特許 6986772 ドラッグデリバリー用脂質単層被覆型ナノ粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6986772

(24)【登録日】2021年12月2日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】ドラッグデリバリー用脂質単層被覆型ナノ粒子

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/69 20170101AFI20211213BHJP

   A61K 47/54 20170101ALI20211213BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20211213BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20211213BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211213BHJP

【ＦＩ】

   A61K47/69

   A61K47/54

   A61K48/00

   A61K45/00

   A61K9/51

   A61K47/34

   A61K47/36

   A61P43/00 121

【請求項の数】7

【全頁数】20

(21)【出願番号】特願2020-62370(P2020-62370)

(22)【出願日】2020年3月31日

(62)【分割の表示】特願2016-93653(P2016-93653)の分割

【原出願日】2016年5月9日

(65)【公開番号】特開2020-109119(P2020-109119A)

(43)【公開日】2020年7月16日

【審査請求日】2020年3月31日

(73)【特許権者】

【識別番号】305027401

【氏名又は名称】東京都公立大学法人

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100120112

【弁理士】

【氏名又は名称】中西 基晴

(74)【代理人】

【識別番号】100135415

【弁理士】

【氏名又は名称】中濱 明子

(72)【発明者】

【氏名】川上 浩良

(72)【発明者】

【氏名】朝山 章一郎

(72)【発明者】

【氏名】浅羽 祐太郎

(72)【発明者】

【氏名】松帆 志幸

(72)【発明者】

【氏名】篠原 良輔

【審査官】 伊藤 基章

(56)【参考文献】

【文献】 草津舞, 外4名，高分子学会予稿集，2014年，63巻, 1号，pp. 3021-3022

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｋ ９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

薬剤と遺伝子を対象に共送達することによりエピジェネティクス制御するための複合体であって、当該複合体は脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびプラスミドＤＮＡを含み、
ここで、当該脂質単層被覆型ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、
当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、
当該プラスミドＤＮＡは、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に吸着または結合している、前記複合体。

【請求項2】

生分解性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。

【請求項3】

脂質が、以下：
ステアリルアミン；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
オレイルアミン；および
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
からなる群より選択される、請求項１又は２に記載の複合体。

【請求項4】

ジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンであり、
ここで、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基であり；そして、
当該ポリエチレングリコールは、分子量２，０００〜１００，０００であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてリガンドと結合している；
請求項３に記載の複合体。

【請求項5】

薬剤が、以下：
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；
ヒストンメチル化酵素阻害剤；および
ヒストン脱メチル化酵素阻害剤；からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項6】

プラスミドＤＮＡが、以下：
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；および
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；
からなる群より選択されるＤＮＡを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。

【請求項7】

請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、生分解性ポリマー及び薬剤を含むコア、及び当該コアを被覆する脂質単分子層を含む、単層被覆型ナノ粒子複合体に関する。当該複合体は、その表面にターゲッティング分子を結合しているものであってもよい。あるいは、当該複合体は、その表面にプラスミドＤＮＡが吸着または結合しているものであってもよい。本出願はさらに、当該複合体を含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

中枢神経系疾患の発病原因の１つとして、脳の神経細胞内で活性酸素種が増加することにより細胞の変性やアポトーシスが誘導される事象が指摘されている。脳神経細胞内に抗酸化剤を送達させ、脳内で抗酸化を行うことでこれら神経変性疾患の治療へのアプローチとなることが期待される。しかし、脳内に抗酸化剤を送達させるにあたり、血液脳関門（ＢＢＢ）と呼ばれる障壁が存在する。ＢＢＢは脳血管内皮細胞がタイトジャンクションによって密に結合した構造をしており、脳毛細血管から神経細胞へのあらゆる物質の侵入を物理的に阻害している。脳神経細胞内に抗酸化剤を送達するにあたっては、ＢＢＢを通過するためのドラッグデザインが必須であるが、この目的を達成可能なキャリアは少なく、さらなる研究開発が臨まれている。

【0003】

ところで、１９６０年代以降、ヒストンのアセチル化と緊密なクロマチン構造のリモデリングが、遺伝子誘導と関係していることが認識されてきたが、遺伝子が転写因子とヒストンアセチル化によって転写活性化される分子機序がよく理解されるようになったのは、つい最近のことである。遺伝子発現制御にはクロマチン構造の変化が重要であり、このようにクロマチンの構造変化により遺伝子発現の制御を行う機構はエピジェネティクス機構と呼ばれている。クロマチン構造は前述したヒストンアセチル化やＤＮＡ／ヒストンのメチル化などの後天的な化学修飾により変化し、この後天的修飾は様々な要因で起こり得るものである。また、近年ではエピジェネティクな異常が疾患の発症、病理の悪化に関係することが報告されており、疾患治療においてはエピジェネティクな異常を正常化することを考慮に入れる必要がある。

【0004】

生分解性ポリマーおよび脂質を含む粒子を用いて薬剤または遺伝子を送達する試みが当該技術分野においてなされてきた（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。また、生分解性ポリマーおよび脂質を含む粒子を用いて薬剤を送達する試みにおいて、特定の細胞や組織への送達を意図して脂質に細胞表面レセプターのリガンドを結合させる試みがなされている（非特許文献３〜６）。

【0005】

しかし、経鼻投与のために最適化された粒子の構成は検討されておらず、また、薬剤および遺伝子の両方を送達して、エピジェネティクス制御による遺伝子発現制御を行う試みもなされていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特表２０１４−５２６４４２号公報

【特許文献2】特表２０１０−５２３５９５号公報

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Rajendran JC Bose, et al., Int. J. Nanomedicine, 2015, Vol.10, p.5367-5382

