特許 6985384 弱毒変異型ジカウイルスを含むワクチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6985384

(24)【登録日】2021年11月29日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】弱毒変異型ジカウイルスを含むワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/40 20060101AFI20211213BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 39/12 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20211213BHJP

   C07K 14/18 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 7/04 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211213BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/40ZNA

   A61P31/14

   A61P37/04

   A61K39/12

   A61K35/76

   C07K14/18

   C12N7/04

   C12N7/01

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

【請求項の数】13

【全頁数】32

(21)【出願番号】特願2019-520486(P2019-520486)

(86)(22)【出願日】2017年6月22日

(65)【公表番号】特表2019-520090(P2019-520090A)

(43)【公表日】2019年7月18日

(86)【国際出願番号】EP2017065462

(87)【国際公開番号】WO2017220748

(87)【国際公開日】20171228

【審査請求日】2020年3月25日

(31)【優先権主張番号】16305764.9

(32)【優先日】2016年6月23日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】591100596

【氏名又は名称】アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル

(73)【特許権者】

【識別番号】518454438

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ラ・レユニオン・サン・ドニ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＡ ＲＥＵＮＩＯＮ ＳＡＩＮＴ ＤＥＮＩＳ

(73)【特許権者】

【識別番号】511227015

【氏名又は名称】アンスティテュ・ドゥ・ルシェルシュ・プール・ル・デヴェロップマン

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＤＥ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＰＯＵＲ ＬＥ ＤＥＶＥＬＯＰＰＥＭＥＮＴ

(73)【特許権者】

【識別番号】595040744

【氏名又は名称】サントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィク

【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＥ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＤＥ ＬＡ ＲＥＣＨＥＲＣＨＥ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＱＵＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】特許業務法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】デプレ，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】ガデア，ジル

(72)【発明者】

【氏名】マヴィンギ，パトリック

(72)【発明者】

【氏名】ヴィラナイケン，ヴィルトリス

【審査官】 中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１９−５２００５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Antivir Chem Chemother, 2015, vol. 24, no. 3-4, pp. 118-126

【文献】 ACS Infect Dis, 2016 Mar 3, vol. 2, no. 3, pp. 170-172

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２を有するアミノ酸配列からなるタンパク質Ｅを含む、弱毒変異型ジカウイルス。

【請求項2】

流行株の構造タンパク質Ｃ及びｐｒＭ並びに流行株の非構造タンパク質を含む、請求項１記載の弱毒変異型ジカウイルス。

【請求項3】

流行株の構造タンパク質Ｃ及びｐｒＭ並びに土着株の非構造タンパク質を含む、請求項１記載の弱毒変異型ジカウイルス。

【請求項4】

配列番号５によって示されるアミノ酸配列からなるポリタンパク質をコードしているゲノム配列によって特徴付けられる、請求項１記載の弱毒変異型ジカウイルス。

【請求項5】

配列番号６によって示されるゲノム配列によって特徴付けられる、請求項１記載の弱毒変異型ジカウイルス。

【請求項6】

請求項１記載の弱毒変異型ジカウイルスをコードしている単離された核酸分子。

【請求項7】

配列番号６によって示される核酸配列を含む、請求項６記載の単離された核酸分子。

【請求項8】

請求項６記載の核酸分子を含む宿主細胞。

【請求項9】

請求項１記載の弱毒変異型ジカウイルスを含むワクチン組成物。

【請求項10】

ある量の請求項１記載の弱毒生ジカウイルス又はある量の請求項１記載の不活化弱毒ジカウイルスを含む、請求項９記載のワクチン組成物。

【請求項11】

治療有効量の請求項９記載のワクチン組成物を含む、被験者におけるジカウイルスに対する免疫応答を惹起するための医薬組成物。

【請求項12】

ワクチン組成物が妊婦に投与される、請求項１１記載の医薬組成物。

【請求項13】

ワクチン組成物が出産可能な年齢の女性に投与される、請求項１１記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野：
本発明は、弱毒変異型ジカウイルスを含むワクチン組成物に関する。

