特許 6985684 細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6985684

(24)【登録日】2021年11月30日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラム

(51)【国際特許分類】

   G06T 7/00 20170101AFI20211213BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20211213BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20211213BHJP

   C12Q 1/04 20060101ALI20211213BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20211213BHJP

【ＦＩ】

   G06T7/00 630

   C12M1/00 A

   C12M1/34 B

   C12Q1/04

   G01N33/48 M

【請求項の数】13

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2018-568608(P2018-568608)

(86)(22)【出願日】2018年2月15日

(86)【国際出願番号】JP2018005303

(87)【国際公開番号】WO2018151223

(87)【国際公開日】20180823

【審査請求日】2020年9月14日

(31)【優先権主張番号】特願2017-27247(P2017-27247)

(32)【優先日】2017年2月16日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(73)【特許権者】

【識別番号】509349141

【氏名又は名称】京都府公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100124800

【弁理士】

【氏名又は名称】諏澤 勇司

(74)【代理人】

【識別番号】100156395

【弁理士】

【氏名又は名称】荒井 寿王

(72)【発明者】

【氏名】田中 求

(72)【発明者】

【氏名】山本 暁久

(72)【発明者】

【氏名】上野 盛夫

(72)【発明者】

【氏名】羽室 淳爾

(72)【発明者】

【氏名】木下 茂

(72)【発明者】

【氏名】田中 寛

(72)【発明者】

【氏名】戸田 宗豊

(72)【発明者】

【氏名】外園 千恵

【審査官】 山田 辰美

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１６−０５９３０６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−２３８８０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５２９１８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１５−５３３２１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５２１９２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５０２２３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０１６３７１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１０８０６９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１６−５１４９６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−２２２０７３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１１８０４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５１７４５９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０６Ｔ ７／００−７／９０

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｃ１２Ｍ １／３４

Ｃ１２Ｑ １／０４

Ｇ０１Ｎ ３３／４８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

複数の細胞を含む細胞集団の品質を、前記細胞の集団秩序から評価する細胞評価方法であって、
前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む、前記細胞の集団秩序に基づく指標を算出する指標算出ステップと、
前記指標算出ステップで算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価ステップと、を含み、
前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められる、細胞評価方法。

【請求項2】

複数の細胞を含む細胞集団の品質を、前記細胞の集団秩序から評価する細胞評価方法であって、
前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の全てを含む、前記細胞の集団秩序に基づく指標を算出する指標算出ステップと、
前記指標算出ステップで算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価ステップと、を含む、細胞評価方法。

【請求項3】

前記平均距離は、複数の前記細胞の重心の動径分布関数をボルツマン分布で近似して求めたポテンシャル関数の極小位置に対応し、
前記ばね定数は、前記ポテンシャル関数の二次微分に対応する、請求項１又は２に記載の細胞評価方法。

【請求項4】

複数の細胞を含む細胞集団の品質を、前記細胞の集団秩序から評価する細胞評価方法であって、
前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数を含む、前記細胞の集団秩序に基づく指標を算出する指標算出ステップと、
前記指標算出ステップで算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価ステップと、を含む、細胞評価方法。

【請求項5】

前記六角格子秩序変数は、複数の前記細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められる、請求項１〜４の何れか一項に記載の細胞評価方法。

【請求項6】

前記指標の値及びその誤差成分から定まるガウス分布の重なり度合いを表すオーバラップ係数を算出するオーバラップ係数算出ステップを含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の細胞評価方法。

【請求項7】

前記指標を変数としてＲＯＣ解析を行うＲＯＣ解析ステップを含む、請求項１〜５の何れか一項に記載の細胞評価方法。

【請求項8】

前記細胞は、六角格子の二次元最密充填構造を有する、請求項１〜７の何れか一項に記載の細胞評価方法。

【請求項9】

前記細胞は、角膜内皮細胞、上皮系細胞、肝細胞、又はこれらの何れかの培養細胞である、請求項１〜８の何れか一項に記載の細胞評価方法。

【請求項10】

前記評価ステップでは、前記指標算出ステップで算出した前記指標に基づいて、前記撮像画像を撮像した時点よりも将来においての前記細胞集団の品質を予測する、請求項１〜９の何れか一項に記載の細胞評価方法。

【請求項11】

薬剤候補物質における前記細胞集団の評価に用いられる、請求項１〜１０の何れか一項に記載の細胞評価方法。

【請求項12】

複数の細胞を含む細胞集団の品質を、前記細胞の集団秩序から評価する細胞評価装置であって、
前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む、前記細胞の集団秩序に基づく指標を算出する指標算出部と、
前記指標算出部で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価部と、を含み、
前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められる、細胞評価装置。

【請求項13】

複数の細胞を含む細胞集団の品質を、前記細胞の集団秩序から評価する細胞評価プログラムであって、
前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む、前記細胞の集団秩序に基づく指標を算出する指標算出処理と、
前記指標算出処理で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価処理と、をコンピュータに実行させ、
前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められる、細胞評価プログラム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明の一側面は、細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラムに関する。

【背景技術】

【0002】

従来、細胞集団の品質評価については、細胞マーカーによる識別又は位相差顕微鏡画像の目視に依拠している。また、例えば特許文献１には、拡大検体画像内における細胞のアスペクト比や配列等の特徴量を算出し、この特徴量に基づいて細胞集団を評価する技術が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１５−１３０８０６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

上記従来技術では、前述のように、アスペクト比等を指標として細胞集団を評価する場合があるが、指標と品質との相関（裏付け）はなく、指標の定量的な意味付けは十分になされていない。そのため、細胞集団の品質を定量的に評価できない可能性がある。

【0005】

そこで、本発明の一側面は、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能な細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラムを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一側面に係る細胞評価方法は、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価方法であって、細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出ステップと、指標算出ステップで算出した指標に基づいて、細胞集団を評価する評価ステップと、を含む。

【0007】

本発明の一側面に係る細胞評価装置は、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価装置であって、細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出部と、指標算出部で算出した指標に基づいて、細胞集団を評価する評価部と、を含む。

【0008】

本発明の一側面に係る細胞評価プログラムは、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価プログラムであって、細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出処理と、指標算出処理で算出した指標に基づいて、細胞集団を評価する評価処理と、をコンピュータに実行させる。

【0009】

本発明の一側面では、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことが細胞集団で最終的に望まれる品質であることに鑑み、平均距離、ばね定数及び六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出し、その指標に基づいて細胞集団を評価する。これにより、集団秩序に基づく指標を評価に適用し、細胞集団において小さい細胞が秩序良く配列されているかどうかに関して数値化して把握することが可能となる。すなわち、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能となる。