【非特許文献2】Qui Zhong, et al., Journal of Nanobiotechnology, 2010, Vol.8, p.6

【非特許文献3】Peng Zhang et al., ONCOLOGY LETTERS, 2015, Vol.9, p.1065-1072

【非特許文献4】Jinsong Ding et al., RSC Advances, 2015, Vol.5, p.16931-16939

【非特許文献5】Cai L et al., Journal of nanoscience and nanotechnology, 2015, Vol.15 p.4792-4798

【非特許文献6】Jun Chen et al., Biomaterials, 2013, Vol.34, p.3870-3881

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上述のように、脳神経細胞内への薬剤の送達や、エピジェネティックな異常に対する治療のための、新しいドラッグデザインの開発が求められている。本出願は、生分解性ポリマーおよび脂質を含むナノ粒子について、これらのドラッグデザイン開発の観点から適したキャリアを提供する。すなわち、本出願は、生分解性ポリマー及び薬剤を含むコア、及び当該コアを被覆する脂質単分子層を含む、単層被覆型ナノ粒子複合体を提供する。当該複合体は、その表面にターゲッティング分子を結合しているものであってもよい。あるいは、当該複合体は、その表面にプラスミドＤＮＡが吸着または結合しているものであってもよい。本出願はさらに、当該複合体を含む医薬組成物を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

以上に鑑み、本件の発明者は、生分解性ポリマーおよび脂質を含むナノ粒子キャリアに注目し、研究を開始した。鋭意検討の結果、経鼻投与による神経保護のための複合体およびエピジェネティクス制御するための複合体として適したキャリアの構成を見いだした。当該知見に基づいて、本発明は完成された。

【0010】

すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。

【0011】

［１］経鼻投与による神経保護のための複合体であって、単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびターゲッティング分子を含み、
ここで、当該脂質単層被覆型ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、
当該薬剤は、生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして
当該ターゲッティング分子は、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に結合している、前記複合体。

【0012】

［２］生分解性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、上記［１］に記載の複合体。

【0013】

［３］脂質が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンである、
ここで、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基であり；そして、
当該ポリエチレングリコールは、分子量２，０００〜１００，０００であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてタンパク質と連結可能な基を有するものである；
上記［１］又は［２］に記載の複合体。

【0014】

［４］ターゲッティング分子が、ラクトフェリンまたはコムギ胚芽凝集素であり、そして当該ターゲッティング分子は、当該脂質と共有結合することにより、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に結合している、上記［１］〜［３］のいずれか１項に記載の複合体。

【0015】

［５］薬剤が、抗酸化剤であり、当該抗酸化剤は以下：ポルフィリン系抗酸化剤、フタロシアニン系抗酸化剤、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロテノイド、キサントフィル類、ポリフェノール、フラボノイド類、からなる群より選択される、上記［１］〜［４］のいずれか１項に記載の複合体。

【0016】

［６］抗酸化剤が、ポルフィリン系抗酸化剤であり、当該ポルフィリン系抗酸化剤は、
下記式（Ｉ）で表されるカチオン性金属ポルフィリン錯体：

【0017】

【化1】

【0018】

（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ_１、Ａｒ_２、Ａｒ_３、およびＡｒ_４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、そしてＡｒ_１、Ａｒ_２、Ａｒ_３、およびＡｒ_４、の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である）；および
下記式（ＩＩ）で表されるカチオン性金属ポルフィリンダイマー：

【0019】

【化2】

【0020】

（式中、
Ｍは錯体を形成するための金属原子を示し、
Ａｒ_１およびＡｒ_１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフ
ィリンにそれぞれ結合しており、
Ａｒ_２、Ａｒ_３、およびＡｒ_４、並びに、Ａｒ_２’、Ａｒ_３’、およびＡｒ_４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基を示し、
Ｘは、−ＣＨ_２−フェニル−ＣＨ_２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ_２Ｈ_４−（ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ａ− ・・・・ （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ_２Ｈ_４−（ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２− ・・・ （ＩＶ）
−Ｃ_３Ｈ_６−（ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２− ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す））
からなる群より選択される、上記［５］に記載の複合体。

【0021】

［７］上記［１］ないし［６］のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。

【0022】

［８］脳疾患を治療するための、上記［１］ないし［６］のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。

【0023】

［９］薬剤と遺伝子を対象に共送達することによりエピジェネティクス制御するための複合体であって、当該複合体は脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびプラスミドＤＮＡを含み、
ここで、当該脂質単層被覆型ナノ粒子は、生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、
当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、
当該プラスミドＤＮＡは、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に吸着または結合している、前記複合体。

【0024】

［１０］生分解性ポリマーが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される、上記［９］に記載の複合体。

【0025】

［１１］脂質が、以下：
ステアリルアミン；
１，２−ジオレオイルオキシ−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
オレイルアミン；および
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
からなる群より選択される、上記［９］又は［１０］に記載の複合体。

【0026】

［１２］ジアシルホスファチジルエタノールアミンが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンであり、
ここで、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０の飽和または不飽和アシル基であり；そして、
当該ポリエチレングリコールは、分子量２，０００〜１００，０００であり、一方の末端
はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてリガンドと結合している；
上記［１１］に記載の複合体。

【0027】

［１３］薬剤が、以下：
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；
ヒストンメチル化酵素阻害剤；および
ヒストン脱メチル化酵素阻害剤；からなる群より選択される、上記［９］〜［１２］のいずれか１項に記載の複合体。

【0028】

［１４］プラスミドＤＮＡが、以下：
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；および
エピジェネティクスの制御に関わる酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；
からなる群より選択されるＤＮＡを含む、上記［９］〜［１３］のいずれか１項に記載の複合体。

【0029】

［１５］上記［９］〜［１５］のいずれか１項に記載の複合体を含む、医薬組成物。

【発明の効果】

【0030】

本発明の複合体は、生分解性ポリマーのコアを脂質単層で被覆した構造を有することにより、安定性が向上しており、薬剤および／またはプラスミドＤＮＡを目的の組織に送達するためのキャリアとして有用である。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１は、ラクトフェリン（Ｌｆ）修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の模式図である。