【0002】

発明の背景：
ジカウイルスは、黄熱病を監視していたネットワークを通して１９４７年にウガンダでサルにおいて初めて同定された蚊媒介性のフラビウイルスである。それは後に１９５２年にウガンダ及びタンザニア連合共和国においてヒトにおいて同定された。ジカウイルス疾患の流行は、アフリカ、アメリカ、アジア、及び太平洋において記録されている。１９６０年代から１９８０年代まで、ヒトへの感染は、アフリカ及びアジアにわたって見られ、典型的には軽度な病気を伴っていた。ジカ感染によって引き起こされた疾患の最初の大流行は、２００７年にヤップ島（ミクロネシア連邦）から報告された。２０１５年７月にブラジルは、ジカウイルス感染とギランバレー症候群との間の関連を報告した。２０１５年１０月にブラジルは、ジカウイルス感染と小頭症との間の関連を報告した。ジカウイルスは主に、熱帯地域において感染したヤブカ属の蚊、主にネッタイシマカの咬傷を通して人々に伝染する。ヤブカ属の蚊は通常は日中にかみつき、ピークは早朝及び午後遅く／夕方である。ジカウイルスを伝染するこの蚊は、チクングニア熱及び黄熱病を伝染するのと同じ蚊である。ジカウイルスの性行為感染も起こり得る。輸血などの他の感染様式も調査されている。ジカウイルス疾患は通常軽度であり、特別な処置を全く必要としない。ジカウイルスで病気になったヒトは、沢山休養をとり、十分な水分を飲み、一般的な医薬品で疼痛及び発熱を処置するべきである。症状が悪化した場合には、治療及び診察を受けるべきである。現在、利用可能なワクチンは全くない。ＷＨＯの専門家は、妊婦及び出産可能な年齢の女性に使用するのに安全である、弱毒ワクチン及び他の生ではないワクチンを開発することが優先事項であると示唆している。

【0003】

発明の要約：
本発明は、弱毒変異型ジカウイルスを含むワクチン組成物に関する。特に、本発明は特許請求の範囲によって定義される。

【0004】

発明の詳細な説明：
本発明は、特に妊婦にワクチン接種するのに安全であるという利点を提供する弱毒変異型ジカウイルスに関する。特に、本発明者らは、ギランバレー症候群の原因となる自己抗体の生成を妨げるであろう、流行株のＥタンパク質上のＮ−グリコシル化部位を消失させる、非常に特異的な位置に突然変異を導入した。さらに本発明者らは、高力価のウイルスを産生する能力に影響を及ぼすことなく、細胞変性作用の劇的な減少をもたらす、ウイルスの追加の突然変異を作製した。

【0005】

したがって、本発明の第一の目的は、１５２位、１５６位、又は１５８位の少なくとも１つのアミノ酸残基が突然変異している、流行株のタンパク質Ｅを含む弱毒変異型ジカウイルスに関する。

【0006】

本明細書において使用する「弱毒化」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、特により病原性を低減させたウイルスを指す。特に本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、非病原性である。本明細書において使用する「非病原性」という用語は本明細書において、非病原性であること、又は病気、特にギランバレー症候群を誘発することができないことを意味する。