【0010】

本発明の一側面では、平均距離及びばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められ、六角格子秩序変数は、複数の細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められていてもよい。

【0011】

本発明の一側面に係る細胞評価方法は、指標の値及びその誤差成分から定まるガウス分布の重なり度合いを表すオーバラップ係数を算出するオーバラップ係数算出ステップを含んでいてもよい。オーバラップ係数によれば、指標の感度（つまり、指標が繊細な変数であるかどうか）を把握することができる。

【0012】

本発明の一側面に係る細胞評価方法は、指標を変数としてＲＯＣ解析を行うＲＯＣ解析ステップを含んでいてもよい。ＲＯＣ解析を利用して指標を評価することができる。

【0013】

本発明の一側面に係る細胞評価方法において、細胞は、六角格子の二次元最密充填構造を有していてもよい。また、本発明に係る細胞評価方法において、細胞は、角膜内皮細胞、上皮系細胞、肝細胞、又はこれらの何れかの培養細胞であってもよい。なお、上皮系細胞としては、例えば、角膜上皮細胞、小気道上皮細胞、乳腺上皮細胞、もしくは網膜色素上皮細胞等が挙げられる。

【0014】

本発明の一側面に係る細胞評価方法において、評価ステップでは、指標算出ステップで算出した指標に基づいて、撮像画像を撮像した時点よりも将来においての細胞集団の品質を予測してもよい。この場合、細胞集団の予後予測に対応できる。

【0015】

本発明の一側面に係る細胞評価方法は、薬剤候補物質における細胞集団の評価に用いられてもよい。例えば眼科治療薬の開発において、薬剤候補物質における細胞集団の評価に本発明を適用することで、薬剤候補物質の有効性及び安全性の検証時間を短縮することができる。

【0016】

本発明の一側面に係る細胞評価方法では、指標は、平均距離、ばね定数、及び六角格子秩序変数の全てを含んでいてもよい。

【発明の効果】

【0017】

本発明の一側面によれば、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能な細胞評価方法、細胞評価装置、及び細胞評価プログラムを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】図１は、第１実施形態に係る細胞評価装置を示す構成図である。

【図2】図２（ａ）は、動径分布関数を説明する図である。図２（ｂ）は、ポテンシャル関数を説明する図である。

【図3】図３は、六角格子秩序変数を説明する図である。

【図4】図４（ａ）は、低品位の細胞集団の撮像画像を示す写真図である。図４（ｂ）は、高品位の細胞集団の撮像画像を示す写真図である。

【図5】図５（ａ）は、ＯＶＬの比較評価を説明するためのグラフである。図５（ｂ）は、ＯＶＬの比較評価を説明するための他のグラフである。

【図6】図６は、細胞評価プログラムを示す図である。

【図7】図７（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図７（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。

【図8】図８（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。図８（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度のＯＶＬとばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。

【図9】図９（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。図９（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度のＯＶＬと平均距離のＯＶＬとを比較評価するグラフである。

【図10】図１０は、第２実施形態に係る細胞評価装置を示す構成図である。

【図11】図１１（ａ）は、低品位の細胞集団のスペキュラー画像を示す写真図である。図１１（ｂ）は、高品位の細胞集団のスペキュラー画像を示す写真図である。

【図12】図１２は、表示部の表示の一例を示す図である。

【図13】図１３（ａ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図１３（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。

【図14】図１４（ａ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。図１４（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度のＯＶＬとばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。

【図15】図１５（ａ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。図１５（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度のＯＶＬと平均距離のＯＶＬとを比較評価するグラフである。

【図16】図１６（ａ）は、密度と時間との関係を示すグラフである。図１６（ｂ）は、３か月時点の密度と３か月時点のばね定数との関係を示すグラフである。図１６（ｃ）は、２４か月時点の密度と３か月時点のばね定数との関係を示すグラフである。図１６（ｄ）は、３か月時点の密度のＯＶＬと３か月時点のばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１６（ｅ）は、２４か月時点の密度のＯＶＬと３か月時点のばね定数のＯＶＬとを比較評価するグラフである。

【図17】図１７（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図１７（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。

【図18】図１８は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。

【図19】図１９は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。

【図20】図２０（ａ）は、第２実施形態における密度と良細胞率との関係を示すグラフである。図２０（ｂ）は、第２実施形態に係るin vivoにおけるばね定数と良細胞率との関係を示すグラフである。

【図21】図２１は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度とばね定数との関係を示すグラフである。

【図22】図２２は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度と平均距離との関係を示すグラフである。

【図23】図２３（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度と第２実施形態に係るin vivoの密度との関係を示すグラフである。図２３（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数と第２実施形態に係るin vivoの密度との関係を示すグラフである。図２３（ｃ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度を変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度が２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。図２３（ｄ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数を変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度が２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。

【図24】図２４（ａ）は、密度と時間との関係を示すグラフである。図２４（ｂ）は、６か月時点のばね定数と２４か月時点の密度との関係を示すグラフである。図２４（ｃ）は、６か月時点の密度と２４か月時点の密度との関係を示すグラフである。図２４（ｄ）は、２４か月時点の密度が１０００以下となる症例を、６か月時点の密度で判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。図２４（ｅ）は、２４か月時点の密度が１０００以下となる症例を、６か月時点のばね定数で判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。

【図25】図２５は、筋繊維の断面画像に自動抽出された細胞位置及び輪郭を重ねて表示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0019】

以下、図面を参照しつつ実施形態について詳細に説明する。なお、以下の説明において同一又は相当要素には同一符号を付し、重複する説明を省略する。

【0020】

［第１実施形態］
図１は、第１実施形態に係る細胞評価装置１を示す構成図である。図１に示されるように、細胞評価装置１は、複数の細胞を含む細胞集団Ｃ１の品質を評価する装置である。細胞評価装置１は、例えば眼科治療薬の開発において、薬剤候補物質（化合物等）における細胞集団Ｃ１の評価に用いられる。特に細胞評価装置１は、角膜内皮の再生医療における細胞懸濁液注入法に用いられる培養細胞の品質管理に利用される。細胞集団Ｃ１は、角膜内皮細胞の培養細胞を複数含んでいる。細胞集団Ｃ１に含まれる細胞は、六角格子の二次元最密充填構造を有する。細胞評価装置１は、コンピュータ１０、表示部２０及び操作部３０を少なくとも備えている。