【図2】図２は、エピジェネティクス制御するための脂質単層被覆型粒子の模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。

【0033】

経鼻投与による神経保護のための複合体
一態様において、本出願は、経鼻投与による神経保護のための複合体であって、脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびターゲッティング分子を含む、前記複合体に関する。当該脂質単層被覆型ナノ粒子は生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、当該ターゲッティング分子は当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に結合している。

【0034】

脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびターゲッティング分子で構成される複合体を調製する手順は、図１の模式図に示される構造が調製される限りにおいて特に制限はない。例えば、生分解性ポリマーおよび薬剤の溶液を、脂質溶液中に滴下し、合わせた溶液を超音波処理により粒子を形成することで、薬剤を含む脂質単層被覆型ナノ粒子を形成することができる。ターゲッティング分子を、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に共有結合させることで、脂質単層被覆型ナノ粒子をターゲティング分子で修飾することができる。複
合体を形成する条件は、当業者が適宜選択することができる。

【0035】

単層被覆型ナノ粒子のコアとなる生分解性ポリマー、単層被覆型ナノ粒子のコアをコートする脂質、薬剤、およびターゲッティング分子としては、以下に詳述するものを用いることができる。

【0036】

生分解性ポリマーは、特に限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される生分解性ポリマーである。

【0037】

経鼻投与による神経保護のための複合体について用いられる脂質は、ポリエチレングリコールで修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンであり、当該アシル基は、炭素数が１２〜２０、好ましくは炭素数が１６〜２０、さらに好ましくは炭素数が１８の飽和または不飽和アシル基であり、そして、当該ポリエチレングリコールは分子量（Ｍｗ）２，０００〜１００，０００、好ましくは５，０００〜８０，０００、５，０００〜５０，０００、または８，０００〜３０，０００、であり、一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてタンパク質と連結可能な基を有する。

【0038】

上記のような脂質の具体例としては、以下の構造を有する脂質が挙げられる。

【0039】

【化3】

【0040】

［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、Ｃ_{１３−１９}アルキルまたはＣ_{１３−１９}アルケニル、好ましくはＣ_{１５−１９}アルキルまたはＣ_{１５−１９}アルケニル、さらに好ましくはＣ_１７アルキルであり；
Ｒ^３は、タンパク質と連結可能な基であり；
ｎは、５０〜２２００の間の整数、好ましくは１００〜１８００、１００〜１０００、１５０〜７００、または１５０〜４００の間の整数である］
「タンパク質と連結可能な基」は、タンパク質のアミノ基、カルボキシル基またはチオール基と共有結合可能な基であれば特に限定されないが、例えば、アミノ基、カルボキシル基、マレイミド基、アルデヒド基、が挙げられる。

【0041】

経鼻投与による神経保護のための複合体について用いられるターゲッティング分子は、鼻腔内の細胞に存在するレセプターに対するリガンドであれば特に限定されないが、例えば、ラクトフェリン、コムギ胚芽凝集素が挙げられる。ターゲッティング分子は、上記脂質におけるタンパク質と連結可能な基と共有結合を形成することで、脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に提示される。

【0042】

経鼻投与による神経保護のための複合体について用いられる薬剤は、特に限定されないが、抗酸化剤がこれに含まれる。抗酸化剤の例として、例えば、ポルフィリン系抗酸化剤
、フタロシアニン系抗酸化剤、アスコルビン酸、グルタチオン、尿酸、メラトニン、ウロビリノーゲン、トコフェロール類、トコトリエノール類、カロテノイド、キサントフィル類、ポリフェノール、フラボノイド類、が挙げられる。

【0043】

ポルフィリン系抗酸化剤として、例えば、カチオン性金属ポルフィリン錯体またはカチオン性金属ポルフィリンダイマーが挙げられる。

【0044】

カチオン性金属ポルフィリン錯体は、下記の式（Ｉ）：

【0045】

【化4】

【0046】

で表される化合物であってもよい。

【0047】

前記式（Ｉ）における中心金属Ｍは、特に制限はないが、好ましくは遷移金属である。例えば、中心金属Ｍは、マンガン原子、ニッケル原子、鉄原子、銅原子、コバルト原子、および亜鉛原子からなる群より選択することができる。さらに好ましい中心金属はマンガン原子である。

【0048】

前記式（Ｉ）におけるＡｒ_１、Ａｒ_２、Ａｒ_３、およびＡｒ_４、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基である。当該芳香族基は、単環式のものでも、多環式のものでも、あるいは、縮合環式のものであってもよい。炭素環式の芳香族基としては例えば、炭素数６〜３６、好ましくは６〜２０の単環式、多環式、または縮合環式の炭素環式芳香族基が挙げられる。これには例えば、ベンゼン環、ナフタレン環などから誘導される基が挙げられる。複素環式の芳香族基としては、１個または２個以上の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜１０員の単環式、多環式、または縮合環式の複素環から誘導される基である。これには例えば、イミダゾール環、ピリジン環、ピリミジン環、アゾール環などから誘導される基である。好ましい芳香族基としては、フェニル基や２−イミダゾリル基などが挙げられる。

