特許 6986965 抗ＰＤ−１抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6986965

(24)【登録日】2021年12月2日

(45)【発行日】2021年12月22日

(54)【発明の名称】抗ＰＤ−１抗体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20211213BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 11/04 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 31/06 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 33/02 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 33/06 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 33/12 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20211213BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20211213BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20211213BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20211213BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20211213BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   A61K39/395 N

   A61P11/00

   A61P11/04

   A61P17/00

   A61P31/00

   A61P31/04

   A61P31/06

   A61P31/10

   A61P31/12

   A61P31/16

   A61P33/02

   A61P33/06

   A61P33/12

   A61P35/00

   A61P35/02

   A61P43/00 105

   C07K16/28

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12P21/08

【請求項の数】15

【全頁数】58

(21)【出願番号】特願2017-525309(P2017-525309)

(86)(22)【出願日】2015年7月22日

(65)【公表番号】特表2017-530722(P2017-530722A)

(43)【公表日】2017年10月19日

(86)【国際出願番号】US2015041575

(87)【国際公開番号】WO2016014688

(87)【国際公開日】20160128

【審査請求日】2018年7月23日

【審判番号】不服2020-6522(P2020-6522/J1)

【審判請求日】2020年5月14日

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2014/082721

(32)【優先日】2014年7月22日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】520509029

【氏名又は名称】アポロミクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ザ チーピン

(72)【発明者】

【氏名】ソン ジーヨン

(72)【発明者】

【氏名】チウ ジュンジュワン

【合議体】

【審判長】 長井 啓子

【審判官】 上條 肇

【審判官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 米国特許第８７３５５５３（ＵＳ，Ｂ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００ − １５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

Ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ｉ）それぞれ配列番号１１５、１１６、及び１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号１１０、１１１、及び１１２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｉｉ）それぞれ配列番号２４、２５、及び２６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号１９、２０、及び２１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｉｉｉ）それぞれ配列番号３４、３５、及び３６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号２９、３０、及び３１のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｉｖ）それぞれ配列番号４５、４６、及び４７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号４０、４１、及び４２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｖ）それぞれ配列番号５５、５６、及び５７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号５０、５１、及び５２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｖｉ）それぞれ配列番号６５、６６、及び６７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号６０、６１、及び６２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｖｉｉ）それぞれ配列番号７５、７６、及び７７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号７０、７１、及び７２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号８５、８６、及び８７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号８０、８１、及び８２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
ｉｘ）それぞれ配列番号９５、９６、及び９７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号９０、９１、及び９２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；または
ｘ）それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；及び
それぞれ配列番号１００、１０１、及び１０２のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；
を含む、１ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、任意で前記抗体またはその抗原結合断片はキメラである、またはヒト化されている、単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項2】

１ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
（ｉ）配列番号１５２と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３１と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｉ）配列番号１３３と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１３１と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｉｉ）配列番号２３と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１８と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｖ）配列番号３３と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号２８と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｖ）配列番号４４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号３９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｖｉ）配列番号５４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号４９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｖｉｉ）配列番号６４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号５９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｖｉｉｉ）配列番号７４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号６９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｉｘ）配列番号８４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号７９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｘ）配列番号９４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号８９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｘｉ）配列番号１０４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号９９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；
（ｘｉｉ）配列番号１１４と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１０９と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１４３と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号１４１と少なくとも９５％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項3】

ＰＤ−１に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、
ｉ）配列番号１５２または１３３の軽鎖可変領域；及び
配列番号１３１の重鎖可変領域；
ｉｉ）配列番号１４３の軽鎖可変領域；及び
配列番号１４１の重鎖可変領域；
ｉｉｉ）配列番号１３９または１５３の軽鎖；及び
配列番号１３５の重鎖；
ｉｖ）配列番号１３９または１５３の軽鎖；及び
配列番号１３７の重鎖；
ｖ）配列番号１４９の軽鎖；及び
配列番号１４５の重鎖；または
ｖｉ）配列番号１４９の軽鎖；及び
配列番号１４７の重鎖
を含む、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項4】

モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ’）_２断片から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項5】

治療剤に連結される、または治療剤と複合体化される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項6】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、ＰＤ−１に対して１ｎＭ〜０．０１ｎＭの親和性を有する、単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項7】

請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片であって、前記抗体が、５ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する、またはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との結合をブロックする、前記単離された抗体またはその抗原結合断片。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片と、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。

【請求項9】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項10】

請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。

【請求項11】

請求項１０に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。

【請求項12】

治療有効量の請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された抗体またはその抗原結合断片を含む、それを必要とする対象において癌または感染症を処置するための医薬組成物であって、
前記癌が、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経膠腫、乳癌、肺癌、結腸癌、骨癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、直腸癌、精巣癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭頸部癌、胃の癌、膵臓癌、またはこれらの組み合わせから成る群から選択され、または
前記感染症が、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核球症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器病、マラリア、住血吸虫症、ならびにトリパノソーマ症から成る群から選択される、前記医薬組成物。

【請求項13】

前記治療剤が、細胞傷害性薬物、放射性同位体、免疫調節剤、または抗体である、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項14】

ＰＤ−１に対して１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の親和性を有する、請求項６に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【請求項15】

５ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２との結合をブロックする、請求項７に記載の抗体またはその抗原結合断片。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年７月２２日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０８２７２１号明細書の優先権を主張し、その全体があらゆる目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

【0002】

発明の分野
本発明は、ＰＤ−１に結合する抗体及びその抗原結合断片、ならびにこのような抗体及び抗原結合断片を使用する方法に関する。

【0003】

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式コピー（ファイル名称：ＣＲＢＩ＿００６＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５）；記録日：２０１５年７月１４日；ファイルサイズ：１４７ＫＢ）。

【背景技術】

【0004】

背景
プログラム死受容体１（ＰＤ−１）は、主としてリンパ球上で発現され、２つのリガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−１は、遺伝子Ｐｄｃｄ１によってコードされる５５ｋＤａのタンパク質であり、リガンドとの結合によって抗原受容体シグナル伝達の下方制御が促進されることが示された（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７−３４（非特許文献１）；Ｌａｔｃｈｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１−８（非特許文献２）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４−４３（非特許文献３））。ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ及びＢＴＬＡなどのメンバーを含む免疫グロブリンスーパーファミリーに属する。ＰＤ−１は、リガンド結合のためのＩｇ可変型（Ｖ型）ドメイン及びシグナル伝達分子の結合のための細胞質尾部を含有するＩ型膜貫通糖タンパク質である。ＰＤ−１は、２つの細胞質チロシンベースのシグナル伝達モチーフ、すなわち免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）及び免疫受容体スイッチ性チロシンモチーフ（ＩＴＳＭ）を含有する。Ｔ細胞の刺激後、ＰＤ−１は、その細胞質尾部内のＩＴＳＭモチーフにチロシンホスファターゼＳＨＰ−２を動員し、ＣＤ３Ｔ細胞シグナル伝達カスケードに関与するエフェクター分子、例えばＣＤ３ゼータ、ＰＫＣシータ及びＺＡＰ７０などの脱リン酸化をもたらす。対照的に、ＰＤ−１のリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）は、未知の機能を有する２つの短い細胞質領域を有する。このリガンドは、ＩｇＶ様及びＩｇＣ様ドメインを含有する細胞外領域を有し、構成的に発現される、または非造血組織に加えて種々の腫瘍型を含む、様々な細胞型で誘導され得る。ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞及び樹状細胞（ＤＣ）上で発現されるだけでなく、微小血管内皮細胞及び心臓、肺などのような非リンパ器官のような末梢細胞上にも発現される。対照的に、ＰＤ−Ｌ２は、マクロファージ及びＤＣ上でのみ見出される。ＰＤ−１リガンドの発現パターンは、末梢寛容の維持におけるＰＤ−１の役割を示唆し、末梢において自己反応性Ｔ細胞及びＢ細胞の応答を制御するのに役立つ場合がある。今日までに、多数の研究が、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用が、インビトロ及びインビボでリンパ球増殖の阻害をもたらすことを示してきた。ＰＤ−１／ＰＤＬ１相互作用を妨げると、Ｔ細胞増殖を増加させ、サイトカイン産生を促進することが示されている。

【0005】

したがって、免疫応答の制御にはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の重要な役割が存在する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の機能不全は、疾患、例えば癌及びウイルス感染などの開始及び発症と相関するようである。ノックアウト動物の分析は、ＰＤ−１が主に末梢性寛容の誘導及び制御において機能するという理解に繋がった。したがって、ＰＤ−１経路の治療的遮断は、免疫寛容の克服及び癌または感染症の処置に加えてワクチン接種（予防的または治療的のいずれか）中の免疫を高めることに有益であろう。ＰＤ−１経路をブロックする改善された方法が、当該技術分野に必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0006】

【非特許文献1】Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７−３４

【非特許文献2】Ｌａｔｃｈｍａｎ，ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１−８

【非特許文献3】Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４−４３

【発明の概要】

【0007】

一態様では、本発明は、プログラム死受容体１（ＰＤ−１）に結合する抗体及びその抗原結合断片を提供する。いくつかの実施形態では、抗体及びその抗原結合断片は、ヒトＰＤ−１に結合する。いくつかの実施形態では、抗体及びその抗原結合断片はＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２とＰＤ−１との結合をブロックする。さらなる実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及びその断片はＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路またはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ２経路を妨げる。一実施形態では、抗体またはその断片は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその断片は、モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’断片、二重特異性抗体、免疫複合体、またはこれらの組み合わせである。

【0008】

一実施形態では、本発明は、配列番号１９〜２１、２４〜２６、２９〜３１、３４〜３６、４０〜４２、４５〜４７、５０〜５２、５５〜５７、６０〜６２、６５〜６７、７０〜７２、７５〜７７、８０〜８２、８５〜８７、９０〜９２、９５〜９７、１００〜１０２、１０５〜１０７、１１０〜１１２、及び１１５〜１１７から成る群から選択される１つまたは複数のＣＤＲを含む、単離された抗体またはその断片を提供する。

【0009】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２４、３４、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、及び１１５から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ１配列を含む。

【0010】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２５、３５、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、及び１１６から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ２配列を含む。

【0011】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２６、３６、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、及び１１７から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ３配列を含む。

【0012】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号１９、２９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、及び１１０から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ１配列を含む。

【0013】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２０、３０、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、及び１１１から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ２配列を含む。

【0014】

一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２１、３１、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、及び１１２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８１％の相同性、少なくとも８２％の相同性、少なくとも８３％の相同性、少なくとも８４％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも８６％の相同性、少なくとも８７％の相同性、少なくとも８８％の相同性、少なくとも８９％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ３配列を含む。一実施形態では、抗体またはその断片は、配列番号２４、３４、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、及び１１５から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５、３５、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、及び１１６から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２６、３６、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、及び１１７から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１９、２９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、及び１１０から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０、３０、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、及び１１１から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る重鎖ＣＤＲ２ならびに配列番号２１、３１、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、及び１１２から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る重鎖ＣＤＲ３を含む。

【0015】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号２４、２５、及び２６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０、及び２１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号２４、２５、及び２６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１９、２０、及び２１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0016】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号３４、３５、及び３６のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号２９、３０、及び３１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号３４、３５、及び３６の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号２９、３０、及び３１の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0017】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号４５、４６、及び４７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号４０、４１、及び４２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号４５、４６、及び４７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号４０、４１、及び４２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0018】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号５５、５６、及び５７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号５０、５１、及び５２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号５５、５６、及び５７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号５０、５１、及び５２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0019】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号６５、６６、及び６７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号６０、６１、及び６２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号６５、６６、及び６７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号６０、６１、及び６２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0020】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号７５、７６、及び７７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号７０、７１、及び７２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号７５、７６、及び７７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号７０、７１、及び７２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0021】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号８５、８６、及び８７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号８０、８１、及び８２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号８５、８６、及び８７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号８０、８１、及び８２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0022】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号９５、９６、及び９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号９０、９１、及び９２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号９５、９６、及び９７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号９０、９１、及び９２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0023】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号１００、１０１、及び１０２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号１０５、１０６、及び１０７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１００、１０１、及び１０２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0024】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、それぞれ配列番号１１５、１１６、及び１１７のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびにそれぞれ配列番号１１０、１１１、及び１１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗体またはその抗体断片は、それぞれ配列番号１１５、１１６、１１７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびにそれぞれ配列番号１１０、１１１、及び１１２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

【0025】

一実施形態では、抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、配列番号２３、３３、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１３３、１４３、及び１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；ならびに配列番号１８、２８、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１３１、及び１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。さらなる実施形態では、単離された抗体またはその断片はＰＤ−１と結合し、配列番号２３、３３、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１３３、１４３、及び１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的に成る、またはそのアミノ酸配列から成る軽鎖可変領域、ならびに配列番号１８、２８、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１３１、及び１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、そのアミノ酸配列から本質的に成る、またはそのアミノ酸配列から成る重鎖可変領域を含む。

【0026】

一実施形態では、本発明は、１０Ｄ１、４Ｃ１０、７Ｄ３、１３Ｆ１、１５Ｈ５、１４Ａ６、２２Ａ５、６Ｅ１、５Ａ８、７Ａ４、及び７Ａ４Ｄから成る群から選択される抗体の可変軽鎖ならびに１０Ｄ１、４Ｃ１０、７Ｄ３、１３Ｆ１、１５Ｈ５、１４Ａ６、２２Ａ５、６Ｅ１、５Ａ８、及び７Ａ４から成る群から選択される抗体の可変重鎖を含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号２３を含む軽鎖可変領域及び配列番号１８を含む重鎖可変領域、配列番号３３を含む軽鎖可変領域及び配列番号２８を含む重鎖可変領域、配列番号４４を含む軽鎖可変領域及び配列番号３９を含む重鎖可変領域、配列番号５４を含む軽鎖可変領域及び配列番号４９を含む重鎖可変領域、配列番号６４を含む軽鎖可変領域及び配列番号５９を含む重鎖可変領域、配列番号７４を含む軽鎖可変領域及び配列番号６９を含む重鎖可変領域、配列番号８４を含む軽鎖可変領域及び配列番号７９を含む重鎖可変領域、配列番号９４を含む軽鎖可変領域及び配列番号８９を含む重鎖可変領域、配列番号１０４を含む軽鎖可変領域及び配列番号９９を含む重鎖可変領域、配列番号１１４を含む軽鎖可変領域及び配列番号１０９を含む重鎖可変領域、配列番号１３３を含む軽鎖可変領域及び配列番号１３１を含む重鎖可変領域、配列番号１４３を含む軽鎖可変領域及び配列番号１４１を含む重鎖可変領域、または配列番号１５２を含む軽鎖可変領域及び配列番号１３１を含む重鎖可変領域を含む抗体またはその断片を提供する。