【0007】

本明細書において使用する「ジカウイルス」という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有する。ジカウイルスは、５’ＮＣＲ及び３’ＮＣＲとして知られる領域にフランキングしている２つの非コード領域を有する、１０７９４塩基長のプラス鎖の一本鎖ＲＮＡ分子である。ジカウイルスのオープンリーディングフレームはポリタンパク質をコードし、これは続いて切断されてキャプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、エンベロープ（Ｅ）及び非構造タンパク質（ＮＳ）となる。Ｅタンパク質は、ビリオン表面の大半を構成し、宿主細胞との結合及び膜融合などの複製の局面に関与する。ＮＳ１、ＮＳ３及びＮＳ５は、大型で高度に保存されたタンパク質であるが、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ４Ａ及びＮＳ４Ｂタンパク質は、小型で疎水性のタンパク質である。３’ＮＣＲに位置するのは、翻訳、ＲＮＡのパッケージング、環状化、ゲノム安定化、及び認識において役割を果たし得る４２８ヌクレオチドである。３’ＮＣＲはループ構造を形成し、５’ＮＣＲはメチル化ヌクレオチドキャップ又はゲノムに連結したタンパク質を介した翻訳を可能とする。

【0008】

「流行株」という用語は、流行性感染の原因となるジカ株を指す。特に、流行株は、配列番号１によって示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一率を有するタンパク質Ｅを有することによって特徴付けられる。いくつかの実施態様では、ジカ流行株は、ジカ株ＢｅＨ８１９０１５（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＫＵ３６５７７８）を指す。

【0009】

したがって、いくつかの実施態様では、本発明は、１５２位、１５６位又は１５８位の少なくとも１つのアミノ酸残基が突然変異している、配列番号１に対して少なくとも９８％の同一率を有するアミノ酸配列からなるタンパク質Ｅを含む弱毒変異型ジカウイルスに関する。

【0010】

本発明によると、第二のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％の同一率を有する第一のアミノ酸配列とは、第一の配列が、第二のアミノ酸配列に対して９８；９９又は１００％の同一率を有することを意味する。配列同一率は頻繁には、同一率（又は類似率又は相同率）に関して測定され；比率が高くなればなるほど、２つの配列はより類似している。比較のための配列のアラインメント法は当技術分野において周知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:2444, 1988; Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153, 1989; Corpet et al. Nuc. Acids Res., 16:10881-10890, 1988; Huang et al., Comp. Appls Biosci., 8:155-165, 1992；及びPearson et al., Meth. Mol. Biol., 24:307-31, 1994に記載されている。Altschul et al., Nat. Genet., 6:119-129, 1994は、配列アラインメント法及び相同性計算の詳細な考察を提示している。例えば、アラインメントツールのＡＬＩＧＮ（Myers and Miller, CABIOS 4:11-17, 1989）又はＬＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman, 1988）を使用して、配列比較を行ない得る（Internet Program（登録商標）1996、W. R. Pearson及びバージニア大学、fasta20u63、バージョン2.0u63、発売日１９９６年１２月）。ＡＬＩＧＮは完全な配列を互いに比較し、一方、ＬＦＡＳＴＡは局所的に類似した領域を比較する。これらのアラインメントツール及びそれらのそれぞれの指導書は、例えば、インターネット上のＮＣＳＡウェブサイトにおいて入手可能である。あるいは、約３０アミノ酸より大きなアミノ酸配列の比較のために、Ｂｌａｓｔ２配列関数を、デフォールトパラメーター（ギャップ存在コストは１１、及び１残基あたりのギャップコストは１）に設定されたデフォールトＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて使用することができる。短いペプチド（約３０アミノ酸より短い）をアラインさせる場合、アラインメントは、Ｂｌａｓｔ２配列関数を使用して、デフォールトパラメーター（オープンギャップ９、エクステンションギャップ１のペナルティ）に設定されたＰＡＭ３０マトリックスを使用して実施されるべきである。ＢＬＡＳＴ配列比較システムは、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトから入手可能である；Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, 1990; Gish. & States, Nature Genet., 3:266-272, 1993; Madden et al. Meth. Enzymol., 266:131-141, 1996; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997；及びZhang & Madden, Genome Res., 7:649-656, 1997も参照されたい。