【0049】

前記式（Ｉ）のＡｒ_１、Ａｒ_２、Ａｒ_３、およびＡｒ_４の少なくとも１つはカチオン性の基を有する芳香族基である。芳香族基が有するカチオン性の基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキル基などによりカチオン化されたアンモニウム基やスルホニウム基などが挙げられるが、第四級アンモニウム基が好ましい。これらのカチオン性の基は芳香族基に直接結合していてもよいが、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは炭素数１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキレン基を解して結合していてもよい、また、カチオン性の基は芳香族基の置換基として有していてもよいが、芳香族基の異種原子、好ましくは窒素原子が炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは
１〜５程度の直鎖状または分枝状のアルキル基などによりカチオン化されたものであってもよい。このような芳香族基としては、例えば、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノフェニル基、４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアミノフェニル基などの４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ低級アルキルアミノフェニル基、Ｎ−メチル−４−ピリジル基、Ｎ−エチル−４−ピリジル基などのＮ−低級アルキル−４−ピジリル基、Ｎ，Ｎ’−ジ置換イミダゾール基などが挙げられる。また、これらのカチオン性の基を有する芳香族基が、フェニル基やナフチル基などの炭素環式芳香族基に直接またはアルキレン基、アミド基、またはエステル基などを解して結合した基となっていてもよい。

【0050】

これらの芳香族基は、置換基を有していてもよい。芳香族基が有していてもよい置換基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基、アミノ基、前記したアルキル基で置換されているアミノ基、前記したアルキル基を含むアルコキシ基などが挙げられる。

【0051】

カチオン性金属ポルフィリンダイマーは、下記の式（ＩＩ）：

【0052】

【化5】

【0053】

で表される化合物であってもよい。

【0054】

前記式（ＩＩ）における中心金属Ｍは、特に制限はないが、好ましくは遷移金属である。例えば、中心金属Ｍは、マンガン原子、ニッケル原子、鉄原子、銅原子、コバルト原子、および亜鉛原子からなる群より選択することができる。さらに好ましい中心金属はマンガン原子である。

【0055】

前記式（ＩＩ）におけるＡｒ_１およびＡｒ_１’はピリジンを示し、ここでピリジンの１位はＸに、４位がポルフィリンにそれぞれ結合している。

【0056】

前記式（ＩＩ）におけるｒ_２、Ａｒ_３、およびＡｒ_４、並びに、Ａｒ_２’、Ａｒ_３’、およびＡｒ_４’、はそれぞれ独立して無置換のまたは置換基を有してもよい炭素環式または複素環式芳香族基である。当該芳香族基は、単環式のものでも、多環式のものでも、あるいは、縮合環式のものであってもよい。炭素環式の芳香族基としては例えば、炭素数６〜３６、好ましくは６〜２０の単環式、多環式、または縮合環式の炭素環式芳香族基が挙げられる。これには例えば、ベンゼン環、ナフタレン環などから誘導される基が挙げられる。複素環式の芳香族基としては、１個または２個異常の窒素原子、酸素原子または硫黄原子を有する５〜１０員の単環式、多環式、または縮合環式の複素環から誘導される基である。これには例えば、ピリジン環、ピリミジン環、アゾール環などおから誘導される基である。好ましい芳香族基としては、フェニル基や４−ピリジル基などが挙げられる。

【0057】

これらの芳香族基は、置換基を有していてもよい。芳香族基が有していてもよい置換基としては、炭素数１〜２０、好ましくは炭素数１〜１０、さらに好ましくは１〜５の直鎖状または分枝状のアルキル基、アミノ基、前記したアルキル基で置換されているアミノ基、前記したアルキル基を含むアルコキシ基などが挙げられる。

【0058】

前記式（ＩＩ）において、Ｘは、−ＣＨ_２−フェニル−ＣＨ_２−であるか、下記式（ＩＩＩ）ないし（Ｖ）のいずれかで表される：
−Ｃ_２Ｈ_４−（ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２）_ａ− ・・・・ （ＩＩＩ）
（式中、ａは、１〜１０の整数を示す）
−Ｃ_２Ｈ_４−（ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２− ・・・ （ＩＶ）
−Ｃ_３Ｈ_６−（ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２）ｂ−ＮＨ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２− ・・・（Ｖ）
（式中、ｂは３〜５の整数を示す）
好ましくは、Ｘは−ＣＨ_２−フェニル−ＣＨ_２−である。

【0059】

経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物
別の態様において、本出願は、上記の経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物に関する。

【0060】

経鼻投与は、鼻腔内への噴霧または吸引により行うことができる。鼻腔内への噴霧は、所定の容量の複合体を、空気又は人体に悪影響のないガス（窒素ガス、アルゴンガス、二酸化炭素ガス、代替フロンガス等）とともに鼻腔内へ噴霧することにより達成できる。噴霧は、当該技術分野において通常用いられている経鼻投与用器具を使用することができる。吸引による経鼻投与は、本発明の組成物の一定量をカプセルまたはブリスターパック等に充填し、これを吸引器具に装着して吸引することにより行うことができる。

【0061】

経鼻投与のための医薬組成物は、本発明の複合体の他、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、保存剤、防腐剤等を含んでいてもよい。

【0062】

経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物の有効投与量は病態や患者により相違するが、一般には、薬剤がポルフィリン系抗酸化剤である場合、１日あたり抗酸化剤が１μｇ〜１ｇになるように投与することができる。本発明の医薬組成物は、１回で投与する、１日数回にわけて投与する、あるいは、連続的に投与する。医師をはじめとする医療従事者は、患者の属性および／または病態等に応じて、本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔、投与時間、投与手順、投与部位等の用法または用量を適宜決定することができる。そのようにして適宜決定される用法または用量で投与される本発明の医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。

【0063】

本発明の、経鼻投与による神経保護のための複合体を含む医薬組成物による予防や治療に適する疾患としては、脳への薬剤送達が治療のために好ましい疾患が挙げられる。このような疾患の例としては、特に限定されるものではないが、アルツハイマー型認知症やパーキンソン病などの脳疾患が挙げられる。

【0064】

エピジェネティクス制御するための複合体
一態様において、本出願は、薬剤と遺伝子を対象に共送達することによりエピジェネティクス制御するための複合体であって、脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびプラスミドＤＮＡを含む、前記複合体に関する。当該脂質単層被覆型ナノ粒子は生分解性ポリマーを含むコア及び当該コアをコートする脂質単分子層を含み、当該薬剤は生分解性ポリマーを含むコア中に存在し、そして、当該プラスミドＤＮＡは当該脂質単層被覆型ナノ粒子の
表面に吸着または結合している。