【0027】

一実施形態では、本発明はキメラ抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１１９、１２１、１２５、及び１２７から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖；ならびに配列番号１２３及び１２９から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。

【0028】

一実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３１及び１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３３、１４３及び１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。

【0029】

別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３１と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖可変領域及び配列番号１３３または１５２と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１４１と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する重鎖可変領域及び配列番号１４３と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有する軽鎖可変領域を含む。

【0030】

一実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３５、１３７、１４５、及び１４７から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する完全重鎖を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３９、１４９、及び１５３から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性、少なくとも８５％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９１％の相同性、少なくとも９２％の相同性、少なくとも９３％の相同性、少なくとも９４％の相同性、少なくとも９５％の相同性、少なくとも９６％の相同性、少なくとも９７％の相同性、少なくとも９８％の相同性、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を有する完全軽鎖を含む。

【0031】

一実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３５の重鎖及び配列番号１３９の軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３７の重鎖及び配列番号１３９の軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３５の重鎖及び配列番号１５３の軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１３７の重鎖及び配列番号１５３の軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１４５の重鎖及び配列番号１４９の軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明はヒト化抗ＰＤ−１抗体を提供し、この抗体は、配列番号１４７の重鎖及び配列番号１４９の軽鎖を含む。一実施形態では、本発明は、本明細書で提供される例示的な抗体のいずれかと、ＰＤ−１上の同じエピトープに結合する抗ＰＤ−１抗体またはその断片を提供する。一実施形態では、抗体またはその断片は、ＰＤ−１への結合について本明細書で提供される例示的な抗体のいずれかと競合する。ＰＤ−１への結合は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、または当該技術分野において既知の、任意のその他の方法により測定されてもよい。

【0032】

一実施形態では、本発明は、約１ｎＭ〜約０．０１ｎＭの親和性でＰＤ−１に結合する抗ＰＤ−１抗体及びその断片を提供する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．５ｎＭ〜約０．１ｎＭの親和性でＰＤ−１に結合する。別の実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約１ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．７５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．２５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．２ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．１５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．１ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．０７５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．０５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．０２５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．０２ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．０１５ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．０１ｎＭ以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．００７５以下の親和性でＰＤ−１に結合する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約０．００５以下の親和性でＰＤ−１に結合する。

【0033】

一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約１ｎｇ／ｍＬ〜約２０００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約１ｎｇ／ｍＬ〜約１５００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約２ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約２ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約５ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ５０を有する。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＰＤ−１に対して約５００ｎｇ／ｍＬ以下、約４００ｎｇ／ｍＬ以下、約３００ｎｇ／ｍＬ以下、約２５０ｎｇ／ｍＬ以下、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、約１５０ｎｇ／ｍＬ以下、約１００ｎｇ／ｍＬ以下、約７５ｎｇ／ｍＬ以下、約６０ｎｇ／ｍＬ以下、約５０ｎｇ／ｍＬ以下、約４０ｎｇ／ｍＬ以下、または約３０ｎｇ／ｍＬ以下の結合ＥＣ５０を有する。

【0034】

一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１０００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１結合を阻害する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約２ｎｇ／ｍＬ〜約８００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１結合を阻害する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約５ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１結合を阻害する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約５ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１結合を阻害する。さらなる実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約１０ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬのＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１結合を阻害する。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、約８００ｎｇ／ｍＬ以下、約４００ｎｇ／ｍＬ以下、約３００ｎｇ／ｍＬ以下、約２５０ｎｇ／ｍＬ以下、約２００ｎｇ／ｍＬ以下、約１５０ｎｇ／ｍＬ以下、約１００ｎｇ／ｍＬ以下、約７５ｎｇ／ｍＬ以下、約６０ｎｇ／ｍＬ以下、約５０ｎｇ／ｍＬ以下、約４０ｎｇ／ｍＬ以下、または約３０ｎｇ／ｍＬ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１結合を阻害する。

【0035】

一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１３３の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１３１の重鎖可変領域アミノ酸を有する、または配列番号１４３の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１４１の重鎖可変領域アミノ酸配列を有する、または配列番号１５２の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１３１の重鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体であり、この抗ＰＤ−１抗体は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって測定されるように、約２００ｎｇ／ｍｌ以下または約１５０ｎｇ／ｍＬ以下または約１００ｎｇ／ｍＬ以下または約８０ｎｇ／ｍｌ以下または約６０ｎｇ／ｍＬ以下のＰＤ−１結合ＥＣ５０を有する。別の実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１３３の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１３１の重鎖可変領域アミノ酸を有する、または配列番号１４３の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１４１の重鎖可変領域アミノ酸配列を有する、または配列番号１５２の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１３１の重鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体であり、この抗ＰＤ−１抗体は、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳによって測定されるように、約１０００ｎｇ／ｍＬ以下、または約８００ｎｇ／ｍＬ以下、または約６００ｎｇ／ｍＬ以下、または約５００ｎｇ／ｍＬ以下、または約４００ｎｇ／ｍＬ以下、または約３００ｎｇ／ｍＬ以下、または約２００ｎｇ／ｍＬ以下、または約１００ｎｇ／ｍＬ以下、または約６０ｎｇ／ｍＬ以下、または約３０ｎｇ／ｍＬ以下、または約２５ｎｇ／ｍＬ以下、または約２０ｎｇ／ｍＬ以下、または約１０ｎｇ／ｍＬ以下のＰＤ−Ｌ１妨害ＩＣ５０を有する。別の実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、配列番号１３３の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１３１の重鎖可変領域アミノ酸を有する、または配列番号１４３の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１４１の重鎖可変領域アミノ酸配列を有する、または配列番号１５２の軽鎖可変領域アミノ酸配列及び配列番号１３１の重鎖可変領域アミノ酸配列を有するヒト化抗体であり、この抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対して約１ｎＭ以下、または約０．５ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下、または約０．０５ｎＭ以下の親和性を有する。特定の実施形態では、ヒト化抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１に対して約０．１ｎＭの親和性を有する。

【0036】

一実施形態では、提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、Ｔ細胞上のＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を妨げ、Ｔ細胞活性化の増加をもたらす。さらなる実施形態では、抗体及びその断片はＰＤ−１と結合し、Ｔ細胞増殖及び／またはサイトカイン産生の増加をもたらす。またさらなる実施形態では、抗体及びその断片はＰＤ−１と結合し、ＩＬ−２、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、及びＧＭ−ＣＳＦから成る群から選択される１種以上のサイトカインの増加をもたらす。したがって、一態様では、本発明は、Ｔ細胞を抗ＰＤ−１抗体またはその断片と接触させることを含む、免疫応答を調節する方法を提供する。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及び断片による免疫応答の調節は、混合リンパ球（ＭＬＲ）反応で測定されてもよい。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、ＭＬＲにおけるリンパ球からのサイトカイン産生レベルを増加させる。さらなる実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＬＲにおけるＩＬ−２産生及び／またはＩＦＮγ産生レベルを増加させる。またさらなる実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ＭＬＲにおけるＩＬ−２産生及びＩＦＮγ産生レベルを増加させる。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、メモリーＴ細胞応答を増強する。さらなる実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、メモリーＴ細胞からのＩＦＮγ産生の増加によって測定されるように、メモリーＴ細胞応答を増強する。

【0037】

一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、制御性Ｔ細胞機能を阻害する。さらなる実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、制御性Ｔ細胞によるエフェクターＴ細胞の抑制を阻害する。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、制御性Ｔ細胞の存在下で、Ｔ細胞のエフェクター機能を回復させる。さらなる実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、制御性Ｔ細胞の存在下で、エフェクターＴ細胞が増殖する及び／またはサイトカインを産生する能力を回復させる。したがって、一実施形態では、本発明は、インビトロまたは制御性Ｔ細胞の抑制効果の阻害を必要とする対象において、制御性Ｔ細胞の抑制効果を阻害する方法を提供する。

【0038】

一態様では、ＰＤ−１に結合する単離された抗体またはその断片が提供され、この抗体は、本明細書で１０Ｄ１、４Ｃ１０、７Ｄ３、１３Ｆ１、１５Ｈ５、１４Ａ６、２２Ａ５、６Ｅ１、５Ａ８、７Ａ４、及び７Ａ４Ｄと称されるハイブリドーマから成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される。したがって、本発明はまた、ハイブリドーマ１０Ｄ１、４Ｃ１０、７Ｄ３、１３Ｆ１、１５Ｈ５、１４Ａ６、２２Ａ５、６Ｅ１、５Ａ８、７Ａ４、及び７Ａ４Ｄ、加えて本明細書で開示される抗体を産生する任意のハイブリドーマを包含する。本発明はまた、本明細書で提供される抗体及びその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及びこのような発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本発明に包含される。

【0039】

一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ−１抗体免疫複合体を提供する。したがって、本発明は、ＰＤ−１に結合し、かつ治療剤に連結される、または治療剤と複合体化される抗体またはその断片を提供する。抗ＰＤ−１抗体に連結されてもよい、または抗ＰＤ−１抗体と複合体化されてもよい治療剤としては、細胞傷害性薬物、放射性同位体、免疫調節剤、または抗体を挙げ得るが、これらに限定されない。

【0040】

一態様では、本発明は、本明細書で提供される１種または複数種の抗ＰＤ−１抗体またはその断片、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。

【0041】

一態様では、本発明は、対象の免疫応答を調節する方法を提供し、この方法は、対象に治療有効量の本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体またはその断片を投与することを含む。一実施形態では、本発明は、疾患または障害の処置または予防を必要とする対象の疾患または障害を処置または予防する方法を提供し、この方法は、対象に治療有効量の本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体またはその断片を投与することを含む。

【0042】

一実施形態では、本発明は、抗腫瘍応答の増強を必要とする対象の抗腫瘍応答を増強する方法を提供し、この方法は、対象に治療有効量の本発明の抗ＰＤ−１抗体または断片を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、腫瘍の減少または腫瘍細胞の成長阻害を必要とする対象の腫瘍を減少させる方法または腫瘍細胞の成長を阻害する方法を提供し、この方法は、対象に治療有効量の本発明の抗ＰＤ−１抗体または断片を投与することを含む。別の実施形態では、本発明は、癌の処置を必要とする対象の癌を処置する方法を提供し、この方法は、対象に治療有効量の本発明の抗ＰＤ−１抗体または断片を投与することを含む。さらなる実施形態では、癌は、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経膠腫、乳癌、肺癌、結腸癌、骨癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、直腸癌、精巣癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭頸部癌、胃の癌、膵臓癌、またはこれらの組み合わせから成る群から選択される。