【0011】

本明細書において使用する突然変異という用語は当技術分野におけるその一般的な意味を有し、置換、欠失、又は挿入を指す。「置換」という用語は、特定の位置における特定のアミノ酸残基が除去され、別のアミノ酸残基が同位置に挿入されることを意味する。「欠失」という用語は、特定のアミノ酸残基が除去されることを意味する。「挿入」という用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、特定のアミノ酸残基の前又は後に挿入され、より具体的には１つ以上、好ましくは１つ又は数個のアミノ酸残基を、特定のアミノ酸残基のカルボキシル基又はアミノ基に結合させることを意味する。

【0012】

いくつかの実施態様では、１５２位、１５６位、又は１５８位のアミノ酸残基が置換されている。いくつかの実施態様では、１５２位のイソロイシン残基（Ｉ）がトレオニン残基（Ｔ）によって置換されている。いくつかの実施態様では、１５６位のトレオニン残基（Ｔ）がイソロイシン残基（Ｉ）によって置換されている。いくつかの実施態様では、ヒスチジン残基（Ｈ）がチロシン残基（Ｙ）によって置換されている。

【0013】

いくつかの実施態様では、タンパク質Ｅは、２つの突然変異を含む。いくつかの実施態様では、該タンパク質は、１５２位のイソロイシン残基（Ｉ）がトレオニン残基（Ｔ）によって置換され、１５６位のトレオニン残基（Ｔ）がイソロイシン残基（Ｉ）によって置換されている、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、タンパク質Ｅは３つの突然変異を含む。いくつかの実施態様では、タンパク質Ｅは、１５２位のイソロイシン残基（Ｉ）がトレオニン残基（Ｔ）によって置換され、１５６位のトレオニン残基（Ｔ）がイソロイシン残基（Ｉ）によって置換され、ヒスチジン残基（Ｈ）がチロシン残基（Ｙ）によって置換されている、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、タンパク質Ｅは、配列番号２によって示されるアミノ酸配列からなる。

【0014】

いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、流行株の構造タンパク質Ｃ及びｐｒＭを含む。

【0015】

いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、流行株の非構造タンパク質を含む。

【0016】

いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、流行株の構造タンパク質Ｃ及びｐｒＭ、並びに流行株の非構造タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、配列番号３によって示されるアミノ酸配列からなるポリタンパク質をコードしているゲノム配列によって特徴付けられる。いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、配列番号４によって示されるゲノム配列によって特徴付けられる。

【0017】

いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、土着株の非構造タンパク質を含む。本明細書において使用する「土着株」という用語は、アフリカを起源とするジカ株を指す。いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、ジカ株ＭＲ７６６−ＮＩＩＤ^＊（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＬＣ００２５２０）の非構造タンパク質を含む。

【0018】

いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、流行株の構造タンパク質Ｃ及びｐｒＭ、並びにジカ株ＭＲ７６６−ＮＩＩＤ^＊（Ｇｅｎｂａｎｋ番号ＬＣ００２５２０）の非構造タンパク質を含む。いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、配列番号５によって示されるアミノ酸配列からなるポリタンパク質をコードしているゲノム配列によって特徴付けられる。いくつかの実施態様では、本発明の弱毒変異型ジカウイルスは、配列番号６によって示されるゲノム配列によって特徴付けられる。

【0019】

本発明のさらなる目的は、本発明の弱毒変異型ジカウイルスをコードしている単離された核酸分子に関する。

【0020】

いくつかの実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、本発明の変異型タンパク質Ｅをコードしている核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号７によって示される核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号４によって示される核酸配列を含む。いくつかの実施態様では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号６によって示される核酸配列を含む。

【0021】

本発明の単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術による本発明の弱毒変異型ジカウイルスの生成に特に適している。典型的には、本発明の単離された核酸分子を標準的なタンパク質発現ベクターにクローニングし、これを使用して適切な宿主細胞に感染させる。次いで、宿主細胞を培養し、これにより所望のウイルスを発現させ、これを所望の程度まで精製し、適切なワクチン製品へと製剤化することができる。