【0065】

脂質単層被覆型ナノ粒子、薬剤、およびプラスミドＤＮＡで構成される複合体を調製する手順は、図２の模式図に示される構造が調製される限りにおいて特に制限はない。例えば、生分解性ポリマー、薬剤および脂質の溶液に貧溶媒を添加した後、撹拌して粒子を形成することで、薬剤を含む脂質単層被覆型ナノ粒子を形成することができる。プラスミドＤＮＡと脂質単層被覆型ナノ粒子とを混合して、当該脂質単層被覆型ナノ粒子の表面に吸着または結合させることで、プラスミドＤＮＡと脂質単層被覆型ナノ粒子を複合化することができる。複合体を形成する条件は、当業者が適宜選択することができる。

【0066】

単層被覆型ナノ粒子のコアとなる生分解性ポリマー、単層被覆型ナノ粒子のコアをコートする脂質、薬剤、およびターゲッティング分子としては、以下に詳述するものを用いることができる。

【0067】

生分解性ポリマーは、特に限定されないが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体、ポリカプロラクトン、ポリジオキサノン、およびキトサン、からなる群より選択される生分解性ポリマーである。

【0068】

エピジェネティクス制御するための複合体について用いられる脂質は、生分解性ポリマー粒子の表面上で単分子層を形成可能な脂質であれば、特に限定されないが、例えば、以下：
ステアリルアミン；
１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；
ジアシルホスファチジルエタノールアミン；
Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；
１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；
オレイルアミン；
１，２−ジミリストイルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）；
が挙げられる。

【0069】

ジアシルホスファチジルエタノールアミンは、上記「経鼻投与による神経保護のための複合体」の項目において記載した、ポリエチレングリコールで修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンであってもよい。この場合において、ポリエチレングリコールの一方の末端はジアシルホスファチジルエタノールアミンのアミノ基に連結しており、および、他方の末端においてリガンドと結合している。リガンドは、特に限定されないが、本発明の複合体を送達することが好ましい細胞、組織等に存在するリガンドであってよい。一態様において、リガンドと結合しているポリエチレングリコールで修飾されたジアシルホスファチジルエタノールアミンは、以下の構造を有する脂質であってよい。

【0070】

【化6】

【0071】

［式中、
Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、Ｃ_{１３−１９}アルキルまたはＣ_{１３−１９}アルケニル、好ましくはＣ_{１５−１９}アルキルまたはＣ_{１５−１９}アルケニル、さらに好ましくはＣ_１７アルキルであり；
Ｒ^３は、リガンドである；
ｎは、５０〜２２００の間の整数、好ましくは１００〜１８００、１００〜１０００、１５０〜７００、または１５０〜４００の間の整数である］
エピジェネティクス制御するための複合体について用いられる薬剤は、特に限定されないが、例えば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、スラミン（Suramin））、ヒストンメチル化酵素阻害剤（例えば、ＥＺＨ２の阻害剤で
あるEPZ005687（１−シクロペンチル−Ｎ−［（１，２−ジヒドロ−４，６−ジメチル−
２−オキソ−３−ピリジニル）メチル］−６−[４−（４−モルホリニルメチル）フェニ
ル］−１Ｈ−インダゾール−４−カルボキサミド））、ヒストン脱メチル化酵素阻害剤（例えば、アデノシン−２’，３’−ジアルデヒド（Adox））が挙げられる。

【0072】

プラスミドＤＮＡは、本願の複合体に含まれるプラスミドＤＮＡは、特に限定されないが、本願の複合体を適用する対象において、酵素またはタンパク質の発現量または活性を変調することができるものである。このようなプラスミドＤＮＡとして、例えば、酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡ；対象において酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡ；あるいは、酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ；を含むプラスミドＤＮＡが挙げられる。

【0073】

酵素またはタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象において当該酵素またはタンパク質を発現する。それにより、当該酵素またはタンパク質の発現量を増加させることができる。

【0074】

対象において酵素またはタンパク質の発現を抑制するアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡをコードするＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象においてアンチセンス核酸または二本鎖ＲＮＡを発現する。それにより、アンチセンス核酸の作用またはＲＮＡ干渉の作用に基づいて、当該酵素またはタンパク質の発現を抑制することができる。

【0075】

酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントをコードするＤＮＡは、本願の複合体が適用された対象において当該酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントを発現する。それにより、当該酵素またはタンパク質の活性が抑制または亢進する。特定の酵素またはタンパク質に結合する抗体またはそのフラグメントは当業者に周知の方法により作製することができ、またそれらをコードするＤＮＡも当業者は適宜同定することができる。抗体のフラグメントは、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、Ｆｖ、ｓｃＦｖが含まれる。

【0076】

エピジェネティクス制御するための複合体を含む医薬組成物
別の態様において、本出願は、上記のエピジェネティクス制御するための複合体を含む医薬組成物に関する。

【0077】

本発明の医薬組成物は、経口投与、または、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、もしくは経直腸投与などの非経口投与により投与することができる。経口投与に適した製剤には、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤、シロップ剤などが挙げられる。非経口投与に適した製剤として、本発明の医薬組成物を無菌溶液または坐剤として調
製してもよい。本発明の医薬組成物は公知の方法により製剤化することができ、投与方法や患者により適宜製剤することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明の抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を有効成分として含有し、これに製薬上許容される担体、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着香料、着色剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などと共に公知の方法により製剤化することができる。

