フォード病院で実施された試験によれば、現在、ＭＲＳＡ治療の第一選択薬はバンコマイシンであると考えられる。しかし、新たに発見されたＭＲＳＡの菌株の中には、バンコマイシンにも耐性を示す菌（例えばバイコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ））や、ＭＲＳＡを治療するために新たに開発された別の抗生物質に耐性を示す菌も存在する。

【0006】

特許文献ＤＥ １０ ２００５ ０５５ ９４４には、抗菌剤としての使用を意図した環状のイミノペプチド誘導体が開示されている。しかし、この公知化合物の実際の臨床における有効性は証明されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

このような背景から、本発明の基礎となる目的は、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）、バイコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）など、現在利用可能な薬剤に耐性を示す感染性因子の治療に有効な新規の抗感染症化合物を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0008】

この目的は、下記の化学式（Ｉ）：

【化1】

（式中、−Ｘは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、アントラニルアラニン、ＤＯＰＡ、チロシン、トレオニン、

【化2】

【化3】

【化4】

【化5】

および

【化6】

からなる群より選択され、少なくとも１つ、好ましくは最大２つもしくは３つのＸは、

【化7】

および／または

【化8】

であり；
−Ｙは、Ｏ、Ｈ、ＯＨ、ＳおよびＮからなる群から選択され、

【化9】

において、
------------は、結合なし、単結合または二重結合を示し、
------------は、単結合または二重結合を示し；
−ｍは、０と３との間の整数であり；
−ｎは、０と４との間の整数である）の化合物、その塩、その溶媒和物ならびにその塩の溶媒和物の提供により達成される。

【0009】

本発明者らは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓという細菌から、化学式（Ｉ）の範囲に含まれる、ある環状ペプチドを単離することに成功した。この環状ペプチドは、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを含む様々な病原性細菌に対して強い活性を示す。本発明者らは、さらに研究を進めて、化学式（Ｉ）で示されるコア構造が、単離した化合物の抗菌活性に関与することを確認した。

【0010】

前記新規化合物は、環状構造内に５〜９個のアミノ酸を含む。この「大員環」に含まれるアミノ酸は、疎水性芳香族アミノ酸が好ましく、少なくとも１つのアミノ酸はトリプトファンまたはフェニルアラニンである必要があり、一実施形態においては、好ましくは最大２つ、３つ、４つなどの複数のアミノ酸がトリプトファンまたはフェニルアラニンである。好ましくは、２個以下の芳香族アミノ酸が含まれている。

【0011】

前記新規化合物は、さらに「小員環」、すなわちチアゾリジン環、オキサゾリジン環またはイミダゾリジン環などの５員環、６員環または７員環の複素環を含んでいてもよい。この小員環は、二重結合を有する必要はないが、破線と下線の組み合わせで示されるように、単結合または二重結合を有していてもよい。また、破線で示されるように、環構造を有さず、「小員環」が開環した状態であってもよい。

【0012】

本発明の化合物には、その個々の構造によって、立体異性体（エナンチオマー、ジアステレオマー）が存在する場合がある。したがって、本発明は、このようなエナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらの混合物も包含する。そのようなエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物から立体異性学的に均一な成分を単離することは、公知の方法により可能である。本発明の化合物において、互変異性体が存在する場合、そのような互変異性体もすべて本発明に包含される。

【0013】

本発明の目的に好適な塩は、本発明の化合物の生理学的に許容される塩である。しかし、それ自体医薬用途に適していなくても、例えば、本発明の化合物の単離または精製に使用することができる塩であれば、このような塩も本発明に包含される。

【0014】

化学式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容される塩として、無機塩基の塩、例えば、アンモニウム塩、アルカリ金属塩、特にナトリウム塩やカリウム塩、アルカリ土類金属塩、特にマグネシウム塩やカルシウム塩；有機塩基の塩、特に、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、オクチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、プロカイン、モルホリン、ピロリン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリンまたはピペラジンといった有機塩基に由来する塩；塩基性アミノ酸との塩、特にリジン、アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンとの塩などが挙げられる。

【0015】

化学式（Ｉ）の化合物の医薬的に許容される塩として、無機酸の塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはホスホン酸塩；有機酸の塩、特に酢酸塩、ギ酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩またはベンゼンスルホン酸塩；酸性アミノ酸との塩、特にアスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩などがさらに挙げられる。

【0016】

本発明の目的に好適な溶媒和物は、固体状態または液体状態で、本発明の化合物に溶媒分子が配位して形成される複合体である、本発明の化合物の溶媒和物形態を指す。水和物は、水分子の配位により形成される、溶媒和物の特定の一形態である。

【0017】

本発明の化合物は、該化合物が配位子として働くことにより、例えば、鉄、カルシウムなどと複合体を形成してもよく、そのような複合体も本発明の対象である。

【0018】

上記により、本発明の根底にある問題は完全に解決される。

【0019】

本発明の別の一実施形態において、本発明の化合物は、下記の化学式（ＩＩ）：

【化10】

（式中、−Ｘは、Ｈ、ＣＨ_３、ＣＨ_２ＣＨ_３、アントラニルアラニン、ＤＯＰＡ、チロシン、トレオニン、

【化11】

【化12】

【化13】

【化14】

および

【化15】

からなる群より選択され、少なくとも１つ、好ましくは最大２つもしくは３つのＸは、

【化16】

および／または

【化17】

である）で示される化合物、その塩、その溶媒和物ならびにその塩の溶媒和物であることを特徴とする。

【0020】

本発明者らにより実証されているように、７個のアミノ酸を含む大員環とチアゾリジン小員環とからなる本発明の化合物は、特に強い抗菌活性を有する。

【0021】

化学式（Ｉ）で示される化合物に関して記載された特徴、特性および利点は、化学式（ＩＩ）で示される化合物にも当てはまる。

【0022】

別の一実施形態において、本発明の化合物は、下記の化学式（ＩＩＩ）：

【化18】

（式中、Ｙは、

【化19】

【化20】

および

【化21】

からなる群より選択される）で示されることを特徴とする。

【0023】

本発明者らによって確認されているように、化学式（ＩＩＩ）のコア構造で示される本発明の化合物は、極めて高い抗菌活性を示す。

【0024】

化学式（Ｉ）および（ＩＩ）で示される化合物に関して記載された特徴、特性および利点は、化学式（ＩＩＩ）で示される化合物にも当てはまる。

【0025】

別の一実施形態において、本発明の化合物は、下記の化学式（ＩＶ）：

【化22】

で示されることを特徴とする。

【0026】

この実施形態において提供される化合物は、まさに本発明者らがＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓから単離した化合物である。この化合物は、一般式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で示される化合物の抗菌活性を実証するための実施形態で、模範的に使用されている。本発明者らにより実証されているように、この化合物は殺菌活性を有しており、よって細菌感染を確実かつ効果的に阻止することができる。この化合物は、周知の微生物学的手法と周知の化学的手法であるクロマトグラフィーとを組み合わせることによって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓから単離することが可能であり、また、ペプチド合成によって合成することも可能である。

【0027】

化学式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で示される化合物に関して記載された特徴、特性および利点は、化学式（ＩＶ）で示される化合物にも当てはまる。

【0028】

本発明のさらなる一発展形態において、本発明の化合物は、疾患、好ましくは感染症、さらに好ましくは細菌性疾患、さらに好ましくはグラム陽性細菌による感染症、特に好ましくは、特にメチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）およびバイコマイシン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＶＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる感染症の治療および／または予防のために提供される。

【0029】

この方策は、様々な感染性因子、特にヒトにおいて種々の重篤な感染症を引き起こすＭＲＳＡに変異したＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対して有効な化合物が提供されるという利点を有する。

【0030】

本発明の化合物は、その薬理学的特性により、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて使用することにより、疾患または感染症、特に細菌感染症を治療および／または予防することができる。

【0031】

例えば、下記の病原体の感染または下記の複数の病原体の混合感染により引き起こされる局所性疾患および／または全身性疾患を治療および／または予防することができる：

【0032】

スタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などのグラム陽性球菌；バチルス属菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、リステリア属菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム属菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）などのグラム陽性杆菌；グラム陰性球菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、シトロバクター属菌（Ｃｉｔｒｏｂ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ、Ｃｉｔｒｏｂ．ｄｉｖｅｒｎｉｓ）、サルモネラ属菌、赤痢属菌などの腸内細菌科に属する菌を含むグラム陰性杆菌；ならびにクレブシエラ属菌（Ｋｌｅｂｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｋｌｅｂｓ．ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター属菌（Ｅｎｔ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ハフニア属菌、セラチア属菌（Ｓｅｒｒ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、プロテウス属菌（Ｐｒ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒ．ｒｅｔｔｇｅｒｉ、Ｐｒ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）、プロビデンシア属菌、エルシニア属菌およびアシネトバクター属菌。さらに、抗菌スペクトルには、シュードモナス属菌（Ｐｓ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＰｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）；Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、ペプトコッカス属、ペプトストレプトコッカス属およびクロストリジウム属の代表的な菌種などの絶対嫌気性細菌；さらにマイコプラズマ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｍ．ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓなどのマイコバクテリアも含まれる。

【0033】

上記の病原体の一覧は単なる例示であり、本発明を限定するものではない。

【0034】

本発明の化合物によって治癒、予防または緩和することができる、上記の病原体または混合感染が原因の疾患としては、例えば、下記の疾患が挙げられる：

【0035】

敗血症性感染症、骨・関節感染症、皮膚感染症、術後創傷感染症、膿瘍、蜂巣炎、創傷感染症、感染した熱傷、熱傷、口腔感染症、歯科術後感染症、化膿性関節炎、乳腺炎、扁桃炎、泌尿生殖器感染症、眼感染症などのヒトの感染症。