【0021】

コンピュータ１０は、オペレーティングシステム及びアプリケーションプログラム等を実行するプロセッサ（例えばＣＰＵ）と、ＲＯＭ、ＲＡＭ及びハードディスク等で構成される記憶部と、ネットワークカード又は無線通信モジュールで構成される通信制御部と、を有する。コンピュータ１０は、後述する細胞評価プログラムをプロセッサ上に読み込ませて実行することによって細胞評価方法を実現する。コンピュータ１０の記憶部内には、処理に必要なデータ又はデータベースが記憶される。コンピュータ１０は、１台で構成されてもよいし、複数台で構成されてもよい。複数台で構成されている場合には、これらがインターネット又はイントラネット等の通信ネットワークを介して接続されることで、論理的に一つのコンピュータ１０が構築される。

【0022】

コンピュータ１０には、位相差顕微鏡２で撮像されて画像処理装置３で画像処理が施された、培養皿５上の細胞集団Ｃ１の撮像画像が入力される。位相差顕微鏡２としては、特に限定されず、種々の位相差顕微鏡を採用できる。画像処理装置３は、公知の画像処理手法により、撮像画像において細胞集団Ｃ１に含まれる複数の細胞の輪郭に関するエッジ情報を抽出する。画像処理装置３は、抽出したエッジ情報をコンピュータ１０に出力する。コンピュータ１０は、機能的構成として、指標算出部１１及び評価部１２を含む。

【0023】

指標算出部１１は、細胞集団Ｃ１の撮像画像に基づいて、当該細胞集団Ｃ１を定量的に評価するための指標を算出する指標算出処理を実行する。具体的には、指標算出部１１は、画像処理装置３から入力された撮像画像のエッジ情報に基づく演算処理を行い、「平均距離」、「ばね定数」及び「六角格子秩序変数」を少なくとも含む指標を算出する。

【0024】

平均距離は、複数の細胞が詰まっている程度を表す指標である。ばね定数は、複数の細胞の間の距離が揃っている程度（均一性）を表す指標である。平均距離及びばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められる。平均距離が小さいほど、複数の細胞が密であると評価できる。ばね定数が大きいほど、複数の細胞の間の距離が揃っている（平均距離からの差異が小さい）と評価できる。例えば指標算出部１１では、以下のように平均距離及びばね定数を算出できる。

【0025】

図２（ａ）は、動径分布関数ｇ（ｒ）を説明する図である。図２（ｂ）は、ポテンシャル関数ｗ（ｒ）を説明する図である。図２（ａ）に示されるように、細胞集団Ｃ１では、ある細胞から距離ｒの位置ｄｒに他の細胞が存在する確率は、動径分布関数ｇ（ｒ）として表される。そして、動径分布関数ｇ（ｒ）は、下式（１）に示されるボルツマン分布の関数として表すことができる。この動径分布関数ｇ（ｒ）の自然対数をとることで、下式（２）に示されるポテンシャル関数ｗ（ｒ）を得る。

【数1】

【数2】

【0026】

そこで、撮像画像の細胞集団Ｃ１に含まれる複数の細胞のエッジ情報から、これら複数の細胞の重心位置を算出する。複数の細胞の中から選択される一対の細胞の組合せの全てについて、その重心位置間距離を横軸としたヒストグラムを生成する。このヒストグラムから算出される重心位置間距離それぞれの頻度（度数）に基づいて、動径分布関数ｇ（ｒ）を取得する。取得した当該動径分布関数ｇ（ｒ）を、上式（２）のポテンシャル関数ｗ（ｒ）に導入する。これにより、ポテンシャル関数ｗ（ｒ）のプロファイルを得ることができる。

【0027】

図２（ｂ）に示されるように、ポテンシャル関数ｗ（ｒ）のプロファイルに対して、二次曲線フィッティングを施す。ここでは、最小二乗法を用いて二次曲線をフィッティングすることで、下式（３）が求められる。その結果、下式（３）において、ｒ_０が平均距離として算出され、ｋがばね定数として算出される。

【数3】

【0028】

六角格子秩序変数は、複数の細胞の配置が正六角形に近い程度を表す指標である。六角格子秩序変数は、複数の細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められる。六角格子秩序変数は、０から１の値を有している。六角格子秩序変数が１に近いほど、複数の細胞の配置が正六角形に近いと評価できる。例えば指標算出部１１では、以下のように六角格子秩序変数を算出する。

【0029】

図３は、六角格子秩序変数Ｑ_６を説明する図である。下式（４），（５）により、任意の細胞ｉについての六角格子秩序変数Ｑ^ｉ_６を算出する。そして、細胞集団Ｃ１に含まれる複数の細胞に関して六角格子秩序変数Ｑ^ｉ_６の平均をとることで、六角格子秩序変数Ｑ_６を算出する。図３に示されるように、θ_ｉｊは任意の細胞ｉを中心にした中心角であり、Ｎ（ｉ）は任意の細胞ｉに最も近い６つの細胞である。

【数4】

【数5】

【0030】

図４（ａ）は、低品位の細胞集団Ｃ１の撮像画像を示す写真図である。図４（ｂ）は、高品位の細胞集団Ｃ１の撮像画像を示す写真図である。図４（ａ）及び図４（ｂ）に示されるように、細胞集団Ｃ１において最終的に望まれる品質は、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことであることが見出される。平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６は、このような品質に立脚した、コロイド物理学及び結晶物理学の基礎学理に基づく指標であるといえる。

【0031】

図１に戻り、評価部１２は、指標算出部１１で算出した指標に基づいて、細胞集団Ｃ１を評価する評価処理を実行する。評価部１２は、指標に平均距離ｒ_０が含まれる場合、平均距離ｒ_０が小さいほど細胞集団Ｃ１が高品位（複数の細胞が密である）と評価してもよいし、平均距離ｒ_０が閾値以下のときに細胞集団Ｃ１が高品位と評価してもよい。評価部１２は、指標にばね定数ｋが含まれる場合、ばね定数ｋが大きいほど細胞集団Ｃ１が高品位（複数の細胞の間の距離が揃っている）と評価してもよいし、ばね定数ｋが閾値以上のときに細胞集団Ｃ１が高品位と評価してもよい。評価部１２は、指標に六角格子秩序変数Ｑ_６が含まれる場合、六角格子秩序変数Ｑ_６が１に近いほど細胞集団Ｃ１が高品位（複数の細胞の配置が正六角形に近い）と評価してもよいし、六角格子秩序変数Ｑ_６が閾値以上のときに細胞集団Ｃ１が高品位と評価してもよい。