【0078】

本発明の医薬組成物の有効投与量は、病態や患者により相違するが、一般的には、１日あたり抗酸化剤が１μｇ〜１ｇ、プラスミドＤＮＡが０．６ｍｇ〜６００ｍｇになるように投与することができる。本発明の医薬組成物は、１回で投与する、１日数回にわけて投与する。あるいは、連続的に投与する。医師をはじめとする医療従事者は、患者の属性および／または病態等に応じて、本発明の医薬組成物の投与量、投与間隔、投与時間、投与手順、投与部位等の用法または用量を適宜決定することができる。そのようにして適宜決定される用法または用量で投与される本発明の医薬組成物もまた、本発明の範囲内である。

【0079】

本発明の抗酸化剤と遺伝子を対象に共送達するための複合体を有効成分とする医薬組成物による予防や治療に適する疾患としては、エピジェネティクスの異常で引き起こされる疾患が挙げられる。このような疾患の例としては、特に限定されるものではないが、例えば炎症性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの炎症性疾患、大腸がん、乳がん、糖尿病、アルツハイマー型認知症等が挙げられる。

【実施例】

【0080】

以下に本発明の具体例を示す。これらの具体例は、本発明を理解するための説明を提供することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0081】

実施例１：ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐの製造
（１）Ｈ_２ＭＩｍＰ_３Ｐ（５−（１−メチルイミダゾール−２−イル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ,２３Ｈ−ポルフィリン）の合成
５００ｍｌの三つ口フラスコにプロピオン酸３００ｍｌを加え、１７０℃にて３０分間攪拌・還流した。温度一定後、ベンズアルデヒド７．８６ｍｌ、１−メチル−２−イミダゾールカルボキシアルデヒド４．０ｇを加え、続いて精製したピロールを８ｍｌ加えた。１時間加熱攪拌後、９０℃まで放冷し、エチレングリコール２００ｍｌを滴下した。室温まで放冷した後、冷蔵庫で一晩静置した。冷却後の溶液を吸引濾過し、冷やしたメタノール洗浄した後に紫粉末の６種類のポルフィリンからなる混合物を回収した。得られたポルフィリンの混合物を、シリカゲルクロマトグラフィーによりメタノール：クロロホルム＝１：２０の溶媒で溶出させ、２番目に溶出してきたＨ_２ＭＩｍＰ_３Ｐを回収した。ロータリーエバポレーターで分画の溶媒を留去し、目的のポルフィリンを得た。
（２）Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐ（５−（１，３−ジメチルイミダゾリウム−２−イル）−１０，１５，２０−トリフェニル−２１Ｈ,２３Ｈ−ポルフィリン）の合成
前記（１）で得たポルフィリンＨ_２ＭＩｍＰ_３Ｐをクロロホルム１０ｍｌに溶解させ、１００ｍｌ三つ口フラスコに加え、続いてヨードメタン１０ｍｌを加え、４０℃で１８時間還流した。ロータリーエバポレーターにより、反応混合物の溶媒を留去し、目的物となるＨ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐを回収した。合成の確認は、^１Ｈ−ＮＭＲとＵＶ−ｖｉｓスペクトルで行った。

【0082】

Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐの極大吸収波長：λｍａｘ ４６３ｎｍ（ｓｏｒｅｔ帯）
Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐの^１Ｈ−ＮＭＲ：９．１０（２Ｈ）（ジメチルイミダゾリウムの４，５位の水素原子）８．９０（４Ｈ）（ピロールのβ位の水素原子）８．７６（４Ｈ）（ピロールのβ位水素原子）８．２１（６Ｈ）（フェニル基のオルト位の水素原子）７．８
１（９Ｈ）（フェニル基のメタ、パラ位の水素原子）−２．６３（２Ｈ）（環内部の水素原子）
（３）Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３ＰへのＭｎ導入
１００ｍｌの三つ口フラスコに前記（２）で得られたＨ_２ｄＭＩｍＰ３Ｐを加えて、メタノールに溶解させた後、１０当量の酢酸マンガン４水和物を加え、５０℃で加熱還流し、ＵＶ−可視スペクトルを用いてポルフィリンのソーレー帯のシフトおよび吸光度変化から金属導入の確認ができるまで反応を行った。反応終了後、エバポレートすることで溶媒を留去した。得られた固体を水に再溶解させ、ヘキサフルオロリン酸アンモニウムを適量加え、吸引濾過し、濾紙上の緑色固体を回収した。ろ物を適量のメタノールに溶解させ、イオン交換樹脂（Ｃｌ⁻）を用いたカラムを行い、ＭｎポルフィリンのカウンターイオンをＣｌ⁻に交換した。合成の確認はＵＶスペクトル測定およびＦＡＢ−ＭＡＳＳで行った。結果を次に示す。

【0083】

Ｈ_２ｄＭＩｍＰ_３Ｐの極大吸収波長：４６７ｎｍ（ｓｏｒｅｔ帯）ＦＡＢ−ＭＡＳＳ測定において、目的物の分子量である６８６にピークが観測された。

【0084】

ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐの構造式：

【0085】

【化7】

【0086】

なお、実施例２以降は、“ＭｎｄＭＩｍＰ_３Ｐ”を単に“ＭｎＰ”と記載することがある。

【0087】

実施例２：ラクトフェリン（Ｌｆ）修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の合成
（１）ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の調製
次式：