【0022】

したがって、本発明のさらなる目的は、本発明の核酸分子を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は典型的には、ウイルスを増殖させるのに適した細胞株である。適切な細胞株としては、哺乳動物細胞、例えばＶｅｒｏ細胞、ＡＧＭＫ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＣＯＳ−１細胞、又はＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＣＶ−１細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、初代細胞株、例えば胎仔アカゲザル肺（ＦＲｈＬ−２）細胞、ＢＳＣ−１細胞、及びＭＲＣ−５細胞、又はヒト二倍体線維芽細胞、並びに、トリ細胞、ニワトリ又はアヒル胚由来細胞株、例えばＡＧＥ１細胞、及び初代ニワトリ胚線維芽細胞、及び蚊細胞株、例えばＣ６／３６が挙げられる。培養液に、細胞の増殖を支持することのできる培地を供給する。宿主細胞を、所望のウイルス力価に到達するまで、培養液中で数日間維持する。場合により、細胞を、連続灌流系において維持し、これからウイルスを数日間又はそれ以上にわたり断続的に又は連続的に得ることができる。非連続培養条件下では、感染から３〜７日間後までに少なくとも約１０^６〜１０^７のＰＦＵ/mlのウイルス力価が望ましい。ウイルスを回収するために、ウイルスを、低速遠心分離をはじめとする当技術分野において公知である一般的な方法によって、又はろ過によって収集する。該ウイルス（群）を濃縮するための方法は、当業者の技能範囲内であり、これには例えば、超ろ過、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いての沈降が含まれる。ウイルスの精製法は当業者には公知であり、典型的には、連続的な若しくは多段階のスクロース勾配、サイズ排除カラム、イオン交換カラム、吸着カラム若しくはアフィニティカラムを使用したカラムクロマトグラフィーによる精製、又はポリマー中で二相系若しくは多相系に分配することによる精製、及びその任意の組合せが含まれる。ウイルス陽性画分をアッセイするための方法としては、プラークアッセイ、赤血球凝集（ＨＡ）アッセイ、及び／又は抗原アッセイ、例えばイムノアッセイが挙げられる。

【0023】

いくつかの実施態様では、本発明の収集された弱毒変異型ジカウイルスを不活化させている。本明細書において使用する「不活化」という用語は、例えばインビトロで複製させ、その後、もはや複製することができないように化学的手段又は物理的手段を使用して死滅させたウイルスを包含する。例えば、弱毒生ウイルスは、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、若しくは過酸化水素などの化学物質を使用して、又は紫外線照射を使用して、又は、２つ以上の不活化工程の組合せ（これは同じであっても異なっていてもよく、例えばホルムアルデヒドとＢＰＬ、ホルムアルデヒドとＵＶ照射、ＢＰＬとＵＶ照射、過酸化水素とＢＰＬ、過酸化水素とＵＶ照射などの任意の組合せ）を使用することによって不活化させることができる。

【0024】

本発明のさらなる目的は、本発明の弱毒ジカウイルスを含むワクチン組成物に関する。

【0025】

本明細書において使用する「ワクチン組成物」という用語は、ジカウイルスなどの病原体に対する特異的な免疫応答を惹起することのできる、ヒトへの投与に適した組成物である。