【0043】

一実施形態では、本発明は、感染症の処置を必要とする対象の感染症を処置する方法を提供し、この方法は、対象に治療有効量の本発明の抗ＰＤ−１抗体または断片を投与することを含む。さらなる実施形態では、感染症は、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核球症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器病、マラリア、住血吸虫症、ならびにトリパノソーマ症から成る群から選択される。
[本発明1001]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号24、34、45、55、65、75、85、95、105、及び115から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ1配列；
配列番号25、35、46、56、66、76、86、96、106、及び116から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ2配列；
配列番号26、36、47、57、67、77、87、97、107、及び117から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する軽鎖ＣＤＲ3配列；
配列番号19、29、40、50、60、70、80、90、100、及び110から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ1配列；
配列番号20、30、41、51、61、71、81、91、101、及び111から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ2配列；及び
配列番号21、31、42、52、62、72、82、92、102、及び112から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有する重鎖ＣＤＲ3配列
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1002]
配列番号24、34、45、55、65、75、85、95、105、及び115から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る軽鎖ＣＤＲ1；
配列番号25、35、46、66、76、86、96、106、及び116から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る軽鎖ＣＤＲ2；
配列番号26、36、47、57、67、77、87、97、107、及び117から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る軽鎖ＣＤＲ3；
配列番号19、29、40、50、60、70、80、90、100、及び110から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る重鎖ＣＤＲ1；
配列番号20、30、41、51、61、71、81、91、101、及び111から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る重鎖ＣＤＲ2；及び
配列番号21、31、42、52、62、72、82、92、102、及び112から成る群から選択されるアミノ酸配列から成る重鎖ＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体またはその断片。
[本発明1003]
それぞれ配列番号24、25、及び26のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号19、20、及び21のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1004]
それぞれ配列番号34、35、及び36のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号29、30、及び31のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1005]
それぞれ配列番号45、46、及び47のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号40、41、及び42のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1006]
それぞれ配列番号55、56、及び57のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号50、51、及び52のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1007]
それぞれ配列番号65、66、及び67のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号60、61、及び62のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1008]
それぞれ配列番号75、76、及び77のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号70、71、及び72のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1009]
それぞれ配列番号85、86、及び87のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号80、81、及び82のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1010]
それぞれ配列番号95、96、及び97のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号90、91、及び92のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1011]
それぞれ配列番号105、106、及び107のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号100、101、及び102のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1012]
それぞれ配列番号115、116、及び117のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3；及び
それぞれ配列番号110、111、及び112のアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1、ＣＤＲ2、及びＣＤＲ3
を含む、本発明1001の抗体または断片。
[本発明1013]
キメラである、またはヒト化されている、本発明1001〜1012のいずれかの単離された抗体またはその断片。
[本発明1014]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号23、33、44、54、64、74、84、94、104、114、133、及び143から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び
配列番号18、28、39、49、59、69、79、89、99、109、131、及び141から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1015]
配列番号23、33、44、54、64、74、84、94、104、114、133、及び143から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；及び
配列番号18、28、39、49、59、69、79、89、99、109、131、及び141から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
を含む、本発明1014の単離された抗体またはその断片。
[本発明1016]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号133または152の軽鎖可変領域；及び
配列番号131の重鎖可変領域
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1017]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号143の軽鎖可変領域；及び
配列番号141の重鎖可変領域
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1018]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号139または153の軽鎖；及び
配列番号135の重鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1019]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号139または153の軽鎖；及び
配列番号137の重鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1020]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号149の軽鎖；及び
配列番号145の重鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1021]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、
配列番号149の軽鎖；及び
配列番号147の重鎖
を含む、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1022]
本発明1001〜1021のいずれかの抗体またはその断片と同じエピトープに結合する、単離された抗体またはその断片。
[本発明1023]
本発明1001〜1021のいずれかの抗体またはその断片とＰＤ−1への結合について競合し、前記競合が、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、または表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより測定される、単離された抗体またはその断片。
[本発明1024]
モノクローナル抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、及びＦ（ａｂ）’断片から成る群から選択される、本発明1001〜1021のいずれかの単離された抗体またはその断片。
[本発明1025]
治療剤に連結される、または治療剤と複合体化される、本発明1001〜1021のいずれかの抗体またはその断片。
[本発明1026]
前記治療剤が、細胞傷害性薬物、放射性同位体、免疫調節剤、または抗体である、本発明1025の抗体またはその断片。
[本発明1027]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、ＰＤ−1に対して約1ｎＭ〜約0．01ｎＭの親和性を有する、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1028]
ＰＤ−1に対して約1ｎＭ以下の親和性を有する、本発明1027の単離された抗体またはその断片。
[本発明1029]
ＰＤ−1に対して約0．1ｎＭ以下の親和性を有する、本発明1027の単離された抗体またはその断片。
[本発明1030]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、前記抗体が、約5ｎｇ／ｍＬ〜約1000ｎｇ／ｍＬの結合ＥＣ50を有する、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1031]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、前記抗体が、ＰＤ−1とＰＤ−Ｌ1との結合をブロックする、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1032]
約5ｎｇ／ｍＬ〜約1000ｎｇ／ｍＬのＩＣ50でＰＤ−1とＰＤ−Ｌ1またはＰＤ−Ｌ2との結合をブロックする、本発明1031の単離された抗体またはその断片。
[本発明1033]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、炎症性サイトカインの産生により測定されるＴ細胞活性化を増加させる、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1034]
ＩＬ−2及びＩＦＮγのＴ細胞による産生を増加させる、本発明1028の単離された抗体またはその断片。
[本発明1035]
ＰＤ−1に結合する単離された抗体またはその断片であって、10Ｄ1、4Ｃ10、7Ｄ3、13Ｆ1、15Ｈ5、14Ａ6、22Ａ5、6Ｅ1、5Ａ8、7Ａ4、及び／または7Ａ4Ｄから成る群から選択されるハイブリドーマによって産生される、前記単離された抗体またはその断片。
[本発明1036]
本発明1001〜1035のいずれかの抗体またはその断片と、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物。
[本発明1037]
本発明1001〜1035のいずれかの抗体またはその断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
[本発明1038]
本発明1037の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
[本発明1039]
本発明1038の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1040]
10Ｄ1、4Ｃ10、7Ｄ3、13Ｆ1、15Ｈ5、14Ａ6、22Ａ5、6Ｅ1、5Ａ8、7Ａ4及び7Ａ4Ｄから成る群から選択される、単離されたハイブリドーマ細胞株。
[本発明1041]
Ｔ細胞活性化を増加させるための方法であって、Ｔ細胞を本発明1001〜1035のいずれかの抗体またはその断片と接触させる段階を含む、前記方法。
[本発明1042]
対象における腫瘍を減少させるための方法または腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、前記対象に治療有効量の本発明1001〜1035のいずれかの単離された抗体またはその断片を投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1043]
癌の処置を必要とする対象において癌を処置するための方法であって、治療有効量の本発明1001〜1035のいずれかの単離された抗体またはその断片を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1044]
前記癌が、リンパ腫、白血病、黒色腫、神経膠腫、乳癌、肺癌、結腸癌、骨癌、卵巣癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、胃癌、直腸癌、精巣癌、唾液腺癌、甲状腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭頸部癌、胃の癌、膵臓癌、またはこれらの組み合わせから成る群から選択される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
感染症の処置を必要とする対象において感染症を処置するための方法であって、治療有効量の本発明1001〜1035のいずれかの単離された抗体またはその断片を前記対象に投与する段階を含む、前記方法。
[本発明1046]
前記感染症が、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核球症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器病、マラリア、住血吸虫症、ならびにトリパノソーマ症から成る群から選択される、本発明1045の方法。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1A】図１Ａ及び図１Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ＰＤ−１に対するＰＤ−１リガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２結合の、マウス抗ＰＤ−１抗体による妨害を示すグラフである。図１Ａは、マウス抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−Ｌ１の結合の妨害を示す。図１Ａ及び図１Ｂの上部パネルは、抗体濃度の範囲にわたるＭＦＩを示す。抗ＰＤ−１抗体の妨害ＩＣ５０を、図１Ａ及び図１Ｂの下部パネルに示す。

【図1B】図１Ａ及び図１Ｂは、ＦＡＣＳにより測定された、ＰＤ−１に対するＰＤ−１リガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２結合の、マウス抗ＰＤ−１抗体による妨害を示すグラフである。図１Ｂは、マウス抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−Ｌ２の結合の妨害を示す。図１Ａ及び図１Ｂの上部パネルは、抗体濃度の範囲にわたるＭＦＩを示す。抗ＰＤ−１抗体の妨害ＩＣ５０を、図１Ａ及び図１Ｂの下部パネルに示す。

【図2】異なる濃度のマウス抗ＰＤ−１抗体に応答した、ＭＬＲにおけるＩＬ−２（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗ＰＤ−１抗体は、左から右へ、対照ｍＩｇＧ１、２２Ａ５−ｍＩｇＧ１、６Ｅ１−ｍＩｇＧ１、１０Ｄ１−ｍＩｇＧ１、４Ｃ１０−ｍＩｇＧ１、７Ｄ３−ｍＩｇＧ１、１３Ｆ１−ｍＩｇＧ１、１４Ａ６−ｍＩｇＧ１、１５Ｈ５−ｍＩｇＧ１、５Ａ８−ｍＩｇＧ１、及び７Ａ４−ｍＩｇＧ１であった。ｘ軸に示されるように、各抗体は、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。

【図3】異なる濃度のマウス抗ＰＤ−１抗体に応答した、ＭＬＲにおけるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験した抗ＰＤ−１抗体は、左から右へ、対照ｍＩｇＧ１、２２Ａ５−ｍＩｇＧ１、６Ｅ１−ｍＩｇＧ１、１０Ｄ１−ｍＩｇＧ１、４Ｃ１０−ｍＩｇＧ１、７Ｄ３−ｍＩｇＧ１、１３Ｆ１−ｍＩｇＧ１、１４Ａ６−ｍＩｇＧ１、１５Ｈ５−ｍＩｇＧ１、５Ａ８−ｍＩｇＧ１、及び７Ａ４−ｍＩｇＧ１であった。ｘ軸に示されるように、各抗体は、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。

【図4】異なる濃度のキメラ抗ＰＤ−１抗体に応答した、ＭＬＲにおけるＩＬ−２（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験したキメラ抗ＰＤ−１抗体は、左から右へ、対照ｈＩｇＧ４、キメラ４Ｃ１０−ｈＩｇＧ４、キメラ６Ｅ１−ｈＩｇＧ４、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４、キメラ１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４、キメラ１５Ｈ５−ｈＩｇＧ４、キメラ２２Ａ５−ｈＩｇＧ４、及びキメラ７Ｄ３−ｈＩｇＧ４であった。ｘ軸に示されるように、各抗体は、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。

【図5】異なる濃度のキメラ抗ＰＤ−１抗体に応答した、ＭＬＲにおけるＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍＬ）産生を示すグラフである。試験したキメラ抗ＰＤ−１抗体は、左から右へ、対照ｈＩｇＧ４、キメラ４Ｃ１０−ｈＩｇＧ４、キメラ６Ｅ１−ｈＩｇＧ４、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４、キメラ１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４、キメラ１５Ｈ５−ｈＩｇＧ４、キメラ２２Ａ５−ｈＩｇＧ４、及びキメラ７Ｄ３−ｈＩｇＧ４であった。ｘ軸に示されるように、各抗体は、２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。

【図6】ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒト化１３Ｆ１（図６Ａ）抗ＰＤ−１抗体及びヒト化７Ａ４（図６Ｂ）抗ＰＤ−１抗体の結合ＥＣ５０を示す。図６Ａの上部パネルは、キメラ１３Ｆ１、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１（ｈ１３Ｆ１−ＩｇＧ１）、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４（ｈ１３Ｆ１−ＩｇＧ４）、または対照ｈＩｇＧ４の濃度の範囲にわたる吸光度を示す。図６Ａの下部パネルは、試験抗体の各々の計算されたＥＣ５０を示す。図６Ｂの上部パネルは、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ１、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４、ヒト化７８４−ｈＩｇＧ１（ｈ７Ａ４ｈＩｇＧ１）、ヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ４（ｈ７Ａ４ｈＩｇＧ４）、または対照ｈＩｇＧ４の濃度の範囲にわたる吸光度を示す。図６Ｂの下部パネルは、試験抗体の各々の計算されたＥＣ５０を示す。

【図7】ＦＡＣＳにより測定された、ヒト化１３Ｆ１（図７Ａ）抗ＰＤ−１抗体及びヒト化７Ａ４（図７Ｂ）抗ＰＤ−１抗体の結合ＥＣ５０を示す。図７Ａの上部パネルは、対照ｈＩｇＧ４、キメラ１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１（ｈ１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１）、またはヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４（ｈ１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４）の濃度の範囲にわたる平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。図７Ａの下部パネルは、試験抗体の各々の計算されたＥＣ５０を示す。図７Ｂの上部パネルは、対照ｈＩｇＧ４、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４、キメラ７Ａ４−キメラ−ＩｇＧ１、ヒト化７Ａ４−ＩｇＧ４（ｈ７Ａ４−ｈＩｇＧ４）、またはヒト化７Ａ４−ＩｇＧ１（ｈ７Ａ４−ｈＩｇＧ１）の濃度の範囲にわたるＭＦＩを示す。図７Ｂの下部パネルは、試験抗体の各々の計算されたＥＣ５０を示す。

【図8】ＥＬＩＳＡにより測定された、ヒト化１３Ｆ１（図８Ａ）抗ＰＤ−１抗体及びヒト化７Ａ４（図８Ｂ）抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−Ｌ１結合の妨害を示す。図８Ａは、対照ｈＩｇＧ４、キメラ１３Ｆ１、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１、またはヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４の濃度の範囲にわたる吸光度を示す。図８Ｂは、対照ｈＩｇＧ４、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ１、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４、ヒト化７８４−ｈＩｇＧ１またはヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ４の濃度の範囲にわたる吸光度を示す。図８Ｃは、キメラ及びヒト化１３Ｆ１及び７Ａ４抗体の計算されたＰＤ−Ｌ１妨害ＩＣ５０を示す。

【図9】ＦＡＣＳにより測定された、ヒト化１３Ｆ１及び７Ａ４抗体によるＰＤ−Ｌ１結合の妨害を示す。図９の上部パネルは、抗体濃度の範囲にわたるＭＦＩを示す。ヒト化抗体の妨害ＩＣ５０を、図９の下部パネルに示す。

【図10】Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより測定された、ＰＤ−１ヒト化モノクローナル抗体のｈ１３Ｆ１（左上パネル）及びｈ７Ａ４（右上パネル）の結合データを示す。下部パネルは、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイにより測定された、定量化結合データを提供する。

【図11】次の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬでの対照ｈＩｇＧ４、マウス１３Ｆ１−ｍＩｇＧ１（１３Ｆ１−ｍＩｇＧ１）、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４、またはキメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４の存在下で、ＭＬＲ反応におけるＩＬ−２産生（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。

【図12】次の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬでの対照ｈＩｇＧ４、マウス１３Ｆ１−ｍＩｇＧ１（１３Ｆ１−ｍＩｇＧ１）、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４、またはキメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４の存在下で、ＭＬＲ反応におけるＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。

【図13】次の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬでの対照ｈＩｇＧ４、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ１、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４、ヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ１、またはヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ４の存在下で、ＭＬＲ反応におけるＩＬ−２産生（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。

【図14】次の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬでの対照ｈＩｇＧ４、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ１、キメラ７Ａ４−ｈＩｇＧ４、ヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ１、またはヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ４の存在下で、ＭＬＲ反応におけるＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。

【図15】ＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）により測定された、破傷風毒素によりリコールされたメモリーＴ細胞応答に対するヒト化抗ＰＤ−１抗体の効果を示す。陰性対照ｈＩｇＧ４抗体、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１抗体、ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４抗体、ヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ１抗体、及びヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ４抗体を、次の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬで試験した。

【図16】１０μｇ／ｍｌのヒト化抗ＰＤ−１抗体（ｈ１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１、ｈ１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４、ｈ７Ａ４−ｈＩｇＧ１、またはｈ７Ａ４−ｈＩｇＧ４）、アイソタイプ対照（ｈＩｇＧ４）抗体の存在下で、または抗体なしで、自己ＤＣ及び抗ＣＤ３抗体による同時刺激に応答したＴ細胞からのＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）を示す。

【図17】図１７Ａ及び図１７Ｂは、ＰＤ−１ヒト化モノクローナル抗体のｈ７Ａ４及びｈ７Ａ４ＤについてのＢｉａｃｏｒｅに基づく結合（図１７Ａ）及びＦＡＣＳに基づく妨害（図１７Ｂ）のデータを示す。図１７Ａについて、左上はｈ７Ａ４を示し、右上は７Ａ４Ｄを示しており、図１７Ａの下部パネルは、Ｂｉａｃｏｒｅ分析により測定された定量化結合データを提供する。図１７Ｂは、７Ａ４Ｄ−ｈＩｇＧ４抗体による、２９３Ｔ−ＰＤ１細胞に対するＰＤ−Ｌ１の結合の妨害ＩＣ５０を示す。

【図18】次の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬでの対照ｈＩｇＧ４、ヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ４、またはヒト化７Ａ４Ｄ−ｈＩｇＧ４の存在下で、ＭＬＲ反応におけるＩＬ−２産生（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。

【図19】次の濃度：２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．０２μｇ／ｍＬ、及び０．００２μｇ／ｍＬでの対照ｈＩｇＧ４、ヒト化７Ａ４−ｈＩｇＧ４、またはヒト化７Ａ４Ｄ−ｈＩｇＧ４の存在下で、ＭＬＲ反応におけるＩＦＮ−γ産生（ｐｇ／ｍＬ）を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0045】

詳細な説明
プログラム死受容体１（ＰＤ−１）は、免疫系のチェックポイント受容体である。ＰＤ−１は、主として活性化Ｔ細胞及びＢ細胞上で発現され、単球ならびに胸腺発達中にＣＤ４−ＣＤ８−ダブルネガティブＴ細胞及びＮＫ−Ｔ細胞上にも生じる（上記のＡｇａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９−８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１−８）。ＰＤ−１は、２つのリガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２を有する。ＰＤ−１と２つのリガンドのいずれかとの相互作用は、インビトロ及びインビボでＴ細胞応答を減弱させることが示されているが、これはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することにより反転され得、その効果は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用も同様にブロックされる場合、相加的である（Ｉｗａｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１２２９３−７；Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６）。