【0036】

特に、鼻腔内コロニー形成および鼻腔感染症の治療および／または予防のための本発明の化合物の使用が好ましい。

【0037】

この点に関して、本発明者らの知見によれば、本発明の化合物は、単離した環状ペプチドが作用する自然環境に配置される。

【0038】

ヒトに限らずその他の動物の細菌感染症も治療または予防することが可能であり、そのような細菌感染症として、下記の例が挙げられる。

【0039】

ブタ：大腸菌性下痢症、腸毒血症、敗血症、赤痢、サルモネラ症、子宮炎−乳腺炎−無乳症症候群、乳腺炎；

【0040】

反芻動物（ウシ、ヒツジ、ヤギ）：下痢、敗血症、気管支肺炎、サルモネラ症、パスツレラ症、マイコプラズマ症および性器感染症；

【0041】

ウマ：気管支肺炎、産褥期感染症および産褥後感染症、サルモネラ症；

【0042】

イヌおよびネコ：気管支肺炎、下痢、皮膚炎、耳炎、尿路感染症、前立腺炎；ならびに

【0043】

家禽類（ニワトリ、七面鳥、ウズラ、ハト、飼育舎で飼われている鳥類など）：マイコプラズマ症、大腸菌感染症、慢性気道疾患、サルモネラ症、パスツレラ症、オウム病。

【0044】

また、有用魚および鑑賞魚の繁殖および飼育において発症しうる細菌性疾患を治療することも可能であり、またヒトの場合においても、抗菌スペクトルは、パスツレラ属菌、ブルセラ属菌、カンピロバクター属菌、リステリア属菌、エリジペロスリックス菌、コリネバクテリウム属菌、ボレリア属菌、トレポネーマ属菌、ノカルディア属菌、リケッチア属菌、エルシニア属菌などの病原体にまで及ぶ。

【0045】

本発明の化合物により、ヒトまたはその他の動物の細菌感染症だけではなく、植物の細菌感染症も治療または予防することが可能である。

【0046】

本発明の化合物は、全身および／または局所に作用させることができる。この目的のために、本発明の化合物は、適切な方法によって投与することが可能であり、例えば、経口、非経口、経肺、経鼻、舌下、舌側、頬側、直腸内、皮膚、経皮、結膜下、耳腔内などの経路から投与してもよく、また、インプラントまたはステントを用いて投与してもよい。

【0047】

中でも、本発明の化合物が深部の組織にまで浸透することが本発明者らにより実証されていることから、局所適用が特に好ましい。

【0048】

このような背景から、本発明の別の主題は、疾患、好ましくは感染症、さらに好ましくは細菌性疾患、さらに好ましくはグラム陽性細菌による感染症、特に好ましくは、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる感染症の治療用および／または予防用の医薬組成物の製造のための、本発明の化合物の使用である。

【0049】

本発明の別の主題は、本発明の化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物である。

【0050】

この目的において、「医薬的に許容される担体」は、感染症の治療の分野で一般的に使用される任意の賦形剤、添加剤または媒体であって、本発明の化合物の生体への投与を簡便もしくは可能にするもの、ならびに／または該化合物の安定性および／もしくは活性を向上させるものを意味するものと理解される。前記医薬組成物には、さらに結合剤、希釈剤または滑沢剤を配合することができる。医薬担体またはその他の添加剤の選択は、所望の投与経路および標準の医薬的慣行に基づいて行われる。医薬的に許容される担体としては、溶剤、増量剤またはその他の液体の結合媒体、例えば、分散剤、懸濁化剤、界面活性剤、等張化剤、展着剤や乳化剤など、さらに、防腐剤、カプセル化剤、固体の結合媒体などを使用することが可能であり、各用法に最も適したもの、また本発明の化合物に適合するものが選択される。このような付加的な成分の概要については、例えば、Ｒｏｗｅら編集のＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（医薬賦形剤ハンドブック）、第７版、２０１２年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ社に記載されている。

【0051】

本発明のさらなる一発展形態において、本発明の医薬組成物は、疾患、好ましくは感染症、さらに好ましくは細菌性疾患、さらに好ましくはグラム陽性細菌による感染症、特に好ましくは、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓによる感染症の治療および／または予防のために提供される。

【0052】

本発明の化合物の特徴、特性、利点および実施形態は、本発明の使用および医薬組成物にも同様に適用される。

【0053】

本発明の別の主題は、本発明の化合物の製造方法であって、
１．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ菌種の細菌を提供する工程、および
２．前記細菌から本発明の化合物を精製する工程
を含む方法である。

【0054】

この点に関して、本発明の化合物を製造または単離するために本発明者らが使用した方法が提供される。この実施形態または本開示内の他の箇所で言及されるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ菌種には、分離株またはＩＶＫ２８株が含まれる。

【0055】

本発明の方法の一実施形態において、工程（１）の後かつ工程（２）の前に、前記細菌および前記細菌の培養液を抽出処理に供し、前記細菌からの抽出物および前記培養液からの抽出物を工程（２）に供して、これらの抽出物から前記化合物を精製する。

【0056】

この方策は、本発明の化合物の主要供給源のみが精製工程に提供されるという利点を有しており、微生物学的手法と化学的手法であるクロマトグラフィー（これらはいずれも当業者に周知である）とを組み合わせて用いることにより、該主要供給源から本発明の化合物を単離することができる。

【0057】

本発明の方法の別の一実施形態において、工程（２）の精製は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、前記化合物に関連するピークシグナルを確認することを含む。

【0058】

この方策は、確立されたペプチド精製ツールを利用して、本発明の化合物を確実に同定できるという利点を有する。

【0059】

本発明の方法の別の一実施形態において、前記シグナルピークは、約６５０Ｄａ〜約９５０Ｄａ、好ましくは約７００Ｄａ〜約８５０Ｄａ、さらに好ましくは約７５０Ｄａ〜約８００Ｄａ、さらに好ましくは約７７０Ｄａ〜約７９０Ｄａ、特に好ましくは約７８２．５Ｄａの分子量に対応する。

【0060】

この方策は、上記範囲に含まれる本発明の化合物を、分子量によって容易に同定することができるという利点を有する。

【0061】

本発明の別の主題は、本発明の化合物の製造方法であって、
１．生体系においてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ菌種の非リボソームペプチド合成酵素系ＩＩ（ＮＲＰＳ−ＩＩ）を発現させる工程、
２．発現させたＮＲＰＳ−ＩＩを、本発明の化合物の合成が可能な条件下でインキュベートする工程、および
３．前記化合物を精製する工程
を含む方法である。

【0062】

本発明者らは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ菌種のＮＲＰＳ−ＩＩが、本発明の化合物の合成に関与していることを見出しており、したがって、本方法は、この天然の装置を利用して、前記新規化合物を製造する方法である。

【0063】

本発明の方法の一実施形態において、前記ＮＲＰＳ−ＩＩは、遺伝子ｌｕｇＡ、ｌｕｇＢ、ｌｕｇＣおよびｌｕｇＤのコード配列のいずれかと、任意で、ＧｎｔＲファミリー転写制御因子、ＡＢＣトランスポーター（ＧｄｍＦ型の多剤輸送システム）、ＡＢＣ−２型輸送システムの透過酵素タンパク質、ＡＢＣトランスポーター、仮定上の膜蛋白質、ＴｅｔＲ／ＡｃｒＲファミリー制御因子、チオエステラーゼファミリータンパク質、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよび（バチルス属菌の）ｓｉｇＹの推定上の負の制御因子のコード配列のいずれかを含む核酸分子でコードされている。

【0064】

本発明者らは、本発明の化合物の合成および任意の補因子に関与する遺伝子を同定することに成功し、その本質的な特徴を分子生物学的な人工システムで利用することにより、目的の化合物を量産する方法を提供することに成功した。

【0065】

ＮＲＰＳ−ＩＩに含まれるコード配列は、配列番号１から取得することができる。以下に、各コード配列のヌクレオチド番号を示す。
ｌｕｇＡ：６００７〜１３１３１
ｌｕｇＢ：１３１２１〜１７３４１
ｌｕｇＣ：１７３５９〜２６１７２
ｌｕｇＤ：２６８９３〜２８６３２
ＧｎｔＲファミリー転写制御因子：４２７〜９３６
ＡＢＣトランスポーター（ＧｄｍＦ型の多剤輸送システム）：１２５３〜２１４３
ＡＢＣ−２型輸送システムの透過酵素タンパク質：２１４０〜２９０４
ＡＢＣトランスポーター：２９１７〜３６３０
仮定上の膜蛋白質：３６２３〜５１６４
ＴｅｔＲ／ＡｃｒＲファミリー制御因子：５４０９〜５９８１
チオエステラーゼファミリータンパク質：２６１６９〜２６８５５
４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ：２８６４０〜２９２９３
（バチルス属菌の）ｓｉｇＹの推定上の負の制御因子：１０２７〜１２６６

【0066】

このような背景から、本発明の別の主題は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸分子および／またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ菌種の非リボソームペプチド合成酵素系ＩＩ（ＮＲＰＳ−ＩＩ）の上記コード配列のうちのいずれかを含む核酸分子である。このような核酸分子としては、例えば、一般的な分子生物学的発現系において、コードされるタンパク質の制御発現に適した構成を有するベクターまたはプラスミドが挙げられる。また、本発明の主題は、上記の核酸分子によってコードされるタンパク質および／またはペプチドと同一のタンパク質および／またはペプチドをコードする核酸分子であって、遺伝子コードの縮重により元のヌクレオチド配列が修飾されているか、異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。

【0067】

本発明の別の主題は、本発明の核酸分子の発現によって得られた発現産物に関し、該発現産物には、遺伝子ｌｕｇＡ、ｌｕｇＢ、ｌｕｇＣ、ｌｕｇＤのいずれかでコードされたタンパク質および／もしくはペプチド、ＧｎｔＲファミリー転写制御因子、ＡＢＣトランスポーター（ＧｄｍＦ型の多剤輸送システム）、ＡＢＣ−２型輸送システムの透過酵素タンパク質、ＡＢＣトランスポーター、仮定上の膜蛋白質、ＴｅｔＲ／ＡｃｒＲファミリー制御因子、チオエステラーゼファミリータンパク質、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼおよび（バチルス属菌の）ｓｉｇＹの推定上の負の制御因子、または本発明の主題である上記のヌクレオチド配列でコードされたタンパク質および／もしくはペプチドが含まれる。