【0026】

本発明のワクチン組成物は、ある量の本発明の弱毒生ジカウイルス又はある量の本発明の不活化弱毒ジカウイルスを含む。

【0027】

本発明のワクチン組成物はまた、免疫応答を惹起又は増強することのできる１つ以上の追加の成分、例えば賦形剤、担体及び／又はアジュバントを含んでいてもよい。「アジュバント」は、物質の非存在下における抗原の投与と比較して、抗原特異的免疫応答の発生を増強する該物質である。一般的なアジュバントとしては、抗原を吸着させている鉱物（又は鉱物の塩、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ヒドロキシリン酸アルミニウム）の懸濁液を含む、アルミニウム含有アジュバントが挙げられる。本開示の内容では、アジュバントは、アルミニウム（ミョウバン）非含有アジュバントであり、これはこのようなアルミニウム塩が全く存在しない下で製剤化される。ミョウバン非含有アジュバントとしては、油性及び水性エマルション、例えば油中水滴型エマルション、及び水中油滴型エマルション（及びその変種、例えばダブルエマルション及び可逆性エマルション）、リポサッカリド、リポポリサッカリド、免疫刺激性核酸（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８、及びＴＬＲ９アゴニスト）、並びにこのような成分の様々な組合せが挙げられる。薬学的に許容される担体及び賦形剤は周知であり、当業者によって選択され得る。例えば、担体又は賦形剤は好ましくは緩衝液を含み得る。場合により、担体又は賦形剤はまた、溶解度及び／又は安定性を安定化させる少なくとも１つの成分を含有している。可溶化剤／安定化剤の例としては、洗浄剤、例えば、ラウロイルサルコシン及び／又はモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンが挙げられる。代替的な可溶化剤／安定化剤としては、アルギニン、及びガラス形成ポリオール（例えばスクロース、トレハロースなど）が挙げられる。数多くの薬学的に許容される担体及び／又は薬学的に許容される賦形剤が当技術分野において公知であり、例えば、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 5th Edition（1975）に記載されている。したがって、選択された投与経路による被験者への送達に適した製剤を作製するのに適した賦形剤及び担体は当業者によって選択され得る。適切な賦形剤としては、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ−プロリン、非界面活性剤型スルホベタイン、グアニジン塩酸塩、尿素、トリメチルアミンオキシド、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、及び他の二価陽イオンに関連した塩、ジチオトレイトール、ジチオエリトロール、及びβ−メルカプトエタノールが挙げられるがこれらに限定されない。他の賦形剤は、洗浄剤（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、トリトンＸ−００、ＮＰ−４０、エンピジェン（Empigen）ＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、ツイッタージェント（Zwittergent）３−０８、ツイッタージェント３−０、ツイッタージェント３−２、ツイッタージェント３−４、ツイッタージェント３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む）であり得る。ヒト被験者への投与用を含む、ワクチン組成物の調製は一般的には、Pharmaceutical Biotechnology, Vol. 61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach、Powell and Newman編、Plenum Press, 1995、New Trends and Developments in Vaccines、Voller et al.編, University Park Press, Baltimore, Md., U.S.A. 1978に記載されている。リポソーム内への封入は、例えば、Fullertonによって、米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の抱合は、例えば、Likhiteによって米国特許第４，３７２，９４５号に、及びArmor et al.によって米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。典型的には、ワクチン組成物の各用量における抗原の量は、典型的な被験者において有意な有害な副作用を及ぼすことなく免疫防御応答を誘導する量として選択される。この内容での免疫防御は必ずしも、感染からの完全な防御を意味せず；症状又は疾患、特に、ウイルスに関連した重度の疾患からの防御を意味する。抗原の量は、どの具体的な免疫源が使用されるかに応じて変更され得る。一般的には、ヒトへの各用量は、０．０５〜１００μgの不活化ウイルス、例えば約０．１μg（例えば０．１、０．２、０．３、０．４又は０．５μg）〜約５０μg、例えば約０．５μg〜約３０μg、例えば約１μg、約２μg、約３μg、約４μg、約５μg、約１０μg、約１５μg、約２０μg、又は約２５μgの不活化ジカウイルスの各株を含むであろうことが予想される。典型的には、ワクチン組成物は、液剤又は懸濁剤のいずれかとしての注射液として調製され；注射前に液体中液剤又は液体中懸濁剤とするのに適した固形剤が調製されてもよい。

【0028】

本発明のさらなる目的は、治療有効量の本発明のワクチン組成物を被験者に投与する工程を含む、被験者においてジカウイルスに対する免疫応答を惹起するための方法に関する。

【0029】

いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、成人又は乳児に投与される。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、妊婦に投与される。いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、出産可能な年齢の女性に投与される。いくつかの実施態様では、被験者は、事前にジカウイルスに曝されていた。