【0088】

【化8】

【0089】

で表されるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ ３．７５ｍｇと、４ｗｔ％エタノール３．７５ｍｌを１０ｍｌバイアル瓶に加え、６５℃で加熱することで完全に溶解させた。溶解後、１００ｍｌビーカー中で、蒸留水（ＤＷ）で１００ｍｌまでメスアップした（ａ）。ＰＬＧＡ（ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）共重合体／Mw 10000） ２５ｍｇとＭ
ｎＰ ０．５ｍｇをアセトニトリル１０ｍｌに加え、スターラー攪拌している上記（ａ）にピペッターで滴下した。滴下後、５分間超音波処理し、粒子を形成した。形成した粒子の含まれる溶液を５０ｍｌ遠沈管２本に移し入れ、遠心分離（１２５００ｒｐｍ，２０分×２回）により粒子の精製を行うことでＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子分散液を得た。粒径は１１１±２５ｎｍ、ゼータ電位は−６４ｍＶの値を示した。
（２）Ｌｆのチオール化
Ｌｆ ３１．２ｍｇをホウ酸バッファー（ＢＢ：０．１Ｍ，ｐＨ８．５）１ｍｌに加え、冷蔵庫内で３時間攪拌した。２−イミノチオラン１ｍｇをＢＢ ２ｍｌに溶解し、上記のＬｆを含む溶液に１００μｌ添加し、Ｎ_２フロー下で１時間反応させた。反応終了後、ＢＢ ４ｍｌを追加し、１００μｌサンプリングした。その後、リン酸バッファー（ＰＢ：５０ｍＭ，ｐＨ７．４）１００ｍｌを加えた２００ｍｌビーカーで分画分子量１０ｋＤａの透析膜を用い、３日間透析を行った。反応後溶液を遠心分離（１４５００ｒｐｍ，４℃，２０分×２回）し、上澄を回収することで凝集体を除去した。また、反応後溶液として１００μｌサンプリングした。

【0090】

反応前後のサンプリングした溶液でアミノ基定量及びチオール基定量を行い、チオール化率を次式：

【0091】

【数1】

【0092】

により算出した。反応後のＬｆのチオール化率は５６％と算出された。
（３）Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の合成
チオール化したＬｆとＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の表面に存在するマレイミド基のモル比が２：１になるように、チオール化したＬｆ溶液３０μｌとＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子分散液１．８ｍｌを１０ｍｌバイアル瓶中で、室温で１０時間攪拌させた。反応後、フリーのＬｆを除くために遠心分離（１２５００ｒｐｍ，２０分間，４℃×２回）で精製を行うことでＬｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子分散液を得た。上澄溶液を分注しておき、上澄溶液中に含まれるタンパク量を定量することで、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子へのＬｆ修飾量を算出した。粒子１つあたり、１４４個のＬｆが修飾されている結果となった。粒径は１７１±４８ｎｍ、ゼータ電位は−１５ｍＶの値を示した。

【0093】

実施例３：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞表面への結合評価
細胞表面への結合評価は、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来細胞）を用いて行った。ＰＣ１２細胞の培養は、１０％ＨＳ、５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ_２、４℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、２×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で４８ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、３度の培地洗浄により細胞膜にリガンドとレセプターの相互作用以外で付着している各種粒子を除去した。洗浄後、１００μｌ／ウェルのcell lysisで細胞を溶解させ、細胞溶解液をサンプル管に回収した。細胞溶解液の上清をサンプルとし、細胞表面に結合した金属ポルフィリンを、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルによって定量した。

【0094】

Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞膜表面への結合量は、０．１６±０．０４μｇ／ｍｇタンパク質となった。これは、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の０．０３±０．００５μｇ／ｍｇタンパク質と比較して５倍程度増加した。

【0095】

実施例４：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞膜内への取り込み評価
細胞膜内への取り込み評価は、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来細胞）を用いて行った。ＰＣ１２細胞の培養は１０％ＨＳ、５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、２×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で４８ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ（−）洗浄により細胞膜に付着している各種粒子を除去した。洗浄後、１００μｌ／ウェルのcell lysisで細胞を溶解させ、細胞溶解液をサンプル管に回収した。細胞溶解液の上清をサンプルとし、細胞内に取り込まれている金属ポルフィリンを、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルによって定量した。

【0096】

Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の細胞膜内への取り込み量は、０．２６±０．０７μｇ／ｍｇタンパク質となった。これは、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の０．０４±０．０２μｇ／ｍｇタンパク質と比較して、７倍程度増加した。

【0097】

実施例５：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子のトランスサイトーシス評価
トランスサイトーシス評価は、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ヒト気道上皮細胞）を用いて行った。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞の培養は５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、２×１０^４ｃ細胞／ウェルの細胞密度でトランスウェルプレートの上層に播種し、下層には、蒸留水を１００μｌ添加し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、上層に播種した細胞内をトランスサイトーシスし、下層に送達された各種粒子中に含まれる金属ポルフィリンを、ＵＶ−ｖｉｓスペクトルによって定量した。

【0098】

Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子のトランスサイトーシスにより、下層に送達された粒子中のＭｎＰ量は、０．４±０．０３μｇ／ｍｇタンパク質となった。これは、ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の０．０７±０．０１μｇ／ｍｇタンパク質と比較して、６倍程度増加した。

【0099】

実施例６：Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子の神経細胞保護効果
神経細胞保護効果の評価は、ＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質由来細胞）を用いて行った。ＰＣ１２細胞の培養は１０％ＨＳ、５％ＦＢＳ、１％抗生物質含有ＤＭＥＭ培地にて５％ＣＯ_２、３７℃の条件で行った。コンフルエントになった細胞を計測して、１×１０^４細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルプレート上に播種し、２４時間インキュベーター内で培養した。ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を各種濃度が１０μＭになるように添加し、４時間培養後、培地を除去し、パラコート（１，１’−ジメチル−４，４’−ジピリジニウムジクロリド）を培地中濃度が３００μＭになるように添加した。２４時間インキュベート後、培地を交換し、アラマーブルーを１０μｌ／ウェルで加え、４時間インキュベートした。インキュベート後、プレートリーダーを用いて、波長５７０ｎｍ及び５９０ｎｍの吸光度を測定することで細胞生存率を算出した。
パラコートを添加した細胞群では、細胞生存率は、８９±３％まで低下し、Ｌｆ修飾ＭｎＰ含有脂質単層被覆型粒子を前添加した細胞群においては、細胞生存率が１０３±１％まで向上し、神経細胞保護効果が示された。