【0068】

本発明のさらなる主題は、本発明の核酸分子の発現によって得られた発現産物（ペプチド、タンパク質）のいずれかを特異的に標的とする抗体に関する。

【0069】

本発明の方法の別の一実施形態において、本発明の化合物の合成が可能な条件は、アミノ酸、チオエステラーゼおよび緩衝液を含む。

【0070】

この方策によって、上記条件が、本発明の化合物が高収率で得られるように調整される。

【0071】

本発明の別の目的は、ヒトまたはその他の動物などの生物の疾患、特に上述した疾患を治療および／または予防する方法であって、抗菌効果が得られる量の本発明の化合物を前記生物に投与することを含む方法である。

【0072】

本発明の別の目的は、本発明の化合物を産生することができる微生物を含むプロバイオティクスである。

【0073】

驚くべきことに、本発明者らは、前記新規抗菌化合物を産生する細菌などの微生物をそのまま使用することにより、例えば、生物の臓器における病原性微生物の増殖またはコロニー形成を阻止または抑制できることを見出した。

【0074】

本発明において、「プロバイオティクス」は、摂取または投与により、ヒトなどの生物に健康上の効用をもたらす微生物と理解される。具体的には、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓなどの病原性微生物のコロニーが形成されやすい臓器にプロバイオティクスを投与することにより、このような病原性因子が排除される。その結果、病原性負荷が低減または完全に排除される。

【0075】

好ましい一実施形態において、前記プロバイオティクスとして使用される微生物は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓである。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓは、その天然形態、すなわち野生株を使用してもよく、また、本発明の化合物の産生能力が保持された変異形態（例えば、遺伝子組換え体、野生株の弱毒変異体）を使用してもよい。

【0076】

本発明の別の一実施形態において、前記プロバイオティクスは、生物の臓器、例えばヒトの臓器における病原性微生物のコロニー形成を阻止または抑制するために用いられる。前記臓器は鼻であってもよく、その場合、前記プロバイオティクスは生物の鼻腔内に投与してもよい。また、前記臓器は皮膚であってもよく、その場合、前記プロバイオティクスは生物の皮膚表面に投与してもよい。

【0077】

当然のことながら、上述した特徴および以下に述べる特徴は、個々の事例で示した組み合わせだけでなく、本発明の範囲から逸脱しない限りは、他の組み合わせまたは単独でも使用可能である。

【0078】

以下、実施形態により本発明についてさらに説明する。これにより、本発明のさらなる特徴、特性および利点が明らかになるであろう。以下の実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。

【0079】

特定の実施形態で述べられる特徴は、本発明全体としての特徴でもあり、それぞれの実施形態でのみ適用されるものではなく、本発明の任意の実施形態で単独でも適用されうるものである。

【図面の簡単な説明】

【0080】

本発明について、下記の図面を参照することより、さらに詳細に記載し、説明する。

【図1】Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの野生株および同質遺伝子変異株によるルグドゥニンの産生を示す図である。Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株、ΔｌｕｇＤ変異株および補完された変異株を用いたＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００に対する生物活性アッセイ。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００をＢＭプレートに接種して菌叢を形成し、このプレート上に、一晩培養したＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８の野生株、変異株ΔｌｕｇＤおよび補完された変異株ΔｌｕｇＤ：：ｐＲＢ４７４／ｌｕｇＤをそれぞれスポットした。

【図2】Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８の非リボソームペプチド合成酵素の、ルグドゥニンの合成に必要とされる遺伝子座、および該酵素のドメイン構造を予測された特異性とともに示した図である。

【図3】Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８の細胞抽出液に含まれるＮＲＰＳ−ＩＩ産物の同定を行った結果である。（Ａ）Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ野生株（青色）および変異株Ｍ１（赤色）の細胞抽出液のＨＰＬＣ−ＵＶクロマトグラム（ＵＶ_{２１０ｎｍ}）（Ｘ軸：時間［分］、Ｙ軸：２１０ｎｍにおける吸収［ｍＡＵ］）；（Ｂ）保持時間１０．６分のピークをＨＰＬＣ−ＭＳで分析した結果、質量は７８２．５Ｄａと確認された（ＥＳＩ ｐｏｓ．：ｍ／ｚ ７８３．６［Ｍ＋Ｈ］^＋、ＥＳＩ ｎｅｇ．：ｍ／ｚ ７８１．５［Ｍ−Ｈ］⁻、ｍ／ｚ ８１７．５［Ｍ＋Ｃｌ］⁻）。

【図4】Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８がＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００を排除可能であることを示した図である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００（黒色）およびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株（Ａ）または変異株ΔｌｕｇＤ（ＢおよびＣ）（白色）を、異なる比率（１０：１（ＡおよびＢ）または１：１０（Ｃ））で混合して、２，２’−ビピリジンを含むＢＭ寒天培地にスポットした。各時点において、スポットした箇所における菌株の比率を求めた。いずれの図も３回の実験の平均値を示したものである。

【図5】本発明の化合物を具体化した環状ペプチド（「ルグドゥニン」）のＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳ断片（Ａ）および構造式（Ｂ）を示した図である。

【図6】ルグドゥニンが殺菌作用を有し、自然発生的な耐性発現を誘導する傾向を有していないことを示した図である。（Ａ）死滅曲線：Ｓ．ａｕｒｅｕｓを１０×ＭＩＣのルグドゥニンと共にインキュベートすると、接種原であるＳ．ａｕｒｅｕｓは３０時間後に完全に死滅する。データは、独立して行った３回の実験の中央値±Ｓ．Ｄ．で示す。（Ｂ）抑制濃度未満のリファンピシンの存在下、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの継代培養を繰り返し行うと、自然発生的にリファンピシン耐性が急速に増大する。しかし、このような耐性発現はルグドゥニンでは見られなかった。独立して行った２回の実験のうちの代表的な結果を示す。

【図7】非増殖性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００に対するルグドゥニンの殺菌作用を示す図である。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００を１．５μｇ／ｍＬルグドゥニンと共にインキュベートすると、６時間以内にＰＢＳ中の生菌数は少なくとも１００分の１に減少する。

【図8】ルグドゥニンがマウステープストリッピングモデルにおいてｉｎ ｖｉｖｏ活性を有することを示した図である。剃毛したＣ５７ＢＬ／６マウスの皮膚にＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎのコロニーを形成させた後、ルグドゥニンを数時間おきに３回塗布した。４５時間後、マウスを屠殺し、皮膚表面（洗浄液画分）の菌体数および深部の皮膚組織（擦り取り画分）の菌体数を測定した。ルグドゥニンの処置により、いずれの画分でも菌体数が有意に低減しており、ルグドゥニンはｉｎ ｖｉｖｏでも効果があることが示された（^★ｐ＜０．０５）。

【図9】３時間のインキュベーションにより、好中性顆粒球に対する細胞傷害性の可能性を確かめた細胞傷害性試験の結果を示す。

【図10】ルグドゥニンを産生するＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓがｉｎ ｖｉｔｒｏ試験およびコットンラットを用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験においてＳ．ａｕｒｅｕｓを排除することを示した図である。（Ａ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株を約９０：１０の比率で接種した寒天プレートでは、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株の増殖がＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を上回る。（Ｂ）一方、接種時のＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤとＳ．ａｕｒｅｕｓの比率が約９０：１０である場合は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖がＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤの増殖を上回る（ｂ）。（Ｃ）Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ΔｌｕｇＤの増殖がＳ．ａｕｒｅｕｓの増殖を上回る能力は、プラスミドにコードされたｌｕｇＤによって大幅に回復される。（Ｄ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤを約１０：９０の比率で接種した場合でも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖がＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ΔｌｕｇＤの増殖を上回る。データは、独立して行った３回の実験の平均値±Ｓ．Ｄ．で示す。開始時と各時点との間の有意差分析は、一元配置分散分析により行った（^＊：ｐ＜０．０５；^＊＊：ｐ＜０．０１；^＊＊＊：ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ：有意差なし）。（Ｅ）コットンラットの鼻腔内にＳ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株を注入して共にコロニーを形成させた場合、５日後のＳ．ａｕｒｅｕｓのＣＦＵはＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤより有意に低い値を示す。横線は、各群の中央値を示す。マン・ホイットニー検定で算出された有意差を示す（^＊：ｐ＜０．０５）。

【図11】コットンラットの鼻腔内におけるＳ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのコロニー形成比率を示した図である。各種接種原のコロニー形成効率を調べるために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎ（Ａ）、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株（Ｂ）およびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤ（Ｃ）をそれぞれコットンラットの鼻腔内に注入した。５日後、各鼻腔における各菌株のＣＦＵを求めて、それぞれ点でプロットした。図中の線は、各群の中央値を示す。

【図12】１８７名の有リスク患者のサンプルにおける、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ保有、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ保有、および両菌種保有の比率を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0081】

実施形態
Ａ．方法
１．菌株および増殖条件
以下の実験において、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属菌株として、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＮＲＳ３８４、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＳＡ１１３、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＳ１８７、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤ：：ｐＲＢ４７４／ｌｕｇＤおよびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８−Ｘｙｌを使用した。ＭＩＣ測定には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ ＢＫ４６３、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＶＲＥ３６６、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ１９１１８、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＡＴＣＣ４９６１９、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５αも使用した。また、クローニング用の宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＣ１０Ｂを使用した。さらに、以下に記載のコロニー形成試験の過程で診断用のサンプルからＳ．ａｕｒｅｕｓ６０株およびＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ１７株を単離した。

【0082】

標準増殖培地として、基礎培地（ＢＭ：１％大豆ペプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．１％グルコースおよび０．１％Ｋ_２ＨＰＯ_４、ｐＨ７．２）を使用した。ＭＩＣ測定および殺菌アッセイは、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ培地（ＭＨＢ；Ｒｏｔｈ社、カールスルーエ、ドイツ）を用いて行った。Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの同定には、当技術分野の過去の文献に記載されているように、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ選択用培地（ＳＳＬ）を使用した。必要に応じて、抗生物質として、ストレプトマイシンを２５０μｇ／ｍＬの濃度で、クロラムフェニコールを１０μｇ／ｍＬの濃度で、エリスロマイシンを２．５μｇ／ｍＬの濃度で、アンピシリンを１００μｇ／ｍＬの濃度で使用した。