【0030】

いくつかの実施態様では、本発明のワクチン組成物は、ジカウイルス感染及び／又はジカウイルスにより誘発された疾患の予防、寛解、若しくは治療に特に適している。

【0031】

ワクチン組成物は、様々な経路によって投与され得、最も一般的には、ワクチン組成物は、筋肉内、皮下、又は皮内投与経路によって送達される。一般的には、ワクチン組成物は、中和抗体の生成及び防御に有効な用量で、皮下、皮内、又は筋肉内に投与され得る。ワクチンは、投与製剤に適合した方法で、予防的及び／又は治療的に有効な量で投与される。投与される予定の量は、一般的には１用量あたり０．０５〜１００μgの範囲内であるが、これは処置される予定の被験者、被験者の免疫系が抗体を合成する能力、及び所望の防御度に依存する。投与される予定のワクチンの正確な量は施行者の判断に依存し得、各被験者に特有であり得る。

【0032】

ワクチン組成物は、１回の投薬の計画で、又は好ましくは複数回の投薬の計画で投与され得、ワクチン接種の初回クールは、１〜１０回の分割用量、続いて免疫応答を維持及び又は強化するのに必要とされるその後の時間間隔（例えば２回目の用量については１〜４カ月目）で投与される他の用量、並びに必要であれば数か月又は数年後にその後の用量（群）を用いるものであり得る。投薬計画はまた少なくとも部分的には、被験者の必要性によって決定され、施行者の判断に依存するだろう。適切な免疫化計画の例としては、１回目の用量、続いて初回の免疫化の７日後から６カ月後までに２回目の用量、及び１か月後から２年後までに任意選択の３回目の用量、又は、防御免疫を付与すると予想されるウイルス中和抗体の力価を惹起するのに十分な他の計画が挙げられる。ワクチン組成物を用いてのジカウイルスに対する防御免疫の発生は妥当には、１〜３回の接種からなる初回の免疫化クールの後に期待され得る。これらは、満足のいく防御免疫レベルを維持するために設計された間隔（例えば２年間毎）におけるブースターによって補充され得る。

【0033】

本発明はさらに、以下の図面及び実施例によって説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面はいずれにしても、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【図面の簡単な説明】

【0034】

【図1】図１は、ジカウイルスの様々なクローンを示す。

【図2】図２は、クローンＺＩＫＡＬＩＶａｘの詳細を示す。

【図3】ＺＩＫＶクローンＡ〜Ｆに感染させたＶｅｒｏ細胞におけるＥタンパク質のプロセシング。抗フラビウイルスＥｍＡｂ ４Ｇ２を使用したＺＩＫＶに感染させたＶｅｒｏ細胞に由来する細胞抽出物に対するイムノブロットアッセイ。（非還元条件下における４〜１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。

【図4】ＺＩＫＶクローンＡ〜Ｆに７２時間かけて感染させたＶｅｒｏ細胞におけるＣＰＥ。

【図5】ＺＩＫＶクローンＡ〜Ｆに感染させたＶｅｒｏ細胞からのＬＤＨの漏出。

【図6】ＺＩＫＶクローンＡ〜Ｆに感染させたＶｅｒｏ細胞への子孫ウイルスの感染。

【0035】

実施例：
ジカウイルスの様々なクローン（Ａ〜Ｆ）を作製した（図１）。クローンＦは「ＺＩＫＡＬＩＶａｘ」と命名され、図２に詳述されている。

【0036】

１５２位、１５６位、及び１５８位に導入された突然変異は、Ｅタンパク質上のＮ−グリコシル化部位を消失させる（図３）。

【0037】

様々なクローンの細胞変性作用を試験した。簡潔に言えば、Ｖｅｒｏ細胞を、１細胞あたり０．１ＰＦＵのＭＯＩで様々なクローンに感染させ、細胞変性作用を、光学顕微鏡によって感染から７２時間後に観察した。図４に示されるように、ＺＩＫＡＬＩＶａｘは、ウイルスの流行株及び土着株を用いて観察されたものとは対照的に細胞変性作用はない。結果は、ＬＤＨ遊離アッセイで確認された。簡潔に言えば、Ｖｅｒｏ細胞を、１細胞あたり０．１ＰＦＵのＭＯＩで様々なクローンに感染させ、細胞上清中のＬＤＨ活性を、比色測定ＬＤＨ定量アッセイキットを使用して決定した。結果を図５に示す。