【0032】

評価部１２は、指標の値及びその誤差成分から定まるガウス分布の重なり度合いを表すオーバラップ係数（overlapping coefficient：以下、「ＯＶＬ」という）を算出するＯＶＬ算出処理を実行する。ＯＶＬは、０以上１以下の値を有する。ＯＶＬが０の場合、当該ガウス分布が完全に分離していることを表し、ＯＶＬが１の場合、当該ガウス分布が完全に重なることを表す。以下、ＯＶＬ算出処理及びＯＶＬによる評価について、２つの任意の指標であるパラメータＡ，ＢのＯＶＬを比較評価する場合を例示して具体的に説明する。

【0033】

図５（ａ）及び図５（ｂ）は、ＯＶＬの比較評価を説明するためのグラフである。図５（ａ）に示されるグラフでは、パラメータＡを横軸とし、パラメータＢを縦軸としている。このグラフ上において、複数のデータ点がプロットされている。例えば（Ａ_１，Ｂ_１）について、その値Ａ_１，Ｂ_１及び誤差成分から定まるガウス分布ＧＡ_１，ＧＢ_１が得られる。また例えば（Ａ_２，Ｂ_２）について、その値Ａ_２，Ｂ_２及び誤差成分から定まるガウス分布ＧＡ_２，ＧＢ_２が得られる。図中において、データ点を中心に広がる線分は、誤差成分を示すエラーバーである（他の図において同様）。なお、平均距離ｒ_０及びばね定数ｋの誤差成分は、フィッティングの際に生じる誤差（フィッティングエラー）を含む。六角格子秩序変数Ｑ_６の誤差成分は、標準偏差及び標準誤差の少なくとも何れかを含む。

【0034】

ガウス分布ＧＡ_１，ＧＡ_２の重なりから、パラメータＡのＯＶＬであるＡ_ＯＶＬがパラメータ差Ａ_ｄｉｆｆ（＝｜Ａ_２−Ａ_１｜）と関連付けて算出される。ガウス分布ＧＢ_１，ＧＢ_２の重なりから、パラメータＢのＯＶＬであるＢ_ＯＶＬがパラメータ差Ｂ_ｄｉｆｆ（＝｜Ｂ_２−Ｂ_１｜）と関連付けて算出される。このようなＡ_ＯＶＬ及びＢ_ＯＶＬの算出を、グラフ上の複数のデータ点の全てに関して実施する。

【0035】

パラメータＡとパラメータＢとを同じ尺度で比較可能にするために、これらの間の線形関係を仮定し、その勾配から、パラメータＡが１変化したときにパラメータＢがいくつ変化するかを求める。パラメータＡが１変化したときに１変化するようにパラメータＢを尺度補正してなるパラメータ＃Ｂ（＃Ｂ＝Ｂ／ｓｌｏｐｅ）を定義する。そして、図５（ｂ）に示されるように、パラメータ差Ａ_ｄｉｆｆ，＃Ｂ_ｄｉｆｆを横軸とし、Ａ_ＯＶＬ，Ｂ_ＯＶＬを縦軸としたグラフを作成したとき、例えばＯＶＬが小さい一方（図中では、差分が大きくなるにつれてＯＶＬが急峻に低下するパラメータＢ）が、誤差が重ならない繊細な指標であると評価できる。

【0036】

なお、３つ以上のパラメータのＯＶＬを比較評価する場合には、基準パラメータを定め、この基準パラメータに基づく尺度補正を当該３つのパラメータに行った上で、評価してもよい。例えば、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６のＯＶＬを比較評価する場合、まず、これらそれぞれと細胞集団Ｃ１の細胞の密度（後述）との比較評価を行う。そして、その各比較評価結果に基づいて、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６のＯＶＬを比較評価してもよい。

【0037】

あるいは、３つ以上のパラメータのＯＶＬを比較評価する場合には、これらのパラメータのＯＶＬが小さい順位を算出することで評価してもよい。例えば平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６のＯＶＬを比較評価する場合、まず、平均距離ｒ_０及びばね定数ｋのＯＶＬを比較評価する。平均距離ｒ_０及び六角格子秩序変数Ｑ_６のＯＶＬを比較評価する。六角格子秩序変数Ｑ_６及びばね定数ｋのＯＶＬを比較評価する。これにより、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６について、ＯＶＬが小さい順位を算出して比較評価してもよい。

【0038】

図６は、細胞評価プログラムＰ１を示す図である。図６に示されるように、細胞評価プログラムＰ１は、細胞集団Ｃ１の品質を評価するプログラムであって、コンピュータ１０の記憶部１３内に記憶されている。細胞評価プログラムＰ１は、指標算出モジュールＰ１１及び評価モジュールＰ１２を含む。指標算出モジュールＰ１１は、上述した指標算出処理をコンピュータ１０に実行させる。評価モジュールＰ１２は、上述した評価処理及びＯＶＬ算出処理をコンピュータ１０に実行させる。

【0039】

細胞評価プログラムＰ１は、例えば、ＣＤ−ＲＯＭやＤＶＤ−ＲＯＭ、半導体メモリなどの有形の記録媒体に固定的に記録された上で提供されてもよい。あるいは、細胞評価プログラムＰ１は、搬送波に重畳されたデータ信号として通信ネットワークを介して提供されてもよい。

【0040】

図１に示されるように、表示部２０は、位相差顕微鏡２の撮像画像、指標算出部１１による指標の算出結果、及び、評価部１２による細胞集団Ｃ１の評価結果の少なくとも何れかを表示させる。表示部２０としては、例えばディスプレイ等を用いることができる。操作部３０は、細胞評価装置１に対するオペレータの各種操作を行う。操作部３０としては、例えばマウス又はキーボード等を用いることができる。

【0041】

次に、細胞評価装置１を用いて細胞集団Ｃ１の品質を評価する細胞評価方法（細胞評価装置１の作動方法）について説明する。

【0042】

まず予め、位相差顕微鏡２により、培養皿５上に載置された細胞集団Ｃ１を撮像する。位相差顕微鏡２で撮像した撮像画像に画像処理装置３により画像処理を施し、撮像画像に含まれる各細胞のエッジ情報を取得する。

【0043】

続いて、細胞評価装置１において、画像処理装置３で取得した撮像画像のエッジ情報に基づいて、細胞集団Ｃ１の品質を評価する。すなわち、指標算出部１１により、上述した指標算出処理を実行し、平均距離ｒ_０とばね定数ｋと六角格子秩序変数Ｑ_６とを含む指標を算出する（指標算出ステップ）。算出した指標に基づいて、評価部１２により、上述した評価処理を実行し、細胞集団Ｃ１を評価する（評価ステップ）。また、算出した指標について、評価部１２により、上述したＯＶＬ算出処理を実行し、ＯＶＬを算出する（オーバラップ係数算出ステップ）。そして、撮像画像、算出した指標、算出したＯＶＬ及び細胞集団Ｃ１の評価結果の少なくとも何れかを、表示部２０に表示させる。