２．生物活性試験

【0083】

９０株のブドウ球菌の鼻腔分離株をスクリーニングして、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を阻止する能力の有無を調べることにより、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８が抗Ｓ．ａｕｒｅｕｓ活性を有することを確認した。このスクリーニングの実施にあたり、一晩培養したＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣを１：１０，０００の比率でＢＭ寒天培地に接種した。培地上に形成された菌叢に各被検株を接種し、各プレートを３７℃で２４〜４８時間インキュベートした。鉄制限下におけるＩＶＫ２８の抗菌活性の有無を調べるために、ＢＭ寒天培地に２００μＭ ２，２’−ビピリジンを添加した。

３．トランスポゾン突然変異誘発およびルグドゥニン遺伝子群の解明

【0084】

温度感受性プラスミドｐＴＶ１ｔｓ（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓの５．３ｋｂのトランスポゾンＴｎ９１７（ｅｒｍ^Ｒ）を含む）を、エレクトロポレーションによりＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８に導入した。転移によりＳ．ａｕｒｅｕｓに対する抗菌活性が消失した変異株をスクリーニングにより選択した。非抑制性クローンから標準的手順により染色体ＤＮＡを単離し、プライマーＴｎ９１７−ｕｐおよびＴｎ９１７−ｄｏｗｎ（拡張データ 表２）を用いて、直接、トランスポゾン挿入部位の隣接領域の配列決定分析を行った。配列決定分析は、ＤＮＡＳＴＡＲ Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州、アメリカ）を用いて行った。また、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）およびａｎｔｉＳＭＡＳＨ ３．０を用いてバイオインフォマティクス分析を行った。

４．Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８−Ｘｙｌの作製

【0085】

ｌｕｇＲの隣接領域を、２組のプライマーセットＳＩＰｒ１−ｕｐ／ＳＩＰｒ１−ｄｏｗｎおよびＳＩＰｒ２−ｕｐ／ＳＩＰｒ２−ｄｏｗｎをそれぞれ用いてＰＣＲにより増幅した。プラスミドｐＢＡＳＥ６−ｅｒｍ／ｌｏｘ１（１箇所のＳｍａＩ部位にエリスロマイシン耐性カセットを含むｐＢＡＳＥ６の誘導体）を、Ａｃｃ６５Ｉを用いて線状化した。このｐＢＡＳＥ６−ｅｒｍ／ｌｏｘ１に、同様に消化したＳＩＰｒ１ ＰＣＲ産物（本来有していたＡｃｃ６５Ｉ制限酵素部位１箇所とプライマーによって導入されたＡｃｃ６５Ｉ制限酵素部位１箇所を含む）を連結した。このようにして得られた、ＳＩＰｒ１ ＰＣＲ産物が正しい配向で挿入されたベクターと、ＳＩＰｒ２ ＰＣＲ産物をそれぞれＥｃｏＲＶとＢｇｌＩＩで消化して、これらを連結した。ｌｕｇＲの２つの隣接領域が挿入されたｐＢＡＳＥ６−ｅｒｍ／ｌｏｘ１コンストラクトを、ＢｓｓＨＩＩを用いて線状化した後、クレノウ酵素で処理してＢｇＩＩＩで消化した。ｐＴＸ１５をＨｉｎｄＩＩＩで制限酵素処理して、ｘｙｌＲとその下流に位置するｘｙｌＡＢ−プロモーターとを含む所望のｘｙｌＲ断片を切り出した後、クレノウ酵素で処理してＢａｍＨＩで消化した。得られたｘｙｌＲ断片を上記の適切なベクターに連結して、ｐＢＡＳＥ６−ｅｒｍ／ｌｏｘ１−ｘｙｌＲを得た。これを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＣ１０Ｂに導入し、次いで、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＰＳ１８７に導入した。得られたプラスミドｐＢＡＳＥ６−ｅｒｍ／ｌｏｘ１−ｘｙｌＲを、バクテリオファージΦ１８７を介してＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８に導入した。当技術分野の過去の文献に記載されているように、ｌｕｇＲをｅｒｍ／ｘｙｌＲで置き換える相同組換えによって、キシロース誘導性ルグドゥニン産生株Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８−Ｘｙｌを得た。

５．ルグドゥニンの製造および精製

【0086】

新鮮な培地で一晩培養したＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８−Ｘｙｌを１：１，０００の比率でグルコース不含ＢＭに接種し、０．５％キシロースを添加した。振盪（１６０ｒｐｍ）しながら３７℃で２４時間インキュベートした後、培養物全体に１−ブタノールを５：１の割合になるように加えて抽出を行った。水相を除去した後、有機相を減圧下、３７℃で蒸発させ、得られた残渣をメタノールに溶解した。このメタノール抽出物を、ゲル濾過カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ ＬＨ２０、１．６×８０ｃｍ、流量１ｍＬ／分）に注入した。ルグドゥニンが含まれる活性画分をプールして、減圧下、３７℃で蒸発させ、得られた残渣をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。得られた溶液を分取逆相ＨＰＬＣカラム（Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８、７μｍ、２５０×２０ｍｍ；Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ社、アンマーブーフ、ドイツ）に供して、７９％メタノール水溶液を用いた定組成溶離を２０分間行った。ルグドゥニンが含まれるピークは、他の化合物のピークと完全に分離（ベースライン分離）していた。メタノールを減圧下、３７℃で留去して、純度の高いルグドゥニンの白色粉末を得た。

６．ルグドゥニンおよびルグドゥニンの誘導体の化学合成

【0087】

全体の化学合成は、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）法に基づく手動の固相ペプチド合成により、Ｈ−Ｖａｌ−Ｈ ＮｏｖａＳｙｎ（登録商標）ＴＧ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社、スイス）上に目的のペプチドを構築して行った。アミノ酸のカップリングは、ＨＡＴＵ（１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム ３−オキシド ヘキサフルオロホスファート）の存在下、４倍過剰量のアミノ酸を用いて行った。バリンのカップリングは２回行ったが、２回目のカップリングには、ＨＡＴＵの代わりにＰｙＯｘｉｍ（［エチル シアノ（ヒドロキシイミノ）アセタト−Ｏ^２］トリ−１−ピロリジニルホスホニウム ヘキサフルオロホスファート）を用いた。合成したペプチドは、アセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸（７９．９５／２０／０．０５）と３０分間反応させて、樹脂から切り離した。一晩凍結乾燥させて、粗生成物を得た。合成したルグドゥニンの粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、精製したルグドゥニンを、ＨＲ−ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ、さらにキラルＨＰＬＣ法（カラム：Ｄｒ．Ｍａｉｓｃｈ社、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ Ｃｈｉｒａｌ ＮＲ、アンマーブーフ、ドイツ；溶出は、予め調製した８０％メタノール水溶液を用いて、流量１．５ｍＬ／分で行った）、生物活性アッセイ、および改良Ｍａｒｆｅｙ分析により、天然ルグドゥニンと比較した。

７．ＭＩＣアッセイおよび活性スペクトル

【0088】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＲＮ４２２０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００（ＬＡＣ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００（ＮＲＳ３８４）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＳＡ１１３、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｍｕ５０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αおよびＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＰＡＯ１を、それぞれＭＨＢで一晩増殖させた。Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＶＲＥ３６６、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ ＢＫ４６３、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを、それぞれトリプチックソイブロス（ＴＳＢ：Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、アウグスブルク、ドイツ）で増殖させた。いずれの菌株も３７℃で振盪しながら培養した。対数増殖期の初期段階まで増殖した各種細菌をＭＨＢに懸濁して、マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に１×１０^６個／ウェルになるように播種し、対象の抗生物質を種々の濃度で添加して、３７℃で振盪しながら２４時間培養した。各ウェルのＯＤ_６００をマイクロプレートリーダーで測定し、細菌増殖が認められない最小のペプチド濃度をＭＩＣとした。本アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレートを用いて行った。

８．殺菌アッセイ

【0089】

一晩培養したＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣを１：１０，０００の比率で新しいＭＨＢに接種し、１×１０^６個／ｍＬに増殖するまで３７℃で振盪しながら（１６０ｒｐｍ）培養した。次いで、１０×ＭＩＣのルグドゥニンを添加した。０時間後、２時間後、４時間後、８時間後、２４時間後および３０時間後にそれぞれサンプルを採取し、遠心分離した。得られたペレットを１×ＰＢＳに再懸濁し、段階希釈した。調製した希釈液をトリプチックソイ寒天培地（ＴＳＡ）にスポットして、３７℃で一晩培養した後、コロニー数を測定した。菌体数が＜１０^２個／ｍＬである場合は、菌体数の計測を行うために、１ｍＬの培養物全体を遠心分離して、ＴＳＡに接種した。

９．ヒト好中性顆粒球に対する細胞傷害性

【0090】

ヒト好中性顆粒球は、標準的なヒストパック／フィコール遠心分離により、健康なボランティアから採取した新鮮な血液から単離した。好中性顆粒球の溶解は、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出を指標とした。１ウェル当たり２００μＬフェノールレッド不含ＲＰＭＩ−１６４０培地（２ｇ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン、ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に１×１０^６個の好中性顆粒球を含む９６ウェルの組織培養プレートにおいて、最終濃度が０．５％ＤＭＳＯに５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬおよび１２．５μｇ／ｍＬとなるようにルグドゥニンをウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２存在下で３時間インキュベートし、細胞傷害性検出キット（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、マンハイム、ドイツ）を用いて好中性顆粒球の溶解の程度を測定した。高い細胞傷害性を示すポジティブコントロールとして、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００をサンプルに添加した。