【0046】

ＰＤ−１は、効率的な免疫破壊から腫瘍細胞を保護するというその役割により、癌の成長及び発症と相関を有することが見出されている。そのリガンド、すなわちＰＤ−Ｌ１は、多数のマウス及びヒト腫瘍上で有意な発現を有することが明らかとなり、これは免疫回避を媒介すると仮定されている（Ｉｗａｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２）；Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７８７−９）。ヒトでは、（腫瘍浸潤リンパ球上の）ＰＤ−１及び／または（腫瘍細胞上の）ＰＤ−Ｌ１の発現は、免疫組織化学によって評価されるような多数の原発腫瘍生検で見出されている。このような組織としては、肺、肝臓、卵巣、子宮頸部、皮膚、結腸、神経膠腫、膀胱、乳房、腎臓、食道、胃、口腔扁平上皮細胞、尿路上皮細胞、及び膵臓の癌に加えて頭頸部の腫瘍が挙げられる（Ｂｒｏｗｎ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−１２６６（２００３）；Ｄｏｎｇ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２）；Ｗｉｎｔｔｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：７４６２−７４６７（２００３）；Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６３：６５０１−６５０５（２００３）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｒ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：３３８１−５（２００６）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：１７５７−６１（２００７）；Ｎｏｍｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５１−７．（２００７））。より著しくは、腫瘍細胞上でのＰＤ−１リガンド発現は、複数の腫瘍型にわたって癌患者の予後不良と相関している（ＯｋａＺａｋｉ ａｎｄ Ｈｏｎｊｏ，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：８１３−８２４（２００７）で概説されている）。

【0047】

ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用が、腫瘍浸潤リンパ球の低減、Ｔ細胞受容体媒介増殖の低減、及び癌性細胞による免疫回避をもたらすが（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１−７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３ ０７−３ １４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００）、それゆえＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の遮断が、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を増強し、免疫系による腫瘍細胞のクリアランスに役立つことが示された。侵襲性膵臓癌のマウスモデルにおいて、例えば、Ｎｏｍｉ Ｔ．， ｅｔ ａｌ．（Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１３：２１５１−２１５７，２００７）は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の治療有効性を実証した。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを指向する抗体の投与は、腫瘍成長を有意に阻害した。抗体による遮断は、腫瘍への腫瘍反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を効果的に促進し、ＩＦＮ−γ、グランザイムＢ及びパーフォリンを含む抗腫瘍エフェクターの上方制御をもたらした。さらに、著者らは、ＰＤ−１遮断を化学療法と効果的に組み合わせて相乗効果を得ることができることを示した。別の研究では、マウスでの扁平上皮癌腫のモデルを使用して、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の抗体による遮断が腫瘍成長を有意に阻害した（Ｔｓｕｓｈｉｍａ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌ．４２：２６８−２７４（２００６））。

【0048】

さらに、マウス肥満細胞腫株へのＰＤ−Ｌ１のトランスフェクションは、腫瘍特異的ＣＴＬクローンと共培養した場合に腫瘍細胞の溶解の低減をもたらした。抗ＰＤ−Ｌ１ ｍＡｂを添加した場合、溶解は回復した（Ｉｗａｉ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２））。インビボで、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１相互作用をブロックすることは、マウス腫瘍モデルにおける養子Ｔ細胞移入療法の有効性を増加させることが示された（Ｓｔｒｏｍｅ Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６３：６５０１−６５０５（２００３））。癌処置におけるＰＤ−１の役割に関するさらなる証拠は、ＰＤ−１ノックアウトマウスで実施された実験からもたらされる。ＰＤ−Ｌ１発現骨髄腫細胞は、野生型動物においてのみ成長し（腫瘍成長及びそれに伴う動物死をもたらす）、ＰＤ−１欠損マウスでは成長しなかった（Ｉｗａｉ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９９：１２２９３−１２２９７（２００２））。ヒトでの研究では、Ｒ．Ｍ．Ｗｏｎｇら（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１２２３−１２３４（２００７））は、完全ヒト抗ＰＤ−１抗体を使用するＰＤ−１遮断が、ワクチン抗原及びワクチン接種された個体由来の細胞を使用するエクスビボ刺激アッセイにおいて、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）の絶対数を増大させたことを示した。同様の研究では、ＰＤ−Ｌ１の抗体による遮断は、腫瘍関連抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞の細胞溶解活性の増強及び腫瘍特異的ＴＨ細胞によるサイトカイン産生の増加をもたらした（Ｂｌａｎｋ Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１９：３１７−３２７（２００６））。同著者らは、ＰＤ−Ｌ１遮断が、抗ＣＴＬＡ−４遮断と組み合わせて使用される場合にインビトロで腫瘍特異的Ｔ細胞応答を増大させることを示した。全体として、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、癌処置のための抗体治療薬開発の標的である。抗ＰＤ−１抗体はまた、慢性ウイルス感染に有用な場合がある。急性ウイルス感染後に生成されたメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞は、高度に機能的であり、防御免疫の重要な構成要素となる。対照的に、慢性感染は多くの場合、ウイルス特異的Ｔ細胞応答の様々な程度の機能障害（疲弊）を特徴とし、この欠陥が、残存する病原体を宿主が排除できない主な理由である。感染の初期段階において最初に機能的エフェクターＴ細胞が生成されるが、それらは慢性感染の過程において徐々に機能を失う。Ｂａｒｂｅｒら（Ｂａｒｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３９：６８２−６８７（２００６））は、ＬＣＭＶの実験室株で感染させたマウスが慢性感染を発症し、血液及びその他の組織において高レベルのウイルスをもたらされたことを示した。これらのマウスは、最初に強力なＴ細胞応答を発現したが、最終的にはＴ細胞疲弊により感染に屈した。著者らは、慢性的に感染したマウスにおけるエフェクターＴ細胞の数及び機能の低下が、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との間の相互作用をブロックする抗体を注入することにより逆転させることができることを見出した。

【0049】

一態様では、本発明は、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。ＰＤ−１。一実施形態では、抗体またはその断片は、ヒトＰＤ−１に結合する。別の実施形態では、抗体またはその断片は、ヒト及びカニクイザルＰＤ−１に結合する。別の実施形態では、抗体またはその断片は、Ｔ細胞上のＰＤ−１とそのリガンドＰＤ−Ｌ１との相互作用をブロックする。一態様では、本発明は、抗ＰＤ−１抗体またはその断片を作製及び使用する方法、ならびに医薬組成物を含む、抗ＰＤ−１抗体またはその断片を含む組成物を提供する。

【0050】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを有する結合タンパク質を指す。本発明の抗体及びその断片は、全長抗体またはその任意の断片であってもよい。したがって、本発明の抗体及び断片としては、モノクローナル抗体またはその断片及び抗体バリアントまたはその断片、加えて免疫複合体が挙げられる。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’断片、Ｆｖ断片、単離されたＣＤＲ領域、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、及び当該技術分野において既知のその他の抗体断片が挙げられる。抗体及びその断片としては、組換えポリペプチド、融合タンパク質、及び二重特異性抗体も挙げ得る。本明細書で開示される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプであってもよい。「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラスを指す。一実施形態では、本明細書で開示される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプである。本発明のＰＤ−１抗体及びその断片は、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ラマ、及びヒトを含むが、これらに限定されない任意の種に由来してもよい。ＰＤ−１抗体及びその断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であってもよい。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体はマウス抗体である。別の実施形態では、抗ＰＤ１抗体はキメラ抗体である。さらなる実施形態では、キメラ抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体である。別の実施形態では、抗体はマウスに由来し、ヒト化されている。

【0051】

「キメラ抗体」は、ある種に由来する重鎖可変領域の少なくとも一部分及び軽鎖可変領域の少なくとも一部分；ならびに別の種に由来する定常領域の少なくとも一部分を有する抗体である。例えば、一実施形態では、キメラ抗体は、マウス可変領域及びヒト定常領域を含んでよい。

【0052】

「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）；及びヒト抗体に由来するフレームワーク領域及び定常領域を含有する抗体である。例えば、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、１種または複数種のマウス抗体に由来するＣＤＲならびにヒトフレームワーク及び定常領域を含んでよい。したがって、一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗体は、抗体のＣＤＲが由来するマウス抗体と、ＰＤ−１上の同じエピトープに結合する。例示的なヒト化抗体は、本明細書で提供される。本明細書で提供される重鎖及び軽鎖ＣＤＲを含む追加の抗ＰＤ−１抗体、またはそのバリアントは、任意のヒトフレームワーク配列を使用して生成されてよく、それらもまた本発明に包含される。一実施形態では、本発明での使用に好適なフレームワーク配列としては、本明細書で提供されるフレームワーク配列に構造的に類似したこれらのフレームワーク配列が挙げられる。フレームワーク領域におけるさらなる修飾が、本明細書で提供される抗体の特性を改善するために行われてもよい。このようなさらなるフレームワーク修飾としては、化学修飾；免疫原性を減少させる、もしくはＴ細胞エピトープを除去する点突然変異；または本来の生殖細胞系配列における残基への復帰突然変異を挙げ得る。

【0053】

いくつかの実施形態では、このようなフレームワーク修飾としては、生殖細胞系配列への復帰突然変異を含む、本明細書で例示される突然変異に対応するものが挙げられる。例えば、一実施形態では、本明細書で提供されるヒト化抗体のＶＨ及び／またはＶＬのヒトフレームワーク領域における１つまたは複数のアミノ酸を、親マウス抗体の対応するアミノ酸に復帰突然変異させる。一例として、７Ａ４及び１３Ｆ１のＶＨ及びＶＬに関しては、上述した鋳型ヒト抗体におけるフレームワークアミノ酸のいくつかの部位を、マウス７Ａ４及び１３Ｆ１抗体の対応するアミノ酸に復帰突然変異させた。一実施形態では、軽鎖可変領域の４０位及び／または４５位及び／または７０位及び／または７２位のアミノ酸を、マウス７Ａ４または１３Ｆ１軽鎖可変領域のそれらの位置で見られる対応するアミノ酸に復帰突然変異させる。別の実施形態では、重鎖可変領域の２位及び／または２６位及び／または４６位及び／または４８位及び／または４９位及び／または６７位及び／または７０位及び／または７１位のアミノ酸を、マウス７Ａ４または１３Ｆ１重鎖可変領域のそれらの位置で見られる対応するアミノ酸に復帰突然変異させる。一実施形態では、ヒト化７Ａ４抗体は軽鎖可変領域を含み、ここで４０位のアミノ酸をＴｙｒ（Ｙ）からＰｈｅ（Ｆ）に変異させ、７２位のアミノ酸をＧｌｙ（Ｇ）からＡｒｇ（Ｒ）に変異させる；かつヒト化７Ａ４抗体は重鎖可変領域を含み、ここで２位のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させ、４６位のアミノ酸をＧｌｕ（Ｅ）からＬｙｓ（Ｋ）に変異させ、７０位のアミノ酸をＰｈｅ（Ｆ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させる。一実施形態では、ヒト化１３Ｆ１抗体は軽鎖可変領域を含み、ここで４５位のアミノ酸をＬｅｕ（Ｌ）からＰｒｏ（Ｐ）に変異させ、７０位のアミノ酸をＰｈｅ（Ｆ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異させる；かつヒト化１３Ｆ１抗体は重鎖可変領域を含み、ここで２６位のアミノ酸をＧｌｙ（Ｇ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異させ、４８位のアミノ酸をＩｌｅ（Ｉ）からＭｅｔ（Ｍ）に変異させ、４９位のアミノ酸をＧｌｙ（Ｇ）からＡｌａ（Ａ）に変異させ、６７位のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させ、７１位のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＡｒｇ（Ｒ）に変異させる。追加の、または代替の復帰突然変異が、抗体の特性を改善するために、本明細書で提供されるヒト化抗体のフレームワーク領域で行われてもよい。

【0054】

本発明はまた、ＰＤ−１に結合し、任意の好適なフレームワーク配列に対する、本明細書に記載される例示的な修飾に対応するフレームワーク修飾、加えてさもなければ抗体の特性を改善するその他のフレームワーク修飾を含むヒト化抗体を包含する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、１つまたは複数の脱アミド部位または１つまたは複数の酸化部位を除去する１つまたは複数の突然変異を含む。例えば、一実施形態では、本明細書で提供される抗体は、１つまたは複数の脱アミド部位を除去する１つまたは複数のアスパラギン残基の突然変異、及び／または１つまたは複数の酸化部位を除去する１つまたは複数のメチオニン残基の突然変異を含む。

【0055】

その他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、安定性を改善する、溶解度を改善する、グリコシル化を変化させる、及び／または免疫原性を減少させる１つまたは複数の突然変異、例えば、脱アミドもしくは酸化を減少させる、異性化を減少させる、疎水性コア及び／もしくは電荷クラスター残基を最適化する、疎水性表面残基を除去する、可変重鎖と可変軽鎖との間の界面に関与する残基を最適化する、ならびに／または等電点を変更する標的アミノ酸変化などによる突然変異を含む。

【0056】

本明細書で使用される場合、「由来の」という用語は、参照抗体またはその他の結合タンパク質に関する分子またはポリペプチドを指すために使用される場合、参照抗体またはその他の結合タンパク質と同じエピトープに対して特異性を有する結合ができる分子またはポリペプチドを意味する。

【0057】

本明細書で開示される抗体及びその抗原結合断片は、ＰＤ−１に特異的である。一実施形態では、抗体及びその断片は、ヒトＰＤ−１に特異的である。一実施形態では、本明細書で提供される抗体及び断片は、ヒトまたは霊長類ＰＤ−１には結合するが、任意のその他の哺乳動物に由来するＰＤ−１には結合しない。さらなる実施形態では、抗体及びその断片は、マウスＰＤ−１に結合しない。「ヒトＰＤ−１」、「ｈＰＤ−１」、及び「ｈｕＰＤ−１」などの用語は、本明細書では同じ意味で使用され、ヒトＰＤ−１及びヒトＰＤ−１のバリアントまたはアイソフォームを指す。「特異的」とは、抗体及びその断片が、任意のその他の標的よりも高い親和性でＰＤ−１受容体と結合することを意味する。一実施形態では、本明細書で提供されるＰＤ−１抗体及び断片は、ＰＤ−１に特異的であり、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２８とは交差反応しない。本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、抗体の最大の応答の５０％を得る有効濃度を指す。本明細書で使用される場合、「ＩＣ５０」という用語は、抗体の最大の応答の５０％を得る阻害濃度を指す。ＥＣ５０及びＩＣ５０の両方とも、ＥＬＩＳＡもしくはＦＡＣＳ分析、または当該技術分野において既知の、任意のその他の方法により測定されてもよい。