【0044】

図７（ａ）は、密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図７（ｂ）は、ばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。密度ｄは、細胞集団Ｃ１における複数の細胞の粗密の度合いであって、１つの細胞の面積の平均値をＳ_Ａとした場合に下式（６）で表される指標である。良細胞率は、細胞集団Ｃ１中における品質が良好である割合である。密度ｄの誤差成分は、標準偏差、標準誤差及び細胞の面積Ｓ_Ａの計測誤差の少なくとも何れかを含む。
ｄ＝１／Ｓ_Ａ …（６）

【0045】

図７（ａ）及び図７（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に相関する。特にばね定数ｋにあっては、密度ｄに比べて、誤差成分が少ない。このことから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。

【0046】

図８（ａ）は、密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図８（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬとばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図８（ｂ）の横軸は、密度差ｄ_ｄｉｆｆ及びばね定数差ｋ_ｄｉｆｆである。密度差ｄ_ｄｉｆｆ及びばね定数差ｋ_ｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。図８（ａ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比において誤差成分が少ないことが分かる。図８（ｂ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比においてＯＶＬが非常に小さく、繊細な指標であることが分かる。これにより、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。

【0047】

図９（ａ）は、密度ｄと平均距離ｒ_０との関係を示すグラフである。図９（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬと平均距離ｒ_０のＯＶＬとを比較評価するグラフである。図９（ｂ）の横軸は、密度差ｄ_ｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ_{０_ｄｉｆｆ}である。密度差ｄ_ｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ_{０_ｄｉｆｆ}の何れかには、上記の尺度補正が施されている。図９（ｂ）に示されるように、平均距離ｒ_０は、細胞集団Ｃ１の評価に際して、密度ｄとの対比においてＯＶＬが小さい場合が多く、繊細な指標であることが分かる。

【0048】

以上、本実施形態に係る細胞評価方法、細胞評価装置１及び細胞評価プログラムＰ１では、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６を含む指標を算出し、その指標に基づいて細胞集団Ｃ１を評価する。細胞集団Ｃ１において最終的に望まれる品質は、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことである。よって、本実施形態では、集団秩序に基づく指標を評価に適用し、細胞集団Ｃ１において小さい細胞が秩序良く配列されているかどうかに関して数値化して把握できる。指標に品質との相関を持たせることができ、指標と品質との間に定量的な意味付けを与えることができる。

【0049】

したがって、本実施形態によれば、細胞集団Ｃ１の品質を定量的に評価することが可能となる。本実施形態によれば、撮像画像だけで細胞集団Ｃ１の品質を非破壊的に評価でき、細胞集団Ｃ１が高品位であるか低品位であるかを明確に識別でき、定量数値化も可能である。本実施形態によれば、統計物理学的手法を用いた２次元細胞集団の定量標準技術を提供できる。本実施形態は、眼科一般の診断における定量標準としての運用に期待される。本実施形態に係る細胞評価プログラムＰ１は、移植細胞培養プラットフォームへの工程管理プログラムとして適用できる。

【0050】

なお、一度減少した角膜内皮細胞は自然には回復しないために効果的な治療が必要であるところ、角膜内皮の機能不全に対する治療法として、角膜内皮細胞を懸濁液の状態で移植する「角膜内皮細胞移入療法」が近年提唱されている。本実施形態の細胞評価装置１によれば、当該治療法に用いられる培養細胞の品質管理工程において、細胞マーカーでの染色を行わずに顕微鏡観察だけで、移植前の品質管理ないし細胞選別が可能となる。

【0051】

本実施形態では、指標のＯＶＬを算出している。これにより、ＯＶＬを用いて指標の感度を把握することができる。指標に加えてそのＯＶＬに基づいて細胞集団Ｃ１を評価することで、細胞集団Ｃ１の定量的な品質評価をより精度よく行うことができる。

【0052】

本実施形態においては、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６を指標として算出したが、これら全てを指標としなくてもよく、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６の少なくとも何れかを指標としてもよい。また、指標は、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６に限定されず、その他のパラメータを含んでいてもよい。例えば指標は、密度ｄ、六角形率、アスペクト比、隣接細胞数及び膜厚（反射率）の少なくとも何れかを更に含んでいてもよい。六角形率、アスペクト比、隣接細胞数及び膜厚（反射率）は、公知手法により算出できる。さらにまた、指標として含む少なくとも何れかのパラメータを、適宜選択してもよい。

【0053】

本実施形態は、例えば眼科治療薬の開発において、薬剤候補物質における細胞集団Ｃ１の評価に用いることができる。このように、薬剤候補物質における細胞集団Ｃ１の評価に本実施形態を適用することで、薬剤候補物質の有効性及び安全性の検証時間を短縮することができる。

【0054】

［第２実施形態］
次に、第２実施形態を説明する。本実施形態の説明では、第１実施形態と異なる点を説明し、重複する説明は省略する。

【0055】

図１０は、第２実施形態に係る細胞評価装置５０を示す構成図である。図１０に示すように、本実施形態の細胞評価装置５０は、例えば眼科用の眼検査装置として用いられる装置であり、スペキュラー顕微鏡６０、コンピュータ７０、表示部２０及び操作部３０を少なくとも備えている。

【0056】

スペキュラー顕微鏡６０は、患者８０の眼の角膜内皮細胞を複数含む内皮組織である細胞集団を撮像し、スペキュラー画像を撮像画像として取得する。スペキュラー顕微鏡６０は、スペキュラー画像をコンピュータ７０へ出力する。

【0057】

コンピュータ７０は、物理的構成としては、上記コンピュータ１０（図１参照）と同様に構成されている。コンピュータ７０は、機能的構成として、画像処理部７１、指標算出部７２及び評価部７３を含む。

【0058】

画像処理部７１は、公知の画像処理手法により、スペキュラー顕微鏡６０で撮像されたスペキュラー画像において細胞集団に含まれる複数の角膜内皮細胞の輪郭に関するエッジ情報を抽出する。画像処理部７１は、抽出したエッジ情報を指標算出部７２に出力する。指標算出部７２は、画像処理部７１から入力されたスペキュラー画像のエッジ情報に基づき、上述した指標算出処理を実行する。これにより、指標算出部７２は、「平均距離ｒ_０」、「ばね定数ｋ」及び「六角格子秩序変数Ｑ_６」を少なくとも含む指標を算出する。評価部７３は、指標算出部７２で算出した指標に基づき、上述した評価処理を実行し、細胞集団を評価する。また評価部７３は、ＯＶＬ算出処理を実行し、指標のＯＶＬを算出する。