１０．耐性発現試験

【0091】

この試験で使用する２種の抗生物質に対して、上記と同様にしてＭＩＣアッセイを行った。本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００に対するリファンピシンの１×ＭＩＣが０．０１μｇ／ｍＬ、ルグドゥニンの１×ＭＩＣが１．５μｇ／ｍＬであることを確認した。一晩培養したＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００ ＬＡＣを１：１０，０００の比率で新しいＭＨＢに接種し、３７℃で振盪しながら培養した。対数増殖期の初期段階まで増殖した菌体を１×１０^６個／ｍＬに調整して、９６ウェルマイクロタイタープレートに１ウェル当たり１００μＬずつ添加した。ルグドゥニンおよびリファンピシンを、それぞれ０．２５×ＭＩＣ、０．５×ＭＩＣ、１×ＭＩＣ、１．５×ＭＩＣ、２×ＭＩＣおよび４×ＭＩＣの濃度になるように添加した。３７℃で振盪しながら２４時間培養した後、マイクロプレートリーダーでＯＤ_６００を測定して増殖の程度を確認し、各抗生物質の０．２５×ＭＩＣ、０．５×ＭＩＣ、１×ＭＩＣ、１．５×ＭＩＣ、２×ＭＩＣおよび４×ＭＩＣの濃度のうち、２番目に高い濃度から菌体を採取した。

１１．統計分析

【0092】

統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、ラホヤ、アメリカ；バージョン５．０４）を用いて行った。統計学的有意差は、記載の適切な統計的手法により算出した。ヒト試験においては、Ｓｔａｔａ バージョン１２．０（Ｓｔａｔ社、カレッジステーション、テキサス州、アメリカ）を用いて、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの存在下および非存在下におけるＳ．ａｕｒｅｕｓによる鼻腔内コロニー形成のリスクを求めるとともに、リスク比の点推定値および信頼区間を求めた。ｐ値が≦０．０５の場合、有意差があると見なした。

１２．動物モデルおよび倫理的配慮

【0093】

すべての動物実験は、ドイツの地方当局（テュービンゲン行政区庁）で承認を得た後（マウス皮膚感染の実験計画書ＨＴ１／１２およびコットンラットコロニー形成の実験計画書Ｔ１／１０）、ドイツの実験動物学会（Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｒ Ｖｅｒｓｕｃｈｓｔｉｅｒｋｕｎｄｅ／Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＧＶ−ＳＯＬＡＳ））のドイツの規制およびヨーロッパ実験動物学会連合（ＦＥＬＡＳＡ）のヨーロッパ衛生法に厳密に従い、ドイツの法令に則って行った。動物実験およびヒト試験はすべてテュービンゲン大学病院で実施し、当該施設内の動物の飼養および使用に関する指針に従って行った。感染／コロニー形成動物モデルにおいては、無作為化も盲検化も不要であり、サンプルの除外も行わなかった。動物実験は、６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスならびに８〜１０週齢の雄性および雌性のコットンラットを用いて行った。ヒト鼻腔内コロニー形成試験は、テュービンゲン大学病院の医学部の倫理委員会で承認された（プロジェクト番号５７７／２０１５Ａ）。

１３．Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける皮膚感染

【0094】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮膚への感染には、ストレプトマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎ菌株を用い、テープストリッピング法を採用した。新たに一晩培養した供試菌株を１：１０，０００の比率で、５００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＴＳＢに接種し、ＯＤ_６００＝０．５になるまで３７℃で振盪しながら培養した。菌体を回収し、１×ＰＢＳで２回洗浄し、１×１０^８個／ｍＬに調整した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎを感染させるために、剃毛したマウスの皮膚に強いテープストリッピングを繰り返し（７回）行って皮膚を損傷させた。調製した細菌懸濁液の１５μＬを接種原として７ｍｍのフィルターペーパーディスクに添加し、このディスクを１匹あたり２枚ずつ、準備した皮膚の上に置いて、スカンポールテープ付きフィンチャンバー（Ｓｍａｒｔ Ｐｒａｃｔｉｓｅ社、フェニックス、アリゾナ州、アメリカ）でカバーした。フィンチャンバーは、伸縮包帯であるフィクソムル ストレッチ（ＢＳＮ ｍｅｄｉｃａｌ社、ハンブルグ、ドイツ）で固定した。２４時間感作させた後、フィンチャンバーを除去して、コロニーが形成されている部位にルグドゥニンを１．５μｇずつ塗布し、次いで、２回目および３回目の処置として３０時間後および４２時間後にも同量のルグドゥニンを塗布した。最後の塗布から６時間後にマウスを安楽死させた。皮膚を広範囲に剥離し、コロニーが形成されていた部位を４ｍｍのパンチで打ち抜き、１×ＰＢＳに浸漬してボルテックスで３０秒間撹拌し、皮膚上に付着している細菌を取り除いた（洗浄液画分）。洗浄した皮膚をメスで切開して、皮膚の深部（組織画分）の細菌を露出させ、１×ＰＢＳに浸漬してボルテックスで３０秒間攪拌することによりホモジネート液を得た。両画分を１×ＰＢＳで段階希釈して各画分のＣＦＵを求め、次いで、各希釈液を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎ^{ｓｔｒｅｐ}菌株を特異的に選択するためにストレプトマイシンを添加したＴＳＡ上にスポットした。次いで、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

１４．Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ΔｌｕｇＤの作製および補完

【0095】

マーカーレスノックアウト株を構築するために、ｌｕｇＤの１ｋｂの隣接領域を、２組のプライマーセットｌｕｇＤ ｕｐｓｔｒｅａｍ−ＳａｃＩ／ｌｕｇＤ ｕｐｓｔｒｅａｍ−Ａｃｃ６５ＩおよびｌｕｇＤ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ−Ａｃｃ６５Ｉ／ｌｕｇＤ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ−ＢｇｌＩＩを用いてＰＣＲにより増幅した。得られた断片を、導入した制限部位に従って消化し、プラスミドｐＢＡＳＥ６に連結してｐＢＡＳＥ６−ΔｌｕｇＤを作製した。作製したプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＤＣ１０Ｂに導入した。目的断片が正しく挿入されたプラスミドをエレクトロポレーションによりＳ．ａｕｒｅｕｓ ＰＳ１８７に導入し、次いで、バクテリオファージΦ１８７を用いた感染により、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株にｐＢＡＳＥ６−ΔｌｕｇＤを導入した。相同組換えにより所望の隣接領域がゲノムに組み込まれることにより、目的のノックアウト株が得られ、ｌｕｇＤが欠失していることをＰＣＲにより確認した。変異株の補完性を調べるために、ｌｕｇＤを、プライマーセットｌｕｇＤ ｃｏｍｐ．ｆｏｒｗ−ＰｓｔＩ／ｌｕｇＤ ｃｏｍｐ．ｒｅｖ−Ａｃｃ６５Ｉを用いて増幅し、増幅した断片を適切な制限酵素で消化して、同じ制限酵素で消化したｐＲＢ４７４に連結した。ノックアウト変異株の場合と同様にして、作製したｐＲＢ４７４−ｌｕｇＤをＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤに導入した。

１５．競争アッセイ

【0096】

Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤ、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤ：：ｐＲＢ４７４−ｌｕｇＤおよびストレプトマイシン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎを、それぞれＢＭ中、３７℃で振盪しながら一晩増殖させた。次いで、これらの菌株を１×ＰＢＳで１×１０^９個／ｍＬに調整し、１：１０に希釈した。開始時のＳ．ａｕｒｅｕｓの割合が９０％になるように、１×１０^９個／ｍＬのＳ．ａｕｒｅｕｓと１×１０^８個／ｍＬのＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを等容量で混合した。同時に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが１０％しか含まれない場合の共培養も行うこととし、いずれの場合も、菌の混合物を２０μＬずつＢＭ寒天培地に３点スポットして、３７℃で培養した。サンプルの採取は、０時間後、２４時間後、４８時間後および７２時間後にそれぞれ行い、寒天プレートから菌体を擦り取り、１×ＰＢＳに懸濁することにより行った。採取したサンプルを段階希釈して、ＢＭとＳ．ａｕｒｅｕｓ選択用のストレプトマイシンを含むＢＭのそれぞれに接種した。３７℃で一晩インキュベートした後、コロニー数を測定し、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの菌数の比率を算出した。

１６．コットンラットの鼻腔内における共コロニー形成

【0097】

コットンラットの鼻腔内でコロニーを形成させるために、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株とＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤのそれぞれのストレプトマイシン耐性自然変異株を、２５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＢＭ寒天プレートで選択した。共コロニー形成は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎ^{ｓｔｒｅｐ}菌株を用いて行った。コットンラットモデルは過去に報告されている。コットンラットの鼻腔におけるＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのコロニー形成能についてはこれまで調べられていないため、本発明者らは、ＩＶＫ２８野生株とその変異株ΔｌｕｇＤを接種して、５日間にわたって安定したコロニーが形成される接種原の量を調べた。本発明者らの過去の実験により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに関しては、１０^７個の菌数を接種原として鼻腔内に投与した場合、約１０^３ＣＦＵのコロニーが安定して形成されることが示されている。Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓで同等のコロニー形成レベルを得るためには、１０^８個の菌数を接種原として鼻腔内に投与する必要があり、野生株とΔｌｕｇＤとでコロニー形成効率における検出可能な差はなかった。したがって、コットンラットの鼻腔内における共コロニー形成実験は、１：１の比率でコロニーが形成されるように、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの１０倍量のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓを用いて行った。

【0098】

コットンラットに麻酔をかけて、１×１０^８個のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ野生株と１×１０^７個のＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎとの混合物、または１×１０^８個のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ΔｌｕｇＤと１×１０^７個のＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎとの混合物を鼻腔内に注入した。菌体を注入してから５日後、動物を安楽死させて、鼻部を外科的に摘出した。摘出した鼻部を１ｍＬの１×ＰＢＳに浸漬してボルテックスで激しく３０秒間攪拌した。使用した菌株を選別するために、かつＳ．ａｕｒｅｕｓ（黄色）とＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（紫色）を色で分離するために、ＰＢＳで希釈したサンプルを、２５０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＳＳＬ寒天培地に接種した。オルニチン脱炭酸酵素活性を特異的に検出するために、接種したプレートを嫌気条件下で（Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ（登録商標）Ａ（アネロカルト Ａ）を備えた嫌気ジャー（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ社）使用）２日間インキュベートした。その後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＮｅｗｍａｎのＣＦＵを測定した。使用した動物はすべて、鼻腔内の天然菌叢を抑制するために、実験の３日前から２．５ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む飲料水を継続的に摂取させた。