【0058】

一実施形態では、抗ＰＤ１抗体及びその断片またはバリアントは、約０．００１ｎＭ〜約１００ｎＭ、約０．００２ｎＭ〜約５０ｎＭ、約０．００５ｎＭ〜約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約１ｎＭ、または約０．０５ｎＭ〜約０．１ｎＭの範囲内でＰＤ−１に対する親和性（ＫＤ）を有する。一実施形態では、抗体及びその断片は、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約８ｎＭ以下、約６ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．９ｎＭ以下、約０．８ｎＭ以下、約０．７ｎＭ以下、約０．６ｎＭ以下、約０．５ｎＭ以下、約０．４ｎＭ以下、約０．３ｎＭ以下、約０．２ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下、約０．０９ｎＭ以下、約０．０８ｎＭ以下、約０．０７ｎＭ以下、約０．０６ｎＭ以下、約０．０５ｎＭ以下、約０．０４ｎＭ以下、約０．０３ｎＭ以下、約０．０２ｎＭ以下、約０．０１ｎＭ以下、約０．００９ｎＭ以下、約０．００８ｎＭ以下、約０．００７ｎＭ以下、約０．００６ｎＭ以下、約０．００５ｎＭ以下、約０．００４ｎＭ以下、約０．００３ｎＭ以下、約０．００２ｎＭ以下、または約０．００１ｎＭ以下のＰＤ−１に対する親和性（ＫＤ）を有する。一実施形態では、抗体及びその断片は、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．０９ｎＭ、約０．０８ｎＭ、約０．０７ｎＭ、約０．０６ｎＭ、約０．０５ｎＭ、約０．０４ｎＭ、約０．０３ｎＭ、約０．０２ｎＭ、約０．０１ｎＭ、約０．００９ｎＭ、約０．００８ｎＭ、約０．００７ｎＭ、約０．００６ｎＭ、約０．００５ｎＭ、約０．００４ｎＭ、約０．００３ｎＭ、約０．００２ｎＭ、または約０．００１のＰＤ−１に対する親和性（ＫＤ）を有する。

【0059】

一実施形態では、本明細書で提供される抗体及び断片は、軽鎖及び重鎖を含み、その各々が３つのＣＤＲ領域を含む。本発明のＰＤ−１抗体に関する例示的な軽鎖ＣＤＲ配列（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）が、表１で以下に提供される。本発明のＰＤ−１抗体に関する例示的な重鎖ＣＤＲ配列（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）が、表２で以下に提供される。本発明のＰＤ−１抗体に関する例示的な可変領域及び完全抗体配列が、表３で以下に提供される。

【0060】

（表１）軽鎖ＣＤＲ配列

【0061】

（表２）重鎖ＣＤＲ配列

【0062】

（表３）軽鎖及び重鎖可変領域配列ならびに完全抗体配列

【0063】

一実施形態では、本発明は、抗体１０Ｄ１、４Ｃ１０、７Ｄ３、１３Ｆ１、１５Ｈ５、１４Ａ６、２２Ａ５、６Ｅ１、５Ａ８、及び／または７Ａ４の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲを含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。当業者は、本明細書で提供される抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲが、本明細書で提供される抗体に由来する任意の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３；ならびに任意の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗体またはその結合断片を形成するために、独立して選択されてもよい、または混合及び適合されてもよいと理解するだろう。したがって、本発明は、配列番号２４、３４、４５、５５、６５、７５、８５、９５、１０５、及び１１５から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２５、３５、４６、５６、６６、７６、８６、９６、１０６、及び１１６から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、配列番号２６、３６、４７、５７、６７、７７、８７、９７、１０７、及び１１７から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３、配列番号１９、２９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、及び１１０から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２０、３０、４１、５１、６１、７１、８１、９１、１０１、及び１１１から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、ならびに配列番号２１、３１、４２、５２、６２、７２、８２、９２、１０２、及び１１２から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書で提供される、対応する軽鎖または重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３と少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書で提供される、対応する軽鎖または重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３と比較して１、２、３、４、５、または６つのアミノ酸置換、欠失、または挿入を有するアミノ酸配列を含む重鎖及び軽鎖ＣＤＲ領域を含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。

【0064】

一実施形態では、本発明は、１０Ｄ１、４Ｃ１０、７Ｄ３、１３Ｆ１、１５Ｈ５、１４Ａ６、２２Ａ５、６Ｅ１、５Ａ８、７Ａ４及び７Ａ４Ｄから成る群から選択される抗体の可変軽鎖ならびに１０Ｄ１、４Ｃ１０、７Ｄ３、１３Ｆ１、１５Ｈ５、１４Ａ６、２２Ａ５、６Ｅ１、５Ａ８、及び７Ａ４から成る群から選択される抗体の可変重鎖を含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。一実施形態では、本明細書で提供される抗体及び断片は、配列番号２３、３３、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１３３、１４３及び１５２の軽鎖可変領域に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、本明細書で提供される抗体及び断片は、配列番号２３、３３、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１３３、１４３、１５２、またはそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、このバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０のアミノ酸置換もしくは欠失、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。別の実施形態では、アミノ酸置換は、本明細書で提供されるような抗体の特性を、例えば脱アミド部位を除去することにより改善する。例えば、一実施形態では、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）残基を変異させる。さらなる実施形態では、Ａｓｎをアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）に変異させる。またさらなる実施形態では、軽鎖可変領域のフレームワーク領域３における８５位のＡｓｎを、Ａｓｐに変異させる。一実施形態では、本開示はヒト化抗体７Ａ４Ｄを提供し、これは脱アミド部位を除去するために軽鎖のフレームワーク３（８５位）に突然変異を有すること以外は、ヒト化抗体７Ａ４と同じアミノ酸配列を含む。

【0065】

一実施形態では、本明細書で提供される抗体及び断片は、配列番号１８、２８、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１３１、及び１４１、または８４の軽鎖可変領域に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、本明細書で提供される抗体及び断片は、配列番号１８、２８、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１３１、１４１、またはそれらのバリアントのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、このバリアントは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくはそれを超えるアミノ酸置換、挿入、もしくは欠失、またはこれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。別の実施形態では、アミノ酸置換は、本明細書で提供されるような抗体の特性を、例えば脱アミド部位を除去することにより改善する。例えば、一実施形態では、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）残基を変異させる。さらなる実施形態では、Ａｓｎをアスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）に変異させる。

【0066】

ＣＤＲ領域または可変軽鎖もしくは重鎖領域に、１つまたは複数のアミノ酸置換、挿入、欠失、またはこれらの組み合わせを有する、本明細書で開示される抗ＰＤ−１抗体は、アミノ酸置換、挿入、または欠失を有しない対応する抗ＰＤ−１抗体の生物活性を保持する。したがって、本明細書で提供されるバリアント抗ＰＤ−１抗体は、ＰＤ−１への結合を保持する。パーセント相同性は、本明細書で使用される場合、２つの参照配列により共有される同一のアミノ酸配列数を、アミノ酸位置の総数で割って１００を掛けた数を指す。

【0067】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、保存的アミノ酸置換を含む。当業者は、保存的アミノ酸置換とは、１つのアミノ酸と、類似した構造的または化学的特性、例えば類似した側鎖などを有する別のアミノ酸との置換であると認識するだろう。例示的な保存的置換は、当該技術分野において、例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｇａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，４^ｔｈ Ｅｄ．（１９８７）に記載されている。

【0068】

当業者は、可変軽鎖及び可変重鎖が、本明細書で提供される抗体から独立して選択されてもよい、または混合及び適合されてもよいと理解するだろう。したがって、本発明は、配列番号２３、３３、４４、５４、６４、７４、８４、９４、１０４、１１４、１３３、１４３、及び１５２から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する軽鎖可変領域、ならびに配列番号１８、２８、３９、４９、５９、６９、７９、８９、９９、１０９、１３１、及び１４１から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する重鎖可変領域を含む抗ＰＤ−１抗体を提供する。

【0069】

一実施形態では、本発明は、本明細書で開示される例示的な抗体のいずれか１つと同じエピトープに結合する抗体を提供する。したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書で提供される例示的な抗体と、ＰＤ−１への結合について競合する抗体を提供する。

【0070】

本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、エフェクター機能を変化させるＦｃ領域修飾をさらに含んでよい。Ｆｃ修飾は、アミノ酸挿入、欠失、もしくは置換であってもよく、または化学修飾であってもよい。例えば、Ｆｃ領域修飾は、補体結合を増加もしくは低減させる、抗体依存性細胞傷害を増加もしくは低減させる、または抗体の半減期を増加もしくは低減させるように行われてもよい。いくつかのＦｃ修飾は、Ｆｃγ受容体、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、またはＦｃＲｎなどに対する抗体の親和性を増加または低減させる。種々のＦｃ修飾が、当該技術分野において、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７６；６５９１（２００１）；Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ １１９；２０７４（２０１２）；Ｓｐｉｅｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １９６；３０３（２００２）；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ ２：２；１８１（２０１０）；Ｍｅｄｚｉｈｒａｄｓｋｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４４６；２９３（２００８）；Ｍａｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３５；８６（２００７）；及びＩｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６４；４１７８（２０００）に記載されている。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域グリコシル化パターンを変化させる。その他の実施形態では、Ｆｃ領域をＰＥＧ化により（例えば、抗体またはその断片をポリエチレングリコール（ＰＥＧと反応させることにより）修飾する。

【0071】

一実施形態では、本明細書で提供される抗体またはその断片は、抗ＰＤ−１抗体またはその断片を含み、追加の治療剤、細胞傷害剤、イムノアドヘシン分子、及び造影剤を含む群から選択される薬剤をさらに含む免疫複合体である。いくつかの実施形態では、造影剤は、放射性標識、酵素、蛍光標識、発光標識、生物発光標識、磁気標識、及びビオチンから成る群から選択される。いくつかの実施形態では、造影剤は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^６２、^６４Ｃｕ、^８９Ｚｒ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、及び^１５３Ｓｍから成る群から選択される放射性標識である。いくつかの実施形態では、治療剤または細胞傷害剤は、化学療法剤、免疫抑制剤、免疫刺激剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、成長因子、サイトカイン、抗血管新生剤、抗有糸分裂剤、アントラサイクリン、毒素、及びアポトーシス剤を含む群から選択される。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、薬剤と直接複合体化される。その他の実施形態では、結合タンパク質は、リンカーにより薬剤と複合体化される。好適なリンカーとしては、本明細書で開示されるアミノ酸及びポリペプチドリンカーが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは、開裂可能であっても、または開裂不可能であってもよい。

【0072】

一実施形態では、本発明は、ＰＤ−１及び少なくとも１つのその他の抗原またはエピトープに特異的な二重特異性または多重特異性抗体を提供する。本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、本明細書で提供される結合アッセイ、または当該技術分野において既知の、任意のその他の結合アッセイを使用して、ＰＤ−１への結合について試験されてもよい。

【0073】

別段の記載がない限り、本発明の実施には、当該技術分野において周知であって、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｃ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ ｅｔ ａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）；及びＵｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）に記載されている従来の分子生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学技術を用いる。

【0074】

一態様では、本発明は、免疫応答の増強、刺激、または誘発に応答する疾患または状態について、対象を処置する方法を提供する。本明細書で使用される場合、「処置」または「処置すること」という用語は、治療的処置及び予防的または防止的手段の両方を指す。処置を必要とする対象としては、既に疾患または状態を有するこれらの対象、加えて疾患または状態を発症する可能性があって、その疾患または状態を予防する、遅延させる、または減少させることを目的とする対象が挙げられる。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、げっ歯類、ネコ科、イヌ科、及び霊長類などの哺乳動物を示す。好ましくは、本発明による対象はヒトである。

【0075】

「治療有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、治療的及び／または予防的有益性を対象に提供するために必要な化合物または組成物の量を指す。

【0076】

一態様では、抗体及びその抗原結合断片は、固形または非固形腫瘍の処置に有用である。したがって、一態様では、本発明は、癌の処置方法を提供する。「癌」は、本明細書で使用される場合、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指す。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫（脂肪肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、内皮肉腫、平滑筋肉腫、脊索腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、横紋筋肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、軟骨肉腫を含む）、神経内分泌腫瘍、中皮腫、滑膜腫、神経鞘腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫、及び白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより詳細な例としては、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮扁平上皮細胞癌）、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病及びリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、及びＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、胸腺腫、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫及び大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟Ｔ細胞及びＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄性腫瘍、例えば、分化型ＡＭＬ、非分化型ＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性単球性白血病、及び急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、ならびに慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性疾患、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫など、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌を含む肺癌、小細胞肺癌腫、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃の癌または胃癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝臓癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、ユーイング腫瘍、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、ヘパトーマ、胆管癌腫、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌腫、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍、肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、骨髄異形成疾患、重鎖病、神経内分泌腫瘍、神経鞘腫、ならびにその他の癌腫、加えて頭頸部癌が挙げられる。

【0077】

一実施形態では、本明細書で提供される抗体及びその断片は、感染因子により引き起こされる疾患の処置に有用である。感染因子としては、細菌因子、菌類因子、寄生因子、及びウイルス因子が挙げられるが、これらに限定されない。このような感染因子の例としては、以下のものが挙げられる：ブドウ球菌属、メチシリン耐性スタフィロコッカス アウレウス（Sｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、連鎖球菌科、ナイセリア科、球菌、腸内細菌科、腸球菌、バンコマイシン耐性腸球菌、クリプトコッカス、ヒストプラスマ症、アスペルギルス、シュードモナス科、ビブリオ科、カンピロバクター、パスツレラ科、ボルデテラ、フランシセラ、ブルセラ、レジオネラ科、バクテロイデス科、グラム陰性桿菌、クロストリジウム、コリネバクテリウム、プロピオニバクテリウム、グラム陽性桿菌、炭疽菌、アクチノマイセス、ノカルジア、マイコバクテリウムトレポネーマ、ボレリア、レプトスピラ、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、リケッチア、クラミジア門、カンジダ、全身性真菌症、日和見真菌症、原虫、線虫、吸虫、条虫、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス及びエプスタインバーウイルス、ならびに帯状疱疹ウイルスを含む）、ポックスウイルス、パポーバウイルス、肝炎ウイルス、（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス及びＣ型肝炎ウイルスを含む）、パピローマウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、及びインフルエンザＣ型を含む）、パラミクソウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、レオウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びレトロウイルス。例示的な感染症としては、カンジダ症、カンジダ血症、アスペルギルス症、連鎖球菌性肺炎、連鎖球菌性の皮膚及び口咽頭の状態、グラム陰性菌による敗血症、結核、単核球症、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされる呼吸器病、マラリア、住血吸虫症、ならびにトリパノソーマ症が挙げられるが、これらに限定されない。