【0059】

図１１は、複数の角膜内皮細胞を含む細胞集団のスペキュラー画像を示す写真図である。図１１（ａ）は低品位の細胞集団を示し、図１１（ｂ）は高品位の細胞集団を示す。図１１（ａ）及び図１１（ｂ）に示されるように、複数の角膜内皮細胞を含む細胞集団において最終的に望まれる品質は、第１実施形態と同様に、小さい細胞が秩序良く配列されている（揃っている）ことであることが見出される。

【0060】

次に、細胞評価装置５０を用いて細胞集団の品質を評価する細胞評価方法（細胞評価装置５０の作動方法）について説明する。

【0061】

まず、スペキュラー顕微鏡６０により、患者８０の角膜内皮細胞を含む細胞集団を撮像する。スペキュラー顕微鏡６０で撮像したスペキュラー画像に画像処理部７１により画像処理を施し、スペキュラー画像に含まれる各角膜内皮細胞のエッジ情報を取得する。取得したスペキュラー画像のエッジ情報に基づいて、指標算出部７２により上述した指標算出処理を実行し、指標を算出する（指標算出ステップ）。算出した指標に基づいて、評価部７３により上述した評価処理を実行し、細胞集団を評価する（評価ステップ）。また、算出した指標について、評価部１２により上述したＯＶＬ算出処理を実行し、ＯＶＬを算出する（オーバラップ係数算出ステップ）。そして、スペキュラー画像、算出した指標、算出したＯＶＬ及び細胞集団の評価結果の少なくとも何れかを、表示部２０に表示させる。

【0062】

図１２は、表示部２０の表示の一例を示す図である。図１２に示されるように、例えば表示部２０上には、スペキュラー顕微鏡６０で撮像したスペキュラー画像６１、指標の名称と値とＯＶＬが互いに関連付けられたチャート６２、及び、各種のアイコンボタンが表示されている。ここでの指標は、ばね定数ｋ、平均距離ｒ_０、六角格子秩序変数Ｑ_６、密度ｄ、六角形率、アスペクト比、隣接細胞数及び膜厚を含んでいる。このような表示によれば、細胞集団を容易に評価ないし診断することができる。

【0063】

図１３（ａ）は、密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図１３（ｂ）は、ばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。本実施形態において、密度ｄは、角膜内皮細胞を含む細胞集団における複数の細胞の粗密の度合いであり、良細胞率は、角膜内皮細胞を含む細胞集団中における品質が良好である割合である。図１３（ａ）及び図１３（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に相関する。特にばね定数ｋにあっては、密度ｄに比べて、誤差成分が少ない。このことから、角膜内皮細胞を含む細胞集団の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。

【0064】

図１４（ａ）は、密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１４（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬとばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１４（ｂ）の横軸は、密度差ｄ_ｄｉｆｆ及びばね定数差ｋ_ｄｉｆｆである。密度差ｄ_ｄｉｆｆ及びばね定数差ｋ_ｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。図１４（ａ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比において誤差成分が少ないことが分かる。図１４（ｂ）に示されるように、ばね定数ｋは、密度ｄとの対比においてＯＶＬが非常に小さく、繊細な指標であることが分かる。これにより、角膜内皮細胞を含む細胞集団の評価に際して、ばね定数ｋは、感度が良く、指標としての信頼性が高いことが分かる。

【0065】

図１５（ａ）は、密度ｄと平均距離ｒ_０との関係を示すグラフである。図１５（ｂ）は、密度ｄのＯＶＬと平均距離ｒ_０のＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１５（ｂ）の横軸は、密度差ｄ_ｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ_{０_ｄｉｆｆ}である。密度差ｄ_ｄｉｆｆ及び平均距離差ｒ_{０_ｄｉｆｆ}の何れかには、上記の尺度補正が施されている。図１５（ｂ）に示されるように、平均距離ｒ_０は、角膜内皮細胞を含む細胞集団の評価に際して、密度ｄとの対比においてＯＶＬが小さい場合が多く、繊細な指標であることが分かる。

【0066】

なお、評価部７３は、指標算出部７２で算出した指標に基づいて、撮像画像を撮像した時点よりも将来においての細胞集団の品質を予測してもよい。すなわち、上述した評価ステップでは、上述した指標算出ステップで算出した指標に基づいて、スペキュラー画像を撮像した撮像時点よりも将来においての細胞集団の品質を予測してもよい。これにより、細胞集団の予後予測に対応できる。本実施形態では、例えば以下に説明するように、特に眼の細胞を注入治療した後での予後予測にも対応できる。

【0067】

図１６は、角膜移植後における６人の患者の角膜内皮細胞の状態を示す各図である。図１６中においては、移植時を基準に（０か月として）示している。図１６（ａ）は、各患者の角膜内皮細胞の密度ｄと時間との関係を示すグラフである。図１６（ｂ）は、各患者の角膜内皮細胞についての３か月時点の密度ｄと３か月時点のばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１６（ｃ）は、各患者の角膜内皮細胞についての２４か月時点の密度ｄと３か月時点のばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１６（ｄ）は、各患者の角膜内皮細胞についての３か月時点の密度ｄのＯＶＬと３か月時点のばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１６（ｅ）は、各患者の角膜内皮細胞についての２４か月時点の密度ｄのＯＶＬと３か月時点のばね定数ｋのＯＶＬとを比較評価するグラフである。図１６（ｄ）及び図１６（ｅ）の横軸は、密度差ｄ_ｄｉｆｆ及びばね定数差ｋ_ｄｉｆｆである。密度差ｄ_ｄｉｆｆ及びばね定数差ｋ_ｄｉｆｆの何れかには、上記の尺度補正が施されている。

【0068】

図１６（ａ）に示されるように、３か月時点では、全患者の密度ｄに差はみられないものの、２４か月時点では、数名の患者の密度ｄが著しく低下している。図１６（ｄ）に示されるように、３か月時点においては、密度ｄは、ＯＶＬが高く、細胞集団の評価の感度が低いことがわかる。図１６（ｅ）に示されるように、密度ｄは、その低下が実際に顕著化した２４か月時点になって、ＯＶＬが低くなり、細胞集団の評価の感度が高まっている。これらにより、３か月時点においては、密度ｄを指標として細胞集団を評価した場合、長期予後の細胞品質及び組織品質の低下までは判断できないことがわかる。