１７．ヒトにおけるコロニー形成実験

【0099】

医療微生物学・衛生学研究所の診断研究室（テュービンゲン大学病院、ドイツ）から、合計で１８７名の入院患者の鼻腔内スワブサンプルの提供を受けた。Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの表現型を同定するために、各サンプルを希釈して血液寒天培地とＳＳＬ寒天培地のそれぞれに接種した。表現型の同定は、コアグラーゼ試験およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（質量分析計：ＡＸＩＭＡ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｅｕｒｏｐａ社、デュースブルク、データベース：２３，９８０スペクトルおよび３，３８０スーパースペクトルを含むＳＡＲＡＭＩＳ（商標）、ＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社、ニュールティンゲン）により行った。

Ｂ．結果
１．Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して強い活性を有する極めて強力な抗菌性の環状ＮＲＰＳペプチドを産生する

【0100】

天然の生息場所、特にヒトの鼻腔内［Ｋｒｉｓｍｅｒら（２０１４） Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｇｏｖｅｒｎｓ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ ｎｉｃｈｅ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｎｏｓｅ．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ １０：ｅ１００３８６２］のような栄養の乏しい生態的地位においては、コロニーを形成する細菌間で栄養分の利用をめぐる熾烈な競争が想定される。本発明者らは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して活性を有する化合物を製造するために、鼻腔内スワブから得られた細菌分離株をスクリーニングした。本発明者らは、広範な鼻腔内細菌種に対する活性に加えて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対して抑制作用を有する２つの菌種を同定した。そのうちＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓと同定された一方の分離株は、実験した条件下で一定した抗菌活性を示し、もう一方の分離株であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を阻止する能力が特に強いことが分かった（図１）。ＩＶＫ２８は、鉄制限下においてのみ抗菌効果を示した。これまでブドウ球菌種でこのような抑制活性を有することは報告されていない。そのため、本発明者らは、このＩＶＫ２８と称されるＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの分離株について、さらに研究を重ねた。

２．Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８ ＮＲＰＳオペロンの遺伝子構成

【0101】

上記菌株をトランスポゾン突然変異誘発に供して、非産生性変異株Ｍ１を得た。インバースＰＣＲによる挿入部位の分析により、ＮＲＰＳ−ＩＩと称されるシステムの一部である非リボソームペプチド合成酵素をコードする遺伝子（ＮＲＰＳ；Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ Ｎ９２０１４３の注釈付きのゲノム配列の８６０３７５／７６位；アクセッション番号：ＦＲ８７０２７１．１）が同定された。このことから、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対するＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの抗菌活性が低分子ペプチドによるものである可能性が明確に示された。Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのゲノムにおいては、これまでに３つの推定ＮＲＰＳ系が同定されている［Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ Ｎ９２０１４３の全ゲノム配列は、Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎｅｒら（２０１１） Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ Ｎ９２０１４３ ａｌｌｏｗｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ ３２２：６０−６７に公開されており、本文献は参照により本明細書に組み込まれる］。ＮＲＰＳ−Ｉは、アウレウシミンＡおよびＢをコードするＳ．ａｕｒｅｕｓのＮＲＰＳジペプチド系と高い相同性を示し［Ｗｙａｔｔら（２０１０） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９：２９４−２９６］［Ｅｒｒａｔｕｍ ｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１１ Ｓｅｐ ９；３３３（６０４８）：１３８１］、ＮＲＰＳ−ＩＩＩは、文献で報告されているシデロフォア系（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎｅｒら、上記引用文献）と極めて高い類似性を有しているが、ＮＲＰＳ−ＩＩでコードされていると考えられる発現産物については知られていない。公開されているＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのゲノム（菌株Ｎ９２０１４３および菌株ＨＫＵ０９−０１の完全配列ならびに菌株ＶＣＵ１３９および菌株Ｍ２３５９０９の部分配列（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ Ｎ９２０１４３．ＨＫＵ０９−０１：８６４８００／８６４８０１間のゲノム配列に基づいて容易に決定可能である））を調べたところ、利用しようとしているＮＲＰＳ−ＩＩオペロンは、ゲノムの配列決定がなされているＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのいずれの菌株にも存在しており、菌株特異的な特徴ではないことが分かった。しかしながら、公開されているゲノムには、様々な配列決定エラーと考えられる箇所が含まれていたり、実際のフレームシフト突然変異により異なる注釈が付されている場合がある。そのため、ＩＶＫ２８株を用いて、フレームシフトの可能性がある関連箇所をすべてＰＣＲにより増幅した。得られたＰＣＲ産物の配列決定分析を行い、遺伝子ＳＬＵＧ＿０８１１０の３’末端の、注釈が付されているヌクレオチド番号８６３５１５を除き、ＩＶＫ２８の配列は菌株Ｎ９２０１４３およびその注釈に対応していることが明らかになった。ただし、ＩＶＫ２８では、Ｎ９２０１４３において７つのアデノシンヌクレオチドがひとつながりとなっている箇所が、８つのアデノシンヌクレオチドで構成されており、それにより遺伝子ＳＬＵＧ＿０８１１０およびＳＬＵＧ＿０８１２０が連結して１つのオープンリーディングフレームを形成している。

【0102】

図２は、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８における２９．６ｋｂのＮＲＰＳ−ＩＩオペロンの遺伝子構成を示した図である。各コード配列の位置を、下記のＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８のＮＲＰＳオペロンの配列情報に示す。

【0103】

興味深いことに、ＮＲＰＳオペロンのＧＣ含量はわずか２６．７％と、ゲノム全体のＧＣ含量（３３．８％）より顕著に低く、ＧＣ含量が極めて低い生物の遺伝子が水平伝播したことが示唆される。このオペロンには、４種類のＮＲＰＳタンパク質をそれぞれコードする遺伝子（ｌｕｇＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄと命名されている）が連続して含まれており、ｌｕｇＣとｌｕｇＤとの間はＩＩ型チオエステラーゼ遺伝子が挿入されている。５’−領域には、２つのＡＢＣトランスポーターおよび２つの制御因子と考えられる遺伝子がコードされている。オペロンの３’末端には、４’−ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼがコードされている。抗菌活性は鉄制限下でのみ検出できたが、オペロン内に明らかなｆｕｒ（鉄取込調節）ボックスは確認できなかったことから、オペロンの発現に対する鉄欠乏の効果は、どちらかと言えば間接的なものであることが示唆された。

【0104】

このいわゆるｌｕｇオペロンは、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓでのみ見つかったものであり、このオペロンには抗生物質の生合成に関わる複数の酵素が他にはない組み合わせでコードされており、いずれの酵素も、文献で報告されている他のどの酵素とも同一性が３５％未満である。これより、ｌｕｇオペロンが新規の化合物の生合成に関与している可能性が示唆される。ｌｕｇオペロンがＩＶＫ２８の抗菌活性に関与することを確認するために、ＮＲＰＳ遺伝子の中で最小の遺伝子であるｌｕｇＤを遺伝子置換により欠失させた。変異株ΔｌｕｇＤでは抗菌活性は検出されなかったが、プラスミドにコードされたｌｕｇＤのコピーを用いて補完することにより元の表現型が回復した（図１）。

【0105】

ｌｕｇＡ〜Ｄでコードされた各タンパク質のコンピュータ分析（ＮＲＰＳ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ２、ａｎｔｉＳＭＡＳＨ、ＨＭＭＥＲ）により、図２に示す珍しいドメイン構造が明らかになった。ほとんどのＮＲＰＳ系では、活性化アミノ酸が直鎖状に連結され、生合成産物の切り離しは、通常、Ｉ型チオエステラーゼで触媒される。一方、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのオペロンには、最終産物を切り離すための還元酵素と推定されるドメインが存在し、ｌｕｇＣの末端にコードされている。また、ＬｕｇＤは、ＬｕｇＡ〜Ｃとは異なり、縮合反応触媒ドメインを欠いている。縮合反応触媒ドメインは、いわゆる開始モジュールと呼ばれる、一部のＮＲＰＳ系において１番目のアミノ酸を提供するモジュールに共通する特徴である。続いて起こる縮合反応は、伸長モジュールで触媒される。

【0106】

ＮＲＰＳ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ２およびＡｎｔｉＳＭＡＳＨソフトウェアを用いて、アデニル化ドメインの特異性を予測したところ、最も可能性の高い活性化アミノ酸として、バリンおよびトレオニン（ＬｕｇＡ）、ロイシン（ＬｕｇＢ）、バリン（ＬｕｇＣ）およびシステイン（ＬｕｇＤ）が示された（ただし、確率はそれぞれ異なっており、トレオニンでは６０％、システインでは１００％であった）。

３．ＮＲＰＳ−ＩＩ生合成産物の同定

【0107】

Ｓ．ａｕｒｅｕｓに対する抑制活性が２００μＭ ２，２’−ビピリジンを含む寒天プレートでのみ検出可能であったことから、同一の条件を用いて目的のペプチドの抽出実験を行った。４８時間増殖させた後、寒天培地からＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８の菌体を擦り取り、１００％エタノールを用いて目的のペプチドを抽出した。野生株および変異株Ｍ１から得られた抽出物をＨＰＬＣで分析したところ、保持時間１０．６分に見られる主ピーク（分子量：７８２．５Ｄａ（図３Ａおよび図３Ｂ））でのみ差が認められた。驚くべきことに、コンピュータによる解析では遺伝子構成からトリプトファンの存在は予測されなかったが、実際の吸光スペクトルでは、トリプトファン含有タンパク質に特徴的な２８０ｎｍの吸収が示された。このペプチドに対応するＨＰＬＣピークの消失が、実際にｌｕｇＡへのトランスポゾンの組込みによるものであって、確認されていない別の突然変異によって起こったものではないことを確かめるために、先に説明したｌｕｇＤのノックアウト菌株（ΔｌｕｇＤ：：ｅｒｍ）を構築した。予想した通り、このΔｌｕｇＤ変異株のＨＰＬＣクロマトグラムは、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ Ｍ１のＨＰＬＣクロマトグラムとほぼ同じで、１０．６分においてピークは認められなかった（データ示さず）。この産生に関わる表現型は、プラスミドｐＲＢ４７４−ｌｕｇＤを用いて補完することにより、部分的に回復された。