【0100】

実施例７：脂質単層被覆型粒子の調製
ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）（２．５ｍｇ）、ＰＬＧＡ（２５ｍｇ）及びステアリルアミン（３．７５ｍｇ）はアセトン（２５００μＬ）に溶解し、１５分静置した。この溶液に対し、エタノール／蒸留水（５０／５０％，ｖ
／ｖ）混合溶媒１２００μＬを２ｍＬ／分で滴下し、４００ｒｐｍで５分間撹拌した。本溶液は蒸留水１０ｍＬに滴下し、目的の粒子懸濁液を得、粒子懸濁液は１３０００ｒｐｍ／２０ｍｉｎの遠心分離により精製した。脂質単層被覆型粒子へのＴＳＡ封入はＵＶ−ｖｉｓスペクトルにより評価し、３．５μｇ／１ｍｇ ＮＰｓの封入量となった。最後に、脂質単層被覆型粒子はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）と複合化した。脂質単層被覆型粒子へのｐＤＮＡの複合化は、アガロースゲル電気泳動により評価し、電荷比（＋／−）が２以降でｐＤＮＡのバンドの完全な消失が認められ、脂質単層被覆型粒子との複合化が確認された。

【0101】

実施例８：脂質単層被覆型粒子の機能評価
実施例７において調製した脂質単層被覆型粒子及びｐＤＮＡと複合化した脂質単層被覆型粒子の粒径・ゼータ電位を、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した。また、ｐＤＮＡと複合化していない脂質単層被覆型粒子単体の粒径の経時変化もＤＬＳにより評価した。脂質単層被覆型粒子の粒径は８３．４±２０．８ｎｍ、ゼータ電位は５４．７０ｍＶの値を示した。ｐＤＮＡと複合化した脂質単層被覆型粒子の粒径は１１５．９±２２．０ｎｍ、ゼータ電位は１８．０８ｍＶの値を示した。調製から一か月経過した粒子の粒径は８５．６±２２．５ｎｍ、ゼータ電位は５２．３４ｍＶの値を示した。

【0102】

実施例９：脂質単層被覆型粒子の遺伝子発現
脂質単層被覆型粒子を、ｐＤＮＡとしてｐＧＬ３（プロメガ）を用いて、実施例７と同様の方法で調製した。

【0103】

ＨｅＬａ細胞は１×１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベート後、培地交換を行い、ルシフェラーゼをコードしたｐＤＮＡであるｐＧＬ３（プロメガ）と複合化した脂質単層被覆型粒子を添加した。サンプル添加から２４時間後、培地除去後にＰＢＳ（＋）により細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加し、４８時間インキュベートした。インキュベート後、培地を除去し、細胞はＰＢＳ（＋）により洗浄した。その後、細胞は５×cell lysis（２０μＬ）を添加することにより溶解させた。各種サンプルの化学発光は、ルシフェラーゼ基質（１００μＬ）を各ｗｅｌｌに添加し、ルミノメーターにより測定した。ｐＧＬ３と複合化した脂質単層被覆型粒子を添加した細胞において遺伝子発現が示された。

【0104】

実施例１０：脂質単層被覆型粒子の細胞毒性評価
脂質単層被覆型粒子を、ｐＤＮＡとしてヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡを用い、ＴＳＡを含めずに、実施例７と同様の方法で調製した。

【0105】

ＨｅＬａ細胞は１×１０^４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベート後、培地交換を行い、ヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡと複合化した薬剤を含まない脂質単層被覆型粒子を添加した。サンプル添加から２４時間後、培地除去後にＰＢＳ（＋）により細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加し、４８時間インキュベートした。インキュベート後、培地交換を行い、各ウェルにアラマーブルー（１０μＬ）を添加し添加し４時間インキュベートした。インキュベート後、吸光度（５７０ｎｍ／６００ｎｍ）はプレートリーダーにより測定し、細胞生存率は未処理の細胞の吸光度（５７０ｎｍ／６００ｎｍ）の相対比として算出した。ｐＤＮＡと複合化した薬剤を含まない脂質単層被覆型粒子を添加した細胞において、電荷比（＋／−）が４まで全くの毒性を示さなかった。

【0106】

実施例１１：細胞内エピジェネティクス評価
脂質単層被覆型粒子を、ｐＤＮＡとしてヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡを用いて、実施例７と同様の方法で調製した。

【0107】

ＨｅＬａ細胞は１×１０^５細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種した。一晩のインキュベート後、培地交換を行い、ヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡと複合化したＴＳＡ脂質単層被覆型粒子を添加した。サンプル添加から２４時間後、培地除去後にＰＢＳ（＋）により細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加し、４８時間インキュベートした。インキュベート後、細胞は５×cell lysis（２００μＬ）を添加することにより溶解させた。２×サンプルバッファー（メルカプトエタノールを含まない）は各ウェルに等量添加し、最終濃度が１０％となる様にメルカプトエタノールを添加した。その後、ウェスタンブロットに用いるサンプルは、９５℃で５分間、熱処理することにより得た。脂質単層被覆型粒子を添加した細胞におけるヒストンアセチル化量はウェスタンブロット法により評価した。ヒストンアセチル化（Ａｃ−Ｈ３Ｋ９）量はヒストンアセチル化酵素をコードしたｐＤＮＡと複合化したＴＳＡ含有脂質単層被覆型粒子を添加した細胞において、未処理の細胞と比較して１．７５倍となった。

【産業上の利用可能性】

【0108】

本発明の複合体は、生分解性ポリマーのコアを脂質単層で被覆した構造を有することにより、安定性が向上しており、薬剤および／またはプラスミドＤＮＡを目的の組織に送達するためのキャリアとして有用である。特に、血液脳関門の作用により、これまで薬剤の送達が難しかった脳内への薬剤送達や、持続的な効果の発現が必要なエピジェネティクス制御による治療のための医薬組成物として利用できる点で有用である。

【図1】

【図2】