【0038】

次いで、様々なクローンの生成を、プラーク形成アッセイで決定した。簡潔に言えば、Ｖｅｒｏ細胞（１×１０^５個/ウェル）を４８ウェル培養プレートに播種した。５％熱不活化ＦＢＳの補充された培養培地中でのウイルス試料の１０倍連続希釈液を２通り調製し、０．１mLの各希釈液を細胞に加えた。プレートを３７℃で２時間インキュベートした。０．８％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）の補充された培養培地 ０．１mlを各ウェルに加え、その後、３７℃で４日間インキュベートした。ＣＭＣのオーバーレイを除去し、細胞をまず、３．７％ＰＦＡを用いて１０分間かけて固定し、次いで２０％エタノール中０．５％クリスタルバイオレットを用いて染色した。プラークを計数し、１mLあたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ/mL）として表現した。表１に示されるように、ＺＩＫＡＬＩＶａｘの子孫の生成は、流行株ウイルス及び土着株ウイルスを用いて観察された生成と比較して、有意に増加している。図６は、ＺＩＫＶクローンＡ〜Ｆに感染させたＶｅｒｏ細胞における子孫ウイルスの感染を示す。

【0039】

【表1】

【0040】

結論付けると、ＺＩＫＡＬＩＶａｘは、細胞変性作用を伴うことなく非常に高いレベルで産生され得る。さらに、Ｎ−グリコシル化が存在しないことにより、ギランバレー症候群の原因となる自己抗体の生成が妨げられるだろう。したがって、このクローンは、弱毒ワクチンの生成のための非常に良い候補を示す。

【0041】

配列：
配列番号１ ＺＩＫＶ株ＢｅＨ８１９０１５（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号ＫＵ３６５７７８．１）由来のＥ糖タンパク質。

【化1】

【0042】

配列番号２ ＺＩＫＶＢＲ１５−ＭＣの突然変異体［Ｅ−Ｉ１５２Ｔ、Ｅ−Ｔ１５６Ｉ、Ｅ−Ｈ１５８Ｙ］のＥ配列

【化2】

【0043】

配列番号３ キメラＺＩＫＶＢＲ１５−ＭＣ突然変異体［Ｅ−Ｉ１５２Ｔ、Ｅ−Ｔ１５６Ｉ、Ｅ−Ｈ１５８Ｙ］のポリタンパク質配列（３，４２３アミノ酸）

【化3】

【0044】

配列番号４ キメラＺＩＫＶＢＲ１５−ＭＣ突然変異体［Ｅ−Ｉ１５２Ｔ、Ｅ−Ｔ１５６Ｉ、Ｅ−Ｈ１５８Ｙ］のゲノム配列（１０，８０７ヌクレオチド）

【化4】

【0045】

配列番号５ キメラＺＩＫＡＬＩＶａｘウイルスのポリタンパク質配列（１０，８０７ヌクレオチド；３，４２３アミノ酸）

【化5】

【0046】

配列番号６ キメラＺＩＫＡＬＩＶａｘウイルスのゲノム配列（１０，８０７ヌクレオチド；３，４２３アミノ酸）

【化6】

【0047】

配列番号７ キメラＺＩＫＡＬＩＶａｘウイルス由来のＥ遺伝子の配列（１５１２ヌクレオチド；５０４アミノ酸）

【化7】

【0048】

参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照によって本明細書に組み入れられる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]