４．Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００との共培養実験において、ＵＳＡ３００を排除することができる

【0108】

ＮＲＰＳ−ＩＩ系の発現がＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓにとって競争上有利になるかどうかを調べるために、ＩＶＫ２８株またはΔｌｕｇＤ：：ｅｒｍ株を、２，２’−ビピリジンを含む寒天プレート上でＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００と種々の比率で共培養した。図４に示すように、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８は、開始時にＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００の割合が９０％であっても、７２時間以内に培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００を完全に排除することができた（Ａ）。一方、変異株Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ΔｌｕｇＤ：：ｅｒｍは、最初の４８時間にＳ．ａｕｒｅｕｓの割合をわずかに低減させたものの、７２時間後にはＳ．ａｕｒｅｕｓの割合が上回った（Ｂ）。さらに、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ変異株は、開始時の割合が９０％であっても、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる入れ替わりが認められた（Ｃ）。以上の結果は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとの競争において、ＮＲＰＳ−ＩＩ系がＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの適応性因子として重要であることを明確に示すものである。ただし、特筆すべき点として、培地から２，２’−ビピリジンを除いた場合でも、結果はほぼ同じであったことが挙げられ、このことから、鉄制限は唯一にして真の誘導シグナルではなく、むしろＳ．ａｕｒｅｕｓとの密接な接触といった特殊なストレスが誘導シグナルである可能性が示唆される。

５．ＮＲＰＳ−ＩＩペプチドの過剰産生および精製

【0109】

興味深いことに、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８を、２，２’−ビピリジンを含む液体培養条件下で増殖させた場合、細胞抽出液、培養上清のいずれにおいても、抗菌活性は検出できなかった。そのため、この菌株に遺伝子操作を施し、ｌｕｇＡの上流のｔｅｔＲファミリー様抑制遺伝子を、確立されているキシロース誘導性ｘｙｌＲ制御システムに置き換えた。この遺伝子操作によって、本発明者らは、ビピリジンの非存在下において、０．５％キシロースの添加によりペプチド産生を誘導することができた。キシロース添加後のこの菌株ΔｔｅｔＲ：：ｅｒｍ／ｘｙｌＲの培養上清において、有意な抗菌活性が確認された。本発明者らは、１−ブタノールで抽出することによって、溶媒中の抗菌活性を濃縮することができた。１−ブタノールを留去した後、１００％メタノールに再懸濁し、セファデックス ＬＨ−２０カラムでサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより、高度に濃縮された活性画分を得ることができた。分取ＨＰＬＣにより最終的な精製を行い、純度の高い抗菌化合物を得た。この化合物をＤＭＳＯに１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解し、−２０℃で保存した。ＬＣ−ＭＳ分析およびＭＳ−ＭＳ分析により、分子量は、先に確認した通り７８２．５Ｄａであり、元素組成式はＣ_４０Ｈ_６２Ｎ_８Ｏ_６Ｓであることが確認された（図５）。

【0110】

本発明の化合物の一実施形態である「ルグドゥニン」と命名されている化合物が、白色固体として単離された。ＵＶスペクトルから、インドール環の存在が示唆され、ＨＲ−ＥＳＩ−ＭＳから、ｍ／ｚ＝７８３．４５８１のイオンピーク（［Ｍ＋Ｈ］^＋）およびＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳにおける特異的な断片の存在が明らかになった。さらに、Ｍａｒｆｅｙ法によるＤ−アミノ酸標準物質、Ｌ−アミノ酸標準物質、ルグドゥニンのそれぞれの修飾産物を、ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳおよびＨＰＬＣ−ＭＳ−ＭＳに供した。質量分析で生成される付加体や断片から、３つのバリン、ロイシン／イソロイシン、トリプトファンに対応するＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸ならびにチアゾリジン環構造に帰属するＣ_８Ｈ_１５Ｎ_２ＯＳの新規断片の存在が明らかになった。^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルでは、バリンのプロトンに特徴的な脂肪族シグナルおよびトリプトファン構造に特徴的なシグナルが認められた。このＮＭＲスペクトルでは、溶液中で４８時間経過した後の化学シフトが変化していたことから、ルグドゥニンには少なくとも２つの異なる異性体および配座異性体が存在することが示唆された。さらに２Ｄ ＮＭＲ実験によって、ルグドゥニンの構造が裏付けられた。しかし、シグナルの重複により、ＮＭＲ法では位置化学を完全に決定することはできず、またルグドゥニンを構成する個々のアミノ酸の立体化学、すなわちＤ−バリン残基およびＬ−バリン残基の順序もＮＭＲ分光法では決定することができなかった。したがって、ルグドゥニンは、７つのアミノ酸および組成式Ｃ_４０Ｈ_６２Ｎ_８Ｏ_６Ｓから得られる、図５Ａおよび図５Ｂに示す環状ペプチドに帰属する。

６．新規化合物は殺菌作用を有し、主として主要なヒト病原体に対する活性を有する

【0111】

活性スペクトルを明らかにするために、臨床的に重要な種々のグラム陽性菌およびグラム陰性菌を用いてＭＩＣを求めた。表１に示すように、前述の新規化合物は、種々のＳ．ａｕｒｅｕｓ菌株に加えて、グリコペプチド系中度耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＧＩＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓおよびＥ．ｆａｅｃｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどの試験に用いたすべての菌種に対して活性を有することが確認された。ＭＩＣの範囲が１．５〜１２μｇ／ｍＬ（１．９〜１５μＭ）であることは、ルグドゥニンが強力な抗菌作用を有することを明確に示すものである。また、興味深いことに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００のＭＲＳＡ菌株は、実験室用の菌株であるＲＮ４２２０より感受性が高かった。ルグドゥニン産生菌株は、さらにＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｔｅｕｓおよびその他の種々のブドウ球菌種に対しても活性を示した。グラム陰性菌に関しては、いずれの菌株においても、供試濃度の範囲（最大１００μｇ／ｍＬ）で顕著な抑制作用は認められなかった。

【表1】

【0112】

ルグドゥニンは、単回用量の処理によりＭＲＳＡを完全に死滅させることができる殺菌作用を有することが示された（図６Ａ）。抑制濃度を下回る濃度のルグドゥニンでＳ．ａｕｒｅｕｓの継代培養を３０日間にわたって繰り返した場合でも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおける自然発生的な耐性発現は見られなかった（図６Ｂ）。一方、リファンピシンで処理した場合は、数日以内に急速に自然発生的な耐性の増大が見られた（図６Ｂ）。

【0113】

ルグドゥニンの活性が静菌作用、殺菌作用のいずれであるかを調べるために、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００と１×ＭＩＣ濃度（１．５μｇ／ｍＬ）のペプチドを用いて殺菌アッセイを行った。図７に示すように、ＰＢＳ中で６時間のインキュベーションにより生菌数が少なくとも２対数減少したことから、ルグドゥニンが殺菌の作用機序を有することが明確に示された。

７．ルグドゥニンによる局所治療はｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおいて有効である

【0114】

ｉｎ ｖｉｔｒｏでルグドゥニンの効果が確認されたことから、次段階の課題はｉｎ ｖｉｖｏモデルの開発であった。そのために、いわゆるテープストリッピングモデルを採用した［Ｗａｎｋｅら（２０１３） Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ｓｋｉｎ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｉｓ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｂｙ ｂａｒｒｉｅｒ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｌｏｃａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ ２２：１５３−１５］。このモデルを作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの背部を剃毛し、傷が生じない程度に強くテープストリッピングを繰り返す（７回）ことにより、皮膚バリアを破壊した。バリアを破壊した皮膚にＳ．ａｕｒｅｕｓ Ｎｅｗｍａｎ（１５μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、１０^７ｃｆｕの接種原を含む）を塗布し、効率的にコロニーが形成されるように、塗布した箇所をフィンチャンバーで覆って２０時間放置した。ルグドゥニンは疎水性であるため、１００％ＤＭＳＯに溶解して１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、次いで、最終濃度が１００μｇ／ｍＬになるように１００％ごま油で希釈した。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの塗布から１８時間後、２４時間後および４２時間後のそれぞれの時点で、コロニーが形成されている箇所に、このルグドゥニン調製液を１５μＬ塗布した。コントロールには、１％ＤＭＳＯのみを含むごま油を塗布した。最後の塗布から３時間後にマウスを屠殺し、皮膚パンチ生検におけるＳ．ａｕｒｅｕｓの有無を調べた。本発明者らは、各サンプルを洗浄液画分（ＰＢＳを用いた洗浄ステップで除去された、緩く付着していた細菌）と、擦り取り画分（皮膚試料をメスで切開して皮膚の深部領域から露出させた細菌）とに分別した。図８では、４５時間後、洗浄液画分、擦り取り画分のいずれにおいてもルグドゥニン処置によりＳ．ａｕｒｅｕｓが減少していることが明確に示されており、ルグドゥニンが深部の組織に浸透していることが示唆される。

【0115】

好中性顆粒球による乳酸脱水素酵素の放出量を測定する予備試験において、好中性顆粒球をルグドゥニンと共に３時間インキュベートしたところ、ルグドゥニンの濃度が５０μｇ／ｍＬ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００のＭＩＣ値の３０倍を超える濃度に相当する）であっても、有意な細胞傷害は認められなかった（図９参照）。

８．ルグドゥニンの産生によりＳ．ａｕｒｅｕｓとの競争に勝つ

【0116】

抗菌物質は、その多くがプラスミドにコードされるリボソーム合成バクテリオシンであり、ヒトの微生物叢に存在する個々の菌株で産生されることが散発的に報告されている。しかし、このような化合物が微生物の適応性や微生物相動態においてどのような役割を果たしているかについては、ほとんど知られていない。Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８がＳ．ａｕｒｅｕｓとの競争に勝つための能力に、ルグドゥニンが寄与しているどうかを調べるために、固体寒天培地上でこの２つの菌種を共培養して、ルグドゥニン産生を亢進させ、それぞれの菌体数を３日間モニターした。