【0069】

一方、図１６（ｂ）及び図１６（ｃ）に示されるように、３か月時点のばね定数ｋは、３か月時点及び２４か月時点の密度ｄに対して、誤差成分が少ない。図１６（ｄ）に示されるように、３か月時点において、ばね定数ｋは、ＯＶＬが十分に低く、細胞集団の評価の感度が高いことがわかる。つまり、３か月時点において、ばね定数ｋを指標として細胞集団を評価することで、密度ｄからでは判断し得なかった長期予後の細胞品質及び組織品質の低下までを予測することができる。よって、ばね定数ｋを指標として細胞集団を評価する場合、例えば３か月時点の経過観察にて、長期予後に低品位化する可能性が高い細胞集団を分離することが可能となる。なお、このような長期予後の細胞品質及び組織品質の予測に関して、対象となる細胞によっては、平均距離ｒ_０及び六角格子秩序変数Ｑ_６を指標としても同様な結果が得られることが想定できる。

【0070】

以上、本実施形態においても、第１実施形態と同様の効果、すなわち、細胞集団の品質を定量的に評価することが可能となる等の効果を奏する。また、本実施形態では、薬剤・眼科手術・コンタクトレンズ等による角膜内皮障害の発症・進展予測が可能になる。例えば眼科手術前のスクリーニング検査やコンタクトレンズ外来等の眼科一般における角膜内皮診断への応用が可能である。

【0071】

図１７（ａ）は、第１実施形態に係るin vitro（培養細胞）における密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図１７（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroにおけるばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。密度ｄは、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１における複数の細胞の粗密の度合いである。良細胞率は、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１中における品質が良好である割合である。図中においてｒ^２は、決定係数である。

【0072】

図１７（ａ）及び図１７（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に強く相関する。このことから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数kは、指標としての信頼性が（密度と同程度に）高いことがわかる。

【0073】

図１８は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。図１８に示されるように、密度ｄとばね定数ｋとは正に強く相関することから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数kは、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。

【0074】

図１９は、第１実施形態に係るin vitroにおける密度ｄと平均距離ｒ₀との関係を示すグラフである。図１９に示されるように、密度ｄと平均距離ｒ_０とは正に強く相関することから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、平均距離ｒ_０は、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。

【0075】

図２０（ａ）は、第２実施形態に係るin vivo（再生角膜）における密度ｄと良細胞率との関係を示すグラフである。図２０（ｂ）は、第２実施形態におけるばね定数ｋと良細胞率との関係を示すグラフである。図２０（ａ）及び図２０（ｂ）に示されるように、密度ｄ及びばね定数ｋの双方は、良細胞率に対して正に相関する。このことから、細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数ｋは、感度がよく、指標としての信頼性が高いことがわかる。

【0076】

図２１は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度ｄとばね定数ｋとの関係を示すグラフである。密度ｄとばね定数ｋとは正に強く相関することから、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１の評価に際して、ばね定数kは、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。

【0077】

図２２は、第２実施形態に係るin vivoにおける密度ｄと平均距離ｒ₀との関係を示すグラフである。図２２に示されるように、密度ｄと平均距離ｒ₀とは正に強く相関することから、角膜内皮細胞を含む細胞集団Ｃ１の評価に際して、平均距離ｒ₀は、密度ｄと同様に用いることができることがわかる。

【0078】

図２３は、第１実施形態に係るin vitroの結果と第２実施形態に係るin vivoの結果との関係を示す各図である。図２３（ａ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度ｄと第２実施形態に係るin vivoの密度ｄとの関係を示すグラフである。図２３（ｂ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数ｋと第２実施形態に係るin vivoの密度ｄとの関係を示すグラフである。図２３（ｃ）は、第１実施形態に係るin vitroの密度ｄを変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度ｄが２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。図２３（ｄ）は、第１実施形態に係るin vitroのばね定数ｋを変数とし、第２実施形態に係るin vivoの密度ｄが２０００を下回る場合を真として行ったＲＯＣ解析の結果を示すグラフである。

【0079】

図２３（ａ）〜図２３（ｄ）に示される決定係数及びＲＯＣ曲線下面積から分かるように、ばね定数ｋは、密度ｄと同等の成績を有することがわかる。このことから、第１実施形態に係るin vitroにおいてばね定数ｋを用いれぱ、密度ｄを用いるのと同等の精度で、第２実施形態に係るin vivoの密度ｄを予測できることがわかる。つまり、ばね定数ｋが有用であることがわかる。

【0080】

ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristics：受信者操作特性）解析とは、信号処理の概念である。ある変数を用いて正常と異常との二項分類を行うとき、その変数の分類精度の測度となる。例えば、ある検査の結果から得られる数値を用いて、被検査群を陽性と陰性とに二項分類する場合を考える。この検査数値に対してある閾値を導入すると、閾値以上を陽性、閾値未満を陰性と判定するとき、真の陽性者を正しく陽性として補足する割合（感度）、真の陰性者を正しく陰性として補足する割合（特異度）が得られる。閾値を媒介変数として単調に変化させながら、横軸に偽陽性率（＝１−特異度）、縦軸に感度をプロットすると、曲線が得られる（ＲＯＣ曲線）。このとき、曲線下面積は０から１までの値をとり得るが、曲線下面積が１に近いほど、使用した変数が被検査群をより正確に二項分類する性能を有することを示す。

【0081】

評価部１２は、平均距離ｒ_０、ばね定数ｋ及び六角格子秩序変数Ｑ_６の少なくとも何れかを含む指標を変数としてＲＯＣ解析を行うＲＯＣ解析処理を実行する。つまり、評価部１２により、指標を変数としてＲＯＣ解析処理を実行し、ＲＯＣ解析を行う（ＲＯＣ解析ステップ）。これにより、ＲＯＣ解析を利用して指標を評価することができる。

【0082】

図２４は、角膜移植後における１２人の患者の角膜内皮細胞の状態を示す各図である。図２４（ａ）は、密度ｄと時間との関係を示すグラフである。図２４（ｂ）は、６か月時点の密度ｄと２４か月時点の密度ｄとの関係を示すグラフである。図２４（ｃ）は、６か月時点のばね定数ｋと２４か月時点の密度ｄとの関係を示すグラフである。図２４（ｄ）は、２４か月時点の密度ｄが１０００以下となる症例を、６か月時点の密度ｄで判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。図２４（ｅ）は、２４か月時点の密度ｄが１０００以下となる症例を、６か月時点のばね定数ｋで判定した場合のＲＯＣ曲線のグラフである。図２４（ａ）では、散布図及び箱ひげ図で密度ｄの推移が表されている。