【0078】

一実施形態では、本明細書で提供される抗体及びその断片は、Ｔヘルパー２型（Ｔｈ２）Ｔ細胞により媒介される疾患、例えば、喘息、アレルギー、または移植片対宿主病などの処置に有用である。

【0079】

一実施形態では、本明細書で提供される抗体及びその断片は、免疫応答の刺激を必要とする対象の免疫応答の刺激に有用である。例えば、一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及びその断片は、関心対象の抗原に対する免疫応答を誘発する目的で、この抗原と組み合わせて投与されてもよい。関心対象の抗原は、病原体、例えばウイルスまたは細菌などに関連した抗原であってもよい。したがって、一実施形態では、本発明は、抗ＰＤ−１抗体及び抗原を含むワクチンを提供し、このワクチンは抗原特異的免疫応答を誘発する。

【0080】

一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、制御性Ｔ細胞機能を調節する。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞機能の効果を抑制する、または減少させるリンパ球である。「制御性Ｔ細胞」及び「Ｔｒｅｇ」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、エフェクターＴ細胞のサイトカイン産生に対する制御性Ｔ細胞の阻害効果を予防する、または反転させる。例えば、一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体は、制御性Ｔ細胞と接触したエフェクターＴ細胞にＩＦＮγ産生能力を回復させる。

【0081】

一実施形態では、本明細書で開示される抗体及びその断片は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内、気管支内、腹内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸内、鼓室内、子宮内、膀胱内、硝子体内、ボーラス、結膜下、膣、直腸、頬、舌下、鼻腔内、腫瘍内、及び経皮から選択される少なくとも１つの経路により対象に投与されてもよい。

【0082】

一実施形態では、本明細書で開示される抗体及びその断片は、１種または複数種の追加の治療剤と組み合わされて、抗体及びその断片を必要とする対象に投与されてもよい。一実施形態では、抗体及びその断片は、追加の治療剤の、対象への投与前、投与中、及び／または投与後に対象に投与されてもよい。一実施形態では、追加の治療剤は、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、抗体もしくはその断片、または疾患を処置するために必要な任意の、その他の追加の治療薬である。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及び追加の治療剤は、同時にまたは逐次的投与に関わらず、一緒に投与される場合に治療的相乗効果を示す。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及び追加の治療剤は、別個の製剤で投与される。別の実施形態では、抗ＰＤ−１抗体及び追加の治療剤は、同じ製剤で投与される。一実施形態では、本明細書で提供される抗ＰＤ−１抗体及び断片は、１種または複数種の追加の治療剤が持つ免疫調節効果を増強する。別の実施形態では、１種または複数種の追加の治療剤は、抗ＰＤ−１抗体またはその断片の効果を増強する。

【0083】

本発明は、単離された抗体及びその抗原結合断片、ならびにこのような抗体及び断片をコードする核酸、加えてこのような単離された抗体、断片、及び核酸を含む組成物を提供する。「単離された」という用語は、その自然環境から分離されている関心対象の化合物（例えば、抗体または核酸）を指す。本発明は、単離された抗体もしくはその断片、またはこのような抗体もしくは断片をコードする核酸を含み、１種または複数種の薬学的に許容される担体をさらに含む医薬組成物をさらに提供する。薬学的に許容される担体としては、例えば、賦形剤、希釈剤、封入材料、充填剤、緩衝剤、またはその他の薬剤が挙げられる。

【0084】

単数形の使用には、別段の具体的な記載がない限り、複数形が含まれる。「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という単語は、別段の具体的な記載がない限り、「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」を意味する。「または（ｏｒ）」の使用は、別段の記載がない限り、「及び／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という語句の意味は、「１つまたは複数の（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」という語句の意味と同等である。さらに、「を含むこと(ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ)」という用語に加えて、その他の形態、例えば「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「〜を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの使用に制限はない。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、別段の具体的な記載がない限り、１つの単位を含む要素または構成要素及び２つ以上の単位を含む要素または構成要素の両方を包含する。

【0085】

前述の本発明を、理解の明確化を目的として例証及び例示によってある程度詳細に記載してきたが、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に一定の変更及び修正が加えられてもよいことが、当業者には容易に明らかとなるであろう。以下の実施例は、例証として提供されているにすぎず、制限として提供されるのではない。当業者は、変更または修正しても、本質的に類似した結果を得ることができる様々な重要でないパラメータを容易に認識するだろう。

【実施例】

【0086】

実施例１−マウス免疫化及びヒトＰＤ−１に対するマウス抗体の産生
ヒトＰＤ−１に対する抗体を生成するために、ｈＰＤ−１をヒスチジンタグ（ｈＰＤ−１−Ｈｉｓタグ、配列番号１）、マウスＦｃ（ｈＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃ、配列番号１３）、及びヒトＦｃタグ（ｈＰＤ−１−ｈＦｃ、配列番号５）と融合して、その細胞外ドメインのオープンリーディングフレームをコードするｃＤＮＡをＰＣＲにより得て、それぞれ発現ベクターのｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｖ−７９０）にサブクローニングした。ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞での一過性発現後、ｈＰＤ−１−ＨｉｓタグをＮＴＡカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ｈＰＤ−１−ｍＦｃ及びｈＰＤ−１−ｈＦｃをプロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。

【0087】

ハイブリドーマ細胞株の生成に必要なマウスを免疫化するために、１００μｇのヒトＰＤ−１−マウスＦｃ融合タンパク質または及び同量の完全フロイントアジュバントを混合し、その混合物を５匹の６〜７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの各々に皮下注射により投与した。２週後、上記と同じ方法を使用して、抗原（先に注射した量の半分）を不完全フロイントアジュバントと混合し、その混合物を各マウスに皮下注射により投与した。１週後、最後の追加免疫化を実施し、３日後に各マウスの尾部から血液を採取して血清を得た。次いで、血清をＰＢＳで１／１０００に希釈し、ＥＬＩＳＡを実施してヒトＰＤ−１−ｍＦｃを認識する抗体の力価が増加したかどうかを分析した。その後、十分な量の抗体を得たマウスを選択し、選択したマウスで細胞融合プロセスを実施した。

【0088】

細胞融合実験の３日前に、５０μｇのＰＢＳとヒトＰＤ−１−ｍＦｃ融合タンパク質との混合物を、各マウスに腹腔内注射により投与した。各免疫化マウスを麻酔し、次いで体の左側に位置するその脾臓を摘出してメッシュで粉砕し、細胞を単離して、これを培地（ＲＰＭＩ１６４０）と混合して脾臓細胞懸濁液を調製した。懸濁液を遠心分離し、細胞層を収集した。得られた１×１０^８個の脾臓細胞を、１．５×１０^７個の骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）と混合し、その混合物を遠心分離して細胞を沈殿させた。沈殿物をゆっくりと分散させて、ＰＥＧ Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．、カタログ番号７１８１）で処置した。混合細胞を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり０．１ｍｌずつ分注し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターでインキュベートした。１日目に、各ウェルに血清及びＨＡＴに加えて２倍のメトトレキサートを含有する追加の０．１ｍｌ培地の添加により細胞に供給した。３日目及び７日目に、各ウェルの０．１ｍｌの培地を０．１ｍｌの新しいＨＴ培地で置き換えた。スクリーニングは、典型的には９〜１４日目に行った。

【0089】

実施例２−ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析に基づいた、ヒトＰＤ−１タンパク質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞の選択
ＥＬＩＳＡ結合分析を、ヒトＰＤ−１−ｈＦｃタンパク質に基づいて実施した。９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号９０１８）を、コーティング緩衝液（ＰＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１Ｂ）中、２μｇ／ｍｌのＰＤ１−ｈＦｃ（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を１００μＬ用いて４℃で一晩コーティングした。ウェルを吸引し、非特異的結合部位を、１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号７３８３２８）を用いた２００μＬのブロッキング緩衝液を添加して、３７℃で１時間インキュベートすることによりブロックした。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１３７９）を加えたＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液中のハイブリドーマ上清の好適な希釈物を１００μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μＬ／ウェルの、ブロッキング緩衝液中のヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３１４３２）で６０分間インキュベートした。プレートを洗浄した後、１００μＬ／ウェルの基質溶液（ＴＭＢ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号００−４２０１−５６）を添加し、プレートを室温で２分間インキュベートした。１００μＬ／ウェルの停止溶液（２ＮのＨ２ＳＯ４）を添加して、反応を停止させた。比色シグナルが生じたら、Ａｕｔｏ Ｐｌａｔｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（供給業者：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；モデル：ＭＮＲ０６４３；ソフトウェア：ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４）を使用して４５０ｎｍで読み取った。この方法により、ヒトＰＤ−１タンパク質と高度に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を、繰り返し選択した。

【0090】

ＥＬＩＳＡに基づくリガンド妨害分析を、ヒトＰＤ−１−ｈＦｃへの結合からビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１−ｍＦｃをブロックすることにより実施した。ＰＤ−１−ｍＦｃ抗原（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を、ＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、カタログ番号ＳＨ３０２５６．０１Ｂ）緩衝液中に懸濁し（２ｕｇ／ｍｌ、１００ｕｌ／ウェル）、９６ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号９０１８）上に４℃で一晩コーティングした。プレートを、洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ１３７９）を使用して３回洗浄した。２００ｕｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号７３８３２８））を各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートして、３回洗浄した。種々の濃度（ＰＢＳ中のハイブリドーマ上清の好適な希釈物）の抗ＰＤ−１抗体をウェルに添加し（１００μｌ／ウェル）、３７℃で１時間インキュベートした。リガンドを添加し（０．１ｕｇ／ｍｌのＰＤＬ−１−ｍＦｃ−ビオチン、１００μｌ／ウェル）、３７℃で２時間インキュベートして、３回洗浄した。二次抗体（アビジンＨＲＰ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ番号Ｅ０７４１８−１６３２、１：５００、１００ｕｌ／ウェル）を添加し、３７℃で０．５時間インキュベートして、３回洗浄した。ＴＭＢ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０、１００ｕｌ／ウェル）を添加し、室温で３分間インキュベートした。反応を停止させるために、２ＮのＨ２ＳＯ４（１００ｕｌ／ウェル）を添加した。比色シグナルが生じたら、Ａｕｔｏ Ｐｌａｔｅ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ（供給業者：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ；モデル：ＭＮＲ０６４３；ソフトウェア：ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．４）を使用して４５０ｎｍで読み取った。

【0091】

抗体の細胞結合分析を、ｈＰＤ−１−２９３Ｔ細胞株に基づいて実施した。２×１０^５個の２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞を、９６ウェル培養プレートの各ウェルにそれらを置くことにより各反応に使用した。細胞を、示した抗体（１／５希釈で２０ｕｇ／ｍｌ）と共に４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。二次抗体（ＰＥヤギ抗マウス：１：２００；ＰＥマウス抗ヒト：１：１０）を１００ｕｌ／ウェルで細胞に添加し、４℃で４０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙによって分析した。

【0092】

ＦＡＣＳに基づくリガンド妨害分析を、フローサイトメトリーアッセイを使用して、ｈＰＤ−１−２９３Ｔ細胞に対するビオチン化ヒトＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２結合の妨害における抗ＰＤ−１ハイブリドーマ抗体を決定するために実施した。ＰＤ−１発現２９３Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（３％のウシ胎児血清を加えたＰＢＳ）中に懸濁した。種々の濃度の試験するハイブリドーマ抗体を細胞懸濁液に添加し、９６ウェルプレートにおいて４℃で６０分間インキュベートした。ビオチン標識ＰＤ−Ｌ１タンパク質またはビオチン標識ＰＤ−Ｌ２タンパク質をウェルに添加し、４℃で６０分間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、マウス抗ビオチンＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｇｅｎｄ、カタログ番号４０９００４）を添加した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳ Ａｒｒａｙを使用して実施した。試験の結果を、図１Ａ（ＰＤ−Ｌ１）及び図１Ｂ（ＰＤ−Ｌ２）に図示する。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体は、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されるように、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と、ヒトＰＤ−１をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞との結合をブロックした。これらのデータは、抗ＰＤ−１抗体が、リガンドＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２と細胞表面ＰＤ−１との結合をブロックすることを実証した。

【0093】

実施例３−モノクローナル抗体クローンを得るためのサブクローニング及び抗ｈＰＤ−１抗体の精製
サブクローニングは限界希釈法の手順に基づき、モノクローナル抗体を産生する個々のハイブリドーマクローンを得るように設計する。ハイブリドーマの各々を複数回（４回）の限界希釈法に供した。サブクローニングの各回について、クローンをＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳに基づく妨害分析により試験した。

【0094】

抗体精製を、合計で２２種の抗ｈＰＤ−１ハイブリドーマ抗体について実施した。ハイブリドーマ細胞を、１０％のウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２％のＬ−グルタミン、及び１％の調整したＮａＨＣＯ_３溶液を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＧＩＢＣＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）で培養した。次いで、選択したハイブリドーマ細胞を無血清培地に適合させ、プロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して上清から抗体を精製した。ＰＢＳで洗浄した後、０．１ＭのグリシンをｐＨ３．０で使用して結合した抗体を溶出し、続いて２．０ＭのＴｒｉｓを使用してｐＨを中和した。ウルトラ−１５遠心濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を、緩衝液交換及び抗体濃縮に使用した。

【0095】

実施例４−ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析に基づいた、結合活性及びリガンド妨害活性における精製マウス抗ｈＰＤ−１抗体の特徴付け
精製したハイブリドーマ抗体を、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析に基づいてさらに特徴付けた。使用した方法は、実施例２で上に記載したものと同様であったが、ただし、この場合は精製抗体を量及び濃度で測定し、その結果を使用してＥＣ５０値及びＩＣ５０値を計算した。以下の表、すなわち表１〜５は、１０種の抗体の結果を示す。