【0117】

図１０Ａに示すように、接種原に含まれるＳ．ａｕｒｅｕｓの菌数がＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの菌数の１０倍である場合でも、ルグドゥニンを産生するＩＶＫ２８野生株は効率的に増殖して、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖を凌駕した。３日後にＳ．ａｕｒｅｕｓの生菌が見られなかったことから、Ｓ．ａｕｒｅｕｓはＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓによって完全に死滅したことが示唆される。一方、ＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの１０倍の菌数で接種した場合でも、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの増殖がＩＶＫ２８ ΔｌｕｇＤの増殖を上回った（図１０Ｂおよび図１０Ｄ）。ただし、ΔｌｕｇＤがＳ．ａｕｒｅｕｓを排除する能力は、プラスミドに含まれるｌｕｇＤで補完することにより、大幅に回復した（図１０Ｃ）。これらのデータから、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓが効果的にＳ．ａｕｒｅｕｓを排除することが可能であること、およびルグドゥニン産生がこの特性に関与していることが明らかになった。

【0118】

鼻腔内保菌は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる侵襲性感染症の主要な危険因子であることが知られている。脊椎動物の鼻腔内におけるＳ．ａｕｒｅｕｓのｉｎ ｖｉｖｏコロニー形成をＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓが阻止できるかどうかを調べるために、コットンラット（Ｓ．ａｕｒｅｕｓによる鼻腔内コロニー形成の研究用に確立された動物モデル）の鼻腔内に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８野生株との混合物、またはＳ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ΔｌｕｇＤとの混合物を注入した。この３種の供試菌株をそれぞれ単独でコットンラットの鼻腔内に注入した場合、５日間の試験期間にわたって、それぞれ安定したコロニーを形成した（図１１）。しかし、２つの菌種を同時接種した場合、ＩＶＫ２８野生株と共にコロニーを形成させた動物から回収したＳ．ａｕｒｅｕｓの菌数は、ΔｌｕｇＤと共にコロニーを形成させた動物から回収したＳ．ａｕｒｅｕｓの菌数と比べると、顕著に少なかった（図１０Ｅ）。この結果から、ルグドゥニンの産生により、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのｉｎ ｖｉｖｏコロニー形成は効果的に阻止されることが分かる。

９．ヒトの鼻腔内にＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓが存在することは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓが存在しないことに関係している可能性が極めて高い

【0119】

Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのＳ．ａｕｒｅｕｓに対する作用の原理を確認するために、ヒトの鼻腔内におけるこの２つの菌種の共出現についての調査を行った。そのために、１８７名の有リスク患者の鼻腔内スワブを調べた。延べ６１名の被験者（３２．６％）においてＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成が確認され、延べ１７名の被験者（９．１％）においてＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓのコロニー形成が確認された。１０９名（５８．２％）からは、いずれの菌種も観察されなかった。これらの数値から、２．９７％（約６名）で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＳ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓとの両方のコロニーが形成されていることが予想される。しかし、実際には、２つの菌種が共にコロニーを形成していたのは１名のみであり、予想より有意に少なかった（図１２、ｐ＜０．０５）。このことから、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓの存在により、ルグドゥニンの分泌によってＳ．ａｕｒｅｕｓのコロニー形成が阻止されている可能性が示唆される。この仮定と一致して、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ保有者のスワブからブタノールで抽出した液ではルグドゥニンの質量（７８２．４５１３Ｄａ）が観測されたが、非保菌者のスワブからブタノールで抽出した液ではルグドゥニンの質量は観測されなかった（データ示さず）。

１０．ルグドゥニン誘導体の生物活性

【0120】

本発明者らは、新たに発見した抗菌活性のプロトタイプを示す抽象化学式または一般化学式を評価するために、ルグドゥニンの複数の化学的誘導体を合成した。合成した化学的誘導体を下掲の表に示す。合成したすべての誘導体を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ＵＳＡ３００に対する生物活性試験に供した。試験で得られた測定値を分類して、「＋」を用いて評価した。「＋」が付された誘導体は、対応する濃度範囲で細菌の増殖を完全に阻止した、すなわち細菌が全く増殖しなかったということである。分類は下表２から明らかである。

【表2】

【0121】

このように、「＋＋＋＋」で示される生物活性は、ＭＩＣが１．５〜１２．５μｇ／ｍＬであることを示す。ルグドゥニンは、最も高い生物活性を有する基準物質であり、ルグドゥニンのＭＩＣは１．５μｇ／ｍＬである。供試菌株であるＵＳＡ３００株を完全に死滅させる誘導体に加えて、有意に増殖を抑制する誘導体も合成した。そのような誘導体では、供試菌株の菌は完全には死滅しない。このような誘導体には、「◆」を付している。

【表3】

【表4】

【表5】

【表6】

【0122】

これらの実験により、本発明者らは、新たに発見した抗菌活性のプロトタイプを示す抽象化学式または一般化学式を同定することができた。その化学式を請求項１に示す。上記の実験で示されたように、置換基ｍ、ｎ、ＸおよびＹは、化合物の抗菌活性を失うことなく、上記範囲内で変更可能である。

９．まとめ

【0123】

本明細書において、本発明者らは、新規の殺菌性ペプチドである抗生物質ルグドゥニンの単離および構造の解明について報告する。ルグドゥニンは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびその他の病原菌種に対して活性を有するペプチドである。このペプチドに基づいて複数の誘導体を合成し、その抗菌活性の有無を調べた。その結果、本発明者らは、確認された活性を示すコア構造を明らかにした。

【0124】

単離した天然ペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ分離株（ＩＶＫ２８株）でリボソームを経由せずに製造されるペプチドであり、該菌株には、対応するＮＲＰＳオペロンが染色体にコードされている。しかし、１４の天然分離株を用いてゲノムデータベース分析およびＰＣＲ増幅実験を行ったところ、すべての供試菌株にＮＲＰＳオペロンは存在するものの、それらの菌株がすべて抗生物質活性を示すわけではないことが分かった（データ示さず）。動物の常在菌であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｏｒｕｍ ＷＳ２７３３株でミクロコクシンＰ１が産生されるという記載（Ｃａｒｎｉｏら（２００１） Ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ ｐｏｌｙｔｈｉａｚｏｌｅ ｃｌａｓｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｉｎ Ｐ１，ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｏｒｕｍ ＷＳ２７３３，ｉｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｎｏｎｒｉｂｏｓｏｍａｌｌｙ．Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６８：６３９０−６４０１）がある以外は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属で産生される抗菌性ＮＲＰＳペプチドは知られていない。ただし、ミクロコクシンＰ１は、もともとＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｖａｒｉａｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓにおいて同定されたものであるのに対して、ルグドゥニンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属で最初に見つかった新規の構造を有する属特異的な抗菌性ＮＲＰＳ産物である。Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓはヒト鼻腔から頻繁に単離可能であることから、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓはこの生息場所においてＳ．ａｕｒｅｕｓの競争者である可能性がある。本発明者らが行った共培養実験から、ルグドゥニンの産生は、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓにとって競争で非常に有利に働くことが明確に示された。すなわち、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ ＩＶＫ２８は、開始時は少数であっても、７２時間以内に培養物からＳ．ａｕｒｅｕｓを排除することが可能である。また、精製ルグドゥニンは、マウスモデル（テープストリッピングモデル）においてＳ．ａｕｒｅｕｓを排除する効果を有する。

【0125】

ルグドゥニンは、トリプトファン残基と、連続した３つのバリン残基（このうち１つは、バリノイル−チアゾリジン環構造の一部である）とを含むことから、新規でやや非凡な構造を示している。４つ目のバリン残基は、トリプトファンとチアゾリジン部分に挟まれている。Ｄ−バリンとＬ−バリンが交互に位置し、これらが高い割合で含まれる構造は、（イオノフォアとして機能する）大環状ラクトンである抗生物質バリノマイシンで見つかっているものの、バリノマイシンとルグドゥニンとは構造的に類似していない。これまでに、Ｌ−トリプトファン−チアゾール構造は、タンパク合成阻害薬Ａ２１４５９［Ｆｅｒｒａｒｉら（１９９６） Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ Ａ２１４５９ Ａ ａｎｄ Ｂ，ｎｅｗ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＩＩ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ） ４９：１５０−１５４］、Ｋｏｃｕｒｉｎ［Ｍａｒｔｉｎら（２０１３） Ｋｏｃｕｒｉｎ，ｔｈｅ ｔｒｕｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＰＭ１８１１０４，ａｎ ａｎｔｉ−ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ （ＭＲＳＡ） ｔｈｉａｚｏｌｙｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｋｏｃｕｒｉａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ．Ｍａｒ Ｄｒｕｇｓ １１：３８７−３９８］や７−メトキシ−トリプトファンを含むゼルコバマイシン［Ｔａｂａｔａ Ｎ，Ｔｏｍｏｄａ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｕｃｈｉｄａ Ｒ，Ｏｍｕｒａ Ｓ （１９９９） Ｚｅｌｋｏｖａｍｙｃｉｎ，ａ ｎｅｗ ｃｙｃｌｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｋ９６−０６７０．ＩＩ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｎｔｉｂｉｏｔ （Ｔｏｋｙｏ） ５２：３４−３９］で報告されている。しかしながら、これらの抗生物質とルグドゥニンとの間にそれ以外の類似性はないため、ルグドゥニンの標的は推測の域を出ない。ルグドゥニンは殺菌作用を示すことから、ルグドゥニンの作用機序は、静菌作用を示すその他の報告されたペプチドとは異なる可能性がある。

【0126】

精製ペプチドおよびその誘導体を菌の排除を目的として使用することに加えて、予防的用途でルグドゥニン産生菌株を使用して、例えば、ヒト鼻腔内のＳ．ａｕｒｅｕｓコロニー形成を抑制することも可能かもしれない。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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