【0083】

図２４（ａ）に示されるように、３か月時点では、全患者の密度ｄに差はみられないものの、２４か月時点では、数名の患者の密度ｄが著しく低下している。図２４（ｂ）に示されるように、６か月時点での密度ｄと２４か月時点での密度ｄとは、互いに無相関である。図２４（ｃ）に示されるように、６か月時点でのばね定数ｋと２４か月時点での密度ｄとは、弱く相関している。つまり、６か月時点では密度ｄよりもばね定数ｋを用いるほうが、２４か月時点での密度ｄをより正確に予測できることがわかる。

【0084】

一方、ＲＯＣ解析の結果、図２４（ｄ）に示されるように、６か月時点の密度ｄを変数に用いた場合、曲線下面積は小さく、細胞集団の評価の感度が低いことがわかる。図２４（ｅ）に示されるように、６か月時点のばね定数ｋは、曲線下面積が大きく、細胞集団の評価の感度が高まっている。つまり、６か月時点において、ばね定数ｋを指標として細胞集団を評価することで、密度ｄからでは判断し得なかった長期予後の細胞品質及び組織品質の低下までを予測することができる。よって、ばね定数kを指標として細胞集団を評価する場合、例えば６か月時点の経過観察にて、長期予後に低品位化する可能性が高い細胞集団を分離することが可能となる。なお、このような長期予後の細胞品質及び組織品質の予測に関して、対象となる細胞によっては、平均距離ｒ_０及び六角格子秩序変数Ｑ_６を指標としても同様な結果が得られることが想定できる。

【0085】

図２５は、筋繊維の断面画像に自動抽出された細胞位置及び輪郭を重ねて表示した図である。図２５中の断面画像については、「“Multiple Sclerosis Affects Skeletal Muscle Characteristics”、Inez Wens, et al.、PLoS ONE 9, 9, e180158 (2014)、doi:10.1371/journal.pone.0108158」を参照している。図２５中の断面画像は、平滑筋繊維の断面の染色画像である。事前に自動抽出された細胞の位置の情報から、ばね定数ｋが０．０００５１、平均距離ｒ_０が７２、六角格子秩序変数Ｑ_６が０．１８であることが求められた。筋繊維の断面のような構造に対しても、構成要素1つ1つの配置から同様に評価することもできる。このように、その種類に制限されず、多様な対象に対して構造を評価することができる。

【0086】

以上、実施形態について説明したが、本発明の一側面は、上記実施形態に限られるものではない。

【0087】

上記実施形態において、評価の対象となる細胞集団に含まれる細胞は、特に限定されるものではない。細胞としては、角膜内皮細胞、上皮系細胞、肝細胞、又はこれらの何れかの培養細胞であってもよい。なお、上皮系細胞としては、例えば、角膜上皮細胞、小気道上皮細胞、乳腺上皮細胞、もしくは網膜色素上皮細胞等が挙げられる。

【0088】

上記第１実施形態では、角膜内皮細胞の移植前の培養細胞における品質評価に適用され、上記第２実施形態では、移植後の角膜内皮細胞の品質評価及び予後予測に適用されているが、本発明の一側面は、術前及び術後の両方に適用可能なものである。すなわち、本発明の一側面によれば、術前及び術後の両方の細胞集団の定量的評価を、品質に基づく同じ指標により行うことができる。術前及び術後の両方に適用できる画像診断プラットフォームを確立できる。細胞移植治療における術前工程管理と予後診断と予後予測とに適用可能である。臨床眼科学における診断の定量標準化ないし細胞移植型再生医療における工程管理等、幅広い分野での応用が見込まれる。

【0089】

上記実施形態では、平均距離ｒ_０及びばね定数ｋを算出する際、複数の細胞の中から選択される一対の細胞の組合せ全てのうち、対象領域における最外周の細胞が含まれる組合せを除いたものについて、その重心位置間距離を横軸としたヒストグラムを生成しているが、これに限定されない。例えば、対象領域における最外周の細胞が含まれる組合せを除かずに、複数の細胞の中から選択される一対の細胞の組合せ全てについて、その重心位置間距離を横軸としたヒストグラムを生成してもよい。

【0090】

上記実施形態では、六角格子秩序変数Ｑ_６を算出する際、上式（４），（５）により、対象領域における最外周の細胞を除いた任意の細胞ｉについての六角格子秩序変数Ｑ^ｉ_６を算出しているが、これに限定されない。例えば、対象領域における最外周の細胞を除かずに、任意の細胞ｉについての六角格子秩序変数Ｑ^ｉ_６を算出してもよい。上記実施形態では、指標の感度は、ＯＶＬを利用して把握してもよいし、これに代えてもしくは加えて、ＲＯＣ解析を利用して把握してもよい。上記において、ばね定数は、例えば「弾性ポテンシャル曲率」とも称される。

【0091】

上記実施形態では、細胞評価プログラムＰ１は、コンパクトディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、光磁気ディスク、ディジタルビデオディスク、磁気テープ又は半導体メモリ等のコンピュータ読取可能な非一時的な記録媒体に記録することができる。つまり、本発明の一態様は、細胞評価プログラムＰ１を記録するコンピュータ読取可能な記録媒体であってもよい。

【0092】

本発明の一側面に係る細胞評価装置は、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価装置であって、前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出部と、前記指標算出部で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価部と、を含み、前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められ、前記六角格子秩序変数は、複数の前記細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められていてもよい。

【0093】

本発明の一側面に係る細胞評価プログラムは、複数の細胞を含む細胞集団の品質を評価する細胞評価プログラムであって、前記細胞集団の撮像画像に基づいて、複数の前記細胞が詰まっている程度を表す平均距離、複数の前記細胞の間の距離が揃っている程度を表すばね定数、及び、複数の前記細胞の配置が正六角形に近い程度を表す六角格子秩序変数の少なくとも何れかを含む指標を算出する指標算出処理と、前記指標算出処理で算出した前記指標に基づいて、前記細胞集団を評価する評価処理と、をコンピュータに実行させ、前記平均距離及び前記ばね定数は、ボルツマン分布を利用して得られた関数であって複数の前記細胞の動径分布関数に基づくポテンシャル関数に、二次曲線フィッティングを施して求められ、前記六角格子秩序変数は、複数の前記細胞のうちの１つの細胞を中心にして当該細胞に最も近い６つの細胞で形成される六角形の６つの中心角に基づき求められていてもよい。

【符号の説明】

【0094】

１，５０…細胞評価装置、１０…コンピュータ、１１，７２…指標算出部、１２，７３…評価部、６１…スペキュラー画像（撮像画像）、Ｃ１…細胞集団、Ｐ１…細胞評価プログラム。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】