【0096】

（表１）１０種のマウス抗ＰＤ−１抗体のＥＬＩＳＡに基づく結合ＥＣ５０

【0097】

（表２）１０種のマウス抗ＰＤ−１抗体のＥＬＩＳＡに基づく妨害ＩＣ５０

【0098】

（表３）１０種のマウス抗ＰＤ−１抗体のＦＡＣＳに基づく結合ＥＣ５０

【0099】

（表４）選択した１０種のマウス抗ＰＤ−１抗体のＦＡＣＳに基づくＰＤ−Ｌ１妨害ＩＣ５０

【0100】

（表５）選択した１０種のマウス抗ＰＤ−１抗体のＦＡＣＳに基づくＰＤ−Ｌ２妨害ＩＣ５０

【0101】

実施例５：マウス抗ＰＤ−１抗体のＢｉａｃｏｒｅ分析
抗体の結合特性をさらに特徴付けるために、１０種のハイブリドーマ抗体をＢｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００、ＧＥ）を使用して特性を明らかにし、結合速度を明らかにして平衡結合定数を計算した。このアッセイを、ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｐｔｕｒｅ ｋｉｔ（ＢＲ−１００８−３８、ＧＥ）を使用して、捕捉方法により実施した。抗マウスＦｃ ｍａｂをｐＨ５．０の固定化緩衝液中で２５μｇ／ｍｌまで希釈した後、５μｌ／分の流速で表６に示すパラメータを用いて固定化を実施した。速度論的実行は、１）リガンドを典型的には０．５〜１分間、１０μｌ／分の流速で注入し；２）好適な分析物を典型的には３分間注入し、続いて典型的には５〜１０分間、３０μｌ／分の流速でのランニング緩衝液（１倍のＰＢＳ−Ｐ２０）中で解離させて；３）再生溶液の１０ｍＭのグリシンをｐＨ１．７で典型的には１〜２分間、１０μｌ／分の流速で注入することにより行った。

【0102】

（表６）Ｂｉａｃｏｒｅパラメータ

【0103】

試験の結果を表７に示す。抗ヒトＰＤ１抗体の各々は、１．１１Ｅ＋０５ １／Ｍｓ〜８．４０Ｅ＋０５ １／Ｍｓの範囲の結合速度（ｋａ）；２．８３Ｅ−０５ １／ｓ〜７．５５Ｅ−０５ １／ｓの範囲の解離速度（ｋｄ）；１．６０Ｅ＋１０ １／Ｍ〜５．４４Ｅ＋１０ １／Ｍの範囲の平衡結合定数（ＫＡ）；及び１．８４Ｅ−１１Ｍ〜６．２３Ｅ−１１Ｍ（０．０１８４ｎＭ〜０．０６２３ｎＭ）の範囲の親和性（ＫＤ）を示した。

【0104】

（表７）抗ＰＤ−１ハイブリドーマ抗体のＫＤ値

【0105】

実施例６：種間の及び類似した分子間の交差反応
抗体の種交差反応を評価するために、マウス及びカニクイザルＰＤ−１受容体をＰＣＲによりクローニングし、安定にトランスフェクトした２９３Ｔ−ＰＤ−１細胞を生成した。抗体を、タンパク質に基づくＥＬＩＳＡを使用して、カニクイザル受容体への結合について試験した。試験の結果は、抗体がヒト及びカニクイザルＰＤ−１に等しい親和性で結合し、ヒトＰＤ−１と比較した場合に類似した有効性でｈＰＤ−Ｌ１／Ｆｃ及びｈＰＤ−Ｌ２／Ｆｃと、カニクイザルＰＤ−１との結合をブロックすることを示した。選択した抗体で、使用したアッセイのいずれにおいても、検出可能な親和性でマウスＰＤ−１と結合したものはなかった。ヒトＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ及びＣＤ２８と交差反応するものはない（表８を参照のこと）。

【0106】

実施例７：混合リンパ球反応におけるサイトカイン産生に対する抗ＰＤ−１ハイブリドーマ抗体の効果
混合リンパ球反応を使用して、リンパ球エフェクター細胞に対する、ＰＤ−１経路をブロックすることの効果を実証した。アッセイでは、マウス抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体の存在下または非存在下における増殖、ＩＦＮ−γ分泌及びＩＬ−２分泌についてＴ細胞を試験した。アッセイでは、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４＋の陰性選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０９１−１５５）を使用してＰＢＭＣから精製した。成熟樹状細胞（ＤＣ）は、精製した単球（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、Ｍｏ−ＤＣ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｂｏｘ、カタログ番号１３０−０９３−５６８）をＭｏ−ＤＣ分化培地で７日間培養し；次いで、ＤＣ成熟をＭｏ−Ｄｃ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎで２日間誘導して得た。各培養物は、２００μｌの総体積中、１０^５個の精製Ｔ細胞及び１０^４個の同種異系樹状細胞を含有した。抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の４Ｃ１０、５Ａ８、６Ｅ１、７Ｄ３、７Ａ４、１０Ｄ１、１３Ｆ１、１４Ａ６、１５Ｈ５、または２２Ａ５を各培養物に異なる抗体濃度で添加した。抗体なし、またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを陰性対照として使用した。細胞を３７℃で５日間培養した。５日目に、５０μｌの培地をＩＬ−２及びＩＦＮ−γの測定のために収集した。培養液中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２のレベルを、ＥＩＡ ｈＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２８５）及びＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して測定した。試験の結果を図２（ＩＬ−２分泌）及び図３（ＩＦＮ−γ分泌）に提供し、これは抗ヒトＰＤ−１モノクローナル抗体が、濃度依存的様式でＴ細胞増殖、ＩＦＮ−γ分泌及びＩＬ−２分泌を促進したことを示す。対照的に、アイソタイプ対照抗体を含有する培養物は、Ｔ細胞増殖、ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌の増加を示さなかった。

【0107】

実施例８：１０種のマウス抗ｈＰＤ−１抗体の特徴
精製して、特徴付けた１０種の抗ＰＤ１モノクローナル抗体の特性を表８にまとめる。これらの抗体は、ＰＤ−１に（２０ｕＭ〜３ｎＭの範囲の解離定数で）強力に結合し、異なるＩＣ５０値でＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２の両方との相互作用をブロックすることができた。抗体の各々は、ＩＬ２及びＩＦＮγ産生を誘導した。１０種の抗体には、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、またはＣＤ２８と交差反応したものはなかった。抗体の各々は、カニクイザルＰＤ−１と結合した。抗体の各々は、溶液に添加した場合に受容体アンタゴニストとして機能し、最終的にＴ細胞応答を増強した（実施例５を参照のこと）。

【0108】

（表８）１０種のマウス抗ｈＰＤ−１抗体の特徴付けした特徴の概要

【0109】

実施例９：抗ＰＤ−１抗体のｃＤＮＡ配列クローニング及びヒト化
免疫グロブリンｃＤＮＡのクローニング
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号７４１０４）により、ｈＰＤ−１抗体を産生するハイブリドーマ細胞株から単離した全ＲＮＡを鋳型として使用し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１８０６４−１４）をメーカーの指示に従って用いて第１鎖ｃＤＮＡを合成した。次いで、ｃＤＮＡ産物を、５０μｌ体積の反応混合物において縮重マウスＩｇＧプライマー（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ，ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：２０６−２１１（１９９３）、Ｓｔｒｅｂｅ Ｎ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：３−１４（２０１０））を使用してＰＣＲに供した。反応は、Ｓ１０００^（商標）サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ番号１８４−２０００）において、９４℃で１．５分間の変性；５０℃で１分間のアニーリング；及び７２℃で１分間の合成を３０サイクル行って実施した。３０回目のサイクルの最後に、反応混合物を伸張するためにさらに７分間７２℃でインキュベートした。

【0110】

ＰＣＲ混合物を、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％のアガロース／Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅゲルにおいて電気泳動に供した。予想したサイズ（重鎖及び軽鎖のおよそ４００ｂｐ）を有するＤＮＡ断片をゲルから除去して精製した。３μｌの精製したＰＣＲ産物をｐＭＤ−１８Ｔベクター（タカラ、カタログ番号Ｄ１０１Ａ）にクローニングし、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｃ４０４０−０３）を形質転換した。クローンを、ユニバーサルＭ１３フォワード及びリバースプライマーを使用してコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、Ｍ１３フォワードプライマー及びＭ１３リバースプライマーを使用した両方向のＤＮＡ配列決定のために、各反応物から１０個の陽性クローンを選択した。

【0111】

抗体４Ｃ１０（配列番号２８、３３）、５Ａ８（配列番号９９、１０４）、６Ｅ１（配列番号８９、９４）、７Ｄ３（配列番号３９、４４）、７Ａ４（配列番号１０９、１１４）、１０Ｄ１（配列番号１８、２３）、１３Ｆ１（配列番号４９、５４）、１４Ａ６（配列番号６９、７４）、１５Ｈ５（配列番号５９、６４）及び２２Ａ５（配列番号７９、８４）の可変領域配列を、対応するハイブリドーマクローンから増幅した。これらの抗体は、所望の機能、例えばＰＤ−Ｌ１に対するＰＤ−１結合のブロックならびにＴ細胞活性化及びサイトカイン放出の増強などを示した。

【0112】

キメラ７Ａ４及び１３Ｆ１抗体の構築及び発現
７Ａ４及び１３Ｆ１キメラ軽鎖（それぞれ配列番号１２３及び１２９）は、ＰＣＲでクローニングしたマウスＶＬ領域のｃＤＮＡを、それぞれヒトカッパ及びＩｇＧ１に連結することにより構築した。７Ａ４及び１３Ｆ１キメラＩｇＧ１重鎖（それぞれ配列番号１１９及び１２５）は、ＰＣＲでクローニングしたマウスＶＨ領域のｃＤＮＡをヒトＩｇＧ１定常領域に連結することにより構築した。７Ａ４及び１３Ｆ１キメラＩｇＧ４重鎖（それぞれ配列番号１２１及び１２７）は、ＰＣＲでクローニングしたマウスＶＨ領域のｃＤＮＡをヒトＩｇＧ４定常領域に連結することにより構築した。マウスｃＤＮＡ配列の５’末端を、軽鎖及び重鎖の両方にリーダー配列を付加するように設計されたＰＣＲプライマーを使用して修飾した。

【0113】

Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞（１０^６個／ｍＬで２００ｍＬ）に、１００μｇのキメラ重鎖及び軽鎖発現プラスミドの各々をトランスフェクトし、６日間培養した。次いで、上清中のキメラ抗体をプロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。キメラ抗体とＰＤ−１との結合を、実施例２及び５で上に記載したようにＥＬＩＳＡ及びＢｉａｃｏｒｅにより測定し、マウス親抗体の親和性と同等の親和性でＰＤ−１に結合することを示した。表９は、ＥＬＩＳＡにより測定された、キメラ抗ＰＤ−１抗体の各々の結合ＥＣ５０を示す。表１０は、ＥＬＩＳＡにより測定された、キメラ抗ＰＤ−１抗体の各々のＰＤ−Ｌ１妨害ＩＣ５０を示す。表１１は、ＦＡＣＳにより測定された、キメラ抗ＰＤ−１抗体の各々の結合ＥＣ５０を示す。表１２は、ＦＡＣＳにより測定された、キメラ抗ＰＤ−１抗体の各々のＰＤ−Ｌ１妨害ＩＣ５０を示す。

【0114】

（表９）キメラ抗ＰＤ−１抗体のＥＬＩＳＡに基づく結合ＥＣ５０

【0115】

（表１０）キメラ抗ＰＤ−１抗体のＥＬＩＳＡに基づく妨害ＩＣ５０

【0116】

（表１１）キメラ抗ＰＤ−１抗体のＦＡＣＳに基づく結合ＥＣ５０

【0117】

（表１２）キメラ抗ＰＤ−１抗体のＦＡＣＳに基づくＰＤ−Ｌ１妨害ＩＣ５０

【0118】

実施例７で上に記載したような混合リンパ球反応を使用して、Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌（図４）及びＩＦＮ−γ分泌（図５）に対するキメラ抗ＰＤ−１抗体の効果を決定した。キメラ抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の各々は、ＭＬＲアッセイにおいて濃度依存的様式でＩＬ−２分泌及びＩＦＮγ分泌を促進した。対照的に、アイソタイプ対照抗体（ｈＩｇＧ４）は、試験したいずれの濃度でもＩＬ−２分泌またはＩＦＮγ分泌を誘発しなかった。

【0119】

抗体ヒト化設計
７Ａ４及び１３Ｆ１抗体を、ＣＤＲ移植手法（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２２５，５３９号明細書）を使用してヒト化する。マウス抗体７Ａ４及び１３Ｆ１の軽鎖及び重鎖可変鎖配列を、ＮＣＢＩデータベースhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgiを検索することにより、構造バイオインフォマティクス研究共同体（ＲＣＳＢ）のタンパク質構造データバンクで入手可能な配列と比較した。７Ａ４及び１３Ｆ１のモデルを、それぞれ最も高い配列相同性を有するＶＨ及びＶＬ構造に基づいて生成した。

【0120】

マウス７Ａ４及び１３Ｆ１抗体のＶＨ及びＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植するための鋳型ヒト抗体をＩＭＧＴ／Ｄｏｍａｉｎ Ｇａｐ Ａｌｉｇｎ ３Ｄ構造データベースhttp://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgiを検索することにより、マウス７Ａ４及び１３Ｆ１抗体と高い相同性を有するアミノ酸配列を有するヒト抗体生殖細胞系から選択した。７Ａ４については、選択した鋳型ヒトＶＨは、ＩＧＨＶ２−５^＊１０とＩＧＨＪ４^＊０１との組み合わせであって、選択した鋳型ヒトＶＬは、ＩＧＫＶ１−３３^＊０１とＩＧＫＪ２^＊０１との組み合わせであった。１３Ｆ１については、選択した鋳型ヒトＶＨは、ＩＧＨＶ３−２１^＊０４とＩＧＨＪ４^＊０１との組み合わせであって、選択した鋳型ヒトＶＬは、ＩＧＫＶ７−３^＊０１とＩＧＫＪ２^＊０１との組み合わせであった。

【0121】

上述した鋳型ヒト抗体のＣＤＲアミノ酸配列を、マウス７Ａ４及び１３Ｆ１抗体のＣＤＲのアミノ酸配列で置換した。加えて、上述した鋳型ヒト抗体ＶＨ及びＶＬのフレームワークに、マウス７Ａ４及び１３Ｆ１抗体のＶＨ及びＶＬから必要なアミノ酸配列を移植して機能的なヒト化抗体を得た。７Ａ４及び１３Ｆ１のＶＨ及びＶＬに関しては、上述した鋳型ヒト抗体におけるフレームワークアミノ酸のいくつかの部位を、マウス７Ａ４及び１３Ｆ１抗体の対応するアミノ酸配列に復帰突然変異させた。ヒト化７Ａ４抗体の軽鎖可変領域については、４０位のアミノ酸をＴｙｒ（Ｙ）からＰｈｅ（Ｆ）に変異させ、７２位のアミノ酸をＧｌｙ（Ｇ）からＡｒｇ（Ｒ）に変異させた；ヒト化７Ａ４抗体の重鎖可変領域については、２位のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させ、４６位のアミノ酸をＧｌｕ（Ｅ）からＬｙｓ（Ｋ）に変異させ、７０位のアミノ酸をＰｈｅ（Ｆ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させた。ヒト化１３Ｆ１抗体の軽鎖可変領域については、４５位のアミノ酸をＬｅｕ（Ｌ）からＰｒｏ（Ｐ）に変異させ、７０位のアミノ酸をＰｈｅ（Ｆ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異させた；ヒト化１３Ｆ１抗体の重鎖可変領域については、２６位のアミノ酸をＧｌｙ（Ｇ）からＴｙｒ（Ｙ）に変異させ、４８位のアミノ酸をＩｌｅ（Ｉ）からＭｅｔ（Ｍ）に変異させ、４９位のアミノ酸をＧｌｙ（Ｇ）からＡｌａ（Ａ）に変異させ、６７位のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＩｌｅ（Ｉ）に変異させ、７１位のアミノ酸をＶａｌ（Ｖ）からＡｒｇ（Ｒ）に変異させた。

【0122】

ヒト化１３Ｆ１抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１４３及び１４１と称した。アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を設計した（それぞれ配列番号１４０及び１４２）。ヒト化７Ａ４抗体の可変軽鎖及び可変重鎖のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１３３及び１３１と称した。アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を設計した（それぞれ配列番号１３０及び１３２）。

【0123】

ヒト化７Ａ４及び１３Ｆ１抗体のＩｇＧ１及びＩｇＧ４型を作製した（ｈ１３Ｆ１−ＩｇＧ１、ｈ１３Ｆ１−ＩｇＧ４、ｈ７Ａ４−ＩｇＧ１及びｈ７Ａ４−ＩｇＧ４）。ＩｇＧ１定常領域がＤ２６５Ａ突然変異（Ｃｌｙｎｅｓ Ｒ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６：４４３−４４６（２０００））を持つ一方で、ＩｇＧ４定常領域は、Ｆ２３４Ａ及びＬ２３５Ａの二重突然変異（Ｘｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２００：１６−２６（２０００））を有する。定常領域配列を配列番号１５０及び１５１に開示する。ｈ１３Ｆ１−ＩｇＧ１（配列番号１４９及び１４５）、ｈ１３Ｆ１−ＩｇＧ４（配列番号１４９及び１４７）、ｈ７Ａ４−ＩｇＧ１（配列番号１３９及び１３５）、及びｈ７Ａ４−ＩｇＧ４（配列番号１３９及び１３７）の完全軽鎖及び重鎖アミノ酸配列を、表３で上に提供する。７Ａ４の軽鎖において脱アミド化し得る部位を除去するために、Ａｓｎ８５をＡｓｐに変異させた（ｈ７Ａ４Ｄ）。軽鎖可変領域（配列番号１５２）及び完全軽鎖アミノ酸配列（配列番号１５３）もまた、表３で上に提供する。

【0124】

ヒト化７Ａ４、７Ａ４Ｄ及び１３Ｆ１抗体の構築及び発現
ヒト化７Ａ４、７Ａ４Ｄ及び１３Ｆ１抗体の軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを合成し、発現ベクターのｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｖ−７９０）にクローニングした。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３細胞（１０^６個／ｍＬで２００ｍＬ）に、１００μｇのヒト化重鎖及び軽鎖発現プラスミドの各々をトランスフェクトし、６日間培養した。次いで、上清中のヒト化抗体をプロテインＧカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。

【0125】

実施例１０：結合活性及び特異性、ならびにリガンド（ＰＤ−Ｌ１）妨害活性におけるヒト化抗ＰＤ−１抗体の特徴付け
ヒト化１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１、１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４、７Ａ４−ＩｇＧ１及び７Ａ４−ｈＩｇＧ４抗体の生成及び精製後、抗体の結合及び特異性を、ＥＬＩＳＡに基づく結合及びＰＤ−１妨害分析、加えてＦＡＣＳに基づく結合及びＰＤ−Ｌ１妨害分析に基づいて決定した。使用した方法は、実施例２及び４で上に記載したものと同様であった。

【0126】

ＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイでは、ヒト化１３Ｆ１抗体のｈｕ−１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１及びｈｕ−１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４は、キメラ抗体の１３Ｆ１−キメラと比較して類似したＰＤ−１への結合を示し（図６Ａ、上部パネル）；ヒト化７Ａ４抗体のｈｕ−７Ａ４−Ｄ２６５Ａ−ｈＩｇＧ１及び７Ａ４−ｈｕＩｇＧ４は、キメラ７Ａ４抗体と比較して類似したＰＤ−１への結合を示した（図６Ｂ、上部パネル）。対照的に、アイソタイプ対照ｈＩｇＧ４抗体は、ＰＤ−１結合を示さなかった。図６Ａ及び図６Ｂの下部パネルは、ＥＬＩＳＡ結合データから計算した、試験した抗体の各々のＥＣ５０を示し、ヒト化１３Ｆ１及び７Ａ４抗体がＰＤ−１結合を示したことを実証している。

【0127】

同様に、ＦＡＣＳに基づく結合アッセイでは、ヒト化１３Ｆ１抗体のｈｕ−１３Ｆ１−ｈＩｇＧ１及びｈｕ−１３Ｆ１−ｈＩｇＧ４（図７Ａ、上部パネル）ならびにヒト化７Ａ４抗体のｈｕ−７Ａ４−Ｄ２６５Ａ−ｈＩｇＧ１及び７Ａ４−ｈｕＩｇＧ４（図７Ｂ、上部パネル）が、ＰＤ−１への結合を示した。ヒト化１３Ｆ１及び７Ａ４抗体のＦＡＣＳ結合データから計算したＥＣ５０を、それぞれ図７Ａ及び図７Ｂに示す。

【0128】

図８は、ヒト化１３Ｆ１抗体及びヒト化７Ａ４抗体のＥＬＩＳＡに基づくリガンドブロッキングアッセイの結果を示す。図８Ａ及び図８Ｂに示すように、それぞれヒト化１３Ｆ１及び７Ａ４抗体は、対応するキメラ抗体と比較して類似したリガンド妨害活性を示した。ヒト化及びキメラ抗体の各々について、ＩＣ５０の定量化を図８Ｃに示す。

【0129】

図９は、ヒト化１３Ｆ１抗体及びヒト化７Ａ４抗体の各々が、ＦＡＣＳに基づくリガンド妨害アッセイにより測定されるようにＰＤ−Ｌ１結合をブロックしたことを示す。図９の下部パネルは、ヒト化抗体の各々のＩＣ５０を提供する。

【0130】

実施例１１：ヒト化１３Ｆ１、７Ａ４及び７Ａ４Ｄ抗ＰＤ−１抗体のＢｉａｃｏｒｅ速度論的分析
ヒト化抗体の結合特性を特徴付けるために、ＰＤ−１とＰＤ−１抗体との間の結合速度をＢｉａｃｏｒｅ３０００により測定し、１Ｈｚのデータ収集速度で記録した。ポリクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ、ＢＲ−１００８−３８）を１０ｍＭのｐＨ５．０の酢酸ナトリウムで希釈し、およそ１５０００ＲＵでＣＭ５バイオセンサーチップの参照用及び実験用フローセルにａｍｉｎｅ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｋｉｔ（ＧＥ、ＢＲ１００５０）を使用して固定化した。各サイクルの開始時に、希釈した試験抗体（１．５μｇ／ｍｌ）を、捕捉するために１分間実験フローセルに注入した。ＰＤ−１分析物系列は、ストックをランニング緩衝液で１００ｎＭまで希釈し、続いて同じ緩衝液中で０．７８ｎＭに至るまで連続２倍希釈を行って調製した。分析物を３０μＬ／分の流速で３分間、参照用及び実験用フローセルに連続して注入した。次いで、ランニング緩衝液（０．０５％のＰ２０を加えたＰＢＳ）を３０μＬ／分の流速で１０分間にわたって流した。各サイクルの最後に、バイオセンサー表面を、１０μＬ／分の流速で１０ｍＭのｐＨ１．７のグリシン−ＨＣｌ緩衝液を３分間注入して再生した。各分析物試料の注入（すなわち、各サイクル）について、同時に記録した参照表面での応答を差し引き、続いて単一参照用のランニング緩衝液試料での応答をさらに差し引いて、実験バイオセンサー表面から得られた結合応答を二重参照した。結合及び解離速度定数（ｋａ及びｋｄ）を、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．０ソフトウェアを使用して、力価測定系列全体の二重参照したセンサーグラムをラングミュアモデル（１：１）にフィッティングすることにより同時に決定した。解離定数、すなわちＫＤを、決定した速度定数から関係ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによって計算した。図１０及び図１７Ａに示すように、ヒト化抗ＰＤ−１抗体の１３Ｆ１、７Ａ４、及び７Ａ４Ｄは、高い親和性でヒトＰＤ−１と結合した。Ｂｉｏｃｏｒｅ結合曲線を図１０及び図１７Ａの上部パネルに示し、定量化結合データを図１０及び図１７Ａの下部パネルにまとめる。図１７Ｂは、７Ａ４Ｄ−ｈＩｇＧ４抗体による、２９３Ｔ−ＰＤ１細胞に対するＰＤ−Ｌ１の結合の妨害ＩＣ５０を示す。

【0131】

実施例１２：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるサイトカイン産生に対するヒト化抗ＰＤ−１抗体の効果
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いて、ヒト化抗体がリンパ球エフェクター細胞のＰＤ−１経路をブロックする能力を実証した。アッセイでは、抗ＰＤ−１抗体の存在下または非存在下におけるＩＦＮγ及びＩＬ−２分泌についてＴ細胞を試験した。ヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞を、ＣＤ４の陰性選択アイソレーションキット（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０９１−１５５）を使用してヒトＰＢＭＣから精製した。未熟樹状細胞（ＤＣ）を、Ｍｏ−ＤＣ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９３−５６８）を使用してヒトＰＢＭＣから単離した単球から得た。細胞をＭｏ−ＤＣ分化培地で７日間培養し、次いで成熟ＤＣとなるようにＭｏ−Ｄｃ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍで２日間誘導した。ＭＬＲを設定するために、１０^５個の精製Ｔ細胞及び１０^４個の同種異系成熟ＤＣ細胞を各ウェルに添加し、総体積を２００μｌとした。試験する抗体を、２０μｇ／ｍｌ〜０．００２μｇ／ｍｌの濃度範囲でアッセイした。抗体なし、またはアイソタイプ対照抗体（ｈＩｇＧ４）のいずれかを陰性対照として使用した。細胞を３７℃で５日間培養した。６日目に、培地中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−２のレベルを、ＩＬ−２ ＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びｈＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＤＹ２８５）を使用して測定した。ヒト化１３Ｆ１抗体について、結果を図１１（ＩＬ−２産生）及び図１２（ＩＦＮγ産生）に示す。ヒト化１３Ｆ１抗体の各々は、濃度依存的様式でＩＬ−２及びＩＦＮγ産生を促進した。同様に、ヒト化７Ａ４及び７Ａ４Ｄ抗体は、濃度依存的様式でＩＬ−２（図１３及び１８）及びＩＦＮγ（図１４及び１９）産生を促進した。アイソタイプ対照抗体を含有する培養物は、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２分泌の増加を示さなかった。したがって、試験の結果は、ヒト化ＰＤ−１抗体がＰＤ−１経路をブロックし、Ｔ細胞免疫応答を刺激することを示した。

【0132】

実施例１３：破傷風トキソイド負荷に対するヒトリコールＴ細胞応答をヒト化抗ＰＤ−１抗体により増強する
抗原特異的Ｔ細胞受容体の誘発が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を抗ＰＤ−１抗体でブロックすることにより調節されたか否かを調査するために、ヒトＴ細胞リコールアッセイを用いて、破傷風トキソイド（ＴＴ）抗原を使用し、健康なＴＴ免疫化ドナーの血中における既存のメモリーＴ細胞を刺激した。この目的のために、ＴＴ免疫化ドナーから最近採取した新鮮なＰＢＭＣ（１年未満に採取した試料）を、８０Ｕ／ｍｌのペニシリン、８０ｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び３０％の自己血清を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０４９１−０１）を使用して、４×１０^５個の細胞／ウェルで９６ウェル丸底プレート（ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３７９９）に播種した。ヒト化１３Ｆ１または７Ａ４抗体を種々の濃度で添加し、０．１ｕｇ／ｍｌのＳＥＢ及び１ｕｇ／ｍｌのＴＴ（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）で刺激した。３７℃、５％ＣＯ_２で７日間の共培養後、上清を採取してＩＦＮ−γの濃度を測定した。試験の結果を図１５に示し、これはＴＴ抗原単独と比較して、抗ＰＤ−１抗体でのＰＤ−Ｌ１妨害が、メモリーＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の増強をもたらしたことを実証する。

【0133】

実施例１４：自己Ｔ細胞活性化に対するヒト化抗ＰＤ−１抗体の効果
本実施例では、Ｔ細胞活性化に対する、ヒト化抗ＰＤ−１抗体によりＰＤ−／ＰＤ−Ｌ１経路をブロックすることの効果を検査した。精製したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０９１−１５５）を、自己単球由来樹状細胞（ＤＣ）の存在下で１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ３抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ１００）で活性化した。力価測定用抗ＰＤ−１抗体の存在下または非存在下における活性化から３日後、培地を採取してＩＦＮγの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。結果を図１６に示し、これは抗ＰＤ−１抗体によるＰＤ−Ｌ１妨害が、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を増強したことを示している。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]